Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)

Комелина, Наталья Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)"

!СИ

Комелина Наталья Павловна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РАЗОБЩАЮЩИХ БЕЛКОВ (иСР) И ДРУГИХ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ-ПЕРЕНОСЧИКОВ

В ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНОМ РАЗОБЩЕНИИ ДЫХАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ (БРЕШОРНит швишт)

специальность 03.01.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

,1 2 МАЙ 2011

ПУЩИНО - 2011

4845869

Работа выполнена в лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Амерханов Зариф Гарриевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Бронников Геннадий Ефремович

кандидат биологических наук Гришина Елена Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита диссертации состоится « 19 » мая 2011 г. в 15 ч 30 мин на заседании совета Д 002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «_> апреля 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н.

Т.И. Смолихина

Актуальность проблемы.

Установлено, что разобщение дыхания и синтеза АТР является одним из главных механизмов срочного образования тепла у теплокровных животных. В бурой жировой ткани (БЖТ), специализированной на продукции тепла, такое терморегуляторное разобщение опосредовано разобщающим белком - 1 (UCP1), ранее именовавшимся термогенином (см. Skulacliev, 1988; Nedergaard et al., 2001; Klingenberg, 2001). Долгие годы термогенин считался уникальным белком, присутствующим исключительно в БЖТ. Предполагалось, что в остальных тканях такое разобщение дыхания, приводящее к дополнительному поглощению кислорода и выделению тепла при низких температурах, помимо своей основной транспортной функции, могут осуществлять другие митохондриальные белки -анионные переносчики, такие как ATP/ADP антипортер (ANT) и аспатрат/глутаматный переносчик, для функционирования которых в этом случае, как и для UCP1, требуется присутствие свободных жирных кислот (Skulachev, 1998). Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по своей аминокислотной последовательности, - UCP2, был обнаружен во всех тканях млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3, который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным артефактом. В настоящее время спектр обнаруженных UCP стал еще шире, и соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций, отличных от функций термогенина бурой жирозой ткани, большинство авторов по-прежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях. Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.

У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT -карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчик^ и UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах

митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не исследовалось.

Цель работы: изучить вклад UCP и других белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в механизм разобщающего действия жирных кислот и реализацию терморегуляторного разобщения в митохондриях печени и скелетных мышц гибернирующих животных в различных физиологических состояниях.

В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus и дифференцировать предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих ингибиторов.

2. Используя описанную в литературе способность UCP-2 и UCP-3 активироваться супероксидом, исследовать ресопрягающее действие GDP в условиях вызванного супероксидом разобщения.

3. С помощью ингибиторов аспартат/глутаматного переносчика, ANT и разобщающих белков (UCP) выявить вклад каждого из них в терморегуляторное разобщение в митохондриях печени и скелетных мышц выходящих из состояния гибернации сусликов.

4. Опираясь на описанные в литературе свойства белков UCP, обнаружить их присутствие и функциональную активность в тканях печени и скелетных мышц гибернирующих сусликов.

Научная новизна работы. Впервые в эксперименте, направленном на выявление активности UCP, для исключения вклада других митохондриальных белков, способных участвовать в транспорте анионов жирных кислот, использованы последовательные добавки специфических ингибиторов. Впервые показано, что ресопрягающий эффект GDP не может служить объективным тестом для выявления функционирования UCP, и представлены доказательства конкурентного взаимодействия GDP с ANT. Впервые в экспериментах на интактных митохондриях печени и мышц показано отсутствие в них проводимости для ионов хлора, характерной для митохондрий БЖТ, содержащих UCP1. Установлено, что cAtr не способен ингибировать UCP1 из БЖТ. На основании этих результатов сделано заключение, что гомологи UCP в печени и скелетных мышцах не участвуют в терморегуляторном разобщении дыхания при пробуждении животных из состояния гибернации, а также в разобщении, активируемом супероксидом. Также нами проведены измерения уровня экспрессии мРНК UCP2 в печени и UCP3 мышцах якутского суслика в различных сезонных состояниях.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют представления о внутриклеточных механизмах, обеспечивающих поддержание природных гипометаболических состояний у млекопитающих. Дают новые сведения о возможных путях регуляции биоэнергетических процессов в клетке. Полученные результаты указывают на необходимость возобновления поиска функций тканеспецифических гомологов UCP. Результаты исследований

используются в учебном процессе в Образовательном центре при ИБК РАН. Они могут иметь значение для медико-биологических работ, направленных на исследование роли UCP в различных патологических процессах, включающих такие социально значимые заболевания, как диабет и ожирение.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004); 19-ом Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (С-Петербург, 2005); Международной научной конференции "Современные проблемы адаптации и биоразнообразия" (Махачкала, 2006 и 2008); 16-ой Европейской Конференции по Биоэнергетике (Варшава, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы двенадцать печатных работ, из них три статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (280 источников). Работа изложена на 125 страницах, иллюстрационный материал включает 26 рисунков и 5 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В экспериментах использовались суслики Spermophilus undulatus. При исследовании выделили следующие группы животных: летних активных, зимних активных (Т=37°С), зимних спящих (Т=4-6 °С) и зимних пробуждающихся при различной температуре тела (Т=4-37 °С). В качестве объектов для контроля использовались самцы крыс линии Wistar (массой 150-200 грамм).

Выделение митохондрий. Митохондрии скелетных мышц и печени выделяли согласно (Andreev et al., 1989) а митохондрии БЖТ согласно (Hittelman et al. 1969). Среда выделения для митохондрий БЖТ содержала: 250 мМ сахарозы, 0.5 мМ ЭГТА, 0.1% BSA, 10 мМ Hepes, рН 7.2. Для митохондрий печени: 300 мМ сахарозы, 0.5 мМ ЭГТА, 8 мМ Трис НС1, рН 7.4. Для митохондрий скелетных мышц: 250 мМ сахарозы, 2 мМ ЭГТА, 50 мМ Трис НС1, рН 7.5. Все процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Концентрацию белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Регистрация дыхания и оценка мембранного потенциала. Скорость потребления кислорода суспензией митохондрий измеряли полярографически закрытым электродом Кларка в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при постоянном перемешивании и температуре 26°С. Регистрацию сигналов осуществляли с помощью прибора Record 4 (Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино) и соответствующего программного обеспечения. Среда инкубации содержала 1.5 мг/мл митохондриального белка, 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES, 3 мМ КН2Р04, 3 мМ MgCl2. В качестве субстрата использовали 4 мМ сукцината в присутствии 3 мкМ ротенона (для исключения вклада эндогенных НАДН-зависимых субстратов). Ресопрягающие эффекты нуклеотидов измерялись в

присутствии 2.5 мкг/мл олигомицина (для ингибирования митохондриальной АТР-азы). Обычно использовали следующие концентрации добавок: 100 мкМ лаурат, 1 мМ глутамат; 1 мМ GDP, 100 мкМ ADP; 1 мкМ cAtr; в качестве разобщителя 1 мкМ FCCP, 2 мкМ С1ССР или 50 мкМ динитрофенола (DNP)

Величину мембранного потенциала оценивали по распределению катиона тетрафенилфосфония (ТРР+) с помощью ТРР+-селективного электрода (Kamo et al., 1979). Среда инкубации в этом случае дополнительно содержала 2 мкМ ТРР.

При изучении влияния супероксида на параметры дыхания и мембранный потенциал митохондрий в среду инкубации вносили ксантиноксидазу (0.015 ед/1мл) и ксантин (50 мкМ) (Echtay et al., 2002; Murphy et al., 2003). Среда инкубации в этих экспериментах дополнительно содержала 0.1 мкМ нигерецина, 2 мг/мл BSA, 100 мкМ пальмитата и 50 мкМ ксантина. Дыхание инициировали добавкой 4 мМ сукцината после предварительной инкубации митохондрий в течение 10 мин в присутствии и в отсутствие ксантиноксидазы в открытой ячейке (чтобы избежать исчерпания кислорода за счет окисления эндогенных субстратов).

При исследовании кинетики стационарная концентрация ADP поддерживалась с помощью метода гексокиназной ловушки, в среду дополнительно вносили 10 мМ глюкозы и 2.5 ед/мл гексокиназы (Wanders et al., 1994). Набухание митохондрий регистрировали по снижению оптической плотности при 520 нм.

Экстракция белков. Для экстракции белков UCP из препаратов митохондрий БЖТ, печени и скелетных мышц использовали последовательно детергенты: 3.2% луброл-wx, осадок затем солюбилизировали в 3% тритон Х-100 в буфере (30 мМ NajS04, 20 мМ MOPS, 0.25 мМ ЭГТА, pH 6.7) (Klingenberg, Lin, 1986). Для проведения адсорбционной хроматографии использовали микроколонку объемом 1 мл, адаптированную для элюции с помощью центрифугирования. Колонку с гидроксилапатитом (НТР Gel Biorad), уравновешивали в буфере для солюбилизации. Для одновременного выделения белков UCP2, UCP3 и ANT ионную силу буфера увеличивали (150 мМ NaiSO«, 10 мМ КН2Р04).

Для идентификации белков использовали метод диск-электорфореза в градиенте пористости ПААГ с использованием SDS (Laemmli, 1970; Anderson et al., 1973). Электрофорез проводили в 5 - 22% ПААГ, Трис HCl 375 мМ pH 8.8, 0.1% SDS. Образцы вносили в буфере, содержавшем 62.5 мМ Трис HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% меркаптоэтанол, 20% сахарозы. Электродный буфер: Трис 25 мМ, глицин 192 мМ, 0.1% SDS, pH 8.3. Гели фиксировали в смеси метанол-уксусная кислота-вода (45:10:45), окрашивали раствором 0.125% Кумасси G-250 в той же смеси. Отмывали и хранили гель в 7% уксусной кислоте.

Количественная PCR в реальном времени. ДНК выделяли методом депротеинизации щелочным фенолом. Для выделения суммарной РНК использовали метод гуанидинизотиоцианат-фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski et al., 1987; Маниатис и др., 1986). Экстракцию проводили сразу после извлечения органов животного, используя соотношение 100 мг ткани на 2 мл буфера для гомогенизации (4 M гуанидинизотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0.5% w/v натриевая соль N-лаурилсаркозина, 0.1 M 2-р-меркаптоэтанол). Качество выделенной РНК оценивали электрофоретически в 0.8% агарозе (130 В/70 мА), концентрацию определяли на спектрофотометре NanoDrop spectrophotometer (США).

При подборе праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа оптимальными считали праймеры длиной 20 нуклеотидов, имеющие >50% G/C-nap и не имеющие в геноме других мишеней, комплементарных более чем к 10-11 нуклеотидам на З'-конце. Степень уникальности оценивали с помощью программы BLAST (NCBI). Для обратной транскрипции и амплификации фрагмента гена ANT были подобраны праймеры в участке, консервативном для обеих изоформ переносчика (ANT1 и ANT2) генома крысы. Праймеры для генов UCP2 и UCP3 были специфичны для генома суслика арктического Spermophilus patyii (NCBI). Для нормирования был использован ген крысы, кодирующий ß-actin (NCBI). Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя набора реактивов для обратной транскрипции (Fermentas) с небольшими модификациями.

RT-PCR в реальном времени проводили на приборе ДТ-322 (ДНК-Технология, Россия) с использованием интеркалирующего в двуцепочечную ДНК красителя SYBR Green I (Invitrogen, США). Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи программы qPCR (ДНК-Технология, Россия), относительное содержание рассчитывали по методу (Livak, Schmittgen, 2001) с небольшими модификациями. Степень гомогенности и молекулярный вес PCR-продуктов оценивали электрофоретически в 5% ПААГ. Кроме того, для оценки корректности реакции PCR фрагменты ДНК вырезали из ПААГ и экстрагировали для последующего секвенирования (Маниатис и др., 19S6). Секвенирование фрагментов ДНК проводили в "ВНТК Генной активности" Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Статистическая обработка данных. При статистической обработке экспериментальных данных за число независимых экспериментов принимали число животных п=5-7. Для оценки достоверности отличий использовали статистический t-критерий Стьюдента (см. Лакин, 1990). В таблицах приведены средние арифметические и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Участие UCP2, аспартат/глутаматного переносчика u ATP/ADP антипортера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях печени сусликов.

1.1. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr па скорость дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов.

Для препаратов митохондрий печени сусликов, находящихся в состоянии зимней спячки, характерно снижение начальной скорости (в присутствии субстрата дыхания и в отсутствии прочих добавок) и максимальной скорости дыхания (в присутствии разобщителя), вследствие ингибирования транспорта электронов в области bei комплекса дыхательной цепи (Брустовецкий, 1991). При пробуждении животных из состояния спячки в печени наблюдается резкое увеличение окислительной активности, которое происходит раньше повышения температуры всего тела. К настоящему времени этот вопрос остается изученным не до конца. Было описано участие ANT в терморегуляторном разобщении в митохондриях

печени пробуждающегося суслика (Брустовецкий, 1990; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени у выходящих из состояния гибернадии животных не исследовалось. В связи с открытием UCP также интересно было выявить их участие в процессе разобщения, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях печени активных зимних сусликов. С другой стороны, данные относительно содержания UCP2 в печени неоднозначны (см. Nedergaard, Cannon, 2003), и в большинстве известных работ говориться об очень незначительном количестве или даже отсутствии белка. В этом случае, важно было бы соотнести полученные данные с результатами, полученными на скелетных мышцах, для которых UCP3 является тканеспецифичным белком.

В качестве объекта в данном случае использовались митохондрии печени зимних активных сусликов с нормальной температурой тела, которых забирали в опыт в короткий период между баутами гибернации. Известно, что для арктических сусликов характерно увеличение содержания UCP в различных тканях (Воуег et al., 1998; Barger et al., 2006).

Для того чтобы выявить вклад каждого из исследуемых белков в разобщение под действием жирных кислот, мы использовали специфические ингибиторы (или субстраты) этих белков: глутамат для аспатрат/глутаматного переносчика, cAtr для ANT, и GDP для UCP, добавляя их в различной последовательности. При этом регистрировали изменение скорости дыхания. Для исключения изменений скорости дыхания, связанных с участием глутамата и GDP в качестве субстратов дыхания и фосфорилирования, в среде инкубации всегда присутствовали ротенон и олигомицин (см. Материалы и методы). Уменьшение скорости дыхания митохондрий, наблюдаемое в присутствии жирной кислоты, под действием соответствующего ингибитора, т.е. их ресопрягающие эффекты, в случае аддитивного и независимого друг от друга характера этих эффектов, может указать на вклад конкретного белка в это разобщение.

Стимуляция дыхания митохондрий печени активного зимнего суслика вызывалась добавкой 100 мкМ лауриновой кислоты и подавлялась 2 мкМ cAtr (рис.1) в присутствии олигомицина. Это свидетельствует об участии ANT в разобщении под действием жирных кислот. Был обнаружен небольшой подавляющий эффект GDP в концентрации 1 мМ на скорость разобщенного дыхания. Однако данный ресопрягающий эффект 1 мМ GDP предотвращался предварительной добавкой 2 мкМ cAtr, ресопрягающий эффект которого полностью перекрывал эффект GDP и не был по отношении к нему аддитивным. Данный результат оказался неожиданным, так как не был упомянут в работах, посвященных исследованию ANT и UCP. Более того, в работах посвященных исследованию UCP, ресопрягающее действие GDP обычно использовалось как специфический тест на присутствие UCP в митохондриях. К сожалению, эти исследования обычно проводились в отсутствии добавки cAtr или других ингибиторов ANT.

Рис.1. Типичные кривые ускорения дыхания митохондрий печени зимнего активного суслика в ответ на добавку лауриновой кислоты (Laur) и ресопрягающее действие GDP и cAtr в зависимости от последовательности добавок. В среде инкубации присутствует олигомицин - 2.5 мкг/мл. Мит. белок - 1.5 мг/мл. Добавки: 50 мкМ Лаурат (Laur); 1 мкМ cAtr, 1мМ GDP, 0.5 мкМ FCCP. Остальные условия см. Методы исследования.

Для изучения вклада аспартат/глутаматного переносчика в разобщающее действие жирных кислот на митохондрии печени активных зимних сусликов регистрировали действие добавок глутамата. При исследовании влияния глутамата на разобщенное под действием лауриновой кислоты дыхание (Табл.1) было обнаружено, что ресопрягающий эффект глутамата (в присутствии ротенона и олигомицина) проявляется одинаково сильно до и после cAtr, т.е. их эффекты независимы. Это указывает на работу отдельного пути транспорта анионов жирных кислот, осуществляемого с участием аспартат/глутаматного переносчика (Samartsev et al„ 1997).

Отсутствие же независимого от добавки cAtr ресопрягающего эффекта GDP можно было объяснить отсутствием самого белка UCP2, либо его активной формы в препаратах митохондрий печени сусликов.

Таблица 1. Ресопрягающие эффекты cAtr и глутамата (Glut), на дыхание митохондрий печени активного зимнего суслика, в зависимости от последовательности.

Скорость дыхания, нг атомов Oj / мин * мг белка

Начальная скорость Лаурат (SO мкМ) Glut (4мМ) |Glut+cAtr (2мкМ) :Atr (2мкМ) jcAtr+Glut (4мМ) FCCP (0.2мкМ)

Очередность добавки

1 2 1 2

24,1±4,3 53,б±4,5 37,7±3,2 25,6±2,6* 36,3±2,4 26,1±3,5" 232,б±9,3

Отличия статистически достоверны (р<0.001): - по отношению к скорости дыхания в присутствии глутамата; - по отношению к скорости дыхания в присутствии сА1г; (п=6). Условия эксперимента см. Методы исследования.

1.2. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на мембранный потенциал митохондрий печени зимних активных сусликов.

Ускорение дыхания митохондрий, отражающее разобщение, вызванное увеличением величины протонной утечки, должно сочетаться со снижением величины электрохимического градиента протонов, которая в используемых нами экспериментальных условиях (присутствие буферной системы и свободного

фосфата) в основном проявляется в снижении величины мембранного потенциала. На рис. 2А показаны результаты регистрации мембранного потенциала, оцениваемые по распределению катиона тетрафенилфосфония ТРР+ с помощью ТРР+-селективного электрода, в суспензии митохондрий печени зимнего активного суслика. Добавка 100 мкМ лауриновой кислоты вызывает падение мембранного потенциала, которое затем восстанавливается последовательными добавками GDP, cAtr и глутамата. Можно отметить, что альбумин (В SA), который связывает жирные кислоты, почти полностью восстанавливает его. Это доказывает с одной стороны, что процесс разобщения окислительного фосфорилирования происходит при непосредственном участии жирных кислот, а также то, что свободные жирные кислоты могут вызывать протонные утечки, частично минуя участие ANT и аспартат/глутаматного переносчика.

Рис.2. Действие cAtr, GDP и глутамата (Glut) на мембранный потенциал митохондрий печени зимнего активного суслика. Мит. белок - 1 мг/мл. Добавки: 50 мкМ Лаурат (Laur); 1мкМ cAtr, 1 мМ GDP, 100 мкМ ADP, 4 мМ глутамата (Glut), 0.2% BSA, 2 мкМ С1ССР. Другие условия см. методы.

При регистрации мембранного потенциала в присутствии cAtr, нам не удалось обнаружить ресопрягающего эффекта GDP в митохондриях печени суслика (рис.2В). В то же время, в условиях полного блокирования ANT с помощью cAtr, последующая добавка глутамата вызывала дальнейшее увеличение потенциала, что указывает на работу другого механизма разобщения, осуществляемого с участием аспартат/глутаматного переносчика (Samartsev et al., 1997).

Таким образом, данные, полученные при регистрации мембранного потенциала митохондрий печени, хорошо коррелируют с эффектами GDP, cAtr и глутамата, наблюдаемыми при измерении скорости дыхания.

1.3. Действие супероксида на параметры дыхания митохондрий печени суслика иресопрягающие эффекты пуриновых нуклеотидов и cAtr.

В литературе было описано, что UCP не только снижают продукцию активных форм кислорода митохондриями, снижая мембранный потенциал на внутренней мембране митохондрий, но и сами UCP резко активируются в присутствии супероксида (Echtay et al., 2002). Активация UCP опосредована перекисным окислением липидов и образованием гидроперекисей жирных кислот, которые возможно уже сами непосредственно воздействуют на UCP (Murphy et al., 2003). Мы решили использовать возможность активировать работу UCP2

супероксидом, и одновременно использовать уже описанный тест для выявления функциональной активности UCP.

Из результатов экспериментов, обобщенных в табл. 2, следует, что под действием супероксида, который генерировался системой ксантин плюс ксантиноксидаза (ХХО) в суспензии митохондрий печени, действительно происходит увеличение скорости дыхания в ответ на жирную кислоту (100 мкМ лаурата). В указанных ранее работах (Echtay et al., 2002) это приводилось в качестве доказательства того, что супероксид активирует работу UCP2. Однако, можно видеть, что начальные скорости дыхания митохондрий до добавки жирной кислоты также увеличены. Это может свидетельствовать о повреждающем воздействии супероксида на митохондриальную мембрану. В присутствии системы генерации супероксида также обнаруживалось небольшое достоверное подавление максимальной скорости дыхания, выявляемое после добавки искусственного разобщителя, что может говорить о повреждающем действии супероксида и на дыхательную цепь митохондрий.

Было обнаружено, что как в отсутствие, так и в присутствии супероксида, eAtr тем не менее полностью предотвращал последующее снижение скорости дыхания под действием GDP (в присутствии олигомицина) (табл. 2).

Таблица 2. Ресопрягающие эффекты cAtr и GDP на дыхание митохондрий печени зимнего активного суслика в зависимости от последовательности добавок и предварительной инкубации митохондрий в присутствии системы генерации супероксида.

Скорость дыхания, нг атомов Ог / мин * мг белка

Начальная скорость Лаурат GDP GDP+cAtr cAtr cAtr+GDP FCCP

Очередность добавок 1 2 1 2

-ХХО 24,1±4,3 53,6±4,5 45,9±3,2 35,7±2,6* 35,3 ±2,7 34,8±3,4" 232,б±9,Г"

+ХХО 32,4±5,1 84,1±6,7 63,4±3,5 48,3±4,3* 47,6±2,9 47,9±2,б" 189,4±7,2'"

Митохондрии предварительно инкубировали 10 мин в присутствии (+ХХО) или в отсутствие ксангиноксидазы (-ХХО). Остальные условия см. Методы исследования. Различная очередность добавок GDP и cAtr соответствует отдельным экспериментам. За число независимых экспериментов принимали число использованных в экспериментах животных. (п=7). * - отличия достоверны по отношению к скорости дыхания в присутствии GDP (р<0.001); " - отличия не достоверны по отношению к скорости дыхания в присутствии cAtr (р> 0.05); - отличия достоверны по отношению к результатам, полученным в отсутствии системы продукции супероксида (р< 0.05).

1.4. Действие супероксида на величину мембранного потенциала митохондрий печени суслика и ресопрягающие эффекты пуриновых нуклеотидов и cAtr.

Мембранный потенциал после инкубации митохондрий печени зимнего активного суслика (рис.3) в присутствии системы ХОХ понижался, и внесение GDP на фоне олигомицина приводило к его увеличению. Однако после добавки cAtr никакого действия GDP на потенциал не обнаруживалось даже после инкубации митохондрий в присутствии ХОХ.

Это свидетельствует о том, что присутствие в среде супероксида оказывает повреждающее действие на митохондрии, приводя к росту протонных утечек и снижению окислительной активности препаратов митохондрий, но не вызывает специфической активации UCP2.

GDP cAtr 1mM 1(iM

CICCP 2|lM

Succlnat 4mM

Succinat 4mM

Рис.3. Действие GDP и cAtr на мембранный потенциал митохондрий печени зимнего активного суслика после инкубации в присутствии (+ХОХ) и в отсутствие (-ХОХ) супероксида. Митохондрии (1мг белка/ мл) предварительно инкубировали 10 мин в присутствии или в отсутствие ксантиноксидазы. Остальные условия см. Методы исследования.

1.5. Заключение к главе 1.

Исследование параметров дыхания и мембранного потенциала митохондрий печени зимних сусликов позволяет заключить следующее: ANT и аспартат/глутаматный переносчик в митохондриях печени способны совместно принимать участие в разобщении дыхания, индуцируемом жирными кислотами. Однако в отношении роли UCP2 мы не можем сделать однозначного заключения. Данные относительно содержания UCP2 в печени противоречивы (см. Nedergaard, Cannon, 2003), и в большинстве известных работ говорится об очень незначительном количестве или даже его отсутствии в ткани печени.

Ресопрягающие эффекты GDP, считавшиеся в литературе специфичным тестом для UCP, наблюдаются в экспериментах с препаратами митохондрий печени зимних сусликов, но полностью поглощаются более мощным ресопрягающим действием cAtr. Несмотря на обилие данных о возможности активации UCP под действием активных форм кислорода, нами не было обнаружено принципиальных изменений эффектов GDP и cAtr под действием супероксида. Влияние супероксида на сопряженность, максимальную скорость дыхания и мембранный потенциал препаратов митохондрий печени может объясняться причинами, не связанными с активацией UCP2.

Тот факт, что действие GDP всегда предотвращается добавкой cAtr, можно было бы объяснить исходя из предположения, что cAtr, специфичный ингибитор ANT, способен ингибировать и UCP, вследствие принадлежности этих белков к одному семейству митохондриальных анионных переносчиков, имеющих высокую гомологию в аминокислотной последовательности и, вероятно, эволюционное родство. Однако до сих пор cAtr считался исключительно специфичным по отношению к ANT. Также можно предположить, что действие высоких концентраций GDP может объясняться его неспецифическим действием на ANT как структурного аналога адениновых нуклеотидов. Однако в литературе считалось, что ANT исключительно селективен и практически не имеет сродства к другим нуклеотидам. Эти две гипотезы мы рассматриваем в Гл.4 и Гл.5.

Глава 2. Участие UCP3 и ATP/ADP антипортера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в мнтохондриях скелетных мышц сусликов.

2.1. Сравнение параметров дыхания митохондрий скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов.

По литературным данным в скелетных мышцах обнаружено значительное содержание мРНК и белка UCP3, специфичного именно для этой ткани (см. Cannon, Nedegaard, 2006). Существование GDP-чувствительной протонной проницаемости, опосредованной UCP3, было продемонстрировано как на липосомах с реконструированным в них белком (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2001), так и на митохондриях скелетных мышцах пингвинов при их адаптации к холоду (Talbot et al., 2004). Кроме того, для арктических сусликов было показано увеличение содержания UCP, и особенно UCP3 в скелетных мышцах, в период зимней спячки по сравнению с летними животными (Воуег et al., 1998; Barger et al., 2006). С другой стороны, на бислойной липидной мембране (Brustovetsky, Klingenberg, 1994) и на скелетных мышцах пробуждающихся сусликов (Брустовецкий и др., 1991; Brustovetsky et al., 1990) было продемонстрировано cAtr-чувствительное разобщение с участием ANT. Поэтому, нами была поставлена задача - выявить и дифференцировать вклад белков UCP3 и ANT в индуцированное жирными кислотами разобщение в митохондриях скелетных мышц в различных сезонных состояниях.

При сравнении параметров дыхания препаратов митохондрий, выделенных из скелетных мышц активных летних и гибернирующих сусликов, наблюдается усиление начальной скорости дыхания в группе гибернирующих сусликов (Табл.3). Это обеспечивается, как было установлено ранее (Brustovetsky et al., 1992), повышенной концентрацией свободных жирных кислот, циркулирующих в плазме крови и тканях спящих животных. Мы полагали, что в разобщение, опосредованное циклическим транспортом жирных кислот, должны быть вовлечены не только ANT, но и UCP3. Можно было ожидать, что это должно быть ярче выражено у гибернирующих животных.

Таблица З.Ресопрягающие эффекты cAtr и GDP на дыхание митохондрий скелетных мышц суслика в зависимости от последовательности их добавок, в присутствии олшчшнцина.

Скорость дыхания, нг атомов СЬ / мин * мг белка

Начальная Лаурат GDP GDP+cAtr cAtr cAti+GDP FCCP

Очередность добавок 1 2 1 2

Скелетные мышцы активного суслика 28,4±5,1 76,4±4,8 68,7±3,2 46,9±2,6* 50,2±2,6 50,5±3,5" 156,8±8,5'"

Скелетные мышцы спящего суслика 38,3±5,4 94,2±6,3 83,5±3,5 68,1±4,8' 70,8±2,2 70,l±2,S" 135,1±9,3°"

- отличия достоверны по отношению к скорости дыхания в присутствии GDP (pO.OOl); " - отличия не достоверны по отношению к скорости дыхания в присутствии cAtr (р>0.05); - отличия достоверны между группами спящих и активных животных (р<0.05); (п=5).

Добавка GDP в среду инкубации, действительно, вызывала ресопряжение дыхания и фосфорилирования, выражающееся в снижении скорости разобщенного под действием жирной кислоты дыхания. Однако обнаружилось, что на фоне более

сильного ресопрягающего действия cAtr дальнейшее ресопрягающее действие GDP полностью отсутствовало (Табл.3).

Рис. 4. Типичные кривые ускорения дыхания митохондрий скелетных мышц гибернирующего суслика в ответ на добавку лауриновой кислоты (Laur) и ресопрягающее действие GDP, ADP и cAtr в зависимости от последовательности добавок, в присутствии олигомицина. Добавки: 50 мкМ Лаурат (Ьаиг);1мкМ cAtr,l мМ GDP, 100 мкМ ADP, 1 мкМ FCCP. Другие условия см. Методы исследования.

Известно, что в присутствии олигомицина, при разобщении митохондрий под действием жирных кислот, кроме cAtr свое ресопрягающее действие, опосредованное ANT, но в меньшей степени, оказывает и ADP (Andreev et al., 1989). Варьируя последовательности добавок GDP и ADP в одном эксперименте, мы обнаружили, что ресопрягающие эффекты GDP полностью предотвращаются ADP (рис.4.С). Учитывая, что действие обоих нуклеотидов, в свою очередь, полностью поглощается ресопрягающим эффектом cAtr (рис.4В, Табл.3), можно предположить, что и GDP, и ADP оказывают свое ресопрягающее действие через ANT, а не через UCP, как предполагается в литературе.

2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий скелетных мышц гибернирующих сусликов.

При регистрации мембранного потенциала в присутствии cAtr нам не удалось обнаружить ресопрягающего эффекта GDP в митохондриях скелетных мышц гибернирующих сусликов (рис.5). Добавление GDP в концентрации 1 мМ до cAtr дает небольшой ресопрягающий эффект. Он значительно менее выражен, чем для ADP, который в концентрации 100 мкМ вызывает максимальный эффект и предотвращает последующее действие GDP (рис.5В).

В то же время, нам не удалось обнаружить заметного ресопрягающего эффекта глутамата на митохондриях скелетных мышц (рис.5П). Подобное наблюдалось на митохондриях сердца крысы, и только при сильном снижении рН авторам удалось наблюдать небольшой ресопрягающий эффект глутамата (Самарцев и др., 1998). Возможно, это связано с особенностями аспартат/глутаматного переносчика в митохондриях мышечных тканей.

CICCP

Рис.5. Действие cAtr, GDP, ADP и глутачата на мембранный потенциал митохондрий скелетных мышц гибернирующего суслика в зависимости от последовательности добавок. Миг. белок - 1 мг/мл. Добавки: 50 мкМ Лаурат (Laur);I мкМ cAtr,l мМ GDP, 100 мкМ ADP, 2мкМ С1ССР. Другие условия см. методы.

Мы попытались, основываясь на данных литературы, использовать возможность активировать работу UCP3 в суспензии митохондрий скелетных мышц супероксидом (Echtay et al., 2002). Мембранный потенциал после инкубации митохондрий скелетных мышц суслика в присутствии системы генерации супероксида (ХОХ) снижался, и внесение GDP на фоне олигомицина приводило к его увеличению (рис.6). Однако после добавки cAtr никакого действия GDP на потенциал не обнаруживалось даже после инкубации митохондрий в присутствии ХОХ.

CICCP

Рис.6. Действие cAtr, GDP и ADP на мембранный потенциал митохондрий скелетных мышц гибернирующего суслика в присутствии супероксида. Условия эксперимента см. подпись к Рис.3 и Рис.5.

Таким образом, мы не обнаружили активацию UCP3 под действием супероксида в скелетных мышцах гибернирующих животных. Ресопрягающие эффекты GDP и в этом случае блокировались предварительной добавкой cAtr.

2.3. Заключение к главе 2.

Начальные и максимальные скорости дыхания митохондрий достоверно увеличены у гибернирующих животных, что по литературным данным характерно для состояния хладоадаптации. Используя ресопрягающие эффекты GDP и cAtr, мы попытались выявить вклад UCP3 и ANT в разобщение, индуцированное под

действием жирных кислот, в суспензии митохондрий, выделенных из зимних гибернирующих и летних активных сусликов.

В митохондриях скелетных мышц обеих групп сусликов был обнаружен заметный вклад ANT, и не было обнаружено вклада UCP3 в разобщение, индуцированное жирными кислотами. Ресопрягающие эффекты GDP и ADP полностью блокировались предварительной добавкой cAtr, специфичного ингибитора ANT. Это наблюдалось также и в случае предполагаемой активации работы UCP3 в присутствии супероксида.

Глава 3. Участие разобщающих белков UCP2 и UCP3, аспартат/глутаматного переносчика и ATP/ADP антипортера в терморегуляторном увеличении скорости дыхания митохондрий печени н скелетных мышц сусликов, пробуждающихся из состояния зимней спячки.

3.1. Сравнение параметров дыхания и мембранного потенциала митохондрий печени и скелетных мышц активных и просыпающихся сусликов, и действие пуриновых нуклеотидов, глутамата и cAtr.

При пробуждении сусликов из состояния зимней спячки в митохондриях происходит разобщение окислительного фосфорилирования с участием эндогенных свободных жирных кислот. Это происходит не только в БЖТ, которая является основным термогенным органом, способствующим разогреву всего организма, что было продемонстрировано в экспериментах с препаратами митохондрий печени и мышц, полученных из тканей сусликов, выходящих из состояния гибернации, и проявлялось в более высоких скоростях дыхания и низком мембранном потенциале препаратов митохондрий (Брустовецкий и др., 1990, 1991; Amerkhanov et al., 1996).

Для митохондрий печени и мышц характерно заметное усиление максимальной скорости дыхания, выявляемой в присутствии разобщителя, в данном случае динитрофенола, в момент активного выхода из состояния гибернации (рис.7). Для митохондрий печени гибернирующих животных, кроме того, характерно сильное подавление исходной окислительной активности. При этом по мере выхода животных из состояния гибернации, наблюдается рост, а затем снижение подавляемого cAtr дыхания (рис.7). Глутамат в случае митохондрий печени (рис.7А) тоже обладает заметным ресопрягающим эффектом. Оказалось, что максимумы эффектов глутамата и cAtr совпадают и наблюдаются при температуре тела просыпающихся животных около 25 °С.

По всей видимости, и ANT, и аспартат/глутаматный переносчик в митохондриях печени способны совместно принимать участие в терморегуляторном разобщении во время выхода гибернирующих животных из состояния зимней спячки. Совпадение максимумов эффективности их работы, вероятно, отражает максимальную концентрацию эндогенных свободных жирных кислот (Brustovetsky et al., 1992). В то же время, нам не удалось обнаружить заметного ресопрягающего эффекта глутамата на митохондриях скелетных мышц (рис.7Б). Предполагается, что это связано с особенностями аспартат/глутаматного переносчика в митохондриях данных тканей (Самарцев и др., 1998).

Спячка ПроОуждеиие Активность

Рис.7. Ресопрягающш. эффеюг cAtr (-о.) и Рис8 Дейтше ^ GDp „

глутамата (-.-) на митохондрии печени (А) и мата (GIu) на мембра1ШЫЙ

скелетных мышц (Б) сусликов, выходящих in П0Т£1ЩИал MIIT0X0Iiap„r, ne4e„„ (А)

состояния гибернации, с различной температурой и скелетньи МЬ1ШЦ (Б) прось]_

тела, и соответствующая максимальная скорость пающегося суслика с температурой

дыхания в присутствии разобщителя (50мкМ Т£Ла 25„с условия зкспериме1па см

DNP) (-Д-). Ресопрягающий эффект оценивали по Методы

исследования.

степени ингибирования начальной скорости дыхания митохондрий, выраженной в %.

При измерении скорости дыхания в суспензии митохондрий печени и скелетных мышц сусликов после добавки cAtr и глутамата нам не удалось зарегистрировать какого-либо заметного ресопрягающего эффекта GDP в концентрации до 1 мМ (результаты не приводятся). Это заставляет нас усомниться в участии гомологов UCP1 в термогенезе, опосредованном разобщающим действием жирных кислот.

При регистрации мембранного потенциала в присутствии ингибитора ANT, cAtr, нам также не удалось обнаружить ресопрягающего эффекта GDP ни в митохондриях печени (рис.8А), ни в митохондриях скелетных мышц (рис.8Б). Однако добавление GDP в 1 мМ концентрации до cAtr дает небольшой ресопрягающий эффект. Он значительно менее выражен, чем для ADP, который в концентрации 100 мкМ вызывает максимальный эффект и предотвращает последующее действие GDP.

Слеяует отметить, что исходный потенциал митохондрий, выделенных из тканей пробуждающихся сусликов (рис.8А, 8Б), немного снижен и добавки ADP и cAtr оказывали заметное действие на потенциал в отсутствие экзогенно добавленной жирной кислоты.

з.2. Заключение к главе 3.

Показано, что ресопрягающий эффект глутамата в митохондриях печени пробуждающихся сусликов проявляется в условиях ингибирования ANT и увеличивается при пробуждении характерным образом, повторяя динамику изменения ресопрягающего действия cAtr. Это свидетельствует о вкладе аспартат/глутаматного переносчика в терморегуляторное разобщение в митохондриях печени. Отсутствие ресопрягающего эффекта глутамата в митохондриях скелетных мышц согласуется с данными об особенностях функционирования переносчика в данной ткани (Самарцев и др., 1998). Тем не менее, в условиях физиологической активации всех терморегуляторных механизмов при пробуждении из состояния зимней спячки, какого-либо заметного эффекта GDP, которое указывало бы на участие UCP2 и UCP3 в печени и мышцах, после предварительной добавки cAtr и ингибирования ANT, выявлено не было, что ставит под сомнение участие этих белков в несократительном темогенезе вообще,

и, в частности, в процессе согревания животных при выходе из гипометаболического состояния при зимней спячке.

Глава 4. Анализ взаимодействия GDP с ATP/ADP - антипортером по кинетике его влияния на скорость фосфорилнрующего дыхания митохондрий в стационарном состоянии.

В приведенных выше исследованиях наблюдался интересный и не исследованный ранее эффект отсутствия действия GDP после ADP и cAtr в присутствии олигомицина, в условиях индуцированного жирными кислотами разобщения, в митохондриях печени и скелетных мышц. Здесь необходимо отметить, что параметры взаимодействия различных пуриновых нуклеотидов с белками UCP исследовался и ранее, но только совсем недавно обратили внимание, на то, что cAtr влияет на сопрягающий эффект GDP. Авторы были вынуждены предположить, что изменение конформации ANT влияет на функционирование UCP через белок-белковое взаимодействие (Parker et al., 2008). Этот эффект можно также трактовать (Khailova et al., 2009) в пользу неспецифического действия GDP на ANT. Для проверки последнего предположения до сих пор никем не была предпринята попытка использовать особенности кинетических зависимостей, характерных для конкурентного ингибирования.

Проверить предположение о том, что действие высоких концентраций GDP может объясняться его неспецифическим действием на ANT, позволяет исследование кинетики влияния GDP на скорость фосфорилнрующего дыхания в стационарном состоянии, обеспеченном присутствием гексокиназы и избытка глюкозы. Мы использовали тот факт, что при скоростях дыхания ниже максимальной скорости дыхания митохондрий, и в условиях избытка субстрата дыхания, скорость дыхания лимитируется концентрацией субстрата фосфорилирования, то есть ADP, внутри митохондрий, а значит скоростью его транспорта в митохондрии. Кроме того, в результате работы АТР-азы значительно снижается мембранный потенциал и сильно снижается величина протонной утечки. Таким образом, количество поглощенного кислорода в таких условиях становится пропорционально количеству ADP, транспортируемому через ANT (Николе, 1985).

В условиях практического постоянства всех прочих компонентов в этих условиях, реакцию транспорта ADP можно считать реакцией первого порядка.

Построенные по данным эксперимента с митохондриями печени активного зимнего суслика, графики Лайнуивера-Берка демонстрируют, что скорость дыхания после добавки ADP в отсутствие и в присутствии 1 мМ GDP стремится к одной величине по мере роста концентрации ADP (рис.9). Это указывает па конкурентный механизм ингибирования транспорта ADP через ANT под действием GDP. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с митохондриями скелетных мышц и печени суслика, а также и митохондриями печени крысы.

Следует обратить внимание, что при низких концентрациях ADP наблюдается отклонение от линейной зависимости на графике Лайнуивера-Берка (рис.9) как в отсутствие, так и в присутствии GDP. Это, очевидно, обусловлено тем, что при низких концентрациях ADP потенциал на внутренней мембране падает незначительно, в результате чего значительный вклад в дыхание митохондрий вносится величиной протонной утечки через внутреннюю мембрану митохондрий.

Рассчитанная на основании графика величина Км=12.05±1.19 мкМ дает хорошее совпадение с литературными данными, в которых кажущуюся величину Км для внешнего ADP и ANT митохондрий определяют в экспериментах с непосредственной регистрацией транспорта ADP в интактных препаратах митохондрий. Обычно получаемые результаты указывают на величину около 10 мкМ, например (Мак at al., 1983). Используя различные концентрации GDP, мы оценили константу ингибирования для GDP, которая в нашем случае составила в экспериментах с митохондриями активных зимних сусликов относительно большую величину Ki=1.25 ±0.12 мМ.

Представленные результаты, свидетельствуют о том, что механизм ресопрягающего действия GDP связан не с приписываемым ему специфическим ингибирующим действием на присутствующие в митохондриях UCP, а с конкурентным ингибированием ANT, который, помимо своей основной функции транспорта АТР и ADP, участвует в циклическом транспорте жирных кислот.

1/IADPl.mM1

Рис. 9. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени зимнего активного суслика от концентрации ADP в координатах Лайнуивера Берка в контроле (А) и в присутствии 1 мМ GDP (В). При регистрации скорости дыхания для обеспечения стационарной концентрации ADP в среде инкубации присутствовало 10 мМ глюкозы и 2.5 ед/мл гексокиназы. Остальные условия эксперимента см. Методы исследования.

Глава 5. Хлорная проводимость, обусловленная присутствием UCP в митохондриальной мембране, и ее чувствительность к GDP и cAtr.

5.1. Хлорная проводимость и ее чувствительность к GDP в митохондриях бурого жира, скелетных мышц и печени активных зимних сусликов.

Из экспериментов на реконструированных в липосомы белках известно, что гомологи UCP по ряду свойств сходны с UCP1, включая высокую хлорную проводимость, которая ингибируются пуриновыми нуклеотидами (Bienengraeber et al., 1998; Jaburek et al., 1999; Jezek et al., 1996). Для качественной оценки содержания в митохондриях печени и скелетной мускулатуры зимних сусликов разобщающих белков UCP2 и UCP3 мы попытались использовать характерную для этих белков высокую хлорную проводимость.

В опытах с митохондриями бурого жира, для которых характерна высокая проницаемость для ионов хлора, добавка валиномицина приводила к набуханию митохондрий вследствие входа ионов калия в матрикс (среда содержала 125 мМ КС1) (рис.ЮА). Ингибирование транспорта ионов хлора через UCP1 добавкой GDP предотвращало набухание (рис.ЮА). Максимальный эффект наблюдали при невысокой концентрации 300 мкМ GDP. После ингибирования набухания добавкой GDP оно повторно могло быть инициировано добавкой искусственного переносчика ионов хлора трифенилтина (рис.ЮА). В опытах с митохондриями скелетных мышц и печени добавление валиномицина не вызывало набухания митохондрий (рис. 10В,С). Однако, последующее добавление переносчика хлора трифенилтина приводило к набуханию митохондрий.

Если хлорные проводимости UCP1 и UCP2 и UCP3 близки, как показано в работах (Bienengraeber et al., 1998; Jaburek et al., 1999), то приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что содержание UCP2 в печени и UCP3 в митохондриях скелетных мышц сусликов значительно ниже, чем содержание UCP1 в митохондриях БЖТ, либо можно даже говорить о полном отсутствии в них функционально-активного белка.

вызванное входом ионов хлора. (А) бурая жировая ткань, (В) скелетные мышцы, (С) печень. Среда содержала 125 мМ KCI, 3 мкМ ротенон, 1 мкМ антимицин А, 1 мМ ЭГТА и 10 мМ Hepes, рН 7.1. Набухание митохондрий (1мг белха/мл) индуцировали добавкой 3 мкМ валиномицина (Vat). Дополнительные добавки: 300 мМ GDP, для индукции хлорной проводимости - 100 мкМ

5.2. Хлорная проводимость и ее чувствительность к cAtr в митохондриях бурого жира.

В связи с отсутствием литературных данных о способности cAtr ингибировать функциональную активность UCP, можно было предположить, что cAtr, являясь специфическим ингибитором ANT, способен ингибировать и UCP, вследствие принадлежности этих белков к одному семейству. Поэтому мы провели контрольные опыты с митохондриями БЖТ, для которых характерна высокая проницаемость для ионов хлора, и добавка валиномицина, в среде содержащий 125 мМ KCl, приводит к набуханию митохондрий вследствие свободного входа противоиона калия в матрикс. Обнаружено (рис.11), что, cAtr в диапазоне

концентраций от 1 мкМ до 250 мкМ не препятствовал проводимости для ионов хлора в митохондриях БЖТ, и не оказывал влияния на ингибирующее действие GDP, что говорит об однонаправленности его действия только на ANT.

Рис.11. Набухание митохондрий БЖТ, вызванное входом ионов хлора (А), и ингибирование транспорта под действием 250 мкМ GDP (В), в контроле и в присутствии 250 мкМ cAtr. Условия эксперимента см. подпись к Рис.10, и Методы исследования.

Глава 6. Выделение разобщающих белков методом адсорбционной хроматографии, и их идентификация методом диск-электрофореза в градиенте пористости ПААГ с использованием SDS.

Описано (Klingenberg, Lin, 1986), что хроматография на гидроксилапатите при низкой ионной силе (30 мМ Na2S04) позволяет прочно адсорбировать большинство мембранных белков, экстрагированных из митохондрий БЖТ с помощью детергента Тритон Х-100, и при этих условиях слабо связывает UCP1, который может быть получен в элюате (рис.12)

Учитывая литературные данные о том, что количество разобщающих белков в других тканях, намного меньше, чем UCP1 в буром жире, мы модифицировали этот метод. Для максимального выхода UCP2 и UCP3, условия адсорбционной хроматографии подобрали таким образом, чтобы с колонки элюировались и другие белки, имеющие сходные структурные свойства. Увеличение ионной силы буферного раствора, уравновешивающего колонку с гидроксилаппатитом, до 150 мМ Na2S04, 10 мМ КН2Р04, 20 мМ Mops, 0.5 мМ ЭГТА, pH 7, ослабляет адсорбцию мембранных белков.

Для идентификации выделенных белков мы провели электрофорез в градиенте ПААГ с использованием SDS. Молекулярную массу белка определяли с помощью стандартных белков-маркеров с известными молекулярными массами. Результаты эксперимента представлены на рис. 12.

В буром жире, во фракциях, сошедших с колонки, обнаружен не только UCP1, молекулярная масса одной субъединицы 32 кДа, но и родственные ему белки-

2 мин

переносчики: ANT (30 кДа) и фосфатный переносчик (34 кДа). Среди белков, выделенных из митохондрий печени и скелетных мышц, и прошедших хроматографию при высокой ионной силе, были обнаружены ANT (30 кДа) и фосфатный переносчик (34 кДа). Полосы, соответствующей гомологам UCP1 (32 1 кДа), обнаружено не было.

Рис.12. Электрофоре) белков митохондрий БЖТ, мышц и | печени в градиенте ПААГ в -присутствии SDS. 1-белки-! маркеры. Белки митохондрий, экстрагированные с помощью Тритон Х-100: 2-БЖТ; 3-мышцы; 4-печень. 5- Выделение UCP1 из| БЖТ на гидроксилапатите при элюции ЗОмМ Na2S04 Элюаты белков при повышенной ионной силе: 6-БЖТ; 7-мышцы; 8-печень. PiC-фосфатный переносчик (34 кДа); иСР-разобщаюший белок (32кДа); ANT - ATP/ADP антипортер (30 кДа).

Несмотря на то, что модифицированный нами метод выделения и очистки не позволил обнаружить гомологов UCP1 в митохондриях печени и мышц, вопрос о | количестве этих белков в митохондриях нельзя считать закрытым. С другой стороны, наряду с другими нашими результатами, это свидетельствует о том, что | UCP2 и UCP3 не могут давать заметного вклада в разобщение с участием жирных кислот в митохондриях печени и скелетных мышц.

Глава 7. Дифференциальная активность генов, кодирующих UCP2, UCP3 и ANT в тканях печени и скелетных мышц сусликов.

7.1. Уровень экспрессии мРНК VCP2, UCP3 и ANT в печени.

Для оценки полученных нами результатов по измерению дыхания и мембранного потенциала в препаратах митохондрий печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus, желательно было получить объективные данные об уровне экспрессии белков UCP2 и UCP3 в этих тканях в соответствующих физиологических условиях. Представляется, что при соблюдении всех предосторожностей метод количественной RT-PCR в реальном времени, дающий количественную оценку мРНК, может дать объективную картину экспрессии генов UCP в тканях. Для оценки измеряемого уровня экспрессии UCP относительно других конститутивных генов, оценивалась экспрессия ANT и р-актина. Были тщательно подобраны праймеры, которые при амплификации соответствующих фрагментов с выделенной ДНК демонстрировали сходную эффективность.

Мы провели оценку уровня экспрессии мРНК UCP2 и UCP3 в ткани печени якутского зимнего активного суслика (рис.13). Экспрессии UCP3, в ткани печени, как и предполагалось, не было обнаружено. Небольшой сигнал RT-PCR для UCP3 не сопровождается образованием соответствующего продукта, а мРНК UCP2 в

кДа 166.0

66.2 45.0 35.0 25.0 18.4

*» I» :!

г-

1 2 3

Шж

PiC UCP ANT

7 8

ткани печени зимнего активного суслика была обнаружена в небольших количествах. Так как UCP2 по литературным данным, скорее всего, не экспрессируется в гепатоцитах, то такой результат, вероятно, обусловлен присутствием в печени Купферовских клеток или примесью крови. Известно, что UCP2 экспрессируется во всех макрофаго-содержащих тканях, таких как селезенка, тимус, костный мозг, и в лейкоцитах (Fleury et al., 1997). Однако митохондрии Купферовских клеток составляют лишь очень небольшую часть от всех митохондрий печени (Wake et al., 1989), и не могут вносить значительного вклада в измеряемые параметры дыхания и величину мембранного потенциала.

Рис.13. Оценка уровня экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT, в печени зимнего активного суслика по результатам RT-PCR в реальном времени. Содержание мРНК приводится в относительных единицах (2Ш , где ACt - разница пороговых циклов RT-PCR для данной мРНК и мРНК р-актина). Остальные условия см. Методы исследования.

UCP2

UCP3

ANT

Таким образом, можно предположить, что некоторый уровень экспрессии иСР2 в печени связан с присутствием в них небольшого количества макрофагов. Однако это не может заметно сказаться на функционировании препаратов митохондрий, полученных из этих тканей. И эти данные полностью соответствуют результатам наших экспериментов по исследованию скорости дыхания и величины мембранного потенциала митохондрий печени суслика и действию пуриновых нуклеотидов, сА1г и влиянию супероксида.

7.2. Уровень экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT в скелетных мышцах.

Проведено сравнение уровня экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT у летних и зимних сусликов в скелетных мышцах. Было обнаружено, что экспрессия UCP3 значительно возрастает в зимний период (рис.14). Наши результаты согласуются с известными из литературы данными для арктических сусликов (Boyer et al., 1998; Barger et al., 2006). Несмотря на это, заметных функциональных проявлений при регистрации параметров дыхания и величины мембранного потенциала зафиксировано не было (см. главу 2). С другой стороны, одинаковая величина эффектов ADP, GDP и cAtr у этих двух групп животных коррелирует с практически одинаковым уровнем экспрессии ANT. В скелетных мышцах летних и зимних сусликов также обнаружена экспрессия UCP2. Это неудивительно, так как мышцы включают в себя ткани и форменные элементы крови, для которых характерна экспрессия мРНК UCP2. В некоторых работах, было обнаружено присутствие мРНК UCP2 в сердце и мышцах крысы (Boss et al., 1997). Однако у мышей в этих же тканях даже мРНК UCP2 обнаружено не было (Fleury et al., 1997). У гибернирующего арктического суслика мРНК UCP2 в мышцах не выявлялась ранее (Boyer et al., 1998). В свете этих данных представленные нами результаты оценки уровня экспрессии разобщающих белков UCP и ANT в различных тканях

якутского суслика (БрегторШт ипсЫаШ) представляют самостоятельный интерес.

Таким образом, было обнаружено, что во время гибернации экспрессия ЧЛСРЗ в мышцах увеличивается в три раза по сравнению с летним периодом. Однако изложенные в предыдущих главах результаты четко указывают, что его роль не связана с реализацией индуцированного жирными кислотами терморегуляторного

разобщения, необходимого для

Летний

Зимний

UCP2 UCP3 ANT

хладоадаптации или выхода животных из состояния зимней спячки.

Рис.14. Оценка уровня экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT в скелетных мышцах летних и зимних сусликов. * -

отличия достоверны для UCP3 в тканях летних и зимних (р<0.001). См. подпись к Рис. 13. и Методы исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что более 10 лет прошло с момента открытия гомологов UCP, до сих пор нет единого мнения среди исследователей о функциях этих белков, более того, предметом споров является даже тот факт, что эти белки обладают физиологически значимой разобщающей активностью. Они изначально были описаны как разобщающие белки, поэтому в ранних исследованиях не уделяли внимания поиску альтернативных функций гомологов UCP1. Некоторые проводимые сейчас исследования выявляют недостатки и артефакты проводимых ранее экспериментов, например, на реконструированных системах (Azzu et al., 2008), в работах, выполненных с использованием антител (см. Cannon, Nedergaard, 2006).

В представленной работе показано, что все свойства белков UCP2 и UCP3, описанные в литературе (ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов и активация супероксидом), исходя из которых обычно делаются выводы об их функциональной активности в препаратах митохондрий, могут быть полностью объяснены участием ANT в разобщении под действием жирных кислот. Полученные результаты позволяют заключить, что распространенные к настоящему моменту представления о механизмах функционирования UCP в клетке и их значении в организме животных, в частности, в процессах хладоадаптации, термогенеза, на примере зимней спячки млекопитающих, не подтверждаются, и могут быть ошибочными.

частично уже нашли отражение в литературе. Возможно, эти белки выполняют иную, не связанную непосредственно с разобщением функцию. Например, участвуют в транспорте жирных кислот, или пирувата (Pecqueur et al., 2009).

ВЫВОДЫ

1. GDP в условиях ингибирования ANT не оказывает заметного ресопрягающсго действия на разобщенное в присутствии жирных кислот дыхание митохондрий печени и скелетных мышц сусликов Spermophiliis undulatus в различных физиологических состояниях, и в условиях воздействия на митохондрии супероксида, которое могло бы быть интерпретировано как функциональное проявление UCP2 и UCP3.

2. Обнаружено, что аспартат/глутаматный переносчик, так же, как и ANT, участвует в терморегуляторном разобщении в митохондриях печени просыпающихся сусликов.

3. Ресопрягающее действие GDP на митохондрии печени и мышц сусликов связано с конкурентным ингибированием ANT, как переносчика анионов жирных кислот, а не с присутствием в митохондриях печени и мышц белков UCP2 и UCP3.

4. В митохондриях печени и скелетных мышц сусликов отсутствует заметная проницаемость для ионов хлора, характерная для содержащих UCP1 митохондрий бурого жира, что свидетельствует о низком содержании либо полном отсутствии в этих тканях функционально-активных белков UCP2 и UCP3.

5. Обнаружено, что, cAtr в концентрации до 250 мкМ не влияет на проводимость для ионов хлора, обусловленную присутствием UCP1 в митохондриях БЖТ, что опровергает возможность ингибирования других разобщающих белков в присутствии cAtr.

6. Сорбционная хроматография на гидроксилапатите, в условиях, оптимизированных для выделения UCP1 из БЖТ, и в условиях, когда UCP1 совыделяется с другими белками - анионными переносчиками внутренней мембраны митохондрий, не позволяет обнаружить UCP2 и UCP3 в митохондриях печени и скелетных мышц суслика, что свидетельствует об их относительно низком содержании в митохондриях этих тканей.

7. У якутских сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации экспрессия мРНК UCP3 в мышцах увеличивается в три раза по сравнению с летним периодом, а экспрессия мРНК UCP2 в мышечной ткани достоверно не изменяется и вероятно связана с присутствием в мышечной ткани примеси клеток иммунной системы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Амерханов З.Г., Ком ели на (Смирнова) Н.П., Маркова О.В., Колаева С.Г., Соломонов Н.Г. Участие некоторых белков переносчиков в терморегуляторном усилении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Citellus undulatus), пробуждающихся из состояния зимней спячки// Доклады академии наук, т.397, №2, с. 1-4,2004.

2. Naumenko V.S., Tkachev S.E., Kulikov A.V., Semenova T.P., Amerkhanov Z.G., Komelina (Smirnova) N.P., Popova N.K. The brain 5-HT 1A receptor gene expression in hibernation// Genes, Brain and Behavior, 7: 300-305, 2008.

3. Komelina'N.P.. Amerkhanov Z. G. A comparative study of the inhibitory effects of purine nucleotides and carboxyatractylate on the uncoupling protein-3 and adenine nucleotide translocase// Acta Biochimica Polonica, Vol. 57(4): 413-419,2010.

4. Комелина (Смирнова) Н.П., Амерханов З.Г. Влияние GDP на разобщение с участием жирных кислот в митохондриях печени и скелетных мышц сусликов якутских (Citellus undulatus) //8-ая Международная школа- конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века», Пущино, 2004, с. 94.

5. Амерханов З.Г., Маркова О.В., Комелина (Смирнова) Н.П. Влияние GDP на взаимодействие жирных кислот и ADP с ATP/ADP антипортером в митохондриях печени и скелетных мышц// 3-ий Съезд Биофизиков России, тез.докл, Воронеж, 2004, с. 177.

6. Комелина (Смирнова) Н.П., Амерханов З.Г., Колаева С.Г. Влияние пуриновых нуклеотидов на разобщение окислительного фосфорилирования с участием свободных жирных кислот в митохондриях печени и скелетных мышц сусликов (Citellus undulatus) и роль разобщающих белков (UCPs) // 19-ый Съезд Физиологического общества им.И.П.Павлова, Екатеринбург, 2004, Российский физиологический журнал, Т.90, №8, с.52.

7. Амерханов З.Г., Комелина (Смирнова) Н.П. Конкурентное действие GDP и других нуклеотидфосфатов на ADP/ATP антипортер, разобщение окислительного фосфорилирования с участием свободных жирных кислот и роль разобщающих белков (UCPs) в термогенезе у гибернирующих сусликов// 19-ый Съезд Физиологического общества им.И.П.Павлова, Екатеринбург, 2004, Российский физиологический журнал, Т.90, №8, с.51,

8. Комелина (Смирнова) Н.П., Амерханов З.Г. Отсутствие термогенной активности гомологов UCP-1 в тканях печени и скелетных мышц сусликов, пробуждающихся из состояния гибернации// Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина», С-Петербург, 2005, Вестник молодых ученых, с. 112.

9. Амерханов З.Г., Комелина Н.П., Устимова И.В. Роль тканевых гомологов разобщающего белка и других митохондриальных белков- переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Citellus undulatus)// Труды международной научной конференции «Современные проблемы адаптации и биоразнообразия», Махачкала 2006, с. 127. М.Кашапова И.Ю., Комелина Н.П., Устимова И.В., Попов В.Н., Амерханов З.Г. Действие активных форм кислорода на сопряженность дыхания и фосфорилирования в митохондриях//11-ая Международная школа- конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века», Пущино, 2007, с.144. П.Амерханов З.Г., Кашапова И.Ю., Комелина Н.П. Возможная функциональная роль тканеспецифических митохондриальных разобщающих белков семейства UCP// Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные механизмы адаптации», Махачкала, 2008, с. 13.

12.Komelina N.P., Kashapova I.Yu., Amerkhanov Z. G. Examination of UCPs involvement in fatty acid-dependent superoxide-activated uncoupling//16th European Bioenergetics Conference, Warsaw, Poland: Biochim Biophys Acta, 1797 Supp!.: 88 (2010).

Подписано в печать:

14.04.2011

Заказ Л» 5332 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комелина, Наталья Павловна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1. Роль протонных утечек рассеивающих АцН* на внутренней мембране митохондрий и снижающих эффективность окислительного фосфорилирования.

1.1. Не сопряженное с фосфорилированием, свободное, дыхание в митохондриях и его возможные функции.

1.2. Механизм разобщающего действия жирных кислот.

2. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщающем действии жирных кислот.

2.1. АТР/АОР антипортер как разобщающий белок.

2.2. Аспартат/глутаматный переносчик как разобщающий белок. 14 2.3 Другие белки, участвующие в транспорте жирных кислот.

3. Разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани (1ГСР1).

3.1. Особенности митохондрий бурой жировой ткани.

3.2. Структура разобщающего белка.

3.3. Модели функционирования разобщающего белка.

4. Тканевые гомологи разобщающего белка(11СР).

4.1. История открытия гомологов иСР.

4.2. Распространение белков семейства иСР в различных тканях.

4.3. Биохимические свойства белков иСР2 и иСРЗ.

4.3.1. Активаторы и ингибиторы 11СР2 и иСРЗ.

4.3.2. Механизм разобщения для иСР2 и иСРЗ. :

4.4. Регуляция экспрессии генов иСР.

4.5. Предполагаемые функции иСР2 и иСРЗ.

4.5.1. иСР2 и ИСРЗ увеличивают термогенез.

4.5.2. иСРЗ участвуют в метаболизме жирных кислот.

4.5.3. ИСР защищают от образования активных форм кислорода.

4.5.4. иСР2 регулирует секрецию инсулина.

4.5.5. иСР2 вовлечен в процесс апоптоза.

4.5.6. иСР2 и ИСРЗ связаны с транспортом Са

4.5.7. иСР2 переключает метаболизм с углеводного на жировой.

4.5.8. иСР2 является маркеров макрофагов.

4.6. Особенности белков ИСР4 и иСР5.

4.7. Эволюция семейства иСР и распространение среди видов.

4.7.1. Распространение ИСР в различных систематических группах живых организмов.

4.7.2. Филогенез семейства иСР.

5. Зимняя спячка (гибернация) млекопитающих. Особенности физиологии и метаболизма^

5.1. Подавление метаболизма в состоянии гибернации.

5.2. Подавление функциональной активности митохондрий гибернирующих животных.

5.3. Активация окислительной активности митохондрий при выходе из состояния гибернации.

5.4. Адаптации на молекулярном уровне.

5.5. Исследования белков UCP у гибернирующих животных.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Выделение митохондрий из бурой жировой ткани, печени и скелетных 54 мышц.

2.3. Полярографический метод определения поглощения кислорода 55 суспензией митохондрий с помощью электрода Кларка.

2.4. Определение трансмембранного потенциала на внутренней мембране 55 митохондрий методом синтетических проникающих ионов с помощью

ТРР+ электрода.

2.5. Метод генерации супероксида с помощью системы ксантин плюс 56 ксантиноксидаза.

2.6. Анализ кинетических параметров конкурентного и неконкурентного 57 ингибирования.

2.7. Определение изменений объема митохондрий по светорассеиванию. •

2.8. Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.9. Экстракция белков с помощью детергентов.

2.10. Разделение белков на колонке с гидроксилапатитом.

2.11. Гель-фильтрация на сефадексе.

2.12. Диск-электрофорез белков в градиенте пористости ПААГ.

2.13. Выделение ДНК методом депротеинизации щелочным фенолом.

2.14. Выделение РНК из тканей.

2.15. Подбор праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа.

2.16. Реакция обратной транскрипции.

2.17. RT-PCR в реальном времени.

2.18. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ.

2.19. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты и их обсуждение. 66 3.1. Участие UCP2, аспартат/глутаматного переносчика и ATP/ADP антипортера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях печени зимних активных сусликов.

3.1.1. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на скорость дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов.

3.1.2. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на мембранный потенциал митохондрий печени зимних активных сусликов.

3.1.3. Действие супероксида на параметры дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.

3.1.4. Действие супероксида на величину мембранного потенциала митохондрий печени суслика и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.

3.1.5. Исследование параметров дыхания митохондрий легких, выделенных из зимних активных сусликов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)"

Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по своей аминокислотной последовательности, - UCP 2, был обнаружен во всех тканях млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3, который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным артефактом.

В настоящее время спектр обнаруженных UGP стал еще шире, и соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций, отличных от функций термогенина бурой жировой ткани, большинство авторов по-прежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях. Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.

У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT - карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика и UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не исследовалось.

В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и скелетных мышц сусликов Spermophilas imdulatus и дифференцировать предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих ингибиторов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Комелина, Наталья Павловна

выводы

GDP' в условиях ингибирования ANT не оказывает заметного ресопрягающего действия на. разобщенное в присутствии; жирных кислот дыхание митохондрий печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus в различных физиологических состояниях, и в условиях воздействия на. митохондрии супероксида, которое могло бы, быть интерпретировано как функциональное проявление UCP2 и UCP3. Обнаружено, что аспартат/глутаматный переносчик, так же, как и» ANT, участвует в терморегуляторном разобщении в митохондриях печени просыпающихся сусликов.

Ресопрягающее действие GDP на митохондрии печени и мышц сусликов связано с конкурентным ингибированием ANT, как переносчика анионов жирных кислот, а не с присутствием в митохондриях печени и мышц белков UCP2 и UCP3.

В митохондриях печени и скелетных мышц сусликов отсутствует заметная проницаемость для ионов хлора, характерная для содержащих UCP1 митохондрий бурого жира, что свидетельствует о низком содержании либо полном отсутствии в этих тканях функционально-активных белков UCP2 и UCP3.

Обнаружено, что, cAtr в концентрации до 250 мкМ не влияет на проводимость для ионов хлора, обусловленную присутствием UCP1 в митохондриях БЖТ, что опровергает возможность ингибирования других разобщающих белков в присутствии сAtr.

Сорбционная хроматография на гидроксилапатите, в условиях, оптимизированных для выделения UCP1 из БЖТ,. и в условиях, когда UCP1 совыделяется с другими белками - анионными переносчиками внутренней мембраны митохондрий; не позволяет обнаружить, UGP2 и - UCP3 в митохондриях печени и скелетных мышц суслика, что; свидетельствует об их относительно низком содержании в митохондриях этих тканей. У якутских сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации экспрессия мРНК UCP3 в мышцах увеличивается в три раза-по сравнению с летним периодом, а экспрессия мРНК UCP2 в мышечной ткани достоверно не изменяется и вероятно связана с присутствием в мышечной ткани примеси клеток иммунной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что более 10 лет прошло с момента открытия гомологов UCP, до сих пор нет единого мнения среди исследователей о функциях этих белков, более того, предметом споров является даже тот факт, что эти белки обладают физиологически значимой разобщающей активностью. Они изначально были описаны как разобщающие белки, поэтому в ранних исследованиях не уделяли внимания поиску альтернативных функций гомологов UCP1. Некоторые проводимые сейчас исследования выявляют недостатки и артефакты проводимых ранее экспериментов, например, на реконструированных системах (Azzu et al., 2008; Harper et al., 2002; Stuart et al., 2001), в работах, выполненных с использованием антител (см. Nedergaard, Cannon, 2003).

Для объяснения противоречия между разобщающей функцией, следующей из гомологии белков семейства UCP, и отсутствием достоверных данных о выявлении соответствующей активности в экспериментах на препаратах митохондрий может быть выдвинуто несколько предположений, не исключающих друг друга, которые частично уже нашли-» отражение в литературе. Возможно, эти белки выполняют иную, не связанную непосредственно с разобщением функцию. Например, участвуют в транспорте жирных кислот, или пирувата (Pecqueur et al., 2009).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комелина, Наталья Павловна, Пущино

1. Амерханов З.Г., Кашапова И.Ю., Попов В.Н. Роль UCP2 и АДФ/АТФ-антипортера в разобщающем действии супероксид-радикала на препараты митохондрий почек// Доклады Академии наук. 2008. - Т. 423. - №2.- с. 264-267.

2. Брустовецкий H.H., Гогвадзе В.Г., Маевский Е.И. Биохимические основы торможения и активации дыхания митохондрий печени гибернирующего суслика//Биологические науки. 1988. Т.4. С.14-20

3. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г. Ингибирование транспорта сукцината, в-оксибутарата и глутамата в митохондриях печени гибернирующего суслика//Журнал Эвол. Биохим. Физиол. 1989. Т.25. С.718-723

4. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г., Егорова М.В., Мохова E.H., Скулачев

5. B.П. Участие ATP/ADP антипортера и жирных кислот в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондрях печени сусликов при зимней спячке и пробуждении// Биохимия. 1991. Т.56, вып.5. С.947-953.

6. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Маевский Е.И. Окислительная активность и AVF митохондрий печени активного и гибернирующего суслика при различных условиях инкубации// Биохимия. 1991а. Т.58.1. C. 1522-1527

7. Гааггь Э., Медыш Г., Верецкей JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул.- М.: Мир, 1982. 448 с.

8. Даудова Г.М. Окислительное фосфорилирование в печени и скелетных мышц суслика при различных физиологических состояниях// Биохимия. 1968. Т.ЗЗ. С.148-152

9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика.-М.: Мир, 1991. 543 с.

10. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М.: Наука, 1985. 210 с.

11. Колаева С.Г. Роль эндогенных и экзогенных компонентов в формировании сезонных ритмов у зимоспящих. Экологическая физиология животных. Л: Наука, 1979, 4.1. с. 247-254.

12. Миронова Г.Д., Маслова Г.И., Федотчева М.А., Миронов Г.П. Участие митохондриальных систем транспорта калия в термогенезе теплокровных животных.- В сб. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. Наука. 1986. С. 64-68

13. Мохова E.H., Старков A.A., Бобылева В.А. Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях печени и мышц// Биохимия. 1993. Т.58, вып. 10. С.1513-1522.

14. Николе Д.Дж. Биоэнергетика: введение в хемиосмотическую теорию. М.: Мир, 1985. 190 с.15

Информация о работе

Комелина, Наталья Павловна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы