Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптационные изменения изоморфного состава и функциональных свойств миозина и миозин-содержащих нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Адаптационные изменения изоморфного состава и функциональных свойств миозина и миозин-содержащих нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов"

На правах рукописи

УДК 577.353.22: 591.175: 591.525

и :.....! >;-;:./

ЛУКОЯНОВА Наталья Александровна

АДАПТАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ МИОЗИНА И МИОЗИН-СОДЕРЖАЩИХ НИТЕЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1997

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций мышечных белков Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, З.А. Подлубная

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Э.А. Рапопорт

кандидат биологических наук И.Г. Штранкфельд

Ведущая организация - НИИ Биологии, Дагестанский государственный университет

Защита состоится "23" йпреь А 1997 г. в 15 час. на заседании Диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292, г. Пущино, Московской обл., ИТЭБ РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан "¿4« 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совет

кандидат биологических наук /I / ^ П.А. Нелипович

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зимняя спячка млекопитающих (гибер-нация) - эволюционно закрепленная способность теплокровных животных адаптироваться к неблагоприятным условиям за счет снижения активности всех физиологических систем организма при сохранении контроля за согласованностью их деятельности. У истинных зимоспящих спячка продолжается 5-8 месяцев и состоит из циклов (баутов) продолжительностью до 30 дней, за которыми следуют кратковременные пробуждения на период от нескольких часов до суток. Во время баута температура тела животного снижается до 2-4°С, частота сердцебиения -до 4-20 уд/мин, уровень окислительного метаболизма уменьшается более чем в сто раз, резко снижается частота дыхательных движений. При пробуждении животного переход от почти полного угнетения всех физиологических систем организма, включая мышечную, к их нормальной функциональной активности совершается очень быстро - за 3-5 часов без каких-либо патологических последствий. В частности, длительное пребывание в обездвиженном состоянии не приводит к необратимым нарушениям в сократительной способности скелетных мышц. Поэтому есть основания ожидать, что в скелетных мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные перестройки, которые вносят вклад в смену физиологического состояния животных. Эти изменения могут касаться состава, структуры и функциональных свойств сократительных нитей и составляющих их белков.

Считается, что возникновение и поддержание гипометаболи-ческих состояний у млекопитающих контролируются нейро-гумораль-ной системой и сопровождаются адаптационными перестройками на разных уровнях организации. Однако механизмы, позволяющие зимоспящим переживать широкие колебания интенсивности процессов жизнедеятельности, в целом остаются не раскрытыми, несмотря на многочисленные исследования. При изучении вклада разных физиологических систем млекопитающих в гибернацию до сих пор не уделялось должного внимания сократительному аппарату мышц и его отдельным белкам, хотя скелетные мышцы составляют значительную часть массы тела животных и занимают одно из первых мест среди органов, вносящих вклад в термогенез зимоспящих. Исследования скелетных мышц зимоспящих касались, в основном, метаболических систем - гликолиза и окислительного метаболизма, а также мембранных процессов, в частности, функционирования саркоплазматического ретикулума. С другой стороны, анализ большого количества работ, посвященных полиморфизму сократительных белков скелетных и

сердечных мышц и смене их изоформ, связанной с адаптационными перестройками у незимоспящих животных, дает основание ожидать подобные изменения в скелетных мышцах зимоспящих. По всей вероятности, изменения в изоформном составе сократительных белков будут приводить к изменению структурных и функциональных свойств формируемых ими нитей, что может вносить вклад б смену физиологического состояния животных во время зимней спячки.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению адаптационных изменений изоформного состава и функциональных свойств миозина и миозин-содержащих нитей скелетных мышц во время зимней спячки и при выходе из нее. Работа включает решение следующих конкретных задач:

1. Изучение сезонных изменений изоформного состава миозина скелетных мышц зимоспящих сусликов.

2. Исследование влияния изменений изоформного состава легких и тяжелых цепей миозина на его основные функции во время зимней спячки и при пробуждении:

- структурную (формирование миозиновых нитей);

- ферментативную (актин-активируемая АТФазная активность);

- регуляторную (Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы);

- координирующую (взаимодействие с некоторыми ферментами энергетических систем).

Научная новизна работы. В настоящей работе проведено исследование обратимых адаптационных изменений, происходящих на субмолекулярном уровне в миозине, основном белке исполнительного аппарата скелетных мышц, во время зимней спячки и при выходе из нее. Впервые обнаружено, что значительные обратимые перестройки в изоформном составе тяжелых и легких цепей миозина при гибернации приводят к изменению функциональных свойств формируемых им нитей. Показано, что изоформы миозина, характерные для скелетных мышц животных во время зимней спячки, обладают сниженными АТФазной активностью и Са2+-чувствительностью, что, вероятно, вносит вклад в ингибирование двигательной способности скелетных мышц в этот период. Определены количественные параметры связывания ключевого фермента гликолиза фосфофруктокиназы (ФФК) с нитями миозина скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях. Показано, что способность связывать и тем самым активировать ФФК снижена для изоформ миозина спящих сусликов по сравнению с таковыми активных животных, что, по-видимому, способствует как ингибированию гликолиза при гибернации, так и подавлению

сократительной активности скелетных мышц в этот период. С другой стороны, впервые показано, что при пробуждении происходит быстрое восстановление изоформного состава и функциональных свойств миозина, характерных для активных животных.

Обнаруженные адаптационные изменения функциональных свойств миозин-содержащих нитей дают основание считать, что изменения в изоформном составе основного сократительного белка -миозина способствуют обездвиживанию скелетных мышц во время зимней спячки и восстановлению их двигательной функции при пробуждении, и что скелетные мышцы, наряду с другими физиологическими системами, вносят вклад в смену физиологического состояния животных в этот период.

Научное и практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют представления о молекулярных механизмах возникновения и поддержания природных гипометаболических состояний у млекопитающих и свидетельствуют о существенной роли миозина и миозин-содержащих нитей в этих процессах. Полученные данные способствуют лучшему пониманию значения адаптационных перестроек на молекулярном уровне в скелетных мышцах в ответ на воздействие неблагоприятных условий. Обнаружение изменений АТФазной активности и ее Са2+-чувствительности разных изоформ миозина является доказательством значения его легких цепей в регуляции сокращения, свидетельствуя в пользу существования Са2+-контроля миозинового типа в скелетных мышцах наряду с актиновой регуляцией. Представленные результаты по изменению способности разных изоформ миозина связывать ФФК существенны для понимания механизмов взаимной регуляции и согласованного функционирования сократительной, и энергетической систем мышцы.

Полученные данные об адаптационных перестройках структуры и свойств миозин-содержащих нитей открывают перспективы для дальнейшего изучения изменений в других белках сократительного аппарата скелетных мышц, происходящих во время гибернации, в частности, в актине, белках-регуляторах мышечного сокращения и белках внутрисаркомерного цитоскелета. Кроме того, полученные ре-зультаты являются основой исследований адаптационных изменений в сердечной мышце при зимней спячке. Обнаруженные обратимые изме-нения свойств миозиновых нитей во время гибернации и при пробуж-дении сходны с патологическими нарушениями в сократительных нитях при старении и дистрофиях скелетных мышц, а также при некоторых кардиомиопатиях. Дальнейшее изучение вклада сократительного аппара-

та скелетных и сердечных мышц в сезонные смены физиологического состояния зимоспящих может пролить свет на механизмы перехода от адаптационных изменений в мышцах в ответ на неблагоприятные воздействия к патологическим изменениям при миопатиях.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), 6-ой Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н. Белозерского" (Москва, 1995), 40-ом Съезде Американского Биофизического общества (Балтимор, США, 1996), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 96" (Москва, 1996), Научной конференции молодых ученых г. Пущино (Пущино, 1996), конференции "Актуальные проблемы терморегуляции и тепломассопереноса кровью" (Санкт-Петербург, 1996), 12-ом Всемирном биофизическом конгрессе (Амстердам, Нидерланды, 1996), 1-ом конгрессе всемирного мышечного общества (Лондон, Великобритания, 1996), Международном симпозиуме "Физико-химические основы организации и функционирования биологических систем" (Тбилиси, Республика Грузия, 1996), 25-м Европейском мышечном конгрессе (Монпелье, Франция, 1996), Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, включает I1* рисунков и к таблицы;

состоит из введения, описания материалов и методов исследования, обзора литературных данных перед каждой главой результатов, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 14*3 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах были использованы длиннохвостые суслики Citellus undulatus, отловленные летом в Якутии и содержащиеся в условиях вивария в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде; обеспечение пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Опыты проводили на группах спящих (ректальная температура 1-4°С), пробуждающихся (15-30°С, время пробуждения 2-4 часа), летних и зимних активных (37°С) сусликов.

В результате сравнительного изучения миозинов скелетных мышц сусликов, выделенных различными способами, была разработана методика выделения этого белка, основанная на дробном высаливании согласно работе Offer et al. (1973).

Чистоту и изоформный состав препаратов миозина тестировали ДСН-электрофорезом в полиакриламидном геле (Laemmli, 1970), а также электрофорезом в 8М мочевине (Perrie & Perry, 1970).

Эксперименты по изучению свойств миозит проводили при ионной силе 0.12, т. е. в условиях, когда миозин формирует нити, обычно называемые реконструированными.

Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100B при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении ЗООООх. Миозиновые нити были сформированы диализом в течение 20 час при температуре 4°С против раствора, содержащего 0.12 M КС1, 0.01 M КН2Р04, рН 7.0 либо 0.12 M КС1, 0.01 M имидазол-HCl, рН 7.0. Суспензию нитей с концентрацией белка 0.1 мг/мл наносили на медные сеточки, покрытые коллодиевой пленкой, укрепленной углеродом, и окрашивали 1% водным раствором уранилацетата.

Растворимость миозина определяли при рН 7.0 в диапазоне ионных сил 0.1-0.35. Объем пробы составлял 2 мл, концентрация миозина 0.4 мг/мл. Образцы инкубировали в течение 4-х часов при 4°С и центрифугировали 1 час при 20000g. Растворимость белка определяли как количество оставшегося в супернатанте белка (в %) по отношению к его исходному содержанию.

АТФазную активность реконструированных актомиозиновых систем измеряли по выходу неорганического фосфата (Taussky & Shorr, 1952; Подлубная и др., 1996). Са24~-чувствительность изученных препаратов миозина определяли как изменение (в %) актин-активируемой АТФ-азной активности при увеличении концентрации Са2+ от рСа 7.5 до рСа 4.6. Реакцию проводили при 25°С. Для реконструкции актомиозина использовали актин, выделенный из скелетных мышц кролика согласно методике, описанной в работе (Spudich & Watt, 1971).

Определение количественных параметров связывания фосфофруктокиназы с миозиновыми нитями проводили методом седиментации (Фрейдина и др., 1986) с предварительной инкубацией образцов перед центрифугированием в течение 1 часа при 4'С. В экспериментах по связыванию использовали фосфофруктокиназу, выделенную из скелетных мышц кролика согласно методике, описанной в работе (Offer et al., 1973).

Концентрацию белков определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции (E2S0>W".i) 0.54 для миозина (Godfrey & Harrington, 1970), 1.09 для актина (Rees & Young, 1967) и 1.00 для фосфофруктокиназы (Фрейдина и др., 1986).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили на персональном компьютере с использованием программы "Excel 7.0". Достоверность различий экспериментальных данных оценивали, используя критерий Сгьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение сезонных изменений изоформного состава миозина скелетных мышц зимоспяших сусликов. Молекула миозина состоит из двух тяжелых цепей, образующих стержневую часть и две головки. Стержневые части упаковываются в стволе миозиновой нити, а головки располагаются на поверхности и при сокращении взаимодействуют с нитями актина. В области головок локализованы легкие цепи миозина (ЛЦ): т.н. щелочные - ЛЦ1 и ЛЦЗ и регуляторные - ЛЦ2, по одной цепи каждого типа на головке. Известно, что миозины быстрых и медленных скелетных мышц отличаются по изоформному составу тяжелых и легких цепей. При сравнительном электрофоретическом изучении миозинов, полученных из скелетных мышц сусликов в разных состояниях (спячка, пробуждение, зимняя и летняя активность), были обнаружены значительные изменения соотношения "быстрых" и "медленных" тяжелых и легких цепей. Денситометрирование ДСН-эдекгрофоретических гелей показало, что в миозине спящих сусликов (Мсп) по сравнению с миозинами активных зимних (Мзим) и летних

Таблица 1. Весовое соотношение изоформ тяжелых цепей в препаратах миозина, выделенных из скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях._

Мсп мпр Мзим

(п=8) (п=7) (п=6)

II А / II X 88.45 ± 3.95 94.98 ±4.71 90.43 ± 6.99

II В 44.54 ± 3.08 54.75 ± 10.79 * 81.96 + 10.60***

I 77.31 ± 3.46 84.23 ± 10.38 83.08 ± 5.39

Достоверность различий оценивали по сравнению с группой спящих животных: * - Р<0.05, *** - Р<0.001.

Таблица 2. Молярное соотношение легких цепей в препаратах миозина, выделенных из скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях.

Мсп Мпр Мзим Млст

п=21 п=14 п=17 п=9

ЛЦ1 1.048+0.039 0.961+0.053 0.95б±0.074 1.096+0.113

ЛЦ2 2.126+0.205 2.104Ю.198 2.043±0.122 1.986Ю.175

ЛЦЗ 0.315+0.017 5.528+0.069*** 0.911±0.063*** 0.943±0.102***

Достоверность различий оценивали по сравнению с группой спящих животных: *** - Р<0.001.

Экспериментальные данные обрабатывали с учетом следующих значений молекулярной массы легких цепей:

20.950 для ЛЦ1 (СагсЗшаис! е1 а1., 1995) 19.000 для ЛЦ2 (Ьо\уеу е1 а1., 1986) 16.500 для ЛЦЗ (Ьо\уеу ^ а1., 1986)

(Млет) животных значительно (на 50%) снижается количество одной из изоформ тяжелых цепей миозина (т. н., 2В), характерной для быстрых мышечных волокон (табл. 1). Кроме того, в изученных препаратах существенно изменяется соотношение легких цепей (табл. 2): содержание ЛЦЗ в Мсп уменьшается примерно до 35% по сравнению с Мзим и Млет. Однако количество ЛЦЗ увеличивается почти в два раза уже за первые 1.5-2 часа пробуждения и составляет в миозине пробуждающихся животных (Мпр) 55-60% от количества этих цепей в Мзии и Млет. Содержание 2В тяжелых цепей также увеличивается при пробуждении. Если учесть факт отсутствия ЛЦЗ в миозинах медленных скелетных мышц (8\уу^1гес1а1ш, 1986; Бугоуу, 1987), полученные данные по уменьшению количества "быстрых" изоформ тяжелых и легких цепей миозина при зимней спячке указывают на возможность трансформации быстрых скелетных мышц в "медленные" при гибернации. Обнаруженные изменения изоформного состава миозина согласуются с результатами сравнительных исследований механических характеристик одиночных волокон скелетных мышц у спящих и активных сусликов (Хромов и др., 1987; Иозс^йУепБкауа е1 а!., 1994), свидетельствующих о более медленном режиме работы мышечных волокон, изолированных из скелетных мышц сусликов во время гибернации. Полученные результаты

согласуются с данными о преимущественой атрофии быстрых мышечных волокон при гибернации (Wickler, 1991; Steffen et al., 1991).

С помощью электрофореза в 8М мочевине было также обнаружено, что около трети изученных препаратов Мсп содержали частично (до 50%) фосфорилированные легкие цепи 2 (ЛЦ2), тогда как остальные миозиновые препараты (Мпр, Мзим, Млет) не были фосфорилировапы.

Следует заметить, что восстановление состава тяжелых, а также состава и состояния легких цепей миозина, характерных для активных животных, по нашим наблюдениям происходит интенсивно уже в течение первых часов пробуждения. Времена, за которые изоформный состав миозина столь существенно изменяется, кажутся на первый взгляд небольшими, однако они реальны в свете данных о гиперактивации синтеза белка в разных тканях сусликов в конце каждого баута спячки и в период пробуждения (Bocharova et al., 1992; Zhegunov et al., 1992).

Известно, что мышечная система выполняет не только сократительную функцию, но и участвует в поддержании гомеостаза и азотистом обмене. Поскольку продукты катаболизма белков составляют в норме 20-25% субстратов глюконеогенеза, предполагается, что при гибернации и особенно во время периодических пробуждений процессы глюконеогенеза в печени происходят именно за счет продуктов деградации белков, и в первую очередь, сократительных белков скелетных мышц (Galster et al., 1975; Reidesel et al., 1980; Yacoe, 1983; Wang, 1989). Известно, что быстрые мышечные волокна наиболее чувствительны к изменению нейротрофического контроля и в значительной степени атрофируются при денервации мышцы или стимуляции с низкой частотой (Buchegger et al., 1984; Bacou et al., 1996). По-видимому, подобным образом быстрые волокна атрофируются во время зимней спячки, когда отключена система нервной стимуляции скелетных мышц, а процессы биосинтеза белка заингибированы низкой температурой или другими пока неизвестными факторами (Жегунов и др., 1993). Результатом такого преимущественного катаболизма сократительных белков быстрых мышечных волокон являются обнаруженные нами изменения в изоформном составе миозина скелетных мышц.

Для выяснения вопроса, вносят ли изменения изоформного состава миозина скелетных мышц сусликов вклад в смену физиологического состояния животных при зимней спячке и выходе из нее, мы изучили, как обнаруженные изменения влияют на основные функциональные свойства миозина: структурные, ферментативные и регуляторные. Результаты этих исследований изложены в следующих разделах настоящей работы.

Изучение структуры реконструированных нитей миозина скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях. При электронно-микроскопическом изучении миозинов скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях (Мсп, Мпр, Мзим и Млет)

не было обнаружено различий в структуре формируемых ими нитей. Все тестированные препараты образуют in vitro упорядоченные нити нормальной длины (1 мкм и более) с регулярным (период 14.3 нм) расположением головок на их поверхности, соответствующим осевой периодичности нативных миозин-содержащих нитей. Необходимо отметить, однако, что отдельные препараты миозина, полученные из скелетных мышц сусликов в начальный период пробуждения (Мнач, ректальная температура 8-12"С, время пробуждения - до 1.5 часов) образуют короткие (-0.5 мкм) неупорядоченные нити с хаотическим расположением кластеров миозиновых головок, чередующихся вдоль нити с разными по длине участками т.н. "голых зон" (зон, лишенных головок). Кроме того, реконструированные нити Мнач обладают меньшей стабильностью по сравнению с другими изученными миозинами: как видно из рис. 1, растворимости Мсп, Мпр, Мзим, и Млет в области ионных сил 0.1-0.35 при рН 7.0 существенно не отличаются, тогда как Миач имеет наибольшую растворимость по сравнению с другими миозинами во всем исследованном диапазоне ионных сил. На основании имеющихся у нас данных не представляется возможным объяснить этот феномен. Возможно, нам удалось обнаружить некую стадию пробуждения, когда количественные и качественные изменения в миозине приводят к временному нарушению его способности формировать упорядоченные нити. Следует указать на сходство структуры нитей Мнач с организацией миозин-содержащих нитей при некоторых кардиомиопатиях, сопровождающихся потерей части легких цепей миозина (Margossian et al., 1983; Margossian et al., 1987; Chowrashi et al., 1989). Выяснение этого

вопроса должно быть предметом специальных исследований, поскольку такие временные структурные и/или

функциональные изменения нитей миозина в начальный период пробуждения могут оказаться хорошей природной моделью для изучения патологических нарушений в сократительных нитях при некоторых мышечных

дисфункциях.

Таким образом,

различия в изоформном составе

Рис 1. Зависимость растворимости (%) препаратов Мсп, Мзим, Млет и миозинов скелетных мышц сусликов в большинстве препаратов Мпр не разных состояниях от ионной силы (ц) сказываются заметно на

структуре их реконструированных нитей. Однако можно полагать, что обнаруженное значительное уменьшение количества "быстрых" изоформ в препаратах Мсп и Мпр по сравнению с Мзнм и Млет будет оказывать влияние на ферментативные и регуляторные свойства этого основного сократительного белка. Результаты проверки сделанного предположения описаны в следующем разделе.

Влияние сезонных изменений изоформного. состава миозина скелетных мышц сусликов на его ферментативные и регуляторные свойства. Нами обнаружено уменьшение актин-активируемой АТФазной активности Мсп до 40% (табл. 3) по сравнению с Мзим и Млет. Однако для препаратов Мпр величина актин-активируемой АТФазы существенно возрастает и составляет уже 80% по сравнению с таковой для Мзим и Млет. Использование актина, выделенного из скелетных мышц кролика, для реконструкции актомиозина позволило сделать заключение, что обнаруженное снижение АТФазной активности Мсп и Мпр по сравнению с Мзим и Млет является следствием описанных выше изменений их изоформного состава.

Принято считать, что в скелетных мышцах позвоночных Са2+-регуляция актин-миозинового взаимодействия при сокращении осуществляется регуляторным комплексом (тропонином и тропомиозином), расположенным на актиновых нитях

Таблица 3. Акгин-активируемая АТФазная активность и Са2+-чувствительность миозинов, выделенных из скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях.

Препараты миозина АТФазная активность, мкмоль Рн/ (мг белка - мин) Са2+- чувствительность %

рСа=4.6 рСа=7.5

Мсп п=8 0.040 ± 0.006 0.031 ± 0.005 26.7 ± 1.4

Мпр п=7 0.079 + 0.004*** 0.064 ± 0.012*** 25.4 + 6.0

М3им п=6 0.100 ± 0.006*** 0.061 ± 0.007*** 60.3 ± 5.4***

Млет П=6 0.105 ± 0.009*** 0.064 ± 0.005*** 64.5+1.19***

Достоверность различий оценивали по сравнению с группой спящих животных: *** - Р<0.001.

(Ebashi et al., 1969; Szent- Gyotgyi, 1975). С другой стороны, многочисленные исследования последних лет свидетельствуют о роли легких цепей миозина в этом процессе (Freydina et al., 1986; Margossian et al., 1993; Lowey, Trybus, 1995; Stepkowski, 1995; Подлубная и др., 1996).

Иначе говоря, накопленные данные указывают на существование в скелетных мышцах регуляции миозинового типа наряду с актиновой регуляцией (Morimoto & Harrington, 1974; Haselgrove, 1975; Lehman, 1978). Поэтому подавление двигательной способности аппарата скелетных мышц при зимней спячке, возможно, является следствием сниженной АТФазной и/или регуляторной способности характерных для этого периода изоформ миозина.

Действительно, нами показано, что Са2+-чувствительность актин-акгивируемой АТФазы снижена в препаратах Мсп и Мпр и составляет в среднем 26% (табл. 3), тогда как Са2+-чувствительность препаратов Мзим и Млст составляет 60%. До недавнего времени считалось, что Са2+-чувствительность АТФазы актомиозина, в отсутствие на актиновых нитях тропонин-тропомиозинового комплекса, определяется ЛЦ2 миозиновой молекулы (Morimoto & Harrington, 1974; Lehman, 1978; Chin & Rowe, 1982; Pulliam et al., 1983; Freydina et al., 1986; Margossian et al., 1987). Хотя нами не было обнаружено изменений в количестве ЛЦ2 миозина спящих сусликов (Лукоянова и др., 1996), учитывая данные последних лет о значении ЛЦ1 и ЛЦЗ для актин-миозинового взаимодействия, генерации силы и регуляции сокращения (Lowey et al, 1993; Margossian et al., 1993; Trybus, 1994; Lowey & Trybus, 1995; Podlubnaya et al., 1995) и наши данные об уменьшении содержания ЛЦЗ во время спячки (Лукоянова и др., 1996), можно полагать, что обнаруженные изменения Са2+-чувствительности АТФазы обусловлены изменением соотношения легких цепей в миозиновой молекуле.

Таким образом, наши данные убедительно свидетельствуют о том, что, наряду с подавлением систем нервной стимуляции, пониженные актин-активируемая АТФазная активность и Са2+-чувствительность изоформ миозина при зимней спячке являются дополнительными адаптационными факторами более надежного ингибирования двигательной способности скелетных мышц в этот период.

Недавно в сердечной мышце животных при гибернации также были обнаружены новые изоформы тяжелых цепей миозина. Они отличались от изоформ миозина активных животных не только по АТФазной активности, но и по ее зависимости от температуры (Могапо et al., 1992). Более высокая АТФазная активность изоформы миозина

сердца спящих животных обладала и большей чувствительностью к температуре. Высказано предположение, что последнее имеет значение для быстрого выхода животного из спячки. Нами показано, что, в отличие от изоформ миозина сердца, АТФазная активность миозинов скелетных мышц спящего, пробуждающегося и активного сусликов обнаруживает одинаковую зависимость от температуры в диапазоне от 25 "С до 10"С, уменьшаясь в среднем на 60-65% (рис. 2). При этом сохраняется исходная разница в уровнях АТФазной активности Мсп, Мпр и Мзим во всем интервале температур, как и разница в Са2+-чувствительности АТФаз вплоть до 10"С, когда Са2+-чувствительность всех миозинов практически исчезает. Расхождение литературных данных для миозинов сердца и полученных нами результатов сравнительного исследования температурной зависимости АТФазных свойств скелетно-мышечных миозинов спящих, пробуждающихся и активных животных обусловлено, скорее всего, отличиями в режиме функционирования сердечной и скелетных мышц во время зимней спячки. Тогда как для сердца необходимо сохранение некоторого уровня сократительной активности в спячке (4-20 ударов/мин) и ее быстрое увеличение при пробуждении (280-310 ударов/мин), в скелетной мышце при гибернации,

АТФазная активность мкмоль Рн/

напротив, имеет место полное ингибирование двигательной активности и не требуется

15

25 уменьшении температуры

С отражает реальное состояние актомиозиновой системы в скелетной мышце при гибернации, когда температура тела животного снижается до 1-4°С. Известно, что центральная нервная система зимоспящих животных, по сравнению с незимоспя-

такое быстрое ее

восстановление при выходе из спячки. Следовательно, можно полагать, что низкая АТФазная активность и

такое

отсутствие

чувствительности актомиозина спящего суслика при

активность и

Са2+-

ее

МактМакгМпрМпрМспМсп 10

рСа рСа рСа рСа рСа рСа

4.6 7.5 4.6 7.5 4.6 7.5 Рис. 2. Температурная зависимость актин-активируемой АТФазы миозинов скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях

щими, более устойчива к низким температурам (Попова, 1979): в некоторых работах отмечается сохранение нервной проводимости у гибернирующих вплоть до 3-4°С (Chatfield, 1948). По-видимому, в этих условиях пониженные АТФазная активность и Са2+-чувствительность изоформ миозина при зимней спячке, а также дополнительное снижение АТФазы и полное подавление Са2+-чувствительности в условиях гибернации являются дополнительными адаптационными факторами надежного ингибирования двигательной способности скелетных мышц в этот период наряду с подавлением систем нервной стимуляции.

Влияние сезонных изменений изоформного состава миозина скелетных мышц сусликов на его способность взаимодействовать с фосфофруктокиназой (ФФК). Известно, что в состав миозин-содержащих нитей скелетных мышц, помимо миозина, входят и другие функционально важные белки, в том числе ферменты энергетических систем: креатинкиназа, дезаминаза и фосфофруктокиназа (Подлубная, 1992). Предполагается, что миозин-содержащие нити, наряду с актиновыми, координируют функционирование некоторых систем энергетического метаболизма в мышце, регулируя активности их ключевых ферментов посредством обратимого связывания последних с сократительными нитями. Поскольку связывание приводит не только к активации этих ферментов, но и но обеспечивает и увеличение скорости доставки АТФ к АТФ-гидролизующим центрам миозина во время сокращения, и синхронный запуск сократительной и энергетических систем мышцы, и их согласованное функционирование (Подлубная, 1992), то нарушения в этом связывании могут приводить к подавлению двигательной способности.

Для выявления возможных нарушений способности миозинов с разным изоформным составом связывать ферменты энергетического метаболизма мы изучили параметры связывания ключевого фермента гликолиза - ФФК. Поскольку имеются данные об идентичности свойств этого фермента, выделенного из скелетных мышц зимоспящих и незимоспящих животных (El Hashimi, 1992), в экспериментах по связыванию использовали ФФК, выделенную из скелетных мышц кролика. Это позволило нам исключить влияние возможных сезонных изменений в самой ФФК при гибернации на взаимодействие с миозиновыми нитями. Показано, что константы связывания практически одинаковы для всех изученных миозинов (табл. 4). Однако количество участков связывания ФФК на нитях Мсп и Мпр меньше, чем на нитях Мзим, соответственно, в 2.0 и 1.7 раза. Эти результаты согласуются с данными по ингибированию гликолиза в скелетных мышцах животных во

Таблица 4. Параметры связывания ФФК с миозинами, выделенными из скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях.

Препараты миозина is ка т "н

мсп п=8 5.72 ± 0.08 1.17 ±+ 0.21 2.57 ± 1.19

мпр п=6 5.85 ± 0.07 1.50 ± 0.15** 3.55 ± 1.83

М3им п=9 5.72 ± 0.10 2.57 ± 0.41** 2.08 ± 0.61

Эспериментальные данные аппроксимировали по схеме нелинейной регрессии, используя следующую формулу: r=m (KaC)nH/[ 1+(КаС)пн] , где С - концентрация свободной ФФК;

г - число молей ФФК (в расчете на мономер с Мг=80000), связанной

с 1 молем миозина; Ка - константа ассоциации, ш - количество участков связывания; пн - коэффициент Хилла. Достоверность различий оценивали по сравнению с группой спящих животных: ** - Р<0.01; *** - PcO.OOl.

время зимней спячки (El Hashimi, 1992). Поскольку связывание с сократительными нитями активирует ФФК (Clarke et al., 1985), уменьшение количества связанного фермента будет приводить к уменьшению его общей активности в клетке, к снижению интенсивности гликолиза и к ингибированию сократительной способности скелетных мышц при гибернации.

Таким образом, обнаруженные изменения в изоформном составе миозина скелетных мышц сусликов во время зимней спячки приводят к значительному снижению его функциональной активности: ингибированию его АТФазных и регуляторных свойств, а также уменьшению способности взаимодействовать с ключевым ферментом гликолиза. По-видимому, обнаруженные изменения структуры и свойств основного сократительного белка - миозина, наряду с подавлением систем нервной стимуляции и энергетического метаболизма во время зимней спячки, вносят вклад в ингибирование двигательной способности скелетных мышц в этот период.

выводы

В работе получены новые данные об изменении состава и

функциональных свойств основного сократительного белка - миозина во

время зимней спячки и при выходе из нее.

1. С помощью различных методов электрофореза показано, что препараты миозина, выделенные из скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях значительно отличаются по изоформному составу тяжелых и легких цепей: содержание "быстрых" 2В и ЛЦЗ цепей в препаратах Мсп уменьшается до 50% и 35%, соответственно, по сравнению с препаратами активных животных, и увеличивается при пробуждении до 60% и 55%, соответственно.

2. Получены данные об уменьшении актин-активируемой АТФазной активности изоформ Мсп и Мпр на 60% и 20%, соответственно, по сравнению с АТФазной активностью препаратов Мзим и МЛ(:т.

3. Показано, что что Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы снижена в препаратах Мсп и Мпр и составляет в среднем 26%, тогда как Са2+-чувствительность препаратов миозина активных животных сотавляет 60%.

4. Показано, что, в отличие от изоформ миозина сердца гибернирующих, АТФазная активность миозинов скелетных мышц спящего, пробуждающегося и активного сусликов обнаруживает одинаковую зависимость от температуры в диапазоне от 25"С до 10"С, уменьшаясь в среднем на 60-65%.

5. Обнаружено снижение Са2+-чувствительности миозина при уменьшении температуры in vitro и ее полное исчезновение при 10°С, что, по-видимому, отражает реальное состояние акгомиозиновой системы в скелетной мышце при гибернации, когда температура тела животного снижается до 1-4°С.

6. Получены данные об уменьшении количества участков связывания ФФК на нитях Мсп и Мпр, соответственно, в 2.0 и 1.7 раза по сравнению с таковым для нитей Мзим.

7. Обнаруженные изменения изоформного состава тяжелых и легких цепей миозина скелетных мышц сусликов сопровождаются значительным, но обратимым ингибированием всех функциональных свойств этого основного сократительного белка во время зимней спячки: снижением его АТФазных и регуляторных свойств, а также подавленем его способности взаимодействовать с ферментами системам, поставляющих АТФ для сокращения мышцы. Полученные данные свидетельствуют о значительном вкладе миозина и миозин-

содержащих нитей в ингибирование двигательной способности скелетных мышц во время зимней спячки и в ее восстановление при пробуждении. Они дают основания считать, что скелетные мышцы, наряду с другими физиологическими системами, вносят вклад в смену физиологического состояния животных в этот период.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Shpagina M.D., Ignat'ev D.A., Kolaeva S.G., Podlubnaya Z.A. Properties of skeletal muscle myosin of ground squirrels ( Citellus undulatus) at the different stages of hibernation //Abstr. Intern. Symp. "Biological motility", Pushchino, Russia, 1994, p. 183.

2. N.A. Lukoyanova, S.N. Udaltsov, Z.A. Podlubnaya Influence of the changes in isoenzyme composition of myosin filaments on their interaction with phosphofructokinase //Abstr. 6th Intern. Conf. "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Dec. 18-22, 1995, Moscow, Russia), p.5.

3. S.L. Malyshev, S.N. Udaltsov, Z.I. Vishnevskaya, N.A. Lukoyanova, Z.A. Podlubnaya Study on the correlation between structural behavior of cross-bridges on the surface of myosin filaments and their actin-activated ATPase //Abstr. 6th Intern. Conf. "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Dec. 18-22, 1995, Moscow, Russia), p.6.

4. Лукоянова H.A., Шпагина М.Д., Удальцов C.H., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. Изменения в структурной организации реконструированных нитей миозина из скелетных мышц зимоспящих сусликов Citellus undulatus во время пробуждения //Биофизика, 1996, т.41, с.116.

5. Подлубная З.А., Малышев С.Л., Лукоянова Н.А., Вишневская З.И., Удальцов С.Н., Степковский Д., Конколова И. Корреляция между Са2+-зависимым движением мостиков в миозиновых нитях и Са2+-чувствительностью актин-активируемой АТФазы миозина скелетных мышц //Биофизика, 1996, т.41, с.58.

6. Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. Binding of rabbit skeletal muscle phosphofructokinase to the filaments formed by skeletal muscle myosins from ground squirrel at different stages of hibernation //Biphys. J., 1996, v. 70, N2, P.A162.

7. Malyshev S, Lukoyanova N, Udaltsov S, Podlubnaya Z. Ca2+-sensitivity of skeletal muscle myosin: biochemical and structural evidence //Progress in Biophysics and Molecl Biol., 1996, v.65, Suppl.l, p.174.

8. Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. Structural and functional changes in myosin-containing filaments of skeletal muscles of

hibernating ground squirrels (Citellus undulatus) // Neuromuscular Disorders,

1996, v. 1, p.S63.

9. Podlubnaya Z.A., Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Shpagina M.D. The role of the myosin of ground squirrels skeletal muscles in inhibition of their activity upon hibernation // Abstr. 25th Europ. Muscle Conf., Montpellier, France, 1996, p. 09-23.

10. Подлубная 3.A., Лукоянова H.A., Удальцов C.H., Шпагина М.Д., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г. Роль миозина в ингибировании двигательной активности скелетных мышц сусликов при гибернации // Тезисы конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц", Пущино, 1996, с. 48.

11. Лукоянова Н.А., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. Изучение АТФазных и регулягорных свойств миозина скелетных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки //Биофизика,

1997, т.42, с.67.

12. Лукоянова Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. Сезонные изменения состава, структуры и функциональных свойств миозиновых нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов Citellus undulatus //Физиол. Журнал им. И.М. Сеченова, 1997 (в печати).

Псч. л. 1X5 Тираж /ОО Заказ//^

Типография МЭИ, Красноказарменная, 13.