Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс

Кашапова, Ирина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс"

На правах рукописи

Кашапова Ир ина Юрьевна ЛЛ1-

Митохондрнальные белки-разобщителн и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс.

Специальность: 03.00.04 - биохимия 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

□03457944

Воронеж 2008

003457944

Работа выполнена в Воронежском государственном университете и Институте биофизики клетки РАН, Пущино

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Попов Василий Николаевич кандидат биологических наук Амерханов Зариф Гарриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Миронова Галина Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Наквасина Марина Александровна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 26 декабря 2008 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ГОУ ВПО "Воронежский государственный университет".

Автореферат разослан^^ноября 2008 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Грабович М. Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время известен целый ряд митохондриальных белков-разобщителей (Uncoupling proteins, UCPs), которые обнаруживаются у представителей различных систематических групп эукариот, от простейших до млекопитающих, и являются молекулярными гомологами разобщающего белка - термогенина из бурой жировой ткани млекопитающих (UCP1). В частности, экспресс™ UCP2 выявлена во многих тканях человека и животных, в то время как UCP3 обнаруживается в скелетных мышцах [для обзора см. Bouillaud et al., 2001; Nedergaard, Cannon, 2003; Rousset et al., 2004]. Большинство авторов связывают функции тканеспецифических гомологов UCP1 с их разобщающим действием и, как следствие, - с регуляцией общего уровня обмена веществ, несократительным термогенезом, снижением уровня продукции активных форм кислорода (АФК) в дыхательной цепи митохондрий и т.д. Имеющиеся на этот счет экспериментальные дашше весьма противоречивы. Функциональное значение этих белков в клетке и организме в целом широко дискутируется и во многом остается неясным до настоящего времени.

Многие факты указывают на участие белков семейства UCP в клеточных механизмах защиты от воздействия АФК. Последнее время в литературе появились данные о том, что UCPs не только могут влиять на уровень продукции АФК посредством снижения мембранного потенциала в митохондриях и/или снижения концентрации кислорода в клетке, но и об активирующем действии супероксид-радикала непосредственно на протонофорную активность UCP2 и UCP3. По данным М. Бранда с соавторами [Echtay et al., 2002; Murphy et al., 2003], рост величины протонной утечки в энергизованных препаратах митохондрий вызывался присутствием в среде инкубации супероксид-радикала и предотвращался добавкой GDP или других пуриновых нуклеотидов. В частности, этот эффект наблюдался на митохондриях почек и отсутствовал в митохондриях печени, где по литературным данным [Larrouy et al., 1997; Zackova et al., 2003; Bouillaud et al., 2001; Nedergaard, Cannon, 2003], отсутствует или незначительна экспрессия UCP2. Было обнаружено, что супероксид-радикал действует со стороны митохондриального матрикса [Echtay et al., 2002]. Предполагается, что активация UCP опосредована перекисным окислением липидов и образованием гидроперекисей жирных кислот, которые возможно уже сами непосредственно воздействуют на UCP [Goglia, Skulachev, 2003]. Способность активироваться под действием АФК соответствует более рациональному расходованию энергии в клетке. Такая точка зрения выглядит весьма привлекательной и во многом объясняет широкое распространение белков семейства UCP в клетках растений и животных.

1997], которые, по всей видимости, обеспечивают возврат анионов жирных кислот с внутренней на внешнюю сторону митохондриальной мембраны. UCPs, ANT и аспартат/глутаматный переносчик являются эволюционно родственными белками, входят в суперсемейство белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий, и предполагается, что циклический механизм переноса протонов жирными кислотами для всех этих белков является одинаковым. В известных нам работах, в которых выявлялась функциональная активность UCPs и изучалось влияние на нее АФК, не исключалось участие и других указанных белков.

В настоящее время накопилось много сведений, противоречащих данным об активирующем действии АФК через продукты перекисного окисления на UCPs [для обзора см. Nedergaard, Cannon, 2003]. Выяснилось, что гидроперекиси жирных кислот являются менее эффективными разобщителями, чем соответствующие жирные кислоты, а ресопрягающий эффект GDP в их присутствии, обычно используемый для выявления активности UCP2, может объясняться его действием на ANT [Khailova L.S. et al., 2006]. Ранее на митохондриях скелетных мышц гибернирующих животных, где по литературным данным, значительно усиливается экспресс™ UCP3, не удалось показать заметного ресопрягающего действия GDP в присутствии специфического ингибитора ANT - карбоксиатрактилата (cAtr) [Амерханов и др., 2004]. Было показано, что ресопрягающее действие GDP, наблюдаемое в отсутствие cAtr, может объясняться его способностью связываться с ANT вместо ADP по конкурентному механизму.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было выявление физиологической роли разобщающих бежов в митохондриях и, в частности, изучение функциональной активности UCP2 в условиях его активации супероксид-радикалом. В связи с этим были поставлены следующие задачи.

1) Изучить влияние супероксид-радикала на скорость дыхания, величину мембранного потенциала и основные биоэнергетические характеристики митохондрий печени и почек крыс.

2) Обнаружить функциональные проявления UCP2, используя в качестве тестовой системы ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов.

3) Дифференцировать активность разобщающих белков и ADP/ATP-антипортера с помощью высокоспецифичного ингибитора ANT карбоксиатрактилата (cAtr).

4) Для выявления защитного влияния UCP2 в митохондриях почек оценить ингибирующее действие пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (высокочувствительного к их действию фермента матрикса митохондрий) в препаратах митохондрий из печени и почек крыс.

5) Получить электрофоретически гомогенный препарат сукцинатдегидрогеназы из различных источников и оценить возможность ее ингибирования активными формами кислорода.

6) Сравнить уровень экспрессии мРНК для UCP2 в почках и печени, как в абсолютных значениях, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ADP/ATP-антипортера и щггохромоксидазы).

Научная новизна. Впервые показано, что в присутствии системы генерации супероксид-радикала (ксантина и ксангиноксидазы) действительно наблюдается разобщение дыхания, оцениваемое по увеличению начальной скорости дыхания, при одновременном небольшом подавлении максимальной скорости дыхания, а также падение мембранного потенциала внутренней митохондриалыгой мембраны. Установлено, что указанные изменения носят одинаковый качественный и количественный характер, как в митохондриях почек, так и в митохондриях печени крыс. Для оценки активации UCP2 использовали ингибирующее действие пуриновых нуклеотидов (ADP) на разобщающие белки. Чтобы дифференцировать вклад в разобщение UCP2 и ANT, был использован cAtr -высокоспецифичный ингибитор ANT. Снижение максимальной скорости дыхания препаратов митохондрий печени и почек указывает на повреждение супероксид-радикалом дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Нами показано, что, в условиях использования в качестве субстрата дыхания янтарной кислоты, это может объясняться ингибированием сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и цитохромоксидазу (СОХ), указывают на более низкую экспрессию мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ). Изучение ингибируюгцего действия пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (АН) не выявило преимущественной устойчивости митохондрий почек по сравнению с митохондриями печени, которое могло бы быть обусловлено присутствием в митохондриях почек UCP2.

Полученные результаты позволяют предположить, что активирующее действие супероксид-радикала на UCPs зависит от физиологических условий, в которых находится ткань, и требует дополнительных изысканий. Ресопрягающий эффект пуриновых нуклеотидов, как в присутствии, так и в отсутствие супероксид-радикала, в митохондриях печени и почек крыс связан не с функционированием UCP2, а с их действием на ANT. Разобщение, наблюдаемое под действием супероксид-радикала в митохондриях почек крысы, может быть интерпретировано без привлечения модели М. Бранда, базирующейся на усилении под действием супероксид-радикала протонофорной активности UCP2.

Практическая значимость работы. Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации с нашей стороны существующих представлений о функциях тканеспецифических изоформ UCPs и осознании необходимости дальнейшего их исследования. Древнее происхождение и широкое распространение UCPs в клетках растений и животных говорит об их, безусловно, большом функциональном значении для эукариотических организмов. Соответственно раскрытие этих функций и

использование полученных знаний на практике чрезвычайно полезно для терапии и диагностики многих заболеваний, разработки лекарственных препаратов, ветеринарии и сельского хозяйства.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по "Биохимии", в спецкурсе "Метаболизм органических кислот", а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробаиия работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9-й и 11-й Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2007), межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2004, 2005, 2006), Международной научной конференции "Современные проблемы адаптации и биоразнообразия" (Махачкала, 2008).

Публикации. Основные результаты представленной работы изложены в 10 публикациях - 2 статьях в рецензируемых научных изданиях, 6 статьях в сборниках научных работ, 2 тезисах докладов научных конференций.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (256 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок и 4 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов использовались самцы крыс (Rattus norvegicus L.) линии Wistar (массой 150-200 граммов). Животные содержались в стандартных условиях вивария. Перед забором материала животных декапитировали. Очистку ферментативных препаратов проводили из печени крыс, клубней картофеля Solanum tuberosum L., пятидневных проростков (щитков) кукурузы Zea mays L.

Выделение митохондрий из печени и почек кпые. Максимально быстро извлеченные почки и печень одного животного помещали в среду выделения, охлажденную до 0'С, и перфузировали этой же средой для удаления остатков периферической крови. Среда выделения для митохондрий печени и почек содержала: 250мМ сахарозы, 1мМ EGTA, ЮмМ Tris-HCl (pH 7.4).Все процедуры проводились в холодной комнате при температуре не выше 4'С.Митохондрии из тканей печени и почек крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования в соответствии с [Echtay et al., 2002; Murphy et al., 2003]. Концентрацию белка определяли методом Лоури [Lovvry et al. 1951].

Регистрация дыхания и опенка мембранного потенциала. Скорость потребления кислорода суспензией митохондрий измеряли полярографическим методом с использованием закрытого электрода Кларка в термостатируемой ячейке объемом 1мл при постоянном перемешивании и температуре 26°С.

Регистрацию сигналов осуществляли с помощью прибора Record 4 (Институт биофизики клетки РАН, Пущино) и соответствующего программного обеспечения. Среда инкубации содержала 1 мг/мл митохондриального белка, 120мМ KCl, 1 мМ EGTA, 5 мМ HEPES, pH 7.2,, 5 мМ КН2Р04, 1 мМ MgCb, 5 мкМ ротенона, 2.5 мкг/мл олигомицина, а также 2 мг/мл BSA, 100 мкМ пальмитата, 0.1 мкМ иигсрищша аналогично [Echtay et al., 2002; Murphy et al., 2003]. Для генерации экзогенного супероксид-радикала использовали систему -ксантиноксидаза 0.015ед./1мл (ХОХ) плюс ксантин (50мкМ). Оцешсу мембранного потенщ!ала проводили по распределению ионов

тетрафенилфосфония (ТРР+) с помощью ТРР+-селективного электрода.

Выделение митохондриально обогащенной Фпакнии СЛГ и АН и очистка Ферментативного препарата Г/ТГ. Очистку фермента проводили по модифицированной четырехстадийной схеме, включающей в себя получение митохондриально обогащенной фракции, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и ионообменную хроматографию на DEAE-fraktogel. Активность СДГ определяли спектрофотометрически с применением искусственных акцепторов электронов (PMS, ДХФИФ) [Cooper et al., 1969] при длине волны 600 нм в течение 5 минут при 25°С. Для изучения влияния Н2О2 на активность СДГ в митохондриях и в очищенных препаратах СДГ вносили 0.1М Н2О2 в концентрации от 1мкМ до ЮмМ, инкубировали 10 минут, разрушали митохондрии добавлением 0.12%v/v Triton-X-100 и измеряли активность фермента. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, образующее 1мкМ субстрата за 1 минуту при 25°С и оптимальном значении pH.

Аналитический электрофорез. Для подтверждения гомогенности полученного белкового препарата использовали метод нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для визуализации белков использовали метод окрашивания нитратом серебра. Для специфической идентификации СДГ использовалась среда следующего состава: калий-фосфатный буфер pH 7.8, 20мМ сукщшат Na, 2мМ MgCl2, 3.3 мМ PMS, 0.5 мг/мл нитросинего тетразолия [Гааль и др., 1982].

Исследование эффекта АФК на АН митохондрий печени и почек крысы. Активность митохондриальной АН оценивали спектрофотометрически на СФ-46 по изоцитратдегидрогеназной реакции [Echtay et al., 2002]. Для исследования влияния АФК пероксид водорода добавляли в кюветы непосредственно (в концентрации 10 мкМ), а генерацию супероксид-радикала осуществляли системой ксантин + ксантиноксидаза (Х/ХОХ). Для этого в кюветы со средой инкубации и митохондриями добавляли 50 мкМ ксантина и 0.01ед./2ш1 ХОХ. Через заданный интервал времени в пробы с Х/ХОХ вносили 45 ед. супероксиддисмутазы. Реакцию инициировали добавлением 0,12% v/v Triton Х-100 для разрушения митохондрий и спектрофотометрировали против пробы, не содержащей изоцитратдегидрогеназы.

Выделение 7ТНК и РНК. ДНК из печени крысы выделяли методом депротеинизации щелочным фенолом. Для выделения из печени и почек крысы образцов тотальной РНК использовали метод гуанидин-изотиоцианат-фенол-

хлороформной экстракции [Chomczynski, Sacchi, 1987; Маниатис и др., 1986]. Качество выделенной РНК оценивали электрофоретически в 0,8% агарозе (130В/70мА), концентрацию определяли на спектрофотометре NanoDrop spectrophotometer (США).

Реакция обратной транскриннни. При подборе праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа оптимальными считали праймеры, имеющие >50% G/C-nap и не имеющие в геноме других мишеней, комплементарных более чем к 10-11 нуклеотидам на З'-конце. Степень уникальности оценивали с помощью BLAST (NCBI). Для обратной транскрипции и амплификации гена ANT праймеры были подобраны в участке, консервативном для двух изоформ переносчика (ANT1 и ANT2). В качестве референтного был использован ген, кодирующий 3-ю субъединииу маркерного белка внутренней митохондриальной мембраны - СОХ. Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя набора реактивов для обратной транскрипции ("Fermentas", Литва) с небольшими модификациями.

Количественная PCR в реальном времени. RT-PCR в реальном времени проводили на приборе ДТ-322 ("ДНК-Технология", Россия) с использованием интеркалирующего в двуцепочечную ДНК красителя SYBR Green I (Invitrogen, США). Качество и молекулярный вес PCR-продуктов оценивали электрофоретически в 5% ПААГ (260В/130мА).

Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ. Полученные после электрофоретического разделения фрагменты ДНК экстрагировали из геля по методике, описанной в [Маниатис и др., 1986]. Секвенирование фрагментов ДНК проводили в "ВНТК Генной активности" Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Статистическая обработка данных. Все опыты проводили не менее чем в 3-кратной повторности. На рисунках и электрофореграммах приведены данные типичных опытов. В таблицах и на гистограммах приведены средние арифметические и их стандартные ошибки. Для оценки достоверности отличий использовали статистический t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие супероксид-радикала на параметры дыхания митохондрий печени н почек крыс и ресопрягающее действие пурнновых нуклеотидов и cAtr.

На рис.1 представлены типичные кривые измерения скорости дыхания суспензии митохондрий почек в присутствии и в отсутствие супероксид-радикала. ХОХ добавлялась до начала измерения дыхания и вызывала небольшое дополнительное поглощение кислорода. После того, как дыхание митохондрий было инициировано добавкой сукцината, полярографическую ячейку закрывали и регистрировали начальную скорость дыхания, скорость дыхания в присутствии пуриновых нуклеотидов и cAtr при разной последовательности этих добавок, и максимальную скорость дыхания в

присутствии разобщителя. Во многих работах, как специфический тест на функциональную активность UCP, используют ресопрягающий эффект GDP. Но, так как ранее было показано, что использование GDP не может служить специфическим тестом на активность UCP в силу его взаимодействия с ANT [Khailova et al., 2006; Амерханов и др., 2004], и большее сродство к UCP2 проявляет ADP [Echtay et al., 2002; Zackova et al., 2003], мы в своих экспериментах предпочли использовать добавку ADP в условиях ингибирования митохондриальной АТР-азы олигомищшом.

ШЧ!

еоз »0 •ЮЗ

зза 202 юо о

с <ж> я» '¿й «с ка «а ?» «в о г» м « к« ка 1» ю <» ,"т

(ЛЯ) <»«)

Рнс.1. Типичные кривые скорости дыхания митохондрий почек крысы в присутствии и в отсутствие суперокснд-радикала, и действие АЭР и сА№ в зависимости от последовательности добавок.

Митохондрии и наличие в среде ХОХ ^нач. ADP ADP +cAtr cAtr cAtr +ADP ^мавх (FCCP) "^mxJ Vfta4

Последовательность добавок ADP и cAtr 1 2 1 2

Митохондрии печени -ХОХ 54.2 ±0,6 44,3 ±0,6 39,2 ±0,6* 41,5 ±0,4 40,5 ±0,7** 187,4 ±0,63 3,46 ±0,13

Митохондрии печени+ХОХ 87,6 ±0,4 70,6 ±0,6 59,3 ±0,4* 62,8 ±0,3 62,2 ±0,6** 171,2 ±0,75 1,95 ±0,15 ***

Митохондрии почек -ХОХ 51.9 ±0.2 32,0 ±0,5 22,1 ±0,4* 24,1 ±0,3 24,5 ±0,3** 205,4 ±0,7 4,0 ±0,1

Митохондрии почек +ХОХ 66,4 ±0,4 42,6 ±0,6 25,4 ±0,5* 27,2 ±0,5 27,8 ±0,5** 177,5 ±0,8 2,7 ±0,1

Таб. 1. Ресопрягающие эффекты сА№ и ЛОР на дыхание митохондрш1 печени и почек крысы в зависимости от последовательности их добавок и предварительной инкубации млтохондрнй с Х/ХОХ. Скорость дыхания указана в нг-Атом 02 / мин-мг белка. - отличия достоверны относительно скорости дыхания в присутствии АОР, р<0.001. - отличия не достоверны относительно скорости дыхания в присутствии сА1г, р> 0.05. * отличия достоверны по отношению к результатам, полученным в отсутствие системы продукции 02", р< 0.05.

Из результатов, обобщенных в таблице 1, видно, что в присутствии системы Х/ХОХ обнаруживалось небольшое подавление максимальной скорости дыхания, выявляемое после добавки искусственного разобщителя (ТССР), как в митохондриях почек, так и в митохондриях печени крыс. Под

разобщение дыхания, оцениваемое по увеличению максимальной скорости дыхания по отношению к начальной скорости. Величина соответствующих дыхательных коэффициентов снижается приблизительно в 1.5 раза в обоих случаях. Но приведенные данные указывают на то, что наблюдаемое разобщение не связано с активацией UCP2, т.к. присутствие cAtr предотвращало снижение скорости дыхания под действием ADP на фоне ингибирования митохондриальной АТР-азы олигомицином.

На рис.2 приведены ресонрягающие эффекты, оцениваемые по отношению начальной скорости дыхания к скорости дыхания в присутствии добавки при разной их последовательности для суспензии митохондрий почек крысы. Ресопрягающий эффект ADP, действительно, оказывался несколько более выражен после инкубации в присутствии супероксида (рис.2В) по сравнению с контролем (рис.2А). Однако действие ADP в обоих случаях полностью предотвращалось в условиях, когда функционирование ANT было предварительно блокировано добавкой cAtr.

А В

ADP ADP

cAtr cAtr

ADP ADP

cAtr cAtr

ADP

Рис. 2. Отношение начальной скорости дыхания суспензии митохондрий почек крысы к скорости дыхания после добавки с\1г и.ш Л1)Р в присутствии и в отсутствие системы Х/ХОХ. А - в среде отсутствовала ХОХ, В - в присутствии Х/ХОХ. * - отличия достоверны по отношению к скорости дыхания в присутствии АЭР (р<0.001). При обратной последовательности добавок отличия не достоверны (р>0.05).

На основании этих данных можно заключить, что наблюдаемое под действием ADP снижение скорости дыхания полностью объясняется участием в разобщении ANT, которое было впервые описано В.П. Скулачевым с сотрудниками [Andreyev et al., 1989].

Действие суперокснд-радикала на величину мембранного потенциала митохондрий печени и почек крысы и действие пуриновых нуклеотидов и cAtr.

Мембранный потенциал после инкубации митохондрий почек в присутствии ХОХ понижается (рис. 3), и внесение ADP на фоне олигомицина приводит к его увеличению. Однако после добавки cAtr никакого действия ADP на потенциал в митохондриях, как почек, так и печени, не обнаруживалось даже после инкубации митохондрий в присутствии ХОХ. В то же время, в условиях полного блокирования ANT с помощью cAtr, последующая добавка глутамата вызывала дальнейшее увеличение потенциала, что указывает на работу другого механизма разобщения, осуществляемого с участием аспартат/глутаматного переносчика [Samartsev et al., 1997]. Мы полагаем, что ресопрягающий эффект пуриновых нуклеотидов, как в отсутствие, так и в присутствии супероксид-радикала, связан не с функционированием UCP2, а с активностью ANT, способного транспортировать анионы жирных кислот и таким образом участвовать в разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования.

Рис. 3. Действие ADP, cAtr и глутамата (Glut) на мембранный потенциал (Дц>) митохондрий почек крысы после инкубации в присутствии (+ХОХ) и в отсутствие (-ХОХ) супероксид-радикала.

Конечно, можно было бы предположить, что cAtr ингибирует и UCP2. Однако в литературе нет достоверных сведений об ингибирующем действии cAtr на разобщающие белки, включая подробно изученный UCP1. Ранее было установлено отсутствие эффекта cAtr на реконструированный UCP из митохондрий картофеля [Попов, 2003], а также на активность UCP1 в митохондриях бурого жира в концентрации вплоть до 200 мкМ. Тем не менее, окончательную ясность в этом вопросе может внести только подтверждение этих результатов для реконструированного UCP2 из животных тканей. Недавно Бранд с соавторами [Parker et al., 2008] представил результаты, указывающие на то, что cAtr может ингибировать UCP3 в митохондриях скелетных мышц

опосредованно, через белок-белковое взаимодействие с ANT. Но такое предположение пока сомнительно и недостаточно аргументированно.

Таким образом, мы не наблюдаем принципиальной разницы в действии супероксид-радшсала на митохондрии печени и почек. Влияние инкубации в присутствии супероксид-радикала на сопряженность, максимальную скорость дыхания и мембранный потенциал должно объясняться причинами, не связанными с активацией UCP2, ни в митохондриях печени, ни в митохондриях почек.

Влияние пероксида водорода на активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях и ее очищенные препараты.

Повреждающее действие АФК на клетку уже давно является объектом пристальных исследований. Хорошо известно, что митохондрии могут быть не только источником АФК, но и мишенью их повреждающего действия. Хотя супероксид-радикал плохо проникает через биологические мембраны [Takahashi М.А., Asada К., 1983; Гуськова и др., 1984], было показано, что он (и другие АФК) способны ингибировать некоторые ферментные системы внутренней мембраны и матрикса митохондрий, в том числе и СДГ [Rosen et al., 1987]. Предполагается, что добавленный снаружи 02"' проникает через внутреннюю мембрану митохондрий в виде гидропероксил-радикала [Guidot et al., 1995].

Можно полагать, что наблюдаемое в нашем случае снижение максимальной скорости дыхания митохондрий печени и почек крысы в присутствии супероксид-радикала частично может объясняться повреждением СДГ. Для изучения ингибирующего действия АФК на СДГ в митохондриях и на ее очищенные препараты мы использовали Н202 вместо супероксид-радикала в силу большей простоты и доступности такого подхода. На рис.4, отражено снижение активности СДГ в митохондриальных фракциях в ответ на инкубацию с Н2О2. Кроме митохондрий печени крысы для сравнения были использованы митохондрии из растительных объектов (клубней картофеля и проростков кукурузы). Для препаратов митохондрий печени крысы полумаксимальная ингибирующая концентрация Н202 составила Ki =0,40±0,0бмМ.

о,м

0,1 0.2 3 10

С (Н,0;), мМ

Рис.4. Влияние Н2О2 на активность СДГ в митохондриях. 1 - митохондрии клубней картофеля; 2 - митохондрии печени крысы; 3 - митохондрии проростков кукурузы.

Все использованные препараты демонстрируют сходную, хотя и относительно невысокую, чувствительность к действию Н202. Для исключения влияния косвенных факторов на активность СДГ в присутствии Н2СЬ ферменты из рассматриваемых объектов были подвергнуты очистке до электрофоретически гомогенных препаратов. Из печени крысы был получен очищенный препарат СДГ с выходом 6,14% и степенью очистки 73,8 (см. таблицу 2). С помощью нативного электрофореза была оценена гомогенность полученных препаратов и окрашиванием на специфическую активность СДГ выявлено их соответствие исследуемому белку (рис. 5).

Таблица 2.

Очистка СДГ из печени крысы (п=10).

Стадия очистки Объем мл Количество белка, мг Общая активность Е Уд. активность, Е/мг белка Выход % Степень очистки

Гомогенат 25 57.76±2.89 8.08±0.4 0.14±0.007 (100) (1)

Фракция митохондрий и микротелец 2.3 3.34±0.17 2.05±0.1 0.615±0.03 25.4 4.42

Фракционирован ие (Ш^О^О-60% 2 1.99±0.09 0.55±0.03 0.28±0.01 6.8 2.0

Гель-фильтрация через сефадекс С-25 4 0.039±0.002 0.50±0.02 1.28±0.06 6.2 9.16

Хроматография на ОЕАЕ-fraktogel 12 0.048±0.003 0.496±0.02 10.33±0.52 6.14 73.8

1 2

Рис. 5. Элекгрофореграммы очищенных препаратов СДГ митохондрий печени крыс после окраски по белку (1) и на специфическую активность(2).

а ей о,г 2 10

с (Нрг}р мМ

Рис. 6. Влияние Н2Ог на активность электрофоретически гомогенных

препаратов СДГ. 1 - СДГ клубней картофеля; 2 - СДГ печени крысы; 3 - СДГ проростков кукурузы

Очищенные препараты СДГ также оказались чувствительными к действию Н202 (рис. 6), что подтверждает сходство механизма воздействия АФК на СДГ с таковым для аконитазы матрикса митохондрий [Rosen et al, 1987; Powell and Jackson, 2003], обусловленное переходом ферментативного комплекса в неактивное состояние в результате выхода атома железа и активного центра.

Таким образом, как СДГ интактных препаратов митохондрий, так и очищенные препараты СДГ ингибируются высокими концентрациями Н202. Это может являться основной причиной снижения максимальной скорости дыхания и мембранного потенциала в присутствии супероксид-радикала в митохондриях почек и печени крысы.

Действие пероксида водорода и супероксид-радикала на активность АН в митохондриях печени и почек крысы.

Митохондриальная АН обычно рассматривается как основная мишень повреждающего действия АФК на митохондрии. Высокая чувствительность АН к АФК была продемонстрирована во многих исследованиях животных, растительных и прокариотических клеток [Vemiquet et al., 1991; Gardner et al., 1991, 1995]. Инактивация АН под действием АФК происходит вследствие окисления ее [4Fe-4S]2+ кластеров, входящих в состав активного центра, до стабильного [3Fe-4S]1+ формы. Бранд в своих работах [Echtay et al., 2002] использовал АН с целью доказать проникновение 02" в митохондрии почек крысы, т.к. по его мнению АФК оказывают активирующий эффект на UCP2 именно со стороны митохондриального матрикса. С другой стороны, предполагалось, что UCP2 способен транспортировать и удалять АФК, в частности гидроперекиси жирных кислот, из митохондрий [Goglia, Skulachev, 2003]. В связи с этим было интересно сравнить чувствительность АН в препаратах интактных митохондрий почек и печени крысы к воздействию экзогенно добавленного Н202 и 02".

Рис. 7. Ннгабирование АН в препаратах митохондрий печени и почек крысы в присутствии Н2О2 и Х/ХОХ (в % от исходной активности). * - отличия достоверны относительно активности АН в отсутствие АФК (р<0.001) и не достоверны между собой (р>0.05); ** - активность АН в присутствии Ог' в митохондриях печени и почек достоверно отличается от активности АН в отсутствие АФК (р<0.001) и достоверно различается в митохондриях печени и почек (р<0.05).

контроль печень почки + +

НА НА

На рис.7 представлена гистограмма, демонстрирующая снижение активности АН в результате инкубации с Н202 и 02~ в печени и почках крыс. Видно, что и в печени, и в почках АФК оказывают деструктивное действие на АН. Небольшая разница в чувствительности АН между митохондриями печени и почек в присутствии супероксид-радикала, как нам кажется, не является качественно значимой.

Дифференциальная активность генов, кодирующих UCP2, ANT и СОХ в ткани печени и почек крысы.

По устоявшемуся мнению, в печени практически отсутствует или крайне незначительна экспрессия UCP2, локализованная в присутствующих в печени резидентных макрофагах (Купферовских клетках) [Larrouy et al., 1997], тогда как в некоторых других тканях, в том числе почках, обнаруживается присутствие UCP2 [Fleury et al., 1997; Gimeno et al., 1997; Ricquier, Bouillaud, 2000]. Эти представления основывались на обнаружении соответствующей мРНК для UCP2 [Fleury et al. 1997; Gimeno et al. 1997, Ricquier and Bouillaud 2000] или косвенно опирались на обнаружение чувствительной к пуриновым нуклеотидам супероксид - стимулируемой протонной проницаемости [Echtay et al. 2002]. Многие результаты, сопровождаемые идентификацией различных UCPs методом иммуноблотинга были поставлены под сомнение из-за низкой специфичности используемых антител. Это удается продемонстрировать, сравнивая результаты соответствующих опытов на животных дикого типа и генетически нокаутированных по локусам UCPs [Pecqueur et al., 2001]. Предположение о том, что UCP2 в результате альтернативного сплайсинга и пострансляционных модификаций может иметь различные формы, не является убедительным [Nedergaard, Cannon, 2008]. Для оценки наших результатов по измерению дыхания и мембранного потенциала в митохондриях печени и почек крысы желательно было получить объективные данные о наличии и экспрессии UCP2 этих тканях. Вызывает сожаление, что животные, нокаутированные по гену UCP2, для наших экспериментов были не доступны. Представляется, что при соблюдении всех предосторожностей метод RT-PCR в реальном времени, дающий количественную оценку мРНК, может дать объективную оценку экспрессии UCP2 в ткани. Для этого, кроме UCP2, оценивалась экспрессия ANT и СОХ. Были тщательно подобраны праймеры, которые при амплификации соответствующих фрагментов с выделенной ДНК демонстрировали одинаковую эффективность.

На рис. 8 представлены результаты электрофореза соответствующих PCR продуктов, свидетельствующие об их гомогенности, полном соответствии продуктов ожидаемой молекулярной массе и отсутствию синтеза продукта в результате наличия примесей ДНК в полученных образцах РНК или случайного взаимодействия праймеров в контрольных пробах. Продукты обратной транскрипции и последующей амплификации были вырезаны из геля и секвенированы. Результаты полностью совпали с ожидаемой последовательностью и исключают ошибочный синтез продукта для UCP2.

«днк да «днк *днк «дик

ANT ANT UCP UCP СОХ СОХ печень почки яечял почки печень лачки

РНК РНК Щ ДИК UCP ANT UCP Липочки ПОЧКИ почки ПОЧКИ

■■I

даьр-

151 bp -

-300 bp -2ШЬр

Рис. 8. Электрофоретическое разделение продуктов, полученных после RT-PCR анализа, соответствующих UCP2 (UCP), ANT и СОХ, с использованием образцов кДНК и исходных препаратов РНК и ДНК. Стрелками указаны расчетные молекулярные массы продуктов.

А В

250x103. 50x103/1

ANT UCP СОХ ANT UCP СОХ

печень почки

ANT UCP A NT UCP

печень почки

Рис. 9. Уровни экспрессии мРНК UCP2 (UCP), А М и СОХ в печени и почках крысы. А

-UCP2, ANT и СОХ в условных единицах. В -UCP2 и ANT относительно СОХ. * - отличия достоверны для UCP2 в тканях печени и почек (р<0.001). В остальных случаях отличия для тканей печени и почек не достоверны (р>0.05). За число независимых экспериментов (п = 7) принято число животных.

Результаты юмерения присутствия в ткани печени и почек крысы мРНК для UCP2, ANT и СОХ приведены на рис. 9. Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2 и ANT, в абсолютных значениях (рис. 9, А) и нормализованные по отношению к уровню экспрессии СОХ (рис. 9, В), дали неожиданный результат. Уровни экспрессии ANT в почках и печени оказались сходными. Экспрессия мРНК для гена UCP2 в почках, напротив, была приблизительно в четыре раза ниже, чем в печени, что противоречит некоторым данным литературы [см. обзор Ricquier, Bouillaud, 2000].

Таким образом, данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и СОХ указывают на более низкую экспрессию мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютных значениях, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ). Возможно, что в обеих тканях некоторый уровень экспрессии UCP2 связан с присутствием в них небольшого количества резидентных макрофагов, для которых, как было показано еще в первых работах по тканеспецифичным гомологам UCP1 [Pecqueur et al., 2001; Forman, Torres, 2001; Kizaki et al., 2002], характерна высокая экспрессия UCP2. Однако это не может заметно сказаться на функционировании препаратов митохондрий, полученных из этих тканей. И эти результаты полностью соответствуют результатам наших экспериментов по влиянию супероксид-радикала на скорость дыхания и величину мембранного потенциала митохондрий печени и почек крыс и действие пуриновых нуклеотидов и cAtr.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Все имеющиеся литературные сведения о выявлении разобщающей активности UCPs и ее активации под действием супероксид-радикала, с нашей точки зрения, могут быть полностью объяснены участием ANT в разобщении.

Для объяснения противоречия между предполагаемой разобщающей функцией, следующей из гомологии белков семейства UCP, и отсутствием достоверных данных о выявлении соответствующей активности в экспериментах на препаратах митохондрий может быть выдвинуто несколько не исключающих друг друга предположений, которые частично уже нашли отражение в литературе.

1. Возможно, эти белки выполняют иную, не связанную непосредственно с разобщением функцию. Например, участвуют в транспорте остатков жирных кислот.

2. Имеются данные о том, что UCP2 - специфический маркерный белок иммунной системы, и его идентификация в различных органах и тканях связана с наличием в этих органах небольшого количества соответствующих резидентных иммунных клеток.

фактором могла бы служить активация иСР при высоких локальных потенциалах, которые, возможно, незначительно влияют на суммарный уровень мембранного потенциала и скорость дыхания митохондрий, но могут давать более заметный вклад в продукцию АФК, которая, как показано, резко повышается с ростом мембранного потенциала.

Рис. 10. Модель в виде электрической цепи, аналогичной протонному циклу в митохондриалыгой мембране, в которой UCP соответствует электрическому элементу -стабилитрону. Стабилитрон способен резко снижать свое сопротивление при превышении определенного порогового значения напряжения. Возможно, что в митохондриях такое превышение потенциала носит локальный и временный характер. Тогда работа UCP не сказывается заметно на суммарном протонном токе и потенциале, но снижает продукцию супероксид-радикала.

Полученные результаты позволяют заключить, что распространенные к настоящему моменту представления об активирующем действии супероксид-радикала на UCPs в отношении UCP2 митохондрий почек крысы не подтверждаются. Ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов в отсутствие ингибиторов ANT не может служить качественным тестом на проявление активности UCPs. Разобщение, наблюдаемое под действием супероксид-радикала в препаратах митохондрий почек крысы, в основном обусловлено функционированием ADP/ATP-антипортера и

аспартат/глутаматного переносчика и может быть интерпретировано без привлечения модели М. Бранда с соавторами, базирующейся на усилении под действием супероксид-радикала протонофорной активности UCP2.

Рис. 11. Гипотетическая схема участия белков-анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий почек крыс в разобщении дыхания и окислительного фосфорилировании в присутствии их субстратов (+) и ингибиторов (-).

ВЫВОДЫ.

1) Супероксид-радикал в митохондриях печени и почек крыс вызывает устойчивое разобщение дыхания, что выражается в снижении величины дыхательного контроля, падении мембранного потенциала и незначительном подавлении окисления сукцината.

2) Аконитаза ( цитрат(изоцитрат)гидролиаза ) в митохондриях почек и печени в равной мере ингибировалась экзогенно добавленными супероксид-радикалом и пероксидом водорода, что может свидетельствовать об отсутствии защитного эффекта от действия АФК со стороны иСР2.

3) Получены электрофоретически гомогенные препараты СДГ из печени крыс, клубней картофеля и проростков кукурузы. Наиболее активный препарат был выделен го печени крыс. Для него значение удельной активности составило 10.33±0.52 Е/мг белка, выход - 6.14%, степень очистки - 73.80.

4) Обнаружено, что СДГ из всех изученных источников ингибируется пероксидом водорода (К; =0.40±0.06 мМ для митохондрий печени крысы). Подобная регуляция может быть связана с разрушением Fe-S кластеров, входящих в состав фермента.

5) Ингибирующий эффект пероксида водорода на сукцинатдегидрогеназу в равной степени наблюдался, как на изолированных препаратах фермента, так и на интактных митохондриях, что подтверждает тезис об относительной проницаемости митохондриальной мембраны для пероксида водорода.

6) Не выявлено заметного ресопрягающего действия ADP в присутствии ингибитора ADP/ATP-антипортера (cAtr), ни в норме, ни на фоне разобщающего действия супероксид-радикала, тогда как cAtr снимает разобщающий эффект жирных кислот и супероксид-радикала. Это свидетельствует о ведущей роли ADP/ATP-антигортера в разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования.

7) Глутамат также проявлял ресопрягающий эффект при действии супероксид-радикала на препараты митохондрий почек и печени крыс, что указывает на возможность участия в разобщении и аспартат-глутаматного антипортера.

8) Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и СОХ, указывают на более низкий уровень мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ).

9) Предложена гипотетическая модель участия разобщающих белков-анионных переносчиков внутренней митохондриальной мембраны в защите митохондрий от действия АФК и, в частности, супероксид-радикала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Регуляция биоэнергетики клетки пуриновыми нуклеотидами./ ... И.Ю. Кашапова (Иванова) [и др.] //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2004. -Вып.6. - с. 150-156.

2. Кашапова (Иванова) И.Ю. Очистка и регуляторные свойства сукцинатдегидрогеназы из растительных митохондрий./ И.Ю. Кашапова (Иванова), М.Н. Тутукина, В,Н. Попов// Труды молодых ученых ВГУ. -Воронеж. - 2004. -Вып.1. -с.106-110.

3. Тутукина М.Н. Использование ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl для очистки сукцинатдегидрогеназы из клубней картофеля (Solanum tuberosum L.)./ М.Н. Тутукина, И.Ю. Кашапова, В.Н. Попов// Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж. - 2005. - Т.5. -Вып.З. - с.407-410.

4. Регуляция пероксидом водорода сукцинатдегидрогеназной системы в растениях./ И.Ю. Кашапова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2005. - Вып. 7 - с. 61-67.

5. Кашапова И.Ю. Очистка и регуляторные свойства сукщшатдегидрогеназы ш растительных митохондрий/ И.Ю. Кашапова, М.Н. Тутукина // IX международная школа-конференция «Биология -наука XXI века»: тез.докл. - Пущино. - 2005. - с.79.

6. Ингибирующее действие пероксида водорода на аконитазу из печени мышей./ И.Ю. Кашапова [и др.] // Труды молодых ученых ВГУ. -Воронеж. - 2006. -Вып.1. -с.93-98.

7. Кашапова И.Ю. Изучение разобщающего действия активных форм кислорода на митохондрии печени и почек при окислении сукцината./ И.Ю. Кашапова, В.Н. Попов, З.Г. Амерханов// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2006. -Вып.8 — с.93-99.

8. Действие активных форм кислорода на сопряженность дыхания и фосфорилирования в митохондриях/ И.Ю. Кашапова [и др.] // XI международная школа-конференция «Биология - наука XXI века»: тез.докл. - Пущино. - 2007. - с. 144.

9. Амерханов З.Г. Роль иСР2 и АДФ/АТФ-антипортера в разобщающем действии супероксид-радикала на препараты митохондрий почек/ З.Г. Амерханов, И.Ю. Кашапова. В.Н. Попов// Доклады Академии наук. -Москва. - 2008. - Т. 423. - №2,- с. 264-267.

10. Амерханов З.Г. Возможная функциональная роль тканеспецифических разобщающих белков семейства иСР/ З.Г. Амерханов, И.Ю. Кашапова, Н.П. Комелина // Труды международной научной конференции «Современные проблемы адаптации и биоразнообразия». - Махачкала -2008.-с. 13-18.

Работы №3,№9 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать 21.11.08. Формат 60x84 '/1б. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 2221

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Нздательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кашапова, Ирина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Митохондрии и их функции в клетке

1.2. Активные формы кислорода, их генерация и биологическое действие

1.3. Кальций и образование АФК в митохондриях

1.4. Влияние АФК на активность ряда ферментов ЦТК и ЭТЦ

1.4.1. Аконитатгидратаза

1.4.2. Сукцинатдегидрогеназа ч

1.5. Механизмы защиты клетки от повреждающего действия АФК

1.6. Разобщающее действие жирных кислот

1.7. Белки внутренней мембраны митохондрий, опосредующие разобщающее действие жирных кислот

1.7.1. ADP/ATP-антипортер как разобщающий белок

1.7.2. Разобщающие белки семейства UCP

1.7.2.1. Термогенин бурого жира млекопитающих

1.7.2.2. Тканевые гомологи UCP

Возможная физиологическая роль UCP2 и UCP

ГЛАВА 2: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 .Объекты и методы исследования

2.1.1. Объекты исследования

2.1.2. Использованные в работе реактивы

2.1.3. Выделение митохондрий из почек и печени крыс

2.1.4. Определение концентрации белка по методу Лоури 61 2.1.5 Полярографический метод определения поглощения кислорода суспензией митохондрий с помощью электрода Кларка

2.1.6. Определение трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий методом синтетических проникающих ионов с помощью тетрафенилфосфониевого электрода

2.1.7. Получение митохондриально обогащенной фракции из клубней картофеля, проростков кукурузы, печени и почек крысы и очищенного ферментативного препарата СДГ из проростков кукурузы, клубней картофеля и печени крыс

2.1.8. Спектрофотометрическое определение активности СДГ

2.1.9. Определение гомогенности фермента методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле

2.1.10. Исследование эффекта АФК на аконитазу митохондрий печени и почек крыс

2.1.11. Выделение ДНК из печени крыс методом депротеинизации щелочным фенолом

2.1.12. Выделение РНК из печени и почек крыс

2.1.13. Подбор праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа

2.1.14. Реакция обратной транскрипции

2.1.15. RT-PCR в реальном времени

2.1.16. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ

2.1.17. Статистическая обработка данных

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. Действие супероксид-радикала на параметры дыхания митохондрий почек и печени крыс и ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов и карбоксиатрактилата

2.2.2. Действие супероксид-радикала на величину мембранного потенциала митохондрий почек и печени крыс и действие пуриновых нуклеотидов и карбоксиатрактилата

2.2.3. Влияние пероксида водорода на активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях и ее очищенные препараты

2.2.4. Действие пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы в митохондриях печени и почек крыс

2.2.5. Дифференциальная активность генов, кодирующих UCP2, ADP/ATP-антипортер и цитохромоксидазу в ткани печени и почек крыс

Введение Диссертация по биологии, на тему "Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс"

В настоящее время известен целый ряд митохондриальных белков-разобщителей (Uncoupling proteins, UCPs), которые обнаруживаются у представителей различных систематических групп эукариот, от простейших до млекопитающих, и являются молекулярными гомологами разобщающего белка - термогенина из бурой жировой ткани млекопитающих (UCP1). В частности, экспрессия UCP2 выявлена во многих тканях человека и животных, в то время как UCP3 обнаруживается в скелетных мышцах [для обзора см. 107, 155, 224]. Большинство авторов связывают функции тканеспецифических гомологов термогенина с их разобщающим действием и, как следствие, - с регуляцией общего уровня обмена веществ, несократительным термогенезом, снижением уровня продукции активных форм кислорода (АФК) в дыхательной цепи митохондрий и т.д. Имеющиеся на этот счет экспериментальные данные весьма противоречивы. Функциональное значение этих белков в клетке и организме в целом широко дискутируется и во многом остается неясным до настоящего времени.

155, 107, 47, 130]. Было обнаружено, что супероксид-радикал действует со стороны митохондриального матрикса [196, 197]. Предполагается, что активация UCP опосредована перекисным окислением липидов и образованием гидроперекисей жирных кислот, которые возможно уже сами непосредственно воздействуют на UCP [99]. Способность активироваться под действием АФК соответствует более рациональному расходованию энергии в клетке. Такая точка зрения выглядит весьма привлекательной и во многом объясняет широкое распространение белков семейства UCP в клетках растений и животных.

Однако в 1989 г., задолго до обнаружения UCPs, в лаборатории В.П. Скулачева было показано, что в разобщающем действии свободных жирных кислот на митохондрии могут участвовать ADP/ATP-антипортер (ANT) [214] и аспартат/глутаматный переносчик [112], которые, по всей видимости, обеспечивают возврат анионов жирных кислот с внутренней на внешнюю сторону митохондриальной мембраны. UCPs, ANT и аспартат/глутаматный переносчик являются эволюционно родственными белками, входят в суперсемейство белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий, и предполагается, что циклический механизм переноса протонов жирными кислотами для всех этих белков является одинаковым. В известных нам работах, в которых выявлялась функциональная активность UCPs и изучалось влияние на нее АФК, не исключалось участие и других указанных белков.

В настоящее время накопилось много сведений, противоречащих данным об активирующем действии АФК через продукты перекисного окисления на UCPs [для обзора см. 155]. Выяснилось, что гидроперекиси жирных кислот являются менее эффективными разобщителями, чем соответствующие жирные кислоты, а ресопрягающий эффект GDP в их присутствии, обычно используемый для выявления активности UCP2, может объясняться его действием на ANT [133]. Ранее на митохондриях скелетных мышц гибернирующих животных, где по литературным данным значительно усиливается экспрессия UCP3, не удалось показать заметного ресопрягающего действия GDP в присутствии специфического ингибитора ANT - карбоксиатрактилата (cAtr) [108]. Было показано, что ресопрягающее действие GDP, наблюдаемое в отсутствие cAtr, может объясняться его способностью связываться с ANT вместо ADP по конкурентному механизму.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было выявление физиологической роли разобщающих белков в митохондриях и, в частности, изучение функциональной активности UCP2 в условиях его активации супероксид-радикалом. В связи с этим были поставлены следующие задачи.

1. Изучить влияние супероксид-радикала на скорость дыхания, величину мембранного потенциала и основные биоэнергетические характеристики митохондрий печени и почек крыс.

2. Обнаружить функциональные проявления UCP2, используя в качестве тестовой системы ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов.

3. Дифференцировать активность разобщающих белков и ADP/ATP-антипортера с помощью высокоспецифичного ингибитора ANT -карбоксиатрактилата (cAtr).

4. Для выявления защитного влияния UCP2 в митохондриях почек оценить ингибирующее действие пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (высокочувствительного к их действию фермента матрикса митохондрий) в препаратах митохондрий из печени и почек крыс.

5. Получить электрофоретически гомогенный препарат сукцинатдегидрогеназы из различных источников и оценить возможность ее ингибирования активными формами кислорода.

6. Сравнить уровень экспрессии мРНК для UCP2 в почках и печени, как в абсолютных значениях, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ADP/ATP-антипортера и цитохромоксидазы).

Научная новизна. Впервые показано, что в присутствии системы генерации супероксид-радикала (ксантина и ксантиноксидазы) действительно наблюдается разобщение дыхания, оцениваемое по увеличению начальной скорости дыхания, при одновременном небольшом подавлении максимальной скорости дыхания, а также падение мембранного потенциала внутренней митохондриальной мембраны. Установлено, что указанные изменения носят одинаковый качественный и количественный характер, как в митохондриях почек, так и в митохондриях печени крыс. Для оценки активации UCP2 использовали ингибирующее действие пуриновых нуклеотидов (ADP) на разобщающие белки. Чтобы дифференцировать вклад в разобщение UCP2 и ANT, был использован cAtr -высокоспецифичный ингибитор ANT. Снижение максимальной скорости дыхания препаратов митохондрий печени и почек указывает на повреждение супероксид-радикалом дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Нами показано, что, в условиях использования в качестве субстрата дыхания янтарной кислоты, это может объясняться ингибированием сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и цитохромоксидазу (СОХ), указывают на более низкую экспрессию мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ). Изучение ингибирующего действия пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (АН) не выявило преимущественной устойчивости митохондрий почек по сравнению с митохондриями печени, которое могло бы быть обусловлено присутствием в митохондриях почек UCP2.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9-й и 11-й Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2007), межрегиональных конференциях, посвящённых памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2004, 2005, 2006), Международной научной конференции "Современные проблемы адаптации и биоразнообразия" (Махачкала, 2008).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (256 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кашапова, Ирина Юрьевна

выводы

1. Супероксид-радикал в митохондриях печени и почек крыс вызывает устойчивое разобщение дыхания, что выражается в снижении величины дыхательного контроля, падении мембранного потенциала и незначительном подавлении окисления сукцината.

2. Аконитаза ( цитрат(изоцитрат)гидролиаза ) в митохондриях почек и печени в равной мере ингибировалась экзогенно добавленными супер оксид-радикалом и пероксидом водорода, что может свидетельствовать об отсутствии защитного эффекта от действия АФК со стороны UCP2.

3. Получены электрофоретически гомогенные препараты СДГ из печени крыс, клубней картофеля и проростков кукурузы. Наиболее активный препарат был выделен из печени крыс. Для него значение удельной активности составило 10.33±0.52 Е/мг белка, выход - 6.14%, степень очистки - 73.80.

4. Обнаружено, что СДГ из всех изученных источников ингибируется пероксидом водорода (К; =0.40±0.06 мМ для митохондрий печени крысы). Подобная регуляция может быть связана с разрушением Fe-S кластеров, входящих в состав фермента.

5. Ингибирующий эффект пероксида водорода на сукцинатдегидрогеназу в равной степени наблюдался, как на изолированных препаратах фермента, так и на интактиых митохондриях, что подтверждает тезис об относительной проницаемости митохондриальной мембраны для пероксида водорода.

6. Не выявлено заметного ресопрягающего действия ADP в присутствии ингибитора ADP/ATP-антипортера (cAtr), ни в норме, ни на фоне разобщающего действия супероксид-радикала, тогда как cAtr снимает разобщающий эффект жирных кислот и супероксид-радикала. Это свидетельствует о ведущей роли ADP/ATP-антипортера в разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования.

7. Глутамат также проявлял ресопрягающий эффект при действии супероксид-радикала на препараты митохондрий почек и печени крыс, что указывает на возможность участия в разобщении и аспартат-глутаматного антипортера.

8. Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и СОХ, указывают на более низкий уровень мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ).

9. Предложена гипотетическая модель участия разобщающих белков-анионных переносчиков внутренней митохондриальной мембраны в защите митохондрий от действия АФК и, в частности, супероксид-радикала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для объяснения противоречия между разобщающей функцией, следующей из гомологии белков семейства UCP, и отсутствием достоверных данных о выявлении соответствующей активности в экспериментах на препаратах митохондрий может быть выдвинуто несколько предположений, не исключающих друг друга, которые частично уже нашли отражение в литературе.

3. Можно предположить, что UCP проявляют свою активность только в определенных, возникающих локально условиях, имеющих место в клетке, но не вносящих заметного вклада в суммарные параметры, измеряемые при изучении препаратов митохондрий in vitro. Таковым фактором могла бы служить активация UCP при высоких локальных потенциалах. Такое локальное повышение потенциала, возможно, незначительный влияет на суммарный уровень мембранного потенциала и скорость дыхания митохондрий, но может давать более заметный вклад в продукцию АФК, которая, как показано, резко повышается с ростом мембранного потенциала (рис.20).

UCP

ATP-ase

ДцН 2 о 00 4

Рис. 20. Модель в виде электрической цепи, аналогичной протонному циклу в мнтохондриальиой мембране, в которой UCP соответствует электрическому элементу — стабилитрону. Стабилитрон способен резко снижать свое сопротивление при превышении определенного порогового значения напряжения. Возможно, что в митохондриях такое превышение потенциала носит локальный и временный характер. Тогда работа UCP не сказывается заметно на суммарном протонном токе и потенциале, но существенно снижает продукцию супероксид-радикала.

Полученные результаты позволяют заключить, что распространенные к настоящему моменту представления об активирующем действии супероксид-радикала на UCPs в отношении UCP2 митохондрий почек крысы не подтверждаются. Ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов в отсутствии ингибиторов ANT не может служить качественным тестом на проявление активности UCPs. Разобщение, наблюдаемое под действием супероксид-радикала в препаратах митохондрий почек крысы, в основном обусловлено функционированием ADP/ATP-антипортера и аспартат/глутаматного переносчика и может быть интерпретировано без привлечения модели М. Бранда с соавторами, базирующейся на усилении под действием супероксид-радикала протонофорной активности UCP2 (рис.

Митохондрии почек* крысы

GDP ©ГА

Рис. 21. Гипотетическая схема участия белков-аниониых переносчиков внутренней мембраны митохондрий почек крыс в разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования в присутствии их субстратов (+) и ингибиторов (-).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кашапова, Ирина Юрьевна, Воронеж

1. Андреев А.Ю. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях/ А.Ю. Андреев, Ю.Е. Кушнарева, А.А. Старков // Биохимия. 2005. - т. 70. - вып. 2. - с. 246-264.

2. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами/ В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Изд-во ВГУ. Воронеж. - 2000. - 294 с.

3. Брустовецкий Н.Н. Кальций-зависимое терморегуляторное разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс/ Н.Н. Брустовецкий// Автореф. диссертации канд. биол. наук. Ташкент. - 1989. -24с.

4. Виноградов А.Д. Генерация супероксид-радикала КАХ)Н:убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца./ А.Д. Виноградов, В.Г. Гривенникова //Биохимия. 2005. - Т. 70. - вып.2. - с. 150-159.

5. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты./ Ю.А. Владимиров// Вестник РАМН. 1998. -т.7. - с. 43-51.

6. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах/ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков // М.: Наука. 1972.

7. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических молекул. / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкин // М.: Мир. 1982. - 283с.

8. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий. Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза./ М.Н. Кондрашова и др. // Новосибирск: Наука. 1997. - с. 40 - 66.

9. Гордеева А.В. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках./ А.В. Гордеева, Р.А. Звягильская, Ю.А. Лабас // Биохимия. 2003. - Т. 68. - вып. 10. - с. 1318-1322.

10. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях./ А.Т. Епринцев, В.Н. Попов // Изд-во ВГУ. Воронеж. - 1999. - 191с.

11. Защитный эффект циклоспорина А, карнитина и Mg2+ с ADP при Са -зависимой пермеабилизации митохондрий жирными кислотами иактивации окисления NADH по внешнему пути./ А.А. Старков и др. // Биохимия. 1993. - т. 58. - вып. 8. - с. 1266-1275.

12. Землянухин А. А. Большой практикум по физиологии растений. / А. А. Землянухин, JI. А. Землянухин // Учеб. Пособие. Воронеж: Издательство ВГУ. - 1996. - 188с.

13. Зоров Д.Б. Действие кратковременного охлаждения на дыхание диафрагмы/ Д.Б. Зоров, Е.Н. Мохова // Биол. науки. 1973. - №7. - с. 4553.

14. Игамбердиев А.У. Уникальная генетическая система митохондрий / А.У. Игамбердиев // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Том.6. -No 1. - с. 32-36.

15. Карбоксиатрактилат препятствует снятию дыхательного контроля пальмитиновой кислотой в митохондриях скелетных мышц/ А.Ю. Андреев и др. // Биол. мембраны. 1987. - Т. 4. - с. 474-478.

16. Кондрашова М. Н. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий / М. Н. Кондрашова, Е. Б. Григоренко, А. М. Бабский // Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. — Новосибирск. 1987. - с. 40-66.

17. Кулинский В. И., Колесниченко JI. С. Успехи современной биологии, 1993, т. 113, вып. 1, с. 107-122.

18. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита/ В.И. Кулинский // СОЖ. 1999. -№1. - с. 2-7.

19. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин // М.: Высш. Шк. 1990. - 351с.

20. Ленинджер А. Основы биохимии./ А. Ленинджер// М.: Мир. 1985. - Т.2.-731 с.

21. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование./ Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук// Москва "Мир". -1984.-443 с.

22. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений/ М.Н. Мерзляк // СОЖ. 1999. - №9. - с. 20-26.

23. Мохова Е.Н. Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях печени и мышц/ Е.Н. Мохова, А.А. Старков, В.А. Бобылева//Биохимия. 1993. - Т.58. - вып. 10. - с.1513-1522.

24. Мохова Е.Н. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот./ Е.Н. Мохова, Л.С. Хайлова // Биохимия. 2005. - Т. 70. - вып. 2. - с. 197-202.

25. Николе Д.Дж. Биоэнергетика: введение в хемиосмотическую теорию./ Д.Дж. Николе//М.: Мир. 1985. - 190 с.

26. Повреждение нагруженных ионами кальция митохондрий жирными кислотами и защитное действие карнитина./ И.И. Дедухова и др. // Биохимия. 1993. - т. 58. - вып. 4. - с. 585-589.

27. Попов В.Н. Роль свободного окисления дыхательных субстратов в защите от активных форм кислорода и метаболизации свободных жирных кислот/ В.Н. Попов // Дисс. на соискание ст. докт. биол. наук. Воронеж. -2003.

28. Практикум по биохимии / под ред. Н. П. Мешковой и ак. С. Е. Северина. -Изд. МГУ. 1979.-428с.

29. Регуляция тиреоидными гормонами и ионами Са2+ транспорта ионов и неспецифического транспорта через внутреннюю мембрану митохондрий на уровне циклоспоринчувствительной поры/ В. В. Конов и др. // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9. - №6. - с. 602-610.

30. Роль АДФ/АТФ и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем эффекте жирных кислот, лаурилсульфата и 2,4-динитрофенола в митохондрии печени/ В.Н. Самарцев и др. // Биохимия. 1999. - Т.64. -вып.8. - с. 1073-1084.

31. Самарцев В.Н. Участие аспартат/ глутаматного антипортера в разобщающем эффекте жирных кислот в митохондриях сердца/ В.Н. Самарцев, И.П. Зелди, Е.Н. Мохова// Биохимия. 1998. - Т.63. - вып.5. - с. 573-578.

32. Самарцев В.Н. Действие цистеинсульфоната на разобщение жирными кислотами: модуляция ресопряжения субстратами аспартат/глутаматного антипортера и диэтилпирокарбонатом/ В.Н. Самарцев, Е.Н. Мохова // Биохимия. 1997. - Т.62. - вып.5. - с. 581-587.

33. Свободные радикалы в живых системах/ Ю.А. Владимиров и др. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т. 29. - с. 67-71.

34. Семенова Е.В. Очистка и физико-химические свойства аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс/ Е.В. Семенова // Дисс. на соискание ст. канд. биол. наук. Воронеж. - 2001.

35. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран./ В.П. Скулачев// М.: Наука. 1989.-564 с.

36. Скулачев В. П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода/ В.П. Скулачев// Молекулярная биология. 1995. - т.29. - вып.6. - с.1199-1207.

37. Скулачев В. П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки / В.П. Скулачев // Биохимия. 1994. -т. 59, №12. - с. 1910-1912.

38. Скулачев В. П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода/ В.П. Скулачев // Молекулярная биология. 1995. - т.29. - вып.6. - с.1199-1207.

39. Скулачев В. П. Кислород в живой клетке: добро и зло/ В. П. Скулачев// Соросовский образовательный журнал. 1996. - №3. - с. 4-10.

40. Скулачев В. П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода/ В. П. Скулачев // СОЖ. -2001.-Т. 7.-№6.-с. 4-10.

41. Скулачев В.П. Роль нефосфорилирующего окисления в терморегуляции/ В.П. Скулачев, С.П. Маслов // Биохимия. 1960. - Т.25. - вып. 12. - с. 10581063.

42. Справочник биохимика./ Р. Досон и др. //М.: Мир. 1991. - 543 с.

43. Теппермен Д. Физиология обмена веществ и эндокринной системы/ Д. Теппермен, X. Теппермен // Москва "Мир". 1989.

44. Участие ATP/ADP-антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени./ М.Э. Бодрова и др. // Биохимия. 1995. - Т. 60. -вып. 8.-с. 1349-1357.

45. Activating go-6 polyunsaturated fatty acids and inhibitory purine nucleotides are high affinity ligands for novel mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3./ M. Zackova et al. // The J. of Biol. Chem. 2003. - vol. 278. -No. 23. - pp. 20761-20769.

46. Avian UCP: the killjoy in the evolution of the mitochondrial uncoupling proteins./ Y. Emre et al. // J Mol Evol. 2007. - vol. 65(4). - pp. 392-402.

47. A role for uncoupling protein-2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generation/ A. Negre-Salvayre et al. // FASEB J. 1997. - vol. 11.-pp. 809-815.

48. A signalling role for 4-hydroxy-2-nonenal in regulation of mitochondrial uncoupling/ K.S. Echtay et al. // EMBO J. 2003. - vol. 22(16). - pp. 410310.

49. An ancient look at UCP1./ M. Klingenspor et al. // Biochimica et Biophysica Acta.-2008.-vol. 1777.-pp. 637-641.

50. Brown G.C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells/ G.C. Brown// Biochem.J. 1992. - vol. 284. - №1. -pp.1-3.

51. Bartsch H. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair./ H. Bartsch, J. Nair // Langenbecks Arch Surg. 2006. - 391(5). - pp. 499-510.

52. Boveris A. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen./ A. Boveris, B. Chance // Biochem J. 1973.- 134(3).-pp. 707-16.

53. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation./ R.T. Dean et al. //Biochem. J. 1997. - vol. 324. - № 1. - pp. Ы8.

54. Brown-Adipose-Tissue mitochondria : photoaffinity labeling of the regulatory site of energy dissipation./ C.M. Heaton et al. // Eur. J. Biocliem. 1978. -vol.82.-pp. 515-521.

55. Bienengraeber M. Kf -transport by uncoupling protein UCP1 is depend on a histidine pair, absent in UCP2 and UCP3/ M. Bienengraeber, K.S. Echtay, M. Klingenberg // Biochemistry. 1998. - vol. 37. - No.l. - pp. 3-8.

56. BMCP1, a novel mitochondrial carrier with high expression in the central nervous system of humans and rodents, and respiration uncoupling activity in recombinant yeast./ D. Sanchis et al. // J Biol Chem. 1998. - vol. 273(51). -pp. 34611-5.

57. Borecky J. Plant uncoupling mitochondrial protein and alternative oxidase: energy metabolism and stress./ J. Borecky, A.E. Vercesi // Biosci Rep. 2005. -vol. 25(3-4).-pp. 271-86.

58. Control of calcium signal propagation to the mitochondria by inositol 1,4,5-trisphosphate-binding proteins/ X. Lin et al. // The J. of Biol. Chem. 2005. -vol. 280. - №13. - pp. 12820-12832.

59. Chance B. The respiratory chain and oxidative phosphorylation/ B. Chance, G.R. Williams//Adv. Enzymol. 1956. - vol. 17. - pp. 65-134.

60. Carboxyatractylate- and cyclosporin A- sensitive uncoupling in liver mitochondria of ground squirrel during hibernation and arousal./ Z.G. Amerkhanov et al. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. - vol.38. - N.5. - pp. 863-870.

61. Czarna M. Role of mitochondria in reactive oxygen species generation and removal; relevance to signaling and programmed cell death/ M. Czarna, W. Jarmuszkiewicz // Postepy Biochem. 2006. - 52(2). - pp. 145-156.

62. Cao L. Aging alters the functional expression of enzymatic and non-enzymatic anti-oxidant defense systems in testicular rat Leydig cells./ L. Cao, S. Leers-Sucheta, S. Azhar // J Steroid Biochem Mol Biol. 2004. - 88(1). - pp. 61-67.

63. Cysteine labeling studies of beef heart aconitase containing a 4Fe, a cubane 3Fe, or a linear 3Fe cluster./ D.W. Plank et al. // J Biol Chem. 1989. -264(34).-pp. 20385-93.

64. Cloning and structural characterization of porcine heart aconitase./ L. Zheng et al. // J Biol Chem. 1990. - 265(5). - pp. 2814-21.

65. Characterization of the Fe-S cluster in aconitase using low temperature magnetic circular dichroism spectroscopy./ M.K. Johnson et al. // J Biol Chem. 1984. - 259(4). - pp. 2274-82.

66. Cooper С. E. The mechanism of potassium movement across the liposomal membrane./ C.E. Cooper, J.M. Wriggles worth, P. Nichols // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. - vol. 173. - No. 3. - pp. 1008-1012.

67. Complete amino acid sequence of the ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria/ H. Aquila et al. // Hoppe-Seylers Ztschr. Physiol. Chem.- 1982. vol. 363. - pp. 345-349.

68. Characterization of novel UCP5/BMCP1 isoforms and differential regulation of UCP4 and UCP5 expression through dietary or temperature manipulation./ X.X. Yu et al. // FASEB J. 2000. - vol. 14(11). - pp. 1611-8.

69. Cooper T. G. Mitochondria and glyoxysomes from castor bean endosperm / T. G. Cooper, H. Beever // J. Biol. Chem. 1969. - vol. 244. - №13. - pp. 411427.

70. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction /Р. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - vol. 162. - pp. 156-159.

71. Compartment-specific protection of iron-sulfur proteins by superoxide dismutase./ F. Missirlis et al. // J. of Biol. Chem. 2003. - vol. 278. - №48. -pp. 47365-47369.

72. Disruption of the uncoupling protein-2 gene in mice reveals a role in immunity and reactive oxygen species production/ D. Arsenijevic et al. // Nat Genet. -2000. vol. 26(4). - pp. 435-9.

73. Esteves T.C. The reactions catalysed by the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3./ T.C. Esteves, M.D. Brand// Biochim Biophys Acta. 2005.- 1709(1).-pp. 35-44.

74. Echtay K.S. Mitochondrial uncoupling proteins—what is their physiological role?/ K.S. Echtay// Free Radic Biol Med. 2007. - 43(10). -pp. 1351-1371.

75. Effect of combined cytostatic cyclosporin A and cytolytic suicide gene therapy on the prevention of experimental graft-versus-host disease./ S. Maury et al. // Gene Ther. 2002. - vol. 9(3). - pp. 201-207.

76. Electron paramagnetic resonance studies of mammalian succinate dehydrogenase. Detection of the tetranuclear cluster S2./ J.J. Maguire et al. // J Biol Chem. 1985.-vol. 260(20).-pp. 10909-12.

77. EPR characterization of an archaeal succinate dehydrogenase in the membrane-bound state./ S. Anemuller et al. // Eur J Biochem. 1995. - vol. 232(2). -pp. 563-8.

78. Energization-dependent endogenous activation of proton conductance in skeletal muscle mitochondria./ N. Parker et al. // Biochem J. 2008. - vol. 412(1).-pp. 131-9.

79. Erdahl W. L. A comparison of phospholid degradation by oxidation and hydrolysis during the mitochondrial permeability transition./ W.L. Erdahl, R.J. Krebsbach, D.R. Pfeiffer // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - vol. 285. - No. 2. - pp. 252-260.

80. Effect of carboxyatractylate on transmembrane electrical potencial of plant mitochondria in different metabolic states / F. Macri et al. // Biochem Mol Biol Int. 1994. - vol. 34. - pp. 217-224.

81. Esteves T.C. The reactions catalysed by the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3/ T.C. Esteves, M.D. Brand // Biochim Biophys Acta. 2005. -vol. 1709(1).-pp. 35-44.

82. Evidence for Anion-translocating Plant Uncoupling Mitochondrial Protein in potato mitochondria /Р. Jezek et al. // J Biol Chem. 1996. - vol. 271. - pp. 32743-32748.

83. Energy metabolism in uncoupling protein-3 gene knockout mice/ A.J. Vidal-Puig et al. //J. Biol. Chem. 2000. - vol. 275. - pp. 16258-16266.

84. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer./ M. Valko et al. // Chem Biol Interact. 2006. - 160(1). - pp. 1-40.

85. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease./ M. Valko et al. // Int J Biochem Cell Biol. 2007. 39(l):44-84.

86. Foster D.O. Quantitative contribution of brown adipose tissue thermogenesis to overall metabolism/ D.O. Foster // Canad. J. Biochem. Cell. 1984. - vol. 62. -pp.618-622.

87. Flatmark T. Brown adipose tissue mitochondria/ T. Flatmark, J. Pedersen // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - vol.416. - pp. 53-103.

88. Forman H.J. Redox signaling in macrophages/ H.J. Forman, M. Torres // Mol. Aspects Med. 2001. - vol. 22. - pp. 189-216.

89. Goetz M.E. Reactive species: a cell damaging rout assisting to chemical carcinogens./ M.E. Goetz, A. Luch // Cancer Lett. 2008. - 266(1). - pp. 7383.

90. Gutterman D. D. Mitochondria and reactive oxygen species. An evolution in function/ D.D. Gutterman // Circ. Res. 2005. - vol. 97. - pp. 302-304.

91. Gutknect J. Proton/hydroxide conductance through phospholipid bilayer membranes: effects of phytanic acid./ J. Gutknect // Biochim. Biophys. Acta. -1987. vol. 898. - No. 2. - pp. 97-108.

92. Graue C. Studies of the ADP/ATP carrier of mitochondria with fluorescent ADP analogue formycin diphosphate./ C. Graue, M. Klingenberg // Biochim Biophys Acta. 1979. - vol. 546(3). - pp. 539-50.

93. Garlid K.D. Mechanism of uncoupling protein action/ K.D. Garlid, M. Jaburek, P. Jezek // Biochem. Soc. Trans. 2001. - vol. 29. - Pt.6. - pp. 803806.

94. Goglia F. A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet/ F. Goglia, V.P. Skulachev // FASEB J. 2003. - vol. 17. - pp. 1585-1591.

95. Gardner P.R. Aconitase: sensitive target and measure of superoxide./ P.R. Gardner // Methods Enzymol. 2002. - vol. 349. - pp. 9-23.

96. Gardner P.R. Inactivation-reactivation of aconitase in Escherichia coli. A sensitive measure of superoxide radical/ P.R. Gardner, I. Fridovich // J Biol Chem. 1992.-vol. 267. - №13. - pp. 8757-63.

97. Gardner P.R. Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase./ P.R. Gardner, I. Fridovich // J Biol Chem. 1991. - vol. 266. - №29. - pp. 1932833.

98. Glutathione depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis./ A. Macho // J Immunol. 1997. - vol. 158. - №10. - pp. 4612-9.

99. Graier W.F. Mitochondrial Ca , the secret behind the function of uncoupling proteins 2 and 3?/ W.F. Graier, M. Trenker, R. Malli // Cell Calcium. 2008. -vol. 44.-pp. 36—50.

100. Hanstein W.G. Uncoupling of oxidative phosphorylation/ W.G. Hanstein // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - vol.456. - No.2. - pp. 129-148.

101. Huang S.G. Chlorid channel properties of the uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria: a patch-clamp study/ S.G. Huang, M. Klingenberg //Biochemistry. 1996. - vol. 35. -No.51. - pp. 16806-16814.

102. Homologues of the uncoupling protein from brown adipose tissue (UCP1): UCP2, UCP3, BMCP1 and UCP4./ F. Bouillaud et al. // Biochim Biophys Acta.-2001.-vol. 1504(1).-pp. 107-19.

103. Ishii N. Role of oxidative stress from mitochondria on aging and cancer./ N. Ishii // Cornea. 2007. - vol.9. - Suppl 1. - pp. 3-9.

104. Ishii N. The role of the electron transport SDHC gene on lifespan and cancer./ N. Ishii, T. Ishii, P.S. Hartman // Mitochondrion. 2007. - 7(1-2). - pp. 24-28.

105. Iron-generated hydroxyl radicals kill retinal cells in vivo: effect of ferulic acid./ H. Chao et al. // Hum Exp Toxicol. 2008. - 27(4). - pp. 327-339.

106. Involvement of aspartate/glutamate antiporter in fatty acid-induced uncoupling of liver mitochondria./ V.N. Samartsev et al. // Biochim Biophys Acta. -1997.-vol. 1319(2-3).-pp. 251-7.

107. Induction of UCP2 mRNA by thyroid hormones in rat heart/ A. Lanni et al. // FEBSLett. 1997.-vol. 418(1-2).-pp. 171-4.

108. Inactivation of aconitase and oxoglutarate dehydrogenase in skeletal muscle in vitro by superoxide anions and/or nitric oxide./ U. Andersson et al. // Biochem Biophys Res Commun. 1998. - vol. 249. - №2. - pp. 512-6.

109. Jeonq S.Y. The role of mitochondria in apoptosis/ S.Y. Jeonq, D.W. Seol// BMB Rep. 2008. - 41(1). - pp. 11-22.

110. Jezek P. Mammalian mitochondrial uncoupling proteins/ P. Jezek, K.D. Garlid //Biochim. Biophys. Acta. 1998. - vol. 1356. -No.1-2. pp. 311-319.

111. Jezek P. Inactive fatty acids are unable to flip-flop across the lipid bilayer/ P. Jezek, M. Modriansky, K.D. Garlid // FEBS Lett. 1997. - vol. 408. - No. 2. -pp. 161-165.

112. Jaburek M. Reconstitution of recombinant uncoupling proteins: UCP1, -2, and -3 have similar affinities for ATP and are unaffected by coenzyme Q10/ M. Jaburek, K.D. Garlid // J Biol Chem. 2003. - vol. 278(28). - pp. 25825-31.

113. Klaunig J.E. The role of oxidative stress in carcinogenesis./ J.E. Klaunig, L.M. Kamendulis // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004. - vol. 44. - pp. 239-67.

114. Kowaltowski A.J. Activation of potato plant uncoupling mitochondrial protein inhibits reactive oxygen species generation by the respiratory chain/ A.J. Kowaltowski, A.D.T. Costa, A.E. Versesi // FEBS Lett. 1998. - vol. 425. -pp. 213-216.

115. Klingenberg M. The ATP, ADP shuttle of the mitochondrion/ M. Klingenberg // Trends Biochem. Sci. 1979. - vol.4. - pp. 249-252.

116. Klingenberg M. Structure and function of the uncoupling protein from brown adipose tissue/ M. Klingenberg, S.G. Huang // Biochem. Biophys. Acta. -1999.-vol.1415.-pp. 108-112.

117. Klingenberg M. Dialectis in carrier reseach: the ADP/ATP carier and the uncoupling protein/ M. Klingenberg // J. Bioenerg. Biomembr. 1993. - vol.25. -No.5.-pp. 447-457.

118. Klingenberg M. The reconstituted isolated uncoupling protein is a membrane potential driven H+ translocator./ M. Klingenberg, E. Winkler // EMBO J. -1985. vol. 4. - No. 12. - pp. 3087-3092.

119. Klingenberg M. Reconstitution of an H+ translocator, the 'uncoupling protein' from brown adipose tissue in phospholipid vesicles/ M. Klingenberg, E. Winkler // Methods enzymol. 1986. - vol. 127. - pp. 772-779.

120. Kowaltowski A. J. Activation of the potato plant uncoupling mitochondrial protein inhibits reactive oxygen species generation by the respiratory chain / A.J. Kowaltowski, A.D.T. Costa, A.E. Vercesi // FEBS Lett. 1998. - vol. 425. -pp. 213-216.

121. Kupffer cells are a dominant site of uncoupling protein 2 expression in rat liver/ D. Larrouy et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - vol. 235. - pp. 760-764.

122. Klingenberg M. Uncoupling protein a usefull energy dissipater/ M. Klingenberg // J. Bioenerg. Biomembr. - 1999. - vol. 31.- No.5. - pp. 419-430.

123. Korshunov S.S. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria/ S.S. Korshunov, V.P. Skulachev, A.A. Starkov //FEBS Lett. 1997. - vol. 416(1). - pp. 15-8.

124. Khailova L.S., Prikhodko E.A., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Popov V.N., Skulachev V.P. / L.S. Khailova et al. // Biochim Biophys Acta. 2006. - vol. 1757.-pp. 1324-29.

125. Kruman LI. Pivotal role of mitochondrial calcium uptake in neural cell apoptosis and necrosis./ I.I. Kruman, M.P. Mattson // J Neurochem. 1999. -vol. 72. - №2.-pp. 529-40.

126. Loschen G. Respiratory chain linked H202 production in pigeon heart mitochondria./ G. Loschen, L. Flohe, B. Chance // FEBS Lett. 1971. - 18(2). -pp. 261-264.

127. Lin C.S. Isolation of the uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria/ C.S. Lin, E.M. Klingenberg // FEBS Lett. 1980. - vol.113. -No.2. -pp. 299-303.

128. Lack of obesity and normal response to fasting and thyroid hormone in mice lacking uncoupling protein-З/ D.W. Gong et al. // J Biol Chem. 2000. - vol. 275.-№21.-pp. 16251-7.

129. Mitchell P.A. chemiosmotic hypotesis for the mechanism of oxidative and photosynthetic phosphorylation/ P.A. Mitchell// Nature. 1961. - vol.191. - № 144.-pp. 5-15.

130. Moreno-Sanches R. Regulation of oxidative phosphorylation in mitochondria by external free Ca2+ concentration/ R. Moreno-Sanches// J. Biol. Chem. -1985. vol. 260. - №7. - pp. 4028-4034.

131. Moller I.M. A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases / I.M. Moller // Trends Plant Sci. 2002. - vol. 7. - pp. 235-237.

132. Muller F.L. Complex III releases superoxide to both sides of the inner mitochondrial membrane./ F.L. Muller, Y. Liu, H. Van Remmen // J Biol Chem. 2004. - 279(47). - pp. 49064-73.

133. Mitochondrial DNA mutations as an important contributor to ageing and degenerative disease./ A.W. Linnane et al. // Lancet. 1989. - pp. 642-645.

134. Magnetic circular clicoism studies of succinate dehydrogenase evidence for (2Fe-2S), (3Fe-3S) and (4Fe-4S) in reconstitovely active enzyme / M.K. Johnson et al. //J.Biol.Chem. 1985. Vol.260. № 12. Pp.7368-7378.

135. Mitochondrial superoxide and aging: uncoupling-protein activity and superoxide production./ M.D. Brand et al. // Biochem Soc Symp. 2004. -vol. 71.-pp. 203-13.

136. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins./ M.D. Brand et al. // Free Radic Biol Med. 2004. - vol. 37(6).-pp. 755-67.

137. Molecular approach to thermogenesis in brown adipose tissue/ D. Ricquier et al. // J. Biol. Chem. 1983. - vol. 258. - pp. 6675-6677.

138. Mice overexpressing human uncoupling protein-3 in skeletal muscle are hyperphagic and lean/ J.C. Clapham et al. // Nature. 2000. - vol. 406(6794). -pp. 415-8.

139. Myeloperoxidase-mediated damage to the succinate oxidase system of Escherichia coli. Evidence for selective inactivation of the dehydrogenase component./ H. Rosen et al. // J Biol Chem. 1987. - vol. 262. - №31. - pp. 15004-10.

140. Mitochondrial respiration scavenges extramitochondrial superoxide anion via a nonenzymatic mechanism./ D.M. Guidot et al. // J Clin Invest. 1995. - vol. 96. - №2.-pp. 1131-6.

141. Nicholls D.G. The regulatory of extramitochondrial free calcium ion concentrations by rat liver mitochondria/ D.G. Nicholls// Biochem. J. 1978. -vol. 170. -№3. - pp. 463-474.

142. Nicholls D.G. Bioenergetics 3./ D.G. Nicholls, S.J. Ferguson// Amsterdam.: Academic press. 2002. - 285 p.

143. Nair U. Lipid peroxidati on-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: a review of published adduct types and levels in humans./ U. Nair, H. Bartsch, J. Nair // Free Radic Biol Med. 2007. - 43(8). -pp. 1109-20.

144. Noctor G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control/ G. Noctor, C. Foyer// Annu. Rev. Plant Physiol. 1998. - vol.49. - pp. 249-279.

145. Nedergaard J. The 'novel' 'uncoupling' proteins UCP2 and UCP3: what do they really do? Pros and cons for suggested functions./ J. Nedergaard, B. Cannon // Exp. Physiol. 2003. - vol. 88. - №1. - pp. 65-84.

146. Nicholls D.G. Thermogenic mechanism in brown fat/ D.G. Nicholls, R.M. Locke // Physiol. Rev. 1984. - vol.64. - pp. 1-64.

147. Nicholls D.G. Brown adipose tissue mitochondria/ D.G Nicholls, O. Lindberg // Eur. J. Biochem. 1973. - vol.37. - pp.523-530.

148. Nicholls D.G., Locke R.M. Heat generation by mitochondria./ D.G. Nicholls, R.M. Locke // In: Chemiosmotic proton circuits in biological membranes. L.: Addison- Wesley. 1981. - pp. 567-576.

149. Nedergaard J. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans./ J. Nedergaard, T. Bengtsson, B. Cannon // Am J Physiol Endocrinol Metab. -2007. vol. 293(2). - pp. 444-52.

150. No evidence for a basal, retinoic, or superoxide-induced uncoupling activity of the uncoupling protein 2 present in spleen or lung mitochondria/ E. Couplan et al. // J Biol Chem. 2002. - vol. 277(29). - pp. 26268-75.

151. Oxidative damage in chemical teratogenesis./ P.G. Wells et al. // Mutat Res. -1997.-396(1-2).-pp. 65-78.

152. Oztiirk O. Age-related changes of antioxidant enzyme activities, glutathione status and lipid peroxidation in rat erythrocytes after heat stress./ O. Oztiirk, S. Gumii§lii // Life Sci. 2004. - 75(13). - pp. 1551-65.

153. Only UCP1 can mediate adaptive nonshivering thermogenesis in the cold./ V. Golozoubova et al. //FASEB J. 2001. -vol. 15(11). -pp. 2048-50.

154. On the mechanism of fatty acid-induced proton transport by mitochondrial uncoupling protein/ K.D. Garlid et al. // J. Biol. Chem. 1996. - vol. 271. -No.5.-pp. 2615-2620.

155. Oxidant, mitochondria and calcium: an overview./ T. Chakraborti et al. // Cell Signal. 1999.-vol. 11. - №2.-pp. 77-85.

156. Pedersen P. L. Mitochondrial adenosinetriphosphotase/ P.L. Pedersen// J. Bioenerg. 1975. - vol. 6. - №6. - pp. 243-275.

157. Proton pumping by cytochrome oxidase as studied by time-resolved stopped-flow spectrophotometry/ G. Antonini et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. -vol. 90. - №13. - pp. 5949-5953.

158. Pressman B.C. Effect of surface-active agents on the ATP-ase of mitochondria/ B.C. Pressman, H.A. Lardy // Biochem.Biophis.Acta. 1956. - vol .21. - №3. -pp. 458-466.

159. Palmieri F. Mitochondrial carrier proteins / F. Palmieri // FEBS Lett. 1995. -vol. 346.-pp. 48-54.

160. Plant uncoupling mitochondrial proteins./ A.E. Vercesi et al. // Annu Rev Plant Biol. 2006. - vol. 57. - pp. 383-404.

161. Possible basic and specific functions of plant uncoupling proteins (pUCP). / P. Jezek et al. // Biosci Rep. 2001. - vol. 21(2). - pp. 237-45.

162. Potential involvement of mammalian and avian uncoupling proteins in the thermogenic effect of thyroid hormones./ A. Collin et al. // Domest Anim Endocrinol. 2005. - vol. 29(1). - pp. 78-87.

163. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - vol. 193. - №1. - pp. 265-275.

164. Powell C.S. Mitochondrial complex I, aconitase, and succinate dehydrogenase during hypoxia-reoxygenation: modulation of enzyme activities by MnSOD./ C.S. Powell, R.M. Jackson // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003. -vol. 285. -№l.-pp. 189-98.

165. PLA(2) dependence of diaphragm mitochondrial formation of reactive oxygen species./ D. Nethery et al. // J Appl Physiol. 2000. - vol. 89(1). - pp. 72-80.

166. Permeability of bilayer lipid membranes for superoxide (02-.) radicals./ R.A. Gus'kova et al. // Biochim Biophys Acta. 1984. - vol. 778(3). - pp. 579-85.

167. Queiroz M.S. Effect of thyroid hormone on uncoupling protein-3 mRNA expression in rat heart and skeletal muscle/ M.S. Queiroz, Y. Shao, F. Ismail-Beigi // Thyroid. 2004. - vol. 14(3). - pp. 177-85.

168. Regulation of thermogenesis in flowering Araceae: the role of the alternative oxidase./ A. M. Wagner et al. // Biochim Biophys Acta. 2008. - 1777(7-8). -pp. 993-1000.

169. Rasheed Z. Hydroxyl radical damaged Immunoglobulin G in patients with rheumatoid arthritis: biochemical and immunological studies./ Z. Rasheed // Clin Biochem. 2008. - 41(9). - pp. 663-669.

170. Rasheed Z. Reactive oxygen species damaged human serum albumin in patients with type 1 diabetes mellitus: biochemical and immunological studies./ Z. Rasheed, R. Ali // Life Sci. 2006. - 79(24). - pp. 2320-8.

171. Rasheed Z. Reactive oxygen species damaged human serum albumin in patients with hepatocellular carcinoma./ Z. Rasheed et al. // J Exp Clin Cancer Res. 2007. - 26(3). - pp. 395-404.

172. Reactive oxygen species inhibit the succinate oxidation-supported generation of membrane potential in wheat mitochondria/ D. Pastore et al. // FEBS Lett. -2002. vol. 516. - pp. 15-19.

173. Resonance Raman studies of beef heart aconitase and a bacterial hydrogenase./ M.K. Johnson et al. // J Biol Chem. 1983.-vol. 258(21).-pp. 12771-4.

174. Rapid inactivation of plant aconitase by hydrogen peroxide / F. Verniquet et al. // Biochem.J. 1991. - vol.276. - pp. 643-648.

175. Reactive oxygen species induce swelling and cytochrome с release, but not transmembrane depolarization in isolated rat brain mitochondria/ M.F. Galindo et al. // British Journal of Pharmacology. 2003. - vol. 139. - pp. 797-804.1. О A

176. Rial E. Brown adipose tissue mitochondria: the regulation of the 32000-Mr uncoupling protein by fatty acids and purine nucleotides/ E. Rial, A. Poustie, D.G. Nicholls //Eur. J. Biochem. 1983. - vol. 137. - pp. 197-203.

177. Regulation of UCP-3 by nucleotides is different from regulation of UCP-1/ K.S. Echtay et al. // FEBS Lett. 1999. - vol. 443. - pp. 326-330.

178. Rapid inactivation of plant aconitase by hydrogen peroxide./ F. Vemiquet et al. // Biochem J. 1991. - vol. 276. - № 3. - pp. 643-8.

179. Ricquier D. Mitochondrial uncoupling proteins: from mitochondria to the regulation of energy balance./ D. Ricquier, F. Bouillaud // Journal of Physiology. 2000. - vol. 529. - №1. - pp. 3—10.

180. Subcellular distribution of rat liver porin/ M. Linden et al. // Biochem. et Biophys. acta. 1984. - vol. 770. - pp. 93 - 96.

181. Somlyo A. P. Cellular site of calcium regulation/ A.P. Somlyo// Nature. 1984. -vol. 309. -№5968. - pp. 516-517.

182. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants / V.P. Skulachev // Quarterly Reviews of Biophysics. 1996. - vol. 29. - pp. 169-202.

183. Superoxide activates mitochondrial uncoupling protein 2 from the matrix side. Studies using targeted antioxidants./ K.S. Echtay et al. // J Biol Chem. 2002. -vol. 49.-pp. 47129-35.

184. Superoxide activates mitochondrial uncoupling proteins./ K.S. Echtay et al. // Nature. 2002. - 415(6867). - pp. 96-99.

185. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics/ V.P. Skulachev // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - vol.1363. -pp.100-124.

186. Schonfeld F. Long-chain fatty acids act as protonophoric uncouplers of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria./ F. Schonfeld, L. Schild, W. Kunz// Biochim. Biophis. Acta. 1989. - vol.977. - pp. 266-272.

187. Shimosawa T. Increasing oxidative stress in aging/ T. Shimosawa // Nippon Rinsho. 2005. - 63(6). - pp. 994-999.

188. Storz P. Reactive oxygen species in tumor progression./ P. Storz// Front Biosci. -2005.-vol.10.-pp. 1881-96.

189. Schonfeld F. Organization and regulation of fatty acid oxidation in mitochondria of brown adipose tissue/ F. Schonfeld // Can .J. Biochem. Physiol. 1956. - vol.34. - pp.1227-1232.

190. Shonfeld P. Does the function of adenine nucleotide translocase in fatty acid uncoupling depend on the type of mitochondria?/ P. Shonfeld // FEBS Lett. -1990. vol. 264. - No. 2. - pp. 246-248.

191. Schonfeld P. Does the role of ADP/ATP- antiporter in the uncoupling effect of fatty acids depend on the mitochondria type? / P. Schonfeld // FEBS Lett. -1992. vol. 303. - pp. 190-192.

192. Smith R.E. Brown fat and thermogenesis/ R.E. Smith, B.A. Horwits // Ibid. -1969.-vol. 49.-pp. 330-425.

193. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation/ V.P. Skulachev // FEBS Lett. 1991. - vol. 294. -No.3. - pp. 158-62.

194. Superoxide activates uncoupling proteins by generating carbon-centered radicals and initiating lipid peroxidation/ M.P. Murphy et al. // The J. of Biol. Chem. 2003. - vol. 278. - No. 49. - pp. 48534-48545.

195. Saleh M.C. Uncoupling protein-2: evidence for its function as a metabolic regulator/ M.C. Saleh, M.B. Wheeler, C.B. Chan // Diabetologia. 2002. -vol. 45.-pp. 174-187.

196. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells./ P.R. Gardner et al. // J. of Biol. Chem. 1995. - vol. 270. - №22. - p. 1339913405.

197. Singer T.P. Determination of the activity of succinate, NADH, choline, and a-glycerophosphate dehydrogenases./ T.P. Singer // Methods Biochem Anal. -1974.-vol. 22.-pp. 158-161.

198. Sources of reactive oxygen species production in excitotoxin- stimulated cerebellar granule cells./ A.A. Boldyrev et al. // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - vol. 256. - №2. - pp. 320-324.

199. The molecular and biochemical basis of nonshivering thermogenesis in an African endemic mammal, Elephantulus myurus./ N. Mzilikazi et al. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007. - 293(5). - pp. 2120-2127.

200. The ATP/ADP antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acid of mitochondria./ A.Yu. Andreyev et al. // Eur. J. Biochem. 1989. - pp. 585592.

201. Toxicity and roles of reactive oxygen species./ H. Kimura et al. // Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005. - 4(4). - pp. 489-95.

202. The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology./ M.L. Genova et al. // Ann N Y Acad Sci. 2004. - vol.1011. -pp. 86-100.

203. Tripathi R. Free radical induced damages to rat liver subcellular organelles: inhibition by Andrographis paniculata extract./ R. Tripathi, J.P. Kamat // Indian J Exp Biol. 2007. - 45(11). - pp. 959-67.

204. The role of mild uncoupled and non-coupled respiration in the regulation of hydrogen peroxide generation by plant mitochondria/ V. Casolo et al. // FEBS Lett. 2000. - vol. 474. - pp. 53-57.

205. The effect of oxidative phosphorylation disconnectors on bimolecular phospholipid membranes./ E.A. Liberman et al. // Biofizika. 1968. - vol. 13(1).-pp. 188-193.

206. Tsofma L.M. Effect of palmitic and lauric acids on the phospholipid bilayer membrane conductivity./ L.M. Tsofina, E.N. Mokhova // Biosci Rep. 1998. -vol. 18(2).-pp. 91-95.

207. Thermogenetic mitochondria/ O. Lindberg et al. // J. Cell. Biol. 1967. -vol.34, - pp. 293-310.

208. Tissue-specific transcription pattern of the adenine nucleotide translocase isoforms in humans./ A. Doerner et al. // FEBS Lett. 1997. - vol.414(2). -pp. 258-262.

209. Transcription of the adenine nucleotide translocase isoforms in various types of tissues in the rat./ A. Doerner et al. // Biochim Biophys Acta. 1999. -vol.1417(1). — pp. 16-24.

210. The Biology of Mitochondrial Uncoupling Proteins./ S. Rousset et al. // Diabetes. 2004. - vol. 53 - No. 1. - pp. 130-135.

211. Transport of anions and ptotons by the mitochondrial uncoupling proteins and its regulation by nucleotides and fatty acids. A new look at old hypothesis/ P. Jezek et al. // J. Biol. Chem. 1994. - vol.269. - No.42. - pp. 26184-26190.

212. Transport function and regulation of mitochondrial uncoupling protein-2 and 3/ M. Jaburek et al. // J. Biol. Chem. 1999. - vol. 274. - No.37. - pp. 2600326007.

213. The plant uncoupling protein homologues: a new family of energy-dissipating proteins in plant mitochondria./ C. Hourton-Cabassa et al. // Plant Physiol Biochem. 2004. - vol. 42(4). - pp. 283-90.

214. Thermoregulation: what role for UCPs in mammals and birds?/ J. Mozo et al. // Biosci Rep. 2005. - vol. 25(3-4). - pp. 227-49.

215. The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death./ S. Tan et al. // J Cell Biol. 1998. - vol. 141. - №6. - pp. 1423-32.

216. The role of reactive oxygen species in mitochondrial permeability transition./ A.E. Vercesi et al. // Biosci Rep. 1997. - vol. 17. - №1. - pp. 43-52.

217. Takahashi M.A. Superoxide anion permeability of phospholipid membranes and chloroplast thylakoids./ M.A. Takahashi, K. Asada // Arch Biochem Biophys. 1983. - vol. 226. - №2. - pp. 558-66.

218. UCP1: the original uncoupling protein—and perhaps the only one? New perspectives on UCP1, UCP2, and UCP3 in the light of the bioenergetics of the UCP1 -ablated mice./ J. Nedergaard et al. // J Bioenerg Biomembr. 1999. -31(5).-pp. 475-491.

219. Uncoupling proteins: a role in protection against reactive oxygen species—or not?/ B. Cannon et al. // Biochim Biophys Acta. 2006. - 1757(5-6). - pp. 449-458.

220. UCP1: the only protein able to mediate adaptive non-shivering thermogenesis and metabolic inefficiency./ J. Nedergaard et al. // Biochim Biophys Acta. -2001. 1504(1).-pp. 82-106.

221. Uncoupling effect of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles/ V.I. Dedukhova et al. // FEBS Lett. 1991. - vol. 295.-No.l-3.-pp. 51-54.

222. Uncoupling protein-2: a novel gene linked to obesity and hyperinsulinemia/ C. Fleury et al. //Nat. Genet. 1997. - vol. 15. - No.3. - pp. 269-272.

223. Uncoupling protein 2 in the brain: distribution and function./ D. Richard et al. // Biochem Soc Trans. 2001. - vol. 29(Pt 6). - pp. 812-7.

224. UCP3: an uncoupling protein homologue expressed preferentially and abundantly in skeletal muscle and brown adipose tissue./ A. Vidal-Puig et al. // Biochem Biophys Res Commun. 1997. - vol. 235(1). - pp. 79-82. '

225. Uncoupling protein-3: a new member of the mitochondrial carrier family with tissue-specific expression./ O. Boss et al. // FEBS Lett. 1997. - vol. 408(1). -pp. 39-42.

226. UCP4, a novel brain-specific mitochondrial protein that reduces membrane potential in mammalian cells./ W. Mao et al. // FEBS Lett. 1999. - vol. 443(3).-pp. 326-30.

227. Uncoupling protein-3 is a mediator of thermogenesis regulated by thyroid hormone, ЬЗ-adrenergic agonists, and leptin/ D.W. Gong et al. // J. Biol. Chem. 1997. - vol. 272. - pp. 24129-24132.

228. Uncoupling protein 2, in vivo distribution, induction upon oxidative stress, and evidence for translational regulation/ C. Pecqueur et al. // J. Biol. Chem. -2001.-vol. 276.-pp. 8705-8712.

229. Uncoupling protein 2 plays an important role in nitric oxide production of lipopolysaccharide-stimulated macrophages/ T. Kizaki et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - vol. 99. - pp. 9392-9397.

230. UCP2, UCP3, avUCP, what do they do when proton transport is not stimulated? Possible relevance to pyruvate and glutamine metabolism/ F. Criscuolo et al. // Biochim Biophys Acta. 2006. - vol. 1757(9-10). - pp. 1284-91.

231. Uncoupling protein-3: a new member of the mitochondrial carrier family with tissuespecific expression/ O. Boss et al. // FEBS Lett. 1997. - vol. 408. - pp. 39—42.

232. Uncoupling proteins 2 and 3 are fundamental for mitochondrial Ca" uniport./ M. Trenker et al. // Nature cell biology. 2007. - vol. 9. - №.4. - pp. 445452.

233. Vanlerberghe G.C. ALTERNATIVE OXIDASE: from gene to function / G.C. Vanlerberghe, L. Mcintosh // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1997. -vol. 48. - pp. 703-734.

234. Vianello A. ATP/ADP antiporter is involved in uncoupling of plant mitochondria induced by low concentrations of palmitate / A. Vianello, E. Petrussa, F. Macri // FEBS Lett. - 1994. - vol. 349. - pp. 407-410.

235. Wagner A.M. The alternative respiration pathway in plants: Role and regulation / A.M. Wagner, K. Krab // Physiologia Plantarum. 1995. - vol. 95. -pp. 318-325.

236. Wiseman H. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer./ H. Wiseman, B. Halliwell // Biochem J. 1996. - vol. 313. - №1. - pp. 17-29.

237. Wei Y.H. Mitochondrial DNA alterations as ageing-associated molecular events./ Y.H. Wei // Mutat Res. 1992. - vol.275. - pp. 145-155.

238. Wagner A.M. Alternative oxidase: its possible role / A.M. Wagner, A. Moore // Bioscience Reports. 1997. - vol. 17. - pp. 319-333.

239. Winkler E. Effect of fatty acids on нГ transport activity of the reconstituted uncoupling protein / E. Winkler, M. Klingenberg // J Biol Chem. -1994. vol. 269.-pp. 2508- 2515.

240. Zoratti M. The mitochondrial permeability transition./ M. Zoratti, I. Szabo // Biochim Biophys Acta. 1995. - vol. 1241. - №2. - pp. 139-76.

Информация о работе

Кашапова, Ирина Юрьевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы