Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика препаратов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малышева, Анна Николаевна
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11.1. Гибернация млекопитающих
11.2. Регуляция метаболизма млекопитающих при зимней спячке
11.3. Регуляция функциональной активности сердца и скелетных мышц при гибернации.
1. Особенности метаболизма сердечной и скелетных мышц при гибернации
2. Молекулярные механизмы сокращения сердца и скелетных мышц
3. Адаптационные изменения сократительных белков при гибернации
4. Адаптационные изменения метаболизма кальция в мышечных клетках при гибернации.
11.4. Основные белковые компоненты мембран саркоплазматического ретикулума
1. Са-связывающие белки CP
2. Молекулярная организация и механизм функционирования Са-АТФазы CP
3. Регуляция активности Са-АТФазы и Са-каналов CP III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
П1.1. .Животные
111.2. Получение препаратов саркоплазматического ретикулума
111.3. Определение концентрации белка
111.4. Определение неорганического фосфора
111.5. Электрофорез в полиакриламидном геле
111.6. Определение активности Са-АТФазы в сопряженной системе
111.7. Исследование свойств мембран саркоплазматического ретикулума при помощи флуоресцентных зондов
III. 8. Фосфорилирование препаратов CP скелетных мышц суслика эндогенными протинкиназами
1. Определение уровня включения фосфата в белки CP скелетных мышц сусликов.
2. Авторадиография
III.8. Материалы
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
IV. 1. Сравнение активности Са-АТФазы и белкового состава мембран CP сусликов, крыс и кроликов
IV.2. Сравнение свойств мембран CP скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов при помощи флуоресцентных зондов IV.3. Анализ сезонных изменений белкового состава мембран CP скелетных мышц сусликов
IV.4. Анализ сезонных изменений активности Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов IV.5. Исследование свойств мембран CP сусликов при помощи флуоресцентных зондов
IV.5. Исследование регуляции активности Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов эндогенными протеинкиназами
Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика препаратов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus"
Известно, что понижение температуры тела большинства млекопитающих, и человека в том числе, всего на несколько градусов Цельсия приводит к тяжелым последствиям и даже к смерти. Однако существует большая группа животных, которые могут переносить понижение температуры тела от 37°С до 1-2°С, сохраняя при этом жизнеспособность и контроль над протеканием обмена веществ. Более того, многие из этих животных способны "управлять" температурой своего тела, "согреваясь" несколько раз в течение зимы до нормальной температуры тела и снова "охлаждаясь". Речь идет о млекопитающих, которые проводят зиму в состоянии зимней спячки (гибернации). В ответ на понижение температуры, сокращение длины светового дня и ограничение пищевых ресурсов эти животные впадают в состояние глубокого оцепенения, которое характеризуется падением скорости обмена веществ (до 1-5% от нормальных значений) и снижением температуры тела до 1-2°С. Подавление метаболизма гибернирующих животных в зимний период не является простым следствием влияния низких температур на скорость биохимических реакций, наоборот, снижение температуры тела - это результат снижения обменных процессов в организме животного. К замедлению метаболизма при гибернации приводит изменение концентрации метаболитов, которые являются аллостерическими регуляторами и ингибиторами ферментов. В комбинации с фосфорилированием ряда ферментов протеинкиназами, которое изменяет их кинетические характеристики, это приводит к эффективному подавлению катаболизма углеводов и одновременно увеличивает использование жиров в качестве основного источника энергии при гибернации.
Сердце и скелетные мышцы гибернирующих животных обладают удивительной способностью - функционировать при температуре тела от
1-2°С до 37°С. Более того, во время пробуждения животных именно в скелетных мышцах производится до 60% тепла, необходимого для разогревания организма. Пока неясно, какие механизмы позволяют мышцам гибернаторов функционировать в столь широком диапазоне температур. Предполагается, что главная роль в поддержании активности сердечной мышцы гибернаторов при низких температурах принадлежит основным компонентам электромеханического сопряжения - Са-каналам плазматической мембраны и белкам саркоплазматического ретикулума (CP). Показано, что при гибернации значительно
0-хуменьшается вход Са через Са-каналы плазматической мембраны, что, вероятно, обусловлено изменением уровня фосфорилирования этих каналов протеинкиназами. В то же время значительно возрастает роль CP в регуляции концентрации цитоплазматического кальция. Отмечена повышенная аккумулирующая способность CP сердца гибернирующих животных, что может быть связано с изменением свойств Са-АТФазы и/или Са-связывающих белков СР. В подтверждение этому, в саркоплазматическом ретикулуме сердца сусликов Spermophilus richardsonii и Spermophilus columbianus была обнаружена новая изоформа Са-связывающего белка кальсеквестрина, которая отличается от других изоформ млекопитающих по электрофоретической подвижности и типу гликозилирования. Кроме этого, CP сердца гибернаторов содержит повышенное число Са-каналов (рианодиновых рецепторов), которые обладают низкой чувствительностью к кальцию.
В настоящее время информация о возможных адаптационных изменениях в свойствах CP скелетных мышц при гибернации практически отсутствует. Известно, что в скелетных мышцах гибернирующих хомяков Cricetus cricetus повышается аккумулирующая способность СР. Однако молекулярные механизмы, регулирующих функциональную активность CP скелетных мышц во время спячки, пока не известны. Поэтому цель данной работы заключалась в характеристике препаратов CP скелетных мышц типичных гибернаторов - сусликов Spermophilus undulatus и изучении сезонных изменений функциональной активности CP этих животных. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать препараты CP скелетных мышц сусликов.
2. Исследовать сезонные изменения активности Са-АТФазы и белкового состава CP скелетных мышц сусликов.
3. Оценить эндогенную протеинкиназную активность в препаратах CP скелетных мышц сусликов и исследовать возможность регуляции активности Са-АТФазы CP эндогенными протеинкиназами.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ПЛ. ГИБЕРНАЦИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Гибернация - это один из способов биологической адаптации животных к неблагоприятным условиям окружающей среды. Термин "гибернировать" означает проводить зиму в оцепенении. Под это широкое понятие может подойти зимнее оцепенение рептилий и амфибий, рыб и беспозвоночных. Но гибернация млекопитающих отличается от гибернации других позвоночных рядом специфических особенностей:
1. Способностью охлаждаться до низкой температуры тела без нарушения координации между отдельными физиологическими процессами в организме. У длительно гибернирующих видов температура тела может падать до 1-2°С, а скорость метаболизма уменьшается до 1% от нормальных значений (Lyman et al., 1982; Калабухов, 1985; Barnes, 1989; Geiser, Ruf, 1995). Важно отметить, что у млекопитающих при впадении в гибернацию уменьшение скорости метаболизма предшествует снижению температуры тела животного (Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992). Таким образом, ингибирование метаболизма млекопитающих при гибернации происходит не в результате снижения температуры тела, а в результате тонкой внутренней регуляции биохимических процессов.
2. Наличием запаса питательных веществ, что позволяет некоторым видам млекопитающих находится в спячке на протяжении нескольких месяцев. Перед зимней спячкой в тканях млекопитающих накапливается ряд энергетических субстратов, прежде всего углеводы и жиры. Так, содержание гликогена в основном его депо - печени у малого кавказского суслика увеличивается осенью почти в 2 раза
Львова, Чубуркова, 1983). Содержание жира у суслика Spermophilus lateralis перед зимней спячкой увеличивается на 35-40%. Для нормального протекания спячки оптимальная диета животного во время активного накопления жиров должна содержать достаточно ненасыщенных жирных кислот, чтобы депонировать жиры с общим содержанием ненасыщенных жирных кислот 80-85%. При этом процент полиненасыщенных жирных кислот в диете должен быть в 2 раза больше мононенасыщенных. Возможно, это отчасти связано с тем, что организм не может синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, в отличие от мононенасыщенных, и они должны поступать с пищей (Frank, Storey, 1996). Как было установлено, именно линолевая и леноленовая полиненасыщенные жирные кислоты, температура затвердевания которых лежит ниже 0°С, служат основным горючим в спячке некоторых видов сусликов. В то же время количество насыщенных жирных кислот за время гибернации практически не изменяется. Олеиновая кислота, температура плавления которой 16-18°С, содержащая одну двойную связь, очевидно расходуется во время спячки лишь частично, в основном в периоды пробуждения, особенно в первые недели после спячки, когда источники кормов весьма скудны (Калабухов, 1985).
3. Способностью пробуждаться и "согреваться" при низкой температуре окружающей среды благодаря своей теплокровности и общему контролю над температурой тела и метаболизмом, что резко отличает млекопитающих от других позвоночных (рептилий, амфибий, рыб) и беспозвоночных.
Пробуждение у зимоспящих состоит из двух стадий. На первой стадии температура тела животного увеличивается от 1-2 до 10-12°С благодаря химическому термогенезу, который происходит в результате окисления бурого жира и несократительного (недрожательного) термогенеза в скелетных мышцах. Бурый жир, в соответствии со своей локализацией, способствует разогреванию в первую очередь головного и спинного мозга, а также сердца и внутренних органов в области сердца. Несократительный термогенез в скелетных мышцах способствует разогреванию, в основном, задних конечностей. Он характеризуется отсутствием внешних проявлений мышечного сокращения, но четкой регистрацией импульсной электрической активности. Показано, что вклад бурого жира в общую теплопродукцию организма не превышает 10%, а наиболее существенную роль в химическом термогенезе и наибольший объем теплопродукции обеспечивает скелетная мускулатура, на долю которой при пробуждении приходится более 60% потребляемого кислорода (Иванов, 1984). На второй стадии выработка тепла осуществляется за счет сократительного термогенеза, который характеризуется синхронным сокращением сразу большой массы мышечных волокон.
Гибернация наблюдается у представителей нескольких отрядов млекопитающих: яйцекладущих (ехидна, утконос), сумчатых (сумчатая мышь, Тасманийский опоссум), насекомоядных (тенрек, землеройка), рукокрылых (летучие мыши), приматов (карликовые лемуры с острова Мадагаскар), хищных (медведь, скунс, енот), грызунов (суслики, сурки, тушканчики, хомяки) (Lyman et al., 1982).
Зимняя спячка - это не непрерывное явление; она состоит из последовательности так называемых баутов продолжительностью 1,5-2 недели с кратковременными, на 20-30 часов, пробуждениями между ними. Во время баутов спячки происходит существенное уменьшение скорости биения сердца и дыхательных движений, например, у суслика Citellus undulatus в активном состоянии (при температуре тела 35,2-36,8°С) пульс составляет 150-370 ударов в минуту, а во время гибернации - 4-5 ударов в минуту (при температуре тела 3-5°С) (Соколов и др., 1995).
Состояние оцепенения у животного могут вызывать такие внешние факторы, как недостаток кормов, снижение температуры окружающей среды, изменение освещенности, газового состава воздуха (Калабухов, 1985). Но, прежде всего, гибернация обусловлена эндогенными ритмами, связанными с циклическими изменениями активности нейроэндокрийной системы животного (Белоусов, 1993). Предполагается, что при переходе животного к зимней спячке происходит постепенное уменьшение порога гипоталамической температуры (определенной заданной температуры гипоталамуса) (Heller, 1979). Известно, что различные температурные воздействия на гипоталамус животного (например, искусственные воздействия через вживленные термоды) приводят к компенсаторным изменениям теплопродукции организма, скорости метаболизма. Так, повышение температуры гипоталамуса относительно этой заданной величины приводит к снижению скорости метаболизма и теплопродукции, а снижение температуры гипоталамуса - к обратному эффекту. Таким образом, предполагается, что прогрессивное снижение порога гипоталамической температуры во время погружения животного в гибернацию приводит к уменьшению теплопродукции, падению скорости метаболизма и постепенному снижению температуры тела спящего животного (Heller, 1979). При пробуждении животного происходит, по-видимому, повышение порога гипоталамической температуры. Предполагается, что изменение порога гипоталамической температуры животного определяется изменением концентрации ряда нейропептидов, серотонина, некоторых других эндогенных факторов и изменениями активности соответствующих ферментативных систем (Wang, Lee, 1989; Jansky, 1990).
Было показано, что при впадении млекопитающих в гибернацию уменьшение скорости метаболизма предшествует снижению температуры тела животного (Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992), а периодические пробуждения гибернирующих животных сопровождаются значительным увеличением скорости метаболизма, после чего повышается температура тела животного. Механизмы, регулирующие скорость метаболизма в организме гибернирующего животного, на данный момент остаются недостаточно изученными.
II. 2. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ЗИМНЕЙ СПЯЧКЕ
Общее потребление энергии при гибернации, включая периодические выходы из нее, у гибернирующих животных на 80-90% меньше, чем у активных (Пантелеев, 1983; Wang, 1985). При зимней спячке наблюдается значительное уменьшение скорости дыхания (Pehowich, Wang, 1984; Fedotcheva et al., 1985; Брустовецкий и др., 1987) и окислительного фосфорилирования в митохондриях (Брустовецкий и др., 1989; Bronnikov et al., 1990).
Одним из основных механизмов, вызывающим уменьшение скорости дыхания митохондрий печени суслика Citellus parry во время гибернации, может быть ингибирование окисления сукцината, которое индуцируется оксалоацетатом (Fedotcheva et al., 1985). Кроме того, при гибернации в результате изменений структуры митохондриальной мембраны в 3 раза снижается скорость транспорта калия как в митохондрии, так и из митохондрий в цитоплазму. При пробуждении животных происходит существенное увеличение скорости транспорта калия в митохондрии, и его содержание в этих органеллах повышается в 2 раза по сравнению с активными сусликами (Fedotcheva et al., 1985). Возможно, снижение скорости транспорта калия митохондриями при гибернации также может вносить свой вклад в ингибирование дыхания, а повышение скорости транспорта калия может увеличивать скорость дыхания в митохондриях при пробуждении (Fedotcheva et al., 1985).
Существуют и другие механизмы регуляции скорости дыхания и окислительного фосфорилирования. Так, в митохондриях печени гибернирующего суслика Citellus undulatus значительно уменьшается сродство регуляторного участка Н-АТФазы к АТФ и АДФ, кроме того, концентрация этих нуклеотидов снижается в 5 раз. Предполагается, что это существенно лимитирует скорость окислительного фосфорилирования в митохондриях гибернирующих животных (Bronnikov et al., 1990).
Также было обнаружено, что зависимость скорости транспорта протонов, поглощения кальция и потребления кислорода митохондриями от температуры носит сезонный характер. Зависимость этих параметров от температуры при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания имеет перегиб у летних активных сусликов Spermophilus richardsonii при 21°С и у летних активных животных, акклиматизированных к холоду (4°С) и теплу (20°С) - при 11-13°С. В то же время, график Аррениуса для этих параметров у зимних гибернирующих и пробудившихся животных имеет линейный характер в температурном интервале от 4 до 37°С (Pehowich, Wang, 1984).
Во время гибернации наблюдается общее снижение гликолитической активности в результате изменения количества метаболитов, которые являются субстратами или аллостерическими регуляторами ферментов гликолиза, изменения кинетических параметров ключевых ферментов гликолиза, а также фосфорилирования ряда ферментов протеинкиназами. Так, в скелетных мышцах гибернирующего тушканчика Jaculus orientalis значительно снижается уровень гексозофосфатов и соотношение АТФ/АДФ в ткани, а активность гексокиназы, фосфофруктокиназы и пируваткиназы существенно уменьшается (El Hachimi et al., 1990). Можно и предположить, что снижение активности этих ферментов в скелетных мышцах происходит в результате их фосфорилирования протеинкиназами.
Во время гибернации полутушканчика Zapus hudsonius выявлены существенные изменения свойств ферментов гликолиза в печени. Так, активность гликогенфосфорилазы значительно снижена как в связи с уменьшением количества активной формы а, так и общего содержания фермента. Кроме того, изменены кинетические параметры пируваткиназы и фосфофруктокиназы, что является результатом их фосфорилирования протеинкиназами (Storey, 1987а). При исследовании активности этих ферментов в других органах гибернирующих Z hudsonius (мозге, сердце, почках и скелетных мышцах) было обнаружено существенное снижение содержания гликогенфосфорилазы а в мозге, и значительное изменение кинетических параметров фосфофруктокиназы в сердце. Однако свойства гликогенфосфорилазы и фосфофруктокиназы в других органах, также как и пируваткиназы во всех этих четырех органах, при гибернации не изменяются (Storey, 19876).
Существенные изменения свойств ферментов гликолиза были обнаружены и у другого типичного гибернатора, суслика Spermophilus lateralis. Так, активность гликогенфосфорилазы уменьшается в почках и печени гибернирующего суслика, более того, в печени значительно снижается содержание активной формы а этого фермента. В дополнение к этому, количество активной формы пируватдегидрогеназы (дефосфорилированной) значительно ниже в тканях гибернирующих животных, и активность пируватдегидрогеназы в сердце и почках гибернирующих сусликов составляет только 4 % от значений, характерных для активных животных. Интересно, что при гибернации кинетические параметры фосфофруктокиназы и пируваткиназы не изменяются в сердце, почках, печени и мозге сусликов, если исследование проводится при 21°С (Brooks, Storey, 1992). Однако при снижении температуры инкубационной среды для пируваткиназы из печени и сердца характерно существенное повышение сродства к своему субстрату, фосфоенолпирувату (Storey, 1997). В печени активной летучей мыши Myotis lusifugus сродство пируваткиназы к фосфоенолпирувату также увеличивается в 4 раза при уменьшении температуры с 40 до 17°С, но у этого фермента из печени гибернирующей летучей мыши такой температурной чувствительности не наблюдается (Storey, 1997). Предполагается, что отсутствие температурной чувствительности у пируваткиназы из гибернирующего животного связано с фосфорилированием фермента, которое индуцируется гибернацией. Как было описано выше, подобная модификация пируваткиназы протеинкиназами была обнаружена у гибернирующего полутушканчика Z. hudsonius (Storey, 1987а). Возможно, ковалентная модификация (фосфорилирование) ферментов при гибернации может влиять не только на кинетические параметры фермента, но и определять его температурную чувствительность.
Контроль над скоростью гликолиза может осуществляться также на уровне обратимой ассоциации ферментов со структурными элементами в клетке. Например, гликолитические ферменты могут обратимо связываться с цитоскелетом и митохондриями, что изменяет их кинетические параметры. Было обнаружено, что во время оцепенения в скелетных мышцах мыши Peromyscus maniculatus значительно уменьшается связывание фосфофруктокиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и пируваткиназы с внутриклеточными структурами, а в сердце увеличивается связывание с ними гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы (Nestler et al., 1996).
Кроме того, установлено, что при гибернации сократительный белок миозин в скелетных мышцах значительно хуже связывает фосфофруктокиназу, что, возможно, связано с изменением изоформного состава миозина при гибернации (Лукоянова и др., 1997а). Известно, что уменьшение количества связанной фосфофруктокиназы приводит к уменьшению активности этого фермента (Подлубная, 1992) и, следовательно, к падению скорости гликолиза.
Таким образом, падение активности ключевых ферментов гликолиза и ингибирование пируватдегидрогеназы приводят к снижению скорости углеводного катаболизма и использованию жиров в качестве основного энергетического субстрата. Существуют и другие способы регуляции углеводного катаболизма при гибернации. Так, у летучей мыши Eptesicus Juscus происходит значительное усиление ингибирования окисления пирувата пальмитоил-карнитином (Yacoe, 1983).
В ряде случаев модификация свойств ферментов гликолиза при гибернации используется для обеспечения глюконеогенеза (Gehnrich, Aprille, 1988), который довольно интенсивно протекает в почках и печени гибернирующих животных. Это позволяет поддерживать уровень гликогена и обеспечивать работу других органов, особенно головного и спинного мозга, а также эритроцитов, для которых глюкоза является основным энергетическим субстратом.
Таким образом, регуляция метаболизма при гибернации осуществляется самыми различными способами. Так, активность ферментов может меняться в результате изменения степени ассоциации ферментов с мембранными структурами, в результате изменения кинетических параметров ферментов, а также изменения концентрации ряда метаболитов, которые могут являться субстратами и/или аллостерическими регуляторами ферментов. Как было описано выше, важнейшим способом регуляции метаболизма при гибернации является модуляция ферментативной активности протеинкиназами.
II.3. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
СЕРДЦА И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ ГИБЕРНАЦИИ
Гибернаторы обладают удивительной способностью - выживать при температуре тела близкой к 0°С, в то время как при понижении температуры тела большинства млекопитающих всего на несколько градусов Цельсия в организме происходят необратимые изменения, приводящие к смерти. Огромный интерес представляют адаптационные изменения в скелетных мышцах гибернаторов, которые при пробуждении обеспечивают наибольший вклад в теплопродукцию организма, а также в сердце, которое продолжает функционировать при низких температурах.
II.3.1 ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ ГИБЕРНАЦИИ
При гибернации большая часть мышц находится в неактивном состоянии, исключением являются диафрагма, межреберные мышцы, обеспечивающие дыхательные движения, сердечная мышца, а также мышцы, поддерживающие позу животного во время спячки. В результате такой временной инактивации мышечной деятельности происходит значительная атрофия скелетной мускулатуры (Agostini et al., 1991; Wickler et al., 1991; Steffen et al., 1991). Так у гибернирующих хомяков Cricetus cricetus L. атрофия камбаловидной и поясничной мышц достигает 25% (Agostini et al., 1991). В то же время при гибернации масса сердечной мышцы увеличивается на 21% (Wickler et al., 1991).
При гибернации в мышцах происходят значительные перестройки метаболизма, направленные на снижение энергетических затрат. Так, в скелетных мышцах происходит существенное снижение скорости метаболизма (El Hachimi et al., 1990). Изменяется содержание основных гликолитических метаболитов: значительно снижается уровень гексозофосфатов: содержание глюкозо-6-фосфата уменьшается до 6%, фруктозо-6-фосфата до 10%, а содержание фруктозо-1,6-бисфосфата практически не определимо (El Hachimi et al., 1990).
Содержание гликогена в скелетных мышцах гибернирующих млекопитающих практически не изменяется. При исследовании содержания гликогена в трапециевидной, жевательной, икроножной и камбаловидной мышцах суслика достоверное снижение уровня этого полисахарида при зимней спячке наблюдалось только в икроножной мышце (Львова, Чубуркова, 1983).
Общее содержание адениловых нуклеотидов в скелетных мышцах при зимней спячке не изменяется, но соотношение АТФ/АДФ у гибернирующих тушканчиков Jaculus orientalis в 2 раза выше, чем у активных (El Hachimi et al., 1990).
Предполагается, что одним из основных механизмов снижения скорости гликолиза является значительное уменьшение активности гликогенфосфорилазы и полное ингибирование активности фосфофруктокиназы, как это происходит в печени полутушканчика Z. hudsonius (Storey, 1987а).
Интенсивность дыхания в мышцах изменяется в зависимости от активности мышцы при гибернации. Так, скорость поглощения кислорода в бедренной и жевательной мышцах краснощекого суслика снижается при гибернации на 15% (Эмирбеков, Львова, 1991). Скорость дыхания в гомогенате грудной мышцы гибернирующей летучей мыши
Eptesicus fuscus значительно ниже, чем у активной, если в качестве субстрата используется пируват, но никаких сезонных различий не наблюдается, если в качестве субстрата используется пальмитат (Yacoe, 1983). Так как известно, что при гибернации у летучей мыши Eptesicus fuscus в качестве основного топлива в организме используются жиры, и происходит значительное усиление ингибирования окисления пирувата пальмитоил-карнитином (Yacoe, 1983), то, скорее всего, скорость дыхания в грудной мышце летучей мыши при гибернации не изменяется.
В некоторых мышцах окислительная активность даже увеличивается, например, в икроножной мышце суслика Spermophilus lateralis она увеличивается на 65%, в полусухожильной мышце на 37%. В сердечной мышце при гибернации активность цитратсинтазы повышается на 20% (Wickler et al., 1991). Возможно, повышение окислительной активности в мышцах связано со значительным снижением гликолитических процессов и активацией окисления жиров.
Увеличение окислительной активности в скелетных мышцах происходит на первом этапе пробуждения при увеличении температуры тела от 1-2°С до 10-12°С, когда происходит так называемый несократительный термогенез. Окислительные процессы в это время происходят в условиях отключенного периферийного кровотока и неработающей системы анаэробного гликолиза. Предполагается, что потребность в кислороде на этом этапе пробуждения обеспечивается за счет увеличения содержания миоглобина в скелетных мышцах животных в зимний период. Так содержание миоглобина в мышцах зимних сусликов Citellus undulatus независимо от состояния животного в 3 раза превышает его содержание летом. При этом уровень миоглобина существенно, более чем в 2 раза, возрастает уже осенью при нормальной температуре тела животного (Postnikova et al., 1999).
II.3.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СОКРАЩЕНИЯ СЕРДЦА И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
Известно, что сокращение в сердце и сердечных мышцах млекопитающих контролируется при помощи сложной системы, в состав которой входят потенциал-зависимые Са-каналы плазматической мембраны и Са-каналы саркоплазматического ретикулума (CP), Са-связывающие и сократительные белки мышечных филаментов, Са-АТФазы плазматической мембраны и саркоплазматического ретикулума. Кроме того, функциональная активность этой системы поддерживается множеством вспомогательных белков, включая Са-связывающие белки и различные протеинкиназы. Несмотря на то, что механизмы электромеханического сопряжения в сердечной и скелетных мышцах отличаются, в этих процессах участвуют одни и те же белки (Meissner, Lu, 1995; Рубцов, Батрукова, 1997; Lamb, 2000).
Сокращение в сердечной и скелетной мышцах начинается с деполяризации плазматической мембраны, что активирует потенциал-чувствительные Са-каналы L-типа (дигидропиридиновые рецепторы или DHPR). Во время деполяризации плазматической мембраны в сердечной мышце DHPR функционируют как потенциалзависимые Са-каналы и обеспечивают вход внеклеточного кальция в цитоплазму клетки. Рост концентрации кальция в цитоплазме запускает выход кальция из CP через Са-каналы (рианодиновые рецепторы или RyR), такой механизм электромеханического сопряжения называется Са-индуцируемым освобождением кальция (Meissner, Lu, 1995; Рубцов, Батрукова, 1997). Для электромеханического сопряжения в скелетных мышцах вход кальция через DHPR не обязателен, так как в скелетных мьппцах дигидропиридиновые рецепторы Т-трубочек (выпячивания сарколеммы внутрь клетки) непосредственно контактируют с рианодиновыми рецепторами. Было показано, что примерно 50% рианодиновых рецепторов непосредственно контактируют с DHPR (Franzini-Armstrong, Jorgensen, 1994). Благодаря этому, конформационные изменения, происходящие с дигидропиридиновыми рецепторами при деполяризации мембраны, передаются на Са-каналы CP, что приводит к активации RyR и выбросу Са2+ из СР. Кальций, поступающий в цитоплазму через эти кальциевые каналы, в свою очередь активирует RyR, которые не взаимодействуют с DHPR (Lamb, 2000). Повышение концентрации кальция в цитоплазме приводит к образованию актомиозинового комплекса и происходит сокращение мышцы. Кроме того, повышение концентрации Са2+ в цитоплазме вызывает активацию Са-АТФаз плазматической мембраны и саркоплазматического ретикулума, их работа приводит к снижению
Ох концентрации Са в цитоплазме, и наступает расслабление мышцы.
Модификация функциональной активности сердца и скелетных мышц при гибернации происходит в результате ряда адаптационных изменений вышеперечисленных белков, которые участвуют в регуляции сократительной активности.
II.3.3. АДАПТАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЖОВ ПРИ ГИБЕРНАЦИИ
Модуляция активности сократительных белков в мышцах при гибернации осуществляется в результате изменения их изоферментного состава и уровня фосфорилирования.
Так, в сердечной мышце хомяков при гибернации меняется изоферментный состав тяжелых цепей миозина. Установлено, что у летних активных хомяков присутствует в основном 6-изоформа тяжелого миозина, которая составляет 79% от всего миозина, а у гибернирующих животных до 53% увеличивается содержание а-изоформы тяжелого миозина. Зимние активные (негибернирующие) хомяки имеют такой же изоферментный состав тяжелых цепей миозина в сердечной мышце, как и летние животные (Morano et. al, 1992). Известно, что а-изоформа миозина обладает большей активностью и большей температурной чувствительностью: при увеличении температуры активность а-изоформы увеличивается в большей степени, чем активность В-изоформы. Более того, во время гибернации в сердечной мышце на 22% уменьшается уровень фосфорилирования легких регуляторных цепей миозина (MLC2) (Morano, et al., 1992).
В скелетных мышцах спящих сусликов по сравнению с активными зимними и летними животными на 50% снижается содержание одной из изоформ тяжелых цепей миозина 2В, характерной для быстрых мышечных волокон. Количество легких цепей-3 миозина (MLC3) в скелетных мышцах гибернирующих сусликов уменьшается до 40%, по сравнению с активными животными, и затем увеличивается до 60% при пробуждении за 1-1,5 часа. При пробуждении содержание тяжелых цепей 2В также увеличивается примерно на 10% по сравнению со спящими животными (Лукоянова и др., 1997а). Поскольку миозины сердечной и медленных скелетных мышц в отличие от быстрых скелетных мышц не содержат MLC3, эти данные об уменьшении количества быстрых изоформ тяжелых и легких цепей миозина указывают на возможную трансформацию при гибернации быстрых волокон скелетных мышц в медленные. Обнаруженные изменения изоформного состава коррелируют с результатами сравнительного анализа механических характеристик одиночных волокон скелетных мышц у спящих и активных сусликов (Rogdestvenskaya et al., 1994). Это также согласуется с данными о преимущественной атрофии быстрых мышечных волокон при гибернации (Wickler et al., 1991). Время, за которое изоформный состав миозина столь существенно изменяется, кажется небольшим, однако оно реально в свете данных о гиперактивации синтеза белков в разных тканях сусликов в конце каждого баута спячки и в период пробуждения (Zhegunov et al., 1992).
Изменения в изоферментном составе легких и тяжелых цепей миозина в скелетных мышцах сопровождается изменением структурной организации нитей миозина. Нити из миозинов сусликов в начальный период пробуждения (ректальная температура тела 12°С) имеют неупорядочную структуру, в отличие от нитей миозина гибернирующих и активных животных, и животных, находящихся на последней стадии пробуждения (ректальная температура 27°С) (Лукоянова, 1996). Предполагается, что именно изменения в изоформах тяжелых и легких цепей миозина могут отвечать за изменение структурной организации нитей при гибернации. Быстрая смена изоферментного состава миозина и изменение его структурной организации в скелетных мышцах в период выхода из спячки может приводить к неупорядоченным сокращениям с низким коэффициентом полезного действия и с увеличенным выделением тепла, что в свою очередь будет вносить вклад в термогенез животного во время пробуждения (Лукоянова, 1996).
При гибернации также изменяются ферментативные свойства миозина из скелетных мышц. Было обнаружено уменьшение активности актин-активируемой АТФазы миозина у спящих и пробуждающихся сусликов на 60% и 20% соответственно по сравнению с активными животными. В то же время, чувствительность к кальцию актомиозинов у спящих и пробуждающихся сусликов меньше на 60% и 55%, соответственно, чем у активных животных (Лукоянова и др., 19976). Поскольку при исследовании изоферментного состава и функциональных свойств актина и тонких филаментов в скелетных мышцах гибернирующих животных не выявлено каких-либо изменений, был сделан вывод, что обнаруженные изменения АТФазной активности являются следствием изменений именно в миозине (Лукоянова, 1998).
Было показано, что при гибернации в скелетных мышцах 30-50% легких регуляторных цепей миозина (MCL2) находится в фосфорилированом состоянии, в то время как в препаратах активных и пробуждающихся сусликов MLC2 полностью дефосфорилирована (Лукоянова и др., 1996). Это может дополнительно вносить вклад в уменьшение АТФазной активности миозина. Так как, возможно, снижение двигательной активности мышц является следствием снижения АТФазной активности миозина, то изменение уровня фосфорилирования легких цепей миозина может играть существенную роль в регуляции двигательной активности скелетных мышц при гибернации.
Недавно было обнаружено увеличение уровня мРНК сердечной изоформы MLC1 в 2 раза в сердце и в 3-4 раза в скелетных мышцах гибернирующих сусликов Spermophilus lateralis, что также может вносить вклад в изменение сократительной активности мышц в условиях низких температур (Fahlman et al., 2000).
При гибернации также изменяется способность миозина связывать ключевые ферменты гликолиза. Так миозин, изолированный из скелетных мышц спящих и пробуждающихся сусликов, значительно хуже связывает фосфофруктокиназу, чем миозин из активных животных. Предполагается, что эти изменения происходят в результате изменения структурной организации миозина (Лукоянова и др., 1997а). Поскольку связывание с сократительными нитями активирует фосфофруктокиназу (Подлубная, 1992), уменьшение количества связанного фермента приводит к уменьшению его активности в клетке при гибернации и снижению скорости гликолиза, что хорошо согласуется с данными по ингибированию гликолиза во время зимней спячки (El Hachimi et al., 1992). Если учесть, что связывание фосфофруктокиназы с сократительными нитями имеет значение для синхронизации запуска гликолитической и сократительной мышечных систем, а также для увеличения скорости доставки АТФ к АТФ-гидролизующим центрам миозина, то обнаруженное снижение связывания будет вносить свой вклад в ингибирование сократительной активности скелетных мышц (Лукоянова и др., 1997а).
Таким образом, предполагается, что изменение изоферментного состава тяжелых и легких цепей сократительного белка миозина и уровня фосфорилирования легких регуляторных цепей миозина (MLC2) является одним из основных способов регуляции сократительной активности сердца и скелетных мышц при гибернации.
II.3.4. АДАПТАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА
КАЛЬЦИЯ В МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ ПРИ ГИБЕРНАЦИИ
При исследовании электрических и механических параметров сердечной мышцы гибернирующих и активных бурундуков Tamias sibiricus были обнаружены существенные различия по некоторым параметрам. Так, для сердечной мышцы спящих бурундуков характерна более низкая амплитуда потенциала действия (Kondo, Shibata, 1984), что объясняется снижением медленного входа Са2+ через Са-каналы L-типа плазматической мембраны (DHPR) (Kondo, 1986). Кроме того, для сердечной мышцы спящих животных характерно изменение отношения частота - сила: при последовательном увеличении частоты стимуляции от 0,05 до 2 Гц сила сердечного сокращения повышается у активных, но снижается у гибернирующих животных.
При обработке препаратов сердечной мышцы бурундуков Tamias sibiricus кардиотоническим агентом изопреналином, который увеличивает транссарколемальный вход Са2+, происходит повышение амплитуды потенциала действия как у активных, так и у гибернирующих животных, но положительный инотропный эффект наблюдается только у активных бурундуков. Ингибитор кальциевых каналов CP рианодин в препаратах активных животных вызывает увеличение амплитуды потенциала действия и частичное ингибирование сокращения, а в препаратах гибернирующих бурундуков сократительная активность совсем прекращается и происходит резкое ингибирование потенциала действия. Более того, в присутствии рианодина эффекты, полученные при обработке препаратов изопреналином, становятся еще сильнее выраженными (Kondo, 1986; Kondo, 1988).
На основе этих данных, было сделано предположение, что при гибернации вклад в сокращение сердечной мышцы внеклеточного кальция, поступающего в клетку через DHPR, значительно снижается и повышается вклад внутриклеточного Са2+, поступающего из CP через RyR. Кроме того, отсутствие положительного инотропного эффекта изопреналина в препаратах сердечной мышцы гибернирующих л , животных можно объяснить повышенной Са -аккумулирующей способностью саркоплазматического ретикулума (Kondo, 1988).
Интересно, что изменения электромеханических параметров сердечной мышцы бурундуков Tamias sibiricus носят сезонный характер и запускаются перед тем, как животные впадают в спячку (Kondo, 1987).
Снижение входа кальция через DHPR при гибернации также было обнаружено и у длиннохвостых якутских сусликов Spermophilus undulatus (Alekseev et al., 1996; Alekseev et al., 1997). Для описания функционирования Са-каналов L-типа была предложена кинетическая модель, предполагающая существование у него двух независимых центров фосфорилирования: центра А, фосфорилируемого протеинкиназой А и центра X, за фосфорилирование которого отвечает пока неидентифицированная протеинкиназа X. Согласно модели, канал может находиться в одном из четырех состояний: дефосфорилированы оба центра, фосфорилирован один из центров (А или X) и фосфорилированы оба центра. (Alekseev et al., 1997; Kokoz et al., 1997). Предполагается, что при вхождении сусликов в гибернацию блокируется фосфорилирование центра X, что приводит к изменению кинетических параметров Са-каналов L-типа и снижению входа кальция через DHPR (Kokoz et al., 1999; Кокоз и др., 2000). Таким образом, изменение активности эндогенных протеинкиназ и/или фосфатаз играет огромную роль в регуляции сократительной активности сердца при гибернации и, возможно, отвечает за особую устойчивость сердца гибернаторов к низким температурам.
При детальном анализе функциональной активности CP сердечной мышцы сусликов Spermophilus richardsonii было установлено, что CP гибернирующих животных имеет самую высокую скорость аккумуляции кальция (измеренную в температурном диапазоне от 4 до 37°С) по сравнению с CP активных сусликов. Весенние и зимние активные суслики Spermophilus richardsonii имеют самую низкую скорость аккумуляции Са2+, в то время как осенние показывают промежуточную скорость между гибернирующими и зимними активными животными (Belke et al., 1991). Таким образом, биохимические изменения саркоплазматического ретикулума сусликов Spermophilus richardsonii также носят сезонный характер и происходят уже на стадии подготовки животных к гибернации (Belke et al., 1991).
Особую устойчивость сердца гибернаторов к низким температурам могут определять уникальные свойства Са-АТФазы СР. В подтверждение этому было установлено, что при гипотермии (охлаждении до 19°С) у холодочувствительного животного крысы происходят значительные нарушения в работе Са-АТФазы мембран CP:
Од. нарушается стехиометрия соотношения транспорта Са в CP к гидролизу АТФ, которая к концу суток гипотермии уменьшается почти в 4 раза, в то время, как сердце сусликов S. richardsonii приспосабливается к деятельности в условиях гипотермии и способно функционировать до 96 часов при 6°С без нарушения работы Са-АТФазы мембран СР. Таким образом, устойчивость сердца сусликов к глубокому длительному охлаждению может быть обусловлена высокой стабильностью Са-АТФазы CP, и одной из основных причин нарушений деятельности сердца крыс при длительной гипотермии может быть нарушение функционирования Са-АТФазы CP (Жегунов и др., 1993).
Также было установлено, что саркоплазматический ретикулум из сердца типичных гибернаторов, сусликов Spermophilus richardsonii и Spermophilus columbianus содержит повышенное число рианодиновых рецепторов, которые обладают низким сродством к кальцию (Milner et al., 1991). Кроме того, анализ белкового состава CP, изолированного из сердца этих сусликов, позволил выявить новую изоформу Са-связывающего белка CP, кальсеквестрина (Milner et al., 1991), который в CP выполняет роль Са-буфера. Некоторые биохимические свойства этого белка отличают его от других изоформ млекопитающих: он имеет уникальную электрофоретическую подвижность в щелочном и нейтральном ПААГ и имеет молекулярную массу приблизительно на 7% выше, чем кальсеквестрин из сердца млекопитающих других видов. Более того, он отличается от других изоформ кальсеквестрина по степени и типу гликозилирования. Известно, что биохимические и ультраструктурные особенности кальсеквестрина консервативны как в скелетных, так и в сердечных мышцах млекопитающих (Coppolino, Dedhar, 1998). Многочисленные исследования показывают, что кальсеквестрин может взаимодействовать с Са-каналами CP (Franzini-Armstrong et al., 1987; Callaway et al., 1994; Murray, Ohlendieck, 1998; Herzog et al., 2000) и регулировать их активность (Ikemoto et al., 1991;
Kawasaki, Kasai, 1994). Предполагается, что новая изоформа кальсеквестрина может модулировать активность Са-каналов CP в сердце типичных гибернаторов, сусликов Spermophilus richardsonii и Spermophilus columbianus. Таким образом, необычные свойства Са-каналов и Са-АТФазы CP у гибернаторов могут определять устойчивость их сердец к низких температурам.
При исследовании кальциевого метаболизма в скелетных мышцах (камбаловидной, поясничной, а также в смешанных мышцах) хомяков Cricetus cricetus, было установлено, что у гибернирующих животных скорость захвата кальция и способность сохранять кальций в CP выше на 43% и 17%, соответственно, чем у активных животных. Некоторые изменения в транспорте кальция были обнаружены в быстрых мышцах зимних активных животных, которые содержались при 22°С и натуральном фотопериоде. Активность Са-АТФазы не различалась в препаратах летних и зимних животных. Так как электронно-микроскопическое исследование не выявило каких-либо изменений в расположении и количестве CP, предполагается, что для CP зимних хомяков характерна более высокая степень сопряжения транспорта кальция и гидролиза АТФ (Agostini et al., 1991).
Таким образом, при гибернации происходят существенные изменения транспорта кальция саркоплазматическим ретикулумом в мышечных клетках: изменяется активность Са-каналов и Са-аккумулирующая способность СР. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений, до сих пор остаются плохо изученными.
II.4. ОСНОВНЫЕ БЕЛКОВЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА
Саркоплазматический ретикулум - высокоразвитая внутриклеточная мембранная сеть, пронизывающая цитоплазму клеток мышц разных типов в непосредственной близости от миофибрилл. Как было сказано выше, в ответ на деполяризацию сарколеммы, возникающую при проведении нервного импульса, в цитоплазму через Са-каналы CP выбрасывается Са2+, что приводит к мышечному сокращению (Martonosi, 1984). При повышении концентрации Са2+ в цитоплазме активируется Са-АТФаза, которая обеспечивает о I аккумуляцию Са во внутреннее пространство CP, в результате чего происходит снижение концентрации Са2+ в цитоплазме, и наступает расслабление мышцы (Inesi, 1985; MacLennan et al., 1997).
Морфологически и функционально CP можно разделить на два отдела: продолговатые трубочки (где в основном локализована Са-АТФаза), окружающие миофибриллы, и терминальные цистерны (где в основном локализованы Са-каналы), находящиеся в тесном контакте с трубочками Т-системы, представляющими собой впячивания сарколеммы.
Мембрана CP кролика состоит на 2/3 из белков и на 1/3 из липидов. Основным белковым компонентом мембран саркоплазматического ретикулума является Са-АТФаза, которая составляет 60-80% от всего белка СР. Молекулярная масса Са-АТФазы - около 105 кДа (MacLennan et al., 1974; Tada et al., 1978).
В состав CP кролика также входят следующие белки: рианодиновый рецептор или кальцевый канал (560 кДа), 53 кДа гликопротеид, Са-связывающие белки: кальсеквестрин (63 кДа), кальретикулин (55 кДа), саркалюменин (160 кДа), богатый гистидином
Са-связывающий белок (170 кДа) и другие (Meisner et al., 1973; Tada et al., 1978; Meldolesi, Pozzan, 1998; Mackrill, 1999).
II.4.1. Са-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ CP
Са-связывающие белки кальсеквестрин, кальретикулин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок участвуют в регуляции концентрации кальция в терминальных цистернах и продолговатых трубочках СР.
Кальсеквестрин - основной Са-связывающий белок, локализованный в терминальных цистернах CP (Somlyo et al., 1981; Jorgensen et al., 1983), связывающий 40-50 моль Ca2+ на моль белка с Кд = 1 мМ (MacLenan et al., 1983; Yano, Zarain-Herzberg, 1994). Это довольно кислый белок, который в терминальных цистернах CP находится в виде олигомеров, образуя сетчатые структуры (Yano, Zarain-Herzberg, 1994). Кальсеквестрин играет существенную роль как в хранении Са2+, так и в регуляции выделения Са2+ через RyR (Ikemoto et al., 1989; Kawasaki, Kasai, 1994). При помощи самых различных методов было установлено, что этот Са-связывающий белок может непосредственно взаимодействовать с RyR (Franzini-Armstrong et al., 1987; Callaway et al., 1994; Murray, Ohlendieck, 1998; Herzog et al., 2000), а также через другие белки, такие как триадин (Guo et al., 1996) или джанктин (Zhang et al., 1997). Предполагается, что триадин и джанктин взаимодействуют друг с другом в мембране CP и образуют комплекс, который заякоривает кальсеквестрин на рианодиновые рецепторы, что сохраняет кальций в непосредственной близости от мест выделения кальция (Zhang et al., 1997).
В настоящее время известны скелетная и сердечная изоформы кальсеквестрина, имеющие 68% гомологии (Yano, Zarain-Herzberg,
1994). Кроме того, в сердце гибернаторов, сусликов S. richardsonii и S. columbianus была выявлена новая изоформа кальсеквестрина (Milner et al., 1991). Некоторые свойства этого белка отличают его от других изоформ кальсеквестрина млекопитающих: он обладает уникальной электрофоретической подвижностью при электрофорезе в щелочной и нейтральной среде, которая соответствует кажущейся молекулярной массе 48,5 кДа и 58 кДа, соответственно, что отличает его от всех известных изоформ кальсеквестрина из скелетных мышц (42 кДа и 63 кДа) и сердца (46 кДа и 55 кДа) других млекопитающих. Кроме того, он отличается от других изоформ кальсеквестрина по степени и типу гликозилирования (Milner et al., 1991).
Другой Са-связывающий белок CP - кальретикулин, связывает 20-30 моль кальция на 1 моль белка с Кд = 2 мМ (Krause, Michalak, 1997). Этот белок локализован внутри везикул CP, а также во многих других участках клетки (Krause, Michalak, 1997). Кальретикулин способен модулировать функцию интегринов в плазмалемме и факторы транскрипции в ядре, а также выполняет функцию шаперона в эндоплазматическом ретикулуме (Meldolesi et al., 1996). Было показано, что кальретикулин, меченый радиактивным йодом (I125), специфически взаимодействует с 30 кДа мембранным белком СР. Предполагается, что это гомолог триадина/джанктина, заякоривающий кальретикулин к местам выделения кальция (Burns, Michalak, 1993).
Саркалюменин - Са-связывающий белок CP, который в основном находится внутри продолговатых трубочек CP (Leberer et al., 1990). Один моль этого белка связывает 35 моль кальция с Кд = 300 мкМ в присутствии 20 мМ КС1 и 600 мкМ в 150 мМ КС1 (Leberer et al., 1990). Саркалюменин и 53 кДа гликопротеин локализованы совместно с Са-АТФазой (Leberer et al., 1990). Предполагается, что эти два белка вовлечены в связывание кальция в продолговатых трубочках CP, где Са-АТФаза откачивает кальций внутрь CP во время мышечного расслабления (Froemming, Ohlendieck, 1998) и, возможно, модулируют активность Са-АТФазы CP (Leberer et al., 1990).
Богатый гистидином Са-связывающий - еще один внутрилюменальный белок CP, который в ретикулуме представлен олигомерными комплексами, которые, как предполагается, больше, чем пентамеры (Suk et al., 1999). Интересно, что при повышении концентрации кальция этот комплекс распадается на более мелкие олигомерные структуры - димеры и тримеры, образуя менее упорядочные структуры. Физиологическая роль этого Са-связывающего белка до конца не ясна, однако в настоящее время известно, что фосфорилирование этого белка и другого Са-связывающего белка, саркалюменина эндогенными протеинкиназами приводит к ингибированию Са-каналов CP скелетных мышц (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996).
II.4.2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Са-АТФазы CP
Са-АТФаза относится к семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа, которые играют важную роль в клетке, обеспечивая трансмембранный перенос катионов против электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТФ. При этом происходит образование промежуточного фосфорилированного интермедиата, который возникает вследствие переноса терминального фосфорильного остатка АТФ на остаток аспарагиновой кислоты активного центра фермента (Moller et al., 1996; Mintz, Guillain, 1997).
Са-АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума или SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-transporting ATPase) представлена несколькими изоформами в разных тканях: SERCA1 - в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a - в сердце, медленных скелетных и гладких мышцах, SERCA2b - в разных типах клеток (гладкие мышцы, мозг, почки) и SERCA3 - в клетках крови и во многих эпителиальных клетках (Moller et al., 1996).
Са-АТФаза CP образована 994 аминокислотными остатками, расположенных в мембране асимметрично: 70% аминокислотных остатков обращено в цитоплазму, 25% находится в мембране и 5% обращены внутрь CP (Toyoshima et al., 1993). Согласно рентгеноструктурному анализу Са-АТФазы CP, проведенному с разрешением в 2,бА (Toyoshima et al., 2000), цитоплазматическая часть Са-АТФазы состоит из следующих доменов: N (нуклеодитсвязывающего), Р (фосфорилируемого) и А (рис. 1). Центральную часть занимает Р-домен, который содержит фосфорилируемый остаток Asp 351. Этот домен состоит из двух частей: N-терминальной (приблизительно между Asp330 и Asp359), которая соединена с трансмембранной спиралью (М4) и С-терминальной (между Lys605 и Asp737), соединенной с трансмембранной спиралью (М5). Эти две части Р-домена, образованные семью слоями параллельных Р-структур с восемью короткими спиралями, вместе формируют Россмановскую складку. Фосфорилируемый остаток Asp351 находится в С-концевой части центральной Р-структуры.
Нуклеотидсвязывающий домен (N-домен) - самый большой из трех цитоплазматических доменов, имеет молекулярную массу около 27 кДа. Этот домен сформирован остатками (Gln360 - Arg604), вставленными между двумя областями Р-домена. Он образован семью полосами антипараллельных p-структур с двумя спиралями, которые объединяют эти p-структуры в образование наподобие сэндвича (рис. 1). Домен А (также называемый р~доменом) - самый маленький домен из трех цитоплазматических доменов, его молекулярная масса около
16 кДа. Он состоит примерно из 110 аминокислотных остатков, расположенных между между трансмембранными спиралями М2 и МЗ, которые формируют неупорядочную структуру, и 40 остатков N-терминальной части фермента, которые формируют две короткие спирали. Этот домен связан с трансмембранной областью длинными петлями.
Участок фосфорилирования (Asp351) находится на расстоянии 25А от нуклеотидсвязывающего участка, это означает, что домены должны приблизиться друг другу во время гидролиза АТФ. Ряд данных указывают на то, что N-домен в отсутствие Са2+ находится в фиксированном состоянии, но становится подвижным в присутствие кальция, кроме того, результате конформационных изменений, которые индуцируются связыванием АТФ, N-домен приближается к Р-домену. Постулируется, что во время активного транспорта А-домен также способен двигаться и приводить в движение или заякоривать N-домен.
Трансмембранная часть фермента (М) состоит из десяти а-спиралей (М1-М10), их порядок указан на рис. 1. Спирали М4-М6 и М8 располагаются вокруг двух высокоплотных областей (рис. 1), которые были идентифицированы как ионы кальция. Было определено, что два участка связывания кальция находятся на одном уровне в мембране на расстоянии друг от друга 5,7А (рис. 1). Первый участок связывания образуется за счет отрицательнозаряженных боковых групп Asn768, Glu771 (М5), Thr799, Asp800 (Мб) и Glu908 (М8). Второй участок связывания кальция сформирован осевыми карбонильными группами спирали М4: Val304, А1а305,11е307 и боковыми кислородсодержащими группами: Asn796, Asp800 (Мб) и Glu309 (М4). Таким образом, два участка связывания Са находится в непосредственной близости друг от друга и образованы четырьмя спиралями М4, М5, Мб, М8, две из которых находится в раскрученном состоянии для более эффективного связывания кальция.
Механизм функционирования Са-АТФазы CP к настоящему времени довольно хорошо изучен и описан в ряде обзоров (Inesi, 1985; MacLennan et al., 1997). Схема реакционного цикла Са-АТФазы приведена на рис. 2.
Реакционный цикл Са-АТФазы начинается с того, что фермент в конформации Е1, которая характеризуется высоким сродством к Са2+,
Л | связывает два иона Са и АТФ с цитоплазматической стороны. После этого происходит фосфорилирование Са-АТФазы, которое осуществляется в результате переноса у-фосфата АТФ на остаток аспарагиновой кислоты (Asp351) фермента. Фосфорилирование индуцирует конформационные изменения фермента и из Е1-конформации он переходит в конформацию Е2, в результате чего понижается сродство Са-АТФазы к ионам кальция, и они отщепляются во внутреннюю полость ретикулума. Далее происходит Mg-зависимый гидролиз фосфофермента с освобождением неорганического фосфата (Фн) в цитоплазму. Цикл транспорта Са2+ завершается изомеризацией фермента из Е2 конформации в Е1.
Са-АТФаза активируется Са2+ в концентрации ниже 10"7 М. Этот , о фермент снижает концентрацию свободного Са в цитоплазме до 10" М, и создает 1000-кратный градиент Са2+ на мембране CP (Inesi, 1985).
Зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ не описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, так как в области высоких концентраций субстрата (0,5-1,0 мМ) наблюдается дополнительная активация фермента (Yamamoto, Tonomura, 1967). Было показано, что график зависимости активности Са-АТФазы от концентрации АТФ в координатах Лайнуйвера-Берка имеет вид двух пересекающихся прямых. Рассчитанные на основе этих экспериментов значения Км для АТФ составили 10 мкМ в области низких концентраций субстрата (до 100 мкМ) и 400 мкМ в области высоких концентраций нуклеотида (свыше 100 мкМ) (Yamamoto, Tonomura, 1967; De Meis, Inesi, 1982).
Негиперболическая зависимость активности от концентрации субстрата описана и для других ферментов: протонного насоса митохондрий (Shuster et al., 1975), №,К-АТФазы плазматических мембран (Post et al., 1972), Н,К-АТФазы (Wallmark et al., 1980).
Одни авторы считают, что в ходе реакционного цикла фермента меняется сродство активного центра к АТФ (Moszydlowski, Fortes, 1981; White, Dewey, 1987). Предполагается, что Са-АТФаза в конформации Е1 имеет высокое сродство к АТФ, а после перехода фермента в конформационное состояние Е2 и освобождения продуктов реакции активный центр приобретает низкое сродство к субстрату. Так как скорость гидролиза АТФ Са-АТФазой лимитируется скоростью конформационного перехода Е2-Е1, то связывание АТФ с гидролитическим центром фермента в Е2 конформации приводит к образованию фермент-субстратного комплекса и значительно ускоряет конформационный переход Е2-АТФ - Е1-АТФ.
Другие авторы объясняют дополнительную активацию фермента высокими концентрациями АТФ тем, что наряду с мономерами фермента, имеющими высокое сродство к АТФ, существуют молекулы фермента, объединенные в олигомеры, активные центры которых в составе олигомера обладают низким сродством к АТФ (Ikemoto et al., 1981; Рубцов, 1982). При низких концентрациях АТФ (до 100 мкМ) работают только мономеры фермента, которые гидролизуют АТФ согласно кинетике Михаэлиса-Ментен, а при повышении концентрации происходит кооперативное насыщение активных центров молекул фермента, объединенных в олигомеры, что и приводит к дополнительной активации Са-АТФазы (Болдырев, Рубцов, 1982).
Недавно, было показано, что у холодоустойчивой лягушки Rana sylvatica зависимость активности Са-АТФазы CP скелетных мышц (SERCA1) от концентрации АТФ и Са2+ в отличие от большинства животных описывается кинетикой Михаэлиса-Ментен (Dode et al.,
2000). Кроме того, по сравнению с Са-АТФазой CP других животных первичная структура этого фермента содержит 7 аминокислотных замен, три из которых находятся в АТФ-связывающем домене (Dode et al., 2001). Поскольку аминокислоты, располагающиеся в этих участках, консервативны в Са-АТФазе CP большинства животных, предполагается, что их замена приводит к изменению белок-белковых взаимодействий мономеров Са-АТФазы Rana sylvatica, вследствие чего не наблюдается дополнительной активации этого фермента высокими концентрациями АТФ (Dode et al., 2001).
Отсутствие дополнительной активации фермента высокими концентрациями АТФ также было описано для ЫаД-АТФазы из скелетных мышц гибернирующих сусликов Spermophilus lateralis (MacDonald, Storey, 1999). Кроме того, активность ЫаД-АТФазы скелетных мышц гибернирующих сусликов была в 3 раза ниже, чем летних активных животных. Предполагается, что причиной изменения кинетических параметров Ка,К-АТФазы скелетных мышц гибернирующих сусликов является фосфорилирование этого фермента протеинкиназами.
11.4.3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ Са-АТФазы и Са-КАНАЛОВ
CP
В настоящее время установлено, что активность Са-АТФазы может регулироваться как цитоплазматическими белками, так и белками СР. Так известно, что активность Са-АТФазы гладких мышц (SERCA2b) модулируется Са-связывающим белком кальретикулином (Krause, Michalak, 1997). Предполагается, что снижение транспортной функции SERCA2b может происходить в результате взаимодействия кальретикулина с гликозилированным участком этой Са-АТФазы (John et al., 1998).
Основным регулятором Са-АТФазы сердца и медленных скелетных мышц (SERCA2a) является интегральный белок CP, фосфоламбан. В результате его ингибиторного влияния происходит уменьшение активности Са-АТФазы и уменьшение ее сродства к кальцию (Simmerman, Jones, 1998). Фосфоламбан - 52 членный пептид (М.м = 6 кДа), который в мембранах CP образует пентамеры. N-Конец фосфоламбана находится в цитоплазме и содержит положительно заряженные аминокислоты, в результате чего N-концевые домены мономеров фосфоламбана отталкиваются друг от друга. Кроме того, в цитоплазматической части этого белка находится аминокислотные остатки Serl6 и Thrl7, фосфорилируемые протеинкиназами. Предполагается, что в дефосфорилированном состоянии мономеры фосфоламбана электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженным цитоплазматическим доменом Са-АТФазы, что вызывает агрегацию Са-АТФазы. Фосфорилирование фосфоламбана цАМФ-зависимой протеинкиназой по Serl6 и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой по Thrl7 вызывает образование агрегатов (пентамеров) фосфоламбана, а Са-АТФаза переходит в неагрегированное активное состояние (Simmerman, Jones, 1998). Схема, иллюстрирующая регуляцию Са-АТФазы фосфоламбаном, представлена на рисунке 3.
Несмотря на то, что фосфоламбан не синтезируется в быстрых скелетных мышцах, было показано, что SERCA1 регулируется фосфоламбаном так же, как и Са-АТФаза сердца и медленных скелетных мышц (SERCA2a), что объясняется высокой степенью гомологии этих АТФаз (Moller et al., 1996). В быстрых скелетных мышцах обнаружен другой интегральный белок CP, сарколипин, регулирующий активность SERCA1 (Odermatt et al., 1998). Сарколипин - это 31-членный протеолипид (М.м = 6 кДа), который синтезируется в основном в активный фосфоламбан неактивный фермент агрегированный фосфрилирование , фосфоламбана г неактивный фосфоламбан активный фермент
Рис. 3. Схема регуляции Са-АТФазы CP сердца и медленных скелетных мышц фосфоламбаном (Simmerman, Jones, 1998).
Фосфоламбан
Рис. 4. Модель строения сарколипина и фосфоламбана. Черные кружочки обозначают идентичные аминокислоты, затемненные -консервативные у сарколипина и фосфоламбана. Домены обозначены слева, номера указывают их расположение в аминокислотной последовательности (Odermatt et al., 1998). роееш (&СУДАРС4 ■ ^блио быстрых скелетных мьпнцах. При помощи иммунохимического анализа была продемонстрирована совместная локализация сарколипина и Са-АТФазы в мембранах CP (Odermatt et al., 1998). Сарколипин имеет сходное строение с фосфоламбаном (рис. 4), но эти белки взаимодействуют с разными участками Са-АТФазы и несколько по-разному влияют на кинетические параметры Са-АТФазы. Так, саколипин при низких концентрациях кальция, также как и фосфоламбан, уменьшает сродство Са-АТФазы к кальцию и ингибирует активность Са-АТФазы. Однако, в отличие от фосфоламбана, при высоких концентрациях кальция саколипин увеличивает активность SERCA1. Кроме того, при использовании очищенных протеинкиназ и при стимуляции эндогенного фосфорилирования не было выявлено фосфорилирования сарколипина. Также не было обнаружено в мембранах CP олигомерных форм сарколипина, хотя исследователи не исключают возможности их существования в физиологических условиях. Поскольку не было обнаружено механизмов, переключающих действие сарколипина на SERCA1, предполагается, что сарколипин обеспечивает постоянную стимуляцию SERCA1 и ее активность модулируется уровнем экспрессии сарколипина (Odermatt et al., 1998).
Кроме того, известно, что функционирование Са-АТФазы в мембранах CP определенным образом синхронизовано с работой Са-каналов CP, несмотря на то что, эти белки локализованы в разных, пространственно удаленных друг от друга компартментах СР. Так было обнаружено, что при активации Са-каналов CP наблюдаются значительные изменения конформации молекулы Са-АТФазы, которая, вероятно, получает определенный сигнал из терминальных цистерн (Meszaros, Ikemoto, 1985). Наиболее вероятными кандидатами, участвующими в передаче такого сигнала из терминальных цистерн CP (где находятся Са-каналы) на продолговатые трубочки CP (где в основном локализована Са-АТФаза), это 63 кДа Са-связывающий белок кальсеквестрин, 55 кДа кальретикулин, 53 кДа гликопротеин и саркалюменин.
Активность Са-АТФазы CP может модулироваться протеинкиназами и напрямую. Так, фосфорилирование Са-АТФазы сердца и медленных мышц Са/СаМ-зависимой протеинкиназой (СаМ KII) приводит к увеличению почти в два раза активности Са-АТФазы (Hawkins et al., 1994). Было установлено, что фосфорилирование Са-АТФазы происходит по Ser38 (Toyofuku et al., 1994). Кроме того, СаМ KII и цАМФ-зависимая протеинкиназы вовлечены в модуляцию выхода кальция через Са-каналы CP (Witcher et al., 1991; Strand et al., 1993; Hain et al., 1995). Показано, что СаМ KII также фосфорилирует триадин, который взаимодействует с Са-каналами CP и, возможно, модулирует их активность (Damiani et al., 1995, Damiani et al., 2000a). Недавно был идентифицирован а-Кар белок (молекулярная масса 25 кДа), который заякоривает СаМ КП на мембране CP скелетных мышц крысы. Этот белок является альтернативным некиназным продуктом гена мозговой а СаМ киназы (Bayer et al., 1998). При помощи антител к СаМ KII из мозга в быстрых скелетных мышцах кролика был идентифицирован белок (23 кДа), который служит специфическим субстратом эндогенной СаМ-ПК II. Предполагается, что этот белок является гомологом а-Кар белка из скелетных мышц крысы (Damiani et al., 20006).
В люмене CP также существует эндогенная система фосфорилирования (Shoshan-Barmatz, Ashley, 1998). В этом случае протеинкиназой, ответственной за фосфорилирование, является внутрилюменальная казеинкиназа II (Shoshan-Barmatz et al., 1996). Известно, что внутрилюменальная казеинкиназа фосфорилирует Са-связывающий белок CP кальсеквестрин (Cala et al., 1991), который имеет несколько участков фосфорилирования протеинкиназами и находится в CP в фосфорилированном состоянии (Cala et al., 1991). Ранее считалось, что фосфорилирование необходимо исключительно для нормальной посттрансляционной модификации (гликозилирования) этого белка и его доставки в терминальные цистерны СР. Однако мутантные формы кальсеквестрина, лишенные участков фосфорилирования, также обнаруживаются в терминальных цистернах (Herzog et al., 2000). Более того, установлено, что дефосфорилирование приблизительно 1 % фосфорилированого кальсеквестрина может быть достаточным для полумаксимальной активации Са-каналов CP (Szegedi et al., 1999; Herzog et al., 2000). Таким образом, фосфорилирование кальсеквестрина играет важнейшую роль в регуляции активности Са-каналов. Субстратами внутрилюменальной казеинкиназы также являются Са-связывающие белки CP саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок. Их фосфорилирование вызывает ингибирование активности Са-каналов (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). Было обнаружено, что АТФ, необходимая казеинкиназе II для фосфорилирования этих белков, транспортируется из цитоплазмы внутрь CP белком, который гомологичен потенциал-зависимому анионному каналу митохондрий (Shoshan-Barmatz et al., 1996). В более поздней работе в CP скелетных мышц был обнаружен 30 кДа кальсеквестрин-связывающий белок, который регулирует активность Са-каналов СР. Было установлено, что это АДР/АТР-транслоказа, которая экспрессируется в митохондриях (Yamaguchi, Kasai, 1998). При обработке CP антителами против АДФ/АТФ-транслоказы происходит активация выброса кальция из СР. Предполагается, что этот фермент экспрессируется в CP скелетных мышц кролика и регулирует выход Са2+ из CP (Yamaguchi, Kasai, 1998).
Активность Са-АТФазы также определяется свойствами липидного бислоя мембраны (Lee et al., 1995; Starling et al., 1995; Lee et al., 1998). Известно, что около 80% поверхности мембраны CP приходится на липиды, остальная часть занята белковыми компонентами (Inesi, 1972). Кроме того, показано, что около 80% от общего количества липидов в мембране CP составляют фосфолипиды, из них на долю фосфатидилхолина приходится 65-73%, фосфатидилэтаноламина - 12-19%, фосфатидилинозитола - -9%, фосфатидилсерина —2%, сфингомиелина —4% и кардиолипина - 0,10,3%- Остальную часть липидов составляют нейтральные жиры, в основном, холестерин, и небольшое количество триглицеридов (Tada et al., 1978). Около 63% жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов, являются ненасыщенными, из них 47% полиненасыщенные (Fiehn, Hasselbach, 1970).
Обработка саркоплазматического ретикулума фосфолипазами или экстракция липидов детергентами приводит к обратимой инактивации Са-АТФазы (Рэкер, 1979). Степень восстановления функциональных свойств фермента зависит от структуры и физического состояния фосфолипидов (Melgunov, Akimova, 1980). Для восстановления активности Са-АТФазы необходимо, чтобы с одной молекулой фермента было ассоциировано не менее 30 молекул фосфолипидов (De Meis, Inesi, 1982), которые относятся к анулярным липидам СР. Поскольку активность Са-АТФазы можно восстановить, используя не только фосфолипиды, но и различные неионные детергенты (Melgunov, Akimova, 1980), было высказано предположение, что липиды необходимы Са-АТФазе для создания гидрофобного окружения (Lee et al., 1995). Однако липиды играют не только структурную, но и регуляторную роль. Так, известно, что отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфотидилинозитол, фосфатидилсерин) способны активировать гидролиз АТФ и аккумуляцию кальция Са-АТФазой (Szymanska et al., 1991). Кроме того, было установлено, что активность Са-АТФазы зависит от толщины липидного бислоя и его структурного состояния (Lee et al., 1995; Starling et al., 1995). Показано, что активность Са-АТФазы значительно снижается, когда фосфолипиды находятся в гелевой фазе, а для максимальной активности Са-АТФазы необходимо, чтобы липиды находились в жидкой фазе (Starling et al., 1995). Какого-то единого механизма, объясняющего влияние фосфолипидов на функционирование Са-АТФазы не существует; в конечном итоге, изменение активности происходит в результате конформационных изменений фермента (Lee, 1998).
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ш.1. ЖИВОТНЫЕ
В работе использовались скелетные мышцы задних конечностей кроликов, крыс и сусликов. Возможность работы с тканями сусликов была любезно предоставлена Р.Х.Зиганшиным (Институт биоорганической химии РАН, Москва) и Ю.М.Кокозом (Институт биофизики клетки РАН, Пущино).
Взрослые суслики Spermophilus undulatus были отловлены в Якутии и содержались в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20-25°С, получая необходимый корм. Материал из летних активных сусликов был получен в июне-июле (температура тела животных 37°С). В зимний период одна группа животных (зимние негибернирующие) содержалась при температуре воздуха 20-25°С и длине светового дня 12 часов, такие суслики в спячку не впадали (температура тела 37°С). Остальные животные в ноябре были помещены в темное помещение при 2-4°С, и через несколько дней впали в спячку. Впоследствии (в январе-феврале) зимние гибернирующие спящие суслики были использованы для получения тканей во время оцепенения в середине баута (температура тела 2-5°С), зимние гибернирующие пробуждающиеся были декапитированы во время выхода из гибернационного баута (температура тела 10-15°С), зимние гибернирующие пробудившиеся были декапитированы в активный период между двумя гибернационными баутами (температура тела 37°С), а гибернирующие засыпающие животные были декапитированы во время вхождения в гибернационный баут (температура тела 10-15°С).
После декапитации скелетные мышцы задних конечностей освобождали от сухожилий и жировой ткани и замораживали в жидком азоте для транспортировки. Мышцы хранили в течение месяца при -70°С. Для проверки влияния замораживания на активность Са-АТФазы и белковый состав мембран CP аналогичной обработке были подвергнуты скелетные мышцы кроликов и крыс. Было установлено, что такая обработка не приводит к достоверным изменениям измеряемых параметров, поэтому в дальнейшем изложении данный вопрос специально не обсуждается.
1П.2. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
РЕТИКУЛУМА
Фрагменты CP получали из скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов методом дифференциального центрифугирования (Ритов и др., 1977) с некоторыми модификациями.
Перед выделением CP замороженные мышцы размораживали в ледяном физиологическом растворе и измельчали ножницами. Фарш помещали в 4-х кратный объем буфера, содержащего 0,3 М сахарозу и 10 мМ гистидин, рН 7,7, и гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе 3 раза по 1 мин с интервалами в 1 мин при 10000 об/мин.
Гомогенат центрифугировали 20 мин при 9000 об/мин (12000xg) на центрифуге "Beckman J2-21", ротор JA-14. Осадок отбрасывали, а супернатант фильтровали через 4 слоя марли, после чего центрифугировали 100 мин при 16000 об/мин (31000xg) на центрифуге "Beckman J2-21", ротор JA-20. Супернатант отбрасывали, осадок суспендировали в небольшом объеме раствора, содержащего 0,6 М КС1, 0,6 мг/мл БСА, 5 мМ гистидин, рН 7,2, и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера при 150 В 3 раза по 1 мин с интервалами в 1 мин. Объем суспензии доводили до 30 мл тем же раствором и инкубировали в течение 1 часа при 4°С при механическом перемешивании.
После этого суспензию центрифугировали 100 мин при 16000 об/мин (31000xg) на центрифуге "Beckman J2-21", ротор JA-20. Супернатант отбрасывали, осадок суспендировали в среде хранения, содержащей 0,25 М сахарозу и 25 мМ имидазол, рН 7,0, и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера вручную. Полученные препараты CP замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
1П.З. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА
Концентрацию белка в препаратах CP определяли по методу Лоури в присутствии 1% дезоксихолата натрия (Lowry et al., 1951). Для построения калибровочного графика использовали БСА. Оптическую плотность регистрировали на фотоколориметре "Specol-Ю" при длине волны 750 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
1П.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА
Для измерения содержания фосфолипидов в препаратах CP использовали метод минерализации с последующим определением неорганического фосфора (Bartlett, 1959). Для минерализации были использованы 100-160 мкг белка исследуемых препаратов CP животных. Пробы нагревали в 0,3 мл концентрированной серной кислоты при Т=150-200°С до момента, когда пробы приобретали коричневую окраску, затем в охлажденные пробы вносили 1-2 капли 36% пергидроля, после чего пробы светлели, и далее их нагревали 10-15 минут. Если же пробы в процессе нагревания вновь становились бурыми или желтоватыми, то процедура повторялась. После полного обесцвечивания пробы нейтрализовали гидроксидом калия, объем проб доводили до 5 мл и определяли неорганический фосфор по методу Бартлетта (Bartlett, 1959). Для построения калибровочной кривой использовали дигидрофосфат калия. Оптическую плотность регистрировали на фотоколориметре "Specol-10" при длине волны 830 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
1П.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Электрофорез проводили в пластине ПААГ толщиной 1,0 мм в присутствии додецилсульфата натрия по методу Лэммли при силе тока 20 мА в концентирующем геле и 40 мА в разделяющем геле (Laemmli, 1970), используя 3-20% градиентный разделяющий гель (Shorina et al., 1997). В качестве белков-маркеров для определения молекулярной массы белков CP использовали тяжелые цепи миозина (205 кДа), (3-галактозидазу (116кДа), фосфорилазу b (97 кДа), БСА (67 кДа), яичный альбумин (45 кДа), ингибитор трипсина (25 кДа), цитохром с (13 кДа). На каждую дорожку геля было внесено 30 мкг бежа СР. После электрофореза гели фиксировали и отмывали три раза в 25% этаноле и окрашивали карбоцианиновым красителем Stains All, в среде следующего состава: 25% этанол, 7,5% формамид, 0,0025% Stains All, 30 мМ трис рН 8,8, в течении 36-48 часов в темноте. После этого гели отмывали в 25% этаноле в темноте и сканировали при длине волны 595 нм на лазерном денситометре UltroScan XL (LKB, Швеция). Гели окончательно отмывали на свету от Stains-All и прокрашивали Кумасси R-250, затем после этого отмывали, используя стандартные процедуры, и сканировали гель при длине волны 595 нм на лазерном денситометре UltroScan XL (LKB, Швеция). Для подсчета площади пиков белков денситограммы обрабатывали с помощью программы GelScan XL (LKB, Швеция).
Предварительно была установлена линейность окрашивания белков CP красителями Stains All и Кумасси-Я250, для чего на дорожки геля было нанесено от 10 до 45 мкг белка СР. Гели после проведения электрофореза были окрашены Stains All и далее Кумасси-11250, согласно вышеописанным процедурам. После этого гели отсканировали, обработали площади пиков индивидуальных белков и построили кривую зависимости площади пиков индивидуальных белков при окрашивании каждым из красителей от содержания белка CP на дорожке геля. Было установлено, что эта зависимость имеет линейный характер при содержании 10-45 мкг белка CP на дорожке геля.
III.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФазной АКТИВНОСТИ В СОПРЯЖЕННОЙ СИСТЕМЕ
Для регистрации активности Са-АТФазы использовали метод непрерывной спектрофотометрической регистрации с использованием сопряженных ферментативных реакций (пируваткиназа + лактатдегидрогеназа). Метод основан на последовательно протекающих реакциях:
АТФ + Н20 АДФ + Фн (Mg-АТФаза, Са-АТФаза) АДФ + ФЕП —> АТФ + пируват (пируваткиназа) пируват + НАДН -» НАД + лактат (лактатдегидрогеназа) Последняя реакция приводит к убыли НАДН в эквимолярном соотношении к израсходованной в первой реакции АТФ и, соответственно, к уменьшению оптической плотности раствора при длине волны 340 нм.
Определение АТФазной активности проводили на спектрофотометре Hitachi-200-20 при длине волны 340 нм и температуре 37°С в среде следующего состава: 80 мМ КС1, 50 мМ MOPS, рН 7,0, 5 мМ
MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ ФЕП, 2,5 мМ АТФ, рН 7,0, 0,3 мг/мл НАДН, 5 ед. ПК, 10 ед. ЛДГ (Murphy, Anderson, 1983). В предварительных опытах были подобраны концентрации ПК и ЛДГ, не лимитирующие АТФазную реакцию. Реакцию начинали добавлением в пробу объемом 1 мл 10 мкг белка СР. При добавлении в пробу белка CP регистрируется лишь Mg-зависимый гидролиз АТФ. После этого добавляли Са2+ до конечной концентрации 1 мМ (коцентрация свободного ионизированного Са2+ в этом случае составляет 10-15 мкМ), что активирует Са-АТФазу, при этом Са2+ быстро накапливается в везикулах CP и ингибирует Са-АТФазу. Следовательно, в этом состоянии активность фермента определяется скоростью утечки Са2+ из везикул ретикулума. Для того, чтобы сделать л , мембраны CP полностью проницаемыми для Са и измерить "истинную" активность Са-АТФазы, в пробу добавляли 1-2 мкг кальциевого ионофора А23187 на 10 мкг белка СР. Активность Са-АТФазы расчитывали, вычитая из общей АТФазной активности активность Mg-АТФазы. При определении активности Са-АТФазы при разных концентрациях АТФ среда измерения активности содержала от 5 мкМ до 2 мМ АТФ.
IH.7. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА ПРИ ПОМОЩИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
В качестве флуоресцентных зондов в работе использовались пирен и АНС. АНС - гидрофобный отрицательно заряженный зонд, который взаимодействует с поверхностным слоем мембраны CP (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986). Места связывания имеют, по-видимому, как полярную, так и неполярную природу (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986).
Пирен - гидрофобный флуоресцентный зонд, который встраивается во внутреннюю часть мембраны. Флуоресценцией обладает как мономерная форма пирена (максимум возбуждения - 335 нм, линейчатый спектр флуоресценции с максимумами при 373-395 нм), так и его эксимер - димер, состоящий из одной возбужденной и одной невозбужденной молекул зонда, максимум флуоресценции которого наблюдается при 460470 нм (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986). Эксимеризация пирена зависит от микровязкости гидрофобной части бислоя и от доступного для пирена объема мембраны (так называемый гидрофобный объем). Поскольку спектр флуоресценции Са-АТФазы CP (максимум 336 нм) перекрывается с максимумом возбуждения пирена, для этой пары флуорофоров характерен так называемый индуктивно-резонансный безызлучательный перенос энергии, поэтому флуоресценцию пирена можно возбуждать также через белок Са-АТФазы при 285 нм. При этом получают информацию об аннулярном слое липидов, находящемся в непосредственной близости от гидрофобной зоны молекулы фермента (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986).
Измерения проводили в четырехугольной кювете на спектрофлуориметре Hitachi F-3000 (Япония). АНС (10-100 мкМ) добавляли к мембранам CP (0,2 мг/мл) в 10 мМ MOPS, рН 7,0. Флуоресценцию АНС возбуждали при 360 нм, измеряли при 480 нм (ширина щелей входного и выходного монохроматоров составляла 5 нм). Расчет значений кажущихся Кд и FMaKC для АНС проводили с помощью графика в координатах 1/F от концентрации АНС (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986). Флуоресценцию пирена возбуждали при 335 нм (собственная флуоресценция) и при 285 нм (вызванная флуоресценция) (ширина щели входного монохроматора составляла 5 нм) и регистрировали в области 350-470 нм (ширина щели выходного монохроматора составляла 1,5 нм). Среда для измерения флуоресценции содержала 10 мМ MOPS, рН 7,0, 100 мМ КС1, 0,5 мг/мл белка CP и 3-12 мкМ пирена. Степень эксимеризации пирена была рассчитана как соотношение интенсивности флуоресценции при 465 (эксимерная форма) и 373 нм (мономерная форма) при его концентрации в пробе 12 мкМ. Компьютерную обработку результатов проводили при помощи программы Biochemical Utilities, разработанной С.Н. Федосовым на кафедре биохимии биологического факультета МГУ. Статистическую обработку проводили с использованием программы Sigma Plot.
Ill 8. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ CP СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ ЭНДОГЕННЫМИ ПРОТЕИНКИНАЗАМИ
III.8.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ВКЛЮЧЕНИЯ ФОСФАТА В БЕЛКИ CP СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ
Фосфорилирование белков CP проводили в среде, содержащей 15 мМ трис-HCl, рН 7,0, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ MgCl2, 1мМ PMSF, 1 мг/мл белка CP и 1мМ [у-32Р]АТФ (300000 срм/нмоль) при температуре 30°С в течение 10 мин (Hawkins et al., 1994; Пелози, Донелла-Деана, 2000). Уровень включения определяли методом отбора проб (Муртазина, 1999). Фосфорилирование начинали добавлением [у-32Р] АТФ. Далее через определенные интервалы времени аликвоты среды инкубации отбирали и наносили на фильтры (18x18 мм) из хроматографической бумаги Whatman ЗММ (Великобритания). Фильтры сначала помещали в 12% раствор ТХУ, 10 мМ пирофосфат натрия, 10 мМ дигидрофосфат натрия на 20 мин, а затем отмывали 4-5 раз по 20 мин при перемешивании в 6 % растворе ТХУ. Отмытые фильтры высушивали при 60°С в течение 15 мин, помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и определяли их радиоактивность в "фосфорном канале" жидкостного сцинтилляционного счетчика "Rackbeta-1214"
LKB, Швеция). Уровень включения 32Р в препараты CP сусликов рассчитывали по формуле:
А-Б
В х Г нмоль 32Р/мг белка CP Где, А и Б - радиоактивность фильтров в опыте и в контроле (имп/мин), соответственно
В - радиоактивность 1 нмоль АТФ, имп/мин Г - количество CP в пробе, мг.
III.8.2. АВТОРАДИОГРАФИЯ
Регистрацию меченых белков в пластинах геля осуществляли методом авторадиографии. Для этого реакцию фосфорилирования останавливали добавлением буфера, содержащего ДДС натрия, используемого для приготовления образцов для проведения электрофореза. Разделение белков проводили при помощи электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС натрия. После проведения электрофореза гель фиксировали и проводили стандартные процедуры по окрашиванию геля красителем Кумасси R-250. После этого гель высушивали, накладывали на него рентгеновскую пленку фирмы FujiFilm (Япония) и экспонировали ее в течение 4-14 дней в темноте в морозильной камере при - 20°С. Экспозицию вели в специальной кассете. Затем пленку проявляли проявителями, предназначенными для получения максимально контрастного изображения.
IV.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
IV. 1. СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ СА-АТФАЗЫ И БЕЖОВОГО СОСТАВА МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СУСЛИКОВ, КРЫС И КРОЛИКОВ
На первом этапе работы была проведена сравнительная характеристика мембранных препаратов CP скелетных мышц летних активных сусликов и хорошо изученных мембранных препаратов CP скелетных мышц крыс и кроликов. Было установлено, что по выходу белка препараты CP этих животных практически не различаются (табл. 1). Содержание фосфолипидного фосфора, определяемое после минерализации образцов, было несколько выше в CP препаратов сусликов, чем CP препаратов крыс и кроликов (табл. 1) и составляло 0,81,1 мкмоль фосфора на 1 мг белка или 0,5-0,8 мг липида на 1 мг белка, что полностью соответствует данным литературы (Tada et al., 1978). Активность Са-АТФазы, основного белкового компонента мембран ретикулума, примерно в 2 раза ниже в препаратах CP сусликов, чем в препаратах CP крыс и кроликов, а активность Са-независимой Mg-АТФазы составила ~9, -12 и ~20% от общей АТФазной активности в препаратах CP кроликов, сусликов и крыс соответственно (табл. 1). Поскольку Mg-АТФаза присутствует в основном в мембраннах трубочек Т-системы (Rosemblatt, Scales, 1989), можно предположить, что полученные препараты CP содержат разное количество фрагментов этих трубочек или содержание Mg-АТФазы в мембранах Т-системы скелетных мышц исследумых животных существенно различается.
Одной из причин низкой активности Са-АТФазы может быть более низкое содержание Са-АТФазы в мембранах CP сусликов. Для проверки этого предположения был проведен электрофорез в ПААГ препаратов ретикулума всех трех видов животных (рис. 5).
Таблица 1. Выход белка, содержание фосфора фосфолипидов, активность Са-АТФазы и Mg-АТФазы в мембранах CP сусликов, крыс и кроликов. суслики (п=6) крысы (п=4) кролики (п=4) выход белка, мг/г ткани 0,94±0,06 0,72±0,12 1,17+0,17 содержание фосфора, мкмольФн/мг белка 1,03±0,07 0,84±0,02* 0,92±0,09 активность Са-АТФазы, мкмоль/мин на мг белка CP 5,9±0,3 11,4±1,9** 13,5±1,1** удельная активность Са-АТФазы, мкмоль/мин на мг Са-АТФазы 14,2±0,4 20,3±2,5** 24,3±2,2** активность Mg-АТФазы, мкмоль/мин на мг белка CP 0,7±0,1 1,5±0,5* 1,2±0,2*
В скобках указано количество используемых для анализа препаратов СР. Звездочками отмечены параметры, величина которых для CP крыс и кроликов достоверно отличается от величины параметра для CP сусликов. *р<0,1 **р<0,01
Действительно, было обнаружено, что содержание Са-АТФазы составляет 40-45% от общего белка в препаратах CP сусликов и 55-60% в препаратах CP крыс и кроликов (табл. 2). Тем не менее, удельная активность Са-АТФазы препаратов CP сусликов, рассчитанная с учетом процентного содержания фермента, в 1,5-1,7 раз ниже, чем удельная активность фермента в препаратах CP крыс и кроликов (табл. 1).
Кроме того, результаты электрофореза позволили выявить различия в содержании ряда других белков с молекулярными массами 450, 350, 205, 63, 55, 44 и 30 кДа в мембранах CP животных этих трех видов (рис. 5; табл. 2). Исходя из величины молекулярной массы, 450 кДа белок был идентифицирован нами как рианодиновый рецептор, а 350 кДа белок - как его протеолитический фрагмент (Sutko, Airey, 1996). В препаратах CP сусликов было обнаружено необычно высокое содержание белка с молекулярной массой 205 кДа (рис. 5), который по электрофоретической подвижности полностью соответствует тяжелым цепям миозина. Этот белок практически отсутствует в CP крыс и кроликов (рис. 5). Поскольку в скелетных мышцах CP тесно контактирует с белками сократительного аппарата (Zhou et al., 1997), можно заключить, что в мышцах сусликов эта связь наиболее прочна и даже обработка 0,6 М КС1 в процессе выделения не приводит к полному удалению миозина из препаратов СР. Белок с молекулярной массой 63 кДа был идентифицирован нами как кальсеквестрин, а белок с молекулярной массой 55 кДа, возможно, является другим Са-связывающим белком мембран CP, кальретикулином (Meldolesi, Pozzan, 1998; Mackrill, 1999). Содержание 44 и 30 кДа белков было близким в препаратах CP сусликов и крыс, но было достоверно ниже в препаратах CP кроликов (рис. 5; табл. 2).
Все эти белки можно идентифицировать, используя антитела к этим белкам, однако идентификацию Са-связывающих белков с достаточно высокой точностью можно провести при помощи анионного
Таблица 2. Содержание основных белков мембран CP сусликов, крыс и кроликов.
Белки CP суслики (п=6) крысы (п=4) кролики (п=4)
Прокрашивание Кумасси R-250
Са-АТФаза (105 кДа) 42,0±3,1 57,2±2,5* 55,7±0,8*
450 кДа белок 2,0±0,4 1,3±0,7 2,9±0,5
205 кДа белок 4,1 ±1,0 0,8±0,4* <0,1**
Богатый гистидином Са-связывающий белок (165, 155,170 кДа) 1,6±0,1 1,3±0,1 1,0±0Д**
Саркалюменин (130,145,160 кДа) 2,0±0,1 2,0±0,3 4,0±0,4**
Кальсеквестрин (63 кДа) 10,3±1Д 7,4±0,7 16,7±0,4**
55 кДа белок 5,7±0,8 3,7±0,6 4,7±1,1
44 кДа белок 5,7±1,3 4,6±0,4 1,1±0,3**
30 кДа белок 11,0±1,9 7,0±0,7 2,1 ±0,2**
Прокрашивание Stains All
Богатый гистидином Са-связывающий белок 100±9Д 89,5±5,1 115,8+10,5
Саркалюменин 100±6,4 133,3±14,1* 211,1±55,5**
Кальсеквестрин 100±5,0 70,1 ±4,5* 258,4±8,2**
При прокрашивании Кумасси R-250 содержание белков выражено в процентах от общего количества белка. При прокрашивании Stains All за 100% принято количество Са-связывающих белков в препаратах CP сусликов. р<0,05 **р<0,01 карбоцианинового красителя Stains All, окрашивающим большинство белков в красный цвет, а Са-связывающие белки и гликопротеины - в синий (Shoshan-Barmatz et al., 1996b). Известно, что этот краситель в CP кроликов окрашивает в синий цвет только три белка - кальсеквестрин (63 кДа), саркалюменин (160 кДа) и богатый гистидином Са-связывающий белок (170 кДа) (Millner et al., 1991; Shoshan-Barmatz et al., 1996b). Bee эти белки - гликопротеины, локализованы^ внутри CP и связывающие кальций с низким сродством (Кд~1 мМ); вероятно, они выполняют в полостях CP роль Са-буфера, снижая концентрацию ионизированного кальция. В исследуемых нами препаратах CP кроликов Stains All окрашивает также большую часть белков в красный цвет и только кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок - в синий (рис. 6).
Как и в препаратах CP скелетных мышц кроликов, в CP сусликов и крыс также содержится только три белка, окрашиваемые Stains All в синий цвет (рис. 6), которые мы идентифицировали как кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок. Содержание кальсеквестрина и саркалюменина практически одинаково в CP сусликов и крыс, а в CP кроликов этих белков в 2-2,5 раза больше (рис. 6; табл. 2). Содержание богатого гистидином Са-связывающего белка практически одинаково в препаратах CP животных всех трех видов. Аналогичные различия в количестве Са-связывающих белков обнаружены и после окрашивания гелей Кумасси R-250 (рис. 5; табл. 2). Интересно отметить, что кальсеквестрин в препаратах CP всех видов исследуемых животных имеет идентичную электрофоретическую подвижность и молекулярную массу 63 кДа (рис. 6), тогда как саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок имеют разную электрофоретическую подвижность и молекулярную массу в препаратах CP животных разных видов: 130, 145 и 160, и 165, 155 и 170 кДа соответственно в CP сусликов, крыс и кроликов (рис. 7). Можно предположить, что в CP скелетных мышц исследуемых нами животных присутствуют разные изоформы этих белков.
Поскольку активность Са-АТФазы существенным образом зависит от фосфолипидного состава и структурного состояния липидной фазы мембран CP (Lee, 1998), свойства поверхностного и внутреннего слоев мембраны CP этих трех видов животных были проанализированы с использованием флуоресцентных зондов АНС и пирена.
IV.2. СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ, КРЫС И КРОЛИКОВ ПРИ ПОМОЩИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
Используемый в нашей работе флуоресцентный зонд АНС является гидрофобным отрицательно заряженным зондом, который связывается с поверхностной частью мембраны как за счет гидрофобных, так и электростатических взаимодействий. Квантовый выход флуоресценции АНС в водном растворе крайне низок, а при его связывании с мембранами флуоресценция АНС резко увеличивается за счет перехода флуорофора в более гидрофобное структурированное окружение (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1983). Максимальный уровень флуоресценции определяется как числом участков связывания АНС на мембране, так и свойствами микроокружения мест связывания зонда. Как видно из таблицы 3, препараты CP сусликов обладают самым высоким сродством к АНС среди всех исследуемых препаратов, а максимальный уровень флуоресценции АНС, связанного с мембранами CP сусликов, в 1,5 и 3 раза ниже, чем зонда, связанного с мембранами CP крыс и кроликов соответственно. Таким образом, можно заключить, что число участков
Таблица 3. Параметры флуоресценции АНС и пирена в мембранах CP сусликов, крыс и кроликов. В скобках указано количество используемых для анализа препаратов СР. Звездочками отмечены параметры, величина которых для CP крыс и кроликов достоверно отличается от величины параметра для CP сусликов. суслики (п=6) крысы (п=4) кролики(п=4)
Кд для АНС, мкМ 29,1 ±2,7 37,4±2,0* 36,6±1,3**
FMaKC для АНС, у.е. 23,0±3,4 33,5±2,8* 62,3±1,3***
1ЛпДех=335нМ (общие липиды) 0,54±0,04 0,51 ±0,03 0,40±0,03*
1Дп Я-ех=285 нм (аннулярные липиды) 0,54±0,01 0,45±0,01 0,40±0,05**
В скобках указано количество используемых для анализа препаратов СР. Звездочками отмечены параметры, величина которых для CP зимних сусликов достоверно отличается от величины параметра для CP летних сусликов. IJIm- соотношение интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной форм пирена. р<0.1 ** р<0,05 ***р<0,01 связывания АНС на мембранах CP сусликов значительно меньше и/или микроокружение мест связывания АНС более гидрофильное, и мембрана CP сусликов имеет более отрицательный поверхностный заряд, чем мембрана CP крыс и кроликов.
Гидрофобный флуоресцентный зонд пирен встраивается во внутренние области фосфолипидного бислоя мембран СР. Этот зонд может образовывать эксимеры - димеры, состоящие из одной возбужденной и одной невозбужденной молекул пирена, максимум флуоресценции которых сдвинут в длинноволновую область (460-470 нм) по сравнению с максимумом флуоресценции мономеров (373-395 нм) (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1983). Степень эксимеризации зонда (соотношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров пирена) является диффузионно-контролируемым процессом и зависит от гидрофобного объема мембраны и ее микровязкости (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1983). Кроме того, в мембранах CP можно индуцировать флуоресценцию части молекул зонда, находящихся в непосредственной близости от гидрофобного домена Са-АТФазы в пределах радиуса Фостера, за счет индуктивно-резонансного переноса энергии с остатков триптофана на пирен при возбуждении флуоресценции остатков триптофана Са-АТФазы. Такая «вызванная флуоресценция» характеризует структурное состояние аннулярных липидов, непосредственно связанных с Са-АТФазой в мембране (Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1983).
Как видно из таблицы 3, степень эксимеризации пирена максимальна в мембранах CP сусликов и минимальна в мембранах CP кроликов. Поскольку соотношение фосфолипид: белок в этих препаратах практически одинаково (табл. 1), то, вероятнее всего, такие различия в степени эксимеризации пирена связаны не с разницей в гидрофобном объеме мембраны, а с низкой микровязкостью липидного бислоя мембран CP сусликов. Об этом же свидетельствуют значения степени эксимеризации пирена для аннулярного слоя липидов во всех исследуемых препаратах (табл. 3). Действительно, в летние месяцы суслики накапливают в разных тканях значительное количество полиненасыщенных жирных кислот, что является необходимым условием для выживания животных во время зимней спячки (Пантелеев, 1983; Калабухов, 1985). По-видимому, повышенное содержание полиненасыщенных жирных кислот является главной причиной низкой микровязкости гидрофобной области мембран CP сусликов.
Таким образом, полученные результаты показывают, что препараты CP скелетных мышц двух представителей отряда грызунов -сусликов S. undulatus и крыс - имеют близкий белковый состав (табл. 2; рис. 5), однако различаются по свойствам липидного бислоя (табл. 3) и по активности Са-АТФазы (табл. 1). Препараты CP скелетных мышц кроликов (отряд зайцеобразных) отличаются от них как по белковому составу, так и по свойствам липидного бислоя. В то же время удельная активность Са-АТФазы в препаратах CP крыс и кроликов практически одинакова. Можно предположить, что более низкая удельная активность Са-АТФазы в препаратах CP сусликов по сравнению с препаратами CP крыс и кроликов связана с видовыми особенностями изоформы фермента, представленной в скелетных мышцах этих животных. Однако нельзя исключить, что определенное влияние на активность Са-АТФазы оказывают свойства липидного бислоя и/или минорные белковые компоненты мембран СР.
Все исследуемые препараты CP различаются по содержанию основных Са-связывающих белков СР. Кроме того, Са-связывающие белки саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок, по-видимому, представлены в CP скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов разными изоформами, различающимися по электрофоретической подвижности (рис. 7). Поскольку эти белки являются гликопротеинами, различия в их электрофоретической подвижности могут быть связаны с разным составом входящих в них углеводных компонентов, однако нельзя исключить и видовые различия их белковой части. Важно отметить, что именно эти белки принимают непосредственное участие в регуляции функциональной активности Са-каналов CP: фосфорилирование саркалюменина и богатого гистидином Са-связывающего белка эндогенными протеинкиназами приводит к ингибированию Са-каналов (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). В регуляции активности Са-каналов CP участвуют также кальсеквестрин и кальсеквестрин-связывающий белок с молекулярной массой 30 кДа (Ikemoto et al., 1989; Kawasaki, Kasai, 1994). Возможно, присутствующий в значительном количестве в препаратах CP сусликов и крыс белок с молекулярной массой 30 к Да (табл. 2) является кальсеквестрин-связывающим белком.
Поскольку суслики являются типичными представителями гибернирующих млекопитающих, можно предположить, что некоторые особенности белкового состава мембран необходимы им для нормального функционирования скелетных мышц при низких температурах, поэтому, далее мы провели анализ сезонных изменений CP скелетных мышц сусликов.
IV.3. АНАЛИЗ СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ БЕЖОВОГО СОСТАВА МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ
Для своего исследования мы использовали летних активных сусликов, зимних сусликов на разных стадиях гибернации (спящих, пробуждающихся, пробудившихся, засыпающих) и зимних негибернирующих животных, которые содержались при комнатной температуре. Как видно из таблицы 4, исследуемые группы животных практически не различаются по выходу белка CP из ткани, а соотношение фосфолипид/белок в препаратах CP зимних сусликов достоверно ниже, чем в препаратах летних животных. По-видимому, это связано с уменьшением содержания фосфолипидов в мембранах CP во время гибернации при сохранении суммарного содержания в них белка.
Было обнаружено, что в зимний период значительно изменяется белковый состав мембран CP скелетных мышц сусликов (рис. 8). Происходит снижение содержания Са-АТФазы (105 кДа), саркалюменина (130 кДа), богатого гистидином Са-связываюгцего белка (165 кДа), кальсеквестрина (63 кДа) и увеличивается содержания белков с молекулярными массами 55, 30 и 24 кДа. Важно отметить, что изменения белкового состава CP наблюдаются в препаратах всех зимних сусликов, как гибернирующих, так и негибернирующих (рис. 8, табл. 5).
Для более детального анализа содержания Са-связывающих белков в препаратах CP гели прокрашивали Stains All. Во всех препаратах сусликов Са-связывающие белки: кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок имеют одинаковую подвижность и молекулярную массу 63 кДа, 130 кДа и 165 кДа соответственно (рис. 9). Но содержание этих белков значительно снижено в мембранах CP всех групп зимних сусликов (табл. 5; рис. 9), что хорошо согласуется с результатами, полученными после прокрашивания гелей Кумасси R-250 (табл. 5; рис. 8). Интересно отметить, что эти изменения наблюдаются в препаратах CP всех групп зимних сусликов, как гибернирующих, так и не впадавших в спячку.
Как видно из рисунков 9 и 10, в препаратах CP всех групп зимних сусликов помимо основных окрашиваемых в синий цвет белковых полос с молекулярными массами 130 и 165 кДа появляется дополнительная белковая полоса с молекулярной массой 125 кДа, которая может быть протеолитическим фрагментом саркалюменина. Кроме того, возможно, что этот 125 кДа белок - новая изоформа саркалюменина или богатого
Таблица 5. Содержание основных белков мембранных препаратов CP зимних и летних сусликов.
Белки CP Летние активные (п=6) Зимние негиберни рующие (п=3) Зимние гибернирующие
Пробудив шиеся (п=3) Пробуждающ иеся (п=7) Засыпаю щие (п=7) Спящие (п=8)
Прокрашивание Кумасси R-250
Са-АТФаза, 105 кДа 42,0±3,1 30,0±1,2** 31,3±3,8* 30Д±2,2*** 30,8±2,3** 29,4±2,8**
450кДа 2,0±0,4 1,0±0,4 1,5±0,2 1,6±0,4 1,4±0,3 0,6±0Д***
205 кДа 4Д±1,0 5,1±2,8 2,2±0,4 6,2±2,9 3,3±1,2 4,7±2,2
Богатый гистидином Са-связывающий белок, 165 кДа 1,6±0Д 0,6±0,3*** 0,6±0,2*** 1,0±0,2** 0,7±0Д*** 0,6±0Д***
Саркалюменин 130 кДа 2,0+0,1 0,8±0,3*** 0,9±0,3** 0,8±0,2*** 0,9±0,2*** 0,6±0Д***
Кальсеквестрин бЗкДа 10,3±1,1 3,0±0,3*** 2,8±0,7*** 4,8±1,3*** 3,8±0,6*** 3,3±0,5***
55 кДа белок 5,7±0,9 8,9±0,6** 9,2±0,8** 7,2±1,3 6,9±0,9 8,7±0,9**
ЗОкДа 10,5±1,9 15,0±0,9** 15,0±1Д* 14,9±1,8* 13,6+0,5* 17,0±0,9**
24 кДа • 4,6±1,6 12,4±2,7** 11,5±1,5** 9,3±2,3* 7,9+1,7 10,6±2,7*
Прокрашивание Stains All
Богатый гистидином Са-связывающий белок 100,0±9,1 36,7±4,7*** 35,6±6Д*** 31,7±6,0*** 44,2±3,8*** 39,8±6,7***
Саркалюменин 100,0±6,4 33,4±5,4*** 35,7±8,1*** 35,0±6,7*** 50,8±2,4*** 39,9±4,8***
Кальсеквестрин 100,0±5,0 21,2±4,5*** 22,7±5,2*** 33,7±6Д*** 39,2±5Д*** 28,7±2,8***
При прокрашивании Кумасси R-250, содержание белков выражено в процентах от общего количества белка. При прокрашивании Stains All за 100% принято количество Са-связывающих белков в препаратах CP летних активных сусликов. *р<0,1, **р<0,05, ***р<0,01
165 кДа 125 кДа 130 кДа /
Рис. 10. Денситограммы белков мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц летних активных (1), зимних негибернирующих (2), зимних гибернирующих спящих (3) и зимних гибернирующих пробудившихся (4) сусликов, полученные после прокрашивания гелей Stains All, в диапазоне молекулярных масс 100-200 кДа. гистидином Са-связывающего белка, которая синтезируется в зимний период в скелетных мышцах сусликов.
Необходимо отметить, что кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок, принимают непосредственное участие в регуляции функционирования Са-каналов CP (Ikemoto et al., 1989; Kawasaki, Kasai, 1994; Shoshan-Barmatz et al., 1996; Mackrill, 1999). Кальсеквестрин контактирует с рианодиновыми рецепторами, обеспечивая поддержание высокой концентрации кальция около внутривезикулярного домена молекулы Са-канала, а его удаление нарушает процесс освобождения кальция из ретикулума (Mackrill, 1999). Реассоциация кальсеквестрина и рианодинового рецептора восстанавливает свойства Са-канала. Саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок, вероятно, также контактируют с молекулой рианодинового рецептора; кроме того, фосфорилирование этих белков эндогенными протенкиназами ингибирует активность Са-каналов CP кролика (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). Поскольку содержание всех этих Са-связывающих белков и самих Са-каналов значительно снижается в ретикулуме спящих сусликов (табл. 5), можно предположить, что это является одним из механизмов изменения функциональной активности Са-каналов CP скелетных мышц сусликов во время спячки.
Как уже было сказано выше, в зимний период в CP сусликов повышается содержание 55 кДа, 30 кДа и 24 кДа белков (табл. 5). Существует несколько белков CP с подобными молекулярными массами. Предполагается, что 55 кДа белок - это Са-связывающий белок кальретикулин. Известно, что на ранней стадии развития мышечных волокон кальретикулин является основным Са-связывающим белком мембран CP, который в зрелых миотрубочках замещается Са-связывающим белком кальсеквестрином (Koyabu et al., 1994). Так как в зимний период в результате снижения двигательной активности наблюдается значительная атрофия скелетной мускулатуры сусликов (Agostini et al., 1991; Wickler et al., 1991), можно предположить, что в мембранах CP этот процесс сопровождается обратным замещением кальсеквестрина на кальретикулин. Также известно, что в гладких мышцах Са-связывающий белок кальретикулин модулирует активность Са-АТФазы CP (Krause, Michalak, 1997). Было показано, что он взаимодействует с гликозилированным участком Са-АТФы CP и ингибирует ее активность (John et al., 1998).
В мембранах CP скелетных мышц присутствует несколько белков с молекулярной массой около 30 кДа; один из них - 30 кДа кальсеквестрин-связывающий белок, который, как предполагается, модулирует активность Са-каналов CP (Yamaguchi et al., 1995). Так, было обнаружено, что 4, 4'-диизотиоциано-2, 2'-стильбендисульфонат (DIDS) активирует Са-каналы CP скелетных мышц кроликов, при этом DIDS взаимодействует именно с 30 кДа кальсеквестрин-связывающим белком, а не с Са-каналами СР. В дальнейшем было обнаружено, что этот 30 кДа белок - АДФ/АТФ-транслоказа, которая, как предполагается, экспрессируется в CP (Yamaguchi, Kasai, 1998). Кроме того, в CP скелетных мышц кролика был обнаружен 35 кДа белок, который является потенциалзависимым анионным каналом (Shoshan-Barmatz et al., 1996). Предполагается, что этот канал транспортирует внутрь CP АТФ, которая служит субстратом для фосфорилирования саркалюменина и, возможно, других белков СР.
Природа 24 кДа белка также неясна. Близкую молекулярную массу имеет 22 кДа Са-связывающий белок CP - сорцин, который ингибирует активность Са-каналов CP в сердечной мышце, взаимодействуя с цитоплазматическим доменом этих белков (Meyers et al., 1995; Lokuta et al., 1997). Показано, что фосфорилирование сорцина протеинкиназой А приводит к значительному снижению его ингибиторного влияния на Са-каналы CP (Lokuta et al., 1997). Кроме этого, молекулярную массу 23-25 кДа имеет ос-Кар белок, заякоривающий Са/СаМ-зависимую протеинкиназу на CP (Bayer et al., 1998; Damiani et al., 20006), а также 2526 кДа белок джанктин, который заякоривает Са-связывающий белок кальсеквестрин на Са-каналы CP, обеспечивая таким образом поддержание высокой концентрации кальция около внутривезикулярного домена Са-каналов (Kagari et al., 1996).
Таким образом, при переходе к зимнему периоду в мембранах CP скелетных мышц сусликов происходят значительные изменения белкового состава. Поскольку в мембранах CP меняется содержание основных Са-связывающих белков, регулирующих работу Са-каналов и Са-АТФазы CP, можно полагать, что активность ключевых компонентов CP - Са-каналов и Са-АТФазы существенно меняется. Поскольку аналогичные изменения наблюдаются в зимний период и у незасыпавших сусликов, можно заключить, что полученные результаты свидетельствуют об эволюционно закрепившихся сезонных изменениях, которые проявляются в зимний период независимо от того, впадает ли в спячку животное или нет.
IV.4. АНАЛИЗ СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ АКТИВНОСТИ Са-АТФазы САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ
МЫШЦ СУСЛИКОВ
Было установлено, что удельная активность Са-АТФазы примерно в 1,5-2 раза ниже в препаратах CP всех групп зимних сусликов, чем в препаратах CP летних животных (табл. 5). Более того, при изучении кинетических параметров Са-АТФазы CP были обнаружены существенные различия зависимости активности Са-АТФазы от концентрации АТФ у летних и зимних животных (рис. 11). У летних сусликов она имеет вид кривой с промежуточным плато, которую невозможно описать уравнением Михаэлиса-Ментен, так как в области высоких концентраций АТФ (0,5-1,0 мМ) наблюдается дополнительная активация фермента (рис. 11). Подобная негиперболическая зависимость активности фермента от концентрации АТФ характерна для Са-АТФазы CP большинства животных (Yamamoto, Tonomura, 1967), а также для других АТФаз Р-типа: Иа,К-АТФазы (Post et al., 1972) и Н, К-АТФазы (Wallmark et al., 1980).
Такой тип зависимости может быть удовлетворительно описан суммой гиперболы и сигмоиды (Рубцов, 1981). В нашей лаборатории была предложена кинетическая модель, которая позволяет объяснить такую зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ (Рубцов, 1981). Предполагается, что при низких концентрациях АТФ (до 100 мкМ) работают только мономеры Са-АТФазы, которые обладают высоким сродством к АТФ (в нашем случае Км = 20,8 мкМ) и гидролизуют АТФ согласно кинетике Михаэлиса-Ментен. При высоких концентрациях АТФ происходит кооперативное насыщение активных центров олигомеров Са-АТФазы, которые обладают низким сродством к АТФ (в нашем случае Кн = 620 мкМ), что приводит к дополнительной активации фермента, и зависимость активности приобретает сигмоидальный характер (Рубцов, 1981). Как видно из рис. 11, в препаратах CP зимних спящих животных зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ имеет форму гиперболы и описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, с Км для АТФ равной 36 мкМ. Важно отметить, что такая гиперболическая зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ была характерна для всех групп зимних сусликов, что свидетельствует о сезонном характере наблюдаемых изменений кинетических параметров Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов. Поскольку в зимний период происходит значительное снижение двигательной активности животного, можно предположить, что в скелетных мышцах в этот период работает в основном мономерная форма Са-АТФазы, которая обладает меньшей активностью.
Известно также, что активность Са-АТФазы CP может изменяться в результате взаимодействия Са-АТФазы с другими цитоплазматическими белками и белками СР. Так, в гладких мышцах 55 кДа Са-связывающий белок кальретикулин взаимодействует с Са-АТФазой CP и ингибирует ее активность (Krause, Michalak, 1997). Мы обнаружили значительное увеличение содержания 55 кДа белка, предположительно кальретикулина, в CP скелетных мышц сусликов в зимний период. Возможно, увеличение содержания этого белка в зимний период в CP скелетных мышц сусликов может вызывать снижение активности Са-АТФазы.
Поскольку известно, что активность Са-АТФазы зависит от свойств липидного бислоя мембраны CP (Starling et al., 1995; Lee et al, 1998), мы исследовали свойства липидного бислоя препаратов CP летних и зимних сусликов при помощи флуоресцентных зондов.
IV.5. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СУСЛИКОВ ПРИ ПОМОЩИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
Было установлено, что константа диссоциации (Кд) и максимальная флуоресценция (FMaKC) отрицательно заряженного гидрофобного зонда АНС практически одинаковы во всех исследуемых мембранных препаратах CP сусликов. Только в препаратах CP зимних спящих сусликов константа диссоциации АНС существенно ниже, чем в препаратах CP летних активных животных (табл. 6), что говорит о более высоком сродстве мембранных препаратов CP зимних спящих сусликов к АНС. Это позволяет предположить, что участки связывания АНС на
Таблица 6. Параметры флуоресценции АНС и пирена в мембранах CP скелетных мышц сусликов.
Летние активные (п=6) Зимние негибернир ующие (п=3) Зимние гибернирующие
Пробудивш иеся (п=3) Пробуждаю щиеся (п=7) Засыпаю щие (п=7) Спящие (п=8)
Кд для АНС, мкМ 29,1 ±2,7 32,3±4,1 30,0±2,2 33,0+1,4 32,4±1,8 21,3±1,6**
Рмакс ДЛЯ АНС, у.е. 23,0±3,4 21,4±3,0 24,5±5,4 19,7+3,1 25,1±2,6 19,2±2,0
1еАтъ XeX=335HM 0,54±0,04 0,60±0,06 0,60±0,05 0,55±0,07 0,41 ±0,04** 0,50±0,01
1еЯт, Хех=285 НМ 0,54±0,02 0,62±0,05 0,63±0,06 0,61±0,03 0,45±0,03* 0,44±0,01***
В скобках указано количество используемых для анализа препаратов СР. Звездочками отмечены параметры, величина которых для CP зимних сусликов достоверно отличается от величины параметра для CP летних сусликов. /е//т- соотношение интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной форм пирена. р<0,1 р<0,05 р<0,01 мембранах CP спящих сусликов имеют более гидрофобную природу и/или более положительно заряжены, что может быть связано с особенностями белкового и липидного состава мембран СР. Поскольку препараты CP всех зимних сусликов имеют близкий белковый состав (табл. 5), скорее всего, обнаруженные отличия в сродстве к АНС препаратов CP спящих сусликов объясняются особенностями липидного состава мембран CP этих животных.
При исследовании степени эксимеризации гидрофобного зонда пирена в мембранах CP летних и зимних сусликов значительных различий обнаружено не было. Исключением являются препараты CP зимних спящих и засыпающих животных, где степень эксимеризации пирена, как для общих так и для аннулярных липидов, достоверно ниже, чем в мембранах CP летних сусликов (табл. 6). Это говорит о том, что эти препараты обладают большей микровязкостью и/или большим гидрофобным объемом, чем препараты CP летних животных. Как видно из таблицы 4, мембранные препараты CP всех зимних сусликов содержат практически одинаковое количество фосфолипидов, которое значительно меньше, чем содержание фосфолипидов в препаратах CP летних активных сусликов. По-видимому, мембраны CP всех зимних сусликов обладают меньшим гидрофобным объемом, чем мембраны CP летних активных животных. Следовательно, более низкая степень эксимеризации пирена в мембранах CP спящих и засыпающих животных объясняется не большим гидрофобным объемом, а большей микровязкостью мембран CP спящих и засыпающих сусликов. Так как снижение активности Са-АТФазы наблюдаются в препаратах CP всех групп зимних животных, то некоторые наблюдаемые изменения свойств липидного бислоя в препаратах CP спящих и засыпающих сусликов не могут объяснить причину снижения активности Са-АТФазы CP скелетных мышц всех групп зимних сусликов.
При изучении свойств другой ион-транспортирующей АТФазы -Na,K-ATOa3bi плазматических мембран скелетных мышц сусликов S. lateralis также были обнаружены изменения кинетических параметров этого фермента в зимний период, аналогичные тем, что описаны в настоящей работе для Са-АТФазы CP скелетных мышц зимних сусликов S. undulatus. Так, было обнаружено снижение активности ИаД-АТФазы скелетных мышц зимних спящих сусликов в 2-3 раза (MacDonald, Storey, 1999). Более того, зависимость Na,К-АТФазы зимних спящих животных от концентрации АТФ имела вид обычной гиперболы, в то время как фермент летних активных сусликов, также как и большинства других животных, - кривой с промежуточным плато. Поскольку показано, что при обработке гомогенатов скелетных мышц зимних спящих сусликов протеинфосфатазами происходит восстановление активности Ка,К-АТФазы, предполагается, что причиной снижения активности этого фермента является его фосфорилирование протеинкиназами (MacDonald, Storey, 1999).
В настоящее время известно, что активность Са-АТФазы CP также может регулироваться протеинкиназами. Так, фосфорилирование Са-АТФазы CP сердца и медленных мышц Са/СаМ-зависимой протеинкиназой приводит к увеличению активности Са-АТФазы практически в 2 раза (Hawkins et al., 1994). Активность Са-АТФазы сердца и медленных мышц также может увеличивается в результате фосфорилирования протеинкиназой А и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой низкомолекулярного мембранного белка CP фосфоламбана (Simmerman et al., 1998). Поскольку изменение активности Са-АТФазы CP скелетных мышц может происходить в результате работы протеинкиназ, мы оценили эндогенную протеинкиназную активность в препаратах CP скелетных мышц сусликов S. undulatus и исследовали возможность регуляции активности Са-АТФазы CP эндогенными протеинкиназами.
IV.5. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ Са-АТФазы САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ ЭНДОГЕННЫМИ ПРОТЕИНКИНАЗАМИ.
Для изучения эндогенной протеинкиназной активности в препаратах CP скелетных мышц сусликов был измерен уровень включения меченого фосфата в белки CP летних активных и зимних спящих животных после инкубации препаратов CP в присутствии у[32Р]АТФ в условиях, стимулирующих протеинкиназную активность: 1 мМ АТФ, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF и 15 мМ Трис-HCl, рН 7,0, при 30°С в течение 10 минут (рис. 12). Важно отметить, что в этих условиях Са-АТФаза CP не работает, поскольку для ее активации в среде инкубации необходим кальций.
Мы обнаружили, что препараты CP скелетных мышц сусликов обладают достаточно высокой протеинкиназной активностью, максимальное включение фосфата в препараты CP сусликов составляет ~1 нмоль фосфата/на мг белка CP и наблюдается уже через 30 с инкубации препаратов CP (рис. 12). Включение фосфата в белки CP зимних спящих сусликов на 10-15% выше, чем в белки CP летних активных животных. Как видно из рисунка 12, уровень включения фосфата в белки CP снижается уже через 1-2 минуты инкубации препаратов CP и на десятой минуте инкубации составляет -85-90% от максимального значения включенного фосфата в препараты CP (рис. 12), возможно, это вызвано работой протеинфосфатаз, которые обращают действие протеинкиназ.
Было установлено, что инкубация препаратов CP в условиях, стимулирующих протеинкиназную активность в течение 30-60 с приводит к увеличению в 2-3 раза активности Са-АТФазы CP зимних спящих животных, но практически не влияет на фермент из скелетных мышц летних активных животных (рис. 13). Как видно из рисунка 13, увеличение активности Са-АТФазы носит временный характер, что, возможно, связанно с работой протеинфосфатаз, дефосфорилирующих белки СР. Это хорошо согласуется с данными по снижению включения фосфата в белки CP через 1-2 минуты инкубации препаратов CP (рис. 13). Можно предположить, что дефосфорилирование белков CP происходит в результате работы PP-1G протеинфосфататазы, связанной с мембранами CP скелетных мышц (Cohen, 1989). Было показано, что эта протеинфосфатаза взаимодействует с мембранами CP как через интегральные, так и периферические белки CP (Cohen, 1989).
Мы также исследовали какие белки CP скелетных мышц сусликов фосфорилируются при инкубации препаратов CP в среде, стимулирующей протеинкиназную активность в течение 1 мин. При анализе авторадиограммы было обнаружено, что включение фосфата происходит в целый ряд белков CP, но Са-АТФаза не является субстратом этих эндогенных протеинкиназ (рис. 14). Таким образом, можно заключить, что активация Са-АТФазы препаратов CP скелетных мышц зимних спящих сусликов при инкубации этих препаратов в условиях, стимулирующих эндогенную протеинкиназную активность, происходит в результате фосфорилирования других белков СР. Как видно из рисунка 14, спектр фосфорилируемых белков в препаратах CP летних активных и зимних спящих животных практически одинаковый, в тоже время наблюдаются некоторые отличия в уровне включения фосфата в индивидуальные белки CP (рис. 14). Так, в препаратах CP скелетных мышц летних сусликов лучше фосфорилируются высокомолекулярные белки 130,125 кДа и 66,40 кДа белки, а у зимних -низкомолекулярные 14, 25 и 30 кДа белки (рис. 14). В настоящей работе уже было показано, что молекулярную массу 130 кДа в CP скелетных мышц сусликов имеет Са-связывающий белок саркалюменин, фосфорилирование которого приводит к ингибированию Са-каналов CP (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). Кроме того, предполагается, что он может
205 кДа
165 к Да -130 кДа
Са-АТФаза
67 к Да - Н КС .
55 кДэ" 43 кДа - 40 кДа *
30 к Да - — 30 кДа -14 кДа-
Рис. 14. Фосфорилирование белков CP скелетных мышц летних активных (А) и зимних спящих (Б) сусликов. Дорожки 1 и 3 -электрофореграмма, полученная после прокрашивания геля Кумасси R-250. На каждую дорожку геля было нанесено 30 |ir белка CP летнего активного (1) и зимнего спящего (3) животных. Дорожки 2 и 4 - авторадиограмма этого геля: 2 - препаратов CP летнего активного и 4 - препаратов CP зимнего спящего сусликов. Препараты предварительно инкубировались в среде следующего состава: 1 мМ АТФ, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, Трис-HCl, рН 7,0, при 30°С в течение 1мин. модулировать активность Са-АТФазы CP (Leberer et al., 1990). Фосфорилированная белковая полоса с молекулярной массой 66 кДа может быть рм-изоформой Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, которая раннее была обнаружена в CP скелетных мышц крысы, где ее молекулярная масса составляла -70 кДа (Bayer et al., 1998). Поскольку препараты CP были изолированы из смешанных скелетных мышц сусликов, состоящих как из быстрых, так и из медленных волокон, то можно предположить, что низкомолекулярные белки - 14, 25 и 30 кДа соответствуют по молекулярной массе димеру, тетрамеру и пентамеру 6 кДа белка фосфоламбана, который присутствует в основном в мембранах CP медленных скелетных мышц и сердца (Simmerman, Jones, 1998). Так как, известно, что фосфорилирование этого белка протеинкиназой А и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой в CP сердца и медленных скелетных мышц приводит к значительной активации Са-АТФазы CP (Simmerman, Jones, 1998), возможно, наблюдаемая нами активация Са-АТФазы в препаратах CP скелетных мышц зимних спящих сусликов происходила именно в результате фосфорилирования этого белка. В тоже время в препаратах CP мы не обнаружили маркера медленных скелетных мышц -так называемой "медленной" сердечной изоформы кальсеквестрина (М. м. = 55 кДа), которая всегда присутствует в препаратах CP медленных мышц кролика совместно с "быстрой" изоформой кальсеквестрина (М. м. = 63 кДа), и также, как и "быстрая" изоформа кальсеквестрина, окрашивается в синий цвет красителем Stains All (Milner et al., 1991; Пелози, Донелла-Деана, 2000). Кроме того, в настоящее время, показано, что в мембранах CP медленных скелетных мышц крыс нет фосфоламбана (Damiani et al., 2000а). Так как мы показали в этой работе, что препараты CP скелетных мышц крыс и сусликов очень близки по белковому составу, то существует большая вероятность, что в препаратах CP скелетных мышц сусликов, как и в препаратах CP скелетных мышц крыс, нет фосфоламбана, и эти низкомолекулярные белки представлены какими-то другими белками. Например, молекулярную массу 25 кДа имеет а-Кар белок, который заякоривает Са/СаМ-зависимую протеинкиназу на мембране CP скелетных мышц крысы, и, как предполагается, является субстратом этой протеинкиназы (Bayer et al., 1998).
Хотя мы и не обнаружили существенных различий в спектре фосфорилированных бежов, а также в уровне их фосфорилирования в препаратах CP скелетных мышц летних и зимних сусликов (рис. 13, рис. 14), тем не менее, известно, что даже незначительное изменение уровня фосфорилирования некоторых регуляторных белков может приводить к существенному изменению активности модулируемых ими белков. Так, показано, что дефосфорилирование даже 1% кальсеквестрина достаточно для полумаксимальной активации Са-каналов CP (Szegedi et al., 1999; Herzog et al., 2000). Таким образом, для решения вопроса -фосфорилирование какого белка CP модулирует активность Са-АТФазы CP препаратов CP скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus необходим дальнейший детальный анализ фосфорилированных белков препаратов CP и изучение влияния фосфорилирования конкретных белков на активность Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов.
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проделанная нами экспериментальная работа позволяет сделать несколько заключений и высказать ряд предположений. Во-первых, сравнительный анализ свойств препаратов CP скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов выявил ряд особенностей препаратов CP сусликов. Так, удельная активность Са-АТФазы в препаратах CP скелетных мышц сусликов существенно ниже, чем удельная активность фермента в CP крыс и кроликов, хотя по белковому составу препараты CP сусликов и крыс достаточно близки. В отличие от препаратов CP скелетных мышц кроликов они характеризуются относительно низким содержанием кальсеквестрина и высоким содержанием низкомолекулярных белковых компонентов. В то же время препараты CP сусликов значительно отличаются по свойствам липидного бислоя от препаратов CP как крыс, так и кроликов, что видно из достоверных различий параметров флуоресценции связанных с мембранами гидрофобных зондов. Можно предположить, что более низкая удельная активность Са-АТФазы в препаратах CP сусликов по сравнению с препаратами CP крыс и кроликов связана с видовыми особенностями изоформы фермента, представленной в скелетных мышцах этих животных. Однако нельзя исключить, что определенное влияние на активность Са-АТФазы оказывают свойства липидного бислоя и/или минорные белковые компоненты мембран СР.
Важно отметить, что Са-связывающие белки - саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок мембран CP скелетных мышц сусликов представлены изоформами, которые отличаются по молекулярной массе от аналогичных белков CP скелетных мышц негибернирующих животных - крыс и кроликов. Кроме того, содержание этих белков, а также Са-связывающего белка кальсеквестрина несколько различно в препаратах ретикулума этих трех видов животных. Известно, что именно эти белки принимают непосредственное участие в регуляции функциональной активности Са-каналов CP (Ikemoto et al., 1989; Kawasaki, Kasai, 1994; Orr, Shoshan-Barmatz, 1996), а фосфорилирование саркалюменина и богатого гистидином Са-связывающего белка эндогенными протеинкиназами приводит к ингибированию Са-каналов (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). Более того, в настоящее время предполагается, что Са-связывающий белок саркалюменин также модулирует активность Са-АТФазы CP (Leberer et al., 1990).
При исследовании сезонных изменений CP скелетных мышц сусликов мы установили, что в зимний период содержание Са-связывающих белков кальсеквестрина, саркалюменина, богатого гистидином Са-связывающего белка в мембранах ретикулума скелетных мышц сусликов значительно снижается. Кроме того, в зимний период появляется дополнительная белковая полоса с молекулярной массой 125 кДа, которая, возможно, является протеолитическим фрагментом саркалюменина, а также может быть новой изоформой саркалюменина или богатого гистидином Са-связывающего белка. Необходимо отметить, что в зимний период изменение белкового состава мембран ретикулума сусликов наблюдалось у всех сусликов независимо от того, гибернирует ли животное или нет.
При исследовании кинетических параметров Са-АТФазы препаратов CP скелетных мышц сусликов было обнаружено значительное снижение активности этого фермента в зимний период. Более того, в зимний период зависимость активности Са-АТФазы CP от концентрации АТФ имеет вид гиперболы, а дополнительная активация фермента высокими концентрациями АТФ, которая характерна для Са-АТФазы препаратов CP летних активных сусликов и большинства животных, у Са-АТФазы препаратов CP зимних сусликов отсутствует. Согласно предложенной в нашей лаборатории кинетической модели, описывающей работу Са-АТФазы, дополнительная активация фермента высокими концентрациями АТФ происходит благодаря работе олигомеров Са-АТФазы, обладающих низким сродством к АТФ (Рубцов, 1981). Поскольку в зимний период происходит значительное снижение двигательной активности животного, можно полагать, что в ретикулуме скелетных мышц в этот период работает в основном мономерная форма Са-АТФазы, которая обладает меньшей активностью.
Интересно, что в зимний период в CP скелетных мышц сусликов мы обнаружили значительное увеличение содержания 55 кДа белка, предположительно кальретикулина, который в гладких мышцах взаимодействуя с Са-АТФазой CP, ингибирует ее активность (Krause, Michalak, 1997). Возможно, увеличение содержания этого белка в зимний период в CP скелетных мышц сусликов может приводить к снижение активности Са-АТФазы.
Мы также оценили эндогенную протеинкиназную активность в препаратах CP скелетных мышц сусликов S. undulatus и исследовали возможность регуляции активности Са-АТФазы CP эндогенными протеинкиназами, так как известно, что Са-АТФаза CP скелетных мышц регулируется протеинкиназами (Hawkins et al., 1994; Simmerman, Jones, 1998). Мы показали, что препараты CP скелетных мышц сусликов обладают достаточно высокой эндогенной протеинкиназной активностью, при стимуляции которой в препаратах CP скелетных мышц сусликов включается до 1 нмоль фосфата на 1 мг белка СР. При этом уровень включения фосфата в препаратах CP зимних спящих сусликов на -15% выше, чем в препаратах CP летних активных сусликов. Было обнаружено, что активация эндогенных протеинкиназ в препаратах CP скелетных мышц сусликов приводит к увеличению активности Са-АТФазы CP зимних спящих сусликов в 2-3 раза и не оказывает влияния на активность Са-АТФазы CP летних активных сусликов. Поскольку субстратами этих протеинкиназ являются белки
CP, но не Са-АТФаза, можно заключить, что фосфорилирование других белков CP отвечает за увеличение активности Са-АТФазы CP скелетных мышц зимних спящих сусликов.
Хотя мы и не обнаружили существенных различий в спектре фосфорилированных белков, а также в уровне их фосфорилирования в препаратах CP скелетных мышц летних и зимних сусликов, тем не менее, известно, что даже незначительное изменение уровня фосфорилирования некоторых регуляторных белков может приводить к существенному изменению активности модулируемых ими белков (Szegedi et al., 1999; Herzog et al., 2000). В дальнейшем необходима идентификация фосфорилированных белков и изучение влияния их фосфорилирования протеинкиназами на активность Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов.
Таким образом, в зимний период в CP скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus меняется содержание основных Са-связывающих белков - регуляторов активности Са-каналов, а также содержание и активность Са-АТФазы. Это свидетельствует о том, что функциональная активность CP скелетных мышц сусликов меняется в зимний период. Так как изменения активности Са-АТФазы и белкового состава мембран CP скелетных мышц сусликов, происходят также и у незасыпавших зимних животных, можно заключить, что наблюдаемые изменения носят сезонный характер. Поскольку препараты CP скелетных мышц сусликов обладают довольно высокой протеинкиназной активностью, стимуляция которой приводит к активации Са-АТФазы CP зимних спящих сусликов, предполагается, что в зимний период в скелетных мышцах именно протеинкиназы играют основную роль в модуляции работы Са-АТФазы CP и функциональной активности ретикулума в целом.
VI. в ы в о д ы
1. Саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок CP скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus отличаются по электрофоретической подвижности от аналогичных белков CP скелетных мышц крыс и кроликов. В зимний период содержание этих белков и Са-связывающего белка кальсеквестрина в CP скелетных мышц сусликов снижается в 2-4 раза.
2. Удельная активность Са-АТФазы препаратов CP скелетных мышц сусликов в зимний период снижается в 1,5-2 раза.
3. Зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ в препаратах CP летних сусликов имеет вид кривой с промежуточным плато, тогда как в препаратах CP зимних животных - гиперболы.
4. Препараты CP скелетных мышц сусликов содержат эндогенные протеинкиназы, субстратами которых являются белки CP, но не Са-АТФаза. Тем не менее, активация эндогенных протеинкиназ приводит к увеличению активности Са-АТФазы CP зимних спящих животных в 2-3 раза, но не влияет на активность Са-АТФазы CP летних сусликов.
5. Поскольку Са-АТФаза препаратов CP скелетных мышц сусликов не фосфорилируется эндогенными протеинкиназами, можно заключить, что увеличение активности Са-АТФазы CP зимних спящих сусликов, наблюдаемое при активации эндогенных протеинкиназ, связано с фосфорилированием других белков СР.
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Белоусов А.Б. (1993) Роль центральной нервной системы в контроле зимней спячки. Успехи Физиол. Наук 24,109-127. Болдырев А.А., Рубцов A.M. (1982) Кооперативные свойства транспортных АТФаз. В книге «Регуляция функции ферментов», Москва, МГУ, 82-96.
Брустовецкий Н.Н., Гришина Е.В., Амерханов З.Г., Маевский Е.И. (1989) Интенсивность окислительного фосфорилирования и состояние аденилатной системы в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов Citellus undulatus. Жур. Эвол. Биох. Физиол. 25,448-453.
Брустовецкий Н.Н., Маевский Е.И., Гогвадзе В.Г. (1987) Возможные механизмы подавления окислительного метаболизма у зимнеспящих животных. Механизмы зимней спячки. Пущино, 32-39. Владимиров Ю.А, Добрецов Г.Е (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. Москва, «Наука», 267 стр. Жегунов Г.Ф., Вонг Л., Джордан М., Белке Д. (1993) Электрофизиологические параметры функционирования сердца и активность Са-насоса мембран саркоплазматического ретикулума миокарда сусликов и крыс во время длительной гипотермии. Физиол. Жур. Им. Сеченова 79, 73-81.
Иванов К.П. (1984) Физиология терморегуляции. Ленинград, «Наука», 157 стр.
Калабухов Н.И. (1985) Спячка млекопитающих. Москва, «Наука», 258 стр.
Кокоз Ю.М., Гриченко А.С., Корыстова А.Ф., Ланкина Д.А., Маркевич Н.И. (2000) Регуляция Са2+"каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных. Виол, мембраны 17, 217-222.
10. Лакович, Дж. (1986) Основы флуоресцентной спектроскопии. Москва, «Мир», 496 стр.
11. Лукоянова Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов Д.А., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Поддубная З.А. (1997а) Сезонные изменения состава и функциональных свойств миозиновых нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов Citellus undulatus. Росс. Физиол. Жур. им. Сеченова 83,143-150.
12. Лукоянова Н.А., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. (19976) Изучение АТФазных и регуляторных свойств миозина скелетных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки. Биофизика 42, 343-347.
13. Лукоянова Н.А., Малышев С.Л., Шпагина М.Д., Удальцов Д.А., Подлубная 3. А. (1998) Отсутствие сезонных адаптационных изменений в изоформном составе и функциональных свойствах белков актинсодержащих нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов. Биофизика 43,1134-1136.
14. Лукоянова Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. (1996) Изменения в структурной организации реконструированных нитей миозина из скелетных мышц зимоспящих сусликов Citellus undulatus во время пробуждения. Биофизика 41,116-121.
15. Львова С.П., Чубуркова С.С. (1983) Содержание гликогена и фосфорилазная активность в различных мышцах крыс и сусликов при гипотермии, самосогревании и зимней спячке. Укр. биохим. журн. 55, 39^4.
16. Муртазина Д. А. (1999) Исследование фосфорилирования Na,K-АТФазы протеинкиназой А. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 140 стр.
17. Пантелеев П.А. (1983) Биоэнергетика мелких млекопитающих: адаптация грызунов и насекомоядных к температурным условиям окружающей среды. Москва, «Наука», 271 стр.
18. Подлубная З.А. (1992) Ферменты в толстых нитях поперечнополосатых мышц позвоночных. Биохимия 57,1785-1814.
19. Пелози М., Донелла-Деана А. (2000) Локализация, очистка и характеристика кальмодулин-зависимой протеинкиназы, связанной с саркоплазматическим ретикулумом кролика. Биохимия 65, 309-320.
20. Ритов В.Б., Мелыунов В.И., Комаров П.Г., Алексеева О.Н., Акимова Е.И. (1977) Интегральные белки мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и карпа. Доклады АН СССР 233,727-733.
21. Рубцов А.М (1981) АТФ как субстрат и регулятор Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 116 стр.
22. Рубцов А.М., Батрукова М.А. (1997) Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия 62,1091-1105.
23. Рэкер Э. (1979) Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. Мир, Москва, 216 стр.
24. Соколов В.Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д.А. (1995) Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика, Citellus undulatus. Доклады Академии Наук 344,282-286.
25. Эмирбеков Э.З., Львова С.П. (1991) Энергетический метаболизм при гибернации у представителей разных филогенетических групп. Успехи Физиол. Наук 22,97-111.
26. Agostini, В., De Martino, L., Soltau, В., and Hasselbach, W. (1991) The modulation of calcium transport by skeletal muscles sarcoplasmic reticulum in the hibernating European hamster. Z. Naturforsch. 46c, 11091126.
27. Alekseev A. E., Markevich N. I., Korystova A. F., Lankina D. A., and Kokoz Yu. M. (1997) The kinetic characteristics of the L-type calcium channels in cardyocytes of hibernators. 1. Development of kinetic model. Membr. Cell Biol. 11, 31-44.
28. Alekseev A. E., Markevich N. I., Korystova A. F., Terzic A., and Kokoz Y. M. (1996) Comparative analysis of the kinetic characteristics of L-type calcium channels in cardiac cells of hibernators. Biophys. J. 70, 786-797.
29. Anderson K. W., and Murphy A. J. (1983) Alterations in the structure of the ribose moiety of ATP reduce its effectiveness as a substrate for the sarcoplasmic reticulum ATPase. J. Biol Chem. 258,14276-14278.
30. Barnes B. (1989) Freeze avoidance in mammal body temperatures below 0°C in arctic hibernator. Science 244,1593-1595.
31. Bartlett G. R. (1959) Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol Chem. 234,466-468.
32. Bayer K. U., Harbers K., and Schulman H. (1998) AlphaKAP is an anchoring protein for a novel CaM kinase II isoform in skeletal muscle. EMBO J. 17, 5598-5605.
33. Belke D. D., Pehowich D. J., and Wang L. С. H. (1987) Seasonal variation in calcium uptake by cardiac sarcoplasmic reticulum in a hibernator, the Richardson's ground squirrel. J. Therm. Biol 12, 5356.
34. Block B. A. (1994) Thermogenesis in muscle. Ann. Rev. Physiol. 56, 535-577.
35. Bronnikov G. E., Vinogradova S. O., and Mezentseva V. S. (1990) Changes in kinetics of ATP-synthase and in concentration of adenine nucleotides in ground squirrel liver mitochondria during hibernation. Сотр. Biochem. Physiol 97B, 411-415.
36. Brooks S. P. J., and Storey К. B. (1992) Mechanism of glycolytic control during hibernation in the ground squirrel Spermophilus lateralis. J. Сотр. Physiol. 162B, 23-28.
37. Burns K., and Michalak M. (1993) Interactions of calreticulin with proteins of the endoplasmic and sarcoplasmic reticulum membranes. FEBS Lett. 318,181-185.
38. Cala S. E., and Jonez L. R. (1991) Phosphorylation of cardiac and skeletal muscle calsequestrin isoforms by casein kinase II. Demonstration of cluster of unique rapidly phosphorylated sites in cardiac calsequestrin. J. Biol. Chem. 266, 391-398.
39. Callaway C., Seryshev A., Wang J. P., Slavik K. J., Needleman D. H., Cantu C. R., Wu Y., Jayaraman Т., Marks A. R., and Hamilton S. L. (1994) Localization and partial characterization of the oligomeric disulfide-linked molecular weight 95,000 protein (triadin) which binds the ryanodine and dihydropyridine receptors in skeletal muscle triadic vesicles. Biochemistry 30, 7507-7513.
40. Cohen P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Ann. Rev. Biochem. 58,453-508.
41. Coppolino M. G., and Dedhar S. (1998) Molecules in focus. Calreticulin. Int. J. Biochem. & Cell Biol. 30, 553-558.
42. Damiani E., Picello E., Saggin L. and Margreth A. (1995) Identification of triadin and of histidine-rich Ca2+-binding protein as substrates of 60 kDa calmodulin-dependent protein kinase in junctional terminal cisternae of sarcoplasmic reticulum of rabbit fast muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 209,457-465.
43. Damiani E., Sacchetto, and Margreth A. (2000a) Variation of phospholamban in slow-twitch muscle sarcoplasmic reticulum between mammalian species and a link to the substrate specificity of endogenous Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase. Biochim. Biophys. Acta 1464, 231-241.
44. Damiani E., Sacchetto, and Margreth A. (20006) Phosphorylation of anchoring protein by calmodulin protein kinase associated to the sarcoplasmic reticulum of rabbit fast-twitch muscle. Biochem. Biophys. Res. Com. 279,181-189.
45. De Foresta В., Chapeil P., and Le Maire M. (1990) Different classes of tryptophan residues involved in conformational changes characteristic of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase cycle. Eur. J. Biochem. 194, 383288.
46. De Meis L., and Inesi G. (1982) The transport of calcium by sarcoplasmic reticulum and various microsomal preparations. In: Membrane transport of calcium (Carafoli E., ed.). Academic Press, London, 22.
47. De Meis L., Wolosker H., and Engelender S. (1996) Regulation of the channel function of Ca-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1275, 105-110.
48. Dode L., Van Baelen K., Wuytack F., and Dean W. L. (2001) Low temperature molecular adaptation of the skeletal muscle sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase 1 (SERCA 1) in the wood frog СRana sylvatica). J. Biol. Chem. 276, 3911-3919.
49. El Hachimi Z., Tijuane M., Boissonnet G., Benjouad A., Desmadril M. and Yon J. M. (1990) Regulation of the skeletal muscle metabolism during hibernation of Jaculus orientalis. Сотр. Biochem. Physiol. 96B, 457-459.
50. Fahlman A., Storey J. M., and Storey К. B. (2000) Gene up-regulation in heart during mammalian hibernation. Cryobiology 40, 332-342.
51. Fedotcheva N. J., Sharyshev A. A., Mironova G. D., and Kondrashova M. N. (1985) Inhibition of succinate oxidation and K+ transport in mitochondria during hibernation. Сотр. Biochem. Physiol. 82B, 191-195.
52. Fiehn W., and Hasselbach W. (1970) The effect of phospholipase A on the calcium transport and the role of unsaturated fatty acids in ATPase activity of sarcoplasmic vesicles. Eur. J. Biochem. 154,7-14.
53. Fliegel L., Newton E., Burns K., and Michalak M. (1990) Molecular cloning of cDNA encoding a 55-kDa multifunctional thyroid hormone binding protein of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 265,15496-15502.
54. Frank G. L., and Storey К. B. (1996) The effect of total unsaturate content on hibernation. In: Adaptation to the Cold: Tenth International Hibernation Symposium (Geiser F., Hulbert A. J. & Nicol S. C., eds.). University of New England Press, Armidale, 211-216.
55. Franzini-Armstrong C., Kenney L. J., and Varriano-Marston E. (1987) The structure of calsequestrin in triads of vertebrate skeletal muscle: a deep-etch study. J. Cell. Biol. 105,49-56.
56. Froemming G. R., and Ohlendieck K. (1998) Oligomerisation of Ca2+-regulatory membrane components involved in the exitation-contraction-relaxation cycle during postnatal development of rabbit skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 1387, 226-238.
57. Gehnrich S. C., and Aprille J. R. (1988) Hepatic glyconeogenesis and mitochondrial function during hibernation. Сотр. Biochem. Physiol. 91B, 11-16.
58. Geiser F. (1988) Reduction of metabolism during hibernation and daily torpor in mammals and birds: temperature effect or physiological inhibition? J. Сотр. Physiol. 158B, 25-37.
59. Geiser F., and Ruf T. (1995) Hibernation versus daily torpor in mammals and birds. Physiological variables and classification of torpor patterns. Physiol. Zool. 68,935-966.
60. Guo W., Jorgensen A. O., Jones L. R., and Campbell K. P. (1996) Biochemical characterization and molecular cloning of cardiac triadin. J. Biol. Chem. 271,458-465.
61. Hain J., Onoue H., Mayrleitner M., Fleischer S., and Schindler H. (1995) Phosphorylation modulates the function of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle. J. Biol. Chem. 270, 20742081.
62. Hawkins C., Xu A., and Narayanan N. (1994) Sarcoplasmic reticulum calcium pump in cardiac and slow twitch skeletal muscle but not fast twitch skeletal muscle undergoes phosphorylation by endogenous Ca2+/Calmodulin - dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 269, 3119831206.
63. Heldmaier G., and Ruf T. (1992) Body temperature and metabolic rate during natural hypothermia in endoterms. J. Сотр. Physiol. 162B, 696706.
64. Heller H. C. (1979) In Hibernation: neural aspects. Ann. Rev. Physiol. 41, 305-321.
65. Herve J. C., Yamaoka K., Twist V. W., Powell Т., Ellory J. C., and Wang L. C. (1992) Temperature dependence of electrophysiological properties of guinea pig and ground squirrel myocytes. Am. J. Physiol. 263, 177-184.
66. Herzog A., Szegedi C., Jona I., Herberg F. W., and Varsanyi M. (2000) Surface plasmon resonance studies prove the interaction of skeletal muscle sarcoplasmic reticular Ca2+ release channel/ryanodine receptor with calsequestrin. FEBS Lett. 472, 73-77.
67. Ikemoto N., Antoniu В., Kang J. J., Meszaros L. G., and Ronjat M. (1991) Intravesicular calcium transient during calcium release from sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 30, 5230-5237.
68. Ikemoto N., Miyao A., and Kurobe Y. (1981) Further evidence for an oligomeric calcium pump by sarcoplasmic reticulum. J Biol. Chem. 256, 10809-10814.
69. Inesi N. (1972) Active transport of calcium ion in sarcoplasmic membranes. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1, 191-210.
70. Inesi G. (1985) Mechanism of calcium transport. Ann. Rev. Physiol. 47, 573-601.
71. Jansky L. (1990) Neuropeptides and the central regulation of body temperature during fever and hibernation. J Therm. Biol. 15, 329-347
72. John L. M., Lechleiter J. D., and Camacho P. (1998) Differential modulation of SERCA2 isoform by calreticulin. J. Cell Biol 142, 963-973.
73. Jorgensen A.O., Shen A. C. Y., Campbell K. P., and MacLennan D. H. (1983) Ultrastructural localization of calsequestrin in rat skeletal muscle by immunoferritin labeling of ultrathin frozen sections. J. Cell Biol. 97, 15731581.
74. Kagari Т., Yamaguchi N., and Kasai M (1996) Biochemical characterisation of calsequestrin-binding 30-kDa protein in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 700706.
75. Kawasaki Т., and Kasai M. (1994) Regulation of calcium channel in sarcoplasmic reticulum by calsequestrin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199,1120-1127.
76. Kokoz Yu. M., Grichenko A. S., Korystova A. F., Lankina D. A., and Markevich N. I. (1999) Effect of isoproterenol on the L-type Ca2+ current in cardiac cell from rats and hibernating ground squirrels. Biosci. Rep. 19, 17-25.
77. Kokoz Yu. M., Markevich N. I., Korystova A. F., Lankina D. A., and Alekseev A. E. (1997) The kinetic characteristics of the L-type calcium channels in cardiac cells of hibernators. 2. Analysis of the kinetic model. Membr. Cell Biol. 11, 213-234.
78. Kondo N. (1986) Excitation - contraction coupling in the myocardium of hibernating chipmunks. Experientia 42,1220-1222.
79. Kondo N. (1987) Identification of a pre-hibernating state in myocardium from nonhibernating chipmunks. Experientia 43, 873-875.
80. Kondo N. (1988) Comparison between effects of caffeine and ryanodine on electromechanical coupling in myocardium of hibernating chipmunks: role of internal Ca2+ stores. Br. Pharmacol. 95,1287-1291.
81. Kondo N., and Shibata S. (1984) Calcium source for excitation-contraction coupling in myocardium of nonhibernating and hibernating chipmunks. Science 225, 641-643.
82. Koyabu S., Imanaka-Yoshida K., Ioshi S. O., Nakano Т., and Yoshida T. (1994) Switching of the dominant calcium sequestering protein during skeletal muscle differentiation. Cell Motility & Cytoskeleton 29, 259-270.
83. Krause K., and Michalak M. (1997) Calreticulin. Cell 88,439-443.
84. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
85. Leberer E., Timms B. G., Campbell K. P., and MacLennan D. H. (1990) Purification, calcium binding properties, and ultrastructural localisation of the 53,000- and 160,000 (sarcalumenin)-dalton glycoproteins of the sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 265,10118-10124.
86. Lamb G. D. (2000) Excitation-contraction coupling in skeletal muscle: comparisons with cardiac muscle. Clin. Exp. Pharmacol Physiol 27, 216224.
87. Lee A. G. (1998) How lipids interact with an intrinsic membrane protein: the case of the calcium pump. Biochim. Biophys. Acta. 1376, 381-390.
88. Lee A. G., Dalton K. A., Duggleby R. C., East J. M., and Starling A. P. (1995) Lipid structure and Ca2+-ATPase function. Biosci. Rep. 15, 289298.
89. Lokuta A. J., Meyers M. В., Sander P. R., Fishmen G. I., and Valdivia H. H. (1997) Modulation of cardiac ryanodine receptors by sorcin. J. Biol. Chem. 272, 25333-25338.
90. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randall R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 195, 265-275.
91. Lyman C. P. (1982) Who is who among the hibernators. In: Hibernation and torpor in Mammals and Birds. (Lyman C. P., Willis J. S., Malan A., Wang L. С. H., eds.). Academic Press, New York, 12-31.
92. MacDonald J. A., and Storey К. B. (1999) Regulation of ground squirrel Na,K-ATPase activity by reversible phosphorylation during hibernation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254,424-429.
93. Mackrill J. J. (1999) Protein-protein interactions in intracellular Ca2+-release channel function. Biochem. J. 337, 345-361.
94. MacLennan D. H., Campbell K. P., and Reithmeier R. A. F. (1983) Calsequestrin. Calcium and Cell Function 4, 151-173.
95. MacLennan D. H., Ostwald T. J., and Steward P. S. (1974) Structural components of sarcoplasmic reticulum membrane. Ann. N. Y. Acad. Sci. 227,527-536.
96. MacLennan D. H., Rice W. J., and Green N. M. (1997) The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase. J. Biol. Chem. 246, 2702-2710.
97. Martonosi A. (1984) Mechanism of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Physiol. Rev. 64,1240-1320.
98. Meissner G., Coner G. E., and Fleischer S. (1973) Isolation of sarcoplasmic reticulum by zonal centrifugation and purification of Ca2+ pump and Ca2+- binding proteins. Biochim. Biophys. Acta 298, 246-269.
99. Meissner G., and Lu X. (1995) Dihydropyridine receptor-ryanodine receptor interactions in skeletal muscle excitation-contraction coupling. BiosciRep. 15, 399-408.
100. Meldolesi J., and Pozzan T. (1998) The endoplasmic reticulum Ca2+ store: a view from the lumen. TIBS 23,10-14.
101. Meldolesi J., Krause К. H., and Michalak M. (1996) Calreticulin: how many functions in how many cellular compartments? Cell Calcium 20, 8386.
102. Melgunov V. I., and Akimova E. I. (1980) On subunit structure of Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett. Ill, 197-200
103. Meszaros L. G., and Ikemoto N. (1985) Conformational changes of the Ca2+-ATPase as early events of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem. 260, 16076-16079.
104. Meyers M. В., Pickel V. M., Sheu S. S., Sharma V. K., Scotto K. W., and Fishman G. I. (1995) Association of sorcin with the cardiac ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 270,26411-26418.
105. Milner R. E., Michalak M., and Wang L. С. H. (1991) Altered properties of calsequestrin and the ryanodine receptor in the cardiac sarcoplasmic reticulum of hibernating mammals. Biochim. Biophys. Acta 1063, 120-128.
106. Mintz E., and Guillain F. (1997) Ca2+ transport by sarcoplasmic reticulum ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1318,52-70.
107. Moller J. V., Juul В., and Le Maire M. (1996) Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta 1286,1-51.
108. Morano, I., Adler, K., Agostini, В., and Hasselbach, W. (1992) Expression of myosin heavy and light chains and phosphorylation of the phosphorylatable myosin light chain in the heart ventricle of the European hamster during hibernation and in the summer. J. Muscle Res. Cell Motil. 13,64-70.
109. Moszydlowski F. G., and Fortes P. A. G. (1981) Inhibition of sodium and potassium adenosine triphosphatase by 2',3'-0-(2,4,6-trinitrocyclohexadienylidene) adenine nucleotides. Implications for the structure and mechanism of the Na,K pump. J Biol Chem. 256,2357-66.
110. Murray В. E., and Ohlendieck K. (1998) Complex formation between calsequestrin and the ryanodine receptor in fast- and slow-twitch rabbit skeletal muscle. FEBS Lett. 429, 317-322.
111. Nestler J. R., Peterson S. J., Smith B. D., HeathcockD. В., Johanson C. R., Sarthou J. C., and King J. G. (1996) Glycolytic enzyme binding during entrance to daily torpor in deer mice (Peromyscus maniculatus). In: Adaptation to the Cold: Tenth International Hibernation Symposium (Geiser F., Hulbert A. J. & Nicol S. C., eds.). University of New England Press, Armidale, 257-262.
112. Odermatt, A., Becker, S., Khanna, V.K., Kurzydlowski, K., Leisner, E., Pette, D., and MacLennan, D.H. (1998) Sarcolipin regulates the activity of SERCA1, the fast-twitch skeletal muscles sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. J. Biol. Chem. 273, 12360-12369.
113. Orr I., and Shoshan-Barmatz V. (1996) Modulation of the skeletal muscle ryanodine receptor by endogenous phosphorylation of 160/150-kDa proteins of the sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1283, 8088.
114. Pehowich D. J., and Wang L. С. H. (1984) Seasonal changes in mitochondrial succinate dehydrogenase activity in a hibernator, Spermophilus richardsonii. J.Сотр. Physiol. 154B, 495-501.
115. Picula S., Epstein L., and Martonosi A. (1994) The relationship between phospholipid content and Ca2+-ATPase activity in the sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1196,1-13.
116. Post R. L., Hegyvary C., and Kume S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J Biol Chem. 247, 6530-6540.
117. Postnikova G. В., Tselikova S. V., Kolaeva S. G., and Solomonov N. G. (1999) Myoglobin content in skeletal muscles of hibernating ground squirrels rises in autumn and winter. Сотр. Biochem. Physiol A. Mol. Integr. Physiol. 124, 35-37.
118. Rogdestvenskaya Z. E., Khromov A. S., and Srebnitskaya L. K. (1994) Abstr. Book of Intern. Symp. "Biological Motility", Pushino, Russia, 189.
119. Rosemblatt M. S., and Scales D. J. (1989) Morphological, immunological and biochemical characterization of purified transverse tubule membranes isolated from rabbit skeletal muscle. Mol Cell Biochem. 87, 57-69.
120. Shorina E. A., Mast N. V., Lopina O. D. and Rubtsov A. M. (1997) Melittin-induced inhibition and aggregation of Ca-ATPase in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum: a comparative study. Biochemistry 36, 13455-13460.
121. Shoshan-Barmatz V., and Ashley R. H. (1998) The structure, function, and cellular regulation of ryanodine-sensitive Ca2+ release channels. Int. Rev. Cytol. 183,185-270.
122. Shoshan-Barmatz V., Hadad N., Feng W., Shafir I., Orr I, Varsanyi M., and Heilmeyer L. M. (1996a) VDAC/porin is present in sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle. FEBSLett. 386, 205-210.
123. Shoshan-Barmatz V., Orr I, Well S., Meyer H., Varsanyi M., and Heilmeyer L. M. (1996b) The identification of the phosphorylated 150/160-kDa proteins of sarcoplasmic reticulum, their kinase and their association with the ryanodine receptor. Biochim. Biophys. Acta 1283, 89100.
124. Shuster S. M., Ebel R. E., and Lardy M. A. (1975) Kinetic studies on rat liver and beef heart mitochondrial ATPase. Evidence for nucleotide binding at separate regulatory and catalytic sites. J. Biol. Chem. 250, 78487853.
125. Simmerman, H.K., and Jones, L.R. (1998) Phospholamban: protein structure, mechanism of action, and role in cardiac contraction. Physiol. Rev. 78,921-947.
126. Somlyo A. V., Gonzalez-Serratos H., Shuman H., and McClellan G. (1981) Calcium release and ionic changes in the sarcoplasmic reticulum of tetanized muscle: an electron-probe study. J. Cell Biol. 90, 577-594.
127. Srere H. K., Wang L. С. H., and Martin S. L. (1992) Central role of differential gene expression in mammalian hibernation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7119-7123.
128. Starling A. P., East J. M., and Lee A. G. (1995) Effects of gel phase phospholipid on the Ca-ATPase. Biochemistry 34, 3084-3091.
129. Steffen J. M., Koebel D. A., Musaccia X. J., and Milson W. K. (1991) Morphometric and metabolic indices of disuse in muscles of hibernating ground squirrels. Сотр. Biochem. Physiol. 99B, 815-819.
130. Storey К. B. (1987a) Regulation of liver metabolism by enzyme phosphorylation during mammalian hibernation. J. Biol Chem. 262, 16701673.
131. Storey К. B. (1987b) Investigations of the mechanisms of glycolytical control during hibernation. Can. J. Zool. 65, 3079-3083.
132. Storey К. B. (1997) Metabolic regulation in mammalian hibernation: enzyme and protein adaptation. Сотр. Biochem. Physiol 118A, 11151124.
133. Strand M. A., Louis C. F., and Mickelson J. R. (1993) Phosphorylation of the porcine skeletal and cardiac muscle sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor. Biochim. Biophys. Acta 1175, 319-326.
134. Suk J. Y„ Kim Y. S., and Park W. J. (1999) HRC (Histidine-rich Ca2+ binding protein) resides in the lumen of sarcoplasmic reticulum as a multimer. Biochem. Bioph. Res. Com. 263, 667-671.
135. Sutko J., and Airey J. A. (1996) Ryanodine receptor Ca2+ release channels: does diversity in form equal diversity in function? Physiol Rev. 76,1027-1071.
136. Szegedi C., Sarkozi S., Herzog A., Jona I., and Varsanyi M. (1999) Calsequestrin: more than 'only' a lumenal Ca2+ buffer inside the sarcoplasmic raticulum. Biochem. J. 337,19-22.
137. Szymanska G., Kim H. W., and Kranias E. G. (1991) Reconstitution of the skeletal sarcoplasmic reticulum Ca-pump: influence of negatively charged phospholipids. Biochim. Biophys. Acta 1091, 127-134. in
138. Tada M., Yamamoto Т., and Tonomura Y. (1978) Molecular mechanism of active calcium transport by sarcoplasmic reticulum. Physiol. Rev. 58, 1-79.
139. Toyofuku Т., Kurzydlowski K., Narayanan N., and MacLennan D. H. (1994) Identification of Ser38 as the site in cardiac sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase that is phosphorylated by Ca/calmodulin-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 269,26492-26496.
140. Toyoshima C., Nakasako M., Nomura H., and Ogawa H. (2000) Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405, 647-655.
141. Toyoshima C., Sasabe H., and Stokes D. L. (1993) Three-dimensional cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplasmic reticulum membrane. Nature 362,467-471.
142. Wagenknecht Т., and Rademacher M. (1997) Ryanodine receptors: structure and macromolecular interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 7,258265.
143. Wallmark В., Stewart H. В., Rabon E., Saccomani G., and Sachs G. (1980) The catalytic cycle of gastric (H+, K+)-ATPase. J. Biol. Chem. 255, 53135319.
144. Wang L. С. H. (1985) Life at low temperature: mammalian hibernation. Cryo-Letters 6, 257-274.
145. Wang L. С. H., and Lee T. F. (1989) Temperature Regulation. In: Psychoendocrinology. 2. Behavior and Regulation of Species Adaptations (S. Levine, R. Brush, eds.), N. Y., Acad. Press, 437-539.
146. White Т. E., and Dewey T. G. (1987) A fluorescence investigation of the nucleodide binding sites of the Ca-ATPase. Membr. Biochem. 7, 67-72.
147. Wickler, S.J., Hoyt, D.F., and van Breukelen, F. (1991) Disuse atrophy in the hibernating golden-mantled ground squirrel, Spermophilus lateralis. Am. J Physiol. 261,1214-1217.
148. Witcher D. R., Kovacs R. J., Schulman H., Cefali D. C., and Jones L. R. (1991) Unique phosphorylation site on the cardiac ryanodine receptor regulates calcium channel activity. J. Biol. Chem. 266, 11144-11152.
149. Yacoe M. E. (1983) Adjustments of metabolic pathways in the pectoralis muscles of the bat Eptesicus fuscus related to carbohydrate sparing during hibernation. Physiol. Zool. 56,648-658.
150. Yamaguchi N„ Kawasaki Т., and Kasai M. (1995) DIDS binding 30-kDa protein regulates the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 648-653.
151. Yamaguchi N., and Kasai M. (1998) Identification of 30 kDa calsequestrin-binding protein, which regulates calcium release from sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal muscle. Biochem J. 335,541-547.
152. Yamomoto Т., and Tonomura Y. (1967) Reaction mechanism of Ca2+-dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle. I. Kinetic studies. Biochem. J. 62, 558-575.
153. Yano K., and Zarain-Herzberg A. (1994) Sarcoplasmic reticulum calsequestrins: structural and functional properties. Mol. Cell. Biochem. 135,61-70.
154. Zhang L., Kelley J., Schmeisser G., Kobayashi Y. M., and Jones L. R. (1997) Complex formation between junctin, triadin, calsequestrin, and the ryanodine receptor. Proteins of the cardiac junctional sarcoplasmic reticulum membrane. J. Biol. Chem. 272, 23389-23397.
155. Zhegunov G. F., Kotlyarov A. P., and Sutshenko E. S. ( 1992) The role of protein rearrangement in cells of heterothermal animals in the course of adaptation to low temperatures. In: Mechanisms of natural hypometabolic states. Pushchino Research Center, 147-154.
156. Zhou D., Birkenmeier C. S., Williams M. W., Sharp J. J., Baker J. E., and Bloch R. J. (1997) Small, membrane-bound, alternatively spliced forms of ankyrin 1 associated with the sarcoplasmic reticulum of mammalian skeletal muscle. J Cell Biol. 136, 621-631.
В заключение я хотела бы выразить искреннюю благодарность всем преподавателям и сотрудникам кафедры биохимии биологического факультета МГУ за те знания и опыт, которые я получила за годы обучения.
Я очень благодарна своему научному руководителю Александру Михайловичу Рубцову за постоянное внимание и помощь на протяжении всей работы.
Я также благодарна Ольге Дмитриевне Лопиной за неоценимые советы и поддержку.
Данная работа существенно усложнилась бы без помощи Рустама Зиганшина, которому я хотела бы выразить искреннюю признательность.
Наконец, я хочу поблагодарить дружный коллектив нашей лаборатории, поддержку и теплое отношение которого, я ощущала на протяжении всего времени обучения и работы над диссертацией.
-
Малышева, Анна Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2001
-
ВАК 03.00.04
- Участие эндогенных протеинкиназ в сезонной регуляции активности Ca-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus
- Адаптационные изменения изоморфного состава и функциональных свойств миозина и миозин-содержащих нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов
- Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих
- Генетическое разнообразие, филогенетические связи и систематика палеарктических сусликов рода Spermophilus
- Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)
