Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий"
0041
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова
Черняк Борис Викторович
МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КЛЕТКИ ПРИ ДИСФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ
03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
На правах рукописи
Москва - 2010
3 О СЕН 2010
004609690
Научный консультант:
академик РАН, профессор Владимир Петрович Скулачев
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Галина Евгеньевна Онищеяко Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова
доктор биологических наук, профессор Рената Александровна Звягильская Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН
доктор медицинских наук, профессор Всеволод Григорьевич Пинелис
Научный центр здоровья детей, РАМН
Ведущая организация: Институт канцерогенеза, Российский
онкологический научный центр, РАМН
Защита состоится 16 ноября 2010 г. на заседании диссертационного совета Д 501. 001. 52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Воробьевы горы, д.1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, в аудитории М-1.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Диссертация в виде научного доклада разослана ( fy, , 2010г.
Ученый секретарь диссертационного совета
Кандидат биологических наук х Е. Н. Калистратова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
В последние десятилетия мы стали свидетелями революции в
митохондриологии. Привычное, вошедшее в учебники представление о митохондриях, как об энергетических станциях клетки, производящих АТР с помощью сложных машин, общие принципы действия которых известны (хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на расплывчатый образ «ящика Пандоры», в который заключены факторы, определяющие судьбу клетки. В прежней парадигме роль митохондрий в развитии патологий ограничивалась нарушением энергообеспечения при токсических и гипоксических повреждениях и при редких генетических нарушениях. Теперь на передний план вышли «побочные» процессы, в которых участвуют митохондрии, такие как продукция активных форм кислорода (АФК), нарушение внутриклеточной передачи сигналов и, наконец, выход из митохондрий в цитоплазму белков, вызывающих программированную гибель клетки (апоптоз). Неканонические функции митохондрий, как правило, связаны с нарушением их биоэнергетических функций и избыточной продукцией АФК, что является серьезной угрозой для жизни клетки.
Синтез АТР в митохондриях легко обратим. При повреждении мембраны митохондрий, ведущем к снижению мембранного потенциала, протонная АТРсинтаза (FoF-i-АТРаза) катализирует гидролиз АТР не сопряженный с совершением полезной работы. Учитывая высокую активность этого фермента, полный гидролиз клеточной АТР мог бы занять лишь несколько минут и привести к необратимым последствиям. Наши исследования показали, что на разных уровнях организации клетки существуют защитные механизмы, предотвращающие гидролиз АТР и последствия падения уровня АТР в клетке.
В митохондриях сосредоточено дыхание клетки, которое неизбежно сопряжено с «утечкой» электронов (однозлектронным восстановлением кислорода) и образованием супероксид-радикала. Супероксид быстро дисмутирует с образованием пероксида водорода (наиболее долгоживущего представителя АФК), который может дать начало более активным АФК (прежде всего гидроксил-радикалу) в реакции Фентона. Кроме того, супероксид, реагируя с N0, вызывает образование активного радикала пероксинитрила. Все АФК, образуемые в митохондриях, чрезвычайно опасны для клетки и в норме их продукция уравновешена различными антиоксидантными системами, которые
находятся как в митохондриях, так и в цитоплазме. Повреждение митохондрий чревато избыточной продукцией АФК, с которой антиоксидантные системы не справляются. Наши исследования были направлены на изучение защитных механизмов способных защитить клетку в этих условиях.
Выраженная дисфункция митохондрий может оказаться несовместимой с нормальным функционированием клетки. Поврежденная клетка представляет опасность, как для окружающей ткани, так и для организма в целом. Основным механизмом защиты в этом случае является апоптоз, позволяющий элиминировать клетку с минимальным ущербом для ее окружения. Наши результаты свидетельствуют о том, что митохондрии не только участвуют в реализации программы апоптоза, но и служат важнейшим сенсором, способным инициировать апоптоз.
Актуальность исследований в этой области определяется тем, что повреждением митохондрий и связанный с этим окислительный стресс лежит в основе многих тяжелых патологий, в частности инфарктов, инсультов и нейродегенеративных заболеваний. Изучение механизмов защиты клетки от дисфункции митохондрий позволит более эффективно бороться с этими заболеваниями. Эти исследования должны содействовать разработке принципиально новых эффективных лекарственных средств, мишенью для которых являются митохондрии.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы было исследование механизмов защиты клетки от дисфункции митохондрий, которая связана с непродуктивным гидролизом АТР и окислительным повреждением, а также разработка и испытание новых препаратов, действие которых направлено на митохондрии. Задачи исследования:
1) Изучение молекулярных механизмов, блокирующих гидролиз АТР при повреждении митохондрий;
2) Изучение роли митохондрий в развитии окислительного стресса;
3) Изучение защитной программы, направленной на элиминацию поврежденных митохондрий (митоптоза);
4) Исследование апоптоза, вызванного дисфункцией митохондрий, как защитной программы;
5) Разработка и испытания новых митохондриально-направленных антиоксидантов.
Научная новизна работы.
В работе исследованы защитные системы, позволяющие уменьшить разрушительные последствия дисфункции митохондрий. Проведено систематическое изучение этих систем на молекулярном уровне, на изолированных митохондриях и на клетках в культуре.
Показано, что в митохондриях существуют механизмы, которые эффективно тормозят непродуктивный гидролиз АТР. Даже временное и неполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток, защищая от повреждения окружающую ткань.
Показано, что при окислительном стрессе митохондрии служат основным источником активных форм кислорода (АФК). Наряду с антиоксидантными системами клетка использует для защиты от стресса программу элиминации поврежденных митохондрий (митоптоз), которая включает открытие неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, их фрагментацию и механизм элиминации, сходный с зкзоцитозом.
Показано, что накопление АФК в митохондриях может инициировать апоптоз и вести в выработке сигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток. При патологических процессах эта защитная программа может усиливать повреждение тканей и органов. Установлено, что новые митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно блокируют накопление АФК, апоптоз и выработку межклеточного сигнала апоптоза при окислительном стрессе.
Научно-практическое значение работы.
Проведенные исследования открывают новые фундаментальные клеточные механизмы, лежащие в основе патологий, связанных с дисфункцией митохондрий и с развитием окислительного стресса. Понимание этих механизмов указывает новые пути для разработки терапевтических подходов и лекарственных средств. Проведенные испытания новых митохондриально-направленных
антиоксидантов показали перспективность их применения при инфарктах, инсультах и нейродегенеративных заболеваниях.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При повреждении мембраны митохондрий активируются механизмы регуляции митохондриальной АТР синтазы, способные эффективно тормозить непродуктивный гидролиз АТР.
2. Временное и неполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток.
3. При окислительном стрессе митохондрии служат основным источником активных форм кислорода (АФК).
4. Для защиты от окислительного стресса клетка может использовать программу элиминации поврежденных митохондрий (митоптоз), которая включает открытие неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, их фрагментацию и механизм элиминации, сходный с экзоцитозом.
5. Накопление АФК в митохондриях может инициировать апоптоз и вести в выработке сигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно блокируют эти процессы.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на Школах-конференциях по биоэнергетике (1976-1990гг), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1980-2007гг), европейских биоэнергетических конференциях ЕВЕС (Валенсия, 1994, Лювен, 1996, Брайтон, 2000, Пиза 2004, Москва, 2006, Дублин, 2008), европейских конференциях по апоптозу ECDO (2005, 2006, 2007, 2008), конгрессах FEBS 1984, 2004 и IUBMB 2006.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 62 печатных работах (включая 6 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Нарушение биоэнергетических функций митохондрий в клетке
Причиной дисфункции митохондрий в клетке могут служить как внешние воздействия, так и процессы, протекающие внутри клетки. Классическим примером служит терморегуляторное разобщение открытое В. П. Скулачевым в 1960г. Возникающая при участии разобщающих белков и жирных кислот протонная проводимость внутренней мембраны митохондрий ведет к свободному окислению субстратов, энергия которого рассеивается в виде тепла. Кратковременное нарушение окислительного фосфорилирования характерно для возбудимых клеток, таких как нейроны. В таких клетках снижение мембранного потенциала (деполяризация) митохондрий происходит в областях, где проведение сигналов связано с резким повышением концентрации Са2+ в цитоплазме.
Мы исследовали состояние митохондрий в фибробластах человека и в клетках карциномы HeLa, используя специфические потенциал-чувствительные флуоресцентные зонды (Митотрекер красный, TMRM и др.). Одновременно митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым, который накапливается в митохондриях независимо от мембранного потенциала. Накапливаясь в митохондриях, TMRM тушит флуоресценцию Митотрекера зеленого, а в деполяризованных митохондриях она остается высокой. Этот подход позволил выявить митохондрии с пониженным потенциалом, определить их содержание и локализацию в клетке. В фибробластах основная часть деполяризованных митохондрий расположена в ламеллярной области вблизи от активного края (Рис. 1). Возможно, в этой области митохондрии выполняют какие-то сигнальные функции.
В двух исследованных линиях клеток карциномы содержание деполяризованных митохондрий было значительно ниже, чем в фибробластах и они были локализованы как на периферии, так и в перинуклеарной области клетки (Рис. 2, 3). Непосредственные причины деполяризации нам установить не удалось, но было показано, что повышенный градиент рН и усиленный синтез АТР не определяют снижение потенциала. Можно полагать, что снижение потенциала связано с повышенной ионной проводимостью внутренней мембраны этой фракции митохондрий. Падение мембранного потенциала приводит к ускорению дыхания митохондрий и повышению продукции АФК.
Митотрекер зеленый : 1
В
Рис.1. Выявление в клетке митохондрий с пониженным мембранным потенциалом. Фибробласты инкубировали с 200 нМ Митотрекера зеленого и 400 нМ ТМИМ в течение 15 мин и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Яркое зеленое окрашивание свидетельствовало о сниженном потенциале (А). Б - распределение отношения зеленой (Митотрекер) и красной (ТМР?М) и флуоресценции в митохондриях. В -локализация митохондрий со сниженным потенциалом (темные). Масштаб, 15мкм.
Рис.2. Выявление в клетке митохондрий с пониженным мембранным потенциалом и повышенной продукцией АФК.
А - клетки Не1_а инкубировали с Митотрекером зеленым и ТМ13М как описано на рис. 1; стрелками показаны деполяризованные митохондрии. Б, В - клетки Не1_а инкубировали одновременно с Митотрекером зеленым (Б) и МйоБох (В), стрелками показаны митохондрии с повышенным уровнем АФК.
Рис. 3. Митохондрии с пониженным потенциалом активно продуцируют АФК. В клетках карциномы ККО экспрессировали митохондриально-направленный АФК-чувствительный белок «НуРег» (А) и окрашивали ТМРМ (Б). Стрелками показаны митохондрии с низким потенциалом и высоким уровнем АФК.
Исследование продукции АФК индивидуальными митохондриями в клетках требует применения митохондриально-направленных АФК-чувствительных зондов. С этой целью был использован гидроэтидин, конъюгированный с катионом трифенилфосфония («MitoSox»). В клетках HeLa этот зонд выявил небольшую фракцию митохондрий, продуцирующих наибольшее количество АФК (Рис. 2). К сожалению, флуоресценция этого зонда не позволяет использовать потенциал-чувствительные индикаторы и проверить предположение о том, что максимальная продукция АФК характерна для деполяризованных митохондрий. Наиболее убедительные доказательства были получены с помощью искусственного флуоресцентного белка «НуРег», флуоресценция которого усиливается под действием АФК (Belousov et al., 2006). К гену этого белка был присоединена адресная последовательность, принадлежащая субъдинице цитохромоксидазы, что обеспечило его избирательный транспорт в митохондрии. Полученная конструкция была включена в геном лентивируса, который эффективно заражает клетки карциномы человека и позволяет получить стабильные клоны экспрессирующие митохондриально-направленный «НуРег». Анализ флуоресценции показал, что продукция АФК повышена в митохондриях, которые не накапливают потенциал-чувствительный зонд TMRM (Рис. 3).
Последствия избыточной продукции АФК в митохондриях для физиологии клетку будут обсуждаться в последующих главах работы. Наряду с продукцией АФК, снижение мембранного потенциала митохондрий должно вести к гидролизу АТР, который катализирует F0FrATPa3a. Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение защитных механизмов снижающих негативный эффект дисфункции митохондрий.
2. Молекулярные механизмы защиты от гидролиза АТФ
Один из механизмов, способных блокировать непродуктивный гидролиз АТР был впервые описан А.Д. Виноградовым и сотр. Он основан на прочном ингибиторном связывании ADP с АТРазой. Для исследования этого механизма мы использовали искусственный аналог ADP, 2N3ADP способный ковалентно связываться с белком после фотоактиваци и показали, что ингибирующее связывание ADP происходит в активном центре АТРазы. Эксперименты с замкнутыми везикулами внутренней мембраны митохондрий (субмитохондриальные частицы, СМЧ) позволили установить, что
кратковременная генерация мембранного потенциала приводит к реактивации комплекса АТРазы с ADP. Эти результаты полностью соответствовали данным А.Д. Виноградов и сотр., которые показали, что синтез АТР не тормозится под действием ADP. Авторы предположили, что конформация фермента при синтезе и гидролизе АТР различаются и лишь «гидролазная» конформация чувствительна к ингибиторному действию ADP. Наши данные не противоречат этой гипотезе, но указывают на ведущую роль мембранного потенциала в переходе АТРазы в «синтетазный» режим и реактивации комплекса cADP (Схема 1):
Наши дальнейшие усилия были направлены на изучение ADP-зависимого ингибирования в интактных изолированных митохондриях. В этих экспериментах мы использовали способность ряда анионов (сульфита, ацетата и др.) ускорять реактивацию комплекса АТРазы с ADP. Мы показали, что эти анионы стимулируют гидролиз АТР в митохондриях при отсутствии мембранного потенциала. Титрование специфическими ингибиторами показало, что скорость гидролиза АТР в этих условиях определялась скоростью переноса АТР через мембрану, а не активностью АТРазы. Измерения активности АТРазы в митохондриях показали, что более 80% фермента находится в неактивном комплексе с ADP. Таким образом, описанный механизм торможения гидролиза АТР весьма эффективен и может играть важную роль в стабилизации уровня АТР в клетке.
Еще один механизм регуляции активности АТРазы включает взаимодействие фермента с природным белковым ингибитором (IFi). Этот небольшой белок, открытый Пульманом и Монро в 1964г, способен полностью блокировать АТРазу, но не тормозит синтез АТР. В экспериментах на СМЧ генерация мембранного потенциала вызывала медленную и неполную диссоциацию комплекса фермента с ингибитором. Мы предположили, что реактивация АТФазы может происходить в комплексе с IFi. Другими словами, ингибитор является субъединицей АТРазного комплекса, регулирующей его
f
Е—-Е • АТР^Е -ADPI' —НЕ
Iх"1 -г"-'1>]не активе*
не активен
активность. В экспериментах, подтвердивших эту гипотезу, мы использовали рН-зависимость действия ингибитора, который блокировал АТРазу лишь при нейтральных и слабокислых значениях рН. Наши исследования показали, что при рН выше 8.0 ингибитор образует комплекс с АТРазой, не препятствуя гидролизу АТР. При снижении рН, гидролиз АТР приводил к инактивации комплекса. Инактивацию АТРазы удавалось предотвратить с помощью ионов Zn2+, которые стабилизировали активный комплекс фермента с ингибитором (Схема 2):
В дальнейших экспериментах мы исследовали возможность существования активного комплекса АТРазы с IFi в интактных изолированных митохондриях. Анализ большого ряда неионных детергентов позволил выбрать один из них -Lubrol-WX, который разрушал мембрану митохондрий, не повреждая АТРазный комплекс. Пользуясь этой методикой, мы получили из митохондрий активный АТРазный комплекс, который содержал IFi. Инкубация этого комплекса в присутствии АТР при рН 7,4 приводила к его инактивации, которая предотвращалась ионами Zn2+. Таким образом, существование активного комплекса АТРазы с IF! в митохондриях было доказано.
Предложенная методика разрушения митохондрий Lubrol-WX позволила количественно оценить величину фракции АТРазы содержащей связанный IFi. Измерения показали, что этот параметр сильно варьирует в различных клетках и тканях, а также имеет выраженные видовые различия. При анализе митохондрий из печени мыши, крысы, морской свинки, свиньи и быка было выявлено крайне малое содержание комплексов, которое не превышало 10% от содержания АТРазы. Эти данные были подтверждены в опытах с кислотной экстракцией IFi, которые показали крайне низкое содержание этого белка в печени по сравнению с содержанием FoFi-АТРазы. Интересное исключение составили митохондрии из печени суслика, в которых практически вся АТРаза находилась в комплексе с IF-i. Суслики являются зимоспящими животными, и естественно было предположить, что содержание IFi в них подвержено сезонным изменением. Это предположение
не активен
активен
не подтвердилось, однако, было установлено, что эффективность торможения гидролиза АТР в митохондриях суслика возрастает в период пробуждения от зимней спячки. В этот период температура тела животного резко повышается и печень (наряду с бурым жиром) участвует в термогенезе, связанном с разобщением окислительного фосфорилирования. По-видимому, в этот период действие IFi особенно важно для предотвращения гидролиза АТР в митохондриях. Высокое содержание активного комплекса АТРазы с IFi было обнаружено нами так же в митохондриях быстрорастущей гепатомы 22а. Можно предполагать, что эффективная регуляция АТРазы придает опухолевым клеткам большую устойчивость к стрессам и является селективным преимуществом при отборе клеток в опухоли. Чрезвычайно эффективное торможение гидролиза АТР было выявлено нами в митохондриях клубней картофеля. Вклад IFi в этом случае не был подтвержден прямыми опытами, но физиологическое значение блокировки гидролиза АТР в покоящейся ткани не вызывает сомнения.
Измерения содержания активного комплекса АТРазы с IFi в митохондриях сердца показали выраженные видовые различия. Было показано, что содержание комплекса в митохондриях сердца мыши, крысы и морской свинки чрезвычайно мало. В митохондриях сердца свиньи и быка практически вся АТРаза находилась в комплексе с IR-i. Кролик занимал промежуточное положение. Эти данные были подтверждены в опытах с кислотной экстракцией IFi. Содержание комплекса коррелировало с частотой сердцебиений, которая значительно выше у мелких животных, однако физиологический смысл этой корреляции остается неясным.
3. Апоптоз, как защита при снижении уровня АТР
Описанные системы регуляции АТРазы способны эффективно затормозить непродуктивный гидролиз АТР в митохондриях, но не могут предотвратить снижение уровня АТР при остановке его продукции в клетке. Наши исследования показали, что в качестве защиты клеточной популяции от клеток с поврежденной системой энергообеспечения может использоваться апоптоз.
В клетках быстрорастущих опухолей основным источником АТР является гликолиз, активность которого не снижается в аэробных условиях («эффект Варбурга»), Так в клетках карциномы шейки матки HeLa полное выключение окислительного фосфорилирования с помощью специфических ингибиторов не ведет к заметному снижению уровня АТР в клетке и уменьшению
жизнеспособности. Эти эксперименты, однако, проводились в среде DMEM, содержащей 25 мМ глюкозы, что значительно выше физиологической нормы. Показано, что недостаток субстратов гликолиза может в значительной степени подавлять рост опухолей. Для снижения эффективности гликолиза мы помещали клетки в среду с 5,5 мМ глюкозы и ингибитором гликолиза 2-деоксиглюкозой (2-ДОГ). Уровень АТР и жизнеспособность клеток в этих условиях поддерживались окислительным фосфорилированием. Ни митохондриальные ингибиторы (олигомицин, ингибитор АТРсинтазы; микостиазол, ингибитор переноса электронов в комплексе III дыхательной цепи или разобщитель FCCP), ни 2-ДОГ, взятые по отдельности, не вызывали значительной гибели клеток.
Инкубация клеток HeLa в присутствии 2-ДОГ в комбинации с одним из митохондриальных ингибиторов вызывала во всех случаях быстрое (за 1-2 ч) и примерно одинаковое (на 60%) падение уровня АТР в клетках (Рис. 4).
Рис. 4. Комбинированное действие ингибиторов гликолиза (2-ДОГ) и окислительного фосфорилирования вызывает обратимое снижение уровня АТР в клетках HeLa. А - клетки инкубировали в среде, содержащей 5,5 мМ глюкозы в присутствии различных ингибиторов окислительного фосфорилирования (олигомицин - 5 мкг/мл, миксотиазол -2 мкМ, FCCP - 10 мкМ) и 2-ДОГ(5 мМ). Б - клетки инкубировали Зч в присутствии 2-ДОГ и олигомицина, а затем была произведена смена среды на среду, содержащую 25 мМ глюкозы и вновь добавлен олигомицин.
В отсутствии 2-ДОГ ингибиторы окислительного фосфорилирования
вызывали снижение уровня АТР в клетках не более, чем на 25% от исходного уровня. Замена среды через 3 ч после индукции падения уровня АТР на среду с высоким содержанием глюкозы (25 мМ) и без 2-ДОГ приводила к восстановлению уровня АТР в клетках практически до исходного уровня. Кратковременное и обратимое снижение уровня АТР приводило к отсроченной гибели клеток (Рис. 5). Основным механизмом гибели являлся апоптоз. Гибель клеток сопровождалась характерной фрагментацией ДНК и появлением фосфатидилсерина на поверхности (Рис. 6 А).
<
Время инкубации, ч
Время инкубации, ч
Рис. 5. Гибель клеток HeLa, вызванная временным падением уровня АТР в клетках. Клетки инкубировали 3 ч в среде содержавшей 2-ДОГ и(или) митохондриальные ингибиторы (как на Рис. 4) и 48 ч в среде с высоким содержанием глюкозы. Клетки окрашивали Hoechst 33342 и йодистым пропидием и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии
Оверэкспрессия антиапоптозного белка Вс1-2 или добавка ингибитора каспаз zVADfmk блокировали апоптоз, не предотвращая падение уровня АТР. Интересно, что zVADfmk одновременно усиливал проявление некроза (Рис. 6 Б), что указывает на защитную роль каспаз в этих условиях. Увеличение времени инкубации клеток в присутствии 2-ДОГ и митохондриальных ингибиторов с 3 ч до 5 ч приводило преимущественно к некротической гибели через 48 ч после восстановления уровня АТФ (Рис. 6В).
- ^и
II IIS
Рис. 6. Временное снижение АТР может вызывать как апоптоз, так и некроз в клетках HeLa.
Условия инкубации как на Рис. 4. Гибель клеток анализировали через 48 ч после восстановления уровня АТР в клетках. А - электрофорез ДНК. Дорожки: 1-ДОГ + FCCP, 2-ДОГ + миксотиазол, 3-ДОГ + олигомицин, 4-Контроль, М - маркеры. Б, В - гибель клеток анализировали как на Рис. 5. Вс1-2 - линия клеток HeLa, экспрессирующая белок Вс1-2.
Апоптоз, вызванный кратковременным снижением АТР имел те же характерные черты, что и апоптоз вызванный другими стрессовыми факторами (см. ниже). В частности, мы наблюдали транслокацию белка ВАХ из цитоплазмы в митохондрии и выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму. Выход цитохрома, но не транслокация ВАХ были блокированы в клетках экспрессирующих Вс1-2. Ингибитор каспаз zVADfmk не влиял ни на транслокацию ВАХ, ни на выход в цитоплазму цитохрома с, так что активация каспаз, по-видимому, происходила по цитохром с-зависимому механизму. Вопрос о механизме индукции апоптоза в этой модели остается открытым. Интересно, что, несмотря на участие митохондрий в апоптозе, нарушение их биоэнергетических функций не препятствует осуществлению программы. К такому же выводу мы пришли, исследовав апоптоз, вызванный ингибитором протеинкиназ стауроспорином, фактором некроза опухолей и окислительным стрессом (см. ниже). Устойчивость апоптоза к нарушениям функций митохондрий указывает на возможность использования этой программы в условиях повреждения митохондрий различной природы.
Обнаруженный нами запуск апоптоза при кратковременном снижении АТР на 60-70%, когда остаточный АТР остается в миллимолярном диапазоне концентраций, позволяет предположить существование в клетке специальной системы детекции энергетического состояния. Возможными кандидатами на роль сенсоров являются киназы mTOR и АМРК. Первая имеет аномально высокую Кт по АТР, а вторая аллостерически активируется AMP. Обе киназы участвуют в регуляции метаболизма и экспрессии генов при различных видах голодания. Конечно, нельзя исключить, что наряду с АТР, ADP и AMP могут детектироваться и другие метаболиты, концентрация которых резко изменяется при небольшом снижении уровня АТР.
4. Митохондрии, как источник АФК при окислительном стрессе
Основными инструментами при изучении роли митохондрий в образовании АФК нам послужили новые митохондриально-направленные антиоксиданты, разработанные при нашем участии под руководством акад. В. П. Скулачева. Эти соединения, получившие название SkQ (примеры показаны на Рис. 7), представляют открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающие катионы конъюгированные с молекулой пластохинона, которая является
15
эффективной ловушкой кислородных радикалов. Эти антиоксиданты эффективно накапливаются в митохондриях, нейтрализуют АФК и регенерируются (восстанавливаются) дыхательной цепью, что позволяет использовать их в крайне низких наномолярных концентрациях.
Рис. 7. Формулы основных митохондриально-направленных антиоксидантов (8к0), использованных в работе.
Митохондрии являются единственным компартментом клетки, имеющим отрицательный (относительно цитоплазмы) заряд, так что можно было ожидать селективного накопления ЭкО в этих органеллах клетки. Накопление БкСЗ в клетках было исследовано с помощью флуоресцентного производного Зк(ЭР1, несущего в качестве катиона остаток родамина 19. Эксперименты с фибробластами человека показали, что Зк(Ж1 избирательно накапливается в митохондриях клеток (Рис. 8). Рассеивание мембранного потенциала митохондрий с помощью протонофорного разобщителя предотвращает накопление ЗкОШ. Накопление БкОЖ достигает максимума за 1,5-2 ч и в дальнейшем не растет. После отмывки лишь часть вкОШ выходила из клеток (рис. 8). Аналогичные эксперименты, проведенные на клетках Не1_а и других линий, подтвердили митохондриальную локализацию БкО. Накопление 8кС1Р1 было заметно снижено во многих опухолевых клетках и дальнейший анализ показал, что причиной тому является высокая активность систем множественной лекарственной устойчивости в этих клетках. Подавление основного компонента этой системы Р-гликопротеида с помощью специфических ингибиторов значительно увеличивало накопление БкОЮ в опухолевых клетках.
БкОГМ
SkQR1
Митотрекер зеленый
Наложение
инкубация »SkQRJ ---без SkQRl
100 200 Время, V
Рис. 8. Накопление 5кОЯ1 в фибробластах человека.
А - клетки инкубировали 2 ч с ЭкОМ (50 нМ) и селективным митохондриальным красителем Митотрекером зеленым (5 мкМ). Конфокальная микроскопия. Б - кинетика накопления Бк(Ж1(50 нМ). Через Зч 5кСЖ1 отмывали и наблюдали его выход из клеток. РССР (10 мкМ) был добавлен одновременно с ЭкОЮ или при отмывке. Данные проточной цитометрии.
контроль ротвнон ротоном* ротвнон* ротвнон* пивриц А миксо DPI NAC SkQ
Рис 9. Продукция АФК в клетках HeLa, вызванная фотоактивацией Митотрекера красного.
Показана зеленая флуоресценция CM-DCF и ее совмещение о красной флуоресценцией Митотрекера: А - до засветки, Б - сразу после фотоактивации, В - через 10 минут после фотоактивации. Г - накопление АФК через 20 мин после фотоактивации. Добавки ротенона (2 мкМ), пиерицидина А (2 мкМ), миксотиазола (2 мкМ), DPI (ЮмкМ) и NAC (20 мМ) сделаны за 1 ч до засветки, SkQ1 (20нМ) добавлен за 7 сут. Данные флуоресцентной микроскопии.
Для выяснения механизмов митохондриальной продукции АФК и их роли в гибели клеток нами были использованы две модели. В первой, эта продукция индуцировалась фотодинамической обработкой, а в качестве фотосенсибилизатора использовался флуоресцентный краситель Митотрекер красный (хлорометил-Х-розамин), селективно накапливающийся в митохондриях. Во второй модели продукцию АФК индуцировали добавкой пероксида водорода. В обоих случаях после периода индукции наблюдалась продолжительная генерация АФК, которую измеряли с помощью флуоресцентного индикатора CM-DCFH-DA чувствительного, преимущественно, к перекисным радикалам. При освещении клеток содержащих Митотрекер первоначально наблюдалось накопление АФК в митохондриях, а затем они распространялись по всей клетке (Рис. 9).
Флуоресценция CM-DCF линейно возрастала в течение 20-30 мин после засветки, что указывало на активную продукцию АФК в клетке. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 в чрезвычайно низкой концентрации (20 нМ) подавлял продукцию АФК, а традиционный антиоксидант N-ацетилцистеин (NAC) был эффективен лишь при концентрации 20 мМ, что указывало на митохондриальное происхождение АФК. Ингибиторы комплекса I дыхательной цепи митохондрий ротенон и пиерицидин А, а также ингибитор комплекса III дыхательной цепи миксотиазол значительно стимулировали продукцию АФК, в то время как ингибитор флавиновых ферментов дифенилен иодониум (DPI) ее блокировал (Рис. 9Г)- Эти данные позволили предположить, что продукция АФК в нашей модели осуществлялась при участии флавинового компонента комплекса I в процессе прямого переноса электронов по дыхательной цепи. Подобный эффект фотоиндуцированной продукции митохондриальных АФК наблюдался ранее в мышечных клетках (Д. Б. Зоров и сотр.).
В качестве индуктора продукции АФК в фибробластах был использован пероксид водорода. Было показано, что добавленный к клеткам Н202 разлагается в течение 15-20 минут, вероятно, вследствие высокой активности каталазы и других антиоксидантных ферментов в среде роста. Накопление АФК в клетках, измеренное с помощью CM-DCF-DA наблюдалось в течение 2 ч, а затем снижалось до исходного уровня. Накопление АФК значительно стимулировалось ингибиторами дыхания пиерицидином и миксотиазолом и предотвращалось DPI и митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1, что указывает на
активацию продукции АФК в митохондриях под действием пероксида водорода (Рис. 10).
Рис. 10. Накопление АФК в фибробластах вызванное Н202. (0,3 мМ). Клетки окрашивали СМ-ОСР-йА через 2 ч (А) или через указанные промежутки времени после добавки Н202 (Б). Пиерицидин (пиер., 2 мкМ) добавляли за 1ч, а БкСЛ (20 нМ) за 1 сут или за 7 сут до Н202.
Результаты проведенных исследований показали, что при различных видах окислительного повреждения клетки: локальном (фотодинамическое воздействие на митохондрии) или генерализованном (обработка пероксидом водорода) митохондрии могут служить основным источником эндогенной продукции АФК. Возможно, избыточное образование АФК в митохондриях лежит в основе целого ряда патологий связанных с окислительным стрессом. Это предположение подтверждает тот факт, что в моделях ишемического повреждения сердца, почек и мозга, при лечении ран, а также при различных заболеваниях глаз нами и нашими коллегами были получены выраженные терапевтические эффекты митохондриально-направленных антиоксидантов.
5. Механизм повреждения митохондрий при окислительном стрессе. Неселективная пора.
При окислительном стрессе митохондрии являются как источником АФК, так и мишенью для их повреждающего действия. Одним из основных механизмов повреждения митохондрий является образование крупных неселективных пор во внутренней мембране. Структура поры остается неизвестной, хотя установлено, что она включает известные белки внутренней мембраны (АТР/АЭР транспортер,
Б
переносчик фосфата), белки внешней мембраны (порин) и матрикса (цикпофиллин О). Основным критерием при изучении поры этого типа является ее чувствительность к ингибиторному действию циклоспорина А (ЦсА), лиганда цикпофиллина. Функциональные исследования поры в изолированных митохондриях показали, что индукторами ее открытия служат ионы Са2\ вещества, снижающие мембранный потенциал, и различные прооксиданты. Для изучения регуляции поры при окислительном стрессе нами были разработаны две модели. В первой, использовалась зависимость поры от мембранного потенциала. Было показано, что в присутствии индукторов поры ее открытие происходит при более высоких значениях потенциала, а ингибиторы действуют в противоположную сторону. В другой модели, измерялась зависимость открытия поры от концентрации Са2+ при полном отсутствии мембранного потенциала. В этом случае индукторы поры повышали ее чувствительность к Са2+, а ингибиторы, напротив, ее понижали. Эти модели позволили исследовать действие ряда прооксидантов, не опасаясь их возможного эффекта на мембранный потенциал или транспорт Са2+.
Важную роль в дальнейших исследованиях сыграл обнаруженный нами новый ингибитор поры монобромобиман. Этот ингибитор предотвращал индукцию поры под действием некоторых прооксидантов (производные мышьяка, диамид), но не действовал в случае органических гидроперекисей и дурохинона. Мы показали, что в первом случае индукция поры определяется окислением вицинальных тиолов в белках, образующих пору. Возможно, эти тиолы находятся в равновесии с пулом восстановленного глутатиона в митохондриях. Второй путь индукции не зависел от модификации белков и определялся окислением пиридиновых нуклеотидов (ЫАОН и ЫАОРН) в матриксе митохондрий. Мы показали, что эти два пути функционируют независимо друг от друга.
Вопрос о функционировании митохондриальной поры в живой клетке изучен пока недостаточно. Это связано с отсутствием методических подходов, позволяющих регистрировать открытие поры в клетке. Большинство из них основаны на измерении мембранного потенциала, который может варьировать по причинам, не зависящим от поры. Для исследования поры в клетке мы использовали ее способность пропускать ионы Са2+. Известно, что транспорт Са2+ в митохондриях устроен так, что при низкой концентрации Са2+ во внешней среде, он не может быстро выйти из матрикса. Такая ситуация может реализоваться в
клетке, если после кратковременного подъема Са2+ и накопления в митохондриях его концентрация снизится до физиологической нормы (около 100 нМ). Мы смоделировали этот процесс в лимфоцитах тимуса, стимулировав подъем Са2+ в цитоплазме с помощью ингибитора Са2+-АТРазы эндоплазматического ретикулума, тапсигаргина. Этот ингибитор вызывает выход Са2+ из ретикулума, что ведет к входу дополнительного количества Са2+ из внеклеточной среды через т. наз. СИАС-каналы. Если через какое-то время убрать Са2* из среды, то его концентрация в клетке нормализуется, благодаря работе Са2+-АТРазы плазматической мембраны. После завершения цикла какое-то количество Са2+ накапливалось и оказывалось запертым в митохондриях. Полное снятие мембранного потенциала с помощью протонофорного разобщителя ЯССР приводило к быстрому выходу Са2+ в цитоплазму и ЦсА лишь частично тормозил этот процесс. Все эти переходы мы наблюдали в лимфоцитах с помощью флуоресцентного зонда Р1ио-ЗАМ, регистрировавшего концентрацию Са2+ в цитоплазме (Рис. 11 А, В).
Эффективные индукторы поры (такие как фениларсеноксид) вызывали выход Са2+ из митохондрий, который тормозился ЦсА (Рис. 11 Б). Если клетки обрабатывали мягкими прооксидантами, то малые дозы разобщителя вызывали быстрый ЦсА-чувствительный выход Са2* в цитоплазму (Рис. 11 Г, Д). Можно полагать, что прооксиданты сенсибилизировали пору в живой клетке и вызывали ее открытие при снижении потенциала, подобно тому, как это наблюдалось в изолированных митохондриях.
Таким образом, показано, что пора действует как чувствительный сенсор окислительных процессов в митохондриях, регистрируя уровни восстановленности основных редокс чувствительных компонентов, глутатиона и ^й(Р)Н. Существование подобного сенсора указывает на возможную роль поры в защите клетки от окислительного стресса. Можно полагать, что продолжительное открытие поры приведет к деградации поврежденных митохондрий в клетке и уменьшит опасность, которую они представляют.
Б
Рис. 11. Индукция митохондриапьной поры в лимфоцитах.
Клетки инкубировали с тапсигаргином (TG, 2 мкМ) 20 мин или указанное время (В), затем добавляли EGTA (5 мМ), FCCP (2 мкМ), фениларсиноксид (PhAsO, 10 мкМ), трет-бутилгидропероксид (t-BOOH, 0,2 мМ). Циклоспорин A (CsA, 2 мкМ) добавляли за 1 мин до индукторов. Д - зависимость эффекта от концентрации FCCP в условиях опыта, показанного на панели (Г). Концентрацию Са2* в цитоплазме измеряли с помощью флуоресцентного зонда Fluo-ЗАМ. Ответ зонда калибровали с помощью внешнего Са2*-буфера в присутствии ионофора иономицина.
6. Митоптоз
6.1.Фрагментация митохондриального ретикулума при окислительном стрессе Митохондрии в большинстве клеток образуют протяженный ретикулум и
объединены в единую электрическую сеть. Такой «кабель» позволяет передавать
энергию в виде мембранного потенциала с периферии клетки, где уровень
кислорода относительно высок, к центральной части клетки, где потребность в
окислительных метаболитах и АТР особенно высока. Митохондриальная сеть
является динамической структурой, которая обратимо фрагментируется при
окислительном стрессе и других повреждающих воздействиях. В клетках HeLa
изменения морфологии митохондрий проявлялись через 8-12 часов после
добавки Н2О2, а через 20-24 часа количество клеток с полностью фрагментированным митохондриальным ретикулумом составляло 60-70 %. В индивидуальных клетках культуры фрагментация начиналась после лаг-фазы различной длительности и затем очень быстро завершалась. Процесс фрагментации значительно ускорялся, если клетки одновременно с Н202 обработать ингибиторами дыхания миксотиазолом или пиерицидином (Рис, 12). Сами по себе пиерицидин и миксотиазол также вызывали фрагментацию митохондрий, но она требовала значительно больше времени. Эти данные согласуются с результатами, полученными при измерении уровня окислительного стресса в тех же условиях.
контроль Н 202 НО; - миксотиазол
Рис. 12. Динамика митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Клетки Не!_а инкубировали с Н202 (250 мкМ) и/или миксотиазолом (2 мкМ). Митохондрии выявляли Митотрекером зеленым. Бар - 15 мкМ.
Мнтохондриально-направленные антиоксиданты вызывают эффективную защиту митохондрий от фрагментации под действием Н202. Защитный эффект проявлялся в чрезвычайно низких концентрациях - 2-20 нМ (Рис. 13). Антиоксиданты общего действия тролокс и Ы-ацетилцистеин также предотвращали фрагментацию митохондрий, вызванную Н202, но в значительно больших концентрациях - 100 мкМ и 10 мМ соответственно.
Электронно-микроскопическое исследование, проведенное Л.Е. Бакеевой и сотр. показало, что ЭкСЛ полностью предотвращает нарушения структуры митохондрий, вызванные окислительным стрессом в клетках Не1_а (Рис. 14). Было обнаружено, что в отсутствие Н202 под действием БкС!1 в клетках НеЬа возрастает содержание протяженных митохондрий.
23
концентрация хинона, нМ
Рис. 13. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают фрагментацию митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Клетки Не1_а инкубировали с антиоксидантами (2 нМ, панель А) в течение 2 ч, добавляли Н202 (250 мкМ) и через 18 ч митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым.
Это наблюдение подтвердили измерения мембранного потенциала митохондрий в клетках Не1_а. Было показано, что при повреждении лазерным лучом небольшого фрагмента митохондрий в клетке происходит деполяризация близлежащих митохондрий, но размер этой области относительно невелик. Инкубация клеток с вкСН приводила к значительному увеличению этой области, что указывало на увеличение слитности митохондриальной электрической сети (Рис. 15). Из Рис. 13 видно, что Эк01 и 5к(2Я1 практически полностью подавляли фрагментацию митохондрий, в то время как МКоС! (их аналог, содержащий убихинон) был не столь эффективен. Аналогичные результаты были получены в опытах с фибробластами (Рис. 16). Во всех экспериментах С12ТРР (аналог Бк01, способный накапливаться в митохондриях, но не обладающий антиоксидантным действием) не оказывал никакого эффекта. При повышении концентрации митохондриально-налравленных антиоксидантов их защитный эффект исчезал и наблюдалось повреждающее действие, связанное, по-видимому, с прооксидантным эффектом. Бк01 предотвращал фрагментацию, вызванную ингибиторами дыхательной цепи митохондрий, миксотиазолом, антимицином А и пиерицидином, и не влиял на фрагментацию, вызванную ингибитором протеинкиназ ставроспорином. Последнее позволяет утверждать, что вк01 не нарушает механизм фрагментации митохондрий.
Контроль
Рис. 14. Влияние SkQ1 на морфологию митохондрий в клетках HeLa. Данные конфокальной и электронной микроскопии. Клетки обрабатывали SkQ1 (20 нМ, 7 дней) и инкубировали 24 ч с Н202 (100 мкМ). При конфокальной микроскопии (а, б) митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым.
Без добавок SkQ1
Рис. 15. ЭкСЦ вызывает образование единой электрической митохондриальной сети в клетках Не1а.
Клетки инкубировали с потенциал-чувствительным зондом ТМРМ (100 нМ, 15 мин), а затем освещали аргоновым лазером (488 нм; 50 сек; размер светового пятна 6 х 60 пикселей) фрагмент указанный стрелкой. Клетки анализировали через 15 мин после освещения. Там, где указано, клетки преинкубировали с 20 нМ ЭкСИ в течение 7 дней. Пунктиром показана область деполяризации митохондрий. Бар, 15 мкм
Важно отметить, что защитный эффект БкСП развивался за 2 ч, что соответствовало времени накопления ЭкОРЯ в клетках. В то же время, общий уровень АФК в клетке за это время не снижался. Для предотвращения накопления АФК требовалась значительно более длительная инкубация (24 ч в случае фибробластов и 7 суток в случае Не(.а). Можно предполагать, что БкСН при кратковременной инкубации нейтрализует АФК в основной части популяции митохондрий и защищает их от фрагментации, а общий уровень АФК в клетке не столь существенен для изменений морфологии митохондрий. Накопление АФК в клетке при окислительном стрессе может определяться небольшой субпопуляцией митохондрий с пониженным мембранным потенциалом (см. Рис. 1-3), которые очень медленно накапливают БкСЛ. Фрагментация митохондрий под действием внутренних АФК указывает на важную роль этого процесса в защите клетки от окислительного стресса. Во-первых, размыкание митохондриальной электрической сети делает ее более устойчивой к локальным повреждениям. Во-вторых, продолжительная фрагментация митохондрий служит первым шагом на пути к их элиминации в процессе митоптоза.
контроль
Концентрация, М
Б
Рис. 16. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают
фрагментацию митохондриального
ретикулума при окислительном стрессе в фибробластах человека. А - клетки инкубировали с БкСИ (2 нМ, 2 ч), затем добавляли Н2Ог (250 мкМ) и через 18 ч митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым. Б - зависимость действия антиоксидантов от их концентрации.
6.2. Митофагия и митоптоз.
Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе, вероятно, является
самым ранним этапом программы направленной на защиту клетки от митохондрий
с поврежденными функциями. Окислительный стресс, вызванный пероксидом
водорода или ингибиторами дыхательной цепи, приводил к обратимой
фрагментации митохондрий. Даже длительная инкубация в этих условиях не
вызывала дальнейших изменений морфологии митохондрий. Отмывка клеток от
ингибиторов дыхания или Н2О2 приводила к восстановлению митохондриальной
сети через 17-24 ч. Разобщители окислительного фосфорилирования ДНФ и
FCCP так же вызывали окислительный стресс (Рис. 17), фрагментации
митохондрий, их кластеризацию и деградации (Рис. 18А). Одновременно в клетке
резко падало содержание митохондриальных белков (Рис. 18Б).
Рис. 17. Разобщители окислительного ДНФ+ фосфорилирования усиливают
миксо окислительный стресс в клетках HeLa.
Клетки обрабатывали миксотиазолом (миксо., 2 мкМ), ДНФ (0,4 мМ), FCCP (10 FCCP+ мкМ) в течение 1 часа, затем промывали, миксо инкубировали с CM-DCF-DA (4 мкМ, 15 минут) и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра. Черный контур - контроль.
.11
миксо Г
ДНФ !
1 А
FCCP
Эффект разобщителей был, по-видимому, связан как со снижением мембранного потенциала, так и с ингибированием дыхания. РССР значительно более эффективен в качестве ингибитора дыхания и индуктора окислительного стресса, чем ДНФ (Рис. 17) и это коррелирует с его большей эффективностью, как индуктора митоптоза. Ингибиторы дыхания значительно ускоряют митоптоз, вызванный разобщителями. Таким образом, для запуска механизма деградации необходимо как повреждение дыхательной цепи митохондрий, так и снижение их мембранного потенциала. Инкубация клеток в течение 48-72 часов с ингибиторами дыхательной цепи в сочетании с разобщителями приводила к гибели 50-70% клеток. Оставшиеся в живых клетки, морфологически практически не отличались от контрольных, имели нормальную структуру ядра и не проявляли признаков апоптоза (таких как переселение белка ВАХ из цитозоля в митохондрии и выход цитохрома с в цитозоль) (рис. 19).
Mito-KYM* контроль Hoi4hst.U42
35
45
Б
Рис. 18. Деградация митохондрий при длительной инкубации с FCCP (10 мкМ). А - клетки HeLa были трансфецированы Mito-EYFP. Ядра окрашивали Hoechst 33342. Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм. Б - Вестерн-блот клеток HeLa после 7 сут инкубации с FCCP. Обозначения белков: HSP60, митохондриальный белок теплового шока, cyt с, цитохром с, COX(I), субъдинца I цитохромоксидазы, VDAC, порин локализованный как во внешней мембране митохондрий, так и в других мембранах клетки, tub, тубулин, использованный в качестве контроля нагрузки.
Митохондрии в клетках окрашивали разными способами: антителами к цитохромоксидазе (внутренняя мембрана митохондрий), к цитохрому с (белку локализованному в межмембранном пространстве), красителем митотракером зелёным, избирательно окрашивающим митохондрии независимо от мембранного потенциала; клетки также трансфецировали плазмидой кодирующей зелёный флуоресцентный белок, слитый с митохондриальным адресом восьмой субъединицы цитохромоксидазы (Mito-EYFP). Во всех случаях в клетках обработанных разобщителями и ингибиторами дыхательной цепи наблюдались крупные кластеры митохондрий. Структура актинового цитоскелета (Рис. 19) и микротрубочек (Рис. 20) остается нормальной даже через 96 часов инкубации с митохондриальными ядами, в условиях, когда митохондрии в клетке сильно деградированы. Эксперименты показали, что ингибирование актинового цитоскелета (с помощью цитохалазина) не оказывает влияния на кластеризацию митохондрий, а разрушение тубулинового цитоскелета (с помощью колцемида) даже ускоряет этот процесс. Таким образом, механизм кластеризации
актшДшнохром с
Рис. 19. Структура актиновых фипамвнтов и локализация митохондрий в клетках HeLa в процессе митоптоза.
Клетки обрабатывали FCCP (10 мкМ) в течение 96 ч, затем отмывали и культивировали 48 ч в среде без ингибиторов. Актин окрашивали фаллоидин-TRITC, а цитохром с с помощью специфических антител. Фотографии получены на конфокальном микроскопе LSM 510 (Cari Zeiss). Показаны оптические срезы одной клетки, сделанные через каждые 10 мкм. Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм.
Рис. 20. Структура митохондрий и системы микротрубочек после длительной инкубации с FCCP и миксотиазолом.
Митохондрии визуализированы с помощью плазмиды Mito-EYFP (А, В) или антител к цитохромоксидазе (Б, Г) Микротрубочки окрашены антителами к тубулину. Ядра окрашены Hoechst 33342. Клетки инкубировались 96 ч в присутствии 10 мкМ FCCP и 2 мкМ миксотиазола (В, Г) или без добавок (А, Б). Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм.
Milo-EYFt'/ тут тип Ilm. Оке/Hoechst
А J Б ■ i
В — г /
митохондрий, по-видимому, отличается от сборки «аггресом» (агрегатов продуктов протеасомной деградации белков), в которой цитоскелет принимает активное участие. Одним из возможных механизмов селективной деградации митохондрий может служить аутофагия. Известно, что с помощью этого механизма происходит регуляция количества и качества клеточных органелл. В ряде случаев было показано, что в клетках, подвергнутых стрессам, аутофагия участвует в селективной деградации митохондрий (т. наз. митофагия). В наших экспериментах было показано, что инкубация клеток с РССР и антимицином вызывает накопление, как лизосом, так и аутофагосом. Несмотря на повышение общего уровня аутофагии в клетке, мы не обнаружили колокализацию митохондриального материала с аутофагосомами. Кроме того, на электронных микрофотографиях клеток Не1_а, подвергнутых действию разобщителей и ингибиторов дыхания, также не было обнаружено аутофагии митохондрий (Рис. 21). Электронная микроскопия подтвердила отсутствие митохондрий в части клеток (Рис. 21 Б), а в ряде случаев в районе ядра видны образования окруженные мембраной и наполненные сферическими везикулами диаметром 50200 нм, а также другим электронно-плотным материалом (Рис. 21В). Подобное образование было названо митоптотическим тельцем. Когда митоптотическое тельце контактируют с внешней средой, плотность его содержимого резко снижается (рис. 21 Г). Видно, что содержимое митоптотического тельца отделено от внешней среды одной мембраной, причем в некоторых местах виден плотный контакт мембраны митоптотического тельца с внешней клеточной мембраной. В других случаях данный контакт отсутствует, и митоптотическое тельце выглядит как большая экзосома окружённая одной мембраной. Мембрана митоптотического тельца довольно нестабильна и при контакте с внешней средой может разрушаться, в этом случае её содержимое свободно выходит в среду.
В другой серии экспериментов проводились наблюдения за одной и той же клеткой, используя флуоресцентную и электронную микроскопию. Митохондрии в клетках, обработанных ДНФ в комбинации с антимицином, окрашивались митотракером зеленым, находили клетку с митоптотическим телом и далее фиксировали её для электронной микроскопии. Электронная микроскопия показала наличие в зоне, ярко окрашиваемой Митотракером зеленым, большого количества сферических мембранных везикул, иногда имеющих
Рис. 21. Анализ митоптоза с помощью электронной микроскопии. Контрольные клетки (А) и клетки обработанные 3 дня ДНФ (0,4 мМ) и 2 мкМ антимицина (Б) или 2 мкМ миксотиазола (В, Г). Митоптотическое тельце (МТ) располагается рядом с ядром (В) не контактируя с внешней клеточной мембраной. На рисунке Г стрелкой показан плотный контакт мембраны митоптотического тела с плазматической мембраной клетки. Масштаб 1 мкм (А,Б), 0,5 мкм (В-Г) и 0,2 мкм для вырезанной секции фото Г. Фотографии получены совместно с В.Б. Сапруновой и Л.Е. Бакеевой.
электронно-плотные включения и везикулы маленького диаметра. Это позволило заключить, что митоптотическое тельце заполнено митохондриальным материалом. Подобные же структуры окрашиваются антителами к цитохрому с, к цитохромоксидазе и к порину (белку внешней мембраны митохондрий), а следовательно все компартменты митохондрий, по-видимому, входят в состав митоптотического тельца.
Результаты экспериментов с использованием фазового контраста, флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии для наблюдения за одной и той же клеткой показаны на Рис. 22. Сканирование клетки с митоптотическим телом показало, что митоптотическое тело имеет крайне неровную, бугристую поверхность и сильно выпячивается из клетки (Рис. 22Б, В). В другом эксперименте в процессе фиксации препарата большая часть митоптотического тела была потерянна, а на его месте видна большая выемка на
внешней поверхности клетки (Рис. 22Д, Е). Полученные результаты указывают на то, что в клетках Не1-а в условиях, когда биоэнергетические функции митохондрий нарушены, реализуется эффективный способ защиты клетки, связанный с выбрасыванием поврежденных митохондрий в межклеточное пространство.
Мы исследовали судьбу клеток, которые избавились от своих митохондрий. После четырехдневной инкубации с ингибиторами в выживших клетках практически не обнаруживалось митохондриального материала и лишь изредка наблюдались мелкие плотные кластеры митохондрий. После двухнедельной инкубации в среде, не содержащей ингибиторов, некоторые клетки полностью восстанавливали структуру митохондриального ретикулума. Вероятно, несмотря на массовый митоптоз. индуцированный митохондриальными ядами, в клетке может оставаться небольшой «неприкосновенный» запас митохондрий, благодаря которому клетка может восстановить свои митохондрии. 7. Апоптоз, как защитный механизм при окислительном стрессе
В предыдущих разделах мы рассмотрели некоторые механизмы защиты клетки от дисфункции митохондрий при окислительном стрессе. В том случае, если все эти меры не предотвращают развитие окислительных повреждений, в клетке может быть индуцирована программа апоптоза - самоубийства клетки, призванного не допустить повреждения окружающей ткани. Митохондрии могут играть роль сенсоров измеряющих силу окислительного стресса и определяющих тот порог, за которым происходит индукция апоптоза. Кроме того митохондрии
Рис. 22. Фазовый контраст, флуоресцентная микроскопия и сканирующая электронная микроскопия клеток обработанных в течении 96 чДНФ (0,4 мМ) и антимицином (2 мкМ).
Митоптотическое тельце ярко окрашено Митотракером зелёным и отчетливо видно на фазовом контрасте (А, Г). Сканирующая микроскопия клетки с митоптотическим тельцем на поверхности (Б, В) и клетки с «кратером», оставшимся после того как митоптотическое тельце отделилось в процессе фиксации препарата. Масштаб, 15 мкм (А,Г) , 10 мкм (Б,
Д), 3 мкм (В, Е).
непосредственно участвуют в реализации программы апоптоза, и их состояние во многом определяет наступление момента необратимой гибели клетки. Центральную роль в процессе апоптоза, вызванного окислительным стрессом, играет продукция АФК в митохондриях описанная нами выше. Основными инструментами для изучения этих явлений, как и в предыдущих экспериментах, служили ингибиторы митохондриальных функций и митохондриально-направленные антиоксиданты (см. Рис. 7).
7. 1. Общие характеристики апоптоза, вызванного окислительным стрессом.
В качестве основной модели окислительного стресса в клетках Не1_а и в фибробластах мы использовали обработку Н202 в концентрациях 100 - 500 мкМ. Сходные результаты были получены при использовании в качестве прооксидантов менадиона, параквата (метилвиологена) и органических гидроперекесей. Мы обнаружили, что через 24 часа после добавки малых доз прооксидантов значительно возрастало количество клеток в в2/М фазе, что указывало на торможение клеточного цикла. При дальнейшей инкубации Н202 разлагался и происходило частичное восстановление клеточного цикла. Если
клетки HeLa культивировали при низкой плотности (конфлюэнтность 30-40%) то Н202 в концентрации 200 мкМ вызывал гибель 20-30% клеток через 17 часов после добавления. Эффект пероксида водорода значительно усиливался, если клетки предварительно инкубировали с ингибиторами дыхания пиерицидином или миксотиазолом, Преинкубация с митохондриально-направленным антиоксидантом (SkQ1, 20 нМ, 7 дн) предотвращала гибель клеток, но лишь в отсутствие ингибиторов дыхания (Рис. 23). Аналогичные эффекты наблюдались и для фибробластов человека, но защитное действие SkQ1 не требовало столь длительной инкубации (Рис. 24). Эти данные полностью коррелировали с измерениями уровня АФК в тех же клетках, обработанных Н202 (см. выше). Таким образом, гибель клеток при окислительном стрессе, вызванном Н2О2, определялась вторичной продукцией АФК в митохондриях.
Гибель клеток HeLa имела все признаки апоптоза: ядра имели
конденсированный и фрагментированный хроматин, ДНК была фрагментирована,
на поверхности клеток экспонировался фосфатидилсерин. Появления всех этих
признаков не наблюдалось в присутствии ингибитора каспаз zVAD-fmk. При
комбинации ингибиторов дыхания и Н202, наблюдалось появление большого
количества клеток с нарушенной целостностью внешней мембраны (окрашивание
йодистым пропидием), что является характерным признаком некроза.
Рис. 23. Гибель клеток HeLa вызванная Н202. Эффекты ингибиторов дыхательной цепи и SkQ 1.
Апоптотическая и некротическая гибель измерялась как на Рис. 5 через 17 ч после добавления Н202 (200 мкМ). Пиерицидин (пиер., 2 мкМ), миксотиазол (миксо., 2 мкМ) и zVADfmk (50 мкМ) добавляли за 1 час до Н202. Клетки инкубировали с 20 нМ SkQ1 в течение 7 дней, затем промывали и культивировали еще 24 ч.
В случае фибробластов некроз наблюдался и в отсутствие ингибиторов дыхания. В обеих моделях zVAD-fmk предотвращал развитие некроза, что указывало на его вторичную природу (Рис. 23).
|+5к<21
Концентрация хинонов нМ
Н20, (ССР Контроль
Рис.24. Эк01 и ЭкОМ предотвращают гибель фибробластов вызванную Н202. Фибробласты инкубировали с БкО в течение 24 ч, затем добавляли Н202 (0.3 мМ) и измеряли гибель клеток через 24 ч. А - С12ТРР, аналог ЭкО, лишенный антиоксидантной функции, Б - ЯССР (1 мкМ) добавлен одновременно с Бк01 (2 нМ).
Апоптоз в клетках Не1_а сопровождался перемещением белка ВАХ из цитоплазмы в митохондрии и выходом цитохрома с в цитоплазму (Рис. 25). Экспрессия антиапоптозного белка Вс1-2 предотвращала выход цитохрома с и защищала клетки Не1_а от гибели под действием Н202. В то же время перемещение ВАХ не тормозилась под действием Вс1-2. Эти данные показали, что перемещение ВАХ предшествует выходу цитохрома с из митохондрий при окислительном стрессе, что согласуется с результатами многочисленных исследований, проведенных на других моделях апоптоза.
7.2. Механизм запуска апоптоза при окислительном стрессе. Роль белка ВАХ.
Мы обнаружили, что уже через два часа после добавки Н202 фракция ВАХ в митохондриях увеличивается, а его содержание в цитоплазме снижается. Перераспределение ВАХ на эти сроки не сопровождалось выходом цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и проявлением других признаков апоптоза. Оказалось, что кратковременная преинкубацмя с Эк01 (20 нМ, 2 часа) предотвращает транслокацию ВАХ, вызванную окислительным стрессом (Рис. 26). Антиоксидант общего действия Тго1ох также обладал защитным действием, но в значительно больших концентрациях (0,1 мМ). Как и в случае фрагментации митохондрий, быстрое развитие эффекта вк01 указывала на то, что транслокация ВАХ определяется уровнем АФК внутри митохондрий. Этот вывод находится в кажущемся противоречии с представлениями о том, что ВАХ
получает сигнал, ведущий к транслокации, находясь в цитоплазме. Дальнейшие эксперименты позволили разрешить это противоречие.
Известно, что ВАХ при апоптозе взаимодействует с белками, локализованными в области контакта внешней и внутренней мембран митохондрий (комплекс «контактных сайтов»). Одним из белков, участвующих в образовании этого комплекса, является транслокатор адениновых нуклеотидов (ANT). Мы исследовали влияние конформации ANT на транслокацию ВАХ при окислительном стрессе, использовав ингибиторы ANT, бонгкрековую кислоту и атрактилозид, фиксирующие транслокатор в различных конформациях.
контроль
н2о2
н2о2+
миксо
ZVAD+
н2о2+
миксо
Рис. 25. Транслокация Sax в митохондрии и выход цитохрома с в цитоплазму под действием Н202.
Клетки HeLa обрабатывали Н202 (200 мкМ) и анализировали через 17 ч. ВАХ и цитохром с окрашивали с помощью специфических антител, а ядра с помощью Hoechst 33342. Миксотиазол и zVAD-fmk были добавлены как на Рис. 23. Стрелками показаны апоптозные клетки. Масштаб, 15 мкм.
Hoechst наложение
Контроль Н202 Н202+5к(31
Рис. 26. Накопление АФК в митохондриях вызывает перераспределение белка ВАХ в клетке.
Клетки Не1_а преинкубировали с ЭкСИ (2 нМ, 2 ч), затем обрабатывали Н202 (250 мкМ, 20 ч). Окраска, как на Рис. 25. Масштаб, 15 мкм.
Бонгкрековая Бонгкрековая
- ' г • Л
БкСЗИ-
Атрактилозид атрактилозид
Рис. 27. Конформация транслокатора адениновых нуклеотидов определяет локализацию ВАХ в клетках Не/_а.
А - клетки инкубировали с бонгкрековой кислотой (10 мкМ, 2 ч), затем добавляли Н202 (300 мкМ). Б - клетки инкубировали с Бк01 (2 нМ, 2 ч), затем добавляли атрактилозид (100 мкМ) и Н202 (300 мкМ). Клетки фиксировали через 24 ч и окпашивяли как на Рис. 25 Масштаб 4 мкм
Было обнаружено, что бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию ВАХ вызванную пероксидом водорода. Атрактилозид, напротив, вызывал транслокацию ВАХ на мембрану митохондрий в значительной части клеток в отсутствие Н202 и усиливал действие Н202 на транслокацию ВАХ. В присутствии атрактилозида SkQ1 уже не влиял на перемещение ВАХ (Рис. 27).
Ингибиторы ANT были использованы для изучения возможной взаимосвязи между транслокацией ВАХ и фрагментацией митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Несмотря на то, что бонгкрековая кислота предотвращала транслокацию ВАХ, она никак не влияла на фрагментацию митохондрий, вызванную Н202. Бонгкрековая кислота так же не подавляла апоптоз, вызванный Н202 в клетках HeLa. Можно полагать, что транслокация ВАХ при окислительном стрессе не является необходимым условием для фрагментации митохондрий и для апоптоза. По-видимому, в митохондриях существуют и иные мишени для действия АФК, ответственные за эти процессы.
Поскольку атрактилозид способствует открытию циклоспорин-чувствительной митохондриальной поры, а бонгкрековая кислота ее закрытию, мы исследовали роль поры в транслокации ВАХ. Для этого были использованы ингибиторы митохондриальной поры циклоспорин А и его аналог Ы-метил-4-изолейцин-циклоспорин, обладающий более селективным действием. Было показано, что оба ингибитора не влияют на изменение локализации ВАХ при окислительном стрессе. Следовательно, определяющим фактором в транслокации ВАХ является конформация ANT, а не состояние поры. Этот вывод согласуется с данными, полученными на частично очищенных препапратах «контактных сайтов», где изменение конформации ANT вызывало изменение сродства ВАХ к комплексу в целом (Vyssokikh et al., 2002). Известно, что окисление дитиола на матриксной стороне молекулы ANT может приводить к изменению его конформации, подобно атрактилозиду. Возможно, окислительный стресс вызывает окисление этого дитиола, что и приводит к увеличению сродства ANT к ВАХ. SkQ1, в таком случае, мог бы предотвращать транслокацию ВАХ, защищая дитиол ANT от окисления. Таким образом, молекула транслокатора адениновых нукпеотидов может играть роль сенсора, чувствительного к АФК внутри митохондрий и инициирующего апоптоз при окислительном стрессе.
7.3. Митохондриапьные АФК участвуют в передаче апоптозного сигнала
между клетками
Изучая апоптоз клеток Не1.а, вызванный пероксидом водорода, мы обратили внимание на то, что апоптозные клетки распределяются в монослойной культуре клеток не случайным образом, а формируют кластеры из близкорасположенных клеток. Это указывает на наличие сигнала, передающегося от погибающих клеток к соседним клеткам и способного вызывать их гибель. Для проверки этой гипотезы мы использовали модель, в которой были исключены прямые межклеточные контакты. Клетки-индукторы и клетки-реципиенты растили на двух разных стеклах в разных чашках, далее одно из стекол обрабатывали Н202, и после инкубации и промывки помещали рядом с другим стеклом в общую чашку Петри в среде, содержавшей ингибитор каталазы, аминотриазол. В этих условиях после 18 ч совместной инкубации наблюдался значительный апоптоз в клетках-реципиентах (Рис. 28). Длительная инкубация клеток-реципиентов с Бк01 (20 нМ, 7 дн) предотвращала их гибель. Эти данные указывали на то, что именно Н2О2 является сигнальной молекулой в этой модели.
Далее мы использовали другой индуктор клеточной гибели - фактор некроза опухоли (ФНО). На Рис. 29 показаны результаты опыта, в котором клетки-индукторы инкубировали Зч с ФНО в комбинации с ингибитором синтеза белка, эметином (необходимым для индукции апоптоза), промывали, помещали рядом с клетками-реципиентами и продолжали инкубацию в течение 17ч. Что бы исключить возможный эффект перераспределения молекул ФНО между стеклами, совместную инкубацию проводили в присутствии моноклональных антител к ФНО. Добавление в среду инкубации каталазы (фермента, специфически разлагающего Н202) эффективно подавляло апоптоз клеток на стекле-реципиенте и при этом не влияло на апоптоз клеток на стекле-индукторе (Рис. 29А).
Для проверки возможной роли митохондрий в продукции Н202 при передаче апоптозного сигнала от клеток обработанных ФНО был использован БкСИ. Передача сигнала апоптоза была подавлена, как при обработке с помощью вк01 индуктора, так и реципиента. В то же время, ЭкСИ практически не влиял на развитие ФНО - зависимого апоптоза на стекле индукторе (Рис. 29Б).
Измерения уровня Н202 в среде инкубации показали его заметное повышение через 1-4,5 ч после совмещения стекол. Обработка клеток-индукторов
с помощью БкСЛ снижала уровень Н2Ог, в то время, как обработка реципиентных клеток не давала эффекта (Рис. 30).
♦ SkQl
t} л
llJlli
: индуктор | реципиент
I I
без добавок аитителак ФНО каталаэа контроль
Рис. 28. Передача сигнала апоптоза от клеток обработанных Н202.
Клетки Не1_а обрабатывали 50 мкМ Н202 3 раза с интервалом в 1 ч и промывали. Клетки-реципиенты совмещали с клетками-индукторами на 8 ч. В среде присутствовал аминотриазол (7 мМ). вкСЛ (20 нМ) был добавлен к клеткам-реципиентам за 7 сут до совмещения стекол и затем присутствовал в течение 18 ч совместной инкубации (черные столбики).
100 90 40
гН
SkQl в SkQl в контроль индухторе реципиенте
Рис. 29. Передача сигнала апоптоза от клеток, обработанных ФНО (10 нг/мл) и эметином (1 мкМ), к интактным клеткам.
Апоптоз определяли через 24 ч после совмещения стекол. А - моноклональные антитела к ФНО (700 нг/мл) были добавлены одновременно с ФНО (штрихованный столбик) или после совмещения стекол. Каталаза (2500 Е/мл) была добавлена в среду инкубации при совмещении стекол. Б - клетки (индукторные или реципиентные) инкубировали с SkQ1 (20 нМ) в течение 7 дн.
Полученные данные позволяют предполагать, что основным фактором передачи сигнала апоптоза между клетками является пероксид водорода, который образуется в митохондриях и выходит во внеклеточную среду. Проникая в реципиентные клетки, Н202 вызывает накопление АФК при участии митохондрий и эти «вторичные» АФК, в свою очередь, инициируют апоптоз (Схема. 3). Описанный выше механизм межклеточной передачи сигнала апоптоза может играть важную роль в защите органов и тканей от повреждения.
часы
Рис. 30. Накопление Н202 в экспериментах по передаче сигнала апоптоза. Клетки обрабатывали ФНО и БкСЛ как на Рис. 29. А - содержание Н202 и алоптозных клеток-индукторов. Б - Бк01 снижает концентрацию Н202 в среде совместного роста клеток. Данные получены совместно с М.Ю. Высоких.
Апоптоз относительно небольшого числа клеток вокруг первичного очага поражения должен препятствовать распространению повреждающего воздействия на более значительные области ткани. Аналогичный способ защиты существует у высших растений, где гибель клеток вокруг очага заражения вирусами или микробами препятствует распространению патогена. Интересно, что ведущую роль в передаче сигнала о гибели в этом случае так же играет пероксид водорода.
Схема 3. Передача сигнала апоптоза между клетками.
В процессе апоптоза (вызванного, например, ФНО или Н202) в клетках-индукторах (стадии 1-3) происходит генерация Н202 внутри митохондрий (стадия 4). В цитозоле клетки Н202 усиливает апоптозные процессы (стадия 5), а, выйдя во внеклеточную среду (стадия 6) атакует клетку-реципиент (стадия 7). В клетке-реципиенте Н202 проникает в митохондрии (стадия 8) и стимулирует в них продукцию Н202 (процесс, аналогичный стадии 4), что приводит к развитию апоптоза.
БкСИ ингибирует продукцию Н202 в митохондриях (9) и предотвращает как выработку, так и восприятие сигнала апоптоза. Разобщитель окислительного фосфорилирования РССР предотвращает накопление 5к(31 в митохондриях и его защитное действие (10).
Заключение
Проведенные нами исследования раскрыли сложную многоступенчатую систему защиты клеток от повреждений, связанных с дисфункцией митохондрий. Эта система включает молекулярные механизмы, предотвращающие непродуктивный гидролиз АТР и антиоксидантные ферменты, призванные нейтрализовать угрозу и справляющиеся с этой задачей при нормальном функционировании клетки. При стрессовых воздействиях и при различных патологических состояниях этой защиты оказывается недостаточно и в клетке включаются механизмы, направленные на элиминацию поврежденных митохондрий (митоптоз). Если эти усилия не обеспечивают нормальное функционирование клетки, то запускается апоптоз. Даже кратковременное и неполное снижение уровня АТР индуцирует клеточное самоубийство. Избыточная продукция АФК в митохондриях так же является сигналом к апоптозу. По-видимому, дисфункция митохондрий опасна не только для жизни клетки, но и для организма в целом; чревата нарушением функций клетки и их перерождением. Наши результаты свидетельствуют о том, что митохондрии служат важнейшим сенсором, способным инициировать апоптоз. Митохондрии, по-видимому, способны воспринимать разнородные сигналы, поступающие из внеклеточной среды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как при физических стрессах) и от других клеточных структур (таких как ядро, цитоскелет, ретикулум и др.), суммировать их, перерабатывать с учетом особых про- и анти- апоптотических механизмов и выдавать унифицированный сигнал, который может практически неизбежно вести к гибели клетки. Более того, выработка АФК в митохондриях участвует в формировании межклеточного сигнала, вызывающего коллективное самоубийство окружающих клеток. Этот защитный механизм должен препятствовать распространению повреждающего воздействия на более значительные области ткани. Описанные нами многочисленные защитные механизмы ослабевают при старении и оказываются неэффективны при развитии различных патологий. Кроме того, чрезмерные защитные реакции (в частности индивидуальный и коллективный апоптоз) могут лежать в основе нарушения жизненных функций организма. Описанные в нашей работе митохондриально-направленные антиоксиданты могут стать важнейшим оружием в борьбе с патологиями, связанными с дисфункцией митохондрий.
Выводы
1. Показано, что при повреждении мембраны митохондрий активируются два механизма регуляции митохондриальной АТР синтазы: образование неактивного комплекса с ADP и переход комплекса с белком-ингибитором в неактивное состояние. Эти механизмы способны эффективно тормозить непродуктивный гидролиз АТР в митохондриях.
2. Временное и неполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток.
3. Показано, что при окислительном стрессе митохондрии служат основным источником активных форм кислорода (АФК).
4. Показано, что окислительное повреждение приводит к открытию неселективной циклоспорин-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий. Открытие поры контролируется уровнем восстановлености глутатиона и NAD(P)H в митохондриях.
5. Накопление АФК в митохондриях приводит к их обратимой фрагментации и распаду единой электрической митохондриальной сети.
6. Продолжительное повреждение митохондрий ведет к их элиминации (митоптозу). При массовом повреждении митохондрии формируют крупные кластеры в перинуклеарной области, которые затем выбрасываются из клетки по механизму сходному с экзоцитозом.
7. Накопление АФК в митохондриях при окислительном стрессе приводит к индукции апоптоза. Инициация апоптоза связана с перемещением белка ВАХ из цитоплазмы в митохондрии. Этот процесс зависит от окисления транслокатора адениновых нукпеотидов во внутренней мембране митохондрий.
8. Образование АФК в митохондриях приводит к выработке межклеточного сигнала, вызывающего алоптоз окружающих клеток.
9. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты в наномолярных концентрациях защищают митохондрии от окислительного повреждения и фрагментации, предотвращают апоптоз при окислительном стрессе и выработку межклеточного апоптозного сигнала.
Основные публикации.
I. Черняк Б.В., Козлов И.А. Локализация каталитического центра Н+-АТФазы в митохондриальной мембране. ДАН ССР (1976) 231,222-225.
2 .Козлов И.А., Черняк Б.В. Взаимодействие бифункциональных сшивающих реагентов с растворимой митохондриальной АТФазой. ДАН ССР (1978) 238, 1479-1482.
3. Chernyak, B.V., Kozlov, I.A. Adenilylimidodiphosphate release from the active site of submitochondrial particles ATPase. FEBS Lett., (1979) 104, 215-219.
4. Chernyak V.Ya., Kozhanova Z.E., Chernyak B.V., Kozlov I.A. Investigation of soluble mitochondrial ATPase by the reacting enzyme. Eur. J. Biochem. (1979) 98, 585-589.
5. Chernyak, B.V., Chernyak, V.Ya.. Gladysheva, T.B., Kozhanova, Z.E., Kozlov, I.A. Structural rearrangements in soluble mitochondrial ATPase. Biochim. Biohys. Acta, (1981) 635, 552-570.
6. Козлов И.А., Черняк Б.В. Мембранный потенциал и синтез АТР на сопрягающих мембранах. Успехи Биол. Химии (1983) 24, 65-82 (Обзор).
7. Гладышева Т.Б., Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Исследование влияния мембранного потенциала на скорость гидролиза АТФ в субмитохондриальных частицах. ДАН ССР (1984) 276,980-983.
8. Chernyak B.V., Khodjaev E.Yu., Kozlov I.A. The oxidation of sullliydryl groups in mitochondrial Fl-ATPase decreases the rate of its inactivation by the natural protein inhibitor. FEBS Lett. (1985) 187,253-256.
9. Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Редокс регуляция взаимодействия митохондриальной Н+-АТРазы с природным белковым ингибитором. ДАН СССР (1985) 281,1482-1484.
10. Chernyak B.V. Kozlov I.A. Regulation of H+-ATPases in oxidative phosphorylation and photophosphorylation. Trends in Biochem Sci. (1986) 11,32 - 39 (Обзор).
II. Духович В.Ф., Козлов И.А., Левит М.Н., Ходжаев ЕЮ., Черняк Б.В. Почему преинкубация митохондрий гепатомы с разобщителями вызывает снижение АТРазной активности. Биол. Мембр. (1986) 3, 506-512.
12. Черняк Б.В., Духович В.Ф., Ходжаев Е.Ю. Что определяет скорость гидролиза АТР в митохондриях. ДАН СССР (1987) 294,497-499.
13. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The effect of the natural protein inhibitor on H+-ATPase |in hepatoma 22a mitochondria. FEBS Lett. (1987) 215, 300-304.
14. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The interaction of MgADP with H+ -ATPase in rat liver mitochondria. FEBS Lett. (1988) 230, 159-162.
15. Гладышева Т.Б., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Влияние дельта мю Н+ на скорость гидролиза АТР в субмитохондриальных частицах. Биол. Мембр. (1989) 6, 159-166.
16. Chernyak B.V., Khodjaev E.Y. Energization of the membrane prevents the formation of tight inactive complexes of ATPase with MgADP in submitochondrial particles. FEBS Lett., (1989) 254, 79-82.
17. Bronnikov G.E., Vinogradova S.O., Chernyak B.V. Regulation of ATP hydrolysis in liver mitochondria from ground squirrel. FEBS Lett. (1990) 266. 83-86
18. Khodjaev E.Yu., Komamitsky F.B., Capozza G., Dukhovich V.F., Chernyak B.V., Papa S. Activation of a complex of ATPase with the natural protein inhibitor in submitochondrial particles. FEBS Lett. (1990) 272, 145-148.
19. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. Regulation of ATP hydrolysis in hepatoma 22a mitochondria. Arch Biochem Biophys, (1991) 286, 604-609.
20. Chernyak B.V., Cross R.L. Adenine nucleotide-binding sites on mitochondrial Fj -ATPase. Studies of the inactive complex formed upon binding ADP at a catalytic site. Arch. Biochem. Biophys. (1992) .295,247-252.
21. Rouslin W., Broge C.W., Chernyak B.V. Za2* allows differentiation between two kinds of IFl-ATPase interaction in intact mitochondria. Ann.N.Y. Acad. Sci. (1992) 671, 507-508.
22. Rouslin W., Broge C.W., Chernyak B.V. Effects of Zn2+ on the activity and binding of the mitochondrial ATPase inhibitor protein.. J. Bioenerg. Biomembr. (1993) 25,297-306.
23. Chernyak B.V., Dedov V.N., Gabai V.L. Mitochondrial ATP hydrolysis and ATP depletion in thymocytes and Ehrlich ascite carcinoma cells. FEBS Lett. (1994) 337, 56-59.
24. Дедов B.H., Габай В.Л., Черняк Б.В. Действие белкового ингибитора митохондриальной АТРазы в интакгных тимоцитах крысы и клетках асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия (1995) 60, 1138-1145.
25. Chernyak B.V., Dedov V.N., Chernyak V.Ya. Ca2+ -triggered membrane permeability transition in deenergised mitochondria from rat liver. FEBS Lett. (1995)365, 75-78.
26. Chernyak B.V., Sigalat C., Diolez P., Haraux F. Enzyme turnover is essential for deactivation of FaFi in plant mitochondria. Bichim. Biophys. Acta (1995) 1229, 121-128.
27. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P. Selective inhibition of the mitochondrial permeability transition pore at the oxidation-reduction sensitive dithiol by monobromobimane. FEBS Lett. (1995) 362,239-242.
28. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore by pyridine nucleotides and dithiol oxidation at two separate sites. J. Biol. Chem. (1996) 271, 6746-6751.
29. Chernyak, B.V. Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore is modulated by oxidative agents through both pyridine nucleotides and glutathione at two separate sites. Eur. J. Biochem. (1996) 238, 623-630.
30. Starkov A.A., Bloch D.A., Chernyak B.V., Dedukhova V.I., Mansurova S.E., Severina 1.1., Simonyan R.A., Vygodina T.V., Skulachev V.P. 6-Ketocholestanol is a recoupler for mitochondria, chromatophores and cytochrome oxidase proteoliposomes.. Biochim. Biophys. Acta (1997) 1318, 159-172.
31. Chernyak B.V. Redox regulation of the mitochondrial permeability transition pore. Biosc. Rep. (1997) 17, 293-302 (Обзор).
32. Chernyak B.V. Cyclosporin A - sensitive release of Ca2+ from mitochondria in intact thymocytes. FEBS Lett. (1997) 418, 131-134.
33. Дедов B.H., Демин О. В., Черняк В. Я., Черняк Б. В. Индукция неселективной проницаемости внутренней мембраны в дезнергизованных митохондриях. Биохимия (1999) 64, 809-816.
34. Черняк Б.В. Индукция неселективной митохондриальной поры в лимфоидных клетках. 1. Пермеабилизованные тимоциты крысы. Биохимия (1999) 64, 916-921.
35. Черняк Б.В. Индукция неселективной митохондриальной поры в лимфоидных клетках. 2. Интактные тимоциты крысы. Биохимия (1999) 64, 922-928.
36. Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Черняк Б.В., Скулачев В.П., Васильев Ю.М. Действие ингибиторов цитоскелета на развитие апоптоза, вызванного фактором некроза опухолей Биохимия (2003) 67, 737-746.
37. Щепина Л.А., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В. Апоптоз клеток HeLa и антиалоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия (2002) 67, 265-270.
38. Shchepina L.A., Pletjushkina O.Yu., Avetisyan A.V., Bakeeva L.E., Fetisova E.1C., Izyumov D.S., Saprunova V.B., Vyssokikh M. Yu., Chernyak B.V., Skulachev V.P Oligomycin, inhibitor of the F0 part of H+-ATP-synthase, suppresses the TNF induced apoptosis. Oncogene (2002) 21, 8149-8157.
39. Abdullaev Z.Mi., Bodrova M.E., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Kluck R.M., Pereverzev M.O., Arseniev A.A., Efremov R.G., Kirpichnikov M.P., Mokhova E.N., Newmeyer D.D., Roder H., Skulachev V.P. A cytochrome с mutant with high electron transfer and antioxidant activities but devoid of apoptogenic effect. Biochem. J. (2002) 362, 749-754.
40. Skulachev V P., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Domnina L.V., Minin A.A., Pletjushkina O.Y., Saprunova V.B., Skulachev I.V., Tsyplenkova V.G., Vasiliev J.M., Yaguzhinsky L.S., Zorov D.B. Thread-grain transition of mitochondrial reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis. Mol. Cell. Biochem. (2004) 256-257,341-358 (Обзор).
41. Lyamzaev K.G., Izyumov D.S., Avetisyan A.V., Yang F., Pletjushkina О. Y., Chernyak B.V. Inhibition of mitochondrial bioenergetics: the effects on structure of mitochondria in the cell and on apoptosis. Acta Biochim. Pol. (2004) 51, 553-562.
42. Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Y., Saprunova V.B., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Selective elimination of mitochondria from living cells induced by inhibitors of bioenergetic functions. Biochem. Soc. Trans. (2004) 32, 1070-1071.
43. Izyumov D.S., Avetisyan A.V., Pletjushkina O.Y., Sakharov D.V., Wirtz K.W., Chernyak B.V., Skulachev V P. "Wages of fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biochim. Biophys. Acta (2004) 1658, 141-147.
44. Domnina L.V., Ivanova O.Y., Pletjushkina O.Y., Fetisova EX., Chernyak B.V., Skulachev V.P., Vasiliev J.M. Marginal blebbing during the early stages of TNF-induced apoptosis indicates alteration in actomyosin contractility. Cell Biol. Int. (2004) 28, 471-475.
45. Pletjushkina O.Y., Fetisova E.K., Lyamzaev K.G., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Vyssokikh M.Y., Pustovidko A.V., Vasiliev J.M., Murphy M.P., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Longdistance apoptotic killing of cells is mediated by hydrogen peroxide in a mitochondrial ROS-dependent fashion. Cell Death Differ. (2005) 12, 1442-1443.
46. Sakharov D.V., Elstak E.D., Chernyak B.V., Wirtz K..W. Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with oxidation-sensitive probe CI 1-BODIPY581/591. FEBS Lett. (2005)579, 1255-1260.
47. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Astapova M.V., Dedukhova V.l., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Arseniev A S., Skulachev V.P., Kirpichnikov M.P. Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome с mutants in living cells. Apoptosis (2005) 10, 797-808.
48. Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Изюмов Д.С., Лямзаев К Г. , Аветисян A.B. Биоэнергетика и смерть. Биохимия (2005) 70,240-245 (Обзор).
49. Плетюшкина О.Ю., Фетисова Е.К., Лямзаев К.Г., Иванова О.Ю., Домнина Л.В., Высоких М.Ю., Пустовидко A.B., Алексеевский A.B., Алексеевский ДА., Васильев Ю.М., Мерфи М.П., Черняк Б.В., Скулачев В.П. Перекись водорода, продуцируемая в митохондриях участвует в передаче сигнала апоптоза между клетками. Биохимия (2006) 71, 60-67.
50. Pletjushkina O.Y., Lyamzaev KG., Popova E.N., Nepryakhina O.K., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum. Biochim Biophys Acta. (2006) 1757, 518-524.
51. Chernyak B.V., Izyumov D.S., Lyamzaev K.G., Pashkovskaya A.A., Pletjushkina O.Y., Antonenko Y.N., Sakharov D.V., Wirtz K.W., Skulachev V.P. Production of reactive oxygen species in mitochondria of HeLa cells under oxidative stress. Biochim. Biophys. Acta. (2006) 1757, 525-534.
52. Chertkova R.V., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Latypov R.F., Chernyak B.V., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Proapoptotic activity of cytochrome с in living cells: effect of K72 substitutions and species differences. Mol. Cell Biochem. (2008) 314, 85-93.
53. Lyamzaev K.G. Nepryakhina O.K.,Saprunova V.B., Bakeeva L.E., Pletjushkina O.Y., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Novel mechanism of elimination of malfunctioning mitochondria (mitoptosis): formation of mitoptotic bodies and extrusion of mitochondrial material from the cell Biochim. Biophys. Acta. (2008) 1777, 817-825.
54. Непряхина O.K., Кузнецова А.Ю., Лямзаев К.Г., Изюмов Д.С., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Скулачев В.П. Активные формы кислорода, генерируемые в митохондриях,
индуцируют фрагментацию митохондриального ретикулума в клетках HeLa. Доклады РАН (2008) 420, 559-561.
55. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Еакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина J1.B., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина O.K., Пашковская А.А., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко А.В., Рогинский
B.А., Рокитская Т.И., Рууге Э.К., Сапрунова В.Б., Северина И.И., Симонян Р.А., Скулачев И.В., Скулачев М.В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлигский В Н., Васильев Ю.М., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замэтнин А.А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное с митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. Биохимия (2008) 73, 1587-1604.
56. Агапова Л.С., Черняк Б.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Ефименко А.Ю., Фетисова Е.К., Иванова, О.Ю., Калинина Н.И., Личиницер М.Р., Лукашев А.Н., Хромова Н.В., Копнин Б.П., Коротецкая М.В., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н., Шагиева Г.С., Скулачев М.В., Степанова Е.В., Титова Е.В., Ткачук В.А., Васильев Ю.М., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное с митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 3. SkQl подавляет развитие опухолей из р53-дефицитных клеток (2008) Биохимия, 73, 1620-1638.
57. Antonenko Y.N., Roginsky V.A., Pashkovskaya А.А., Rokitskaya T.I., Kotova E.A, Zaspa A.A., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Protective effects of mitochondria-targeted antioxidant SkQ in aqueous and lipid membrane environments. J. Membr. Biol. (2008) 222,141-149.
58. Skulachev V.P., Anisimov V.N., Antonenko Y.N., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Erichev V.P., Filenko O.F., KalininaN.I., Kapelko V.I., Kolosova N.G., Kopnin B.P., Korshunova G.A., Lichinitser M.R., Obukhova L.A., Pasyukova E.G., Pisarenko O.I., Roginsky V.A., Ruuge E.K., Senin I.I., Severina I.I., Skulachev M.V., Spivak 1.М., Tashlitsky V.N., Tkachuk V.A., Vyssokikh M.Y., Yaguzhinsky L.S., Zorov D.B. An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach. Biochim. Biophys. Acta (2009) 1787,437-461 (Обзор).
59. Муфазалов И.А., Пеньков Д.Н., Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Высоких М.Ю., Кирпичников М.П., Долгих Д А., Круглое А.А., Купраш Д.В., Скулачев В.П., Недоспасов
C.А. Получение и характеристика мышиных эмбриональных фибробластов с мутацией K72W в соматическом гене цитохромас. (2009) Мол. Биол. 43,648-656.
60. Fetisova Е.К., Avetisyan A.V., Izyumov D.S., Korotetskaya M.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Mitochondria-targeted antioxidant SkQRl selectively protects MDR (Pgp 170)-negative cells against oxidative stress. (2009) FEBS Lett. 584, 562-566.
61. Изюмов Д.С., Домнина Л.В., Непряхина O.K., Аветисян A.B., Голышев С.А., Иванова О.Ю., Коротецкая М.В., Лямзаев К.Г., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н., Черняк Б.В. Митохондрии как источники активных форм кислорода при окислительном стрессе. Исследование с помощью новых митохондриально-направленных антиоксидантов на основе «ионов Скулачеква». (2010) Биохимия 75,149-157.
62. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Егоров М.В., Иванова О.Ю., Ильинская О.П., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н, Сахаров И.Ю., Федоров А.В., Черняк Б.В.. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты на основе «ионов Скулачева» ускоряют заживление кожных ран у животных. (2010) Биохимия 75,274-280.
Подписано в печать: 01.07.2010
Заказ № 4075 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Черняк, Борис Викторович
Актуальность проблемы.
В последние десятилетия мы стали свидетелями революции в митохондриологии. Привычное, вошедшее в учебники представление о митохондриях, как об энергетических станциях клетки, производящих АТР с помощью сложных машин, общие принципы действия которых известны (хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на расплывчатый образ «ящика Пандоры», в который заключены факторы, определяющие судьбу клетки. В прежней парадигме роль митохондрий в развитии патологий' ограничивалась нарушением энергообеспечения при токсических игипоксических повреждениях и при редких генетических нарушениях. Теперь на передний план вышли «побочные» процессы, в которых участвуют митохондрии, такие^как продукция активных форм кислорода (АФК), нарушение внутриклеточной передачи сигналов и, наконец, выход из митохондрий в цитоплазму белков, вызывающих программированную гибель клетки (апоптоз). Неканонические функции митохондрий, как правило, связаны с нарушением их биоэнергетических функций и избыточной продукцией АФК, что является серьезной угрозой для жизни клетки.
Синтез АТР в митохондриях легко обратим. При повреждении мембраны митохондрий, ведущем к снижению мембранного потенциала, протонная АТРсинтаза (FoF-i-АТРаза) катализирует гидролиз АТР не сопряженный с совершением полезной работы. Учитывая высокую активность этого фермента, полный гидролиз клеточной АТР мог бы занять лишь несколько минут и привести к необратимым последствиям. Наши исследования показали, что на разных уровнях организации клетки существуют защитные механизмы, предотвращающие гидролиз АТР и последствия падения уровня АТР в клетке.
В митохондриях сосредоточено дыхание клетки, которое неизбежно сопряжено с «утечкой» электронов (одноэлектронным восстановлением кислорода) и образованием супероксид-радикала. Супероксид быстро дисмутирует с образованием пероксида водорода (наиболее долгоживущего представителя АФК), который может дать начало более активным АФК (прежде всего гидроксил-радикалу) в реакции Фентона. Кроме того, супероксид, реагируя с N0, вызывает образование активного радикала пероксинитрила. Все АФК, образуемые в митохондриях, чрезвычайно опасны для клетки и в норме их продукция уравновешена различными антиоксидантными системами, которые находятся как в митохондриях, так и в цитоплазме. Повреждение митохондрий чревато избыточной продукцией АФК, с которой антиоксидантные системы не ■ справляются. Наши исследования были направлены на изучение защитных механизмов способных защитить клетку в этих условиях.
Выраженная дисфункция митохондрий может оказаться несовместимой с нормальным функционированием клетки. Поврежденная клетка представляет опасность, как для окружающей ткани, так и для организма в целом. Основным механизмом защиты в, этом случае является апоптоз, позволяющий элиминировать клетку с минимальным ущербом для ее окружения. Наши результаты свидетельствуют о том, что митохондрии не только участвуют в реализации программы апоптоза, но и служат важнейшим сенсором, способным инициировать апоптоз.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий"
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы было исследование механизмов защиты клетки от дисфункции митохондрий, которая связана с непродуктивным гидролизом АТР и окислительным повреждением, а также разработка и испытание новых препаратов, действие которых направлено на митохондрии. Задачи исследования:
1) Изучение молекулярных механизмов, блокирующих гидролиз АТР при повреждении митохондрий;
2) Изучение роли митохондрий в развитии окислительного стресса;
3) Изучение защитной программы, направленной на элиминацию поврежденных митохондрий (митоптоза);
4) Исследование; апоптоза; вызванного дисфункцией« митохондрий; как защитной программы;
5) Разработка и. испытания новых; митохондриально-направленных антиоксидантов.
Научная новизна работы.
В работе; исследованы защитные системы, позволяющие уменьшить разрушительные- последствиям дисфункции? , митохондрий; Проведено; систематическое изучение' этих систем на молекулярном^ уровне; на? изолированных митохондриях и наяслетках в культурен
Показано; что; в> митохондриях; существуют механизмы, которые эффективно тормозят непродуктивный гидролиз АТР. Даже; временное и-неполное снижение уровня* АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток, защищая от повреждения окружающую ткань.
Показано; что при окислительном'стрессе митохондрии служат основным источником активных^ форм кислорода- (АФК). Наряду с антиоксидантными1 системами: клетка использует для; защиты от стресса программу элиминации поврежденных митохондрий- (митоптоз)^ которая; включает; открытие; неселективныхг пор:; во; внутренней мембране митохондрий; их. фрагментацию и; механизм элиминации, сходный с экзоцитозом.
Показано, что накопление АФК в митохондриях может инициировать апоптоз и вести в выработке сигнала, вызывающего; апоптоз окружающих клеток. При патологических- процессах; эта защитная, программа может усиливать, повреждение тканей и органов: Установлено, что, новые митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно блокируют накопление АФК, апоптоз и выработку межклеточного сигнала апоптоза при окислительном стрессе:
Научно-практическое значение работы.
Проведенные исследования открывают новые фундаментальные клеточные механизмы, лежащие в основе патологий, связанных с дисфункцией < митохондрий и с развитием окислительного стресса. Понимание этих механизмов; указывает новые пути для разработки терапевтических подходов и лекарственных средств. Проведенные испытания новых митохондриально-направленных антиоксидантов показали перспективность их применения1 при- инфарктах, инсультах и нейродегенеративных заболеваниях.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При повреждении мембраны митохондрий активируются механизмы регуляцииf митохондриальной' АТР синтазы, способные эффективно' тормозить непродуктивный гидролиз АТР.
2. Временное и неполное снижение уровня» АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток.
3. При окислительном стрессе митохондрии служат основным источником активных форм кислорода (АФК).
4. Для защиты от окислительного стресса клетка может использовать программу элиминации поврежденных митохондрий (митоптоз), которая включает открытие неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, их фрагментацию и механизм элиминации, сходный с экзоцитозом.
5. Накопление АФК в митохондриях может инициировать апоптоз и вести в выработке сигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно блокируют эти процессы.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на Школах-конфер.енциях по биоэнергетике (1976-1990гг), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1980-2007гг), европейских биоэнергетических конференциях ЕВЕС (Валенсия, 1994, Лювен, 1996, Брайтон, 2000, Пиза 2004, Москва, 2006, Дублин, 2008), европейских конференциях по апоптозу ECDO (2005, 2006, 2007, 2008), конгрессах FEBS 1984, 2004 и IUBMB 2006.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 62 печатных работах (включая 6 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.
РЕЗУЛЬТАТЫ ^ОБСУЖДЕНИЕ
1е. Нарушение биоэнергетических функций митохондрий в клетке
Причиной дисфункции < митохондрий в клетке могут служить как» внешние воздействия, так и процессы, протекающие внутри клетки. Классическим примером служит терморегуляторное • разобщение открытое В. ГН Скулачевым*в 1960г. Возникающая при участии разобщающих^ белков и жирных кислот протонная проводимость внутренней мембраны митохондрий ведет к свободному окислению субстратов, энергия которого рассеивается в виде тепла. Кратковременное нарушение окислительного фосфорилирования характерно для возбудимых клеток, таких как нейроны. В таких клетках снижение мембранного потенциала (деполяризация) митохондрий происходит в областях, где проведение сигналов связано с резким повышением концентрации« Са2+ в цитоплазме.
Мы исследовали состояние митохондрий в фибробластах человека и в клетках карциномы HeLa, используя специфические потенциал-чувствительные флуоресцентные зонды (Митотрекер красный, TMRMt и др.). Одновременно митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым, который, накапливается' в митохондриях независимо от мембранного потенциала. Накапливаясь в митохондриях, TMRM тушит флуоресценцию Митотрекера* зеленого, а в деполяризованных митохондриях она остается высокой. Этот подход позволил-выявить митохондрии с пониженным потенциалом, определить их содержание и локализацию в клетке. В фибробластах основная часть деполяризованных митохондрий расположена в ламеллярной области вблизи от активного края (Рис. 1). Возможно, в этой области митохондрии выполняют какие-то сигнальные функции.
В двух исследованных линиях клеток карциномы содержание деполяризованных митохондрий было значительно ниже, чем в фибробластах и они были локализованы как на периферии, так и в перинуклеарной области клетки (Рис. 2, 3). Непосредственные причины деполяризации нам установить не удалось, но было показано, что повышенный градиент рН и усиленный синтез АТР не определяют снижение потенциала. Можно полагать, что снижение потенциала связано с повышенной ионной проводимостью внутренней мембраны этой фракции митохондрий. Падение мембранного потенциала приводит к ускорению дыхания митохондрий и повышению продукции АФК. Б В
Рис.1. Выявление в клетке митохондрий с пониженным мембранным потенциалом. Фибробласты инкубировали с 200 нМ Митотрекера зеленого и 400 нМ ТМРМ в течение 15 мин и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Яркое зеленое окрашивание свидетельствовало о сниженном потенциале (А). Б - распределение отношения зеленой (Митотрекер) и красной (ТМРМ) и флуоресценции в митохондриях. В -локализация митохондрий со сниженным потенциалом (темные). Масштаб, 15мкм.
Рис.2. Выявление в клетке митохондрий с пониженным мембранным потенциалом и повышенной продукцией АФК.
А - клетки Не1а инкубировали с Митотрекером зеленым и ТМРМ как описано на рис. 1; стрелками показаны деполяризованные митохондрии. Б, В - клетки Не1а инкубировали одновременно с Митотрекером зеленым (Б) и МКоБох (В), стрелками показаны митохондрии с повышенным уровнем АФК.
Рис. 3. Митохондрии с пониженным потенциалом активно продуцируют АФК. В клетках карциномы РКО экспрессировали митохондриально-направленный АФК-чувствительный белок «НуРег» (А) и окрашивали ТМРМ (Б). Стрелками показаны митохондрии с низким потенциалом и высоким уровнем АФК.
Исследование продукции АФК индивидуальными-митохондриями в клетках, требует применения митохондриально-направленных, АФК-чувствительных< зондов. С этой целью был» использован гидроэтидин; конъюгированный с катионом» трифенилфосфония («МКоЗох»). В клетках- НеЬа* этот- зонд* выявил* небольшую фракцию митохондрий, продуцирующих наибольшее-количество АФК (Рис: 2): К сожалению; флуоресценция'этого зонда не позволяет использовать потенциал-чувствительные индикаторы, и> проверить* предположение о том, что максимальная продукция! АФК характерна для деполяризованных митохондрий. Наиболее убедительные доказательства были' получены с. помощью-искусственного флуоресцентного! белка1 «НуРег»; флуоресценция которого, усиливается под действием АФК (ВеЬиэоу е1 а1., 2006)1 К гену« этого белка был присоединена адресная последовательность, принадлежащая субъдинице цитохромоксидазы, что обеспечило его избирательный транспорт в митохондрии: Полученная конструкция была включена- в геном лентивируса, который эффективно заражает клетки* карциномы человека и позволяет получить стабильные клоны экспрессирующие митохондриально-направленный. «НуРег». Анализ флуоресценции показал, что продукция1 АФК повышена в-митохондриях, которые не накапливают потенциал-чувствительныйзонд ТМРМ (Рис. 3).
Последствия избыточной продукции АФК в митохондриях для физиологии клетку будут обсуждаться в последующих главах работы. Наряду с продукцией' АФК, снижение мембранного потенциала митохондрий должно вести к гидролизу-АТР, который катализирует РоРгАТРаза. Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение защитных механизмов снижающих негативный эффект дисфункции митохондрий.
2. Молекулярные механизмы защиты от гидролиза АТФ
Один из механизмов, способных блокировать непродуктивный гидролиз АТР был впервые описан А.Д. Виноградовым и сотр. Он основан на прочном ингибиторном связывании АОР с АТРазой. Для исследования этого механизма мы использовали искусственный аналог АОР, 2МзАРР способный ковалентно связываться с белком после фотоактиваци и показали, что ингибирующее связывание АРР происходит в активном центре АТРазы. Эксперименты с замкнутыми везикулами внутренней мембраны митохондрий (субмитохондриальные частицы, СМЧ) позволили установить, что кратковременная« генерация* мембранного? потенциалам приводит к реактивации комплексам АТРазы. с: ADPL Эти? результаты;, полностью: соответствовали? данными А.Д. Виноградов и сотр:, которые* показали; что« синтез»: АИР5 не тормозится; под: действием ADP: Авторы; предположили; чтконформациязфермента пригсинтезе ил гидролизе АТР различаются .и лишь «гидролазная». конформация чувствительна к ингибиторному действию ADP. Наши'данные не противоречат этой гипотезе, ног указывают нак ведущую ¿роль мембранного? потенциала: в переходе АТРазы в «синтетазный» режим и реактивации комплекса с ADP (Схема 1):
Наши дальнейшие усилия были направлены на изучение ADP-зависимого ингибирования.в интактных!: изолированных? митохондриях. В этих экспериментах: мы использовал и; способность ряда-анионов: (сульфита; ацетата; Й1др;) ускорять,, реактивацию комплекса АТРазы с ADP: Мы показали; что эти« анионы; стимулируют гидролиз АТР в митохондриях^ при; отсутствии ■ мембранного: потенциала. Титрование специфическими ингибиторами показало; что скорость» гидролиза АТР в этих условиях определялась скоростью переноса, АТР через мембрану; а не активностью АТРазы. Измерения активности» АТРазы в митохондриях показали; что« более? 80%; фермента находится: в неактивном комплексе с ADP: Таким: образом, описанный механизм, торможения; гидролиза АТР весьма эффективен и может играть важную: роль в;стабилизации;уровня АТР в клетке.
Еще один механизм регуляции активности АТРазы включает взаимодействие фермента с: природным белковым ингибитором (IFi). Этот небольшой белок, открытый Пульманом и Монро в 1964г, способен полностью блокировать АТРазу, но не. тормозит синтез АТР. В экспериментах на СМЧ генерация мембранного потенциала вызывала медленную и неполную диссоциацию комплекса фермента с ингибитором. Мы предположили, что реактивация АТФазы может происходить в комплексе с IF-|. Другими словами, ингибитор является субъединицей: АТРазного комплекса, регулирующей его активность. В экспериментах, подтвердивших эту гипотезу, мы использовали рН-зависимость действия ингибитора, который блокировал АТРазу лишь при нейтральных и слабокислых значениях рН. Наши исследования показали, что при рН выше 8.0 ингибитор образует комплекс с АТРазой, не препятствуя гидролизу АТР. При снижении рН, гидролиз АТР приводил к инактивации комплекса. Инактивацию АТРазы удавалось предотвратить с помощью ионов Zn2+, которые стабилизировали активный комплекс фермента с ингибитором (Схема 2):
В дальнейших экспериментах мы исследовали возможность существования активного комплекса АТРазы с IFi в интактных изолированных митохондриях. Анализ большого ряда неионных детергентов позволил выбрать один из них -Lubrol-WX, который разрушал мембрану митохондрий, не повреждая АТРазный комплекс. Пользуясь этой методикой, мы получили из митохондрий активный АТРазный комплекс, который содержал IF-|. Инкубация этого комплекса в присутствии АТР при рН 7,4 приводила к его инактивации, которая предотвращалась ионами Zn2+. Таким образом, существование активного комплекса АТРазы с IFi в митохондриях было доказано.
Предложенная методика разрушения митохондрий Lubrol-WX позволила количественно оценить величину фракции АТРазы содержащей связанный IFi. Измерения показали, что этот параметр сильно варьирует в различных клетках и тканях, а так же имеет выраженные видовые различия. При анализе митохондрий из печени мыши, крысы, морской свинки, свиньи и быка было выявлено крайне малое содержание комплексов, которое не превышало 10% от содержания АТРазы. Эти данные были подтверждены в опытах с кислотной экстракцией IF-i, которые показали крайне низкое содержание этого белка в печени по сравнению с содержанием FoF^ATPasbi. Интересное исключение составили митохондрии из печени суслика, в которых практически вся АТРаза находилась в комплексе с IFi. Суслики являются зимоспящими животными, и естественно было предположить, что содержание IFi в них подвержено сезонным изменением. Это предположение не активен активен не подтвердилось, однако, было установлено, что эффективность торможения гидролиза АТР в митохондриях суслика возрастает в период пробуждения от зимней спячки. В этот период-температура тела животного резко повышается и печень (наряду с бурым жиром) участвует в термогенезе, связанном с разобщением окислительного фосфорилирования. По-видимому, в этот период действие IFi особенно важно для предотвращения гидролиза АТР в митохондриях. Высокое содержание активного комплекса АТРазы с IFi было-обнаружено нами так же в митохондриях быстрорастущей гепатомы 22а. Можно предполагать, что эффективная регуляция АТРазы придает опухолевым клеткам большую устойчивость к стрессам и является селективным преимуществом при отборе клеток в опухоли. Чрезвычайно эффективное торможение гидролиза АТР было выявлено нами в-митохондриях клубней картофеля. Вклад IFi в этом случае не был подтвержден прямыми опытами, но физиологическое значение блокировки гидролиза АТР в покоящейся ткани не вызывает сомнения.
Измерения содержания активного комплекса АТРазы с IFi в митохондриях сердца показали выраженные видовые различия. Было показано, что содержание комплекса в митохондриях сердца мыши, крысы и морской свинки чрезвычайно мало. В митохондриях сердца свиньи и быка практически вся АТРаза находилась в комплексе с IFi. Кролик занимал промежуточное положение. Эти данные были, подтверждены в опытах с кислотной экстракцией IFi. Содержание комплекса коррелировало с частотой сердцебиений, которая значительно выше у мелких животных, однако физиологический смысл этой корреляции остается неясным.
3. Апоптоз, как защита при снижении уровня АТР
Описанные системы регуляции АТРазы способны эффективно затормозить непродуктивный гидролиз АТР в митохондриях, но не могут предотвратить снижение уровня АТР при остановке его продукции в клетке. Наши исследования показали, что в качестве защиты клеточной популяции от клеток с поврежденной системой энергообеспечения может использоваться апоптоз.
В клетках быстрорастущих опухолей основным источником АТР является гликолиз, активность которого не снижается в аэробных условиях («эффект Варбурга»). Так в клетках карциномы шейки матки HeLa полное выключение окислительного фосфорилирования с помощью специфических ингибиторов не ведет к заметному снижению уровня АТР в клетке и уменьшению жизнеспособности. Эти эксперименты, однако, проводились в среде DMEM, содержащей 25 мМ глюкозы, что значительно выше физиологической нормы. Показано, что недостаток субстратов гликолиза может в значительной степени подавлять рост опухолей. Для снижения эффективности гликолиза мы помещали • клетки в среду с 5,5 мМ глюкозы и ингибитором гликолиза 2-деоксиглюкозой (2-ДОГ). Уровень АТР и жизнеспособность клеток в этих условиях поддерживались окислительным фосфорилированием. Ни митохондриальные ингибиторы (олигомицин, ингибитор АТРсинтазы; микостиазол, ингибитор переноса электронов в комплексе III дыхательной цепи или разобщитель FCCP), ни 2-ДОГ, взятые по отдельности, не вызывали значительной гибели клеток.
Инкубация клеток HeLa в присутствии 2-ДОГ в комбинации с одним из митохондриальных ингибиторов вызывала во всех случаях быстрое (за 1-2 ч) и примерно одинаковое (на 60%) падение уровня АТР в клетках (Рис. 4).
Рис. 4. Комбинированное действие ингибиторов гликолиза (2-ДОГ) и окислительного фосфорилирования вызывает обратимое снижение уровня АТР в клетках HeLa. А - клетки инкубировали в среде, содержащей 5,5 мМ глюкозы в присутствии различных ингибиторов окислительного фосфорилирования (олигомицин - 5 мкг/мл, миксотиазол -2 мкМ, FCCP - 10 мкМ) и 2-ДОГ(5 мМ). Б - клетки инкубировали Зч в присутствии 2-ДОГ и олигомицина, а затем была произведена смена среды на среду, содержащую 25 мМ глюкозы и вновь добавлен олигомицин.
В отсутствии 2-ДОГ ингибиторы окислительного фосфорилирования вызывали снижение уровня АТР в клетках не более, чем на 25% от исходного уровня. Замена среды через 3 ч после индукции падения уровня АТР на среду с высоким содержанием глюкозы (25 мМ) и без 2-ДОГ приводила к восстановлению уровня АТР в клетках практически до исходного уровня. Кратковременное и обратимое снижение уровня АТР приводило к отсроченной гибели клеток (Рис. 5). Основным механизмом гибели являлся апоптоз. Гибель клеток сопровождалась характерной фрагментацией ДНК и появлением фосфатидилсерина на поверхности (Рис. 6 А).
Рис. 5. Гибель клеток HeLa, вызванная временным• падением: уровня A TP в клетках. Клеткигинкубировали.3; ч Bvсреде, содержавшей- 2-ДОГ и(или)> митохондриальные: ингибиторы?, (как на Рис. 4) и 48 ч в среде с высоким *< содержанием i глюкозы:. Клетки» окрашивали Hoechst 33342; и - йодистым г пропидием и анализировали; с:. помощью! флуоресцентной микроскопиик
Оверэкспрессия антиапоптозного белка? Вс1-2 или;? добавка; ингибитора? каспаз zVADfmk блокировали апоптоз, не предотвращая» падение уровня АТР. Интересно?что;zVADfmk одновременно; усиливал; проявление некроза (Рис. 6еБ)« что указывает на защитную роль каспаз в этих условиях. Увеличение времени инкубации клеток в присутствии.2-ДОГ и митохондриальных ингибиторов с 3 ч до 5 ч приводило преимущественно к некротической гибели через 48 ч после восстановления уровня АТФ (Рис. 6В).
1 2 3 4 5
Рр*м| инкубации ■ присутствии * ДОГ и олмгомицина, ч ■
Рис. 6. Временное снижение АТР может вызывать как апоптоз, так- и некроз в клетках HeLa.
Условия инкубации; как на Рис. 4. Гибель клеток анализировали через 48 ч после восстановления уровня: АТР в клетках. А - электрофорез ДНК. Дорожки: 1-ДОГ + FGGP, 2-ДОГ + миксотиазол, 3-ДОГ + олигомицин, 4-Контроль, М — маркеры. Б, В - гибель клеток анализировали как на Рис. 5. Вс1-2 — линия клеток HeLa, экспрессирующая белок Вс1-2.
Апоптоз,' вызванный' кратковременным, снижением АТР имел те же характерные черты, что и апоптоз вызванный.другими стрессовыми факторами' см. ниже). В частности, мы наблюдали транслокацию белка.ВАХ из цитоплазмы в митохондрии и? выход цитохрома с из митохондрий4 в* цитоплазму. Выход« цитохрома, но. не транслокация- ВАХ4 были- блокированы в клетках экспрессирующих,Вс1-21 Ингибитор каспаз zVADfmk не влиял ни натранслокацию
ВАХ, ни на. выход в цитоплазму цитохрома с, так что-активация* каспаз; повидимому, происходила по цитохрома с-зависимому механизму. Вопрос омеханизме индукции апоптоза*в^этойшодели.остается открытым.' Интересно, что, 0 несмотря на, участие митохондрий в- апоптозе, нарушение их биоэнергетических функций не-препятствует осуществлению, программы. К такому же-выводу мы, пришли, исследовав апоптоз, вызванный ингибитором? протеинкиназ^ стауроспорином, фактором некроза опухолей и окислительным стрессом (см. ниже). Устойчивость апоптоза>к нарушениям функций митохондрий указывает на возможность использования этой программы в условиях повреждения митохондрий различной природы.
Обнаруженный нами запуск апоптоза при кратковременном снижении-АТР на- 60-70%, когда остаточный АТР остается в- миллимолярном диапазоне концентраций, позволяет предположить существование в клетке специальной-системы детекции энергетического состояния. Возможными кандидатами на роль сенсоров являются киназы mTOR и АМРК. Первая имеет аномально высокую Кт по АТР, а вторая аллостерически активируется AMP. Обе киназы участвуют в регуляции метаболизма* и экспрессии генов при различных- видах голодания. Конечно, нельзя исключить, что наряду,с АТР, ADP и AMP могут детектироваться и другие метаболиты, концентрация которых резко изменяется при небольшом снижении уровня АТР.
4. Митохондрии, как источник АФК при окислительном стрессе
Основными инструментами при изучении роли митохондрий в образовании АФК нам послужили новые митохондриально-направленные антиоксиданты, разработанные при нашем участии под руководством акад. В. П. Скулачева. Эти соединения, получившие название SkQ (примеры показаны на Рис. 7), представляют открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающие катионы конъюгированные с молекулой пластохинона, которая является
15 эффективной ловушкой1 кислородных радикалов. Эти антиоксиданты эффективно накапливаются в митохондриях, нейтрализуют АФК и регенерируются (восстанавливаются) дыхательной цепью, что позволяет использовать их в крайне низких наномолярных концентрациях.
Рис. 7. Формулы основных митохондриально-направленных антиоксидантов (ЭкО), использованных в работе.
Митохондрии являются единственным компартментом клетки, имеющим отрицательный (относительно цитоплазмы) заряд, так что можно было ожидать селективного накопления ЭкО в! этих органеллах клетки. Накопление БкСЗ в клетках было исследовано с помощью флуоресцентного производного 8кОК1, несущего в качестве катиона остаток родамина 19. Эксперименты с фибробластами человека показали, что избирательно накапливается в митохондриях клеток (Рис. 8). Рассеивание мембранного потенциала митохондрий с помощью протонофорного разобщителя предотвращает накопление ЗкСЖ1. Накопление вкОР1 достигает максимума за 1,5-2 ч и» в дальнейшем не растет. После отмывки лишь часть 8к(Ж1 выходила из клеток (рис. 8). Аналогичные эксперименты, проведенные на клетках Не1а и других линий, подтвердили митохондриальную локализацию вкО. Накопление было заметно снижено во многих опухолевых клетках и дальнейший анализ показал, что причиной тому является высокая активность систем множественной лекарственной устойчивости в этих клетках. Подавление основного компонента этой системы Р-гликопротеида с помощью специфических ингибиторов значительно увеличивало накопление БкО^ в опухолевых клетках.
8кОГ?1
SKQR1
Митотрекер зеленый
Наложение
ОЙ О
Jd
1П 5 я
X Oj инкубация +SkQRl —-I— без SkQRl без FCCP
С 3 с. I С е
FCCP на 180 минуте
100
200 300 Время, мин
400
Рис. 8. Накопление БкОт в фибробластах человека.
А - клетки инкубировали 2 ч с БкОР1 (50 нМ) и селективным митохондриальным красителем Митотрекером зеленым (5 мкМ). Конфокальная микроскопия. Б - кинетика накопления 5кС5Р1(50 нМ). Через Зч ЭкОМ отмывали и наблюдали его выход из клеток. РССР (10 мкМ) был добавлен одновременно с 5кОР1 или при отмывке. Данные проточной цитометрии. контроль рот• мои рот• мои* ротвмом* ротрмом* пиерии А МИ*( о
DPI NAC Ska
Рис 9. Продукция АФК в клетках HeLa, вызванная фотоактивацией Митотрекера красного.
Показана зеленая флуоресценция CM-DCF и ее совмещение с красной флуоресценцией Митотрекера: А - до засветки, Б - сразу после фотоактивации, В - через 10 минут после фотоактивации. Г - накопление АФК через 20 мин после фотоактивации. Добавки ротенона (2 мкМ), пиерицидина А (2 мкМ), миксотиазола (2 мкМ), DPI (ЮмкМ) и NAC (20 мМ) сделаны за 1 ч до засветки, SkQ1 (20нМ) добавлен за 7 сут. Данные флуоресцентной микроскопии.
Для выяснения механизмов митохондриальной продукции АФК и их роли в гибели клеток нами были использованы две модели. В первой, эта продукция индуцировалась фотодинамической обработкой, а в качестве фотосенсибилизатора использовался флуоресцентный краситель Митотрекер красный (хлорометил-Х-розамин), селективно накапливающийся в митохондриях. Во второй модели продукцию АФК индуцировали добавкой пероксида водорода. В обоих случаях после периода индукции наблюдалась продолжительная генерация АФК, которую измеряли с помощью флуоресцентного индикатора CM-DCFH-DA чувствительного, преимущественно, к перекисным радикалам. При освещении клеток содержащих Митотрекер первоначально наблюдалось накопление АФК в митохондриях, а затем они распространялись по всей клетке (Рис. 9).
Флуоресценция CM-DCF линейно возрастала в течение 20-30 мин после засветки, что указывало на активную продукцию АФК в клетке. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 в чрезвычайно низкой концентрации (20 нМ) подавлял продукцию АФК, а традиционный антиоксидант N-ацетилцистеин (NAC) был эффективен лишь при концентрации 20 мМ, что указывало на митохондриальное происхождение АФК. Ингибиторы комплекса I дыхательной цепи митохондрий ротенон и пиерицидин А, а также ингибитор комплекса III дыхательной цепи миксотиазол значительно стимулировали продукцию АФК, в та время как ингибитор флавиновых ферментов дифенилен иодониум (DPI) ее блокировал (Рис. 9Г). Эти данные позволили предположить, что продукция АФК в нашей модели осуществлялась при участии флавинового компонента комплекса I в процессе прямого переноса электронов по дыхательной цепи. Подобный эффект фотоиндуцированной продукции митохондриальных АФК наблюдался ранее в мышечных клетках (Д. Б. Зоров и сотр.).
В качестве индуктора продукции АФК в фибробластах был использован пероксид водорода. Было показано, что добавленный к клеткам Н202 разлагается в течение 15-20 минут, вероятно, вследствие высокой активности каталазы и других антиоксидантных ферментов в среде роста. Накопление АФК в клетках, измеренное с помощью CM-DCF-DA наблюдалось в течение 2 ч, а затем снижалось до исходного уровня. Накопление АФК значительно стимулировалось ингибиторами дыхания пиерицидином и миксотиазолом и предотвращалось DPI и митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1, что указывает на активацию продукции АФК в митохондриях под действием пероксида водорода (Рис. 10).
Рис. 10. Накопление АФК в фибробластах вызванное Н202 (0,3 мМ). Клетки окрашивали СМ-ОСР-йА через 2 ч (А) или через указанные промежутки времени после добавки Н202 (Б). Пиерицидин (пиер., 2 мкМ) добавляли за 1ч, а БкСЛ (20 нМ) за 1 сут или за 7 сут до Н202.
Результаты проведенных исследований показали, что при различных видах окислительного повреждения клетки: локальном (фотодинамическое воздействие на митохондрии) или генерализованном (обработка пероксидом водорода) митохондрии могут служить основным источником эндогенной продукции АФК. Возможно, избыточное образование АФК в митохондриях лежит в основе целого ряда патологий связанных с окислительным стрессом. Это предположение подтверждает тот факт, что в моделях ишемического повреждения сердца, почек и мозга, при лечении ран, а также при различных заболеваниях глаз нами и нашими коллегами были получены выраженные терапевтические эффекты митохондриально-направленных антиоксидантов.
5. Механизм повреждения митохондрий при окислительном стрессе. Неселективная пора.
При окислительном стрессе митохондрии являются как источником АФК, так и мишенью для их повреждающего действия. Одним из основных механизмов повреждения митохондрий является образование крупных неселективных пор во внутренней мембране. Структура поры остается неизвестной, хотя установлено, что она включает известные белки внутренней мембраны (АТР/АОР транспортер,
51(01, 7 суток
Время пост добавления нх^ ч переносчик фосфата), белки внешней мембраны (порин) и матрикса (циклофиллин О). Основным критерием при изучении поры этого типа является ее чувствительность к ингибиторному действию циклоспорина' А (ЦсА), лиганда циклофиллина. Функциональные исследования поры в изолированных митохондриях показали, что индукторами ее открытия служат ионы Са2+, вещества, снижающие мембранный потенциал, и различные прооксиданты. Для изучения регуляции поры при окислительном стрессе нами были разработаны две модели. В первой, использовалась зависимость поры от мембранного потенциала. Было показано, что в присутствии индукторов поры ее открытие происходит при более высоких значениях потенциала, а ингибиторы действуют в противоположную сторону. В другой модели, измерялась зависимость открытия поры от концентрации Са2+ при полном отсутствии мембранного потенциала. В этом случае индукторы поры повышали ее чувствительность к Са2+, а ингибиторы, напротив, ее понижали. Эти модели позволили исследовать действие ряда прооксидантов, не опасаясь их возможного эффекта на мембранный потенциал или транспорт Са2+.
Важную роль в дальнейших исследованиях сыграл обнаруженный нами новый ингибитор поры монобромобиман. Этот ингибитор предотвращал индукцию поры под действием некоторых прооксидантов (производные мышьяка, диамид), но не действовал в случае органических гидроперекисей и дурохинона. Мы показали, что в первом случае индукция поры определяется окислением вицинальных тиолов в белках, образующих пору. Возможно, эти тиолы находятся в равновесии с пулом восстановленного глутатиона в митохондриях. Второй путь индукции не зависел от модификации белков и определялся окислением пиридиновых нуклеотидов (ЫАОН и ЫАРРН) в матриксе митохондрий. Мы показали, что эти два пути функционируют независимо друг от друга.
Вопрос о функционировании митохондриальной поры в живой клетке изучен пока недостаточно. Это связано с отсутствием методических подходов, позволяющих регистрировать открытие поры в клетке. Большинство из них основаны на измерении мембранного потенциала, который может варьировать по причинам, не зависящим от поры. Для исследования поры в клетке мы использовали ее способность пропускать ионы Са2+. Известно, что транспорт Са2+ в митохондриях устроен так, что при низкой концентрации Са2+ во внешней среде, он не может быстро выйти из матрикса. Такая ситуация может реализоваться в клетке, если после кратковременного подъема Са2+ и накопления в митохондриях его концентрация снизится до физиологической нормы (около 100 нМ). Мы смоделировали-этот процесс в лимфоцитах тимуса, стимулировав подъем Са2+ в цитоплазме с помощью ингибитора, Са2+-АТРазы эндоплазматического ретикулума, тапсигаргина. Этот ингибитор вызывает выход Са2+ из ретикулума, что ведет к входу дополнительного.количества Са2+ из внеклеточной среды через т. наз. СРАС-каналы. Если через какое-то время убрать Са2+ из среды, то его концентрация в клетке нормализуется, благодаря работе Са2+-АТРазы плазматической мембраны. После завершения цикла какое-то количество Са2+ накапливалось и оказывалось запертым в митохондриях. Полное снятие мембранного потенциала с помощью протонофорного разобщителя- РССР приводило к быстрому выходу Са2+ в цитоплазму и ЦсА лишь частично тормозил этот процесс. Все эти переходы мы наблюдали в лимфоцитах с помощью флуоресцентного зонда Р1ио-ЗАМ, регистрировавшего концентрацию Са2+ в цитоплазме (Рис. 11 А, В).
Эффективные индукторы поры (такие как фениларсеноксид) вызывали выход Са2+ из митохондрий, который тормозился ЦсА (Рис. 11 Б). Если клетки обрабатывали мягкими прооксидантами, то малые дозы разобщителя вызывали быстрый ЦсА-чувствительный выход Са2+ в цитоплазму (Рис. 11 Г, Д). Можно полагать, что прооксиданты сенсибилизировали пору в живой клетке и вызывали ее открытие при снижении потенциала, подобно тому, как это наблюдалось в изолированных митохондриях.
Таким образом, показано, что пора действует как чувствительный сенсор окислительных процессов в« митохондриях, регистрируя уровни восстановленности основных редокс чувствительных компонентов, глутатиона и ЫАО(Р)Н. Существование подобного сенсора указывает на возможную роль поры в защите клетки от окислительного стресса. Можно полагать, что продолжительное открытие поры приведет к деградации поврежденных митохондрий в клетке и уменьшит опасность, которую они представляют.
I | t га» cu. t-ьо» tow »(« ai iM w-a~
FCCPl(jM
Рис. 11. Индукция митохондриальной поры в лимфоцитах.
Клетки инкубировали с тапсигаргином (TG, 2 мкМ) 20 мин или указанное время (В), затем добавляли EGTA (5 мМ), FCCP (2 мкМ), фениларсиноксид (PhAsO, 10 мкМ), трет-бутилгидропероксид (t-BOOH, 0,2 мМ). Циклоспорин A (CsA, 2 мкМ) добавляли за 1 мин до индукторов. Д - зависимость эффекта от концентрации FCCP в условиях опыта, показанного на панели (Г). Концентрацию Са2+ в цитоплазме измеряли с помощью флуоресцентного зонда Fluo-ЗАМ. Ответ зонда калибровали с помощью внешнего Са2+-буфера в присутствии ионофора иономицина.
6. Митоптоз
6.1. Фрагментация митохондриального ретикулума при окислительном стрессе Митохондрии в большинстве клеток образуют протяженный ретикулум и объединены в единую электрическую сеть. Такой «кабель» позволяет передавать энергию в виде мембранного потенциала с периферии клетки, где уровень кислорода относительно высок, к центральной части клетки, где потребность в окислительных метаболитах и АТР особенно высока. Митохондриальная сеть является динамической структурой, которая обратимо фрагментируется при окислительном стрессе и других повреждающих воздействиях. В клетках HeLa изменения морфологии митохондрий проявлялись через 8-12 часов после добавки Н2С>2, а через 20-24 часа количество клеток с полностью фрагментированным митохондриальным ретикулумом составляло 60-70 %. В индивидуальных клетках культуры фрагментация начиналась после лаг-фазы различной длительности и затем очень быстро завершалась. Процесс фрагментации значительно ускорялся, если клетки одновременно с Н2О2 обработать ингибиторами дыхания миксотиазолом или пиерицидином (Рис. 12). Сами по себе пиерицидин и миксотиазол также вызывали фрагментацию митохондрий, но она требовала значительно больше времени. Эти данные согласуются с результатами, полученными при измерении уровня окислительного стресса в тех же условиях. контроль
Нг02+миксотиазол
24«. миксотиазол
• * —- <
• *»1г
-1Г > г- 4 'V* . ••
24 ч . —Й 40 Ч
Рис. 12. Динамика митохондриального ретикулума при окислительном стрессе.
Клетки Не1а инкубировали с Н202 (250 мкМ) и/или миксотиазолом (2 мкМ). Митохондрии выявляли Митотрекером зеленым. Бар - 15 мкМ.
Митохондриально-направленные антиоксиданты вызывают эффективную защиту митохондрий от фрагментации под действием Н2О2. Защитный эффект проявлялся в чрезвычайно низких концентрациях - 2-20 нМ (Рис. 13). Антиоксиданты общего действия тролокс и М-ацетилцистеин также предотвращали фрагментацию митохондрий, вызванную Н2О2, но в значительно больших концентрациях - 100 мкМ и 10 мМ соответственно.
Электронно-микроскопическое исследование, проведенное Л.Е. Бакеевой и сотр. показало, что ЭкСМ полностью предотвращает нарушения структуры митохондрий, вызванные окислительным стрессом в клетках Не1а (Рис. 14). Было обнаружено, что в отсутствие Н2О2 под действием ЭкСИ в клетках Не1а возрастает содержание протяженных митохондрий.
23 концентрация хинона, нМ
Рис. 13. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают фрагментацию митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Клетки Не1а инкубировали с антиоксидантами (2 нМ, панель А) в течение 2 ч, добавляли Н202 (250 мкМ) и через 18 ч митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым.
Это наблюдение подтвердили измерения мембранного потенциала митохондрий в клетках Не1а. Было показано, что при повреждении лазерным лучом небольшого фрагмента митохондрий в клетке происходит деполяризация близлежащих митохондрий, но размер этой области относительно невелик. Инкубация клеток с Бк01 приводила к значительному увеличению этой области, что указывало на увеличение слитности митохондриальной электрической сети (Рис. 15). Из Рис. 13 видно, что ЭкСЛ и ЭкОРЯ практически полностью подавляли фрагментацию митохондрий, в то время как МйоО (их аналог, содержащий убихинон) был не столь эффективен. Аналогичные результаты были получены в опытах с фибробластами (Рис. 16). Во всех экспериментах С12ТРР (аналог 8к01, способный накапливаться в митохондриях, но не обладающий антиоксидантным действием) не оказывал никакого эффекта. При повышении концентрации митохондриально-направленных антиоксидантов их защитный эффект исчезал и наблюдалось повреждающее действие, связанное, по-видимому, с прооксидантным эффектом. БкСЛ предотвращал фрагментацию, вызванную ингибиторами дыхательной цепи митохондрий, миксотиазолом, антимицином А и пиерицидином, и не влиял на фрагментацию, вызванную ингибитором протеинкиназ ставроспорином. Последнее позволяет утверждать, что ЭкСИ не нарушает механизм фрагментации митохондрий.
Контроль
ЭкО! е
Рис. 14. Влияние Бк01 на морфологию митохондрий в клетках Не1-а. Данные конфокальной и электронной микроскопии. Клетки обрабатывали БкСЛ (20 нМ, 7 дней) и инкубировали 24 ч с Н202 (100 мкМ). При конфокальной микроскопии (а, б) митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым. X X б) т с ю о о а X а> т с «о о
III с о о ъ XI V ч N \ >» ' г V л ь ч 1 \^ г* V.
Рис. 15. Бк01 вызывает образование единой электрической митохондриальной сети в клетках Не1.а.
Клетки инкубировали с потенциал-чувствительным зондом ТМРМ (100 нМ, 15 мин), а затем освещали аргоновым лазером (488 нм; 50 сек; размер светового пятна 6 х 60 пикселей) фрагмент указанный стрелкой. Клетки анализировали через 15 мин после освещения. Там, где указано, клетки преинкубировали с 20 нМ БкСЛ в течение 7 дней. Пунктиром показана область деполяризации митохондрий. Бар, 15 мкм
Важно отметить, что защитный эффект Бк01 развивался за 2 ч, что соответствовало времени накопления 8кОР1 в клетках. В то же время, общий уровень АФК в клетке за это время не снижался. Для предотвращения накопления АФК требовалась значительно более длительная инкубация (24 ч в случае фибробластов и 7 суток в случае Не1а). Можно предполагать, что Эк01 при кратковременной инкубации нейтрализует АФК в основной части популяции митохондрий и защищает их от фрагментации, а общий уровень АФК в клетке не столь существенен для изменений морфологии митохондрий. Накопление АФК в клетке при окислительном стрессе может определяться небольшой субпопуляцией митохондрий с пониженным мембранным потенциалом (см. Рис. 1-3), которые очень медленно накапливают БкСЛ. Фрагментация митохондрий под действием внутренних АФК указывает на важную роль этого процесса в защите клетки от окислительного стресса. Во-первых, размыкание митохондриальной электрической сети делает ее более устойчивой к локальным повреждениям. Во-вторых, продолжительная фрагментация митохондрий служит первым шагом на пути к их элиминации в процессе митоптоза. фрагментацию митохондриального ретикулума при окислительном стрессе в фибробластах человека.
А - клетки инкубировали с SkQ1 (2 нМ, 2 ч), затем добавляли Н202 (250 мкМ) и через 18 ч митохондрии окрашивали Митотрекером зеленым. Б - зависимость действия антиоксидантов от их концентрации. контроль
SkQI
SkQR1
Концентрация, М
6.2. Митофагия и митоптоз.
Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе, вероятно, является самым ранним этапом программы направленной на защиту клетки от митохондрий с поврежденными функциями. Окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода« или ингибиторами« дыхательной цепи, приводил к обратимой фрагментации митохондрий. Даже длительная инкубация в этих условиях не вызывала дальнейших изменений морфологии митохондрий. Отмывка клеток от ингибиторов дыхания или Н2О2 приводила к восстановлению митохондриальной сети через 17-24 ч. Разобщители окислительного фосфорилирования ДНФ и FCCP так же вызывали окислительный стресс (Рис. 17), фрагментации митохондрий, их кластеризацию и деградации (Рис. 18А). Одновременно в клетке резко падало содержание митохондриальных белков (Рис. 18Б).
V"
S Si» миксо
ДНФ
FCCP
ДНФ+ миксо
FCCP+ миксо
Рис. 17. Разобщители окислительного фосфорилирования усиливают окислительный стресс в клетках Не1.а. Клетки обрабатывали миксотиазолом (миксо., 2 мкМ), ДНФ (0,4 мМ), РССР (10 мкМ) в течение 1 часа, затем промывали, инкубировали с СМ-ОСР-ОА (4 мкМ, 15 минут) и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра. Черный контур - контроль.
Эффект разобщителей был, по-видимому, связан как со снижением мембранного потенциала, так и с ингибированием дыхания. РССР значительно более эффективен в качестве ингибитора дыхания и индуктора окислительного стресса, чем ДНФ (Рис. 17) и это коррелирует с его большей эффективностью, как индуктора митоптоза. Ингибиторы дыхания значительно ускоряют митоптоз, вызванный разобщителями. Таким образом, для запуска механизма деградации необходимо как повреждение дыхательной цепи митохондрий, так и снижение их мембранного потенциала. Инкубация клеток в течение 48-72 часов с ингибиторами дыхательной цепи в сочетании с разобщителями приводила к гибели 50-70% клеток. Оставшиеся в живых клетки, морфологически практически не отличались от контрольных, имели нормальную структуру ядра и не проявляли признаков апоптоза (таких как переселение белка ВАХ из цитозоля в митохондрии и выход цитохрома с в цитозоль) (рис. 19).
Рис. 18. Деградация митохондрий при длительной инкубации с FCCP (10 мкМ). А - клетки HeLa были трансфецированы Mito-EYFP. Ядра окрашивали Hoechst 33342. Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм. Б - Вестерн-блот клеток HeLa после 7 сут инкубации с FCCP. Обозначения белков: HSP60, митохондриальный белок теплового шока, cyt с, цитохром с, COX(I), субъдинца I цитохромоксидазы, VDAC, порин локализованный как во внешней мембране митохондрий, так и в других мембранах клетки, tub, тубулин, использованный в качестве контроля нагрузки.
Митохондрии в клетках окрашивали разными способами: антителами к цитохромоксидазе (внутренняя мембрана митохондрий), к цитохрому с (белку локализованному в межмембранном пространстве), красителем митотракером зелёным, избирательно окрашивающим митохондрии независимо от мембранного потенциала; клетки также трансфецировали плазмидой кодирующей зелёный флуоресцентный белок, слитый с митохондриальным адресом восьмой субъединицы цитохромоксидазы (Mito-EYFP). Во всех случаях в клетках обработанных разобщителями и ингибиторами дыхательной цепи наблюдались крупные кластеры митохондрий. Структура актинового цитоскелета (Рис. 19) и микротрубочек (Рис. 20) остается нормальной даже через 96 часов инкубации с митохондриальными ядами, в условиях, когда митохондрии в клетке сильно деградированы. Эксперименты показали, что ингибирование актинового цитоскелета (с помощью цитохалазина) не оказывает влияния на кластеризацию митохондрий, а разрушение тубулинового цитоскелета (с помощью колцемида) даже ускоряет этот процесс. Таким образом, механизм кластеризации актин\ц1ГТохром с
1 \ 1 \ V VA / ч ". )№ \ /
Jf 1 1 V «м- 1 ' ¿v.4'" /
Рис. 19. Структура актиновых филаментов и локализация митохондрий в клетках HeLa в процессе митоптоза.
Клетки обрабатывали FCCP (10 мкМ) в течение 96 ч, затем отмывали и культивировали 48 ч в среде без ингибиторов. Актин окрашивали фаллоидин-TRITC, а цитохром с с помощью специфических антител. Фотографии получены на конфокальном микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss). Показаны оптические срезы одной клетки, сделанные через каждые 10 мкм. Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм.
Mito-EYFP/ тубудин I hn. Ом /Hoechst Рис. 20. Структура митохондрий и системы микротрубочек после длительной инкубации с FCCP и миксотиазолом.
Митохондрии визуализированы с помощью плазмиды Mito-EYFP (А, В) или антител к цитохромоксидазе (Б, Г)-Микротрубочки окрашены антителами к тубулину. Ядра окрашены Hoechst 33342. Клетки инкубировались 96 ч в присутствии 10 мкМ FCCP и 2 мкМ миксотиазола (В, Г) или без добавок (А, Б). Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб, 15 мкм.
А % J ' ÄS ж Б ' Иже* / 1
В .V. У J Г V митохондрий, по-видимому^ отличается от сборки «аггресом» (агрегатов продуктов протеасомной деградации белков), в которой цитоскелет принимает активное участие. Одним из возможных механизмов селективной деградации митохондрий может служить аутофагия. Известно, что с помощью этого механизма происходит регуляция-количества и качества клеточных органелл. В ряде случаев было показано, что в клетках, подвергнутых стрессам, аутофагия участвует в селективной деградации митохондрий (т. наз. митофагия). В наших экспериментах было показано, что инкубация клеток с РССР и антимицином вызывает накопление, как лизосом, так и аутофагосом. Несмотря на повышение общего уровня аутофагии в клетке, мы не обнаружили колокализацию митохондриального материала с аутофагосомами. Кроме того, на электронных микрофотографиях клеток НеЬа, подвергнутых действию разобщителей» и ингибиторов дыхания, также не было обнаружено аутофагии митохондрий (Рис. 21). Электронная микроскопия подтвердила отсутствие митохондрий в части клеток. (Рис. 21 Б), а в ряде случаев в районе ядра видны образования окруженные мембраной и наполненные сферическими везикулами диаметром 50200 нм, а также другим электронно-плотным материалом (Рис. 21В). Подобное образование было названо митоптотическим, тельцем. Когда митоптотическое тельце контактируют с внешней средой, плотность его содержимого резко снижается (рис. 21 Г). Видно, что содержимое митоптотического тельца отделено от внешней среды одной мембраной, причем в некоторых местах виден плотный контакт мембраны митоптотического тельца с внешней клеточной мембраной. В других случаях данный контакт отсутствует, и митоптотическое тельце выглядит как большая экзосома окружённая одной мембраной. Мембрана митоптотического тельца довольно нестабильна и при контакте с внешней средой может разрушаться, в этом случае её содержимое свободно выходит в среду.
В другой серии экспериментов проводились наблюдения за одной и той же клеткой, используя флуоресцентную и электронную микроскопию. Митохондрии в клетках, обработанных ДНФ в комбинации с антимицином, окрашивались митотракером зеленым, находили клетку с митоптотическим телом и далее фиксировали её для электронной микроскопии. Электронная микроскопия показала наличие в зоне, ярко окрашиваемой Митотракером зеленым, большого количества сферических мембранных везикул, иногда имеющих
Рис. 21. Анализ митоптоза с помощью электронной микроскопии. Контрольные клетки (А) и клетки обработанные 3 дня ДНФ (0,4 мМ) и 2 мкМ антимицина (Б) или 2 мкМ миксотиазола (В, Г). Митоптотическое тельце (МТ) располагается рядом с ядром (В) не контактируя с внешней клеточной мембраной. На рисунке Г стрелкой показан плотный контакт мембраны митоптотического тела с плазматической мембраной клетки. Масштаб 1 мкм (А,Б), 0,5 мкм (В-Г) и 0,2 мкм для вырезанной секции фото Г. Фотографии получены совместно с В.Б. Сапруновой и Л.Е. Бакеевой. электронно-плотные включения и везикулы маленького диаметра. Это позволило заключить, что митоптотическое тельце заполнено митохондриальным материалом. Подобные же структуры окрашиваются антителами к цитохрому с, к цитохромоксидазе и к порину (белку внешней мембраны митохондрий), а следовательно все компартменты митохондрий, по-видимому, входят в состав митоптотического тельца.
Результаты экспериментов с использованием фазового контраста, флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии для наблюдения за одной и той же клеткой показаны на Рис. 22. Сканирование клетки с митоптотическим телом показало, что митоптотическое тело имеет крайне неровную, бугристую поверхность и сильно выпячивается из клетки (Рис. 22Б, В). В другом эксперименте в процессе фиксации препарата большая часть митоптотического тела была потерянна, а на его месте видна большая выемка на внешней поверхности клетки (Рис. 22Д, Е). Полученные результаты указывают на то, что в клетках Не1а в условиях, когда биоэнергетические функции митохондрий нарушены, реализуется эффективный способ защиты клетки, связанный с выбрасыванием поврежденных митохондрий в межклеточное пространство.
Мы исследовали судьбу клеток, которые избавились от своих митохондрий. После четырехдневной инкубации с ингибиторами в выживших клетках практически не обнаруживалось митохондриального материала и лишь изредка наблюдались мелкие плотные кластеры митохондрий. После двухнедельной инкубации в среде, не содержащей ингибиторов, некоторые клетки полностью восстанавливали структуру митохондриального ретикулума. Вероятно, несмотря на массовый митоптоз, индуцированный митохондриальными ядами, в клетке может оставаться небольшой «неприкосновенный» запас митохондрий, благодаря которому клетка может восстановить свои митохондрии. 7. Апоптоз, как защитный механизм при окислительном стрессе
В предыдущих разделах мы рассмотрели некоторые механизмы защиты клетки от дисфункции митохондрий при окислительном стрессе. В том случае, если все эти меры не предотвращают развитие окислительных повреждений, в клетке может быть индуцирована программа апоптоза - самоубийства клетки, призванного не допустить повреждения окружающей ткани. Митохондрии могут играть роль сенсоров измеряющих силу окислительного стресса и определяющих тот порог, за которым происходит индукция апоптоза. Кроме того митохондрии митотракер t Hoechst 33342
Б V . | V • 'v •, v * ^ , Л * 44 - л^Ч Ф .С1 00007 Юуп » |
Рис. 22. Фазовый контраст, флуоресцентная микроскопия и сканирующая электронная микроскопия клеток обработанных в течении 96 ч ДНФ (0,4 мМ) и антимицином (2 мкМ).
Митоптотическое тельце ярко окрашено Митотракером зелёным и отчетливо видно на фазовом контрасте (А, Г). Сканирующая микроскопия клетки с митоптотическим тельцем на поверхности (Б, В) и клетки с «кратером», оставшимся после того как митоптотическое тельце отделилось в процессе фиксации препарата. Масштаб, 15 мкм (А,Г) , 10 мкм (Б, Д), 3 мкм (В, Е). непосредственно участвуют в реализации программы апоптоза, и их состояние во многом определяет наступление момента необратимой гибели клетки. Центральную роль в процессе апоптоза, вызванного окислительным стрессом, играет продукция АФК в митохондриях описанная нами выше. Основными инструментами для изучения этих явлений, как и в предыдущих экспериментах, служили ингибиторы митохондриальных функций и митохондриально-направленные антиоксиданты (см. Рис. 7).
7. 1. Общие характеристики апоптоза, вызванного окислительным стрессом.
В качестве основной модели окислительного стресса в клетках Не1а и в фибробластах мы использовали обработку Н202 в концентрациях 100 - 500 мкМ. Сходные результаты были получены при использовании в качестве прооксидантов менадиона, параквата (метилвиологена) и органических гидроперекесей. Мы обнаружили, что через 24 часа после добавки малых доз прооксидантов значительно возрастало количество клеток в 02/М фазе, что указывало на торможение клеточного цикла. При дальнейшей инкубации Н2О2 разлагался и происходило частичное восстановление клеточного цикла. Если клетки Не1а культивировали при низкой плотности (конфлюэнтность 30-40%) то Н202 в концентрации 200 мкМ вызывал гибель 20-30% клеток через 17 часов после добавления. Эффект пероксида водорода значительно усиливался, если клетки предварительно инкубировали с ингибиторами дыхания пиерицидином или миксотиазолом. Преинкубация с митохондриально-направленным антиоксидантом (8к<31, 20 нМ, 7 дн) предотвращала гибель клеток, но лишь в отсутствие ингибиторов дыхания (Рис. 23). Аналогичные эффекты наблюдались и для фибробластов человека, но защитное действие Бк01 не требовало столь длительной инкубации (Рис. 24). Эти данные полностью коррелировали с измерениями уровня АФК в тех же клетках, обработанных Н202 (см. выше). Таким образом, гибель клеток при окислительном стрессе, вызванном Н202, определялась вторичной продукцией АФК в митохондриях.
Гибель клеток Не1а имела все признаки апоптоза: ядра имели конденсированный и фрагментированный хроматин, ДНК была фрагментирована, на поверхности клеток экспонировался фосфатидилсерин. Появления всех этих признаков не наблюдалось в присутствии ингибитора каспаз г\/АО-(тк. При комбинации ингибиторов дыхания и Н202, наблюдалось появление большого количества клеток с нарушенной целостностью внешней мембраны (окрашивание йодистым пропидием), что является характерным признаком некроза.
Рис. 23. Гибель клеток Не1а вызванная Н202. Эффекты ингибиторов дыхательной цепи и Бк01.
Апоптотическая и некротическая гибель измерялась как на Рис. 5 через 17 ч после добавления Н202 (200 мкМ). Пиерицидин (пиер., 2 мкМ), миксотиазол (миксо., 2 мкМ) и г\/АОТтк (50 мкМ) добавляли за 1 час до Н202. Клетки инкубировали с 20 нМ Бк01 в течение 7 дней, затем промывали и культивировали еще 24 ч.
В случае фибробластов некроз наблюдался и в отсутствие ингибиторов дыхания. В обеих моделях г\/АО^тк предотвращал развитие некроза, что указывало на его вторичную природу (Рис. 23). А Б
ГИИ.СШииш
Р^СР контроль
Рис.24. Бк01 и 8кОИ1 предотвращают гибель фибробластов вызванную Н202. Фибробласты инкубировали с ¿кО в течение 24 ч, затем добавляли Н202 (0.3 мМ) и измеряли гибель клеток через 24 ч. А - С12ТРР, аналог ЭкО, лишенный антиоксидантной функции, Б - РССР (1 мкМ) добавлен одновременно с 5к<31 (2 нМ).
Апоптоз в клетках Не1а сопровождался перемещением белка ВАХ из цитоплазмы в митохондрии и выходом цитохрома с в цитоплазму (Рис. 25). Экспрессия антиапоптозного белка Вс1-2 предотвращала выход цитохрома с и защищала клетки Не1а от гибели под действием Н2О2. В то же время перемещение ВАХ не тормозилась под действием Вс1-2. Эти данные показали, что перемещение ВАХ предшествует выходу цитохрома с из митохондрий при окислительном стрессе, что согласуется с результатами многочисленных исследований, проведенных на других моделях апоптоза.
7.2. Механизм запуска апоптоза при окислительном стрессе. Роль белка ВАХ.
Мы обнаружили, что уже через два часа после добавки Н2О2 фракция ВАХ в митохондриях увеличивается, а его содержание в цитоплазме снижается. Перераспределение ВАХ на эти сроки не сопровождалось выходом цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и проявлением других признаков апоптоза. Оказалось, что кратковременная преинкубацмя с Бк01 (20 нМ, 2 часа) предотвращает транслокацию ВАХ, вызванную окислительным стрессом (Рис. 26). Антиоксидант общего действия Тго1ох также обладал защитным действием, но в значительно больших концентрациях (0,1 мМ). Как и в случае фрагментации митохондрий, быстрое развитие эффекта Бк01 указывала на то, что транслокация ВАХ определяется уровнем АФК внутри митохондрий. Этот вывод находится в кажущемся противоречии с представлениями о том, что ВАХ получает сигнал, ведущий к транслокации, находясь в цитоплазме. Дальнейшие эксперименты позволили разрешить это противоречие.
Известно, что ВАХ при апоптозе взаимодействует с белками, локализованными в области контакта внешней и внутренней мембран митохондрий (комплекс «контактных сайтов»). Одним из белков, участвующих в образовании этого комплекса, является транслокатор адениновых нуклеотидов (ANT). Мы исследовали влияние конформации ANT на транслокацию ВАХ при окислительном стрессе, использовав ингибиторы ANT, бонгкрековую кислоту и атрактилозид, фиксирующие транслокатор в различных конформациях.
Вах
Cyt с Hoechst наложение
• -щ т * л 1 * * \ i ' / i t + ♦ <f \ '-V"' л Л V * V г * * i х'1 4 Г ч 1
•V/ -. Ь- •к. • ■ ■ ь. ■ 1 ■-- г . -' контроль н,о
2^2 н2о2+ миксо zVAD+
НА+ миксо
Рис. 25. Транслокация Вах в митохондрии и выход цитохрома с в цитоплазму под действием Н202.
Клетки HeLa обрабатывали Н202 (200 мкМ) и анализировали через 17 ч. ВАХ и цитохром с окрашивали с помощью специфических антител, а ядра с помощью Hoechst 33342. Миксотиазол и zVAD-fmk были добавлены как на Рис. 23. Стрелками показаны апоптозные клетки. Масштаб, 15 мкм.
Контроль н202 Н202+БкС>1
Рис. 26. Накопление АФК в митохондриях вызывает перераспределение белка ВАХ в клетке.
Клетки Не1а преинкубировали с Эк01 (2 нМ, 2 ч), затем обрабатывали Н202 (250 мкМ, 20 ч). Окраска, как на Рис. 25. Масштаб, 15 мкм.
Бонгкрековая Бонгкрековая 5к(31 +
Рис. 27. Конформация транслокатора адениновых нуклеотидов определяет локализацию ВАХ в клетках Не1.а.
А - клетки инкубировали с бонгкрековой кислотой (10 мкМ, 2 ч), затем добавляли Н202 (300 мкМ). Б - клетки инкубировали с Бк01 (2 нМ, 2 ч), затем добавляли атрактилозид (100 мкМ) и Н202 (300 мкМ). Клетки фиксировали через 24 ч и окоашивали. как на Рис. 25. Масштаб. 4 мкм.
Было обнаружено, что бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию ВАХ вызванную пероксидом водорода. Атрактилозид, напротив, вызывал транслокацию ВАХ на мембрану митохондрий в значительной части клеток в отсутствие Н202 и усиливал действие H202 на транслокацию ВАХ. В присутствии атрактилозида SkQ1 уже не влиял на перемещение ВАХ (Рис. 27).
Ингибиторы ANT были использованы для изучения возможной взаимосвязи между транслокацией ВАХ и фрагментацией митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Несмотря на то, что бонгкрековая кислота предотвращала транслокацию ВАХ, она никак не влияла на фрагментацию митохондрий, вызванную Н202. Бонгкрековая кислота так же не подавляла апоптоз, вызванный Н202 в клетках HeLa. Можно полагать, что транслокация ВАХ при окислительном стрессе не является необходимым условием для фрагментации митохондрий и для апоптоза. По-видимому, в митохондриях существуют и иные мишени для действия АФК, ответственные за эти процессы.
Поскольку атрактилозид способствует открытию циклоспорин-чувствительной митохондриальной поры, а бонгкрековая кислота ее закрытию, мы исследовали роль поры в транслокации ВАХ. Для этого были использованы ингибиторы митохондриальной поры циклоспорин А и его аналог Ы-метил-4-изолейцин-цикпоспорин, обладающий более селективным действием. Было показано, что оба ингибитора не влияют на изменение локализации ВАХ при окислительном стрессе. Следовательно, определяющим фактором в транслокации ВАХ является конформация ANT, а не состояние поры. Этот вывод согласуется с данными, полученными на частично очищенных препапратах «контактных сайтов», где изменение конформации ANT вызывало изменение сродства ВАХ к комплексу в целом (Vyssokikh et al., 2002). Известно, что окисление дитиола на матриксной стороне молекулы ANT может приводить к изменению его конформации, подобно атрактилозиду. Возможно, окислительный стресс вызывает окисление этого дитиола, что и приводит к увеличению сродства ANT к ВАХ. SkQ1, в таком случае, мог бы предотвращать транслокацию ВАХ, защищая дитиол ANT от окисления. Таким образом, молекула транслокатора адениновых нуклеотидов может играть роль сенсора, чувствительного к АФК внутри митохондрий и инициирующего апоптоз при окислительном стрессе.
7.3. Митохондриальные АФК участвуют в передаче апоптозного сигнала между клетками
Изучая- апоптоз' клеток НеЬа, вызванный- пероксидом* водорода; мы обратили внимание на то, что апоптозные клетки»распределяются^ монослойной. культуре клеток не случайным* образом, а формируют кластеры из близкорасположенных клеток. Это указывает на,наличие сигнала, передающегося от погибающих клеток к- соседним клеткам и способного1 вызывать их гибель. Для проверки1 этой гипотезы мы использовали модель, в которой) были исключены прямые межклеточные контакты. Клетки-индукторы и клетки-реципиенты растили на двух разных стеклах в разных чашках, далее одно из'стекол1 обрабатывали Н2О2, и после инкубации и промывки помещали,рядом с другим стеклом ib общую чашку Петри в среде, содержавшей ингибитор катал азы, аминотриазол. В этих условиях после 18'ч совместной инкубации наблюдался значительный апоптоз в клетках-реципиентах (Рис. 28). Длительная инкубация клеток-реципиентов с SkQ1 (20 нМ; 7 дн) предотвращала их гибель. Эти данные указывали на то, что именно Н2О2 является сигнальной молекулой в этой модели.
Далее мы использовали, другой индуктор* клеточной гибели - фактор некроза опухоли (ФНО). На Рис. 29 показаны результаты опыта, в которомклетки-индукторы инкубировали* Зч с ФНО в комбинации с ингибитором синтеза^ белка, эметином (необходимым для индукции апоптоза), промывали, помещали рядом с клетками-реципиентами и продолжали инкубацию в течение 17ч. Что бы исключить возможный эффект перераспределения молекул ФНО между стеклами; совместную инкубацию проводили в присутствии моноклональных антител к ФНО. Добавление в среду инкубации каталазы (фермента, специфически разлагающего Н2О2) эффективно подавляло апоптоз клеток на стекле-реципиенте и при этом не влияло на апоптоз клеток на стекле-индукторе (Рис. 29А).
Для проверки возможной роли митохондрий в продукции Н2Ог при передаче апоптозного сигнала от клеток обработанных ФНО был использован SkQ1. Передача сигнала апоптоза была подавлена, как при обработке с помощью SkQ1 индуктора, так и реципиента. В то же время, SkQ1 практически не влиял на развитие ФНО - зависимого апоптоза на стекле индукторе (Рис. 29Б).
Измерения уровня Н2О2 в среде инкубации показали его заметное повышение через 1-4,5 ч после совмещения стекол. Обработка клеток-индукторов с помощью Бк01 снижала уровень Н2О2, в то время, как обработка реципиентных клеток не давала эффекта (Рис. 30).
I +вк(}1
Рис. 28. Передача сигнала апоптоза от клеток, обработанных нго2.
Клетки Не1а обрабатывали 50 мкМ Н202 3 раза с интервалом в 1 ч и промывали. Клетки-реципиенты совмещали с клетками-индукторами на 8 ч. В среде присутствовал аминотриазол (7 мМ). Эк01 (20 нМ) был добавлен к клеткам-реципиентам за 7 сут до совмещения стекол и затем присутствовал в течение 18 ч совместной инкубации (черные столбики). без добавок антителах ФНО каталаза контроль Г
-ь без ЭкСН
БкСЛ в Бк01 в контроль индукторе реципиенте
Рис. 29. Передача сигнала апоптоза от клеток, обработанных ФНО (10 нг/мл) и эметином (1 мкМ), к интактным клеткам.
Апоптоз определяли через 24 ч после совмещения стекол. А - монокпональные антитела к ФНО (700 нг/мл) были добавлены одновременно с ФНО (штрихованный столбик) или после совмещения стекол. Каталаза (2500 Е/мл) была добавлена в среду инкубации при совмещении стекол. Б - клетки (индукторные или реципиентные) инкубировали с Эк01 (20 нМ) в течение 7 дн.
Полученные данные позволяют предполагать, что основным фактором передачи сигнала апоптоза между клетками является пероксид водорода, который образуется в митохондриях и выходит во внеклеточную среду. Проникая в реципиентные клетки, Н202 вызывает накопление АФК при участии митохондрий и эти «вторичные» АФК, в свою очередь, инициируют апоптоз (Схема. 3). Описанный выше механизм межклеточной передачи сигнала апоптоза может играть важную роль в защите органов и тканей от повреждения. часы
Рис. 30. Накопление Н202 в экспериментах по передаче сигнала апоптоза. Клетки обрабатывали ФНО и Эк01 как на Рис. 29. А - содержание Н202 и апоптозных кпеток-индукторов. Б - Бк01 снижает концентрацию Н202 в среде совместного роста клеток. Данные получены совместно с М.Ю. Высоких.
Апоптоз относительно небольшого числа клеток вокруг первичного очага поражения должен препятствовать распространению повреждающего воздействия на более значительные области ткани. Аналогичный способ защиты существует у высших растений, где гибель клеток вокруг очага заражения вирусами или микробами препятствует распространению патогена. Интересно, что ведущую роль в передаче сигнала о гибели в этом случае так же играет пероксид водорода.
Схема 3. Передача сигнала апоптоза между клетками.
В процессе апоптоза (вызванного, например, ФНО или Н202) в клетках-индукторах (стадии 1-3) происходит генерация Н202 внутри митохондрий (стадия 4). В цитозоле клетки Н202 усиливает апоптозные процессы (стадия 5), а, выйдя во внеклеточную среду (стадия 6) атакует клетку-реципиент (стадия 7). В клетке-реципиенте Н202 проникает в митохондрии (стадия 8) и стимулирует в них продукцию Н202 (процесс, аналогичный стадии 4), что приводит к развитию апоптоза.
Бк01 ингибирует продукцию Н202 в митохондриях (9) и предотвращает как выработку, так и восприятие сигнала апоптоза. Разобщитель окислительного фосфорилирования РССР предотвращает накопление Бк01 в митохондриях и его защитное действие (10).
Заключение
Проведенные нами« исследования- раскрыли^ сложную многоступенчатую систему защиты-клеток*от повреждений, связанных с дисфункцией'митохондрий; Эта система включает молекулярные механизмы, предотвращающие непродуктивный гидролиз, АТР и- антиоксидантные ферменты, призванные нейтрализовать угрозу и' справляющиеся» с этой- задачей при нормальном,! функционировании клетки. При стрессовых воздействиях и- при! различных патологических состояниях этой' защиты оказывается недостаточно и в клетке включаются механизмы, направленные- на< элиминацию поврежденных' митохондрий (митоптоз). Если эти усилия не обеспечивают нормальное функционирование клетки, то запускается апоптоз.* Даже кратковременное и неполное снижение уровня АТР индуцирует клеточное самоубийство. Избыточная продукция АФК в митохондриях так же является сигналом к апоптозу. По-видимому, дисфункция митохондрий опасна не только для жизни клетки, но и для организма в целом; чревата нарушением функций клетки и их, перерождением. Наши> результаты свидетельствуют о том, что митохондрии служат важнейшим сенсором, способным инициировать апоптоз: Митохондрии, по-видимому, способны воспринимать разнородные1 сигналы,- поступающие из внеклеточной среды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как при физических стрессах) и от других клеточных структур (таких как ядро, цитоскелет, ретикулум и др.), суммировать их, перерабатывать с учетом* особых про- и анти- апоптотических механизмов* и< выдавать- унифицированный сигнал, который может практически* неизбежно вести к гибели клетки. Более того, выработка1 АФК в митохондриях участвует в формировании межклеточного сигнала, вызывающего коллективное самоубийство- окружающих клеток. Этот защитный механизм должен препятствовать распространению повреждающего воздействия на более значительные области ткани. Описанные нами многочисленные защитные механизмы ослабевают при старении и оказываются неэффективны при развитии различных патологий. Кроме того, чрезмерные защитные реакции (в частности индивидуальный и коллективный апоптоз) могут лежать в основе нарушения жизненных функций организма. Описанные в нашей работе митохондриально-направленные антиоксиданты могут стать важнейшим оружием в борьбе с патологиями, связанными с дисфункцией митохондрий.
Выводы
1. Показано, что при» повреждении, мембраны митохондрий > активируются два механизма регуляции, митохондриальной АТР синтазы: образование^ неактивного комплекса с ADP-и^переход комплекса с белком-ингибитором'в неактивное' состояние. Эти,» механизмы* способны« эффективно тормозить непродуктивный гидролиз АТР вмитохондриях.
2. Временное- и> неполное снижение уровня* АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток.
3. Показано, что при окислительном, стрессе митохондрии служат основным, источником активных форм кислорода (АФК).
4. Показано, что5 окислительное повреждение приводит к открытию неселективной циклоспорин-чувствительной' поры во внутренней мембране митохондрий. Открытие поры контролируется уровнем восстановлености глутатиона и NAD(P)H в митохондриях.
5. Накопление АФК в митохондриях приводит, к их обратимой; фрагментации и распаду единойгэлектрической митохондриальной сети.
6. Продолжительное повреждение митохондрий ведет к их элиминации (митоптозу). При массовом повреждении! митохондрии, формируют крупные, кластеры в перинуклеарной области, которые затем выбрасываются из клетки« по механизму сходному с экзоцитозом.
7. Накопление АФК в митохондриях при окислительном стрессе приводит- к индукции апоптоза. Инициация апоптоза связана с перемещением белка ВАХ из цитоплазмы в митохондрии. Этот процесс зависит от окисления транслокатора адениновых нуклеотидов во внутренней мембране митохондрий.
8. Образование АФК в митохондриях приводит к выработке межклеточного сигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток.
9. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты в наномолярных концентрациях защищают митохондрии от окислительного повреждения и фрагментации, предотвращают апоптоз при окислительном стрессе и выработку межклеточного апоптозного сигнала.
Основные публикации.
I. Черняк Б.В., Козлов И.А. Локализация каталитического центра Н+-АТФазы в митохондриальной мембране. ДАН ССР (1976) 231, 222-225.
2 .Козлов И.А., Черняк Б.В. Взаимодействие бифункциональных сшивающих реагентов с растворимой митохондриальной АТФазой. ДАН ССР (1978) 238, 1479-1482.
3. Chernyak, B.V., Kozlov, I.A. Adenilylimidodiphosphate release from the active site of submitochondrial particles ATPase. FEBS Lett., (1979) 104, 215-219.
4. Chernyak V.Ya., Kozhanova Z.E., Chernyak B.V., Kozlov I.A. Investigation of soluble mitochondrial ATPase by the reacting enzyme. Eur. J. Biochem. (1979) 98, 585-589.
5. Chernyak, B.V., Chernyak, V.Ya., Gladysheva, T.B., Kozhanova, Z.E., Kozlov, I.A. Structural rearrangements in soluble mitochondrial ATPase. Biochim. Biohys. Acta, (1981) 635, 552-570.
6. Козлов И.А., Черняк Б.В. Мембранный потенциал и синтез АТР на сопрягающих мембранах. Успехи Биол. Химии (1983) 24, 65-82 (Обзор).
7. Гладышева Т.Б., Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю.,- Черняк Б.В. Исследование влияния мембранного потенциала на скорость гидролиза АТФ в субмитохондриальных частицах. ДАН ССР (1984) 276, 980-983.
8. Chernyak B.V., Khodjaev E.Yu., Kozlov I.A. The oxidation of sulfhydryl groups in mitochondrial F1 -ATPase decreases the rate of its inactivation by the natural protein inhibitor. FEBS Lett. (1985) 187, 253-256.
9. Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Редокс регуляция взаимодействия митохондриальной Н+-АТРазы с природным белковым ингибитором. ДАН СССР (1985) 281, 1482-1484.
10. Chernyak B.V. Kozlov I.A. Regulation of H+-ATPases in oxidative phosphorylation and photophosphorylation. Trends in Biochem Sci. (1986) 11, 32 — 39 (Обзор).
II. Духович В.Ф., Козлов И.А., Левит М.Н., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Почему преинкубация митохондрий гепатомы с разобщителями вызывает снижение АТРазной активности. Биол. Мембр. (1986) 3, 506-512.
12. Черняк Б.В., Духович В.Ф., Ходжаев Е.Ю. Что определяет скорость гидролиза АТР в митохондриях. Д АН СССР (1987) 294, 497-499.
13. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The effect of the natural protein inhibitor on H+-ATPase |in hepatoma 22a mitochondria. FEBS Lett. (1987) 215, 300-304.
14. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The interaction of MgADP with H+ -ATPase in rat liver mitochondria. FEBS Lett. (1988) 230, 159-162.
15. Гладышева Т.Б., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Влияние дельта мю Н+ на скорость гидролиза АТР в субмитохондриальных частицах. Биол. Мембр. (1989) 6, 159-166.
16. Chernyak B.V., Khodjaev E.Y. Energization of the membrane prevents the formation of tight inactive complexes of ATPase with MgADP in submitochondrial particles. FEBS Lett., (1989) 254,79-82.
17. Bronnikov G.E., Vinogradova S.O., Chernyak B.V. Regulation of ATP hydrolysis in liver mitochondria from ground squirrel. FEBS Lett. (1990) 266, 83-86
18. Khodjaev E.Yu., Komarnitsky F.B., Capozza G., Dukhovich V.F., Chernyak B.V., Papa S. Activation of a complex of ATPase with the natural protein inhibitor in submitochondrial particles. FEBS Lett. (1990) 272, 145-148.
19. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. Regulation of ATP hydrolysis in hepatoma 22a mitochondria. Arch Biochem Biophys. (1991) 286, 604-609.
20. Chernyak B.V., Cross R.L. Adenine nucleotide-binding sites on mitochondrial Fi -ATPase. Studies of the inactive complex formed upon binding ADP at a catalytic site. Arch. Biochem. Biophys. (1992) .295, 247-252.
21. Rouslin'W., Broge C.W., Chernyak B.V. Zn2+ allows differentiation between two kinds of IFl-ATPase interaction in intact mitochondria. Ann.N.Y. Acad. Sci. (1992) 671, 507-508.
22. Rouslin W., Broge C.W., Chernyak B.V. Effects of Zn2+ on the activity and binding of the mitochondrial ATPase inhibitor protein. J. Bioenerg. Biomembr. (1993) 25, 297-306.
23". Chernyak B.V., Dedov V.N., Gabai V.L. Mitochondrial ATP hydrolysis and ATP depletion in thymocytes and Ehrlich ascite carcinoma cells. FEBS Lett. (1994) 337, 56-59.
24. Дедов B.H., Габай B.Jl., Черняк Б.В. Действие белкового ингибитора, митохондриальной АТРазы в интактных тимоцитах крысы и клетках асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия (1995) 60, 1138-1145.
25. Chernyak B.V., Dedov V.N., Chernyak V.Ya. Ca2+ -triggered" membrane permeability transition in deenergised mitochondria from* rat liver. FEBS Lett. (1995) 365, 75-78.
26. Chernyak B.V., Sigalat C., Diolez P., Haraux F. Enzyme turnover is essential for deactivation of FoFi in plant mitochondria. Bichim. Biophys. Acta (1995) 1229, 121-128.
27. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P. Selective inhibition of the mitochondrial permeability transition pore at the oxidation-reduction sensitive dithiol by monobromobimane. FEBS Lett. (1995) 362, 239-242.
28. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P: Modulation of the mitochondrial permeability transition pore by pyridine nucleotides and dithiol oxidation at two separate sites. J. Biol. Chem. (1996) 271, 6746-6751.
29. Chernyak, B.V. Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore is modulated by oxidative agents through both pyridine nucleotides and glutathione at two separate sites. Eur. J. Biochem. (1996) 238, 623-630.
30. Starkov A.A., Bloch D.A., Chernyak B.V., Dedukhova V.L, Mansurova S.E., Severina I.I., Simonyan R.A., Vygodina T.V., Skulachev V.P. 6-Ketocholestanol is a recoupler for mitochondria, chromatophores and cytochrome oxidase proteoliposomes. Biochim. Biophys. Acta (1997) 1318; 159-172.
31. Chernyak B.V. Redox regulation of the mitochondrial permeability transition pore. Biosc. Rep. (1997) 17, 293-302 (Обзор).
32. Chernyak B.V. Cyclosporin A - sensitive release of Ca2+ from mitochondria in intact thymocytes. FEBS Lett. (1997) 418, 131-134.
33. Дедов B.H., Демин О. В., Черняк В. Я., Черняк Б. В. Индукция неселективной проницаемости внутренней мембраны в деэнергизованных митохондриях. Биохимия (1999) 64, 809-816.
34. Черняк Б.В. Индукция неселективной митохондриальной поры-в лимфоидных клетках. 1. Пермеабилизованные тимоциты крысы. Биохимия (1999) 64, 916-921.
35. Черняк Б.В. Индукция! неселективной митохондриальной поры в лимфоидных клетках. 2. Интактные тимоциты крысы. Биохимия (1999) 64, 922-928.
36. Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Черняк Б.В., Скулачев В.П., Васильев Ю.М. Действие ингибиторов цитоскелета на развитие апоптоза, вызванного фактором некроза опухолей Биохимия (2003) 67, 737-746.
37. Щепина Л.А., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В. Апоптоз клеток HeLa и антиапоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия (2002) 67, 265-270.
38. Shchepina L.A., Pletjushkina O.Yu., Avetisyan A.V., Bakeeva L.E., Fetisova E.K., Izyumov D.S., Saprunova V.B., Vyssokikh M. Yu., Chernyak B.V., Skulachev V.P Oligomycin, inhibitor of the F0 part of H+-ATP-synthase, suppresses the TNF induced apoptosis. Oncogene (2002) 21, 8149-8157.
39. Abdullaev Z.Kh., Bodrova M.E., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Kluck R.M., Pereverzev M.O., Arseniev A.A., Efremov R.G., Kirpichnikov M.P., Mokhova E.N., Newmeyer D.D., Roder H., Skulachev V.P. A cytochrome с mutant with high electron transfer and antioxidant activities but devoid of apoptogenic effect. Biochem. J. (2002) 362, 749-754.
40. Skulachev V.P., Bakeeva. L.E., Chernyak B.V., Domnina L.V., Minin A.A., Pletjushkina, O.Y., Saprunova V.B:, Skulachev I.V., Tsyplenkova V.G., Vasiliev J.M., Yaguzhinsky L.S., Zorov D.B. Thread-grain transition of mitochondrial, reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis. Moll Cell. Biochem. (2004) 256-257, 341-358 (Обзор).
41. Lyamzaev K.G., Izyumov D.S., Avetisyan A.V., Yang F., Pletjushkina O.Y., Chernyak BiV. Inhibition of mitochondrial bioenergetics: the effects on structure of mitochondria in the cell'and on apoptosis. Acta Biochim. Pol. (2004) 51; 553-562.
42. Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Y., Saprunova V.B., Bakeeva L.E., Chernyak. B.V., Skulachev V.P. Selective elimination of mitochondria from living cells induced'by inhibitors of bioenergetic functions. Biochem. Soc. Trans. (2004) 32; 1070-1071.
43. Izyumov D.S., Avetisyan A.V., Pletjushkina O.Y., Sakharov D.V., Wirtz K.W., Chernyak B.V., Skulachev V.P. "Wages of fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biochim. Biophys. Acta (2004)<1658, 141-147.
44. Domnina L.V., Ivanova O.Y., Pletjushkina O.Y., Fetisova E.K., Chernyak B.V., Skulachev V.P., Vasiliev J.M. Marginal blebbing during the. early stages of TNF-induced apoptosis indicates alteration in actomyosin contractility. Cell Biol. Int. (2004) 28^ 471-475.
45. Pletjushkina O.Y., Fetisova E.K., Lyamzaev K.G., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Vyssokikh M.Y., Pustovidko A.V., Vasiliev J.M., Murphy M.P., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Longdistance apoptotic killing of cells is mediated by hydrogen peroxide in a mitochondrial ROS-dependent fashion. Cell Death Differ. (2005) 12, 1442-1443.
46. Sakharov D.'V., Elstak E.D., Chernyak B.V., Wirtz K.W. Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with> oxidation-sensitive probe G11-BODIPY581/591. FEBS Lett. (2005) 579; 1255-1260.
47. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Astapova MiV., Dedukhova V.I., Chernyak B.V., DolgikfrD.A., Arseniev A.S., Skulachev V.P., Kirpichnikov M.P. Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome с mutants in living cells. Apoptosis (2005) 10/797-808.
48. Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Изюмов Д.С., Лямзаев К.Г. , Аветисян А.В: Биоэнергетика и смерть. Биохимия (2005) 70, 240-245 (Обзор).
49. Плетюшкина О.Ю., Фетисова Е.К., Лямзаев К.Г., Иванова О.Ю., Домнина Л.В., Высоких М.Ю., Пустовидко А.В., Алексеевский А.В., Алексеевский Д.А., Васильев Ю.М., Мерфи М.П., Черняк Б.В., Скулачев В.П. Перекись водорода, продуцируемая в митохондриях участвует в передаче сигнала апоптоза между клетками. Биохимия (2006) 71, 60-67.
50. Pletjushkina O.Y., Lyamzaev K.G., Popova E.N., Nepryakhina O.K., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum. Biochim Biophys Acta. (2006) 1757, 518-524.
51. Chernyak B.V., Izyumov D.S., Lyamzaev K.G., Pashkovskaya A.A., Pletjushkina O.Y., Antonenko Y.N., Sakharov D.V., Wirtz K.W., Skulachev V.P. Production of reactive oxygen species in mitochondria of HeLa cells under oxidative stress. Biochim. Biophys. Acta. (2006) 1757, 525-534.
52. Chertkova R.V., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Latypov R.F., Chernyak B.V., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Proapoptotic activity of cytochrome с in living cells: effect of K72 substitutions and species differences. Mol. Cell Biochem. (2008) 314, 85-93.
53. Lyamzaev K.G. Nepryakhina O.K.,Saprunova V.B., Bakeeva L.E., Pletjushkina O.Y., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Novel mechanism of elimination of malfunctioning mitochondria (mitoptosis): formation of mitoptotic bodies and extrusion of mitochondrial material from the cell. Biochim. Biophys. Acta. (2008) 1777, 817-825.
54. Непряхина O.K., Кузнецова А.Ю., Лямзаев К.Г., Изюмов Д.С., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Скулачев В.П. Активные формы кислорода, генерируемые в митохондриях, индуцируют фрагментацию митохондриального ретикулума в клетках HeLa. Доклады РАН (2008) 420, 559-561.
55. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина JT.B., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина O.K., Пашковская А.А., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко А.В., Рогинский
B.А., Рокитская Т.И., Рууге Э.К., Сапрунова В.Б., Северина И.И., Симонян Р.А., Скулачев И.В., Скулачев М.В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлитский В.Н., Васильев Ю.МС, Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замятнин А.А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное с митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in« vitro. Биохимия (2008) 73, 1587-1604.
56. Агапова Л.С., Черняк Б.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Ефименко А.Ю., Фетисова Е.К., Иванова, О.Ю., Калинина Н.И., Личиницер М.Р., Лукашев А.Н., Хромова Н.В., Копнин Б.П., Коротецкая М.В., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н., Шагиева Г.С., Скулачев М.В., Степанова Е.В., Титова Е.В., Ткачук В.А., Васильев Ю.М., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное с митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 3. SkQl подавляет развитие опухолей из р53-дефицитных клеток (2008) Биохимия, 73, 1620-1638.
57. Antonenko Y.N., Roginsky V.A., Pashkovskaya А.А., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Zaspa A.A., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Protective effects of mitochondria-targeted antioxidant SkQ in aqueous and lipid membrane environments. J. Membr. Biol. (2008) 222, 141-149.
58. Skulachev V.P., Anisimov V.N., Antonenko Y.N., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Erichev V.P., Filenko O.F., Kalinina N.I., Kapelko V.I., Kolosova N.G., Kopnin B.P., Korshunova G.A., Lichinitser M.R., Obukhova L.A., Pasyukova E.G., Pisarenko ОЯ., Roginsky V.A., Ruuge E.K., Senin I.I., Severina I.I., Skulachev M.V., Spivak I.M., Tashlitsky V.N., Tkachuk V.A., Vyssokikh M.Y., Yaguzhinsky L.S., Zorov D.B. An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach. Biochim. Biophys. Acta (2009) 1787,437-461 (Обзор).
59. Муфазалов И.А., Пеньков Д.Н., Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Высоких М.Ю., Кирпичников М.П., Долгих Д.А., Круглов А.А., Купраш Д.В'., Скулачев В.П., Недоспасов
C.А. Получение и характеристика мышиных эмбриональных фибробластов с мутацией K72W в соматическом гене цитохрома с. (2009) Мол. Биол. 43, 648-656.
60. Fetisova Е.К., Avetisyan A.V., Izyumov D.S., Korotetskaya M.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. Mitochondria-targeted antioxidant SkQRl selectively protects MDR (Pgp 170)-negative cells against oxidative stress. (2009) FEBS Lett. 584, 562-566.
61. Изюмов Д.С., Домнина Л.В., Непряхина O.K., Аветисян A.B., Голышев С.А., Иванова О.Ю., Коротецкая М.В., Лямзаев К.Г., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н., Черняк Б.В. Митохондрии как источники активных форм» кислорода при окислительном стрессе. Исследование с помощью новых митохондриально-направленных антиоксидантов на основе «ионов Скулачеква». (2010) Биохимия 75, 149-157.
62. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Егоров М.В., Иванова О.Ю., Ильинская О.П., Плетюшкина О.Ю., Попова Е.Н, Сахаров И.Ю., Федоров А.В., Черняк Б.В. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты на основе «ионов Скулачева» ускоряют заживление кожных ран у животных. (2010) Биохимия 75, 274-280.
-
Черняк, Борис Викторович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.00.25
- Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности
- Биохимические закономерности действия на митохондрии модельных нейротоксинов и нейропротекторных препаратов
- Участие митохондрий в окислительном и нитрозильном стрессе при ишемии/реперфузии почки
- Роль анионного канала в транспорте супероксида из митохондрий в условиях кальциевого стресса
- Митохондрии как центральное звено повреждающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности
