Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени и сердца

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пути разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени и сердца"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

РГ6 од

Биологическим факультет

: 8 лПР да

На правах рукописи

СТАРКОВ Анатолий Анатольевич

ПУТИ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994 г.

Работа выполнена в отделе биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е. Н. Мохова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Г. Д. Миронова кандидат биологических наук Т. В. Вотякова

Ведущая организация: Институт проблем передачи информации РАН (ИППИ).

Защита состоится « » 1994 года в часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор Н. Б. Гусев

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Жирные кислота играют ваясную роль в окислительном обмене не только как субстраты окисления, но и как природные разобщители окислительного фосфорилирования. Разобщающий Эффект ЖИрНЫХ КИСЛОТ был открыт 3 1956 Г [Pressman and Lardy, 1956], однако к настоящему времени разобщающее действие жирных кислот достаточно полно исследовано только для митохондрий бурой жировой ткани, специализированной на терморегуляторной

ТвПЛОПрОДУКЦШ [СМ. Nicho lis and Locke 1984 И ССЫЛКИ ТЗМ Же] .

Интерес к разобщающему действию жирных кислот был связан глзенем образом с их участием в 'несократительном термогенезе, которое было предсказано на основе концвнши В.П.Скулачева о свободном окисловии, и подтверждено в сштах с митохондриями скелетных мышц при кратковременном охлаждении животных [Скулачев и Маслов, I960; Grav and Blix, 1973]. В митохондриях печени ЖИр-ше кислоты являются также физиологическими активаторами окисления внэмитохондриалъного НАДН по "внешнему" пути , имеющего прямое отношение к термогенозу в этой ткани [В.П.Скулачев, 1969].

В настоящее время внимание к жирным кислотам как эндогенным разобщителям направлено в основном на изучение их повреждающего действия в клетках и тканях при различии патологиях. Показано, что концентрация свободных кпрнкх кислот в тканях быстро и значительно возрастает при пиемии или аноксии различных тканей, л осссенно сердца [7us.se G J et al, 1982; Chien К R et si, 1984] И печет! IBoine I et al, 1970; Färber J L and Voting E E. 1981] .

Несмотря на почти 40 лет исследований, к настоящему времени молекулярный механизм разобщения окислительного фосфорилировакия нщзеыш кислотам остается невыясненным. Опубликованные данные расходятся в отнокаюш действующих концентраций вирных кислот и факторов, влияло!"' m разобщение. Существующие гипотезы относительно механизма разпбцения также во многом противоречии!.

Причина этих противоречий становится понятной, если отказаться от представлений о существовании единого механизма разобща-яцего действия жирных кислот. Анализ литературных данных позволяет щраддоложкть, что кгсрные кислоты могут разобщать окислительное 2оаЭорилирование в митохондриях несколькими различными способами, в зависимости как от специфяческгос особенностей ткани, из которой выделены митохондрии, так и от экспериментальных условий.

Недавно было обнаружено, что разобщающее действие

пальмитиновой - кислоты в митохондриях скелетных мышц и печени опосредовано АТФ/АДФ-аНТШЮртерОМ [A.Yu.Andreyev, 1989] . Этот интегральный болок внутренней мембраны митохондрий, присутствующий во всех тканях, является неотъемлемым компонентом системы окислительного фосфорилировашш и одним из ключевых звеньев в регуляции производства энергии митохондриями. Поэтому представляется ванным более подробно исследовать роль АТФ/АДФ-антипортера в различных путях разобщения энергетического сопряжения жирными кислотами в ипохондриях из разных тканей.

ШЗь_и_за£ачи_исслэаования. Основная часть работы ' посвящена развитию представлений об участии АТФ/АДФ-антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях сердца. Другая часть диссертации посвящена изучению Са2+-зависимого разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени. Круг исследований был ограничен следующими задачами:

1.) Сравнить действие жирной кислоты на .энергетическое сопрянение митохондрий сердца и субмитохондриалышх частиц, при этом: а)-, исследовать действие жирной кислоты ьа дыхание и ы> митохондрий;..

б) изучить действие жирной кислоты на сопряженность вывернутых субмитохондриалышх частиц, приготовленных из митохондрий сердца,-

в) сравнить действие ингибиторов АТФ/АДФ- антипортера и его субстрата АДФ на разобщение индуцированное жирной кислотой в митохондриях сердца и субмитохондриалышх частицах.

2.)Исследовать роль АТФ/АДФ-антипортера в Са2*-зависимом разобщении митохондрий печени жирными кислотами: а) изучить действие субстратов АТФ/АДФ- антипортера (АДФ и АТФ) и его ингибитора -карбоксиатрактилата ,а так же L-каршгоша на Са2+-зависимое разобщение митохондрий печени жирными кислотами,- С) изучить действие жирной кислоты на дФ и дыхание митохондрий печени цри активации in vitro "внешнего" пути окисления внемитохондриального НАДИ и его .чувствительности к ингибиторам и субстратам: АТФ/АДФ-антипортера.

Научная новизна работы: Изучено влияние длинноцепочечной жирной кислоты на энергетическое сопряжение митохондрий сердца. Впервые показано, что' пальмитиновая кислота в разобщающих концентрациях вызывает значительное снижение электрического мембранного потен циала не только митохондрий сердца, но и субмитохондриалышх частиц. При этом специфический ингибитор АТФ/АДФ-антипортера, действующий с цитоплазматической стороны внутренней митохондриаль-ной мембраны -карбоксиатрактплат, и субстрат антипортера -АДФ полностью или частично подавляют разобщающее действие пальмитата в

митохондриях, но не в СЫЧ. Бонгкрековая кислота, являющаяся ингибитором антипортера, способны.: проникать через внутрешпсю митохон-дриальную мембрану, частично подавляет действие пальмитата и в митохондриях, и в СМЧ .

Результата, полученные в опытах с диполышм модификатором флоретпяом, позволяют предположить, что анион жирной кислоты сам по себе -или не пересекает внутреннюю мембрану митохондрий, или этот процесс не вносит существенного вклада в разобщающее действие «ирной кислоты, по крайней мерз в условиях наших опытов.

Совокупность полученных результатов подтверждает предположение об участии АТФ/АДФ- антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях сердца. Приведенные в диссертации данные о подавлении карбоксиатрактилатом потешдаирупцего действия ТФФ+ при разобщении митохондрий пальыитатом также подтверждают это предположение .

Показано, . что ь-карниткн в сочетании с АТФ интибиругот Са2+-зависимое действие пальмитиновой кислоты. Изучено действие АДФ, АТФ, ь-карнитипа, Мд2"1" и кзрбоксиатрактилата на пермеабилизо-ванные кальцием и пальмитиновой кислотой митохондрии печени. Полученные данные позволяют считать, что по крайней мере в условиях еэщих опытов, в Са"+- зависимом повреждении митохондрий участвуют непосредственно жирные кислоты, а не их ацил-КоА производные.

Показано, что активация пальмитиновой кислотой з.п vicro внешнего пути окисления экзогенного НАДК в I,ипохондриях печени подавляется циклоспорином А и другими ингибиторам: неспецифического увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий. Это доказывает, что индукция Са2+~зависимой поры внутренней мембраны митохондрий является молекулярным механизмом Са2+-зависимой активации агарными кислотам внешего пути окисления НАДН.

На основании полученных результатов сделано предположение об участии АТФ/АДО-агтяпсртера в Са2+-завискмом разобщении митохондрий жирными кислотада.

Практическое значение. работы: Полученные результаты дают новую информации о путях разобщения энергетического сопряжения митохондрий длинноцепочечяыми жирными кислотами. Показано, что АТФ/АДФ-знтипортер является основным элементом механизма разобщающего действия стрных кислот в матохонфиях печзнз и сердца при различных путях разобщения. Результаты могут быть использованы при дальнейших исследованиях в области биоэнергетики. Кроме того, они • способствуют пониманию причин тканоспецифичности повреждающего действия свободных жирных кислот в клетках и тканях при патологи-

ческих состояниях организма.

Апробация работы; Результаты исследований докладывались на 7-ой конференции ЕВЕС, сателлитом симпозиуме по кальциевому транспорту, (The Seventh ЕВЕС meeting. Satellite Symposium on calcium transport, Helsinki, 1992); IIa 5-ОМ РоССИЙСКО-ШвеДСКОМ симпозиуме по Физико-химической Биологии, Биомембранам, Биоэнергетике, Фотосинтезу, Пупашо, 1992г.,- а также на научных семинарах лаборатории биоэнергетики НИИФХБ им.А.Н.Белозерского. Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура диссертации: Текст диссертации изложен на _

машинописных листах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения исследования, выводов и списка

цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована _таблицами и

_ рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение митохондрий из печени крыс.

Митохондрии из печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования /Johnson, Lardy, 1967/. Среда выделения митохондрий содержала: 250 мМ сазарозу, 5 мМ mops, 2 мМ ЭГТА, рн 7,4. Изолированную охлажденную печень гомогенизировали, гомогенат центрифугировали 10 минут при 600 д. полученный супернатант фильтровали через 3 слоя марли. Для получения митохондрий супернатант центрифугировали 10 минут при 12000 д, осадок суспендировали в среде выделения и вновь осавдали ( 10 мин, 12000 д). Полученные митохондрии суспендировали в среде выделения и хранили в на льду. Количество митохондриального белка в суспензии определяли биуретовым методом, используя бычий сывороточный альбумин КгК стандарт. . ■...•■

Выделение митохондрий из сердца крыс.

Митохондрии выделяли из сердец белых крыс весом 150 -200 г. Среда выделения митохондрий содержала 0.25 Ы сахарозу, 10 Mil Mops, I мМ ЭГТА, pH 7.4. Гомогенат (соотношение ткань :среда составлло 1:8) центрифугировали 10 мин при 700 д; митохондрии осаждали 10 мин при 12000 д, ресуспендировали в I мл среды такого ке состава с добавлением 3 мг/мл БСА, затем добавляли среду без БСА и центрифугировали 10 мин при 12000 д. Митохондрии суспендировали в среде, содержавшей 250 мМ сахарозу, I мМ ЭГТА, 10 мМ Mops, pH 7,4; суспензия содержала 60 - 80 мг белка/мл.

Регистрация дыхания суспензии ьягеохондрий.

Дгааниэ суспензии митохондрий регистрировали полярографическим методом с помощью кислородного электрода типа Кларкэ и полярографа lp-э ( ЧССР ) при 27°С и непрерывном перемешивании запаянной в стекло или тефлон магнитной меаалкой. Регистрация светорассеяния суспэкзией изолированных митохондрий.

Набухание митохондрий регистрировали по изменению интенсивности света, прошедшего через через суспензию митохондрия. Ход лучей горизонтальный, длина волш ок. 66G та, объем ячейкк-I мл. Ягизрэлнз мембранного потенциала мгсохондррй и субштохондриэльнэт частиц.

Трансмс.чбрзинкй потенциал в митохондриях определяли

методом пглшкгюЕЮс ' хатксшз, по распределения ТвФ+ между [латрик-ссм матохопдрай и средой ипсубациц. Концентрации про никаодего каззкш в среде инкубации шкврялк при помечен ТФФ+-селективного электрода, Используемый электрод имел крутизну электродной функции (к.о.ф. ) 57 мЕ.

Транемаглс'ронняй потенциал в субкатохоидриакьянх частицах определяла по раецределошю провисающего анаопа CKS" между средой лысубанки к внутренним обгс?.ш частиц. Концентрацию ФК1Г в ерзде шгсуо'зцик определяла при помоги 'ГКВ~-свлективвого электрода с к.э.ф. 42 «.«В. Оба электрода бала изгоговлзны А. Старковым по стандартным кетозжэк cava et ai, 1979].

В некоторш: оянтзх траксызхбратй потенциал на внутренней мембране ъитохондалй оцеаивали слектрофэтомзтрическпм методом по разности поглоценкя зонда сайрагонз 0 при длинах воле 555 : 523 км. Длл зтях акмгсржоЕтсг, попользовали двухвалковой спектрофотометр, оснащений кюветой объеяом 3 мл и вибрационной мешалкой. УЬедяченпо разнос^-: ттзглощешм соответствовала снижена» мембранного потенциала ь/хсоядрий.

В работе использовали ояггошцин, ДНО, mops, ЭТТА, сафранин О (" sekva"ФРГ'), ротеноп, пируват, глутамат, малат, пальмитиновую кислоту С CIGMA", США ), ФКФ И MgClg (Fluka) ,ТФФ+с1 (Merck) если ьеаркп о.с.ч., Согараахпм. Сахарозу ( х.ч,, Соазраа-хш ) дазвдц перокртотоялизовавзли кз нгешцонного раствора в бкдиошпяированной ' воде двавда перегнанным этиловым спиртом. Ротапон, ФКФ и пэльгатипсвую кислоту растворяла в дваады перегнанном этиловом спирте.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

i. влигаш шкотшовои кислоты и шгишоров атф/адф - антк-

ПОРТЕРА НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА И СУЫШТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ.

1.1. Влияние пальмитиновой кислоты и ингибиторов АТФ/АДФ-антипортера на дыхание и л^ изолированных митохондрий сердца крысы.

Как показано на Рис.1, кривые а-в, кАтр полностью подавляет дыхание митохондрий сердца крысы, стимулированное пальмитиновой кислотой в присутствии олигомицина. Последующая добавка ДНФ вновь стимулирует дыхание. АДФ (кривая "в") и Оонгкрековая кислота (не показано) также подавляли стимулированное пальштатом дыхание, но действие этих веществ было слабее чем карбоксиатрактилата. Интересно , что действие ингибиторов АТФ/АДФ-антипортера и АДФ на стимулированное пальмитатом дыхание митохондрий по-разному зависели от порядка добавок. Как видно из Табл.1, АДФ и бонгкрековая кислота частично подавляли стимулированное разными концентрациями пальштата дыхание, когда добавлялись к митохондриям после жирной кислоты, и не проявляли эффекта при обратном порядке добавок. Карбоксиатрактилат не только подавлял, но и предотвращал стимуляцию дыхания пальмитатом, хотя и с меньшей эффективностью (Табл.1). Важно отметить, что кАтр ингибировал разобщающее действие пальштата и дыхание митохондрий сердца, фосфорилируюодах экзогенный АДФ, примерно в одинаковых концентрациях (данные не приведены).

Стимуляция дыхания митохондрий пальмитиновой кислотой сопровождалась снижением ЬФ, которое обращалось полностью карбоксиатрактилатом и частично обращалось при добавлении АДФ пли бонгкрековой кислоты (Рис.2.а-в). Ни АДФ, ни ингибиторы АТФ/АДФ-антипортера не обращали падение ьу индуцированное низкими концентрациями ФКФ (Рис.2.г).

Необходимо упомянуть, что бонгкрековая кислота, в отличие от кАтр, не подавляла разобщающее действие пальмитата, если среда инкубации содержала 1-2 мМ

Добавление пальмитиновой кислоты на фоне кАтр вызывало небольшое увеличение д<Р митохондрий, особенно заметное при.сниженном рН среды инкубации (Рис.З.а), так же как и собственно кАтр. На фоне бонгкрековой кислоты таких эф$ектов не наблюдалось, однако

Рис.1. Действие ингибиторов АТФ/ЛД5-антипортера и ЛДФ на стимулированное пальгмтатом дыхакиэ ыктохсндрий сердца.

Среда инкубации: 0,25 М сахароза, 10 мМ МОПС, 0,5 ?лМ ЭГТА, 5 ыМ глутамат, 5 мМ малат, олигомицин (I мкг/мл), БСА (0,2 мг/мл), рН 7,4 , й=27°С. Добавки: мтх- митохондрии сердца крысы (I мг/мл), ПК- 30 мкМ пальмитиновая кислота, кАтр- 2 мкМ карбоксиатрактилат, АДФ - 40 мкМ АДФ, ДКФ- 5 мкМ ДКФ.

[Т®Ф ;,мкм

0,125-

0,35

0,5

5.0

- дно

ПК I

I

П

1ГФФ 1.ЫК1.1 о, 1 г 5-

(1

кАтр

V

1 . о

1ТФ0 1,мкМ О,'.25 -

\ 1,0

ПК

4

п

дн®

д

(ТФв 1,мкМ

О, 12 5-

КАтр

- I

АДФ

1,0

п

ФКФ КАтр

Рис.2. Действие кврбохсиатрактияата, бонткреховой кислоты и АДФ на сниженный пальмитиновой кислотой д<I/ митохондрий сердца.

Среда инкубации: 0,25 М сахароза, 10 мл МОПС, 0,5 м!Л ЭГТА, 5 (Л! сукцинат, олигсжищш (I мкг/ця), I мкМ ротенон, БСА (0,4 от/мл), 1,5 мкМ ТФСГ, рН 7,4 , ь=28 С. Добавки: митохондрии сердца крысы (0,8 мг/мл); пк- 40 мкМ пальмитиновзя кислота (а,г) и 20 икМ пальмитиновая кислота (б); кАтр- 2 мкМ карбоксиатрактилат,- АДФ -20 мкЦ АДФ,- ЕК - 5 глкГД бонгкрековая кислота,- ФКФ - 120 ям ФКФ

Таблица I.

Влияние очередности добавления на эффективность ингабирукщего действия лигандов АТФ/АДФ-антипоптера на ст1шул!фованное пальшта-том дыхание митохондрий сердца.

Среда инкубации: 250 мМ сахароза, I мМ ЭГТА, 10 ыЫ МОПС (рН 7,4), 5 Ш сукцинат, 2 мкМ ротенон, 2 мкг/мл олигомицин, митохондрии сердца крысы (0,7 мг белка/мл), t=26uC . Приведены средние значения ± в.е.,- п=3 (БК, палм-КоА, ДНО),п=4 (АДФ), п=10 (кАтр)

дооавка 2-я 1-Я добавка +30мкМ паль- ■ мптат +2мгсМ КАтр +7мкМ БК +2 икМ палм-КоА +40мкМ АДФ + 8 икН ДНФ

6 ± 1,2 28±3,0 5 ±0,7 5 ±1,1 6 ± 1,4 6 ± 1,1 32± 4,8

+30 мкМ пальмитат 28 ±3.0 - 7 ±2,2 14±4,2 20± 4,8 15± 2,1 34± 4,0

+■ 2 мкМ КАтр 5 ± 0,7 9 ±1,6 - - - - . 30± 3,0

+ 7 МКМ БК 5 4 1,1 27±4,3 - - - - 32± 4,6

6 ± 1,4 28±3,3 - —- - -. 33± 4,5

+40 мкМ АДФ 6 ± 1,1 26±3,1 - - - - 30± 2,3

+ 8 мкМ дне 32 ±4,8 32±3,5 26±2,1 30±3,7 32±4Д 27±1,9 -

1тфф ),ыкы

О, I 25-

1, О

1т05 1.ыкы О, 12 5'

0.«

1, О

. 4МИН

Рис.3. Действие карбоксиатрактилата, бонгкрековой кислоты и пальмитата на д^ Ю1тохондрий сердца крысы.

Среда инкубащш0,25 М сахароза, 10 мМ МОПС, 0,5 мМ ЭГТА, 5 мМ сукцинат, олиго.мицин (I мкг/мл), I мкМ ротенон, БСА (0,2 мг/мл), 1,5 мкМ ТФФ , рН 7,0 , с=26 С. Добавки: митохондрии сердца крысы (1,0 мг/мл),- ПК- 30 мкМ пальмитиновая кислота ,• кАтр- 2 мкМ карбоксиатрактилат,- БК - 10 мкМ Оонгкрековая кислотаДНФ- 12 мкМ

да.

0.3$

0.25

сама бонгкрековая кислота значительно сильнее увеличивала дФ митохондрий, чем кАтр (Рис.З.б). Включение в среду инкубации устраняло эти эффекты кАтр, пальмитата и Сонгкрековой кислоты. Эти • данные можно объяснить, предположив, что пальмитиновая кислота помимо сзозго разобщапцего действия способна осуществлять Ме+/Н+ обмен, что неоднократно предполагалось ранее. По-видимому, такое же объяснение применимо к к эффектам Сонгкрековой кислоты, хотя для доказательства необходимы дальнейшие исследования.

Таким образом, шлученннэ результаты ясно указывают, что в митохондриях сердца АТФ/АДФ-антхпортер участвует в разобщающем действии жирных кислот. В пользу такого предположения свидетельствует подавление стимулированного па.чьмитатсм дыхания митохондрий и восстановление сниженного киркой кислотой мембранного потенциала под действием специфических ингибиторов АТФ/АДФ-антипогторз. Полученные данные находятся в хорошем соответствии с опубликованными ранее наблюдениями, сделанными в экспериментах с млтохондрия-ми печени и мышц, а именно что среди специфических ингибиторов анишортера icAip является наиболее сильным ингибитором разобщающего действия гшршх кислот, в то время как АД®, пальмитоил-КоА и бонгкрексвая КЙСЛОТЗ были менее Э®еКТИВНЫ [Andreyev A.Yu., fit al., 1987, 1989].

1.2. ДейстБиз пальмитиновой кислоты и ингибиторов АТФ/АДФ-антипор ■гера на &Ф субгатохсндриэльшн частиц.

Вывернутые субштохондриальныз частицы, приготовленные из митохондрий сердца бмка,. были любезно предоставлены проф. А. Д. Виноградовым.

Как показано на Рис.4, добавление сукцината к СМЧ, инкубирующимся в присутствии олигомицика, вызывает генерацию дФ. 30 мкМ пальмитиновая кислота Бпзнвает еншвшо мембранного потенциала субмитохондриальнг-К чзгщц. Последующее добавление бонгкрековой кислоты частЕчао восстанавливает д»'< СМЧ. Добавление СКФ после бонгкреяовой к?.слота вновь снижает трансмембранннй потенциал СМЧ (Рис,4.а). Как и ожидалось, кпрбоксиатрактилат не влияет на сни-яеяняй пальмитатом Ait СМЧ (Рис.4.6).

При снижении мембранного потенциала СМЧ добавлением ФКФ ни бонгкрзкавая кислота, ни карбоксиатрактилат нв влияли на величину (Ее показано).

В отличяэ от описанных выше экспериментов с митохондриями, в _ стих опытах вкхзчониз неорганического фосфата в среду инкубации

№КБ 1.МКМ

сукцияат

э, о-

©КО

I 4мкН|

Рис.4. Действие бонгкрековой кислоты, карбоксиатрактилата и ФКФ на

индуюфованное пальмитатом снижение д^ субмитохондриальных частиц.

Среда инкубации: 0,25 М сахароза, 10 мМ ШПС, 0,5 ыИ ЭГТА, олигомицин (4 мкг/мл), I мкМ ротенон, 15пмкМ ФКБ . субмитохондриаль-ные частицы (0,45 мг/мл), ри 7,3 , ь=26 С. Добавки: 5 Ш сукцинат,-ПК- 30 мкМ пальмитиновая кислота ,- кАтр- 2 мкМ карбоксиатрактилат/ ЕК - 8 мкМ бонгкрековая кислота,- ФКФ - I мкМ ФКФ.

п ш <-» 4(1 м1 |>ишннгаК.кгН

II ?И 11) ВН .«¡I 11Ш )?|! ИМ, чИ

Рис.5. Действие -флоретина на дыхание митохонндрий сердца крысы в присутствии различных концентраций пальмитата и ФКФ.

Среда инкубации: 0,25 И сахароза, 10 мМ МОПС, 0,5 мМ ЭГТА, олигомицин (4 мкг/мл), 5 мМ глутамат, 5 ММ малат, митохондрии сердца крысы (1,1 мг/мл), рН 7,4 , с=2б"С. Добавки: панель А: а)-без добавок,- б)- среда инкубации дополнена 2 мкМ кАтр,- в)- в среде присутствует 20 мкм флоре тин,- г)- в среду инкубации добавлен 20 мкМ флоретин и 2 мкМ кАтр,- панель Б: кривая I- без добавок,- кривая 2- в среду инкубащш добавлен 20 мкЬТфлоретин.

О , 5-

СЫЧ не изменяло действие пальмитиновой кислоты, карбоксиатрактила-та и бонгкрековой кислота на трансмембрзпный потенциал субмитохон-дрпальных частиц.

Необходимо отметить, что АДФ в концентрациях 50-150 мкМ не оказывал действия на сниженный пэльмктатом а^ СЫЧ. Более высокие коцентраиии АДФ (300-500 мкМ) частично подавляли разобщающее действие пальмитиновой кислот». Однако добавление ФКФ после АДФ не снижало мембранн^ потенциал частиц. По-видимому, в данном случае зффекты -АДФ были связаны не с действием его на СКЧ, но с влиянием высоких концентраций этого нуклзотида на ФКБ~-селективный электрод в присутствии лилидеех везикул. Действительно, добавление 500 мкМ АДФ к СМЧ, инактивировгнным нагреванием до 90° С. приводило к перераспределению ФКЕГ, шлттзруюэдзыу генерацию мембранного потенциала, хотя и незначительного по величине (не показано).

Пальмятоил-КоА оказывал ресопрягащео действие, аналогичное бонгкрековой кислоте, хотя и не столь отчетливое. Оба ингибитора но проявляли эффекта, когда добавлялись до пальмитиновой кислоты.

Известно, что ацол-КоА длипноцепочечных жирны: кислот шггиби-руют переносчик адешшовых нуклеотидоз, ■ взаимодействуя с зим белком как с цитоплазмзтичесхоЯ сторокн [shug д., et al., i37i;

Pande S.V. and Blanchaer M.C., 1Э71; Harris R.A., et al., 1972],

■ так и со сторопк матрикса митохондрий - "в субмитохондриальных частицах [Lauquia G.J.П., st al., 1Э77; Xlingsnberg M., 1977; Paulson d.j. and shug a.l., 1901). Бонгкрековая кислота является сшгшгм ингибитором АТФ/АДФ антинортера и оказывает свое действие, связываясь с апишортером со стороны матрикса, в отлггао от другого специфического сильною ингибитора антшортера, карбокскатрак-тплата, который вэаямог.зйствувт с этил боксом со стороны цитоплазма и не проникает через внутрезнюю мембрану митохондрий (см. vignaia et ai., 19ё5). Таким образом, ингибировавке бонгкрековой кислотой и пальштоял-НоА индуцированного пальштатом снижения tras ¡Оранного потенциала ■ СКЧ и отсутствие эффекта карбоксиатрактила-та i'.otso считать дополнительным свидетельством в пользу предположения об участии АТФ/АДФ-антшгортвра в разобщающем действии жирной кислоты.

Необходимо отмэтить одну интересную особешость представленных выше данных: п в митохондриях, и в субмитохондриальных частицах отнокосительно нпзкие концентрации яирвой кислота значительно снижают íiii параллельно с стимуляцией дыхания. Эти данные противо-

речат предположению др. Роттенберга (Rottenberg н., 19 ) о том, что жирные кислоты относятся к отдельному классу разобщителей -"декаплеров" (decoupler), способных оказывать разобщающее действие без уменьшения величины мембранного потенциала. 1.3. Влияние дипольного модификатора на разобщающее действие пальмитиновой кислоты в митохондриян сердца.

Как было показано выше (см.разд.1.1), кАтр подавляет стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий. На Рис.5.А приведена зависимость скорости дыхания митохондрий от концентрации добавленной пальмитиновой кислоты в отсутствии карбоксиатрактилата (кривая а) и в присутствии предварительно добавленого кАтр (кривая б). Видно, что при возрастании концентрации добавленной жирной кислоты растет и кАтр- нечувствительная составляющая дыхания. Эта составляющая могла бы объясняться транспортом аниона жирной кислоты через липидный бислой внутренней мембраны митохондрий, не опосредованным никакими белками- переносчиками аниона. Для проверки этого предположения были поставлены опыты с модификатором дипольного потенциала липидного бислоя флоретипом.

Рис.5.Б показывает, что 20 мкМ флоретин ингибирует стимулированное ФКФ дыхание митохондрий (кривая 2), хотя и не во всем диапазоне концентраций добавленного ФКФ. Хорошо установлено, что флоретин значительно замедляет транспорт гидрофобных анионов через

КЧМ (Andersen O.S., et al., 197С; Perkins W.R., and Cafiso D.S., 1987]. По-видимому, в области низких концентраций ФКФ его разобщающее действие лимитировано не скоростью транспорта анионной формы через липидный бислой внутренней мзмбраны митохондрий, а каким-то иным фактором. Тем не менее, эти данные подтверждают применимость выводов, сделанных на основе опытов с БЛЫ, к экспериментам с митохондриями.

20 мкМ флоретин незначительно стимулирует дыхание митохондрий (Рис.5.А.в, Рис.5.Б). Низкие концентрации жирной кислоты сильнее стимулируют дыхание в присутствии флоретина (Рис.5.А.в), однако максимальная скорость дыхания не изменяется. Флоретин также увеличивает скорость дыхания в присутствии кАтр (Рис.б.А.г), при этом в области высоких концентраций пальмитата на кривой появляется плато.

Эти данные могут быть интерпретированы следующим образом: в отличие от ФКФ, анион жирной кислоты не пересекает мембрану "сам по себе". Поэтому флоретин не ингибирует дыхание, стимулированное жирной кислотой. Однако флоретин, по-видимому, изменяет распреде-

ленив жирной кислота в мембране таким образом, что доля мирной кислоты, проявляющей разобщающее действие, возрастает. При таком объяснении понятен также и "разобщающий" эффект самого флоретика.

Такое объяснение в прицапе не противоречит и наблюдавшимся эффектам карбоксиатрактилата. Как видно на Рис.5.А.в,г, максимальная стимуляция дыхания в присутствии флоретина и кАтр несколько смещается в область более низких концентраций добавленной киркой кислоты. Появление "плато" на кривой зависимости скорости дыхания от'концентрации добавленного пальмптатз в присутствии кАтр свидетельствует о том, что сам по себе флоре тип не разобщает, а его кажущийся разобщающий эффект связан, по-вцдпмсму, с усилением разобщающего действия эндогенных жирных кислот. 2. ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ И СУБСТРАТОВ АТФ/АДФ -ЛНТИПОРТЕРА НА ЭНЕР- ' ГЕТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ МИТОХОНДРИИ ПЕЧЕНИ ПРИ Са2+- ЗАВИСИМОМ РАЗОЩЕНИИ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ.

2.1. Уменьшение кальциевой емкости митохондрий печени жирными кислотами и защитное действие ь-карнитина,• АДО и АТФ.

Было показано , что индуцируемое олеатом Са2* -зависимое разобщение окислительного фосфэрилировашш сопровождается набуханием митохондрий и что эта эффекты объясняются пермеабклизацией внутренней мембраны митохондрий для веществ с молекулярной массой ДО 1500 [Hunter D.R. ее al.,1976 ].

Роль жирных кислот в этих процессах не ясна. Было высказано предположение, что свободные жирные кислоты вообще но участвуют непосредственно в индукции Са2+-эавискмой пермеабилизации, а истинными индукторами являются ацил-КоА длишюцепочечных жирных

КИСЛОТ [Beatrice М.С. et al., 1980).

В связи с этим представляло интг-рэс изучить действие ь-каркитина при Са2+-зависимом разобщении митохондрий жирной кислотой, который должен ингибкровать разобщение, если оно вызвано аТщл-КоА. Для этого изучали изменения Са2+~емкости митохондрий печени под действием жирной кислоты.

Рис.б.а-г показывает, что первая добавка 50 мкМ CaCig приводит к кратковременному ускорению дыхания, отражающему транспорт Са2+ в митохондрии. После 2-й добавки СаС12 скорость дыхания устойчиво возрастает, и дальнейпее добавление СзС12 или ДНФ не увеличивает скорость дыхания. Это указывает на то, что после 2-й добавки СаС12 произопла пермеабилизация внутренней мембраны митохондрий [Nicholls D., and Akerman К., 1982J.

Кальциевую емкость митохондрий оценивали по сумме добавок

Таблица 2

Влияний лигандов АТв/АДЗ- антилортера, ь-картггина и пальш -тата на Са -емкость митохондрий печени.

Условия инкубации - см. Рис.6. Добавки: 50 мкМ АТФ, БОмкЫ АДФ, 5 мМ 1-карнитин, I мкЫ карбоксиатрактилат, 10 мкМ пальмитат. В Таблице даны относительные величины,- за 100 % принята Са"'-емкость в контроле (без добавок), она составляла 150 пмоль/мг белка. Приведены средние значения из п опытов ± стандартная ошибка средней.

Добавки Са -емкость Добавки Саг+-ем

юи (п=Ш пальмитат 73 ± В "

капнигпн Й7 ± 3 (п=Ь) пальмитат + карнитин 57 . В "'

адф г::в ± '¿г (п^В) пальмитат + атф Т2Ь 1~Г

20о ± 22 (п=и) пальмитат + лтзн-карнитин "153 "±"Г

адф +каршши 246 ± 4-У (п=4) пальмитат + АДФ 122 ± I

АТФ+карнлтин 372 ± '67 (п=8) пальмигат + АДФ+каршшш 122 1 I

карбоксиатпактилат 71±5 (п=Ь)

карбоксиатрактилат +кариитин 65±Э (п=5)

карооксяа тракшлат +АТФ 80±21 (п=6)

каоооксиатрактилат +А5Ф+карнитин 85±21 (п=6)

Рис.6. Влияние АТФ и х-каршгаша на Са2+-ёмкссть шггохоцдрий печени.

среда инкубации содержала 250 мМсахарозу, 5мИ МОПС, ЗыН I мы

КдС1о, 5 мМ сукцинат, I мкЫ ротенон, олигомацкн (I мкг/мл),

с=28 с, рН=7,4,• АТФ,АДФ и карнитин добавляли перед митохопдрлпш. Добавки: 50 мк!1 АТФ,- 50 мкМ Сас12; бмМь-каршшш. -Концентрация

штохондриального белка - мг/ил. а- среда инкубации дополнена АТФ' и 1-карнитином,- б-контроль,- в- в присутствии х-карнитина,- г- в среде инкубации нрисугствует 50 мкМ АТФ.

Н'

CaCig. которые предшествовал! добавке, вызывающей стабильную стимуляции дыхания.

Включение в среду. инкубации (содержащую олигокицин) 50 г«кМ АТФ увеличивало Са2+-емкость примерно в 1,7 раза (Рис.6.г, Табл.2), а в сочетании с 5 ММ L-карнитином эти же концентрации АТФ Еызшзали более чем 3-х кратное увеличение Са2+-емкости митохондрий печени (Рис.6.а, Табл.2). Отдельно добавленный 5 мМ L-карнлтин практически не изменял Са2+-е^ость (Рис.6.в, Табл.2).

Включение карбоксиатрактилата в среду инкубации почт™ подно-стью снимало не только ■ эффекты АТФ и АД®, но и увеличение Са2+-емкости карнитином в присутствии АТр (Табл.2). При этом само . по себе присутствие кАтр в среде приводило к уменьшению Са2+-емкости митохондрий примерно на 30 %.

Как показано в Табл.2, 10 мкМ пальмитат снижает Са2+-емкость митохондрий приблизительно на 30 % . В присутствии 10 мкМ пальми-тата АТФ и АДФ значительно увеличивают Са2+-еш:ость. В среде без АТФ и в присутствии пальмитэта кзрнитин снижает Са2+-емкость почти на 50 % , при этом включение в среду инкубации АДФ предотвращает этот эффект карнитина. В средах с АТФ карнитин отчетливо увеличивает Са -емкость.

- Хорошо установлено,что L-карнитин может увеличивать удержание Са2+ в митохондриях в присутствии добавленных ацил-КоА вследствие превращения ацил-КоА в ацилкарнитин. Сходный эффект карнитина без добавленных ацил-КоА объясняют снижением концентрации эндогенных ацил-КоА карнитином {Beatrice М.С. et al., 1980; Di Lisa F. et ai.,19891. Однако в наших опытах ь-карнитин в отсутствие добавленного АТФ или АДФ не только не увеличивал, но даже несколько снижал Са2+-емкость митохондрий (см. Табл. 2).

Уменьшение Са2+-емкости митохондрий жирными кислотам! и отсутствие защитного действия карнитина в средах бе'з АТФ (Табл.2) 'позволяет предположить, что по меньшей мере в экспериментах без АТФ митохондрии поврездаются жирными кислотами, а не ацил-КоА.. В этих условиях ( в присутствии олигомицина без добавленного АТФ) длинноцепочечные жирные кислоты такие как пальмитиновая кислота не могут превращаться в ацил-КоА, так как для этого необходим АТФ. Таким образом, можно думать,что эндогенные или добавленные ¡»ирные кислоты могут усиливать Са2+-зависимое повревдение митохондрий.

Можно предположить, что карнитин (в присутствии АТФ) оказывает сопрягающее действие путем снижения локальной концентрации жирных кислот в мембране митохондрий, при этом жирные кислоты

превращаются в ацил-КоЛ, а затем в ацплкарнитин. Известно, что для уменьшения Са2+-емкости митохондрий необходимы значительно более высокие концентрации ацилкарышша, чем ацнл- КоА или жирных кислот [Ее Villiers M. and Lochnor A., 1386]. КрОМЗ ТОГО, ЭЩШСарНИ-

т;ш р-зобщает окислительное фосфорилпрование в меньшей степени и

ПРИ более ВЫСОКИХ концентрациях, ЧЗМ ПГрНЦЗ КИСЛОТЫ [Baydoun а.р.. et al., 1388].

Такая интерпретация в принципе согласуется и с наблюдавшимся б опыте подавлением защитного действия кзрнитина ингибитором АТФ/АДЗ-антипсртера карбоксиатрактилатом. Известно, что переход Ектипортера в так называемую "С" копфогмзцию, происходящий под дейстзием кАтр, способствует образованию поры. Возможно, что взаимодействие жирной кислоты с антипортером также способствует его переходу в' "С"-кснформацию. ъ-каряитик с АТФ могут уменьшить концентрации кцраых кислот, но этот эффект нивелируется переходом анг.шортера б -С" -конформацпю под действием сильного необратимого ингибитора антшюртера - карбоксиатрактилата. 2.2 Действие жирной кислоты на и дыхание митохондрий печени при активации "внешнего" пути окисления НАДИ.

Внешний путь окисления НаДН in vitro активируется добавленными хжрнымл кислотами и Се'"1 [Агуреев А.П, Мохова Е.Н., 1979], п является ваншм случаем Са2+-зависимого разобщающего действия тарных кислот. Поэтому представлялось интересным более подробно изучить это явление, обращая особое внимание' на действие ингибиторов Са2+--заБисикого увеличения проницаемости. 2.2.а ДейскЗие цшиаспсгруа Л m индущиа палыхяыюл и Ccf внешнего пуши окисления НАМ.

Активация окислэнил КАДЯ ш внешнему пути Са2+и .гарной кислотой неразрывно связана с шеокоамштудным набухаиззм митохондрий пзчзни ГАгуреов А.П, Мохова Е.Н., 1979,-Agureov et al, i9aij. Такое набухание указывай! на пзрьвабшшэоцк» вдутрешой цзибрааы МИТОХОНДРИЙ [Hanter d.r., 1976]. Поэтому било интересно выяслзть чувствительность актизгцик взешнзго пути к специ&иесжсму ищ'иби-юру Са -зависимой поры -циклоспорину "А".

На Рис.7.А-в показано, что одновременное добавление к митохондриям Са"+ и пальмитата. параллельна приводят к уволйчешвз ci 'ростя потребления кислорода (Рис.7.А.б), вдскесоамшахудао;^ набухания митохондрий (Рис.7.Б.б), к активации окисления НАДН по внесшему пути (Рис.7.А.б) 'и к скквнея (Рис.7.в.б). Все эта эффекты свидетельствуют о шрмеайклцзвют внугреяезй иамбракы

А

ЦЧТПХРОМ С

л

мх

I

ча[/1нгНААН

74

М тГ

I «Г

СаС?2,ПК гг\

' Л - ЦОТТОР0М с

о

ПК

Гч. I цкгохр оч с

|\\1 ! сп

\ifiW •

Яг \por i ^

1лИГ0<Г0М с

ЧИТОУРОН с

Рис.7. Динамика потребления кислорода, мембранный потенциал и набухание Аситохондаий при активации внешнего пути окисления НАДН*.

Митохондрии печени крысы (1,8 мг/мл) инкубировали в среде, содержащей 70 ыМ КС1, 5 мМ КН2Р04, 4 мМ глутамат, I ш малат, 2 мкг/мл

0ЛИГ0МИЦИЯ, 1,6 МКМ Т»+, рН=7,4 , t=280C. А-скорость поглощения кислорода,- Б - оптическая плотность суспензии митохонд рий; В - мембранный потенциал (Д<Л митохондрий. На рис.А,. Б, В: а- контроль, б- при добавлении Са и паль'.ятата, в- в среде инкуба цик присутствует I мкг/мл циклоспорин А. Добавки-, рот- 2 мкМ ротенон. Ант- I мкМ штшицин А, НАДН- I мМ НАДН, цитохром с- 5 мкМ цитохром с, С'гС12- 10

мкМ (А,Б) и 20 мкМ (В) СаС12, ПК- 10 г.з.Ч (А,Б)

и 20 мкМ (В) пальмитиновая кислота. Сн- 2 мМ КС и, сб- I мкг/мл циклоспорин А.

митохондрий для низкомолекулярных Ееществ.

При включении в среду инкубации циклоспорина А добавленный НАДН не стимулирует дыхание в присутствии ротенона и антимицина (Рис.7.А.в), Са2+и пальмитат не стимулируют высокоамплитудное набухание митохондрий (Рис.7.Б.в).

Как видно из Рис.7.В.б, добавление 20 мкм палылитата к нагруженным Са2+ митохондриям приводило к необратимому сильному снинзшю с характерной для открытия "поры" кинетикой. При этом последующее добавление НАДН и цит.с не увеличивало д^ даже при введении циклоспорина, несмотря на высокую скорость окисления НАДН в этих условиях.

При включении циклоспорина в среда ыжубащш ответ на Са^ не изменялся, но псльмитат вызывал только небольшое снижение д^ (Рис.7.В.в). В этом случае добавление НАДН и цит.с не увеличивало дф, так как внешний путь окисления НАДН не активировался.

Приведенные результаты позволяют предположить, что Са -зависимое разобщение митохондрий гирными кислотам и активация окисления НАДН по внешнему пути обусловлены открытием циклоспорин-чувствительной "поры" .

Окисление НАДН с небольшой скоростью и без добавленного

р.

Са и пальмитата (рис.7.А.а) мо:шо объяснить тем ,что в присутствии фосфата в некоторой части митохондрий пора индуцируется зндо- • генным Са2,и жирными кислотами.

2.2.6 Защитное действие

«я2 и АЛФ при пер,г.еабилизации лжохснЭрий

Саг'1' с палълитапол.

Ыд2+ или АДФ, добавлг гае порознь, не уменьшают стимуляцию дыхания при добавлении НАДН па фоне ротенона и антимицина. Одна-' ко они влияли на изменение д^ после добавок Са2+ и. палылитата. Добавка 100 мк1.1 Са21" вызывала необратимое падение ья (Рис.8.а). В присутствии Мд2+ сшшешшй Са2+ дф но восстанавливался до исходного уровня, а пальмитат индуцировал сильной' снижение Ц> (Рис.8.6.). . 3 присутствии АДФ сниженный Са2+ восстанавливался до исходной в°тачины, но пальмитат и в этом случае вызывал деэноргизациа митохондрий (Рис.8.в).

При одновременном добавлении Мд^и АДФ ответ па Са2+не изменялся, тогда как пальмитат приводил лишь к небольшому снижению д^ (Р. :.8.г). При одновременном введении Ыд2+с ДДФ и карбоксизтрзкти-лата динамика изменения щ сходка с наблюдаемой в присутствии , одного Ыд2+(Рис.8.д).

СзГ ПК ПК Сс1'

?4-

Рис.8. Действие Мд и АДФ на мембранный потенциал митохондрий в присутствии кальция и па.чьмитата.

Условия инкубации см. в рис.7-, а-контроль,- б-среда инкубации дополнена 3 мМ МдС12 ,• в-в среду инкубации добавлен 400 мкМ АДФ; г-

в среде инкубации присутствует 3 мМ МдС12 и 400 мкМ АДФ,- д- среда

инкубации как в "Г" + 4 мкг/мл карбоксиатрактилат. Добавки: ПК-20 мкМ пальмитиновая кислота, Рот- 2 мкМ ротенон.

Представленные данные показывают, что не только циклоспорин, но и Мд2+с АДФ предотвращают пермеабилизащш митохондрий Са2+и пальмитатом и активацию внешнего пути окисления НАДН. При этом защитное действие наблюдается только при сочетании этих веществ, по отдельности они не эффективны, несмотря на примерно равную способность АДФ и Мд2+ увеличивать устойчивость митохондрий к пермеабилизации Са2+ (ср. Рис.8.б и Рис.8.в). Кроме того, добавление карбоксиатрактилата вместе с Мд и АДФ сншало защитный эффзкт Мд2+и АДФ от Са2+ -зависимой пермеабилизации митохондрий пальмитатом (рис.Э.д).

В условиях наша опытов специфический ингибитор антипортера карбоксиатрактилат приблизительно в 1.5 раза увеличивал скорость окисления НАДН по внешнему пути (данные не приведет). 2.2.6 Действие 1-карнтина на окисление НАЛН по бнетелу пуши, индуцированному

-зависилой пер.юабилизацией мтохонОрий

жирной кислотой.

ь-карнитин оказывает защитное действие при Са2+-зависи?.:ом разобщении окислительного фосфорилирования жирными кислота: я [мокЬоуа ее а1, 1991,- чо^сгак ь., 1974] . Мы сопоставили действие Мд2+и АДФ с влиянием карнитина. ь-кзрнитин и АТФ, совместно

добавленные в инкукбациопвув смесь, действуют сходно с %2+и АДФ. АТФ без каркитинэ дзйствоэал так не, как АДФ (см. Ряс.8.в)

Действие каряитина в отсутствие добавленного АТФ зависит от времени хранения митохондрий. При добавлении карнитина к митохондриям, хранившимся не более 4 часов, он не влиял на динамику изменения дс в ответ на добавление Сз2+и пальыитата. Поело длительного хранения мятохондый добавление карнитина приводило к к тому, что уже один Ся2+ецзывзл спонтанную ддэнергизацшэ МИТОХОНДРИЙ.

Заиитная роль карикпша без АТФ обычно объясняется превращением ваемитохондриальЕКХ ацшт-йэА в ашшеарнитин.Одаако в этих условиях карнитш ш«эт «икать содержание» ацил-КоА в катраксе мктохотойа и такс.; путем уменьаать устойчивость к пермеабилиза-ции, если' Гфедполоззта, что внутраматрикеше ацил-КоА дзйствуыт йналогично бонг-крековой кислоте, т.е. увеличивают устойчивость ЫИТОХОКДРИЗ К П9рМбабтаИ38Ц5Ы. Известно, что ацил-КоА цроизводшз дгаяноцепочечных зирпах кислот взаимодействуют с АДФ/АТФ-антпг;ортером как со стороны цитоплазм, так и со. стороны матраса митохондрий. Реализация того или иного эффекта кврнитана зависит от соотяоиення концентраций внутри- и внегстсхондриальних а:щл~ КоА. Этим »»ярю было бн объяснить различЕ9 в sgftuzxax карнжшга на свекеззделенных и "состариишхся» митохондриях. 2.г.г СраЗшш эффемшвноаы ингибиторов Cc^*~saBuaiaoso пум разоби&ния хирнихи мх'дэкшга по способности ресопрягааь перхеабиг-лизосстные лхягахаиврии..

Б отдельной серии сгогов да сравнили способность 'Мз^+с А®, циклоспорина а юрштина с AT® ресопрятать першабшшовашш митохондрии, ь&тохокдрш церкэабюазэвали добавленном-с падь-митзта, после окончания садешя м вводили ротокоп и аяпшвцин. Для генерации w добавляли НАДЯ к штохром с.'

ни в ода« из сочетаний ресоцрягапз® атш но вызывали увеличение л»'/ при добавлении КЛДН, если штахрои с ко добавлялся. Р'^о езязано с '¿ем, что набухание шп'охоЕДрай а сслжой ерздо Приводит К вшывашао ЭТОГО ЦИТОХРОНЭ [Jacobs S.E,an:J Ear.adi ■ D. К., i9£o]. Введение цаюхрома с выбывало максимальное увеличение д^ ДРй одновременном щжсутсшш всех ресодрягакада ereEicst Mg2+c -АД", каркихина с /Ж> и циклоспорина "А*. По-отдзльноста psсопрягающие агенты были нз1>№ктивня; сочетание (Мэ2++лДФ) с. циклоспорином "А" приводило к примерно такому из увеличению в охват на

добавку цитохрома с, как и сочетание (Мд2++АДФ.) с (L-кэрнитин+АТФ). В отсутствие (Мд2++АДФ) ни циклоспорин, ни (L-карнитин+АТФ), ни их сочетание не оказывали ресопрягающего действия.

Полученные данные, хотя и не позволяют сделать обоснованного предположения о механизме индукции поры ионами кальция и жирными кислотами, тем не менее дают некоторую новую информацию о регуляции процесса. Во-первых, очевидно, что пермеабилизация внутренней мембраны в этих условиях не связана с необратимыми повреждениями митохондрий. Во-вторых, данные подтверждают исторически наиболее равнее мнение, что проницаемость митохондриальной мембраны регулируется такими эндогенными эффекторами, как Мд2+ и АДФ. Как показано в этом разделе, циклоспорин не является, строго говоря, непосредственным изгибпто-,ром Са2+-зависимой поры, так как его эффект не проявляется в отсутстсвии Мд2+ и АДФ. Это объясняет также, почему циклоспорин А наиболее эффективен в предотвращении открытия поры," чем в ресопря-жении нормеабплизованЕых митохондрий. Причина заключается в вымывании нуклеотидов и Мд2+ из митохондрий при их пермеабилизации.

Вероятно, конформационное состояние АТФ/АДФ-антипортера является основным фактором, спределящим вероятность открытия/закрытия Са2+-зависимой поры. При этом аккумуляция митохондриями некоторого избыточного количества Са2+ является необходимым, но недостаточны!.! условием для открытия поры. Наиболее важными эндогенными регуляторами состояния поры представляются длинноцепочеч-ные жирные кислоты и соотношение концентраций вне- и внутриматрик-сных ацил-KqA длинноцепсчечных жиреых кислот. Накопление жирных кислот и внешних ацил-КоА увеличивает вероятность открытия поры, тогда как внутренние ацил-КоА оказывают защитное действие. Эффекты этих веществ осуществляются путем влияния на конформационное состояние АТФ/АДФ-аптипортера ("с-конформэция антипортера потен-циирует открытие "поры», а "Ы"-конформация препятствует [Dierks

Т., et al., 1990,- Halestrap А.P., and Davidson A.M., 1990,- Le Quoc X., and Le Quoc D., 1988; Le Quoc D., Le Quoc K., 1989]).

ВЫВОДЫ

I.Пальмитиновая кислота стимулирует дыхание и значительно снижает &Ф митохондрий сердца, при этом специфические ингибиторы АТФ/АДФ-антипортера карбоксиатрактилат и бонгкрековая кислота,

его субстрат АДФ, а так же пальмитоил-КоА полностью или частично подавляют разобщающее действие пальмитата.

2.Пальмитиновая кислота в концентрациях, стимулирующих дыхание митохондрий, сникает л^ суСмитохондриальных частиц, при этом бонгкрексвая кислота и пальыитоил-КоА частично обращают эффект пальмитата.

3.Данные .полученные в экспериментах с дипольным модификатором, позволяют считать, что анион жирной кислоты сам по себе или не пересекает внутреннюю мембрану митохондрий, или этот процесс не вносит существенного вклада в разобщающее действие кирной кислоты, но крайней мере в условиях наших опытов.

4.Полученные результаты подтверждают предположение об участии АТФ/АДФ- антипортсра б разобщающем действии жирных кислот в митохондриях сердца. Совокупность данных указывает, что наиболее вероятным является участие АТФ/АДФ-знтидортера в транспорта анионов жирных кислот через внутреннюю мембрану митохондрий.

5.Активация пальмитиновой кислотой и Ca2+in vitro внешнего пути окисления экзогенного НАДН в митохондриях печени подавляется циклоспорином А и другими ингибиторами неспецифического увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий.

6.Сделан вывод, что индукция Са2+-завискмой поры внутренней мембраны митохондрий является молекулярным механизмом Са2+-заЕ':ск.:ого пути разобщающего действия жирных кислот.

7.Изучено действие АДФ, АТФ, L-карнитина, Mg2* и карбоксиатрактк-лата па парма абшшзованныз Са2+ и пальмитиновой кислотой митохондрии печени, и на основанл полученных результатов сделано предположение о возможном участия АТФ/АДФ-антипортера в Са2+-згвиси-' мом разобщении митохондрий жирными кислотами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.E.Mokhova ,E.Arrigoni-Martelli, Н.Beilei, V.Dedukhova, U.Muscatello, A.Starkov, . V.Bcbyleva . "The protecting effect

L-carnitine on Ca2+-load2d rat liver mitochondria" FEBS Letters v.289, p.l87-lS9, 1991

2. V. I. Dedukhova, E. К. Molch ova, V. P. Gkulachev, X. A.Starkov, E.Arri-goay-Martelli, V.A.Bobyltva "Uncoupling effect of fatty acids on h^art muscle mitochondria' and subtrdtochondrial particles" PEBS Letters v.295,p.51-54, 1991

3. V. P. Skulachev, V. I .Deduchova, E .N. Jtokhova, A.A. Starkov, E.Arrigoni-

Martelli,V.A.Bobyleva"Uncoupling action of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles is mediated by the ADP/ATP antiporter." _ in:Adenine Nucleotides in Cellular Energy Transfer and Signal Transduction, ed. -.3.Papa,A.Azzi and H.Tager, Birkhauser Verlag,Basel/Switzerland,1992,pp.83-96.

4.Dedukhova V.I., Mokhova В.II., Starkov Л.Л. , l.eikin Yu.N.,"Carboxyatractylate inhibits the potentiating effect of lipophylic cation TPP+ on uncoupling activity of fatty acids." Biochera.Mol.Biol.International, v.30, pp.1161-1167, 1993.

5.Е.Н.Мохова, А.А.Старков, В.А.Бобылева, "Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях печени и мышц" Биохимия, т.58, стр.1513-1522, 1993.

е.В.И.Дедухова, Е.Н.Мохова, А.А.Старков, Д.Баттелли, М.Беллей, В.А.Бобылева, "Повреждение нагруженных ионами кальция митохондрий жирными кислотами и защитное действие, карнитинаг Биохимия, т.58, стр.585-589, 1993.

7.А.А.Старков, О.В.Маркова, Е.Н.Мохова, Е.Арригони-Мартелли, Д.Баттелли, М.Беллей, В.А.Бобылеза, "Защитны,'! эффект циклоспорина А, карнитина и Мд2+ с'AdP при' Са2+-зависимой пермеабилизации митохондрий жирными кислота;® и активации окисления nadH по внешему пути.", Биохимия, т.58, стр.1266-1275, 1993.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУННХ СОКРАЩЕНИИ. АДФ - аденозин-5'-дифосфат; АТФ - аденозин-5'-трифосфат; БДМ -бислойная фосфолипидная мембрана,- ДНФ - 2,4-дпнптрофенол,- ФКФ -4- трифторметоксифенилгидразсшсарбошищианид,- ЭГТА - зтиленгли-коль- бис-(2- амшюэтиловый эфир)- n,n, n* ,и'-тетрауксусная кислота,- mops - 4-морфэлинопропансульфонсвая кислота,- д^ - разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий.

Подписано в печать £%. СЗ- 199 Формат 60ХЖ/М> Бум. офс. Печать офс.

Тираж (оо Заказ¿¿i/ МП «ПЕТИТ» 107564, Москва, Богатырский мост, 17, корп. 5