Изучение термогенеза у растений при низкотемпературном стрессе

Турчанинова, Виктория Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение термогенеза у растений при низкотемпературном стрессе
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение термогенеза у растений при низкотемпературном стрессе"

На правах рукописи

ТУРЧАНИНОВА Виктория Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОГЕНЕЗА У РАСТЕНИЙ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2006

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Войников Виктор Кириллович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук, профессор

Глянько Анатолий Константинович

Илли Иван Экидиусович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Казанский государственный университет

Защита диссертации состоится «23» июня 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 003.25.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr. irk. ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан «22» мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.003.047.01 кандидат биологических наук

Акимова Г. П.

— ч_> |-т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение адаптивных возможностей растений и их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды относится к центральным проблемам биохимии и физиологии растений. Особенно актуальными в данном направлении остаются исследования, направленные на установление механизмов адаптации растительных объектов к низким температурам. Прежде всего, это связано с тем, что низкотемпературный стресс и вызываемые им повреждения являются одними из основных факторов, ограничивающими рост, урожайность и распространение растений на земном шаре. Во многих случаях повышение морозоустойчивости культурных растений всего на 2—3 °С может обеспечить получение хорошего урожая там, где они пока не выращиваются из-за низкой температуры.

Из литературы известно, что негативное воздействие отрицательных температур обуславливается, прежде всего, образованием внутри- и внеклеточного льда, что приводит к обезвоживанию цитоплазмы и нарушению мембранных структур [Самыгин, 1974]. Кроме этого, при гипотермии, как и в других экстремальных условиях, в клетках развивается окислительный стресс. При этом усиливаются процессы образования активных, токсичных для клетки, форм кислорода, способных инак-тивировать многие ферментные системы и инициировать перекисное окисление макромолекул клетки [Владимиров, Арчаков, 1972; МсКегае, 1996]. В то же время низкие температуры вызывают значительную перестройку клеточного метаболизма, направленную на преодоление действия этого стрессового фактора К числу наиболее изученных к настоящему времени защитных механизмов относятся: накопление растворимых углеводов, гидрофильных белков, пролина, т.е. веществ способных связывать воду в своих гидратных оболочках, препятствуя образованию внутриклеточного льда и обезвоживанию [Левитт, 1983; Касперска-Палач, 1983; Стаценко, 1994]; увеличение степени ненасыщенности жирных кислот в составе фосфолипидов мембран, что повышает проницаемость клеточных мембран для воды и предотвращает их повреждение [Кравец, 1996]; накопление антиоксидантов [Веселовский, Веселова, 1990]; а также синтез специфических (стрессовых) белков, таких, как антифризные белки, молекулярные шапероны, дегидрины и белки, разобщающие окисление и фосфорилирование [СасепЬу, УНшпеп, 1994; ТЪота81ю\у, 1998; Не^Ьег^ а1., 1999; Шсцшсг, ВоиШаис!, 2000].

Известно, что при разобщении процессов окисления и фосфо-рилирования выделяется тепло [Скулачев, 1989]. Генерацию тепла клетками принято называть «термогенезом». К природным эндогенным разобщителям относятся длинноцепочечные жирные кислоты, содержание которых в растительной клетке повышается при охлаж-

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА 3 С.-Петербург ОЭ 200£акт.Л&)

дении [Войников и др., 1980; 1981а, б]. В качестве разобщителей окислительного фосфорилирования они могут действовать самостоятельно, либо совместно со специфическими белками. Большинство известных к настоящему времени разобщающих белков (UCP, uncoupling protein) принадлежит к семейству митохондриальных анионных переносчиков, локализованных во внутренней мембране органелл [Jezek et al., 1998]. У злаков обнаружен также белок холодового шока с мол. массой 310 кДа (БХШ 310), который вызывает разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях при низкотемпературном стрессе, но в отличие от UCP-подобных белков его функционирование не требует наличия свободных жирных кислот [Колесниченко и др., 1996; Войников и др., 2001]. Помимо разобщающих белков в генерацию тепла растительными клетками вносит вклад цианидрезис-тентная альтернативная оксидаза [Vanlerberghe, Mcintosh, 1997]. Хотя вопрос о роли термогенеза в защите растений от повреждения низкими температурами в мировой литературе широко дискутируется [Breidenbach et al., 1997; Jarmuszkiewicz et al., 2001], общая точка зрения на это явление еще не сложилась.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физиологической роли функционирования энергорассеивающих систем митохондрий в защите проростков растений при низкотемпературном стрессе. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) сопоставить кривые охлаждения живых и «убитых» проростков растений при заданной внешней температуре; 2) установить влияние степени охлаждения на генерацию тепла проростками; 3) изучить влияние разобщения процесса окисления и фосфорилирования на уровень тепловыделения и выживаемость проростков растений при действии низких температур; 4) изучить влияние ингибиторов митохондриальных энергорассеивающих систем на уровень термогенеза и выживаемость проростков растений, подвергнутых холодовому шоку; 5) определить влияние закаливания на интенсивность поглощения кислорода, уровень термогенеза и выживаемость проростков после низкотемпературного стресса; 6) исследовать влияние ингибиторов и активаторов митохондриальных энергорассеивающих систем на интенсивность перекисного окисления липидов у проростков растений при низкотемпературном стрессе.

Научная новизна. В настоящей работе проведено исследование влияния функционирования некоторых энергорассеивающих систем митохондрий на уровень термогенеза, интенсивность образования АФК и выживаемость проростков при низкотемпературном стрессе.

Впервые установлено, что термогенез является широко распространенным явлением среди проростков растений при низкотемпера-

турном воздействии. При этом показано, что уровень генерации тепла проростками растений повышается при снижении стрессирующей температуры. Показано, что термогенез у проростков озимой пшеницы зависит от функционирования альтернативной оксидазы, разобщающих белков типа иСР и стрессового белка БХШ 310. У проростков гороха выявлены первые две термогенные системы.

Впервые показано, что инфильтрация проростков озимой пшеницы экзогенными разобщителями окислительного фосфорилирова-ния оказывает положительный эффект на жизнеспособность проростков во время низкотемпературного стресса. Обработка экзогенными разобщителями вызывает как усиление поглощения кислорода проростками, так и усиление термогенеза в их тканях. Одновременно она вызывает увеличение выживаемости проростков во время низкотемпературного стресса. Установлено, что ингибирование энергорассеи-вающих систем приводит к снижению температуры тканей и уменьшает количество выживших после стресса проростков. Установлено, что все исследованные энергорассеивающие системы участвуют в защите проростков озимой пшеницы от окислительного стресса при действии низких температур.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые полученные данные о физиологической роли энергорассеивающих систем митохондрий позволяют выдвинуть гипотезу об участии данных систем в защите проростков растений при воздействии низких температур. Понимание физиологической роли разобщающих белков и альтернативной оксидазы при низкотемпературном стрессе может быть использовано для целенаправленного получения устойчивых к низким температурам сортов растений ценных в хозяйственном отношении. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе, при чтении лекций по физиологии и биохимии растений.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из них 10 в рецензируемых журналах. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на лабораторных, межлабораторных семинарах Сибирского Института физиологии и биохимии растений СО РАН (2002-2004 гт.), на научной сессии Института (2004), на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, Республика Коми, 2001), на ежегодной научно-теоретической конференции молодых ученых (Иркутск, 2001), на ХЬ Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 24 рисунка; состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, заключения, выводов и библиографии. Библиография включает 265 наименований, из них 104 на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы растения озимой пшеницы (Tríticum aestivum L., сорт «Иркутская озимая»), озимой ржи (Secale cereale L., сорт Чулпан), кукурузы (Zea mays L., гибрид ВИР 36) и гороха (Pisum sativum, сорт «Марат»). В экспериментах использовали этиолированные 3-х дневные побеги злаков и 6-ти дневные побеги гороха. Инги-бирование терминальной оксидазы осуществляли KCN (10 мМ), циа-нидрезистентной оксидазы — БГК (25 мМ), фосфолипазы-А2 — про-каином (40 мМ), БХШ 310 — антисывороткой (1 мг/мл), которые ин-фильтровали в ткани проростков в течение 40 мин непосредственно перед экспериментом. Также проводили 40-минутную инфильтрацию растений СССР (конечная концентрация составляла 1—10 мкМ) либо БХШ 310 (0,5 мг/мл, что соответствует 1,5 мкМ). Для оценки выживаемости использовали проростки с удаленными зерновками. Контролем служили проростки, инфильтрованные водой.

Температуру тканей побегов регистрировали с помощью термопары медь-константан (диаметр проволоки 0,1 мм), подключенной к входу дифференциального микровольтметра. Чувствительность прибора составляла 0,025 °С. Измерения проводили по методу, описанному в работах В.К. Войникова с соавторами [Войников, Корзун, 1984; Vojnikov et al., 1984]. В ходе эксперимента измерялась температура живых и «убитых» при помощи кипячения проростков. Результаты экспериментов оформляли в виде графиков зависимости разницы температур живых и «убитых» образцов ткани от времени охлаждения растительного материала. На рисунках указаны средние значения и их стандартные ошибки.

Об интенсивности дыхания судили по скорости потребления кислорода проростками. Потребление кислорода проростками озимой пшеницы (0,1 г) оценивали полярографически при 27 °С с использованием платинового электрода закрытого типа в ячейке объемом 1,4 мл [Estabrook, 1967]. Реакционная среда содержала 50 мМ КН2Р04 (рН 5,2) и 50 мМ сахарозу. Потребление кислорода проростками выражали в нмоль 02/мин/г сырого веса. В таблице указаны средние значения и стандартные отклонения.

Для определения выживаемости инфильтрованные проростки в количестве 50 штук подвергали холодовому шоку, который имел 20-ти минутную экспозицию при —4 "С. После холодового шока проростки

помещали в термостат с температурой 25—26 "С. Через трое суток отрастания проводили подсчет выживших проростков в процентном отношении от их общего числа. Представлены средние арифметические не менее чем из 10 независимых экспериментов, каждый из которых проведен в 3-кратной биологической повторности, и их стандартные ошибки.

Определение диеновых конъюгатов (продуктов ПОЛ) у тканей растений проводили по модифицированному методу Стальной [1977]. Для этого побеги проростков озимой пшеницы (3 г) после инфильтрации подвергали холодовой обработке в термостате при —4 °С, 1 час. Обработанные проростки гомогенизировали с 6 мл среды содержащей 175 мМ КС1 и 25 мМ Трис-НС1 (рН 7,4). После инкубации к 1 мл суспензии или 1 мл гомогената добавляли 9 мл экстрагирующей смеси гексана с изопропанолом в объемном отношении 1 : 1. К полученной суспензии добавляли 1/10 объема дистиллированной воды. После интенсивного двукратного встряхивания и расслаивания фаз отбирали гексановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляли этиловый спирт в объемном отношении 1 : 6. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», СССР) при 233 нм в кварцевых кюветах (ход луча 10 мм). В качестве контроля использова-. ли пробы, содержащие только экстрагирующую фазу.

Во всех случаях биологическая повторность экспериментов не менее чем 6-ти кратная. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и ошибки средних [Лакин, 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Термогенез у проростков растений при низкотемпературном стрессе

1.1. Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой пшеницы при заданной внешней температуре

Эксперименты показали, что при внешней температуре 0 и —4 °С разница температур (дг) в объеме живых и «убитых» проростков озимой пшеницы достигала максимума (~2 °С) в 15—20 минут с начала холодового шока, затем она снижалась до 1—0,5 °С и сохранялась на таком уровне в течение одного часа охлаждения (рис. 1). При понижении стрессирующей внешней температуры до —7 °С Л! живых и «убитых» проростков достигала за 15—20 минут холодового шока ~5 °С. Затем она падала до ~1 °С. При усилении холодового шока (—10 °С) А1 живых и «убитых» проростков составляла 7—8 °С (рис. 1). Таким образом, термогенез проростков является, по-видимому, регулируемым ответом растений на охлаждение и определяется внешними условия-

ми, то есть интенсивностью стресса. При этом необходимо отметить, что хотя точка замерзания воды (кристаллизации) у живых и «убитых» тканей лежала в одном температурном диапазоне, у живых тканей для ее достижения требовался гораздо больший временной интервал, что позволяет предположить, что термогенез является адаптивным приспособлением, позволяющим растениям выиграть некоторое время для включения других защитных механизмов.

О 10 20 30 40 50 60

время, мин

Рис. 1. Разница температур живых и «убитых» проростков озимой пшеницы во время холодового шока при 0 "С (1), -4 °С (2), -7 °С (3) и -10 °С (4)

1.2. Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой ржи, кукурузы и гороха при заданной внешней температуре

Для изучения термогенеза у проростков растений необходимо было выяснить, является ли это явление общим среди растений, или носит видоспецифичный характер. В связи с этим, было исследовано влияние интенсивности холодового шока на ход дифференциальных кривых охлаждения проростков озимой ржи, гороха и кукурузы. Для этих растений были использованы два температурных режима: 0 и — 4 "С (рис. 2), т.к. при более низких температурах в проростках кукурузы быстро образовывался лед. Сопоставление кривых охлаждения живых и «убитых» растительных тканей показало, что термогенез присущ проросткам представителей как холодостойких злаков (озимая рожь), так и теплолюбивых (кукуруза) (рис 2). Из двудольных растений был изучен горох. Его живые проростки также генерировали тепло, поддерживая температуру выше, чем у «убитых» (рис. 2). Таким образом, можно сделать вывод, что явление термогенеза характерно не только для проростков озимой пшеницы, но и для других злаков, а также двудольных растений (горох). Необходимо отметить, что у проростков

устойчивых к низким температурам ржи и гороха ход термических кривых был практически одинаковым как при О °С, так и при —4 'С. Напротив, у проростков кукурузы термогенез зависел от внешней температуры и при —4 °С был более ярко выражен (рис. 2).

время, мин А

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

время, мин Б

Рис. 2. Разница температур живых и «убитых» проростков кукурузы, гороха и озимой ржи при внешней температуре 0 °С (А) и —4 "С (Б)

1.3. Вклад различных термогенных систем в термогенез

у растений

Для того чтобы выяснить, каков вклад различных митохондри-альных энергорассеивающих систем в термогенез у проростков растений при низкотемпературном стрессе, было проведено изучение

воздействия ингибиторов иСР-подобных белков, БХШ 310, альтернативного и цитохромного пути переноса электронов на ход дифференциальных термических кривых охлаждения проростков озимой пшеницы и гороха. Проростки гороха были выбраны для сравнения, поскольку ранее было установлено, что в белковом спектре гороха присутствуют иммунохимически родственные БХШ 310 белки, но с другими мол. м., чем у злаков [СгаЬе1пусИ е1 а1., 2001], и сыворотка против БХШ 310 не оказывает влияние на уровень сопряженности митохондрий гороха [КоквтсИепко е1 а1., 2001].

Предварительно было исследовано влияние ингибиторов известных митохондриальных энергорассеивающих систем на дыхание проростков озимой пшеницы (табл. 1). Как известно, прокаин ингибирует фосфолипазу А2, снижая содержание свободных жирных кислот, кофакторов иСР-опосредованного разобщения. Бенз-гидроксамовая кислота (БГК) является ингибитором альтернативной оксидазы. Установлено, что инфильтрация проростков озимой пшеницы прокаином так же, как и БГК, снижает интенсивность потребления ими кислорода на 30 % по отношению к контролю. Ингибирование терминальной оксидазы осуществляли цианидом калия. При этом наблюдали 68 % снижение потребления кислорода проростками. Одновременная инфильтрация проростков цианидом и БГК снижала уровень дыхания проростков примерно на 80 % (табл. 1). Таким образом, все изученные в ходе данных экспериментов ингибиторы снижали интенсивность дыхания проростков, влияя, по-видимому, на процесс окисления и фосфорилирования в митохондриях растений.

Таблица 1

Интенсивность дыхания проростков озимой пшеницы, инфильт-рованных различными ингибиторами

Варианты опыта Поглощение кислорода, нмоль Ог/мин/г сырого веса

Контроль (инфильтрация водой) 449,43 ±41,17

Прокаин (40 мМ) 318,23144,03

КСМ(ЮмМ) 139,96 + 8,99

БГК (25 мМ) 340,82 ± 37,16

КСМ (10 мМ) + БГК (25 мМ) 107,97 ±21,28

Далее был установлен эффект ингибиторов на термогенез озимой пшеницы. Эксперименты проводились при —4 °С. Инфильтрацией проростков KCN выявляли возможный вклад в термогенез альтернативной оксидазы, который составлял примерно половину от полной генерации тепла (рис. 3).

время, мин

Рис. 3. Разница температур инфильтрованных водой и «убитых» (контроль), инфиль-трованных прокаином и «убитых» (прокаин), инфильтрованных КС^ и «убитых» (КСМ) и инфильтрованных анти-БХШ 310 и «убитых» (анти-БХШ 310) проростков озимой пшеницы сорта «Иркутская озимая» во время холодово-го шока при -4 °С

Ингибирование ИСР-подобных белков и БХШ310 (прокаином и антисывороткой против БХШ 310, соответственно) снижало генерацию тепла, причем примерно одинаково. Таким образом, было выявлено наличие как минимум трех термогенных систем у проростков озимой пшеницы. Первая из них связана с цианидрезистентной оксида-зой, вторая — с разобщением окисления и фосфорилирования при помощи свободных жирных кислот и иСР-подобных белков, а третья — со стрессовым белком БХШ 310.

Поскольку нами был установлено, что проростки гороха отвечают на холодовой шок генерацией тепла, мы провели исследование вклада отдельных митохондриальных энергорассеивающих систем в термоге-нез у проростков этого двудольного растения. Измерение термогенеза у проростков гороха, проводили при внешней температуре 0 °С. Полученные дифференциальные кривые охлаждения представлены на рис. 4. Инфильтрацией проростков гороха цианидом выявляли вклад в тер-могенез альтернативной оксидазы. Инфильтрацией проростков прокаином снимали термогенный эффект разобщающих иСР-подобных белков. Было установлено, что iC.CN и прокаин в равной степени снижали разность температур (ДО живых и «убитых» проростков в первые 15— 20 минут (рис. 4). Таким образом, можно полагать, что у гороха выявлены две термогенные системы — иСР-подобные разобщающие белки, чья активность зависит от присутствия свободных жирных кислот, и цианидрезистентная альтернативная оксидаза (рис. 4).

2,5

1,5

0,5

время, мин

Рис. 4. Разница температур живых и «убитых» (контроль), инфильтрованных прока-ином и «убитых» (прокаин) и инфильтрованных КСЫ и «убитых» (КС1М) проростков гороха во время холодового шока при 0 "С

2. Изучение влияния разобщителей и ингибиторов дыхания на выживаемость проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе

Как показано выше у проростков озимой пшеницы термогенез происходит с участием альтернативной оксидазы, иСР-подобных белков и стрессового белка БХШ 310. Вместе с тем остается невыясненным вопрос о физиологической роли процесса разобщения окисления и фосфорилирования у растений во время холодового шока. Таким образом, дальнейшим этапом исследования явилось изучение влияния обработки экзогенными разобщителями окисления и фосфорилирования в митохондриях, а также ингибирования различных известных ми-тохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе.

2.1. Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на выживаемость проростков озимой пшеницы подвергнутых

холодовому шоку

Для изучения роли разобщения окисления и фосфорилирования в жизнедеятельности проростков озимой пшеницы необходимо было количественно оценить разобщающие эффекты искусственного разобщителя с хорошо изученным механизмом действия протонофора карбонилцианид-т-хлорофенилгидразона (в англ. транскрипции — СССР) и стрессового белка БХШ 310 (табл. 2). Нами установлено, что 40-минутная инфильтрация проростков водным раствором БХШ 310 при оптимальной его концентрации вызывала увеличение интенсив-

ности дыхания проростков на 21 % по отношению к контрольным (инфильтрованным водой) проросткам. Это составляет 2/3 соответствующего эффекта СССР.

Таблица 2

Интенсивность поглощения кислорода проростками озимой пшеницы, инфильтрованными водой (контроль), СССР и БХШ310

Варианты опыта Поглощение кислорода, нмоль 02/мин/г сырого веса

Контроль (инфильтрация водой) 362,44 ±12,92

СССР (2 мкМ) 473,19± 11,16

БХШ 310 (1 мг/мл) 439,50 ±12,93

Поскольку процессы разобщения и термогенеза взаимосвязаны, можно было ожидать, что данные разобщители повлияют также на ход дифференциальных кривых охлаждения проростков. В связи с этим измеряли термогенез проростков во время холодового шока при внешней температуре —4 °С. Полученные кривые имели ярко выраженные максимумы, которые достигались в первые 10—15 минут холодового шока. При этом уровень термогенеза у проростков инфильтрованных БХШ 310 повышался на 50 %, а инфильтрованных СССР на 75 % по сравнению с контролем (рис. 5). Таким образом, можно сделать вывод, что термогенные функции разобщающих агентов определяются их влиянием на интенсивность поглощения кислорода проростками.

3,5 3

2,5 2

1,5 1

0 5 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

время мин

Рис. 5. Разница температур инфильтрованных водой и «убитых» (контроль), инфильтрованных СССР и «убитых» (СССР), инфильтрованных БХШ 310 и «убитых» (БХШ 310) проростков озимой пшеницы во время холодового шока при -4 °С

Для проверки влияния разобщения процессов окисления и фос-форилирования на выживаемость проростков озимой пшеницы был

проведен ряд экспериментов, в ходе которых инфильтрованные проростки в количестве 50 штук подвергали холодовому шоку (20 мин, —4 °С). Полученные данные свидетельствовали, что инфильтрация проростков разобщающим агентом (СССР), а также инфильтрация их стрессовым белком БХШ310 повышала выживаемость проростков озимой пшеницы на 15—20 % при 20-ти минутном низкотемпературном воздействии (рис. 6). Таким образом, можно сделать заключение, что разобщение, вызывая термогенез, участвует в защите растения от повреждающего действия низких температур.

Рис. 6. Выживаемость проростков озимой пшеницы сорта «Иркутская озимая», ин-фильтрованных водой (контроль), СССР (2 мкМ), БХШ 310 (1 мг/мл) после низкотемпературного стресса (-4 "С, 20 мин)

2.2. Влияние ингибиторов митохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых низкотемпературному стрессу

Исследовано также влияние инфильтрации проростков озимой пшеницы ингибиторами митохондриальных термогенных систем на их жизнеспособность во время холодового шока. Инфильтрация проростков цианистым калием (КС1Ч), а также инфильтрация прокаином, в равной степени влияли на жизнеспособность растений, подвергнутых холодовому шоку. В обоих вариантах опыта выживаемость проростков после кратковременного низкотемпературного стресса была примерно на 20 % ниже контрольной (рис. 7). Ингибирование альтернативной оксидазы бензгидроксамовой кислотой (БГК) приводило к уменьшению количества выживших проростков на 30 % (рис. 7). Таким образом, ингибирование каждой из изученных митохондриальных систем разобщения окисления и фосфорилирования приводило к снижению выживаемости растений. Представленные результаты хо-

рошо согласуются с ранее полученными данными о влиянии функционирования митохондриальных разобщающих белков и альтернативной оксидазы на термогенез проростков при низкотемпературном стрессе При одновременной инкубации проростков с KCN и БГК регистрировали 70 %-ное снижение выживаемости, в то время как инфильтрация проростков раствором БГК и прокаина снижала выживаемость лишь на 60 % (рис. 7). Это свидетельствует, по-видимому, о существовании еще каких-то систем разобщения, помимо иСР-по-добных белков, принимающих участие в защите проростков и связанных с основным дыхательным путем. Возможно, такой системой является стрессовый белок БХШ 310, разобщающий эффект которого не зависит от наличия свободных жирных кислот и, следовательно, не ингибируется прокаином. В то же время, как было показано ранее, БШХ 310 не является активатором альтернативной оксидазы, поскольку вызванное его добавлением увеличение нефосфорилирующего дыхания ингибируется KCN [РоЬегЫтоуа е1 а1., 2001].

Рис. 7. Выживаемость проростков озимой пшеницы сорта «Иркутская озимая», ин-фильтрованных водой (контроль), прокаином 40 мМ (прокаин), цианистым калием 10 мМ (КСМ), бензгидроксамовой кислотой 25 мМ (БГК), бензгидрок-самовой кислотой и прокаином (БГК+прокаин), а также бензгидроксамовой кислотой и цианистым калием (БГК+КСЫ) после кратковременного низкотемпературного стресса (-4 "С, 20 мин)

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют, что инфильтрация проростков озимой пшеницы экзогенными разобщителями окислительного фосфорилирования оказывает положительный эффект на жизнеспособность проростков во время низкотемпературного стресса. Обработка экзогенными разобщителями вызывает как усиление поглощения кислорода проростками, так и усиление

термогенеза в их тканях Одновременно она вызывает увеличение выживаемости проростков во время низкотемпературного стресса. При изучении роли известных митохондриальных термогенных систем в жизнеспособности проростков озимой пшеницы во время холодово-го шока установлено, что ингибирование данных систем, приводящее к снижению температуры тканей, уменьшает количество выживших после стресса проростков.

3. Исследование термогенеза у закаленных проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе

Известно, что морозоустойчивость растений повышается в процессе закаливания. При этом происходят значительные изменения клеточного метаболизма, направленные на формирование и активацию защитных систем организма [Туманов, 1979; Касперска-Палач, 1983]. Следовательно, необходимо было выяснить, как закаливание влияет на термогенез. Эксперименты показали, что закаливание значительно изменяло картину термогенеза: закаленные проростки озимой пшеницы отвечали на холодовой шок более слабой генерацией тепла (рис. 8). Необходимо отметить, что выживаемость закаленных проростков озимой пшеницы, подвергнутых холодовому шоку, была близка к 100 %. Это, скорее всего, объясняется тем, что во время закаливания у проростков подготавливаются механизмы защиты к действию низких температур, поэтому они не нуждаются в термогенезе. В то же время, незакаленные проростки, отвечая на холодовой шок генерацией тепла, какое-то время поддерживают свою температуру выше внешней, что позволяет им активировать защитные системы.

Рис. 8. Влияние холодового шока -4 °С на разницу температур живых и «убитых» незакаленных (контроль) и закаленных при +4 °С в течение 7 суток (закаленные) проростков озимой пшеницы

4. Изучение роли разобщенного и несопряженного дыхания в процессах ПОЛ у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса

Как известно, одним из возможных следствий функционирования энергорассеивающих систем митохондрий является их воздействие на содержание в клетке активных форм кислорода, инициирующих перекисное окисление липидов (ПОЛ) [Бкиксйеу, 1994; Сазо1о е1 а1., 2000]. Поскольку ПОЛ является общей неспецифической реакцией растительной клетки на действие стрессовых факторов различной природы, можно допустить, что снижение уровня АФК в клетке будет приводить и к снижению вредного воздействия холодового шока. В связи с этим было проведено исследование влияния ингибиторов и активаторов альтернативной оксидазы и иСР-подобных белков на протекание процессов ПОЛ у проростков озимой пшеницы после низкотемпературной обработки. Предварительно было рассмотрено их влияние на интенсивность потребления кислорода проростками. Инфильтрация проростков как БГК, так и прокаином уменьшала потребление кислорода проростками после низкотемпературного стресса на 25 % по отношению к стрессированным контрольным проросткам (рис. 9). При этом пируват, активатор альтернативной оксидазы, приводил к повышению уровня скорости потребления кислорода примерно на 20 %. При инфильтрации проростков линолеатом, кофактором иСР-опосредованного разобщения, наблюдали увеличение интенсивности потребления кислорода на 100 % (рис. 9).

900 -р--------------------------—--—--------—

800 - - - — --- - — , _ _ --ИВ---

Контроль Стресс Пируват БГК линолеат Прокаин

Рис. 9. Влияние активаторов и ингибиторов митохондриальных энергорассеивающих систем на интенсивность дыхания у проростков озимой пшеницы сорта «Иркутская озимая» при низкотемпературном стрессе (-4 °С, 1 час)

О пёрекисном окислении липидов у проростков судили по уровню образования диеновых конъюгатов. При ингибировании альтернативной оксидазы БГК наблюдали 20 % индукцию ПОЛ по сравнению с контролем после стресса. При ее активировании пируватом — 30 % снижение (рис. 10). Было также установлено, что ингибирование прокаином ТЛСР-подобных белков не оказывало заметного действия на протекание процессов ПОЛ в стрессированных проростках озимой пшеницы. Инфильтрация проростков линолеатом приводила к 30 % снижению интенсивности ПОЛ (рис. 10). В то же время, интересно отметить, что даже в том случае, когда инфильтрация ингибиторами не оказывала влияния на уровень ПОЛ, она вызывала уменьшение термогенеза и выживаемости.

S 110 т

* 40

контроль стресс Пиру ват БГК Линолеат прокаин

Рис. 10. Влияние активаторов и ингибиторов митохондриальных энергорассеиваю-щих систем на перекисное окисление липидов у проростков озимой пшеницы сорта «Иркутская озимая» при низкотемпературном стрессе (-4 "С, 1 час)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

пространенным явлением среди растений. Изучение влияния степени охлаждения на уровень генерации тепла проростками показало, что на снижение стрессирующей температуры проростки отвечали усилением термогенеза. Результаты экспериментов позволяют сделать вывод, что чем ближе внешняя температура к повреждающей, тем интенсивнее начинает работать данный механизм. По-видимому, термогенез является регулируемым ответом растений на охлаждение и определяется внешними условиями, то есть интенсивностью действия стрессора. Хотя с другой стороны, возможно, предположить также, что при повреждении в клетке усиливаются окислительные процессы, сопровождающиеся выделением тепла, чем и объясняется интенсификация термогенеза. В связи с этим следует упомянуть, что хотя точка кристаллизации воды у живых и «убитых» тканей лежала в одном температурном диапазоне, для ее достижения живым тканям требовался гораздо больший временной интервал, что говорит о возможном адаптивном характере термогенеза.

Полученные данные о влиянии ингибиторов дыхания на температуру проростков показали, что в термогенезе участвуют такие энер-горассеивающие митохондриальные системы, как альтернативная ок-сидаза и разобщающие белки. При этом, если у озимой пшеницы были обнаружены, как минимум, три термогенные системы (альтернативная оксидаза, иСР-подобные белки и разобщающий белок БХШ 310), то у проростков гороха при низкотемпературном стрессе были выявлены первые две термогенные системы. Вероятно, наличие у проростков озимой пшеницы дополнительной термогенной системы, опосредованной активностью БХШ 310, является эволюционным приобретением в связи с озимым образом жизни для повышения устойчивости к действию низких температур.

Изучение влияния разобщителей окислительного фосфорилиро-вания на температуру проростков озимой пшеницы и их выживаемость после 20 мин низкотемпературного воздействия (—4 °С) показало, что разобщение, вызывая термогенез, участвует в защите растения от повреждающего действия низких температур. Это же подтвердили эксперименты по исследованию роли митохондриальных термогенных систем в жизнеспособности проростков озимой пшеницы во время холодового шока, в ходе которых было установлено, что ингибирование данных систем, приводящее к снижению температуры тканей, уменьшает количество выживших после стресса проростков.

Анализ влияния закаливания на температуру проростков позволил установить, что у закаленных проростков озимой пшеницы при холодовом шоке наблюдался слабо выраженный термогенез. Вероятно, во время закаливания у проростков формируются механизмы защиты от повреждающего действия низких температур, и они уже не нуждаются в функционировании энергорассеивающих систем.

Сравнительный анализ влияния активаторов и ингибиторов энер-горассеивающих систем на перекисное окисление у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса показал, что исследованные системы как несопряженного, так и разобщенного дыхания, могут участвовать в защите растений от действия низких температур, уменьшая уровень АФК, генерируемый митохондриями растительной клетки.

Таким образом, суммируя полученные данные можно сделать вывод, что функционирование энергорассеивающих систем, сопровождающееся термогенезом, а также снижением уровня формирования АФК митохондриями, играет защитную роль при низкотемпературном стрессе, предохраняя клетки растений от губительного образования внутриклеточного льда и повреждений, вызванных активацией ПОЛ.

ВЫВОДЫ

1. В проростках растений при низкотемпературном стрессе происходит термогенез.

2. Уровень генерации тепла проростками растений зависит от интенсивности низкотемпературного воздействия.

3. Термогенез у проростков озимой пшеницы является следствием функционирования альтернативной оксидазы, разобщающих белков типа иСР и стрессового белка БХШ 310 У гороха выявлены первые две термогенные системы.

4. Инфильтрация проростков разобщителями процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях повышает температуру и выживаемость проростков озимой пшеницы при кратковременном низкотемпературном стрессе.

5. Инфильтрация ингибиторами митохондриальных энергорассеивающих систем снижает выживаемость проростков озимой пшеницы при кратковременном низкотемпературном стрессе.

6. Закаливание проростков озимой пшеницы вызывает уменьшение уровня термогенеза во время низкотемпературного стресса.

7. Все исследованные энергорассеивающие системы участвуют в защите проростков озимой пшеницы от окислительного стресса при действии низких температур, уменьшая интенсивность образования АФК.

8. Вся совокупность полученных данных позволяет заключить, что функционирование энергорассеивающих систем, которое сопровождается термогенезом и уменьшением уровня образования АФК в митохондриях растений, положительно влияет на способность проростков озимой пшеницы переносить кратковременный низкотемпературный стресс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kolesnichenko А, Pobezhimova Т., Grabelnych О., Tourchaninova V., Voinikov V. An influence of cold stress on temperature of maize shoots // Maize genetics cooperation newsletter. — 2001 — Vol. 75. — P. 24.

2. Voinikov V , Grabelnych O., Pobezhimova Т., Korzun A., SuminaO., Tourchaninova V., Kolesnichenko A. Plant stress uncoupling protein CSP 310 caused thermogenesis in winter wheat mitochondria in vitro // J. Plant Physiol.

- 2001. - Vol. 158, N 6. - P. 807-810.

3. Войников B.K., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Корзун А.М., Сумина О.Н., Турчанинова В.В., Колесниченко А.В. Стрессовый разобщающий растительный белок БХШ 310 индуцирует термогенез в митохондриях пшеницы при гипотермии in vitro //Доклады РАН. — 2001.

- Т. 377, N 4. - С. 565-567.

4. Kolesnichenko A., Grabelnych О., Tourchaninova V., ZykovaV., KorolevaN., Pobezhimova Т., Voinikov V. An influence of stress protein CSP 310 and antiserum against this protein on lipid peroxidation in cereal mitochondria // J. Immunoassay & Immunochemistiy. - 2001. - Vol. 22, N 2. - P. 113-126.

5. Войников B.K., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Корзун А.М., Турчанинова В В , Колесниченко А.В. Влияние различных термогенных систем митохондрий на температуру проростков озимой пшеницы во время холодового шока // Доклады РАН. - 2001. - Т. 378, N 5. - С. 700-702.

6. Kolesnichenko A., Grabelnych О., Tourchaninova V , Koroleva N., Pobezhimova Т., Korzun A , Voinikov V. The difference between temperatures of hardened and nonhardened winter wheat seedlings shoots during cold stress // Annu. Wheat Newslett. - 2001. - Vol. 47 - P. 158-159.

7 ZykovaV, Kolesnichenko A., Grabelnych O., Tourchaninova V., Voinikov V. The influence of cold stress on the peroxidation of lipids in the respiratory chain in the mitochondria of different winter wheats // Annu. Wheat Newslett. - 2001 - Vol. 47. - P. 164-165

8. Kolesnichenko A., Grabelnych О , ZykovaV, Tourchaninova V., Koroleva N., Pobezhimova T, Voinikov V. The influence of known plant uncoupling protein function on lipid peroxidation in winter wheat seedlings shoots during cold stress//Annu Wheat Newslett. - 2001. - Vol 47. - P. 160-163.

9. Kolesnichenko A , Grabelnych O., Tourchaninova V , KorolevaN., Pobezhimova T , Korzun A , Zykova V , Voinikov V. The influence of different plant thermogenic systems on heat generation in shoots of winter wheat seedlings during cold stress // Annu. Wheat Newslett. - 2001. - Vol. 47. -P. 169-170.

10. Зыкова B.B., Грабельных О.И., Колесниченко А.В , Турчанинова В.В., Королева Н А., Побежимова Т.П. Влияние известных растительных разобщающих белков на перекисное окисление липидов в проростках озимой пшеницы во время холодового стресса // Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке: Тезисы док-

ладов Международной конференции. — Сыктывкар, Республика Коми, 1-6 октября 2001 г. - С. 61.

11. Турчанинова В.В., Колесниченко А.В. Термогенез у растений при низкотемпературном стрессе: роль стрессового белка БХШ 310 // Вестник Иркутского университета. Специальный выпуск. Материалы ежегодной научно-теоретической конференции молодых ученых / Под ред О.А. Эделъш-тейн, Г.В. Логунова. - Иркутск: Иркутский ун-т., 2001. - С. 16-18.

12. Зыкова В.В., Грабельных О.И., Турчанинова В.В., Антипина А.И., Королева Н А., Колесниченко А.В., ПобежимоваТ.П., Константинов Ю.М., Войников В К Влияние БХШ 310 на перекисное окисление липидов и дыхательную активность митохондрий озимой пшеницы // Физиология растений. - 2002. - Т. 49, N 5. - С 703-710.

13. Турчанинова В.В., Колесниченко А.В Термогенный эффект разобщающего белка БХШ 310 при холодовом шоке // Студент и научно-технический прогресс: Материалы XL Международной научной студенческой конференции' Биология. — Новосибирск: Новосиб гос. университет. - 2002. - С. 151-152.

14 Tourchaninova V., Kolesnichenko A., Pobezhimova Т., Grabelnych О., Korzun A., Koroleva N , Zykova V, Voinikov V. Thermogenesis in plant seedling shoots during cold stress: a difference between nonhardened and hardened plants // ELSO 2002 Meeting, Poster Abstract N839 http://www.elso.org/ index.php?id=abstr2002&lid=494

15. Kolesnichenko A , Grabelnych O., Tourchaninova V., Zykova V., Koroleva N , Pobezhimova Т., Voinikov V. Influence of stress protein CSP 310 and antiserum against this protein on oxygen uptake,lipid peroxidation and temperature of winter wheat seedling shoots during cold stress // J. of Immunoassay & Immunochemistry. - 2003. — Vol. 24, N 1. - P. 41—55.

16. Kolesnichenko A., Pobezhimova Т., Grabelnych O., Tourchaninova V., Korzun A., Koroleva N., Zykova V, Voinikov V. Difference between the temperature of nonhardened and hardened winter wheat seedling shoots during cold stress // J. Therm. Biol. - 2003. - Vol. 28, N 3. - P. 235-244.

17 Kolesnichenko A., Pobezhimova T., Grabelnych О., Tourchaninova V., Korzun A., Koroleva N., Zykova V., Voinikov V. The role of different plant seedling shoots mitochondrial uncoupling systems in thermogenesis during low-temperature stress // J. Therm. Biol. - 2003. - Vol. 28, N 8. - P. 571-580.

18. Колесниченко A.B., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Турчанинова В В., Корзун A.M., Королева Н А., Зыкова В.В., Войников В.К. Участие митохондриальных разобщающих систем в термогенезе проростков разных видов растений во время низкотемпературного стресса и закаливания // Физиология растений — основа фитобиотехнологии: Международная конференция. V съезд общества физиологов растений России. Пенза, 15—21 сентября 2003 г.: Тезисы докладов. — Пенза, 2003. — С. 288-289.

19 Турчанинова В В., Колесниченко А В , Войников В.К. Роль различных термогенных систем в жизнеспособности проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе // Физиология растений — основа фитобиотехнологии: Международная конференция. V съезд общества физиологов растений России. Пенза, 15—21 сентября 2003 г.: Тезисы докладов. - Пенза, 2003. — С. 344.

20. Tourchaninova V., Kolesnichenko A., Voinikov V. The influence of different mitochondrial thermogenic systems on winter wheat seedling shoot surviving during cold shock // ELSO 2003 Meeting, Poster Abstract N 295 http://www.elso.org/index.php?id=abstrlist2003&lid==480

21. Турчанинова B.B., Колесниченко A.B., Грабельных О.И., Войников В.К. Роль разобщения процессов окисления и фосфорилирования в выживаемости проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе // Стрессовые белки растений: Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск, 6—10 сентября 2004 г. — Иркутск' Издательство института географии СО РАН, 2004. - С. 125-129.

22 Турчанинова В.В., Колесниченко А.В., Грабельных О.И., Побе-жимова Т.П., Корзун A.M., Войников В.К. Влияние разобщения процессов окисления и фосфорилирования на выживаемость проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе // Вестник Харьковского национального аграрного университета, Серия Биология. — 2004. — N 2 (5). - С. 39-45.

23. Tourchaninova V , Grabelnych О., Pobezhimova Т., KorzunA., Voinikov V., Kolesnichenko V., Kolesnichenko A The importance of oxidative phosphorylation uncoupling systems function for surviving of winter seedling shoots during short term cold stress // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2005. - Vol. 1. - P. 21-29.

Подписано в печать 19.05 2006. Бумага офсетная Формат 60х841/,6.

Гарнитура Тайме. Усл. печ л. 1,0 _Тираж 100 экз Заказ № 093-06._

РИО НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН

(Иркутск, ул Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37 E-mail arleon@rol.ru)

_яооу_

i A 3 6 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Турчанинова, Виктория Валерьевна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС У РАСТЕНИЙ.

2.1.1 Причины гибели растительной клетки при низкотемпературном стрессе.

2.1.2 Адаптация растений к низким температурам.

2.2 СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ.

2.2.1 Краткая характеристика растительных митохондрий.

2.2.2 Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование.

2.3 ТЕРМОГЕНЕЗ У РАСТЕНИЙ.

2.3.1 Выделение тепла у термогенных растений.

2.3.2 Альтернативная оксидаза.

2.3.3 Возможность терморегуляции у нетермогенных растений при действии низких температур.

2.3.4 Разобщающие белки.

2.3.4.1 UCP-подобные белки животного происхождения.

2.3.4.2 Растительные разобщающие белки.

2.3.4.3 Механизм разобщения.

2.3.4.4 БХШ 310 - растительный разобщающий белок, не принадлежащий к семейству UCP-подобных белков.

2.4 НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ.

2.4.1 Перекисное окисление липидов.

2.4.2 Механизм реакций ПОЛ.

2.4.3 Активные формы кислорода.

2.4.4 ПОЛ и повреждения в клетке.

2.4.5 Взаимосвязь ПОЛ и различных видов стресса.

2.4.6 ПОЛ в митохондриях растений.

2.5 ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 ПОДГОТОВКА РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА.

3.2 ИЗМЕРЕНИЕ ТЕРМОГЕНЕЗА ТКАНЕЙ ПРОРОСТКОВ РАСТЕНИЙ.

3.3 ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ СТРЕССОВОГО БЕЖА БХШ 310.

3.3.1 Выделение цитоплазматических белков.

3.3.2 Получение белковой фракции, обогащенной стрессовым белком БХШ 310.

3.3.3 Фракционирование белков с помощью гель-фильтрации.

3.3.4 Подготовка к работе неиммунной сыворотки и антисыворотки против БХШ 310.

3.4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ПРОРОСТКОВ

3.5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИЕНОВЫХ КОНЬЮГАТОВ.

3.6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ РОСТОВОЙ РЕАКЦИИ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ РАЗОБЩИТЕЛЕМ И ДЕЙСТВИЯ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ.

3.7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫЖИВАЕМОСТИ ПРОРОСТКОВ ПОСЛЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА.

3.8 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 ТЕРМОГЕНЕЗ У ПРОРОСТКОВ РАСТЕНИЙ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ.

4.1.1 Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой пшеницы при заданной внешней температуре.

4.1.2 Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой ржи, кукурузы и гороха при заданной внешней температуре.

4.1.3 Вклад различных термогенных систем в термогенез у растений.

4.1.3.1 Влияние ингибиторов на дыхание проростков озимой пшеницы.

4.1.3.2 Влияние ингибиторов на дифференциальные термические кривые проростков озимой пшеницы.

4.1.3.3 Влияние БХШ 310 и сыворотки против данного стрессового белка на дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой пшеницы.

4.1.3.4 Роль различных термогенных систем при термогенезе у проростков гороха в течение низкотемпературного стресса.

4.2 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ И ИНГИБИТОРОВ ДЫХАНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ.

4.2.1 Влияние различных концентраций СССР на интенсивность дыхания проростков озимой пшеницы.

4.2.2 Динамика дыхания проростков озимой пшеницы, инфильтрованных водой и водным раствором СССР.

4.2.3 Сравнительный анализ воздействия БХШ 310 и СССР на дыхание проростков озимой пшеницы.

4.2.4 Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на дифференциальные термические кривые проростков озимой пшеницы.

4.2.5 Разработка методики определения выживаемости проростков растений.

4.2.6 Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых холодовому шоку.

4.2.7 Изменения ростовой реакции проростков озимой пшеницы после обработки разобщителем и действия низкой температуры.

4.2.8 Влияние ингибиторов митохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых низкотемпературному стрессу.

4.3 ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОГЕНЕЗА У ЗАКАЛЕННЫХ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ.

4.3.1 Воздействие низкотемпературного стресса на дифференциальные кривые охлаждения незакаленных и закаленных проростков озимой пшеницы.

4.3.2 Влияние ингибиторов дыхания на выживаемость закаленных проростков озимой пшеницы.

4.4 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ РАЗОБЩЕННОГО И НЕСОПРЯЖЕННОГО ДЫХАНИЯ В ПРОЦЕССАХ ПОЛ У ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ТЕЧЕНИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА.

4.4.1 Сравнительный анализ влияния ингибиторов и активаторов несопряженного и разобщенного дыхания на ПОЛ у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса.

4.4.2 Влияние разобщающего стрессового белка БХШ 310 на перекисное окисление липидов у проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение термогенеза у растений при низкотемпературном стрессе"

Изучение адаптивных возможностей растений и их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды относится к центральным проблемам биохимии и физиологии растений. Особенно актуальными в данном направлении остаются исследования, направленные на установление механизмов адаптации растительных объектов к низким температурам. Прежде всего, это связано с тем, что низкотемпературный стресс и вызываемые им повреждения являются одними из основных факторов, ограничивающими рост, урожайность и распространение растений на земном шаре. Во многих случаях повышение морозоустойчивости культурных растений всего на 2-3 °С может обеспечить получение хорошего урожая там, где они пока не выращиваются из-за низкой температуры. Известно, что в нашей стране большинство пахотных земель находятся в так называемых «зонах рискованного земледелия», где неблагоприятные температурные условия возникают часто, либо постоянно. Таким образом, исследование механизмов адаптации растений к низкотемпературному воздействию имеет не только важное теоретическое, но и огромное практическое значение, поскольку дает возможность определения путей для создания приемов, повышающих холодоустойчивость ценных сельскохозяйственных культур.

В настоящее время общепринятой точкой зрения на причины гибели растительной клетки при действии низких температур считается образование внутри- и внеклеточного льда. В последние годы особое внимание исследователей привлекает также токсичное действие на организм активных форм кислорода (АФК), содержание которых резко возрастает как при гипотермии, так и при других типах стресса. За более чем столетний период изучения адаптационных механизмов растений создана огромная база данных, показывающая, что низкотемпературный стресс сопровождается рядом физиологических и биохимических изменений, направленных на преодоление действия неблагоприятного фактора. К ним относятся изменения в метаболизме липидов и фосфолипидов, накопление криопротекторных веществ, что в целом позволяет избежать механического повреждения мембран кристаллами льда, последствий обезвоживания и повреждения клеточных структур. Установлено, что температурное воздействие изменяет генную экспрессию: происходит индукция синтеза стрессовых, обладающих специфичными функциями, белков на фоне замедления или прекращения общего белкового синтеза. В последнее десятилетие была выделена и охарактеризована группа белков низкотемпературного стресса [Thomashow, 1998], среди которых, в частности, выделяют белки разобщающие окисление и фосфорилирование в митохондриях. Изучение разобщающих белков началось с открытия белка, названного термогенином или UCP-1, специфичного для бурой жировой ткани млекопитающих. UCP-1 является высокорегулируемым переносчиком протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, транспорт которых активируется жирными кислотами. В активированном состоянии UCP-1 служит промежуточным звеном возврата протонов в матрикс, в результате чего энергия электрохимического потенциала, генерируемая дыхательной цепью, рассеивается в виде тепла и происходит разобщение дыхания и фосфорилирования [Скулачев, 1989; Palou et al., 1998]. Все разобщающие белки (в англ. транскрипции - uncoupling proteins, UCP) имеют высокую степень гомологии и принадлежат к семейству митохондриальных анионных переносчиков. Основными физиологическими функциями UCP-подобных белков у животных считаются участие в терморегуляции посредством термогенеза [Ricquier et al., 2000], регуляция метаболического и энергетического баланса, а также снижение образования АФК. Впервые наличие у растений разобщающих белков (plant mitochondrial uncoupling proteins, PUMP) было показано Vercesi с соавторами [Vercesi et al., 1995], которыми был выделен и охарактеризован белок внутренней мембраны митохондрий клубней картофеля. В дальнейшем PUMP были обнаружены в митохондриях других растений [Laloi et al., 1997; Jezek et al., 1998; Vercesi et al., 2001].

Как считалось ранее, механизмы регулируемого разобщения окисления и фосфорилирования под действием различных факторов внешней среды [Скулачев, 1989], присущи только животным организмам. Однако в последние годы в растениях также были обнаружены физиологические системы, способные диссипировать энергию, генерируемую митохондриями [Побежимова и др., 1996; Laloi et al., 1997; Vanlerberghe, Mcintosh., 1997; Moller, 2001; Casolo et al., 2003; Rasmusson et al., 2004]. Существование у растений таких систем, одним из следствий функционирования которых является термогенез, позволяет предположить, что, несмотря на общепринятую среди физиологов точку зрения о пойкилотермности растений, они способны к некоторой регуляции температуры тела. Интерес к данной гипотезе возрастает благодаря тому факту, что в отличие от животных, имеющих только одну митохондриальную энергорассеивающую систему (UCP-подобные разобщающие белки), у растений обнаружено несколько таких систем. К ним, в частности, относится альтернативная оксидаза, открытие которой тесно связано с изучением феномена теплопродукции у так называемых «термогенных» растений [Raskin et al., 1987]. Генеративные органы некоторых цветковых за счет высокой активности цианидрезистентного дыхания поддерживают температуру своих тканей на уровне, значительно превышающем температуру окружающего воздуха. Например, установлено, что термогенез у цветков Symplocarpus foetidus может происходить с такой интенсивностью, что их температура на 35 °С выше температуры окружающей среды [Knutson, 1974]. У некоторых видов, так называемых «нетермогенных» растений, было обнаружено увеличение активности альтернативной оксидазы во время холодового стресса и в процессе закаливания растения к холоду [Stewart et al., 1990; Vanlerberghe, Mcintosh, 1992; Ito et al., 1997], что позволяет предположить участие альтернативной оксидазы в термогенных процессах, связанных с защитой растения от воздействия низкой температуры окружающей среды.

Необходимо подчеркнуть, что о термогенезе у нетермогенных растений в литературе имеется весьма ограниченное число данных. Мнение исследователей о возможной терморегуляторной роли альтернативной оксидазы и UCP-подобных разобщающих белков растений при низкотемпературном стрессе остается противоречивым [Ordentlich et al., 1991; Nevo et al., 1992; Moynihan et al., 1995; Breidenbach et al., 1997; Jarmuszkiewicz et al., 2001; Jezek et al., 2001; Calegario et al., 2003].

В последние годы у озимых злаков была обнаружена еще одна энергорассеивающая система, связанная с функционированием стрессового белка — БХШ 310, который вызывает разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях при низкотемпературном стрессе. Данный белок отличается от UCP-подобных белков по механизму действия, т.к. его разобщающая активность не зависит от содержания свободных жирных кислот в клетке [Колесниченко и др., 1996; Войников и др., 2001а]. В тоже время БХШ 310 не является активатором альтернативной оксидазы, поскольку, как было показано, вызванное его добавлением увеличение нефосфорилирующего дыхания и термогенез ингибируется KCN [Войников и др., 2001а].

Таким образом, у растений имеется несколько энергорассеивающих систем, которые, возможно, участвуют в защите организма от повреждающего действия низких температур. В связи с этим настоящая работа посвящена изучению физиологической роли некоторых энергорассеивающих систем митохондрий растений при низкотемпературном стрессе.

Автор выражает благодарность всему коллективу лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН, а особенно научному руководителю Войникову В.К., руководителю исследовательской группы д.б.н. Колесниченко А.В., а также д.б.н. Побежимовой Т.П., к.б.н. Грабельных О.И.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Турчанинова, Виктория Валерьевна

6 выводы

1. В проростках растений при низкотемпературном стрессе происходит термогенез.

2. Уровень генерации тепла проростками растений зависит от интенсивности низкотемпературного воздействия.

3. Термогенез у проростков озимой пшеницы является следствием функционирования альтернативной оксидазы, разобщающих белков типа UCP и стрессового белка БХШ 310. У гороха выявлены первые две термогенные системы.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование термогенеза у проростков растений при низкотемпературном воздействии позволило установить, что в определенном временном интервале температура живых проростков поддерживается на более высоком уровне, чем у «убитых». При этом максимум разности температур живых и «убитых» тканей проростков достигался за первые 15-20 минут холодового шока. Факт термогенеза при действии низких температур был установлен для проростков озимой пшеницы, озимой ржи, кукурузы и гороха. Данные результаты хорошо согласуются с известными из литературы сведениями о термогенезе у различных нетермогенных растений [Ordentlich et al., 1991; Nevo et al., 1992; Moynihan et al., 1995] и позволяют заключить, что термогенез является широко распространенным явлением среди растений. При этом необходимо отметить, что проростки растений являются наиболее удачной моделью для изучения термогенеза, поскольку, подобно початкам ароидных лилий (представителей термогенных растений), отличаются выгодным для теплопродукции отношением поверхности к объему.

Изучение влияния степени охлаждения на уровень генерации тепла проростками показало, что на снижение стрессирующей температуры проростки отвечали усилением термогенеза. Результаты экспериментов позволяют сделать вывод, что чем ближе внешняя температура к повреждающей, тем интенсивнее начинает работать данный механизм. По-видимому, термогенез является регулируемым ответом растений на охлаждение и определяется внешними условиями, то есть интенсивностью стресса. Хотя с другой стороны, возможно, предположить также, что при повреждении в клетке усиливаются окислительные процессы, сопровождающиеся выделением тепла, чем и объясняется интенсификация термогенеза. В связи с этим следует упомянуть, что хотя точка кристаллизации воды у живых и «убитых» тканей лежала в одном температурном диапазоне, для ее достижения живым тканям требовался гораздо больший временной интервал, что говорит о возможном адаптивном характере термогенеза.

Полученные данные о влиянии ингибиторов дыхания на температуру проростков показали, что в термогенезе участвуют такие энергорассеивающие митохондриальные системы, как альтернативная оксидаза и разобщающие белки. При этом, если у озимой пшеницы были обнаружены три термогенные системы (альтернативная оксидаза, UCP-подобные белки и разобщающий белок БХШ 310), то у проростков гороха при низкотемпературном стрессе функционировали только первые две термогенные системы. Участие БХШ 310 в термогенезе у проростков озимой пшеницы было подтверждено данными, показывающими, что инфильтрация проростков БХШ 310 повышала эффективность генерации ими тепла. При этом инфильтрация их сывороткой против данного белка снижала эффективность термогенеза. Вероятно, наличие у проростков озимой пшеницы дополнительной термогенной системы, опосредованной активностью БХШ 310, является эволюционным приобретением в связи с озимым образом жизни для повышения устойчивости к действию низких температур.

Изучение влияния разобщителей окислительного фосфорилирования на температуру проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе позволило установить, что способность разобщающих агентов воздействовать на термогенез определяется степенью их воздействия на интенсивность дыхания проростков. После 20 мин низкотемпературного воздействия (-4 °С) инфильтрация проростков озимой пшеницы как искусственным разобщителем - СССР (2 мкМ), так и природным -стрессовым белком БХШ 310 (1,5 мкМ) повышала их выживаемость. Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать вывод, что разобщение, вызывая термогенез, участвует в защите растения от повреждающего действия низких температур. Это же подтвердили эксперименты по исследованию роли митохондриальных термогенных систем в жизнеспособности проростков озимой пшеницы во время холодового шока, в ходе которых было установлено, что ингибирование данных систем, приводящее к снижению температуры тканей, уменьшает количество выживших после стресса проростков.

Исследование влияния обработки разобщителем окисления и фосфорилирования на рост проростков после стресса показало значительное ингибирование роста побегов стрессируемых растений, что, возможно, объясняется тем, что значительная часть энергетических ресурсов, идущих на поддержание метаболизма, при разобщении процессов окисления и фосфорилирования расходуется в виде тепла. Таким образом, разобщитель может выступать в качестве ингибитора роста, что совместно с повышением температуры тканей положительно сказывается на выживаемости проростков после низкотемпературного стресса.

Анализ влияния закаливания на температуру проростков позволил установить, что у закаленных проростков озимой пшеницы при холодовом шоке наблюдался слабо выраженный термогенез. Вместе с тем, было обнаружено, что ингибирование альтернативного и основного пути переноса электронов по дыхательной цепи не оказывало значимого влияния на выживаемость закаленных проростков после низкотемпературного стресса. Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать вывод, что выживаемость закаленных проростков озимой пшеницы, в отличие от незакаленных, не зависит от интенсивности дыхания и температуры тканей. Вероятно, во время закаливания у проростков формируются механизмы защиты от повреждающего действия низких температур, и они уже не нуждаются в функционировании энергорассеивающих систем.

Известно, что гипотермия, как и другие экстремальные условия, сопровождается увеличением содержания активных форм кислорода в клетках, которые способны инактивировать многие ферментные системы и инициировать перекисное окисление липидов. Считается, что одним из основных источников АФК при низкотемпературном стрессе являются митохондрии [Purvis et al., 1995]. Хотя основной функцией UCP-подобных разобщающих белков животного происхождения признано участие в термогенезе, в последнее время высказываются гипотезы о возможной антиоксидантной роли «мягкого разобщения» при низкотемпературном стрессе [Skulachev, 1994; Kowaltowski et al., 1999]. В тоже время в литературе имеются данные, показывающее, что одним из следствий функционирования альтернативной оксидазы может являться ограничение образования АФК в митохондриях растений [Purvis, 1997; Maxwell et al., 1999]. Таким образом, альтернативная оксидаза и разобщающие белки, возможно, играют защитную роль при низкотемпературном стрессе путем ингибирования реакций ПОЛ. В связи с этим был проведен сравнительный анализ влияния активаторов и ингибиторов известных энергорассеивающих систем на перекисное окисление у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса.

При изучении влияния инфильтрации проростков озимой пшеницы пируватом (активатором альтернативной оксидазы) полученные данные свидетельствовали о значительном уменьшении уровня образования диеновых конъюгатов, вторичных продуктов ПОЛ. В тоже время ингибирование альтернативного пути переноса электронов при помощи инфильтрации проростков БГК приводило к увеличению интенсивности процессов ПОЛ в стрессированных проростках, что подтверждает участие альтернативной оксидазы в защите растений от окислительного стресса. Менее однозначные результаты были получены при исследовании влияния активаторов и ингибиторов растительных разобщающих белков на уровень

ПОЛ при гипотермии. При инфильтрации проростков линолевой кислотой, которая является субстратом разобщающих белков типа UCP, наблюдали снижение скорости образования диеновых конъюгатов до уровня контрольных (нестрессированных) проростков. Вместе с тем ингибирование UCP-подобных белков прокаином не оказывало на содержание диеновых конъюгатов статистически значимого эффекта. По-видимому, отсутствие количественно определяемого влияния прокаина в данном случае объясняется наличием двух вектрально противоположных процессов, протекающих в клетке: с одной стороны, происходит повышение формирования АФК за счет снижения активности разобщающих белков, и с другой, - уменьшение содержания свободных жирных кислот, субстратов ПОЛ.

В проведенных ранее экспериментах на митохондриях, инкубируемых in vitro, было установлено, что стрессовый белок БХШ 310 может выступать как в качестве прооксиданта [Зыкова и др., 2000], так и антиоксиданта [Kolesnichenko et al., 2001Ь]. Добавление экзогенного БХШ 310 к митохондриям в условиях искусственно вызванного окислительного стресса вызывало индукцию ПОЛ [Зыкова и др., 2000]. Вместе с тем, связывание эндогенного БХШ 310 сывороткой против этого белка, при котором устранялась его разобщающая активность, значительно повышало содержание диеновых конъюгатов в митохондриях растений [Kolesnichenko et al., 2001b; Zykova et al., 2001], вызывая более сильную индукцию ПОЛ, чем наблюдаемую при добавлении экзогенного белка. В связи с этим, необходимо было проверить, какой из этих эффектов (про-или антиоксидантное действие) превалирует в целом растении во время низкотемпературного стресса. Эксперименты in vivo показали, что инфильтрация проростков озимой пшеницы БХШ 310 вызывало значительное снижение содержания диеновых конъюгатов в течение низкотемпературного стресса. Таким образом, можно предположить, что

БХШ 310, как и другие разобщающие белки, в соответствие с теорией В.П. Скулачева [Skulachev, 1994], оказывает антиоксидантное действие, снижая концентрацию кислорода вследствие вызываемого разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях.

Таким образом, наличие у растений нескольких энергорассеивающих систем позволяет постулировать существование у них на определенных этапах онтогенеза механизмов терморегуляции. В последнее время у растений были обнаружены разобщающие белки гомологичные UCP1 митохондрий бурого жира млекопитающих. Одной из основных функций UCP считается участие в терморегуляции посредством термогенеза. Помимо разобщающих белков типа UCP, у растений при низкотемпературном стрессе функционирует альтернативная оксидаза, открытие которой тесно связано с феноменом теплопродукции у так называемых термогенных растений. Поскольку не обнаружено каких-либо структурных или регуляторных особенностей альтернативной оксидазы термогенных растений, по сравнению с нетермогенными, можно предположить, что различия между этими растениями могут быть не столько качественными, сколько количественными. По-видимому, повышение температуры тканей незакаленных растений даже на несколько градусов препятствует быстрому образованию внутриклеточного льда и обеспечивает период необходимый для активации защитных систем. У озимых злаков обнаружена третья термогенная система, связанная с активностью стрессового белка БХШ 310, механизм действия которого отличается от классических UCP-подобных белков. Наличие дополнительной термогенной системы у холодоустойчивых проростков озимой пшеницы, возможно, связано с жизненным циклом данных растений, вынужденных в процессе эволюции приспособиться к перенесению осенних и весенних заморозков. Еще одним важным следствием функционирования энергорассеивающих систем, является снижение уровня формирования АФК митохондриями. По-видимому, роль альтернативной оксидазы и разобщающих белков у растений в условиях холодового шока, является многозначной и, несмотря на то, что их функционирование связано со значительным расходом энергии, оно необходимо растению для выживания при кратковременном низкотемпературном стрессе.

К сожалению, в рамках представленной работы не удалось четко сопоставить эффект термогенной и антиоксидантной функций энергорассеивающих систем при защите растений от повреждающего действия низких температур. Проработка данной проблемы требует дополнительных, многочисленных и тщательных исследований. В частности, представляется необходимой количественная оценка степени воздействия на выживаемость проростков антиоксидантов и бинарных композиций: антиоксидант-разобщитель. Важной задачей является также установление роли термогенеза при различной степени интенсивности стресса. Вместе с тем, полное понимание физиологической роли разобщающих белков и альтернативной оксидазы при низкотемпературном стрессе открывает заманчивую перспективу целенаправленного получения устойчивых к низким температурам сортов растений ценных в хозяйственном отношении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турчанинова, Виктория Валерьевна, Иркутск

1. Акимова Г.П., Родченко О.П. Изменение активности пероксидазы в клетках корня кукурузы в условиях низкой температуры // Физиолого-биохимические аспекты устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды. - Иркутск. - 1976. - С.4-5.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 5-ти т. Т.З. - М.: Мир, 1987. - 296 с.

3. Арчаков А. И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. -327 с.

4. Арчаков А. И. Оксигеназы биологических мембран. М.: Наука, 1983.-237 с.

5. Асахина Е. Процессы замерзания и повреждения // Холодостойкость растений / Отв. ред. Самыгин Г.А. М.: Колос, 1983. -С.23- 37.

6. Баймиев А.Х., Гималов Ф.Р., Чемерис А.В. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при различных условиях холодовой акклимации // Физиол. растений. 1999. -Т.46, №4. - С.605-609.

7. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

8. Блехман Г.И. Синтез белка в условиях стресса // Успехи современной биологии. 1987. — Т. 103, вып.З. — С.340-353.

9. Белоус А. М., Бондаренко В. А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.- Киев, 1982. 255 с.

10. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука, 1987. - 232 с.

11. Бурлакова Е. Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. 1985. - Т. LIV, вып. 9.-С.1540-1558.

12. Веселовский В.А. О роли биоантиоксидантов в устойчивости растений к неблагоприятным условиям существования // Биоантиоксиданты в регуляции метаболизма в норме и патологии. М.: Наука, 1982.-С. 150-162.

13. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. М.: Наука, 1990.-201 с.

14. Винтер А.К. Заморозки и их последствия на растения. -Новосибирск: Наука, 1980. 150 с.

15. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

16. Владимиров Ю. А. Биологические мембраны и патология клетки. -М.: 1979.-48 с.

17. Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И., Козлов А. В., Осипов А. Н., Рощупкин Д. И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика / ВИНИТИ, 1991. -Т. 29. - С.1-252.

18. Войников В.К., Лузова Г.Б., Лемзяков В.П. Количество свободных жирных кислот митохондрий озимой ржи при гипотермии // Изв. Сиб. отд-ния АН СССР. Сер. биол. Наук 1980. - Т. 1, N5. - С.119-125.

19. Войников В.К., Лузова Г.Б., Лемзяков В.П. Действие холода на количество свободных жирных кислот и активность митохондрий у озимой ржи // Физиол. растений. 1981а. - Т.28, вып.1. - С. 18-26.

20. Войников В.К., Лузова Г.Б., Лемзяков В.П. Количественное определение свободных жирных кислот митохондрий озимой ржигазохроматографическим методом // Физиол. и биох. культ. Растений. -19816. Т.13, N2. - С.213-217.

21. Войников В.К., Лузова Г.Б., Корзун A.M. Влияние холодового шока на количество свободных жирных кислот, энергетическую активность митохондрий и температуру в проростках озимых злаков // Доклады АН СССР. 1983а. - Т.270, N3. - С.761-764.

22. Войников В.К., Лузова Г.Б., Кравец B.C. Разобщающее действие свободных жирных кислот при "старении" изолированных митохондрий пшеницы // Изв. Сиб. отд-ния АН СССР. Сер. биол. Наук. 19836. - Т.1, N5.-С.81-85.

23. Войников В.К., Корзун A.M. Температура тканей побегов озимой пшеницы при холодовом шоке // Известия Сибирского отделения Академии наук СССР, серия биологических наук. Вып. 2 / Новосибирск: Наука, 1984.-С.22-25.

24. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина Н.Н. Действие холода на жирнокислотный состав и энергетическую активность митохондрий клеток растений // Физиол. и биох. культ, растений. 1985. - Т. 17, N5. — С.431-440.

25. Войников В.К. Температурный стресс и митохондрии растений. -Новосибирск: Наука., 1987. 136 с.

26. Войников В.К. Реакция генома клетки на температурный стресс // Рост и устойчивость растений. — Иркутск: Наука, 1988. С. 154-163.

27. Войников В.К., Константинов Ю.М., Негрук В.И. Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука, 1989. - 144 с.

28. Войников В.К., Корытов М.В. Синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы при закаливании к холоду // Физиол. растений. 1991. -Т.38, вып.5. - С.960-969.

29. Войников В.К., Корытов М.В. Низкотемпературная индукция синтеза стрессовых белков в клетках озимой пшеницы // 3 съезд Всеророс. об-ва физиологов растений (24-29 июня, 1993 г., Санкт-Петербург): Тез.докладов. СПб, 1993. - С.518.

30. Войников В.К., Колесниченко А.В., Побежимова Т.П., Варакина Н.Н. Первая и шестая хромосомы D-генома озимой мягкой пшеницы контролируют синтез стрессового белка с молекулярной массой 310 кДа // Физиол. растений. 1998. - Т.45, N5. - С.688-692.

31. Войников В.К., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Колесниченко А.В. Белок холодового шока 310 кДа разобщает окислительное фосфорилирование в растительных митохондриях // Физиол. растений. -2001а. Т. 48, N21. - С.89-94.

32. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости. М.: Наука, 1982.-280 с.

33. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. -М.: Мир, 1997.-624 с.

34. Досон Р., Эллиот Д., Элллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - 544 с.

35. Жигалова Т.В., Тукеева М.И., Чивкунова О.Б. , Мерзляк М.Н. Влияние водного дефицита на липиды и жирные кислоты хлоропластов проростков пшеницы сортов Саратовская 55 и Лютесценс 1848 // Вестник МГУ. 1989. -N1. - С.29-35.

36. Жиров В. К., Мерзляк М. Н., Кузнецов Л. В. Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами // Физиол. растений. 1982. -Т.29, вып. 6. — С.1045-1053.

37. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Успехи современной биологии. 1999. - Т. 119, N5. - С.440-450.

38. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений. М.: Наука, 1974. -223 с.

39. Иванов И.И., Мерзляк М.Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль в связи с антиоксидантными свойствами // в сб. «Биоантиокислители». Труды МОИП, т.52. М.: Наука, 1975. - С.30-52.

40. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1986. -Т.18. - С.1-136.

41. Карасев Г.С., Нарлева Г.И., Боруах К.К., Трунова Т.И. Изменение состава и содержания полипептидов в процессе адаптации озимойпшеницы к низким отрицательным температурам // Физиол. и биохим. культ. Растений. 1991. - Т.23. N 5. - С.480-486.

42. Карасев Г.С., Красавцев О.А., Трунова Т.И. Роль белков в адаптации растений к морозу // 3 съезд Всерос. об-ва физиологов растений (24-29 июня, 1993 г., СПб): тез.докладов. СПб, 1993. - С.601.

43. Касперска-Палач А. Механизм закаливания травянистых растений // Холодостойкость растений / Отв. ред. Самыгин Г.А. М.: Колос, 1983. — С.112-123.

44. Кравец B.C. Развитие представлений об адаптации растений к низким температурам // Физиол. и биох. культурный растений. 1996. -Т.28, N3. — С. 167-182.

45. Козлов Ю.П. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах. М., 1973. - 174 с.

46. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Архипенко Ю.В. Молекулярные механизмы повреждения кислородом системы транспорта кальция в саркоплазматическом ретикулуме мышц. Иркутск: Изд-во Иркутского университета, 1983. - 136 с.

47. Колесниченко А.В., Боровский Г.Б., Войников В.К., Мишарин С.И., Антипина А.И. Характеристика белка из озимой ржи, накапливающегося при гипотермии // Физиол. растений. 1996. - Т.43. -С.894-899.

48. Колесниченко А.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Изменения в содержании белка 310 кДа при холодовом закаливании проростков озимой пшеницы // Физиол. и биох. культ, растений. 1997. - Т.29, N5. - С.383-381.

49. Колесниченко А.В., Побежимова Т.П., Войников В. К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиол. растений. 2000. - Т.47, N 4. - С.624-631.

50. Константинов Ю.М., Луценко Г.Н., Подсосоный В.А., Зыкова В.В. Исследование перекисного окисления липидов в растительных митохондриях в связи с проблемой температурного стресса // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука, 1989. - С.88-113.

51. Кулаева О.Н. Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. - С.62-84.

52. Куликов В. Ю., Семенюк А. В., Колесникова Л. И. Перекисное окисление липидов и холодовой фактор. Н.: Наука. Сиб. отд-ние, 1988. -192 с.

53. Куцый М.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия. 1999. - Т.64, вып.2. - С. 149-163.

54. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - 343 с.

55. Левитт Дж. Повреждения и выживание после замораживания и связь с другими повреждающими воздействиями. // Холодостойкость растений / Отв. ред. Самыгин Г.А. -М.: Колос, 1983. С.10-23.

56. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. — М.: Мир, 1974. -957 с.

57. Лось Д.А. Десатуразы жирных кислот: адаптивная экспрессия и принципы регуляции // Физиол. растений. 1997. - Т.44, N4. - С.528-540.

58. Лукаткин А.С., Левина Т.Е. Влияние экзогенных модификаторов перекисного окисления липидов на холодовое повреждение листьев огурца // Физиол. растений. 1997. - Т.44, N3. - С.З97-403.

59. Меденцев И.Г., Аринбасорова А.Ю., Акименко В.К. Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений // Биохимия. 1999. - Т.64, вып. II. - С.1457-1472.

60. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-реакции, основные стадии процесса // Физиология адаптационного процесса. М.: Наука, 1986. - С.77-123.

61. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. ВИНИТИ, 1989. - Т.6. - С. 1-168.

62. Мерзляк М.Н., Жиров В.К. Свободнорадикальное окисление в хлоропластах при старении растений // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика ВИНИТИ, 1990. - Т.40. - С. 101-135.

63. Молотковский Ю.Г. Механизмы структуры и функциональных переходов мембран // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985.-С. 104-119.

64. Новицкая Г.В., Астахова Н.В., Суворова Т.А., Трунова Т.И. Роль липидной компонетны мембран в устойчивости растений огурца к низким температурам // Физиол. растений. 1999. - Т.46, N4. - С.618-625.

65. Остерман JI.A. Хроматорграфия белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1985.-536 с.

66. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология.1995. Т.37, N112. - С.66-92.

67. Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Войников В.К., Варакина Н.Н., Боровский Г.Б. Стрессовый белок 310 кДа при гипотермии влияет на энергетическую активность растительных митохондрий // Доклады АН.1996. Т.350, N 5. - С.715-718.

68. Побежимова Т.П., Войников В.К. Биохимические и физиологические аспекты функционирования убихинона // Биологические мембраны. 1999. - Т.16, N5. - С.485-490.

69. Полевой В.В. Физиология растений. JL: Высшая школа, 1989. -464 с.

70. Рахимов М.М., Джамбаева Н.Р. Липолитические ферменты // Успехи совр. биол. 1977. - Т.84, N3. - С.323-337.

71. Родионов B.C. Влияние низких температур на липидный обмен в растениях и фазовые переходы в мембранах // Эколого-физиологические механизмы устойчивости растений к действию экстремальных температур. Петрозаводск, 1978. - С.37-51.

72. Самыгин Г. А., Матвеева Н. М. Микроскопические наблюдения замороженных срезов // Физиология устойчивости растений.

73. Морозоустойчивость, засухоустойчивость и солеустойчивость. М: Изд-во АН СССР, 1960.-С.31-40.

74. Самыгин Г.А. О причинах гибели растительной клетки от мороза. -М.: Наука, 1974.-191 с.

75. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медицина, 1960.-254 с.

76. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. - 122 с.

77. Селье Г. Стресс без дистресса. М.: Прогресс, 1979. - 125 с.

78. Семищева А.А., Козлов Ю.П. Метаболизм фосфолипидов и биологические мембраны. Иркутск: Изд-во Иркутск. Ун-та, 1988. - 88 с.

79. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.-564 с.

80. Скулачев В.П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит «белок самоубийства», который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз // Биохимия. 1996. - Т.61, вып.1. - С.2060-2063.

81. Скулачев В. П. Возможная роль АФК в защите от вирусных инфекций. // Биохимия. 1998. - Т.63, вып.12. - С. 1691-1694.

82. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высшиъ жирных кислот // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. - С.63-64.

83. Стаценко А.П. О криозащитной роли аминокислот в растениях // Физиол. и биох. культ, растений. 1992. - Т.24, N6. - С.560-564.

84. Стаценко А.П. О роли свободного пролина в криоадаптации озимых растений // Физиол. и биох. культ, растений. 1994. - Т.26, N5. -С.509-512.

85. Тарусов Б.Н. Первичные процессы лучевого поражения. М.: Госатомиздат, 1962. - 96 с.

86. Тарусов Б.Н., Веселовский В.А. Сверхслабые свечения растений и их прикладное значение. — М.: МГУ, 1978. 149 с.

87. Тарчевский И.А., Безуглов В.К., Заботин А.И., Петров В.Е. Реактивность фотосинтетического аппарата. Казань: Казанск. университет, 1975.— 101 с.

88. Туманов И.И. Современное состояние и очередные задачи физиологии зимостойкости растений // Физиология устойчивости растений. Морозоустойчивость, засухоустойчивость и солеустойчивость. — М.: Изд-во АН СССР, 1960. С.5-17.

89. Туманов И.И. Физиология закаливания и морозостойкости растений. — М. Наука, 1979. 350 с.

90. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям // Тр. прикл. ботан. генет. селекции. — 1979.-Т. 64, N3. С.5-20.

91. Дроздов С.Н., Курец В.К., Титов А.Ф. Терморезистентность активно вегетирующих растений. Л.: Наука, 1984. - 168 с.

92. Хатано С. Изучение морозостойкости Chlorell ellipsoidea: влияние анитетаболитов, детергентов, гормонов и Сахаров на процесс закаливания на свету и в темноте // Холодостойкость растений / Отв. ред. Самыгин Г.А. -М.: Колос, 1983. — С.141-157.

93. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, 1990. -Т.2.-671 с.

94. Храпова Н.Г. О взаимодействии природных и синтетических антиоксидантов // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. -М, 1982. С.59-73.

95. Четверикова Е.П. Роль абсцизовой кислоты в морозоустойчивости растений и криоконсервация культур in vitro II Физиол. растений. — 1999. — Т.46, N5. С.823-829.

96. Шестакова С.В., Каган В.У., Глущенко Н.Н. и др. Действие окисленной линолевой кислоты на клеточное деление // Биоантиокислители и регуляция окислительных процессов в клетке. М.: Изд-во Москов. Университета, 1972. - С.88-89.

97. Шугаев А.Г. Некоторые особенности структурной организации и окислительной активности дыхательной цепи митохондрий растений // Успехи современной биологии. -1991.-Т. 111, вып.2. С.178-191.

98. Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводов в жидкой фазе. -М.: Наука, 1965. 375 с.

99. Albert F.G., Bennet L.W, Anderson A.J. Peroxidase associated with the root surface of Phaseolus vulgarus II Canad. J. Bot. 1986. - V.64. - P.573-578.

100. Anderson L., Borg H., Mikaelsson M. Molecular weght estimation of proteins by electrophoresis in polyacrylamide gels of graded porosity // FEBS Lett. 1972. - V.20. -P.199-202.

101. Andreyev A.Yu., Bondareva Т.О., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Volkov L.M., Vygodina T.V. The ATP/ADP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 182. -P.585-592.

102. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas C.E. Role of metals in oxygen radical reactions // J. Free Rad. Biol. Med. 1985. - V.l, N3. -P.3-25.

103. Bohnert H., Sheveleva E. Plant stress adaptations making metabolism move // Plant Biol. - 1998. - V. 1. - P.267-274.

104. Borovskii G., Voinikov V., Kolesnichenko A. The effect of hypothermia on the content of 310 kD stress protein in seedlings of winter rye and wheat // J. Therm. Biol. 1999. - V.24. - P.91-95.

105. Brandalise M., Maia I., Borecky J., Vercesi A., Arruda P. ZmPUMP encodes a maize mitochondrial uncoupling protein that is induced by oxidative stress // Plant Sci. 2003. - V.165. - P.329-335.

106. Brienengraeber M., Echtay K., Klingenberg M. НГ transport by uncoupling protein (UCP-1) is dependent on a histidine pair, absent in UCP-2 and UCP-3. // Biochemistry. 1998. - V.37. - P.3-8.

107. Casolo V., Braidot E., Chiandussi E., Macri F., Vianello F. The role of mild uncoupling and non-coupled respiration in the regulation of hydrogen peroxide generation by plant mitochondria // FEBS Lett. 2000. - V.474. -P.53-57.

108. Casolo V., Braidot E., Chiandussi E., Vianello F. , Macri F. K+ ATF channel opening prevents succinate-dependent H202generation by plant mitochondria // Physiol. Plant. 2003. - V.l 18. - P.313-318.

109. Cattivelli L., Bartels D. Molecular cloning and characterization of cold-regulated genes in barley // Plant Physiol. 1990. - V.93. - P. 1504-1510.

110. Cattivelli L., Crosatti C., Grossi M. Molecular analysis of cold-hardening in barley // Biochemical and Cellular Mechanism of Stress Tolerance in Plans / Ed. Cherry J.H. Berlin: Springer, 1994. P.515-526.

111. Close T.J. Dehydrins: emergence of a biochemical role of a family of plant dehydratation proteins.// Physiol. Plant. 1996. - V.97. - P.795-803.

112. Costa A., Nantes I., Jezek P., Leite A., Arruda P., Vercesi A. Plant uncoupling mitochondrial isolated from tomatoes at different stages of ripening //J. Bioenerg. Biomemb. 1999. - V.31. -P.527-533.

113. Chakraborti Т., Das S., Mondal M., Roychoudhury S., Chakraborti S. Oxidat, mitochondria and calcium: an overview // Cell.Signal. 1999. V.ll -P.77-85.

114. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. Involvement of abscisic acid in potato cold acclimation // Plant Physiol. 1983. - V.71, N2. - P.362-365.

115. Churchill G., Reaneyl M., Abrams S., Gusta L. Effects of abscisic acid and abscisic acid analogs on the induction of freezing tolerance of winter rye (Secale cereale L.) seedlings // Plant Growth Regulation. 1998. - V.25. -P.35-45.

116. D'Angeli S., Malho R., Altamura M. M. Low-temperature sensing in olive tree: calcium signaling and cold acclimation // Plant Sci. 2003. - V.165. -P.1303-1313.

117. Dhindsa R.S. Inhibition of protein synthesis by products of lipid peroxidation //Phytochem. 1982. - V.21. -P.309-313.

118. Elthon Т.Е., Mcintosh L. Identification of the alternative terminal oxidase of higher plant mitochondria // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. -V.84. - P.8399-8403.

119. Esen A. A simple method for quantitative, semiquantitative and qualitative assay of protein // Anal.Biochem. 1978. - V.89. - P.264-273.

120. Estabrook R.W. Mitochondrial Respiratory Control and the Polarographic Measurement of ADP:0 Ratio // Meth. Enzimol. 1967. - V.10. — P.41-47.

121. Fergyson S.L. Fully delocalised chemiosmotic or localised proton flow pathways in energy couplig // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V.811. - P.47-95.

122. Fletcher G.L., Goddard S.V., Wu Y. Antifreeze proteins and their genes: From basic research to business opportunity // Chemtech. 1999. - V.30. -P. 17-28.

123. Gatenby A.A., Viitanen P.V. Structural and Functional Aspects of Chaperonin-Mediated Protein Folding // Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. - V.45. - P.469-491.

124. Garlid K., Jaburek M., Jezek P. The mechanism of proton transport mediatet by mitochondrial uncoupling proteins // FEBS Lett. 1998. - V.438. -P.10-14.

125. Gebicki J.M., Bielski B.H.J. Comparison of the capacities of the perhydroxyl and superoxide radicals to initiate chain oxidation of linoleic acid // J. Amer. Chem. Soc. 1981. - V.103. - P.7020-7027.

126. Gonzalez-Meier M.A., Ribas-Carbo M., Siedow J.N., Drake B.G. Direct inhibition of plant mitochondrial respiration by elevated C02 // Plant Physiol. 1996. - V.l 12. - P.1349-1355.

127. Gottsberger G. Flowers and beetles in the South American Tropics // Bot. Acta. 1990. - V.103. - P.360-365.

128. Griffith M., Ala P., Yang D., Hon W.-C., Moffatt B. Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves // Plant Physiol. 1992. - V.100. -P.593-596.

129. Griffith M., Antikainen M., Hon W.-C., Pihakaski Maunsbach K., Yu X., Chun J., Yang D. Antifreeze Proteins in Winter Rye // Physiol. Plant. -1997. — V. 100. P.327-332.

130. Gueta-Dahan Y., Yaniv Z., Zilinskas В., Gozal B. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in Citrus // Planta. 1997. - V.203. - P.460-469.

131. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine // Oxford: Claredon Press. 1989. - P.215.

132. Нага M., Terashima S., Fukaya Т., Kuboi T. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco // Planta. 2003. - V.217: - P.290-298.

133. Hinz W., Gruninger S., Pover A., Chiesi M. Properties of the human long and short isoforms of the uncoupling protein-3 expressed in yeast cells // FEBS Lett. 1999a. -V.462. -P.411-415.

134. Hinz W., Faller В., Gruninger S., Gazzotti P., Chiesi M. Recombinant human uncoupling protein-3 increases thermogenesis in yeast cells // FEBS Lett.- 1999b.-V.448.-P.57-61.

135. Huang J., Hirji R., Adam L., Rozwadowski K., Hammerlindl J., Keller W., Selvaraj G. Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations // Plant Physiol. — 2000. V.122, N3. — P.747-756.

136. Ito K. Isolation of two distinct cold-inducible cDNAs encoding plant uncoupling proteins from the spadix of skunk cabbage (Symplocarpus foetidus) // Plant Sci. 1999. - V. 149. - P. 167-173.

137. Ito Y., Saisho D., Nakazono M., Tsutsumi N., Hirai A. Transcript levels of tandem-arranged alternative oxidase genes in rice are increased by low temperature // Gene. 1997. - V.203. - P. 121-129.

138. Jarmuszkiewicz W., Milani G., Fortes F., Schreiber A., Sluse F., Vercesi A. First evidence and characterization of an uncoupling protein in fungikindrom: CpUCP of Candida parapsilosis II FEBS Lett. 2000. - V.467. -P.145-149.

139. Jarmuszkiewicz W., Sluse-Goffart C.M., Vercesi A.E, Sluse F.E. Alternative oxidase and uncoupling protein: thermogenesis versus cell energy balance // Bios. Rep. 2001. - V.21, N.2. - P.213-222.

140. Jezek P., Garlid K.D. New substrates and competitive inhibitors of the СГ translocating pathway of the uncoupling protein of brown adipose tissue mitochondria // J. Biol. Chem. 1990. - V.265, N31. - P.l9303-19311.

141. Jezek P., Orosz D.E., Garlid K.D. Reconstitution of uncoupling protein of brown adipose tissue mitochondria. Demonstration of GDP-sensitive halide anion uniport // J. Biol. Chem. 1990.-V.265, N31.-P. 19296-19302.

142. Jezek P., Costa A., Vercesi A. Evidence for anion-translocating plant uncoupling mitochondrial protein in potato mitochondria // J. Biol.Chem. -1996. V.271, N.51. - P.32743-32748.

143. Jezek P., Costa A., Vercezi A. Reconstituted plant uncoupling protein allows for proton translocation via fatty acid cycling mechanism // J. Biol. Chem. 1997. - V.272, N39. - P.24272-24278.

144. Jezek P., Garlind K.D. Mammalian mitochondrial uncoupling proteins // Biochim. Cell Biol. 1998. - V.30. - P.l 163-1168.

145. Jezek P., Engstova H., Zackova M., Vercesi A.E., Costa A.D.T., Arruda P., Garlid K. D. Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial unconpling proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1365. - P.319-327.

146. Jezek P., Zackova M., Kosarova, J., Rodrigues E.T.S., Madeira V.M.C., Vicente J.A.F. Occurrence of plant-uncoupling mitochondrial protein (PUMP) in diverse organs and tissues of several plants // J. Bioenerg. Biomembr. 2000- V.32. -P.549-561.

147. Jezek P., Borecky J., Zackova M., Costa A.D.T., Arruda P. Possible basic and specific functions of plant uncoupling proteins (pUCP) // Bios. Rep. -2001. V.21, N2. - P.237-245.

148. KapuInik Y., Yalpani N., Raskin I. Salicylic acid induces cyanide resistant respiration in tobacco cell suspension cultures // Plant Physiol. 1992.- V.100. — P.1921-1926.

149. Klingenberg M., Huang S. Structure and function of the uncoupling protein from brown adipose tissue // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1415. -P.271-296.

150. Knight M.R., Campbell A.K., Smith S.M., Trewavas AJ. Transgenic plant aequorin report the effects of touch and cold shock and elicitors on cytoplasmic calcium // Nature. 1991. - V.352. - P.524-526.

151. Knight H., Trewavas A.J., Knight M.R. Cold calcium signaling in Arabidopsis thaliana responding to drought and salinity // Plant Cell. 1996. -V.8. -P.489-503.

152. Knutson R. M. Heat production and temperature regulation in eastern skunk cabbage // Science. 1974. - V.186. - P.746-747.

153. Knutson R. M. Plants in heat // Natural History. 1979. - V.88. -P.42-47.

154. Kolesnichenko A., Grabelnych O., Pobezhimova Т., Voinikov V. The association of plant stress uncoupling protein CSP 310 with winter wheat mitochondria in vitro during exposure to low temperature // J. Plant Physiol. -2000c. V. 156. - P.805-807.

155. Kolesnichenko A.V, Pobezhimova T.P., Grabelnych O.I., Tourchaninova V.V., Voinikov V.K An influence of cold stress on temperature of maize shoots // Maize genetics cooperation newslett. — 2001c. V.75. - P.24.

156. Kolesnichenko A.V., Grabelnych O.I., Pobezhimova T.P., Voinikov V.K. Non-phosphorylating bypass of the plant mitochondrial respiratory chain by stress protein CSP 310 // Planta. 2005. - V.221. - P. 113-122.

157. Koornneef M., LeonKloosterziel K., Schwartz S., Zeevaart J. The genetic and molecular dissection of abscisic acid biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis // Plant Physiol. Biochem. 1998. - V.36, N1-2. -P.83-89.

158. Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev V.P., Starkov A.A. Fatty acids as natural uncouplers preventing generation of О \ and H2O2 by mitochondria in the resting state. // FEBS Lett. 1999. - V.435. -P.215-218.

159. Kowaltowski A J., Costa A.D.T., Vercesi A.E. Activation of the potato plant uncoupling mitochondrial protein inhibits reactive oxygen species generation by the respiratory chain. // FEBS Lett. 1999. - V.425. - P.213-216.

160. Laloi M., Klein M., Riesmeier J., Muller-Rober В., Fleury C., Bouilland F., Ricguier D. A plant cold-induced uncoupling protein // Nature. -1997. — V.389. -P.135-136.

161. Levitt J. Responses of plants to environmental stress. — London, 1980. V.l. -497 p.

162. Listabarth C. Pollination of Bactris by Phyllotrox and Epurea. Implications of the palm breeding beetles on pollination at the community level // Biotropica. 1996. - V.28. - P.69-81.

163. Maia I G., Benedetti C.E., Leite A., Turcinelli S.R., Vercesi A.E., Arruda P. AtPUMP: an Arabidopsis gene encoding a uncoupling mitochondrial protein // FEBS Lett. 1998. - V.429. - P.403-406.

164. Mao W., Yu X., Zhong A., Li W., Brush J., Sherwood S., Adams S., Pan G. UCP4, a novel brain-specific mitochondrial protein that reduces membrane potential in mammalian cells // FEBS Lett. 1999. - V.443. - P.326-330.

165. Maxwell D., Wang Y., Mcintosh L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. Plant Biol. 1999. - V.96. - P.8271-8276.

166. Mcintosh L., Eichler Т., Gray G., Maxwell D., Nickels R., Wang Y. Biochemichal and genetic controls exerted by plant mitochondria // BBA. -1998. V. 1365. - P.278-284.

167. McKersie B.D. Chilling stress 11 In Plant environment interaction and stress Physiology / University of Guelph. 1996. - P.l-35.

168. Mead J.F. Free radical mechanisms in lipid peroxidation and prostaglandins // Free radicals in molecular biology, aging, and disease / Ed. D. Armstong et al. N.Y.: Kaven Press, 1984. P.53-66.

169. Meeuse B. Thermogenic respiration in aroids // Annu. Rev. Plant physiol. 1975. - V.26. - P. 117-126.

170. Millenaar F.F., Benschop J.J., Wagner A.M., Lambers H. The role of the alternative oxidase in stabilizing the in vivo reduction state of the ubiquinonepool and the activation state of the alternative oxidase // Plant Physiol. 1998. -V.118. -P.599-607.

171. Moller I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 2001. - V.52. - P.561-591.

172. Moore A.L., Siedow J.N. The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. -1991. V.1059. — P.121-140.

173. Moore A.L., Umbach A.L, Siedow J.N. Structure-function relationships of alternative oxidase of plant mitochondria: a model of the active site // J. Bioenerg. Biomembr. 1995. - V.27. - P.367-377.

174. Moynihan M.R., Ordentlich A., Raskin I. Chilling-induced heat evolution in plants // Plant Physiol. 1995. - V.108. - P.995-999.

175. Murata N., Los D.A. Membrane fluidity and temperature perception // Plant Physiol. 1997. - V.l 15, N3. - P.875-879.

176. Nagy K. A., Odell D. K., Seymour R. S. Temperature regulation by the inflorescence of Philodendron II Science. 1972. - V.l78. - P. 1195-1197.

177. Nevo E., Ordentlich A., Raskin I. Genetic divergence of heat production within and between the wild progenitors of whea tand barley: evolutionary and agronomical implications // Theor. Appl. Gen. 1992. - V.84. -P.958-962.

178. Nicholls D. Some recent advances in mitochondrial calcium transport // Trends Biochem.Sci. 1981. - V.6. -P.36-38.

179. Ordentlich A., Linzer R., Raskin I. Alternative respiration and heat evolution in plants // Plant Physiol. 1991. - V.97. - P. 1545-1550.

180. Papa S., Skulachev V. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Mol. Cel. Biochem. 1997. - V.l74. - P.305-319.

181. Palmer J. M., Ward J. A. Encyclopedia of plant physiology, V.l 8 / Eds Douce R., Day D.A. Berlin: Springer-Verlag. 1985. - P. 173.

182. Palou A., Pico C., Bonet M. L., Oliver P. The uncoupling protein, thermogenin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1998. - V.30. - P.7-11.

183. Parkin K.L., Marangoni A., Jackman R., Yada R., Stanley D. Chilling injury. A review of possible mechanisms. // J. Food Biochem. 1989. - V.13. -P.127-153.

184. Patino S., Grace J., Banziger H. Endothermy by flowers of Rhizanthes lowii (Rafflesiaceae) II Oecologia. 2000. - V.124. - P.149-155.

185. Patterson B.D., Payne L.a., Chen Y., Gracham D. An inhibitor of catalase induced by cold in chilling-sensitive plans // Plant Physiol. 1984. -V.76, N4. -P.1014-1018.

186. Pobezhimova T.P., Voinikov V.K. Protein import to mitochondria // Russian J. Plant Physiol. 2000. - V.47, N1. - P.129-136.

187. Pobezhimova Т., Grabelnych O., Kolenichenko A., Voinikov V. The comparison of uncoupling activity of constituently synthesized and stress-induced forms of winter rye stress uncoupling protein CSP 310 // J.Therm.Biol. -2001. V.26. -P.95-101.

188. Popov V., Simonian R., Skulachev V., Starkov A. Ingibition of the alternative oxidase stimulates H2O2 production in plant mitochondria // FEBS Lett. 1997. - V.415. - P.87-90.

189. Prance G. Т., Arias J. R. A study of the floral biology of Victoria amazonica (Poepp.) Sowerby (Nymphaeaceae) // Acta Amazonica. 1975. — V.5. -P.109-139.

190. Purvis A. C., Shewfelt R. L., Gegogeine J. W. Superoxide production by mitochondria isolated from green bell pepper fruit. // Physiol. Plant. 1995. - V.94. - P.743-749.

191. Purvis A.C. Role of the alternative oxidase in limiting superoxide production by plant mitochondria // Physiol. Plant. 1997. - V.100. - P. 165170.

192. Raskin I., Ehmann A., Melander W. R., Meeuse B. J. D. Salicylic acid: a natural inducer of heat production in Arum lilies // Science. 1987. - V.237. -P.1601-1602.

193. Rasmusson A.G., Soole K.L., Elthon Т.Е. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. - V.55 -P.23-39.

194. Rhoads D. M., Mcintosh L. Salicylic acid regulation of respiration in higher plants: alternative oxidase expression // Plant Cell. 1992. - V.4. -P.l 131-1139.

195. Ricquier D., Kader J. Mitochondrial protein alternation in active brown fat. A sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoretic study // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. - V.73. - P.577-583.

196. Ricquier D., Bouillaud F. The uncoupling protein homologues: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP // J. Biochem. 2000. - V.345. - P. 161-179.

197. Richter Ch., Gogvadze V., Laffranchi R., Schlapbach R., Schweizer M., Suter M., Walter P., Yaffee M. Oxidants in mitohondria: from physiology to diseases // Biochem. Biophys. Acta. 1995. - V. 1271. - P.67-74.

198. Roberts Т.Н., Fredlund K.M., Moller I.M. Direct evidence for the presence of two external NAD(P)H dehydrogenases coupled to the electron transport chain in plant mitochondria // FEBS Lett. 1995. - V.373, N3. -P.307-309.

199. Ruggeri В., Gray R., Watkins Т., Tomlins R. Effects of low-temperature acclimation and oxiden stress on tocoferol production in Euglena gracilis Z // App. And Environ. Microbiol. 1985. - V.50. - P.1404-1408.

200. Rustin P., Dupont J., Lance C. Involvement of lipid peroxy radicals in the cyanide-resistant electron transport pathway // Physiol. Veg. 1984. - V.22, N5. — P.643-663.

201. Saisho D., Nambara E., Naito S., Tsutsumi N., Hirai A., Nakazono M. Characterization of the gene family for alternative oxidase from Arabidopsis Thaliana II Plant Mol. Biol. 1997. - V.35. - P.585-596.

202. Samartcev V., Smirnov A., Zeldi I., Markova O., Mokhova E., Skulachev V. Involvement of aspartate/glutamate antiporter in fatty acid-induced uncoupling of liver mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. -V.1339. -P.251-257.

203. Schneider E. L., Buchanan J. D. Morphological studies of the Nymphaeaceae. XI. The floral biology of Nelumbo pentapetala II Am. J. Bot. — 1980. V.67. -P.182-193.

204. Seymour R. S. Plants that warm themselves //Scientific American. -1997. — V.276. -P.104-109.

205. Seymour R.S., Blaylock A.J. Switching off the heater: influence of ambient temperature on thermoregulation by eastern skunk cabbage Symplocarpus foetidus // J. Exp. Bot. 1999. - V.50. - P. 1525-1532.

206. Seymour R. A., Schultze-Motel P. Respiration, temperature regulation and energetics of thermogenic inflorescences of the dragon lily Dracunculus vulgaris (Araceae) // Proc. Roy. Soc. Lond. Ser. B. Biol. Sci. 1999. - V.266. -P.1975-1983.

207. Seymour R.S. Biophysics and physiology of temperature regulation in thermogenic flowers // Biosci. Rep. 2001. - V.21, N.2. - P.223-236.

208. Seymor R.S., Gibernau M., Ito K. Thermogenesis and respiration of inflorescences of the dead horse arum Helicodiceros muscivorus, a pseudothermoregulatory aroid associated with fly pollination // Functional Ecol. 2003. - V. 17. - P.886-894.

209. Skulachev V. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation // FEBS Lett. 1991- V.294. - P.158-162.

210. Skulachev V. Lowering of the intracellular O2 concentration as a special function of respiratory systems of the cells. // Biochem. (Moskow). -1994. V.59. -P.1910-1912.

211. Skulachev V. Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Lett. 1998a. - V.423. - P.275-280.

212. Skulachev V. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochim. Biophys. Acta. 1998b. - V.1363. - P. 100-124.

213. Sluse F.E., Almeida A.M., Jarmuszkiewicz W., Vercesi A.E. Free fatty acids regulate the uncoupling protein and alternative oxidase activities in plant mitochondria // FEBS Lett. 1998. - V.433. - P.237-240.

214. Shewfelt R.L., Erickson M.E. Role of lipid peroxidation in the mechanism of membrane-associated disorders in edible plant tissue. // Trends in Food Sci. Technol. 1991. - V.2. - P. 152-154.

215. Siedow J.N., Umbach A.L. Plant mitochondrial electron transfer and molecular biology // Plant Cell. 1995. - V.7. -P.821-831.

216. Siedow J.N., Umbach A.L. The mitochondrial cyanide-resistant oxidase: structural conservation amid regulatory diversity // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1459. - P.432-439.

217. Soole K.L., Menz R.I. Functional molecular aspects of the NADH dehydrogenases of plant mitochondria // J. Bioenerg. Biomembr. 1995. -V.27, N4. — P.397-406.

218. Stewart C.R., Martin B.A., Reding L., Cerwick S. Seedling growth, mitochondrial characteristics, and alternative respiratory capacity of corn genotypes differing in cold tolerance // Plant Physiol. 1990. - V.92. - P.761-766.

219. Susulic V., Lowell B. Brown adipose tissue and the regulation of body fat stores // Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes. 1995. - V.3. - P.44-50.

220. Symonyan R.A., Skulachev V.P. Thermoregulatory uncoupling in heart muscle mitochondria: involvement of the ATP/ADP antiporter and uncoupling protein // FEBS Lett. 1998. - V.436, N1. - P.81-84.

221. Terry I., Moore C. J., Walter G. H., Forster P. I., Roemer R. В., Donaldson J. D., Machin P. J. Association of cone thermogenesis and volatiles with pollinator specificity in Macrozamia cycads I I Plant Syst. Evol. 2004. — V.243. - P.233-247.

222. Thien L. В., Azuma H., Kawano S. New perspectives in the pollination biology of basal angiosperms // In: XVI International Botanical Congress, 1999.

223. Thomashow M. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance // Plant Physiol. 1998. - V.l 18. - P. 1-7.

224. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L. Lower grows temperature increases alternative pathway capacity and alternative oxidase protein in tobacco. // Plant Physiol. 1992. - V. 100. - P. 115-119.

225. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L. Alternative oxidase: from gene to function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V.48. - P.703-734.

226. Vercesi A.E., Martins I.S., Silva M.A.P., Leite H.M.F., Cuccovia I.M., Chaimovich H. PUMPing plants // Nature. 1995. - V.375. - P.24.

227. Vercesi A.E. The discovery of an uncoupling mitochondrial protein in plans // Biosci. Rep. 2001. - V.21, N2. - P. 195-200.

228. Vianello F., Petrussa E., Macri F. Carboxyatractyloside restores the palmitate-induced uncoupling in sunflower mitochondria // Biol. Plant. 1994. -V.36, Suppl. -P.183.

229. Vojnikov V., Luzova G., Korzun A. The composition of free fatty acids and mitochondrial activity in seedlings of winter cereals under cold shock // Planta. 1983. - V.158.-P.194-198.

230. Vojnikov V., Korzun A., Pobezhimova Т., Varakina N. Effect cold shock on the mitochondrial activity and on the temperature of winter wheat seedlings // Biochim. Physiol. Pflanz. 1984. - V.179. - P.327-330.

231. Voinikov V., Pobezhimova Т., Kolesnichenko A., Varakina N., Borovskii G. Stress protein 310 kDa affects the energetic activity of plant mitochondria under hypotermia // J. Therm. Biol. 1998. - V.23. - P. 1-4.

232. Wang W., Vinocur В., Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance // Planta. 2003. - V.218. - P. 1-14.

233. Watanabe A., Nakazano M., Tsutsumi N., Hirai A. AtUCP2: A novel isoform of the mitochondrial uncoupling protein of Arabidopsis thaliana II Plant Cell Physiol. 1999. - V.40. - P.l 160-1166.

234. Wieckowski M., Wojtczak L. Involvement of the dicarboxylate carrier in the protonophoric action of long-chain fatty acids in mitochondria // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1997. -V.232. -P.414-417.

235. Winkler E., Klingenberg M. Effect of fatty acids on FT transport activity of the reconstituted uncoupling protein // J. Biol. Chem. 1994. -V.269, N4. — P.2508-2525.

236. Yang G., Rhodes D., Joly R. Effect of high temperature on membrane stability and chlorophyll fluorescence in glycinebetaine-deficient and glycinebetaine-containing maize lines // Aust J Plant Physiol. 1996. - V.144. -P.591-596.

237. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ1. АДФ аденозиндифосфат1. АТФ аденозинтрифосфат

238. АФК активные формы кислорода

239. БГК бензгидроксамовая кислота

240. БСА бычий сывороточный альбумин

241. БХШ 310 белок холодового шока с мол. массой 310 кДа1. ДК дыхательный контроль1. ЖК жирные кислоты1. МДА малоновый диальдегид

242. НАД(Ф) никотинамидадениндинуклеотид (фосфат)1. ПО перекисное окисление

243. ПОЛ перекисное окисление липидов

244. СЖК свободные жирные кислоты1. СОД супероксиддисмутаза

245. ФАД флавинадениндинуклеотид1. ФМН флавинмононуклеотид

246. УФ- ультрафиолетовое излучениецАМФ циклический аденозинмонофосфате электрон1. НО* гидроксильный радикал1. НО* 2 гидродиоксид1. Н2О2 перекись водорода1. О2* диоксид (супероксид)

247. СССР карбонилцианид-га-хлорфенилгидразон

248. МАСР митохондриальные анионные переносчики

249. PUMP — растительные разобщающие белки1. UCP разобщаяющие белки

Информация о работе

Турчанинова, Виктория Валерьевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Изучение термогенеза у растений при низкотемпературном стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы