Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и при окислительном стрессе in vitro
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и при окислительном стрессе in vitro"

На правах рукописи

КОЖИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ОСОБЕННОСТИ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЖИРНЫХ

КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ ПРИ СТАРЕНИИ ЖИВОТНЫХ И ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0030G4729

Казань 2007

003064729

Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной биологии биолого-химического факультета ГОУ ВПО «Марийский государственный университет» (г. Йошкар-Ола)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Самарцев Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией регуляции клеточного окисления Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, г. Казань Гордон Лев Хаймович

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, г. Санкт-Петербург Савина Маргарита Васильевна

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

inOj!

Защита состоится «27» сентября 2007 г. в Цх часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан «¿?3» СЬ&'^СбСц 200т7 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук^^?.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются не только высокоэффективными энергетическими станциями, обеспечивающими клетку АТР и теплом, но и участвуют в ее гибели по типу апоптоза и некроза. Эта альтернативная функция митохондрий связана с усилением продукции активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Hugues et al., 2005; Skulachev, 2006). В настоящее время известны различные пути образования активных форм кислорода в митохондриях. В дыхательной цепи в процессе одноэлектронного восстановления кислорода в I и III комплексах образуется непосредственно супероксидный анион-радикал, из которого вследствие последующих химических реакций, как ферментативных, так и неферментативных, могут образовываться пероксид водорода, гидроксильный радикал и другие активные формы кислорода (Lenaz, 1998; Brand et al., 2004; Андреев и др., 2005). Показано, что при старении животных в митохондриях усиливается продукция активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Baija, 2002а; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005). Это, в свою очередь, приводит к мутации митохондриальной ДНК, окислительному повреждению белков и . перекисному окислению липидов и, согласно одной из теорий старения, является ведущей причиной дегенеративных изменений в органах и тканях, усиливающихся с возрастом (Lenaz, 1998; Barja, 2002b; Hagen et al., 2002; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005). Предполагается, что наблюдаемые при старении окислительные повреждения митохондрий связаны со снижением активности одного из природных антиоксидантов а-токоферола (Armeni et al., 2003; Kamzalov et al, 2004).

При моделировании окислительного стресса в митохондриях широко применяются гидроперекиси органических соединений, например, от/?еяг-бутилгидропероксид (Lôtscher et al., 1979; Costantini et al., 1996; Slyshenkov et al., 2002). В отсутствие ионов кальция обработка митохондрий этим оксидантом приводит к окислению пиридиновых нуклеотидов и глутатиона (Lôtscher et al., 1979; Siess et al., 1988; Slyshenkov et al., 2002; Liu et al., 1996), к образованию метального и других свободных радикалов (Kennedy et al., 1992), к повышению уровня гидропероксидов (Martin et al., 2000) и диеновых конъюгатов (Nigam et al., 1999; Slyshenkov et al., 2002).

Одним из путей подавления продукции активных форм кислорода в митохондриях является снижение разности электрохимических потенциалов протонов (ДцН^) на внутренней мембране при усилении протонной проводимости (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). Показано, что это может быть достигнуто

с помощью природных разобщителей окислительного фосфоршшрования свободных (неэтерифицированных) жирных кислот (Korshunov et al., 1998). В настоящее время известны различные пути разобщающего действия жирных кислот (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). В отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров (Samartsev et al., 1997b; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). В этом случае ингибитор ADP/ATP-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат способны подавлять разобщающее действие жирных кислот (Samartsev et al., 1997а; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). Участие ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). Было предположено, что модификация ADP/ATP- антипортера продуктами перекисного окисления липидов может привести к усилению протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий в присутствии жирных кислот (Мохова и Хайлова, 2005). Интересно предположить, что при окислительном стрессе наряду с ADP/ATP-антипортером изменяются свойства и аспартат/глутаматного антипортера, и это сопровождается повышением скорости переноса аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный и (или) устранением способности лигандов этих переносчиков подавлять этот транспорт. Представляет интерес исследовать влияние антиоксидантов с различным механизмом действия на разобщающее действие жирных кислот в митохондриях старых животаых в условиях эндогенного окислительного стресса, а также в митохондриях молодых животных при индукции окислительного стресса in vitro.

Целью настоящей работы является выяснение роли окислительного стресса как регулятора протонофорного разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и действии in vitro окисляющих агентов.

Задачи исследования:

1. В опытах in vitro оценить интенсивность генерации диеновых конъюгатов и эффективность действия антиоксидантов в митохондриях печени молодых и старых крыс.

2. Выяснить, имеются ли различия в протонофорном разобщающем действии пальм »тага при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых крыс.

3. Исследовать влияние окислительного стресса in vitro, вызванного /я/?еот-бутилгидропероксидом, на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых крыс.

4. Изучить влияние физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров , ADP и аспартата на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых и старых крыс в отсутствии и присутствии антиоксидантов и окисляющего агента /яре/и-бутилгидропероксида.

5. Выяснить, какова роль тиоловых групп митохондрий печени в модуляции протонофорной разобщающей активности жирных кислот при развитии окислительного стресса в митохондриях как молодых, так и старых крыс.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что инкубация митохондрий печени старых крыс приводит к развитию окислительного стресса и это вызывает устранение способности лигандов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, соответственно карбоксиатрактилата и аспартата, подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот. Такие, свойственные для митохондрий старых крыс, особенности протонофорного разобщающего действия жирных кислот могут быть воспроизведены на митохондриях молодых животных путем инкубации органелл с окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что как в митохондриях старых, так и молодых животных, окислительный стресс индуцирует модификацию ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, связанную с окислением критических SH-групп митохондрий. В присутствии физиологических субстратов этих переносчиков, соответственно ADP и аспартата, такая модификация приводит к усилению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

Положения, выносимые на защиту:

1. В митохондриях печени старых животных окислительный стресс, обусловленный пониженной активностью пассивной утечки протонов в условиях недостаточного защитного действия природных антиоксидантов, приводит к модификации ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, проявляющейся в устранении способности лигандов этих переносчиков подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот.

2. В митохондриях печени молодых животных аналогичная модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров может быть воспроизведена путем инкубации органелл с окисляющим агентом от/ге/и-бутилгидропероксидом.

3. В присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров - ADP и аспартата - вызванная окислительным стрессом модификация этих переносчиков в митохондриях печени как молодых, так и старых животных, приводит к повышению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

4. Модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых животных связана с окислением критических SH-групп митохондрий.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при окислительном стрессе, развивающемся при старении животных и действии окисляющих агентов in vitro. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в клеточной патофизиологии и медицине, поскольку в настоящее время известно, что окислительный стресс является одним из ведущих пусковых механизмов, приводящих к гибели клеток по типу апоптоза и некроза.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международной научной конференции «Физиология развития человека» (Москва, 2004); на юбилейной конференции, посвященной 70-летию академика В.П. Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005); на 9-ой и 10-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005 и 2006); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2007); на V . Сибирском физиологическом съезде (Новосибирск, 2005); на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); на «XIV European Bioenergetic Conference» (Moscow, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных

работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 28 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов исследования; полученных экспериментальных данных, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 193 библиографических названия, в том числе 167 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение митохондрий го печени крыс. В опытах использованы белые беспородные крысы-самцы в возрасте 6-9 месяцев с массой тела 200 — 250 г (молодые крысы) и 22 — 26 месяцев с массой тела 420 - 500 г (старые крысы). Содержание, кормление и забой животных соответствовали необходимым требованиям, изложенным в соответствующем руководстве (Западнюк и др., 1983). Митохондрии из печени животных выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования (Pedersen et al., 1978). Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ MOPS-трис (рН 7,4). Для удаления эндогенных жирных кислот митохондрии преинкубировали с очищенным от жирных кисло.т БСА. Суспензию митохондрий (60-70 мг митохондриалыгого белка в 1 мл среды выделения) хранили на льду. Белок определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА.

Регистрация дыхания суспензии митохондрий. Дыхание митохондрий регистрировали при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа LP-9. Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке ~1,2 —1,3 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ КС1, 5 мМ сукцинат калия, 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭГТА, 10 мМ MOPS-трис (рН 7,0 или 7,4). Олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенон добавляли в кислородную ячейку сразу после митохондрий. При определении скорости дыхания в процессе окислительного синтеза АТР (состояние 3) среда инкубации дополнительно содержала 5 мМ КН2Р04 без олигомицина. В этом случае через 2 мин. после ротенона к митохондриям добавляли 200 мкМ ADP. Величину коэффициента ADP/O определяли пульсовым методом (Hinkle and Yu, 1979).

Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопрягающих агентов к величине стимуляции дыхания пальмитатом по формуле 100*AJu/(Ju - Jo), где Ju и Jo - скорости дыхания соответственно в присутствии и в отсутствие пальмитата, AJu -величина снижения скорости дыхания ресопрягающим агентом.

Разобщающая активность пальмитата. Протонофорную разобщающую активность пальмитата, согласно разработанному ранее подходу (Самарцев и др., 2004) определяли как увеличение скорости дыхания пальмитатом, отнесенное к его концентрации по формуле: (Ju — Jo)/[U], где Ju и Jo — скорости ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров и дыхания митохондрий без учета их концентрации

(мкМ Oj/мин) соответственно до и после добавки пальмитата, [U] -концентрация пальмитата (мкМ).

Определение диеновых конъюгатов. Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях определяли после экстракции в гептане спектрофотометрическим методом (Ambrosio et al., 1991). Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях в процессе их инкубации в контролируемом состоянии определяли следующим образом. Митохондрии (1,4 мг белка на мл) суспендировали в среде инкубации при перемешивании при 25°С. Одновременно с митохондриями в среду вносили олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенона. Другие соединения, исходя их задачи исследований, добавляли одновременно с этими ингибиторами. Отбор проб (по 0,7 мм) в первый раз осуществляли сразу после этих добавок и во второй -через 5 мин. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях выражали как разницу между величинами оптической плотности гептанового экстракта при 233 im в начальный момент времени инкубации митохондрий (АА0) и через 5 мин (ДА) или в относительных единицах как фактор а, который определяли по формуле: а = (АА - АА0) / АА0-

В работе использовали MOPS, трис, пальмитиновую кислоту, FCCP, олигомицин, сукцинат калия, глутамат калия, аспартат калия, карбоксиатрактилат, тиомочевину, л-этилмалеимид, пируват натрия, очищенный от жирных кислот БСА ("Sigma", США), ионол, тролокс ("Aldrich", США), ротенон, ЭГТА ("Serva", Германия), ДНФ, трет-бутилгидропероксид, сахарозу ("Fluka" Германия), KCl, MgCl2 ("Merck", Германия). Остальные реактивы квалификации х.ч. и ос.ч. произведены в России. Использовали растворы пальмитиновой кислоты (20 мМ) в этаноле.

Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стыодента с помощью пакета прикладных программ Statistica-6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Особенности разобщающего действия пальмитата и ресопрягагощих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата в митохондриях старых крыс

Одним из индикаторов усиления генерации активных форм кислорода в клетках при различных патологических состояниях является аккумуляция продуктов перекисного окисления липидов, в том числе диеновых конъюгатов (Romaschin et al., 1990; Sokol et al., 1991; Ambrosio et al., 1991; Dröge, 2002). Как показано на рисунке 1, в

тпохондртх сгарщ крыс уровень диеновых конъюгатов выше, чем а митохондриях молодых.

0,12-,

| о,Ю

I3

(ф О

0 Ё 0.00

% S

1 са

s ё

¡2 ^

о

Ев ü'04

Ч г.

£ о,сг

<

*

Т

| ¡'Г,:

Т ■

Д 'i. ■ 'vi

■ ■ } ■ ■ ВДЯЗЯ

Г 1 ЩШ; ——j

Митохондрии молодых крыс

Митохондрии

старых крыс

Рисунок 1. Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях печени молодых и Старых крыс. Приведены средние значения + стандартная ошибка среднего (гг=8-9).

* Различия между показателями митохондрий молодых и старых крыс статистически достоверны. р<0,03 (критерий Стьюдснта).

Инкубация митохондрий печени в контролируемом состоянии в течение 5 мин л присутствии сукциоата, роте но на и олигомицина приводит к аккумуляции диеновых конъюгатов, и этот процесс более интенсивно протекает в митохондриях старых крыс. Полученные результаты подтверждают известные данные о том, что при старении животных в митохондриях усиливается генерация активных форм кислорода, что, и Свою очередь, приводят к аккумуляции продуктов лерекисного окисления липидов (Lenaz, 1998, Barja, 2002а; 2002b; Ilagen et al., 2002; Judge el al., 2005).

Ii Опытах использовали хорошо известные антиоксиданты — уборщики свободных радикалов, отличающиеся по химической структуре и по степени растворимости в воде и липидах: растворимое только в воде т иолов ос соединение тномочешшу (Зенкон и др., 2001), аналог а-токоферола тролокс, растворимый как в иоде, так и в липидах (Davics et al., 1988), и высокоэффективный лшшдорастворимый фенольный антиоксид ант к о пол (другое название бутйлгидрокситолуол) (Биленко, 1989).

Все ЭТИ антиоксиданты замедляют аккумуляцию диеновых конъюгатов в митохондриях печени старых крыс в процессе их инкубации в контролируемом состоянии (таблица 1), Подавление

аккумуляции диеновых конъюгатов наблюдается также при инкубации митохондрий в присутствии протонофорного разобщителя БССР (таблица 1), что согласуется с известными данными о подавлении образования активных форм кислорода в митохондриях путем индукции мягкого разобщения (КогэЬипоу ег а!., 1997; 1998; БкЫасЬеу, 1998).

Таблица 1. Влияние антиоксидантов на аккумуляцию диеновых конъюгатов в митохондриях печени старых крыс в контролируемом состоянии. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,4. Исследуемые соединения были добавлены сразу после митохондрий.

Условия эксперимента а (относительные единицы)

Контроль (п = 8) 0,235 ± 0,022

Тиомочевина 0,2 мМ (п = 5) 0,060 + 0,022*

Тролокс 20 мкМ (п = 5) 0,074 ± 0,024*

Ионол 10 мкМ (п = 4) 0,081 ± 0,023*

FCCP 20 нМ (п = 4) 0,077 ±0,021*

* Различия между опытом (присутствие антиоксиданта) и контролем (отсутствие антиоксиданта) статистически достоверны, р<0,01 (критерий Стьюдента).

Не выявлено различий в скорости дыхания в состоянии 3 и в коэффициенте ADP/O в митохондриях печени молодых и старых крыс. Вместе с тем в митохондриях старых животных скорость дыхания в состоянии 4 меньше, а коэффициент дыхательного контроля больше, чем в митохондриях молодых. Это хорошо согласуется с известными из литературных источников данными, что усиление образования активных форм кислорода в митохондриях печени при старении животных может не сопровождаться снижением скорости дыхания в состоянии 3 и показателей сопряженности дыхания и окислительного фосфорилирования (Paradies et al., 1991; Kerner et al., 2001; Bakalaet al., 2003).

При изучении разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени в среде инкубации обязательно присутствовали ЭГТА, ионы магния, олигомицин и ротенон. В присутствии этих реагентов, как известно (Самарцев и др., 1999), стимуляция дыхания митохондрий жирными кислотами обусловлена только их протонофорным действием, главным образом, при участии ADP/ATP-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера. В наших экспериментах применялся пальмитат как анион одной из наиболее распространенных природных жирных кислот (Wojtczak et al., 1993). Установлено, что зависимость скорости дыхания митохондрий печени

крыс от концентрации пальмитата в пределах от 0 до 40 мкМ близка к линейной.

Дыхание митохондрий молодых крыс в присутствии пальмитата эффективно подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом независимо от порядка их добавок (рис. 2, кривые ¿г и б). В отличие от этого дыхание митохондрий старых крыс в присутствии пальмитата практически не подавляется карбоксиатрактилатом в то время как последующее добавление аспартата приводит к почти полному подавлению его разобщающего действия (рис. 2, кривая в). При добавлении указанных реагентов в другой последовательности — после пальмитата аспартат, а затем карбоксиатрактилат - наблюдается обратный эффект (рис. 2, кривая г).

Рисунок 2. Дыхание митохондрий печени молодых (а и'б) и старых (в и г) крыс в присутствии 30 мкМ пальмитата (Пальм) и при последующем добавлении 1 мкМ карбоксиатрактилата (Катр), 3 мМ аспартата (Асп) и 50 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ).

Тиомочевина, ионол и тролокс в равной степени увеличивают ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата, аспартата, но не

влияют на величину ресопрягающего эффекта при совместном действии карбоксиатрактилата и аспартата (таблица 2).

Таблица 2. Влияние антиоксидантов на дыхание митохондрий печени старых крыс при разобщающем действии пальмитата и при последующем добавлении карбоксиатрактилата и аспартата в различной последовательности. Исследуемые соединения: 0,2 мМ тиомочевины, 10 мкМ ионола или 20 мкМ тролокса были добавлены сразу после митохондрий. Другие добавки: 30 мкМ Пальмитата (Пальм), 1 мкМ карбоксиатрактилата (Катр), 3 мМ аспартата (Асп)

Добавки Скорость дыхания (нмоль 02/мин на 1 мг белка)

Контроль (п = 8) Тиомочевина (п = 5) Ионол (п = 6) Тролокс (п = 4)

Без добавок Пальм Пальм + Катр Пальм + Катр + Асп Пальм+Катр+Асп+ДНФ 9,5 ± 0,3 23,2 ± 0,6 21,8 ±0,4 12,2 ±0,3 52,6 ± 1,3 9,6 ± 0,4 23,8 ± 1,1 17,6 ±0,8* 12,5 ±0,6 58,0 ± 6,5 9,8 ± 0,3 24,0 ± 0,9 18,0 ± 0,5* . 12,7 ±0,3 51,0 ±2,4 9,6 ± 0,4 23,5 ± 0,8 17.5 ±0,6* 12,1 ±0,4 50.6 ±3,2

Без добавок Пальм Пальм + Асп Пальм + Асп + Катр Пальм+Асп+Катр+ДНФ 9,7 ± 0,3 23,0 ± 0,7 22,0 ± 0,5 12,2 ±0,4 52,2 ± 1,7 9,3 ± 0,5 22,8 ± 1,2 18,1 ± 1,1* 12,4 ±0,7 53,4 ±4,9 9,9 ± 0,3 23,1 ±0,6 18,1 ±0,5* 12,5 ±0,3 53,8 ± 2,9 9,4 ± 0,4 22,8 ± 0,9 18,0 ±0,5* 11,7 ±0,5 51,5 ± 3,1

* Различия между опытом (присутствие антиоксиданта) и контролем (отсутствие антиоксиданта) статистически достоверны, р<0,01 (критерий Стыодента).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что подавление продукции активных форм кислорода в митохондриях печени старых крыс в контролируемом состоянии с помощью антиоксидантов придает карбоксиатрактилату и аспартату способность подавлять разобщающее действие пальмитата.

2. Влияние вызванного /яре/м-бутилгидропероксидом окислительного стресса и я-этилмалеимнда на разобщающее действие пальмитата и ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата

При моделировании окислительного стресса в митохондриях использовали известный окисляющий агент трет-бутилгидропероксид. Можно предположить, что модификация трет-бутилгидропероксидом разобщающего действия жирных кислот при участии АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров может быть вызвана продуктами перекисного окисления липидов или окислением критических БН-групп. Необходимы дальнейшие исследования

механизмов регуляции протонофорного разобщающего действия жирных кислот при окислительном стрессе.

Инкубация митохондрий молодых крыс в контролируемом состоянии в присутствии сукцината, ротенона и олигомицина сопровождается аккумуляцией диеновых конъюгатов (таблица 3), что свидетельствует об усилении свободно-радикальных реакций, инициирующих перекисное окисление липидов (Slater, 1984; Ambrosio et al., 1991). Уборщики свободных радикалов тролокс и тиомочевина замедляют аккумуляцию диеновых конъюгатов в контролируемом состоянии (таблица 3). Подавление аккумуляции диеновых конъюгатов наблюдается также при инкубации митохондрий в присутствии пальмитата (таблица 3), что согласуется с известными данными о способности жирных кислот подавлять образование активных форм кислорода в митохондриях путем индукции мягкого разобщения (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998). Аккумуляция диеновых конъюгатов не наблюдается в присутствии пирувата (таблица 3). Как известно, пируват в присутствии ротенона способен повышать степень восстановленное™ митохондриальных пиридиновых нуклеотидов, это, в свою очередь, вызывает повышение восстановленности глутатиона и других тиоловых групп (Lehninger et al., 1978; Rigobello et al., 1995), которые, являясь антиоксидантами, ингибируют продукцию диеновых конъюгатов (Slater, 1984; Davies et al., 1988).

Таблица 3. Влияние трелз-бутилгвдропероксида (ТБГ), антиоксидантов и других модулирующих агентов на аккумуляцию диеновых конъюгатов в митохондриях печени в контролируемом состоянии. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. Исследуемые соединения были добавлены сразу после митохондрий. Приведены средние

Условия эксперимента а (относительные единицы)

Контроль (п = 9) Пируват 7 мМ (л = 5) Тиомочевина 200 мкМ (п = 5) Тролокс 30 мкМ (п = 5) Пальмитат 25 мкМ (п = 6) ТБГ 0,1 мМ (п = б) п-Этилмалеимид 25 мкМ (п = 6) ТБГ 0,1 мМ + тролокс 30 мкМ (п = 4) ТБГ 0,1 мМ + пируват 7 мМ (п = 4) 0,203 ±0,018 0,027 ±0,012* 0,060 ± 0,022* 0,065 ±0,010* 0,079 ± 0,020* 0,327 ± 0,026* 0,081 ±0,021* 0,164 ±0,018 0,092 ±0,023*

контролем (отсутствие модулирующего агента) статистически достоверны, р<0,01 (критерий Стьюдента).

Аккумуляция диеновых конъюгатов подавляется и п-этилмалеимидом (таблица 3). По-видимому, это связано со

ср990$Н9сты(1 л?-:?тилмалеимида ингибировать образование свободных радикалов в митохондриях (Kennedy et al., 1986; Chen et al., 1999). Обработка митохондрий м/?е?и-бутилгидропероксидом в низкой концентрации усиливает аккумуляцию диеновых конъюгатов в контролируемом состоянии. Этот эффект от/^егя-бутилгидропероксида ослабляется тролоксом и пируватом (таблица 3).

В отсутствие шреш-бутилгидропероксида дыхание митохондрий печени в присутствии пальмитата подавляется при последующем добавлении аспартата, а затем карбоксиатрактилата (рис. 3, кривая а), или сначала карбоксиатрактилата, а затем аспартата (рис. 3, кривая б).

Рисунок 3. Стимуляция дыхания митохондрий пальмитатом и влияние на дыхание аспартата и карбоксиатрактилата в отсутствии и присутствии трет-бугилгидропероксида. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. ТБГ - отреяг-бутилгидропероксид, 0,1 мМ; Пальм - пальмитат, 30 мкМ; Асп - аспартат, 3 мМ; Катр -карбоксиатрактилат, 1 мкМ; ДНФ - 2,4-динитрофенол, 50 мкМ.

При обработке митохондрий /лре/и-бутилгидропероксидом дыхание в присутствии пальмитата не подавляется аспартатом или карбоксиатрактилатом при введении этих соединений после

пальмитата, но при добавлении их в другой последовательности — карбоксиатрактилата после аспартата или аспартата после карбоксиатрактилата - эти агенты в существенной степени ингибируют дыхание (рис. 3, кривые в и г). Вместе с тем треш-бутилгидропероксид не влияет на дыхание митохондрий в присутствии одного пальмитата или пальмитата в присутствии одновременно аспартата и карбоксиатрактилата (рис. 3).

Инкубация митохондрий с /и/?е/я-бутилгидропероксидом в контролируемом состоянии в соответствии с условиями, указанными на рисунке 3, приводит к изменению характера ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата. Каждый из этих ресопрягающих агентов не оказывает влияние на действие пальмитата, в то время как совместно они на 80% подавляют его разобщающее действие (таблица 4).

Таблица 4. Влияние трет-бутилгидропероксида (ТБГ) в отсутствии и присутствии пирувата, тролокса и тиомочевины на ресопрягающие эффекты аспартата (Асп) и карбоксиатрактилата (Катр) при разобщающем действии пальмитата в митохондриях печени при рН 7,0 (1) и 7,4 (2). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части. Асп — аспартат, 3 мМ; Катр — карбоксиатрактилат, 1 мкМ. Добавка трет-бутилгидропероксида, как на рисунке 3. Добавка других указанных в таблице соединений - вместе с /ирет-бутилгидропероксидом. Приведены средние

Условия опыта Ресопрягающий эффект, %

Асп Катр Асп + Катр

1 Контроль(п = 6) ГБГ 0,1 мМ (п = 5) ГБГ 0,1 мМ + пируват 7 мМ (п = 5) ГБГ 0,1 мМ + тролокс 30 мкМ (п = 4) 49,5 ± 1,8 0 47,4 ± 1,9 44,1 ± 1,9 31,3 ±2,5 0 30,7 ± 1,7 35,0 ± 1,8 80,3 ± 1,9 75,3 ± 2,3 79.0 ± 2,5 79.1 ± 1,8

2 5ез добавок (п = 6) ГБГ 0,2 мМ (п = 4) ГБГ 0,2 мМ + пируват 7 мМ (п = 4) ТБГ 0,2 мМ + тиомочевина 0,3мМ (п=4 34,0 ± 1,4 0 32,4 ± 1,9 34,2 ±1,3 45,4 ± 1,4 0 45,6 ±1,3 45,8 ± 1,7 79.6 ± 1,7 73.7 ± 2,7 78,6 ± 1,9 80,9 ± 1,4

В следующих экспериментах митохондрии были инкубированы в контролируемом состоянии в присутствии трет-бутилгидропероксида и одного из агентов, вызывающих подавление аккумуляции диеновых коныогатов: пирувата, тролокса или тиомочевины. Установлено, что при этих условиях трет-бутилгидропероксид не оказывает влияния на ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата (таблица 4).

Полученные результаты позволяют говорить о том, что увеличение интенсивности свободно-радикальных реакций в

митохондриях в процессе их инкубации в контролируемом состоянии с от/;сот-бутилгидропероксидом приводит к устранению ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата. Такая модификация АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, участвующих в разобщающем действии пальмитата, может быть вызвана продуктами перекисного окисления липидов и (или) окислением критических ЭН-групп. Очевидно, что в этом случае антиоксиданты — уборщики свободных радикалов эффективны только при добавлении их в начальный момент времени инкубации митохондрий.

Мит

этилмалеимида. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. ЭМ - и-этилмалеимид, 25 мкМ; Пальм -пальмитат, 30 мкМ; Асп - аспартат, 3 мМ; Катр — карбоксиатрактилат, 1 мкМ; ДНФ - 2,4-динитрофенол, 50 мкМ.

В следующих экспериментах митохондрии были инкубированы в контролируемом состоянии я-этилмалеимидом. Этот БН-реагент не влияет на дыхание митохондрий в отсутствие и в присутствии пальмитата. В то же время и-этилмалеимид устраняет ресопрягающие эффекты аспартата и карбоксиатрактилата при введении этих

соединений после пальмитата, но при добавлении их в другой последовательности — карбоксиатрактилата после аспартата или аспартата после карбоксиатрактилата - эти агенты в существенной степени ингибируют дыхание (рис. 4 и таблица 5). Этот эффект п-этилмалеимида не проявляется при добавлении его к митохондриям одновременно с тиомочевиной или меркаптоэтанолом (таблица 5). Как известно, тиоловые соединения способны в растворе связываться с н-этилмалеимидом (Ропуо, 1979), образуя таким образом не способный взаимодействовать с БН-группами комплекс. В отличие от тиомочевины и меркаптоэтанола пируват и тролокс не влияют на эффекты и-этшшалеимида (таблица 5). Следовательно, алкилирование критических БН-групп митохондрий гс-этилмалеимидом моделирует действие окислительного стресса, вызванного трет-бутилгидропероксидом.

Таблица 5. Влияние л-этилмалеимида (ЭМ) в отсутствии и присутствии пирувата, тиомочевины, меркаптоэтанола и тролокса на ресопрягающие эффекты аспартата (Асп) и карбоксиатрактилата (Катр) при разобщающем действии пальмитата в митохондриях печени. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. Асп - аспартат, 3 мМ; Катр — карбоксиатрактилат, 1 мкМ. Добавки других указанных в таблице соединений — вместе с л-этилмалеимидом. Приведены средние значения ±

Условия опыта Ресопрягающий эффект, %

Асп Катр Асп + Катр

Контроль (п = 6) ЭМ 25 мкМ (п = 5) ЭМ 25 мкМ + пируват 7 мМ (а = 4) ЭМ 25 мкМ + тиомочевина 0,3 мМ (п = 4) ЭМ 25 мкМ + меркаптоэтанол 0,5мМ (п= 4) ЭМ 25 мкМ + тролокс 30 мкМ (п = 4) 46,3 ± 3,8 0 0 46,9 ± 2,8 41,6 ±3,5 0 33,5 ±2,1 0 0 34,1 ± 1,0 32,3 ± 2,9 0 80,0 ± 1,9 73,0 ±2,1 72,3 ± 2,3 81,6 ±3,8 78.8 ±2,1 71.9 ± 1,9

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что вызванный трет-бутпгидропероксидом окислительный стресс так же, как влияние л-этилмалеимида, в митохондриях печени при разобщающем действии пальмитата приводит к изменению характера ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата й аспартата. Каждый из этих ресопрягающих агентов не оказывает влияние на действие пальмитата, в то время как совместно они на 80% подавляют его разобщающее действие. Эти данные можно объяснить, основываясь на известной гипотезе о том, что ЛПР/ЛТР- и

аспартат/глутаматный антипортеры могут функционировать совместно как разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот (Самарцев и др., 2002а).

Полученные результаты позволяют говорить о том, что эффект отрето-бутилгидропероксида связан с усилением свободно-радикальных процессов, вызывающих окисление критических БН-групп митохондрий. Аналогичные характерные изменения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата наблюдаются также при инкубации митохондрий с л-этилмалеимидом, способным непосредственно взаимодействовать с БН-группами митохондрий.

3. Ресопрягающее действие АБР при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени молодых и старых крыс

В следующих экспериментах карбоксиатрактилат был заменен 0,2 мМ АБР. А ЭР эффективно подавляет стимулируемое пальмитатом дыхание митохондрий в присутствии тролокса, в то время как в отсутствии этого антиоксиданта не влияет на дыхание (рис. 5). Аспартат обладает ресопрягающим действием как в присутствии, так и в отсутствии этого антиоксиданта (рис. 5). При инкубации митохондрий с трет-бутилгидропероксидом АИР и аспартат не оказывают влияния на разобщающую активность пальмитата (рис. 5).

Как показано на рисунке 6, в присутствии АБР и аспартата протонофорная разобщающая активность пальмитата минимальна при обработке митохондрий тролоксом и достигает максимальных значений при обработке митохондрий /иреот-бутилгидропероксидом. Аналогичные результаты получены при замене тролокса тиомочевинной или пируватом.

М1п

Рисунок 5. Стимуляция дыхания митохондрий печени пальмитатом И влияние на дыхание АГ)р и аспартата п присутствии тролокей (а), в отсутствии добавок (б), в присутствии трет-бутил гидр о перок си д а (в). Добавки: 200 нкМ А1)Р, остальные добавки как на рис, 2.

о,7-

5 0.6

0.*-

0.3-

о £

0.2-

Щ§ж

шщ.

ШшМ

; - ■

ЩРЙР

тролокс без дибавок ТБГ

Рисунок 6, Разобщающая активность пат.митага (Vр) в присутствии 25 МКМ тролокса, а отсутствии добавок и в присутствии 0,1 мМ ТБГ.

* различия между опытом (гтрисугствий тролпкеа и ТБГ) и контролем (в отсутствие добавок) статистически достоверны, р<0,01 (критерий Сгьюденга)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в митохондриях печени протонофорная разобщающая активность пальмитата в присутствии физиологических субстратов АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров зависит от интенсивности формирования активных форм кислорода. В присутствии антиоксидантов разобщающая активность пальмитата приблизительно на 80% подавляется АБР и аспартатом. Без антиоксидантов формирование активных форм кислорода в контролируемом состоянии сопровождается аккумуляцией диеновых коньюгатов и приводит к изменению свойств АБР/АТР- антипортера. Эта модификация вызывает устранение ресопрягающего действия АБР, но не карбоксиатрактилата.

В условиях интенсивной продукции активных форм кислорода (при обработке митохондрий тэт/ге/и-бутилгидропероксидом) наряду с АБР/АТР-антипортером модифицируется и аспартат/глутаматный антипортер, и это приводит к устранению ресопрягающих эффектов одновременно АБР и аспартата.

Исследовано ресопрягающее действие АБР и аспартата при разобщении пальмитатом в митохондриях печени старых крыс. Установлено, что АБР и аспартат в отсутствии антиоксидантов не влияют на дыхание митохондрий печени старых крыс в присутствии пальмитата (таблица 6).

Таблица 6. Влияние антиоксидантов на ресопрягающие эффекты АОР, аспартата (Асп) и их совместного действия (АОР + Асп) при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени

Ресопрягающие соединения Ресопрягающий эффект, %

Контроль (п = 4) Тиомочевина (п = 4) Ионол (п = 4) Тролокс (п = 4)

АБР Асп АОР + Асп 0±0 7,3 ±2,1 7,3 ±2,1 38,0 ± 2,9* 37,2 ± 2,3* 75,2 ±3,7* 36,1 ± 1,9* 35.6 ± 1,6* 71.7 ±2,3* 38.2 ±2,1* 36.3 ± 1,8* 74,5 ± 2,2*

* Различия между опытом (присутствие антиоксиданта) и контролем (отсутствие антиоксиданта) статистически достоверны, р<0,01 (критерий Стъюдента).

В то же время в присутствии тиомочевины, ионола или тролокса АБР и аспартат заметно подавляют разобщающее действие пальмитата (таблица 6; рис. 7).

В присутствии этих физиологических субстратов АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров разобщающая активность пальмитата под влиянием антиоксидантов многократно снижается.

Мит

в присутствии 30 мкМ пальмитата (Пальм) и при последующем добавлении 200 мкМ ЛОР, 3 мМ аспартата (Асп) и 50 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ).

Как предположено выше, способность АОР и аспартата подавлять разобщающее действие жирных кислот зависит от окислительно-восстановительного состояния тиоловых групп, возможно принадлежащих АОР/АТР- и аспартат/глутаматному антипортерам. Можно ожидать, что реагенты, алкилирующие тиоловые группы, например и-этилмалеимид, будут оказывать влияние на ресопрягающие эффекты ЛОР и аспартата. Установлено, что п-этилмапеимид, будучи добавленный одновременно с митохондриями, препятствует проявлению ресопрягающих эффектов АОР и аспартата в присутствии антиоксидантов тролокса и тиомочевины. Полученные данные свидетельствуют о том, что при алкилировании тиоловых групп АОР и аспартат не проявляют ресопрягающего действия даже в присутствии антиоксидантов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенные исследования показали, что в митохондриях старых крыс содержание диеновых конъюгатов выше, чем в митохондриях молодых. Поскольку формирование диеновых конъюгатов как первичных продуктов перекисного окисления липидов связано с дислокацией двойной связи в полиненасыщенных жирных кислотах при действии свободных радикалов, и в том числе супероксидного анион-радикала (Romaschin et al., 1990; Ambrosio et al., 1991; Sokol et al., 1991; Droge, 2002), полученные результаты можно рассматривать как подтверждение известных данных об усилении в митохондриях при старении животных продукции активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Barja, 2002а; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005).

Установлено, что инкубация митохондрий в контролируемом состоянии сопровождается аккумуляцией диеновых конъюгатов и этот процесс протекает более интенсивно в митохондриях старых животных, чем в митохондриях молодых. Это различие может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, более интенсивной /' продукцией активных форм кислорода в митохондриях старых

животных по сравнению с митохондриями молодых. Как известно, ¡ продукция активных форм кислорода в дыхательной цепи

митохондрий очень сильно зависит от ДЧ' (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2.006). В этом случае даже очень небольшое снижение Д*Р, вызванное небольшим увеличением протонной проводимости внутренней мембраны с помощью каких-либо протонофорных разобщителей (мягкое разобщение), приводит к значительному ингибированию продукции активных форм кислорода (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). Как показано в настоящей работе, очень небольшое увеличение протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий старых животных с помощью протонофорного разобщителя FCCP приводит к подавлению аккумуляции диеновых конъюгатов. Второй причиной более интенсивной аккумуляции диеновых конъюгатов в митохондриях старых животных по сравнению с митохондриями молодых является снижение при старении активности природных антиоксидантов, в частности, а-токоферола (Armeni et al., 2003; Kamzalov et al., 2004). Вследствие этого нарушается утилизация активных форм кислорода, образующихся в митохондриях в контролируемом состоянии.

Установлено, что карбоксиатрактилат и аспартат, будучи добавленные к митохондриям печени старых крыс в присутствии пальмитата по отдельности, не обладают ресопрягающим действием. Однако совместно эти агенты подавляют разобщающее действие

пальмитата на 80%. т.е. в равной степени в митохондриях старых и молодых крыс. Снижение продукции активных форм кислорода в митохондриях с помощью применяемых антиоксидантов или FCCP приводит к тому, что карбоксиатрактилат и аспартат приобретают способность подавлять разобщающее действие пальмитата.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в митохондриях печени старых животных окислительный стресс, обусловленный пониженной активностью пассивной утечки протонов в условиях недостаточного защитного действия антиоксидантов, приводит к модификации ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров.

Показано, что аналогичного характера изменения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата при разобщении нальмитатом наблюдаются также в митохондриях печени молодых крыс в том случае, если они были обработаны окисляющим агентом шреот-бутилгидропероксидом. И в этом случае антиоксиданты тролокс и тиомочевина восстанавливают ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата. Следовательно, описанные выше особенности ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата при разобщении пальмитатом в митохондриях старых крыс обусловлены интенсивным формированием активных форм кислорода. Эти особенности могут быть воспроизведены на митохондриях молодых крыс в услов1их окислительного стресса, вызванного трет-бутилгидропероксидом и при алкилировании SH-групп митохондрий и-этилмалеимидом.

Таким образом, модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров происходит как при окислении, так и при алкилировании критических SH-групн митохондрий. Полученные результаты можно объяснить, основываясь на известной гипотезе о том, что ADP/ATP- и аспартат/глутаматный антипортеры могут функционировать совместно как разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот (Самарцев и др., 2002а). По-видимому, формирование разобщающего комплекса происходит как при окислении, так и при алкилировании одних и тех же критических SH-грулп митохондрий. По-видимому, при этих условиях жирные кислоты приобретают способность перемещаться от одного переносчика к другому: под влиянием карбоксиатрактилата от ADP/ATP-антипортера к аспартат/глутаматному антипортеру, под влиянием аспартата - в противоположном направлении. Благодаря такому перемещению в присутствии карбоксиатрактилата компенсируется выключение из разобщения ADP/ATP-антипортера, а в присутствии аспартата -аспартат/глутам атного антипортера.

В отличие от карбоксиатрактилата другой лиганд АОР/АТР-антипортера А О Г' в митохондриях печени старых крыс не подавляет разобщающее действие пальмитата как в отсутствии, так и в присутствии аспартата. Однако в присутствии антиоксидантов, когда продукция активных форм кислорода в митохондриях снижается, АОР приобретает способность подавлять разобщающее действие пальмитата. Аналогичным действием обладают восстановители тиоловых групп даже в том случае, когда антиоксиданты не эффективны. При этих условиях совместное действие физиологических субстратов АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров АОР и аспартата подавляет разобщающее действие пальмитата приблизительно в той же степени, как совместное действие карбоксиатрактилата и аспартата. Эти данные позволяют говорить о том, что АБР способен ингибировать транспорт аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный только в том случае, если тиоловые группы, принадлежащие, возможно, АБР/АТР-антипортеру, находятся в восстановленном состоянии. Модификация этого переносчика, заключающаяся в окислении или алкилировании п-этилмапеимидом его БН-групп, приводит к устранению ингибирующего действия АОР. Можно предположить, что генерация активных форм кислорода в митохондриях старых-крыс, приводящая к окислению БН-групп АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, может быть также причиной увеличения скорости транспорта аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный и в отсутствии АОР. Совместное действие этих двух факторов, по-видимому, является причиной значительного повышения разобщающей активности пальмитата в присутствии АОР и аспартата.

Таким образом, развитие окислительного стресса в митохондриях печени как старых, так и молодых животных в присутствии физиологических субстратов АОР/АТР- и аспартат-глутаматного антипортеров АОР и аспартата приводит к повышению протонофорной разобщающей активности пальмитата. Такое усиление мягкого разобщающего действия жирных кислот, вызванное окислительной модификацией АОР/АТР- и аспартат-глутаматного антипортеров, можно рассматривать как один из механизмов антиоксидантной защиты митохондрий. Вполне возможно, что этот механизм включается при избыточной продукции активных форм кислорода в митохондриях старых животных, а также при действии окисляющих агентов в митохондриях молодых, компенсируя тем самым недостаток природных антиоксидантов.

выводы

1. Инкубация митохондрий печени в отсутствии синтеза АТР и разобщителей окислительного фосфорилирования приводит к аккумуляции диеновых конъюгатов. Этот процесс протекает более интенсивно в митохондриях печени старых крыс, чем молодых, и ингибируется антиоксидантами и протонофорным разобщителем FCCP.

2. В отсутствие антиоксидантов или FCCP протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени старых крыс, в отличие от митохондрий молодых, не подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом по отдельности.

3. В митохондриях печени молодых крыс при окислительном стрессе in vitro, вызванном т/гети-бутилгидропероксидом, так же, как в митохондриях старых животных, протонофорное разобщающее действие пальмитата не подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом по отдельности.

4. В присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров ADP и аспартата протонофорная разобщающая активность пальмитата в митохондриях молодых и старых крыс усиливается при окислительном стрессе.

5. Способность антиоксидантов при разобщении пальмитатом включать ресопрягающее действие карбоксиатрактилата, ADP и аспартата блокируется одним из реагентов на SH-группы п-этилмалеимидом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самарцев В.Н. Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс различного возраста / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, Л.С. Полищук // Биологические мембраны.- 2005,- Т.22, № 2,- С.92-97.

2. Самарцев В.Н. Соотношение между дыханием и синтезом АТР в митохондриях при различной степени разобщения окислительного фосфорилирования / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, Л.С. Полищук // Биофизика,- 2005,- Т.50, № 4,- С.660-667.

3. Кожина О.В. Ресопрягающее действие ADP при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени / О.В. Кожина, М.П. Каратецкова, В.Н. Самарцев // Биологические мембраны.- 2006.- Т.23, №3,- С.213-218.

4. Самарцев В.Н. Количественная характеристика участия ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии

жирных кислот в митохондриях печени при условий формирования разобщающего комплекса / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, JI.C. Полищук // Биологические мембраны.- 2006,- Т.23, №5.- С.402^11.

5. Самарцев В.Н. Сравнительное исследование протонофорного и кальций-зависимого разобщающего действия пальмитата в митохондриях печени морских свинок Cavia porcellus зрелого и старческого возрастов / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, JI.C. Полищук // Журнал эволюционной биохимии и физиологии,- 2006,- Т.42, №4,-С.397—398.

6. Самарцев В.Н. Соотношение между дыханием и синтезом АТР в митохондриях печени при ингибировании транспорта электронов малонатом и в условиях токсического стресса / В.Н. Самарцев, И.П. Зелди, О.В. Кожина, Л.Б. Киселёва, О.В. Полозова, JI.C. Полищук // Биологические мембраны,- 2007.- Т.24, №3.- С.235-243.

7. Полищук JI.C. Возрастная зависимость образования тепла в митохондриях печени / JI.C. Полищук, О.В. Кожина, В.Н. Самарцев // Альманах «Новые исследования». Материалы международной научной конференции «Физиология развития человека», Москва, 22-26 ноября 2004г.- №1-2,- Москва, 2004.- С. 312.

8. Kozhina O.V. Formation of redox-dependent complex at participation of ADP/ATP- and aspartate/glutamate antiporters during the uncoupling of oxidative phosphorylation by fatty acid in liver mitochondria of old rats / O.V. Kozhina, V.N. Samartsev // Материалы юбилейной конференции, посвященной 70-летию основоположника российской биоэнергетики академика В.П. Скулачева, «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке», МГУ 21 -23 февраля 2005г.- Москва, 2005,- С. 46-47.

9. Кожина О.В. Особенности участия ADP/ATP и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени старых животных / О.В. Кожина, В.Н. Самарцев // Биология - наука XXI века. 9-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых 18 — 22 апреля 2005г.- Пущино, 2005.- С. 82.

10. Самарцев В.Н. Изменение окислительно-восстановительного состояния пиридиновых нуклеотидов и SH-групп мембранных белков как фактор регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, JI.C. Полищук // Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6 — 9 июня 2005г.- Пущино, 2005.- С.274-277.

11. Самарцев В.Н. Образование комплекса мембранных белков в митохондриях как один из пусковых механизмов нарушения функций

жизненно важных органов при старении / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, М.П. Каратецкова, Л.С. Полищук Н Бюллетень сибирской медицины. Приложение 1. Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда.- Новосибирск, 2005,- С.119.

12. Кожина О.В. Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени животных различного возраста / О.В. Кожина, Л.С. Полищук, В.Н. Самарцев // Тезисы докладов и лекций XIII международного совещания и VI школы по эволюционной физиологии. Санкт-Петербург, 23 - 28 января 2006г.- Санкт-Петербург,

2006,- С. 108-109.

13. Кожина О.В. Индуцированное окислительным стрессом образование комплекса ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени в процессе разобщающего действия жирных кислот / О.В. Кожина, В.Н. Самарцев // Биология -наука XXI века. 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Путинского научного центра РАН, 17 - 21 апреля 2006г.- Пущино, 2006,- С.79.

14. Samartsev V.N. Oxidative stress induce formation in liver mitochondria of the complex of ADP/ATP and aspartate/glutamate antiporters at fatty acid uncoupling activity / V.N. Samartsev, O.V. Kozhina, L.S. Polishchuk // Biochim. Biophys. Acta; EBEC Short Reports.- 2006.- V.14.- P.389.

15. Самарцев В.Н. Окислительный стресс в митохондриях печени усиливает протонофорное разобщающее действие жирных кислот в присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров / В.Н. Самарцев, О.В. Кожина, Л.С. Полищук // Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 5-7 июня 2007г.- Пущино,

2007.- С.194—197.

Подписано в печать 20.08.2007 г. Формат 60x84/16. Усл.печ.л. 1.62. Тираж 100. Заказ № К1/789.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в копицентре «LANFORT» 424001, г.Иошкар-Ола, пр. Гагарина,2.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кожина, Ольга Владимировна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ В РАЗВИТИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И В ПРОЦЕССАХ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА.

1.1.1. Митохондрии - основной источник активных форм кислорода в клетке.

1.1.2. Митохондрии как мишени активных форм кислорода.

1.1.3. Митохондрии и старение.

1.1.4. Системы удаления АФК в митохондриях.

1.2. РАЗОБЩАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ.

1.3. БЕЛКИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ УЧАСТВУЮЩИЕ В РАЗОБЩАЮЩЕМ ДЕЙСТВИИ

ЖИРНЫХ КИСЛОТ.

1.3.1. Митохондриальные белки-переносчики анионов.

1.3.2. ADP/ATP-антипортер как разобщающий белок.

1.3.3. Аспартат/глутаматный антипортер.

1.3.4. Другие разобщающие белки митохондрий.

1.3.5. Участие разобщающих белков в антиоксидантной защите.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение митохондрий из печени крыс.

2.2. Регистрация дыхания суспензии митохондрий.

2.3. Определение диеновых конъюгатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности разобщающего действия пальмитата и ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата в митохондриях старых крыс.

3.2. Влияние вызванного /я/?т-бутилгидропероксидом окислительного стресса и л-этилмалеимида на разобщающее действие пальмитата и ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата.

3.3. Ресопрягающее действие АЭР при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени молодых и старых крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и при окислительном стрессе in vitro"

Актуальность проблемы. Митохондрии являются не только высокоэффективными энергетическими станциями, обеспечивающими клетку АТР и теплом, но и участвуют в ее гибели по типу апоптоза и некроза. Эта альтернативная функция митохондрий связана с усилением продукции активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Hugnes et al., 2005; Skulachev, 2006). В настоящее время известны различные пути образования активных форм кислорода в митохондриях. В дыхательной цепи в процессе одноэлектронного восстановления кислорода в I и III комплексах образуется непосредственно супероксидный анион-радикал, из которого вследствие последующих химических реакций, как ферментативных, так и неферментативных, могут образовываться пероксид водорода, гидроксильный радикал и другие активные формы кислорода (Lenaz, 1998; Brand et al., 2004; Андреев и др., 2005). Показано, что при старении животных в митохондриях усиливается продукция активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Barja, 2002а; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005). Это, в свою очередь, приводит к мутации митохондриальной ДНК, окислительному повреждению белков и перекисному окислению липидов и, согласно одной из теорий старения, является ведущей причиной дегенеративных изменений в органах и тканях, усиливающихся с возрастом (Lenaz, 1998; Barja, 2002b; Hagen et al., 2002; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005). Предполагается, что наблюдаемые при старении окислительные повреждения митохондрий связаны со снижением активности одного из природных антиоксидантов а-токоферола (Armeni et al., 2003; Kamzalov et al., 2004).

Данные о состоянии процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях старых животных противоречивы. Согласно одним авторам старение животных сопровождается в митохондриях подавлением дыхания и окислительного синтеза АТР (Tummino et al., 1991; Kim et al., 1998). Согласно другим авторам, при старении в митохондриях показатели сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования не только не снижаются, или даже несколько увеличивается (Paradies et al., 1991; Kerner et al., 2001; Bakala et al., 2003).

Показано, что в митохондриях старых животных по сравнению с митохондриями молодых осуществляется более быстро индукция кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры) (Goodell et al., 1998; Mather et al., 2000). Такое повреждение большого количества митохондрий, называемое также митоптозом, приводит к гибели клеток жизненно важных органов, что, в свою очередь, вызывает нарушение их функции и, в конечном итоге, гибель организма (Skulachev, 2006).

При моделировании окислительного стресса в митохондриях широко применяются гидроперекиси органических соединений, например трет-бутилгидропероксид (Lôtscher et al., 1979; Costantini et al., 1996; Slyshenkov et al., 2002). Необходимо отметить, что трет-бутилгидропероксид обладает многообразным действием на митохондрии. В отсутствие ионов кальция обработка митохондрий этим оксидантом приводит к окислению пиридиновых нуклеотидов и глутатиона (Lôtscher et al., 1979; Siess et al., 1988; Slyshenkov et al., 2002; Liu et al., 1996), к образованию метального и других свободных радикалов (Kennedy et al., 1992). При этих условиях окисление глутатиона в митохондриях сопровождается повышением уровня гидропероксидов (Martin et al., 2000) и диеновых конъюгатов (Nigam et al., 1999; Slyshenkov et al., 2002).

Одним из путей подавления продукции активных форм кислорода в митохондриях является снижение разности электрохимических потенциалов протонов (ДцН+) на внутренней мембране при усилении протонной проводимости (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). Показано, что это может быть достигнуто с помощью природных разобщителей окислительного фосфорилирования свободных (неэтерифицированных) жирных кислот (Korshunov et al., 1998). В настоящее время известны различные пути разобщающего действия жирных кислот (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). В отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров (Samartsev et al., 1997b; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). В этом случае ингибитор ADP/ATP-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат способны подавлять разобщающее действие жирных кислот (Samartsev et al., 1997а; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). Участие ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). Было предположено, что модификация ADP/ATP-антипортера продуктами перекисного окисления липидов может привести к усилению протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий в присутствии жирных кислот (Мохова и Хайлова, 2005). Интересно предположить, что при окислительном стрессе наряду с ADP/ATP-антипортером изменяются свойства и аспартат/глутаматного антипортера, и это сопровождается повышением скорости переноса аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный и (или) устранением способности лигандов этих переносчиков подавлять этот транспорт. Представляет интерес исследовать влияние антиоксидантов с различным механизмом действия на разобщающее действие жирных кислот в митохондриях старых животных в условиях эндогенного окислительного стресса, а также в митохондриях молодых животных при индукции окислительного стресса in vitro.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является выяснение роли окислительного стресса как регулятора протонофорного разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и действии in vitro окисляющих агентов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. В опытах in vitro оценить интенсивность генерации диеновых конъюгатов и эффективность действия антиоксидантов в митохондриях печени молодых и старых крыс.

2. Выяснить, имеются ли различия в протонофорном разобщающем действии пальмитата при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых крыс.

3. Исследовать влияние окислительного стресса in vitro, вызванного я?/?ет-бутилгидропероксидом, на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых крыс.

4. Изучить влияние физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров ADP и аспартата на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых и старых крыс в отсутствии и присутствии антиоксидантов и окисляющего агента /ире/и-бутилгидропероксида.

5. Выяснить, какова роль тиоловых групп митохондрий печени в модуляции протонофорной разобщающей активности жирных кислот при развитии окислительного стресса в митохондриях как молодых, так и старых крыс.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что инкубация митохондрий печени старых крыс приводит к развитию окислительного стресса и это вызывает устранение способности лигандов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, соответственно карбоксиатрактилата и аспартата, подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот. Такие, свойственные для митохондрий старых крыс, особенности протонофорного разобщающего действия жирных кислот могут быть воспроизведены на митохондриях молодых животных путем инкубации органелл с окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что как в митохондриях старых, так и молодых животных, окислительный стресс индуцирует модификацию ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, связанную с окислением критических SH-групп митохондрий. В присутствии физиологических субстратов этих переносчиков, соответственно ADP и аспартата, такая модификация приводит к усилению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

Положения, выносимые на защиту:

1. В митохондриях печени старых животных окислительный стресс, обусловленный пониженной активностью пассивной утечки протонов в условиях недостаточного защитного действия природных антиоксидантов, приводит к модификации ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, проявляющейся в устранении способности лигандов этих переносчиков подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот.

2. В митохондриях печени молодых животных аналогичная модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров может быть воспроизведена путем инкубации органелл с окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом.

3. В присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров - ADP и аспартата - вызванная окислительным стрессом модификация этих переносчиков в митохондриях печени как молодых, так и старых животных, приводит к повышению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

4. Модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых животных связана с окислением критических SH-групп митохондрий.

Научно-практическое значение работы.

Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при окислительном стрессе, развивающемся при старении животных и действии окисляющих агентов in vitro. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в клеточной патофизиологии и медицине, поскольку в настоящее время известно, что окислительный стресс является одним из ведущих пусковых механизмов приводящих к гибели клеток по типу апоптоза и некроза.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кожина, Ольга Владимировна

выводы

1. Инкубация митохондрий печени в отсутствии синтеза АТР и разобщителей окислительного фосфорилирования приводит к аккумуляции диеновых конъюгатов. Этот процесс протекает более интенсивно в митохондриях печени старых крыс, чем молодых, и ингибируется антиоксидантами и протонофорным разобщителем FCCP.

2. В отсутствие антиоксидантов или FCCP протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени старых крыс, в отличие от митохондрий молодых, не подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом по отдельности.

3. В митохондриях печени молодых крыс при окислительном стрессе in vitro, вызванном трет-бутилгидропероксидом, так же, как в митохондриях старых животных, протонофорное разобщающее действие пальмитата не подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом по отдельности.

4. В присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров ADP и аспартата протонофорная разобщающая активность пальмитата в митохондриях молодых и старых крыс усиливается при окислительном стрессе.

5. Способность антиоксидантов при разобщении пальмитатом включать ресопрягающее действие карбоксиатрактилата, ADP и аспартата блокируется одним из реагентов на SH-группы л-этилмалеимидом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в митохондриях старых крыс содержание диеновых конъюгатов выше, чем в митохондриях молодых. Поскольку формирование диеновых конъюгатов как первичных продуктов перекисного окисления липидов связано с дислокацией двойной связи в полиненасыщенных жирных кислотах при действии свободных радикалов, и в том числе супероксидного анион-радикала (Romaschin et al., 1990; Ambrosio et al., 1991; Sokol et al., 1991; Dröge, 2002), полученные результаты можно рассматривать как подтверждение известных данных об усилении в митохондриях при старении животных продукции активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Barja, 2002а; Brand et al., 2004; Judge et al., 2005).

Установлено, что инкубация митохондрий в контролируемом состоянии сопровождается аккумуляцией диеновых конъюгатов и этот процесс протекает более интенсивно в митохондриях старых животных, чем в митохондриях молодых. Это различие может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, более интенсивной продукцией активных форм кислорода в митохондриях старых животных по сравнению с митохондриями молодых. Действительно, в контролируемом состоянии скорость дыхания митохондрий старых животных ниже, чем митохондрий молодых. Так как скорость дыхания в контролируемом состоянии обусловлена пассивной утечкой протонов (Rolfe et al., 1997), это свидетельствует о снижении протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий при старении животных. Как известно, продукция активных форм кислорода в дыхательной цепи митохондрий очень сильно зависит от А у (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). В этом случае даже очень небольшое снижение Ду, вызванное небольшим увеличением протонной проводимости внутренней мембраны с помощью каких-либо протонофорных разобщителей (мягкое разобщение), приводит к значительному ингибированию продукции активных форм кислорода (Korshunov et al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). Как показано в настоящей работе, очень небольшое увеличение протонной

94 проводимости внутренней мембраны митохондрий старых животных с помощью протонофорного разобщителя БССР приводит к подавлению аккумуляции диеновых конъюгатов. Второй причиной более интенсивной аккумуляции диеновых конъюгатов в митохондриях старых животных по сравнению с митохондриями молодых является снижение при старении активности природных антиоксидантов, в частности, а-токоферола (Агтеш е1 а1., 2003; Катга1оу е1 а!., 2004). Вследствие этого нарушается утилизация активных форм кислорода, образующихся в митохондриях в контролируемом состоянии. Вполне понятно, что в этом случае внесение каких-либо антиоксидантов приводит к утилизации активных форм кислорода, а это, сопровождается подавлением продукции диеновых конъюгатов.

Установлено, что карбоксиатрактилат и аспартат, будучи добавленные к митохондриям печени старых крыс в присутствии пальмитата по отдельности, не обладают ресопрягающим действием. Однако как совместно эти агенты подавляют разобщающее действие пальмитата на 80%, т.е. в равной степени в митохондриях старых и молодых крыс. Снижение продукции активных форм кислорода в митохондриях с помощью применяемых антиоксидантов или БССР приводит к тому, что карбоксиатрактилат и аспартат приобретают способность подавлять разобщающее действие пальмитата.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в митохондриях печени старых животных окислительный стресс, обусловленный пониженной активностью пассивной утечки протонов в условиях недостаточного защитного действия антиоксидантов, приводит к модификации АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров.

Показано, что аналогичного характера изменения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата при разобщении пальмитатом наблюдаются также в митохондриях печени молодых крыс в том случае, если они были обработаны окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом. И в этом случае антиоксиданты тролокс и тиомочевина восстанавливают ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата. Следовательно,

95 описанные выше особенности ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата при разобщении пальмитатом в митохондриях печени старых крыс обусловлены интенсивным формированием активных форм кислорода. Эти особенности могут быть воспроизведены на митохондриях молодых крыс в условиях окислительного стресса, вызванного трет-бутилгидропероксидом и при алкилировании БН-групп митохондрий и-этилмалеимидом.

Таким образом, модификация АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров происходит как при окислении, так и при алкилировании критических БН-групп митохондрий. Полученные результаты можно объяснить, основываясь на известной гипотезе о том, что АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеры могут функционировать совместно как разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот (Самарцев и др., 2002). По-видимому, формирование разобщающего комплекса происходит как при окислении, так и при алкилировании одних и тех же критических БН-групп митохондрий. Можно предположить, что при этих условиях жирные кислоты приобретают способность перемещаться от одного переносчика к другому: под влиянием карбоксиатрактилата от АОР/АТР-антипортера к аспартат/глутаматному антипортеру, под влиянием аспартата - в противоположном направлении. Благодаря такому перемещению в присутствии карбоксиатрактилата компенсируется выключение из разобщения АОР/АТР-антипортера, а в присутствии аспартата -аспартат/глутаматного антипортера.

В отличие от карбоксиатрактилата другой лиганд АОР/АТР-антипортера АОР в митохондриях печени старых крыс не подавляет разобщающее действие пальмитата как в отсутствии, так и в присутствии аспартата. Однако в присутствии антиоксидантов, когда продукция активных форм кислорода в митохондриях снижается, АОР приобретает способность подавлять разобщающее действие пальмитата. Аналогичным действием обладают восстановители тиоловых групп даже в том случае, когда антиоксиданты не эффективны. При этих условиях совместное действие

96 физиологических субстратов АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров АОР и аспартата подавляет разобщающее действие пальмитата приблизительно в той же степени, как совместное действие карбоксиатрактилата и аспартата. Эти данные позволяют говорить о том, что АОР способен ингибировать транспорт аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный только в том случае, если тиоловые группы, принадлежащие, возможно, АОР/АТР- антипортеру, находятся в восстановленном состоянии. Модификация этого переносчика, заключающаяся в окислении или алкилировании и-этилмалеимидом его БН-групп, приводит к устранению ингибирующего действия АОР. Можно предположить, что генерация активных форм кислорода в митохондриях старых крыс, приводящая к окислению ЭН-групп АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, может быть также причиной увеличения скорости транспорта аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный и в отсутствии АОР. Совместное действие этих двух факторов, по-видимому, является причиной значительного повышения разобщающей активности пальмитата в присутствии АОР и аспартата.

Таким образом, развитие окислительного стресса в митохондриях печени как старых, так и молодых животных в присутствии физиологических субстратов АОР/АТР- и аспартат-глутаматного антипортеров АОР и аспартата приводит к повышению протонофорной разобщающей активности пальмитата. Такое усиление мягкого разобщающего действия жирных кислот, вызванное окислительной модификацией АОР/АТР- и аспартат-глутаматного антипортеров, можно рассматривать как один из механизмов антиоксидантной защиты митохондрий. Вполне возможно, что этот механизм включается при избыточной продукции активных форм кислорода в митохондриях старых животных, а также при действии окисляющих агентов в митохондриях молодых, компенсируя тем самым недостаток природных антиоксидантов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кожина, Ольга Владимировна, Йошкар-Ола

1. Андреев А.Ю. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях / Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. // Биохимия.- 2005.-Т.70, вып. 2.- С.246-264

2. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов,-М.: Медицина, 1989.- 368 с.

3. Бодрова М.Э. Участие ADP/ATP антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени / Бодрова М.Э., Маркова О.В., Мохова E.H., Самарцев В.Н. // Биохимия.- 1995.- Т.60, вып. 8.- С. 13491357

4. Бра М. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели / Бра М., Квинан Б., Сузин С.А. // Биохимия.- 2005.-Т.70, вып. 2.- С.284-293

5. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И.- М.: Наука, 1972.-210 с.

6. Досон Р. Справочник биохимика / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.: Пер. с англ-М.: Мир, 1991 544 с.

7. Западнюк И.П. Лабораторные животные. Разведение, содержание и использование в эксперименте / Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В.- Киев: Вища школа, 1983.-315 с.

8. Зенков Н.К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б.- М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001.- 343 с.

9. Ю.Зоров Д.Б. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота / Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова99

10. Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. // Биохимия.- 2005.-Т.70, вып.2.- С.265-272

11. П.Мохова E.H. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот / Мохова E.H., Хайлова Л.С. // Биохимия.- 2005.- Т.70, вып. 2.- С. 197-202

12. Самарцев В.Н. Роль аспартат/глутаматного антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени / Самарцев В.Н., Мохова E.H. // Второй съезд биохимического общества Российской АН, тезисы стендовых сообщений, Пущино, 1997b.- С.391

13. Самарцев В.Н. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования//Биохимия,- 2000.- Т.65.- С.1173-1189

14. Самарцев В.Н. Влияние этанола на разобщение пальмитиновой кислотой окислительного фосфорилирования в митохондриях печени / Самарцев В.Н., Белослудцев К., Чезганова С.А., Зелди И.П. // Биохимия.- 2002а.-1.61, вып. 11.- С. 1502-1510

15. Самарцев В.Н. Протонный футильный цикл при различных энергетических состояниях митохондрий, линейная модель / Самарцев В.Н., Полищук Л.С. // Биол. мембраны.- 2002b.- Т. 19,- С.232-237

16. Самарцев В.Н. Температурная зависимость дыхания митохондрий печени крыс при разобщении окислительного фосфорилирования жирными кислотами. Влияние неорганического фосфата / Самарцев

17. B.Н., Чезганова С.А., Полищук JI.C., Пайдыганов А.П., Видякина О.В., Зелди И.П. //Биохимия.- 2003.- Т.68, вып. 6.- С.1137-1143

18. Самарцев В.Н. Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени млекопитающих с различной массой тела / Самарцев В.Н., Полищук JI.C., Пайдыганов А.П., Зелди И.П. // Биохимия.- 2004,- Т.69, вып. 6.- С.832-842

19. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах.- М.: Наука, 1972

20. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран.- М.: Наука, 1989

21. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации О2 как особая функция дыхательных систем клетки // Биохимия.- 1994.- Т.59.- №12.1. C.1910-1912

22. Скулачев В.П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода // Мол.биол.- 1995.- Т.29, вып. 6.- С.1199-1209

23. Скулачев В.П. Альтернативные функции клеточного дыхания // Соросовский образовательный журнал.- 1998, №8,- С.2-7

24. Скулачев В.П. Старение как атавистическая программа, которую можно попытаться отменить // Вестник РАН.- 2005

25. Черняк Б.В. Биоэнергетика и смерть / Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Изюмов Д.С., Лямзаев К.Г., Аветисян А.В. // Биохимия.- 2005.- Т.70, вып. 2.- С.294-301

26. Adelman R. Oxidative damage to DNA: Relation to species metabolic rate and life span / Adelman R., Saul R.L., Ames B.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988.- V.85.- P.2706-2708

27. Ames B.N. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging / Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993.- V.90.- P.7915-7922

28. Andreyev A.Yu. Carboxyatractylate inhibits the uncoupling effect of free fatty acids / Andreyev A.Yu., Bondareva T.O., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P., and Volkov N.I. // FEBS Lett.- 1988.- V.226.- P.265-269

29. AquiIa H. Solute carriers involved in energy transfer of mitochondria form a homologous protein family / Aquila H., Link T.A., and Klingenberg M. // FEBS Lett.- 1987.- V.212.- P.l-9

30. Barja G. Mitochondrial free radical production and aging in mammals and birds // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1998,- V.854.- P.224-238

31. Barja G. Mitochondrial free radical generation: sites of production in states 4 and 3, organ specificity and relationship with aging rate // J. Bioenerg. Biomembr.- 1999.- V.31.- P.347-366

32. Barja G. Endogenous oxidative stress: relationship to aging, longevity and caloric restriction // Ageing Research Reviews.- 2002a.- V.I.- P.397-411

33. Barja G. The quantitative measurement of H2O2 generation in isolated mitochondria//J. Bioenerg. Biomembr.- 2002b.- V.34.- P.227-233

34. Beckman K.B. Oxidative decay of DNA / Beckman K.B., Ames B.N. 11 J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.19633-19636

35. Berlett B.S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress / Berlett B.S., StadtmanE. //J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.20313-20316

36. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers and permeability transition // Physiol. Rev.- 1999,- V.79.- P. 1127-1155

37. Boss 0. Tissue-dependent upregulation of rat uncoupling protein-2 expression in response to fasting or cold / Boss 0., Samec S., Dulloo A., Seydoux J., Muzzin P. and Giacobino J.P. // FEBS Lett.- 1997b.- V.412.-P.l 11-114

38. Boss 0. The uncoupling proteins, a review / Boss 0., Muzzin P., Giacobino J.P. //Eur. J. Endocrin.- 1998a.- V.139.- P. 1-9

39. Boss 0. Genomic structure of uncoupling protein-3 (UCP 3) and its assignment to chromosome llql3 / Boss 0., Muzzin P., Giacobino J.P. // Genomics.- 1998b.- V.47.- P.425-426

40. Bouillaud F. Homologues of the uncoupling protein from brown adipose tissue (UCP1): UCP2, UCP3, BMCP1 and UCP4 / Bouillaud F., Couplan E., Pecqueur C., Ricquier D. // Biochim. Et Biophys. Acta.- 2001,- V.1504.-P. 107-119

41. Boveris A. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide / Boveris A., Chance B. // Biochem J.- 1973.- V.134.- P.707-716

42. Brand M.D. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins / Brand M.D., Affourtit C., Esteves T.C., Green K., Lambert A.J., Miwa S., Pakay J.L., Parker N. // Free Rad. Biol. Med.- 2004.- V.37.- P.755-767

43. Brustovetsky N. The reconstituted ADP/ATP carrier can mediate H+ transport by free fatty acids, which is further stimulated by mersalyl / Brustovetsky N., Klingenberg M. // J. Biol. Chem.- 1994.- V.269.- P.27329-27336

44. Chen Y.R. An electron spin resonance spin-trapping investigation of the free radicals formed by the reaction of mitochondrial cytochrome c oxidase with H202 / Chen Y.R., Gunther M.R., Mason R.P. // J. Biol. Chem.- 1999.-V.274.- P.3308—3314

45. Costantini P. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore by pyridine nucleotides and dithiol oxidation at two separate sites / Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V. Bernardi P. // J. Biol. Chem.-1996.- V.271.- P.6746-6751

46. Costantini P. Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis / Costantini P., Belzacq A.-S., Vieira H.L. // Oncogene.- 2000,- V.19.- P.307-314

47. Couplan E. High level of uncoupling protein 1 expression in muscle of transgenic mice selectively affects muscles at rest and decreases their libfiber content / Couplan E., Gelly C., Goubern M. et al. // J. Biol. Chem.-2002a.- V.277.- P.43079-43088

48. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in the cell death //Biochem. J.- 1999.- V.341.- P.233-249

49. Davies M.J. Vitamin E analogue Trolox C. E.s.r. and pulse-radiolysis studies of free-radical reactions / Davies M.J., Forni L.G., and Willson R.L. // Biochem. J.- 1988.- V.255.- P.513-522

50. Dierks T. Reaction mechanism of the reconstituted aspartate/glutamate carrier from bovine heart mitochondria / Dierks T., Riemer E., and Kramer R. //Biochim. Biophys. Acta.- 1988.- V.943.- P.231-244

51. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev.- 2002.- V.82.- P.47-82

52. Duszynski J. Microcompartmentation of aspartate in rat liver mitochondria / Duszynski J., Mueller G., and LaNoue K. // J. Biol. Chem.- 1978.- V.253.-P.6149-6157

53. Esterbauer H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malnaldehyde and related aldehydes / Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H. // Free Radic. Biol. Med.-1991.- V.l 1.- P.81-128

54. Fonyo A. SH-group reagents as tools in the study of mitochondrial anion transport//J. Bienerg. Biomembr.- 1978.- V.10.- P.171-194

55. Fonyo A. Inhibitors of mitochondria phosphate transport // Pharmac. Ther.-1979.- V.l.- P.627-645

56. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems // J. Lipid Res.- 1998.- V.39.- P. 1529-1542

57. Goglia F. A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet / Goglia F. and Skulachev V.P. // FASEB J.-2003.- V.l 7,- P.1585-1591

58. Goodell S. Analysis of oxygen consumption and mitochondrial permeability with age in mice / Goodell S., Cortopassi G. // Mech. Ageing Dev.- 1998.-V.101.- P.245-256

59. Gremse D.A. Effect of pyridoxal 5-phosphate on the function of the purifed mitochondrial tricarboxylate transport protein / Gremse D.A., Dean B., Kaplan R.S. //Arch. Biochem. Biophys.- 1995.- V.316.- P.215-219

60. Halestrap A.P. The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore and a key player in cell death / Halestrap A.P. and Brenner C. // Curr. Med. Chem.- 2003,- V.10.- P. 15071525

61. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems // Amer. J. of Med.-1991,- V.91.- P. 14-23

62. Hansford R.G. Control of mitochondrial substrate oxidation // Curr. Top. Bioenerg.- 1980.- V.10.- P.217-278

63. Harper M.-E. Age-related increase in mitochondrial proton leak and decrease in ATP turnover reactions in mouse hepatocytes / Harper M.-E., Monemdjou S., Ramsey J.J., Weindruch R. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.- 1998.- V.275,1. 2.- P.E197-E206

64. Harper J.A. Artifactual uncoupling by uncoupling protein 3 in yeast mitochondria at the concentrations found in mouse and rat skeletal-muscle mitochondria / Harper J.A., Stuart J.A., Jekabsons M.B. et al. // Biochem. J.-2002.- V.361.- P.49-56

65. Herrero A. Effect of aging on mitochondrial and nuclear DNA oxidative damage in the heart and brain throughout the life-span of the rat / Herrero A., Barja G. // J. Am. Aging Assoc.- 2001.- V.24.- P.45-50

66. Hickson-Bick D.L. Palmitate-induced apoptosis in neonatal cardiomyocytes is not dependent on the generation of ROS / Hickson-Bick D.L., Sparagna G.C., Buja L.M., McMillin J.B. // Am. J. Physiol. Heart Circ Physiol.-2002.- V.282(2).- P.H656-H664

67. Hinkle P.C. The phosphorus/oxygen ratio of mitochondrial oxidative phosphorilation / Hinkle P.C., Yu M.L. // J. Biol. Chem.- 1979.- V.- 254, No.7.- P.2450-2455

68. Jaburek M. Reconstitution of recombinant uncoupling proteins: UCP1, -2, and -3 have similar affinities for ATP and are unaffected by coenzyme Q10 / Jaburek M. and Garlid K.D. // J. Biol. Chem.- 2003.- V.278, № 28,-P.25825-25831

69. James A.M. Antioxidant and prooxidant properties of mitochondrial Coenzyme Q / James A.M., Smith R.A.J., Murphy M.P. // Arch, of Biochem. and Biophys.- 2004.- V.423.- P.47-56

70. Kamzalov S. Effect of age and caloric restriction on coenzyme Q and alpha-tocopherol levels in the rat / Kamzalov S., Sohal R.S. // Exp. Gerantol.-2004.- V.39.- P. 1199-1205

71. Kennedy C.N. Hydroperoxide-induced radical production in liver mitochondria / Kennedy C.N., Pryor W.A., Winston G.W., Church D.F. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1986.- V.141.- P. 1123-1129

72. Kennedy C.H. Tert-Butyl hydroperoxide-induced radical production in rat liver mitochondria / Kennedy C.H., Church D.F., Winston G.W., Pryor W.A. // Free Radic. Biol. Med.- 1992.- V.12.- P.381-387

73. Kerner J. Aging skeletal muscle mitochondria in the rat: decreased uncoupling protein-3 content / Kerner J., Turkaly P.J., Minkler P.E., and Hoppel C.L. //Am. J. Physiol.- 2001.- V.281.- P.E1054-E1062

74. Kim J.H. Age-related changes in respiration coupled to phosphorylation. I. Hepatic mitochondria / Kim J.H., Woldgiorgis G., Elson C.E., Shrago E. // Mech. Ageing Dev.- 1998.- V.46.- P.263-277

75. Klingenberg M. The ADP/ATP translocation in mitochondria, a membrane potential controlled transport / J. Membr. Biol.- 1980.- V.56.- P.97-105

76. Klingenberg M. The ADP/ATP carrier in mitochondrial membranes // Enzymes Biol. Membr.- 1985a.- V.4.- P.511-553

77. Klingenberg M. The reconstituted isolated uncoupling protein is a membrane-potential driven Hf translocator / Klingenberg M. and Winkler E. // EMBO J.- 1985b.- V.4.- P.3087-3092

78. Klingenberg M. Structure-function of the ADP/ATP carrier // Membrane transport.- 1992.- V.20.- P.547-549

79. Kong J.Y. Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A / Kong J.Y., Rabkin S.W. // Bioch. Biophys. Acta.- 2000.- V.1485.- 45-55

80. Kong J.Y. Mitochondrial effects with ceramide-induced cardiac apoptosis are different from those of palmitate / Kong J.Y., Rabkin S.W. // Arch. Biochem. Biophys.- 2003.- V.412.- P. 196-206

81. Korshunov S.S. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria / Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. // FEBS Lett.- 1997.- V.416.- P. 15-18

82. Korshunov S.S. Fatty acids as natural uncouplers preventing generation of O2' and H2O2 by mitochondria in the resting state / Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev, V.P., Starkov A.A. // FEBS Lett.- 1998.- V.435.- P.215-218

83. Korshunov S.S. The antioxidant functions of cytochrome c / Korshunov S.S., Krasnikov B.F., Pereverzev M.O., Skulachev V.P. // FEBS Lett.- 1999.- V.462.- P. 192-198

84. Kramer R. Reconstitution of adenine nucleotide transport with purified ADP, ATP-carrier protein / Kramer R. and Klingenberg M. // FEBS Lett.- 1977.- V.82.- P.363-367

85. Kushnareva Yu. Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome c and NAD (P) + oxidation-reduction state / Kushnareva Yu., Murphy A.N., and Andreyev A. // Biochem. J.-2002.- V.368.- P.545-553

86. LaNoue K.F. Electrogenic characteristics of the mitochondrial glutamate-aspartate antiporter / LaNoue K.F. and Tischler M.E. // J. Biol. Chem.- 1974.- V. 249, №23,- P.7522-7528

87. LaNoue K.F. Metabolite transport in mitochondria / LaNoue K.F. and Schoolwerth A.C. // Ann. Rev. Biochem.- 1979.- V.48.- P.871-922

88. Lehninger A.L. Regulation of Ca2+ release from mitochondria by the oxidation-reduction state of pyridine nucleotides / Lehninger A.L., Vercesi A., Bababunmi E.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- V.75.- P. 16901694

89. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and aging // Biochimica et Biophysica Acta.- 1998.- V.1366.- P.53-67

90. Lin C.S. Isolation of the uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria / Lin C.S., Klingenberg M. // FEBS Lett.- 1980a.- V.113.-P.299-303

91. Lin C.S. The uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria is a dimer. A hydro-dynamic study / Lin C.S., Hackenberg H., Klingenberg M. // FEBS Lett.- 1980b.- V.l 13.- P.304-306

92. Listenberger L.L. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway / Listenberger L.L., Ory D.S., Schaffer J.E. //J. Biol. Chem.- 2001,- V.276, No 18.- P. 14890-14895

93. Liu H. The reduction of glutathione disulfide produced by t-butyl hydroperoxide in respiring mitochondria / Liu H., Kehler J.P. // Free. Radic. Biol. Med.- 1996.- V.20.- P.433-442

94. Lotscher H.R. Hydroperoxides can modulate the redox state of pyridine nucleotides and calcium balance in rat liver mitochondria / Lotscher H.R., Winterhalter K.H., Carafoli E„ Richter C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979.- V.76.- P.4340-4344

95. Majima E. / Majima E., Koike H., Hong Y.-M., Shinohara Y., Terada H. // J. Biol. Chem.- 1993,- V.268.- P.22181-22187

96. Martin M. Melatonin but not vitamins C and E maintains glutathione homeostasis in t-butyl hydroperoxide-induced mitochondrial oxidative stress

97. Martin M., Macias M., Escames G., Leon J., Acuna-Castroviejo D. // FASEB J.- 2000,- V.M.- P. 1677-1679

98. Mather M. Aging enhances the activation of the permeability transition pore in mitochondria / Mather M., Rottenberg H. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2000.- V.273.- P.603-608

99. Melov S. Mouse models of mitochondrial diseas, oxidative stress, and senescence / Melov S., Coskun P.E., Wallace D.C. // Mutat. Res.- 1999.-V.434.- P.233-247

100. Mecocci P. Oxidative damage to mitochondrial DNA shows marked age-dependent increases in human brain / Mecocci P., MacGarvey U., Kaufman A., Koontz D., Shoffner J., Wallace D., Beal M. // Ann. Neurol.-1993.-V.33.- P.609-616

101. Morel E. An apprisal of functional significance of the inhibitory effect of long chain acyl-CoAs on mitochondrial transports / Morel E., Lauquin C, Lunardy J., Duszynsky J., Vignais P.V. // FEBS Lett.- 1974.- V.39.- P. 133138

102. Murphy E. Kinetics and regulation of the glutamate-aspartate translocator in rat liver mitochondria / Murphy E., Coll K.E., Viale R.O., Tischler M.E., Williamson J.R. // J. Biol. Chem.- 1979.- V.254.- P.8369-8376

103. Nicholls D.G. Thermogenic mechanisms in brown fat / Nicholls D.G., Locke R.M. // Physiol. Rev.- 1984,- V.64.- P. 1-64

104. Nigam D. Glutathione depletion and oxidative damage in mitochondria following exposure to cadmium in rat liver and kidney / Nigam D., Shukla G.S., Agarwal A.K. // Toxicol. Lett.- 1999.- V.106.-P.151-157

105. Palmieri F. Mitochondrial substrate carriers / Palmieri F., Bisaccia F., Iacobazzi V., Indiveri C, Zara V. // Biochim. Biophys. Acta.- 1992.- V.101.-P.223-227

106. Palmieri F. Mitochondrial carrier proteins // FEBS Lett.- 1994,-V.346.- P.48-54

107. Palmieri F. Mitochondrial metabolite transporters / Palmieri F., Bisaccia F., Capobianco L., Dolce V., Fiermonte G., Iacobazzi V., Indiveri C, Palmieri L. // Biochim. Biophys. Acta.- 1996.- V.1275.- P. 127-132

108. Palmieri L. Citrin and aralarl are Ca -stimulated aspartate/glutamate transporters in mitochondria / Palmieri L., Pardo B., Lasorsa F.M., del Arco113

109. A., Kobayashi K., Iijima M., Runswick M.J., Walker J.E., Saheki T., Satrustegui J., Palmieri F. // EMBO J.- 2001.- V.20.- P.5060-5069

110. Pande S.V. Reversible inhibition of mitochondrial adenosine diphosphate phosphorylation by long chain acyl coenzyme A esters / Pande S.V., Blanchaer M.C. // J. Biol. Chem.-1971.- V.246.- P.402-411

111. Papa S. Reactive oxygen species, mitochondria apoptosis and aging / Papa S. and Skulachev V.P. // Mol. Cell. Biochem.- 1997.- V.174, № 1-2.-P.305-319

112. Paradies G. Effect of aging on the activity of the phosphate carrier and on the lipid composition in rat liver mitochondria / Paradies G., Ruggiero F.M. // Arch. Biochim. Biophys.- 1991.- V.284.- P.332-337

113. Pecqueur C. Uncoupling protein 2, in vivo distribution, induction upon oxidative stress, and evidence for translational regulation / Pecqueur

114. C., Alves-Guerra M.-C., Gelly C., Levi-Meyrueis C., Couplan E., Collins S., Ricquir D., Bouillaud F., Miroux B. // J. Biol. Chem.- 2001,- V.276, No. 12.-P.8705-8712

115. Penzo D. Effects of fatty acids on mitochondria: implications for cell death / Penzo D., Tagliapietra C., Colonna R., Petronilli V., Bernardi P. // Bioch. Biophys. Acta.- 2002.- V.1555.- P. 160-165

116. Penzo D. Arachidonic acid released by phospholipase A2 activation trigger Ca2+-dependent apoptosis through the mitochondrial pathway / Penzo

117. D., Petronilli V., Angelin A., Cusan C., Colonna R., Scorrano L., Pagano F.,

118. Prato M., Di Lisa F., Bernardi P. // J. Biol. Chem.- 2004.- V.279.- P.25219-25225

119. Petronilli V. Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A-sensitive permeability transition pore of mitochondria / Petronilli V., Cola C., Massari S., Colonna R., Bernardi P. // J. Biol. Chem.-1993.- V.268.- P.21939-21945

120. Piper H.M. Fatty acid-membrane interactions in isolated cardiac mitochon-dria and erythrocytes / Piper H.M., Sezer O., Schwartz P., Hutter J.F., Spieckermann P.G. // Biochim. Biophys. Acta.- 1983.- V.732, No 2,-P. 193-203

121. Polcic P. Fatty acids induced uncoupling of Saccharomyces cerevvisiae mitochondria requires an intact ADP/ATP carrier / Polcic P., Sabova L., Kolarov J. // FEBS Lett.- 1997.- V.412.- P.207-210

122. Ricquier D. The uncoupling protein homologues: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP / Ricquier D. and Bouillaud F. // Biochem. J.-2000.- V.345.- P.161-179

123. Rigobello M.P. Inhibition of rat liver mitochondrial permeability transition by respiratory substrates / Rigobello M.P., Turcato F., Bindoli A. // Arch. Biochem. Biophys.- 1995.- V.319.- P.225-230

124. Rolfe D.E. The physiological significance of mitochondrial proton leak in animal cells and tissues / Rolfe D.E. and Brand M.D. // Biosci. Rep.-1997.- V.17.- P.9-16

125. Romaschin A.D. Subcellular distribution of peroxidized lipids in myocardial reperfusion injuiy / Romaschin A.D., Wilson G.J., Thomas U., Feitler D.A., Tumiati L., Mickle D.A. // Am. J. Physiol.- 1990.- V.259.-P.H116-H123

126. Samartsev V.N. The pH-dependens reciprocal changes in contribution of ADP/ATP antiporter and aspartate/glutamate antiporter to the fatty acid-induced uncoupling / Samartsev V.N., Mokhova E.N., Skulachev V.P. // FEBS Lett.- 1997c.- V.412.- P.179-182

127. Schwenke W.D. Mitochondrial and cytosolic ATP/ADP rations in rat liver in vivo. / Schwenke W.D., Soboll S., Seitz H.J., Sies H. // Biochem. J.-1981.- V.200, No 2.- P.405-408

128. Scorrano L. Arachidonic acid causes cell death through the mitochondria permeability transition / Scorrano L., Penzo D., Petronilli V., Pagano F., Bernardi P. // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276, No 15.- P. 1203512040

129. Sharpe M.A. Transport of K+ and cations across phospholipid membranes by nonesterified fatty acids / Sharpe M.A., Cooper C.E., Wrigglesworth J.M. //J. Membr. Biol.- 1994.- V.141.- P.21-28

130. Shigenaga M.K. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging / Shigenaga M.K., Hagen T.M., Ames B.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.- V.91.- P.10771-10778

131. Shinohara Ya. Inhibitory effect of Mg on the protonophoric activity of palmitic acid / Shinohara Ya., Unami A., Teshima M., Nishida E.L., van Dam K., Terada H. // Biochim. Biophis. Acta.- 1995.- V.1228.- P.229-234

132. Sies H. Glutathione conjugation: mechanisms and biological significance / Sies H., Ketterer B. // Acad. Press.- 1988.- P.480

133. Siess E.A. Control of pyruvate carboxylase activity by the pyridine-nucleotide redox state in mitochondria from rat liver / Siess E.A., Banik E., Neugebauer S. // Eur. J. Biochem.- 1988.- V.173.- P.369-374

134. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation // FEBS Lett.- 1991- V.294.-P.158-162

135. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidants in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants // Quart. Rev. Biophys.- 1996.- V.29.- P. 169-202

136. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochim. Biophys. Acta.- 1998.- V.1363, № 2.- P.100-124

137. Skulachev V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms // Mol. Asp. Med.-1999.- V.20.- P. 139-184

138. Skulachev V.P. The programmed death phenomena, aging, and the Samurai law of biology // Exp. Gerontology.- 2001.- V.36.- P.995-1024

139. Skulachev V.P. Programmed death phenomena: from organelle to organism // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 2002.- V. 959.- P.214-237

140. Skulachev V.P. How to clean the dirtiest place in the cell: cationic antioxidants as intramitochondrial ROS scavengers // IUBMB Life.- 2005.-V.57(4/5).- P.305-310

141. Skulachev V.P. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis // Apoptosis.- 2006.- V.l 1,- P.473-485

142. Slater T.F. Free-radical mechanisms in tissue injury // Biochem. J.-1984.- V.222.- P. 1-15

143. Slyshenkov V.S. Protective role of L-methionine against free radical damage of rat brain synaptosomes / Slyshenkov V.S., Shevalye A.A., Liopo A.V., Wojtczak L. // Acta Biochim. Pol.- 2002.- V.49.- P.907-916

144. Sokol R.J. Effect of dietary lipid and vitamin E on mitochondrial lipid peroxidation and hepatic injury in the bile duct-ligated rat / Sokol R.J., Devereaux M., Khandwala R.A. //J. Lipid. Res.- 1991.- V.32.- P.1349-1357

145. Sparagna G.C. A metabolic role for mitochondria in palmitate-induced cardiac myocyte apoptosis / Sparagna G.C., Hickson-Bick D.L., Buja L.M., McMillin J.B. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.- 2000,- V.279.-P.H2124-H2132

146. Stuart J.A. Mitochondrial proton leak and the uncoupling protein 1 homologues / Stuart J.A., Cadenas S., Jekabson M.B., Roussel D. and Brand M.D. // Biochim. Biophys. Acta.- 2001.- V.1504.- P. 144-158

147. Stubbs M. Inhibitors of the adenine nucleotides translocase // Pharm. And Ther.- 1979.- V.l.- P.329-349

148. Sultan A. Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane / Sultan A. and Sokolove P.M. // Arch. Biochem. Biophys.- 2001a.- V.386.- P.37-51

149. Sultan A. Free fatty acids effects on mitochondrial permeability: an overview / Sultan A. and Sokolove P.M. // Arch. Biochem. Biophys.-2001b.- V.386.- P.52-61

150. Tager J.M. / Tager J.M., Wanders R.J.A., Groen A.K., Kunz W., Bohnensack R., Küster U., Letko G., Böhme G., Duszynski J., Wojtczak L. // FEBS Lett.- 1983.- V.151,No 1.- P.l-9

151. Tummino P.J. A comparative study of succinate-supported respiration and ATP/ADP translocation in liver mitochondria from adult and old rats / Tummino P.J., and Gafni A. //Mech. Ageing Dev.- 1991,- V.59.- P. 177-188

152. Van Iwaarden P.R. What we can learn from the effects of thiol reagents on transport proteins / Van Iwaarden P.R., Driessen A.J.M., Konings W.N. // Biochim. Biophys. Acta.- 1992.- V.l 113.- P. 161-170

153. Veech R.L. Cytosolic phosphorilation potential. / Veech R.L., Lawson J.W.R., Cornell N.W., Krebs H.A. // J. Biol. Chem.- 1979.- V.254, No 14.-P.6538-6547

154. Vercesi A.E. PUMPing plants / Vercesi A.E., Martins I.S., Silva M.A.P., Leite H.M.F., Cuccovia I.M. and Chaimovich H. // Nature (London).- 1995.- V.375.- P.24

155. Walker J.E. The mitochondrial transport protein superfamily / Walker J.E., and RunswickM.J. //J. Bioenerg. Biomembr.- 1993.- V.25.- P.435-446

156. Wilson D.F. / Wilson D.F., Erecinska M., Drawn C., Silver I.A. // Arch. Biochim. Biophys.- 1979.- V.195, No 2.- P.485-493

157. Wojtczak L. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria / Wojtczak L., Schönfeld P. // Biochim. Biophys. Acta.- 1993,-V.1183.- P.41-57

158. Wojtczak L. The mechanisms of fatty acid-induced proton permeability of the inner mitochondrial membrane / Wojtczak L. and Wieckowski M.R. // J. Bioenerg. Biomembr.- 1999.- V.31.- P.447-455

159. Zoratti M. The mitochondrial permeability transition / Zoratti M., Szabo I. //Biochim. Biophys. Acta.- 1995.- V. 1241, № 2,- P. 139-176

160. Zoratti M. Mitochondrial permeability transition: how many doors to the house? / Zoratti M., Szabo I., De Marchi U. // Biochim. Biophys. Acta.-2005.- V.1706.- P.40-52

161. Zorov D.B. Voltage activation of heart inner mitochondrial membrane channels / Zorov D.B., Kinnally K.W., Tedesci H. // J. Bioenerg. Biomembr.- 1992.- V.24.- P. 119-124