Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии

Вихлянцев, Иван Милентьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии"

4002448

На правах рукописи

ВИХЛЯНЦЕВ ИВАН МИЛЕНТЬЕВИЧ

ПОЛИМОРФИЗМ ТАЙТИНА ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦ В НОРМЕ, ПРИ АДАПТАЦИИ И ПАТОЛОГИИ

03.01.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино —2011

' 1 СЕН 2011

4852448

Работа выполнена в лаборатории Структуры и функции мышечных белков Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Подлубпая Зоя Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Николай Константинович

доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович

доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН, Екатеринбург.

Защита диссертации состоится " " ¿¿//ю &$><£, 2011 г. ъ/Ъ час^^мин. на заседании совета Д 002.093.01 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат диссертации разослан " " ^/¿^¿Х* 2011 г. Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук Н.Ф. .Панина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

До открытия тайтина мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: толстых (миозиновых) и тонких (актиновых). Открытие тайтина (коннектина) (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981) не только разрушило старые представления о двунитевой структуре саркомера, но и определило интерес многих исследователей к выяснению роли этого белка в поддержании структуры и функционировании саркомера и мышцы в целом. В настоящее время известно, что тайтин - гигантский эластичный белок в саркомерах поперечно-полосатых мышц позвоночных (Labeit, Kolmerer, 1995; Tskhovrebova, Trinick, 2010). Молекулярные массы известных изоформ тайтина (N2A, N2B и N2BA) составляют 3000000-3700000 Да (Freiburg et al., 2000; Guo et al., 2010). Молекулы тайтина, перекрывая расстояние от М-линии до Z-диска, формируют третью филаментную систему в миофибриллах и составляют по количеству ~15% от массы саркомерных белков (Tskhovrebova, Trinick, 2010). В А-зоне саркомера тайтин связан с миозиновыми нитями. В I-диске саркомера тайтин проходит свободно, соединяя концы миозиновых нитей с Z-мембраной (Granzier, Labeit, 2004). Исследования, проведенные за последние 20 лет, показали, что тайтин является одним из ключевых компонентов саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных, играющим важную роль в сборке толстых нитей, формировании высокоупорядоченной структуры саркомера, регуляции актин-миозинового взаимодействия и процессов внутриклеточной сигнализации (Granzier, Labeit, 2004; Lange et al., 2005; Linke, Krüger, 2010; LeWinter, Granzier, 2010; Gautel, 2011). Однако огромная молекулярная масса тайтина, а также способность этого белка легко деградировать во время препаративных процедур сильно затрудняют исследование его структурно-функциональных свойств, вследствие чего не все свойства тайтина в норме до конца изучены. Необходимо выяснение роли тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия и, в частности, вклада этого белка в Са2+-чувствительность развития силы. Остается нерешённым вопрос о связывании тайтина с актином в саркомере и функциональной значимости такого взаимодействия. Недостаточно широко исследован изоформный состав тайтина в мышцах животных и человека, и не открыты изоформы тайтина с м.м. более 3700 кДа, хотя ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200 кДа (38138 аминокислотных остатка) (Guo et al., 2010). Не совсем ясно, как на уровне половины саркомера функционируют изоформы тайтина, имеющие разную длину растяжимой I-области молекулы этого белка. Несомненно, что присутствие в саркомере разных изоформ тайтина имеет важное физиологическое значение для функционирования мышцы.

мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (L. Wang, 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животного. Проведённые исследования показали, что изменения структурно-функциональных свойств миозина и связанных с ним белков (С-белка, Х-белка) вносят вклад в адаптацию поперечно-полосатых мышц зимоспящих животных к условиям гибернации (Morano et al., 1992; Лукоянова и др., 1997; Вихлянцев и др., 2002; Rourke et al., 2004; Зуйкова и др., 2005; Малышев и др., 2006). Исследования роли тайтина в адаптации мышц к условиям зимней спячки не проводились. Не изучен вклад тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома», который наблюдается у человека и животных в условиях моделируемой или реальной невесомости. Этот синдром проявляется в развитии атрофии скелетных позно-тонических мышц, сопровождающейся уменьшением объёма мышечных волокон, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Григорьев и др., 2004). На фоне описанных изменений выявлено снижение содержания N2A-изоформы тайтина в m. soleus крысы после 14-суточного пребывания в условиях моделируемой микрогравитации (Toursel et al., 2002), что сопровождалось изменением эластичных свойств мышцы. Однако исследования возможных изменений сократительных свойств мышцы вследствие уменьшения содержания тайтина не проводились. Известны данные, свидетельствующие об атрофии сердечной мышцы человека и животных в условиях реальной или моделируемой микрогравитации (Baranska et al., 1990; Goldstein et al., 1992; Perhonen et al., 2001). Однако какие при этом происходят изменения качественного и количественного состава тайтина в сердечной мышце, и каково функциональное значение этих изменений, остаётся неясным. Следует обратить внимание на отличительную особенность атрофических изменений в мышцах при гибернации и микрогравитации. В отличие от негативных последствий атрофии мышц в условиях микрогравитации, приводящих к длительному нарушению сократительных свойств мышц, атрофические изменения в мышцах в период зимней спячки легко обратимы при пробуждении животного и не влекут за собой патологических последствий (Lee at al., 2008). Однако причина подобных различий неясна.

Тайтин играет важную роль не только в физиологии, но и в патофизиологии мышц. Исследования последних лет показали, что патогенез ряда мышечных заболеваний сопровождается изменениями в изоформном составе, содержании тайтина и экспрессии гена этого белка (LeWinter, Granzier, 2010; Ottenheijm, Granzier, 2010). Однако имеющиеся литературные данные противоречивы. В частности, выявлены противоположные изменения в содержании N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) у человека (Makarenko et al., 2004; Nagueh et al.,

2004) и собаки (Wu et al., 2002; Jaber et al., 2008). В гипертрофированном сердце спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) выявлено уменьшение содержания №ВА-изоформы тайтина (Warren et al., 2003), тогда как при развитии гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) у человека не обнаружено изменений в содержании и изоформном составе этого белка (Hoskins et al., 2010). В скелетных мышцах человека при развитии миодистрофий одними авторами обнаружено уменьшение содержания тайтина (Matsumura et al., 1990; Cullen et al., 1992), тогда как другими исследователями подобных изменений в содержании этого белка не зарегистрировано (Horowits et al., 1990). Противоречивость имеющихся литературных данных не позволяет сделать чётких заключений о роли разных изоформ тайтина в патогенезе исследуемых заболеваний. Несомненно, что для лучшего понимая роли тайтина при патологии необходимо более детальное исследование структурно-функциональных свойств этого белка в норме и при адаптации. Поэтому сравнительное исследование структурно-функциональных свойств тайтина в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах является актуальной фундаментальной задачей и имеет важное прикладное значение.

Цель работы: исследование структурно-функциональных свойств тайтина сердечной и скелетных мышц животных и человека в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах.

Задачи исследования:

1. Провести злектрофоретическое исследование тайтина сердечной и скелетных мышц человека и животных для выявления новых высокомолекулярных изоформ этого белка;

2. Изучить in vitro молекулярные параметры и агрегационные свойства тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика, его связывание с актиновыми и миозиновыми нитями и влияние на ферментативные и регуляторные свойства миозина;

3. Исследовать сезонные изменения изоформного состава тайтина и степени его фосфорилирования в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulalus;

4. Изучить вклад изменений изоформного состава тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» в условиях моделируемой или реальной микрогравитации;

5. Оценить эффективность разных подходов, направленных на предотвращение или уменьшение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»;

6. Изучить изменения изоформного состава тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) при развитии гипертрофии, в миокарде человека с конечной стадией развития ДКМП и в спинной мышце человека с синдромом «ригидного человека».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В поперечно-полосатых мышцах человека и животных наряду с известными N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформами тайтина электрофоретическими методами обнаружено присутствие более высокомолекулярных изоформ этого белка.

2. Способность тайтина связываться in vitro с актиновыми нитями и его активирующий эффект на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина указывают на участие тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышцах.

3. Изменения в изоформном составе тайтина в сердечной и скелетных мышцах сусликов Spermophilus undulatus при зимней спячке направлены на сохранение содержания более высокомолекулярных изоформ тайтина при уменьшении (в -1.3-1.5 раза) содержания известных изоформ этого белка. Адаптационное значение сохранения более высокомолекулярных изоформ тайтина заключается в поддержании саркомерной структуры и необходимого уровня сократительной активности мышц сусликов в разные периоды гибернации.

4. Развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» и патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека») в поперечно-полосатых мышцах человека и крысы сопровождается уменьшением (в -1.5-2.5 раза) содержания известных N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина, а также уменьшением (в -2-5 раз) содержания или полным разрушением более высокомолекулярных изоформ этого белка.

Научная новизна работы

Разработан метод ДСН-электрофореза в крупнопористом горизонтальном геле и модифицированы известные методы ДСН-электрофореза в вертикальных гелях для исследования полиморфизма гигантского белка тайтина. С помощью этих методов получены новые данные, показывающие, что в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих наряду с известными N2A-, N2BA- и ШВ-изоформами тайтина присутствуют более высокомолекулярные изоформы этого белка. Проведено сравнительное исследование вклада изменений изоформного состава тайтина в изменения структурно-функциональных свойств в мышцах млекопитающих при адаптации к экстремальным условиям среды (гибернация, микрогравитация) и при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы, дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека»). В поперечнополосатых мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации обнаружено уменьшение содержания известных изоформ тайтина при сохранении содержания новых, более высокомолекулярных изоформ этого белка. Обнаруженные изменения в содержании тайтина не сопровождались нарушением структурно-функциональных свойств мышц гибернирующих животных. Сделано заключение об адаптационном значении сохранения в мышцах гибернирующих сусликов более высокомолекулярных изоформ тайтина для поддержания упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и необходимого уровня сократительной активности мышц при спячке и пробуждении, что способствует выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий. В мышцах человека и крысы при развитии патологических процессов и «гипогравитационного мышечного синдрома» наряду с уменьшением содержания известных изоформ тайтина обнаружено разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка, что сопровождалось нарушением структурно-функциональных свойств мышц. Сделано заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-

функциональных характеристик мышц играют открытые нами более высокомолекулярные изоформы тайтина, а не N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформы этого белка.

Получены другие важные фундаментальные результаты, расширяющие наши представления о роли тайтина в мышцах. Обнаружена способность тайтина поперечно-полосатых мышц связываться in vitro с актиновыми нитями, а также активирующий эффект тайтина на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина. Полученные результаты указывают на участие тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышцах. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина, выделенного из скелетных мышц спящих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния этого белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са" -чувствительность миозина in vitro. Сделано предположение о вкладе фосфорилирования тайтина в ингибирование сократительной активности скелетных мышц сусликов в период гибернации. Эти данные также свидетельствуют о важной роли тайтина в регуляции мышечного сокращения. В предсердиях и желудочках сердца сусликов в период осенней подготовки животных к спячке, а также на протяжении всего гибернационного сезона выявлено двукратное увеличение доли длинных (более эластичных) изоформ тайтина. Адаптационное значение выявленных изменений заключается в повышении эластичности сердечной мышцы сусликов с целью усиления сократительного ответа миокарда для выброса более густой крови из камер сердца в период спячки и при пробуждении животного. Выявлено снижение (в ~5 раз) экспрессии гена тайтина в миокарде зимоспящих сусликов на всех фазах гибернационного цикла (спячка, пробуждение, межбаутная активность, вход в спячку), что можно рассматривать как адаптацию, направленную на минимизацию энергетических затрат в период гибернации. При развитии гипертрофии сердечной мышцы у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) обнаружено увеличение экспрессии гена тайтина в миокарде 15-недельных крыс и снижение экспрессии гена этого белка в миокарде 26-недельных крыс. Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития патологических изменений в гипертрофированной сердечной мышце.

Научная и практическая значимость работы

Полученные данные вносят вклад в формирование современных представлений о структурно-функциональных свойствах тайтина в мышце в норме, при адаптации и патологии. Разработанные электрофоретические методы, позволяющие выявлять более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина, открывают новые возможности для дальнейших исследований вклада этих форм тайтина в функционирование мышцы в норме и при развитии адаптационных и патологических процессов. Изучение адаптационных изменений изоформного состава тайтина в мышцах зимоспящих сусликов помогло понять причины нарушений структурно-функциональных свойств в мышцах человека и животных при развитии патологических процессов. Полученные результаты имеют большое практическое значение, поскольку тестирование изменений качественного и количественного состава тайтина в мышцах может быть использовано в медицинской практике с целью диагностики развития патологических

процессов и оценки эффективности подходов к их коррекции. Результаты исследований по связыванию тайтина с актином и влиянию тайтина на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина важны для лучшего понимания механизма актин-миозинового взаимодействия в мышце в норме и могут быть полезны для выяснения причин нарушения сократительных свойств мышцы при развитии патологии. Данные об изменении экспрессии гена тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR могут быть использованы в диагностике развития гипертрофии сердечной мышцы. Результаты работы используются при чтении курса лекций по биофизике и биохимии мышечного сокращения и биологической подвижности студентам и слушателям на биологических факультетах МГУ и ПущГУ.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на: 29-ой, 31-37-ой Европейских мышечных конференциях (Berlin, Germany, 2000; Lunteren, Netherlands, 2002; Montpellier, France, 2003; Isola d'Elba, Italy, 2004; Hostobagy, Hungary, 2005; Heidelberg, Germany, 2006; Stockholm, Sweden, 2007; Keble College, Oxford, England, 2008); Международных симпозиумах "Biological motility" (Пущино, 2001, 2004; 2006; 2008; 2010); Международных симпозиумах по термофизиологии (Минск, Беларусь, 2000, 2002); Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002, 2008); Всероссийских школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2010); 24-27-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Santa-Monica, USA, 2003, Moscow, Russia, 2004, Cologne, Germany, 2005; Angers, France, 2008); Конференциях молодых ученых, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005, 2008); Пущинских конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001-2006, 2009, 2010); Международной конференции «Стресс и висцеральные системы» (Минск, Беларусь, 2005); XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005); I и II Съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005; Кишинев, Молдова, 2008); 15-ой Международной конференции "Human in Space" (Graz, Austria, 2005); 15-ом Международном биофизическом конгрессе (Montpellier, France, 2005); Международной конференции «Медико-биологические аспекты действия физических факторов» (Минск, Беларусь, 2006); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); Международном Междисциплинарном симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине (ЕХВ+Р1М'07) (Судак, Украина, 2007); Joint British-Russian young scientists workshop "Muscles: structure, function and regulation" (Yekaterinburg, Russia, 2007); 4-ом и 5-ом Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2008, 2009); 7-ом Европейском биофизическом конгрессе (Genova, Italy, 2009); 30-ом и 34-ом FEBS конгрессах (Budapest, Hungary, 2005; Prague, Czech Republic, 2009); Конференции молодых научных сотрудников ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009); Международной научно-практической конференции «Человек

и животные» (Астрахань, 2010); XVIII, XX, XXI Съездах физиологов России (Казань, 2001; Москва, 2007; Калуга, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 92 печатных работы, в том числе 29 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 235 страницах, содержит 42 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы включает 449 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальный и клинический материал

Для выделения тайтина с целью изучения in vitro его структурно-функциональных свойств были использованы быстрая скелетная мышца psoas и медленная скелетная мышца soleus кролика породы Шиншилла, скелетные мышцы спины, верхних и нижних конечностей зимоспящего якутского суслика Spermophilus undulatus, а также левый желудочек сердца этих животных. Суслики содержались в условиях вивария ИБК РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде. Обеспечивались пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Для выделения тайтина были использованы мышцы сусликов разных физиологических состояний: летних активных (май-сентябрь); гибернирующих (спящих) (конец ноября-март, температура сердечной мышцы 2-5°С, продолжительность баута спячки 7-14 суток) и пробуждающихся (температура сердечной мышцы 15-32°С, ректальная температура 10-27°С, время пробуждения 1.5-2.5 часа) животных. Подготовку сусликов к эксперименту и контроль их физиологического состояния проводили совместно с сотрудниками лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний ИБК РАН.

Для исследования изоформного состава тайтина в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих в норме были использованы отдельные мышцы спины, брюха, передних и задних конечностей кролика, суслика, крысы (линия Wistar Kyoto), мыши (линия C57BL/6) и монгольской песчанки (Meriones unguiculatus), разные отделы сердечной мышцы этих животных, а также т. soleus, ш. quadriceps femoris и т. vastus lateralis человека.

Для изучения сезонных изменений изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов, а также экспрессии гена тайтина в миокарде этих животных использовали сусликов разных физиологических состояний: летних активных (май-сентябрь); осенних активных (октябрь-середина ноября); гибернирующих (конец ноября-март, температура сердечной мышцы 2-5°С, продолжительность баута спячки 7-14 суток); пробуждающихся (температура сердечной мышцы 20-32°С, время пробуждения 1.5-2.5 часа); зимних активных (активность от нескольких часов после пробуждения до двух суток) и входящих в спячку (температура сердечной мышцы 15-30°С).

Для исследований изменений изоформного состава тайтина, а также экспрессии гена этого белка в левом желудочке сердца спонтанно-гипертензивных крыс (линия SHR) были использованы 2 возрастные группы этих животных: 15-недельные, на ранних сроках развития гипертрофии, и 26-недельные, с выраженной гипертрофией сердца. В качестве контрольных животных использовались крысы линии Wistar Kyoto в возрасте 17 недель. Экспериментальные животные были предоставлены питомником корпуса Биомедицинских исследований ФИБХ РАН (Пущино).

Для исследования изменений тайтина в мышцах человека при патологии был использован следующий клинический материал: биопсии левого желудочка сердца с диагностированной конечной стадией ДКМП (IV стадия, NYHA), п=4; биопсии скелетной мышцы, выпрямляющей позвоночник, от трёх пациентов с синдромом «ригидного человека». Продолжительность развития заболевания более двух лет. Данный клинический материал был предоставлен Научным Центром сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН и ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава (биопсии левого желудочка сердца) и Клиникой нервных болезней им. А.Я. Кожевникова ММА им. И.М. Сеченова (биопсии скелетной мышцы пациентов с синдромом «ригидного человека»). Клиникой нервных болезней также были предоставлены биопсии мышц m. quadriceps femoris и т. vastus lateralis человека, используемые в качестве контроля. Взятие экспериментального материала было одобрено этическим комитетом РАМН.

Для изучения изменений тайтина в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации были использованы аутопсийные образцы m. soleus крыс, а также биопсии m. soleus человека, взятые до и после проведения экспериментов по моделированию условий гравитационной разгрузки. В работе также использовались аутопсийные образцы скелетных мышц m. soleus и т. tibialis anterior и левого желудочка сердца монгольской песчанки (Meriones unguiculatus), взятые до и после 12-суточного пребывания животных в условиях космического полёта на борту искусственного спутника Земли «Фотон-МЗ». Песчанки были отловлены в Монголии и содержались в виварии ГНЦ РФ - ИМБП РАН (Москва).

Выделение и очистка белковых препаратов

Тайтин из сердечной и скелетных мышц кролика и суслика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993). Для изучения влияния тайтина поперечнополосатых мышц кролика и зимоспящего суслика на структурные и функциональные свойства миозиновых нитей использовали миозин из сердечной или скелетных мышц кролика. Методики получения миозина описаны в работах (Offer et al., 1973, скелетный миозин) и (Margossian, 1985, сердечный миозин). Актин из скелетных мышц кролика выделяли по методу, описанному в работе (Pardee, Spudich, 1982).

Измерение АТФазной активности актомиозина в присутствии тайтина

АТФазная активность реконструированного актомиозина кролика измерялась по выходу неорганического фосфата с использованием колориметрического метода на основе красящего агента малахитового

зеленого (Lanzetta et al., 1979). Реакцию инициировали добавлением миозиновых нитей, предварительно сформированных в присутствии или в отсутствие тайтина, к раствору, содержащему необходимые количества актина и АТФ. Соотношение миозина к тайтину по весу составляло 4:1. Расчет Са2+-чувствительности актин-активируемой АТФазной активности миозина производился по формуле (Lehman, Szent-Gyorgyi, 1975): Са2+-чувствительность (%) = 100-[(АТФазаСа) - (АТФазаЕГТА)] / АТФазаЕГГА, где АТФазаЕгтА - АТФазная активность при рСа 7.5; АТФазаса - АТФазная активность при рСа 4.6.

Электронно-микроскопические исследования

Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрацией 0.05-0.1 мг/мл. Электронно-микроскопические исследования проводили, используя негативно окрашенные образцы. Одиночные выпрямленные молекулы тайтина получали по методу (Tskhovrebova, Trinick, 1997).

Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денснтометрия

Для обнаружения изоформ тайтина и их изовариантов с молекулярной массой более 3000 кДа, применялись крупнопористые полиакриламидные мини-гели (8x10 см) с добавлением агарозы по методу (Tatsumi, Hattori, 1995) с нашими модификациями. Методика приготовления таких гелей заключалась в следующем: к раствору, содержащему определенное количество акриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1.0), додецилсульфата натрия (ДСН), трис-HCl буфера, рН 8.9-9.0 и нагретому до температуры 40°С, добавляли расплавленную агарозу до концентрации 0.5-0.6%. Конечная концентрация акриламида составляла 2.0-2.3%, ДСН - 0.1%, трис-HCl буфера - 0.375 М. Полимеризация инициировалась добавлением 0.058% тетраметилэтилендиамина и 0.075% персульфата аммония. Полученный раствор максимально быстро заливали между двух охлаждённых (а не нагретых, как принято) вертикально расположенных стёкол, вставляли гребёнку и в течение первых 15 минут полимеризовали при температуре 5-6°С. Этого времени было достаточно для застывания агарозы, после чего полимеризацию акриламида проводили в течение 2-3-х часов при комнатной температуре (а не при 5-6 °С). Описанные модификации способствовали лучшему фокусированию тайтиновых полос в геле. Однако в таких гелях, из-за их небольшого размера, редко удавалось разделить изоварианты изоформ тайтина, вследствие их малых различий в электрофоретической подвижности. Для лучшего разделения в геле высокомолекулярных форм тайтина нами была разработана методика электрофореза в крупнопористом горизонтальном полиакриламидном геле с добавлением агарозы. Для формирования горизонтального геля, раствор, нагретый до 40°С и содержащий все необходимые добавки, включая акриламид и агарозу (см. методику приготовления агарозного мини-геля), заливали в камеру для горизонтального электрофореза. Конечная концентрация полиакриламида в горизонтальном геле составляла 1.0-1.3%, агарозы - 0.6-0.8%. В течение первых 15-20 минут полимеризация проводилась при температуре 5-6°С, затем в течение 3.0-3.5 часов при комнатной температуре. В горизонтальном геле значительно возросла электрофоретическая подвижность тайтина, что немал отважно как для

выявления изовариантов тайтиновых изоформ, мало отличающихся по электрофоретической подвижности, так и для более точных оценок их молекулярной массы. Однако более сильная диффузия полос тайтина в горизонтальном геле по сравнению с вертикальным мини-гелем затрудняла проведение подобных оценок. Для решения этой проблемы мы использовали вертикальный полиакриламидный (1.9-2.3%) агарозный гель размером 14.5x16.0 см. Методика приготовления вертикального агарозного геля большого размера не отличалась от методики приготовления вертикального мини-геля с добавлением агарозы (см. выше). Следует только отметить, что для предотвращения проскальзывания сформированного геля между стёклами (под действием силы тяжести), предварительно заливалась 8% полиакриламидная пробка (высотой 1.0-1.5 см).

Нами был также изменен процесс приготовления электрофоретических проб. Известно, что перед проведением электрофореза для лучшей солюбилизации белков и предотвращения их агрегации электрофоретические пробы кипятят в течение нескольких минут. С целью предотвращения протеолиза тайтина эндогенными протеазами при нагревании мышечной пробы в солюбилизирующий раствор добавляют протеолитические ингибиторы леупептин и Е64, что, однако, не исключает разрушающего действия на тайтин температур выше 57°С (Granzier, Wang, 1993). В наших экспериментах образцы скелетных мышц инкубировались в течение 40-60 мин минут при температуре 25-30°С в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 80 мМ ДТТ, 8-10 мкг/мл леупептина, 8-10 мкг/мл Е64, рН 6.8-7.0. Денатурацию белковых препаратов тайтина также проводили без дополнительного нагревания, инкубируя пробы в течение 30-40 минут при температуре 25-30°С в солюбилизирующем растворе, содержащем 12 мМ трис-НС1, 0.5% ДСН, 5% глицерина, 16 мМ ДТТ, рН 6.8-7.0. Денатурацию миозина и актина проводили в течение 2-3 минут при 95-100°С в том же солюбилизирующем растворе.

Чистоту выделенных препаратов тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et. al., 1989), а также в 2.0-2.3% полиакриламидном мини-геле с агарозой. Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970). Денситометрию проводили с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. В качестве стандартов для оценки молекулярной массы изоформ тайтина были использованы полосы тяжелых цепей миозина (205 кДа), небулина (770890 к Да), тайтина-2 (2100-2400 кДа) (Maruyama et al., 1984; Wang et al., 1991; Kruger et al., 1991; Granzier, Wang, 1993). Содержание тайтина оценивали по отношению к содержанию тяжелых цепей миозина. В таблицах приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их ошибки. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия с уровнем достоверности р<0.05.

Вестерн-блоттииг тайтина

Вестерн-блоттинг тайтина проводили по методу (Towbin et al., 1970) с нашими модификациями. Перенос белка из полиакриламидных гелей на

нитроцеллюлозные мембраны после электрофореза проводили в трис-глицин/метанольном буфере с добавлением ДСН при силе тока 0.8 мА/см2 в течение 48-72 часов при постоянном охлаждении. В качестве первичных антител использовали: АВ5 (к участку молекулы тайтина в А-диске, расположенному около М-линии саркомера), BD6 (к участку молекулы тайтина, расположенному на границе А-диска и I-области саркомера), 9D10 и Т11 к участкам I-зоны тайтина, Z1/Z2 (к N-концу молекулы тайтина, расположенному в Z-диске саркомера). В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей ("Sigma") или кролика («Имтек», Москва). Белковые полосы выявляли с помощью З.З'-диаминобензидина.

Фосфоршшрование in vitro тайтина сердечной и скелетных мышц сусликов

Фосфорилирование iп vitro очищенных препаратов тайтина сердечной и скелетных мышц сусликов проводили в присутствии радиоактивного изотопа у-[32Р]АТФ с использованием каталитической субъединицы протеинкиназы А (ICN Biochemicals, Cat. number 195812) согласно методу, описанному в работе (Takano-Ohmuro et al., 1992). Для контроля фосфорилирования белковых препаратов применяли метод авторадиографии, с использованием рентгеновской пленки Retina (Германия).

Исследование экспрессии тайтина методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Изучение сезонных изменений экспрессии гена тайтина в сердечной мышце зимоспящих сусликов, а также в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс проводили методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR).

Выделение геномной ДНК из образцов миокарда

Выделение геномной ДНК осуществляли классическим фенол-хлороформным способом (Sambrook et al., 1989, http//:wvvw.molbiol.ru').

Выделение тотальной РНК и проведение реакции обратной транскрипции

РНК из ткани миокарда была выделена с использованием набора Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit BIO-RAD (США), согласно протоколу изготовителя. Выровненные по концентрации РНК (100 нг/мкл) использовали для реакции обратной транскрипции, с помощью набора MINT-Universal cDNA synthesis kit («Евроген», Россия). Качество полученных препаратов оценивали электрофоретическим методом в 0.8% агарозном геле с 2.2 М формальдегида.

Количественная ПНР

Праймеры для qRT-PCR синтезировали на основе последовательности гена тайтина сердечной мышцы крысы (Opitz et al., 2004). Реакцию проводили на амплификаторе ДТ-322 («ДНК-Технология», Россия), используя набор Tersus PCR kit («Евроген», Россия), с применением SYBR Green I ("Invitrogen", США) в качестве флуоресцентного зонда. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 2—4 мкл кДНК, по 4 пмоль каждого праймера, 0.1 мМ каждого dNTP, стандартный буфер («Евроген», Россия), 1 мкл SYBR Green I

(разведение 1:3000) и 1 U Taq-полимеразы .(«Евроген», Россия). Программа амплификации для всех пар праймеров была следующей: предварительная денатурация при 94°С - 2 минуты; далее 30-40 циклов: 94°С - 20 секунд, 58°С - 20 секунд, 72°С - 20 секунд. Флуоресцентный сигнал регистрировали в конце каждого цикла в течение 15 секунд. Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи программы q_PCR («ДНК-Технология», Россия). Относительное количество синтезированных ампликонов гена тайтина (tin) рассчитывали по методу 2"ЛАС', описанному в работе (Livak, Schmittgen, 2001), где Ct - пороговый цикл реакции или точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Расчеты ДДС, проводили по формуле AACt = ДС,(контроль) - ДС,(опыт), а каждое значение АС, рассчитывали по формуле ДС, = AC,(Ttn) - ДС,(Р-актин). В качестве референсного гена использовали ген ß-актина. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия с уровнем достоверности р<0.05.

Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле

Продукты амплификации разделяли в 5% полиакриламидном геле (Sambrook et al., 1989). Для визуализации фронта ДНК использовали смесь красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Электрофорез проводили при напряжении 200-250 В и силе тока 70-110 мА. Использовали буфер TBE (89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0) После разделения фрагментов гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали на трансиллюминаторе.

Клонирование фрагментов ПНР в pAL-TA вектор

С целью клонирования фрагментов ПЦР в pAL-TA вектор полученные после электрофоретического разделения (см. выше) фрагменты ДНК экстрагировали из геля по методике, описанной в (Sambrook et al., 1989). Для клонирования был использован pAL-TA вектор («Евроген», Россия) — аналог pGEM-T Easy для быстрого клонирования продуктов ПЦР. Лигирование проводили с использованием Т4 ДНК лигазы и подходящего для нее лигазного буфера фирмы "Fermentas" (Литва) в соответствии с протоколом производителя. Для трансформации были использованы клетки Е. coli ТорЮ ("Invitrogen", США). Выросшие клоны проверяли на наличие вставок с помощью ПЦР с праймерами, один из которых был специфичен к промотору фага Т7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'), находящемуся в векторе, а второй - к последовательности клонируемого фрагмента. Программа амплификации была следующей: 94°С-2 минуты (предварительное плавление), далее 30-35 циклов по программе: 94°С-20 сек, 54°С-20 сек, 72°С-20 сек. Флуоресцентный сигнал регистрировали в конце каждого цикла в течение 15 секунд. Продукты амплификации разделяли в 5% полиакриламидном геле.

Выделение плазмиды и секвенирование

Трансформанты, содержащие вектор со вставкой искомого фрагмента ДНК, пересевали в жидкую среду LB (100 мкг/л ампициллина), растили до поздней стационарной фазы и затем выделяли плазмиду с помощью щелочного лизиса íhttp://www.molbiol.ru/protocol/04 02.htmll. Нуклеотидная

последовательность вставленных в вектор фрагментов ДНК была секвенирована в ЗАО «Евроген» (Москва).

Моделирование условий гравитационной разгрузки

Эксперименты по моделированию условий гравитационной разгрузки у крыс, а также эксперименты с применением различных подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния микрогравитации на ш. soleus, были проведены в ГНЦ РФ - ИМБП РАН (лаборатория миологии, рук. д.б.н. Шенкман Б.С.) и в Казанском государственном университете (КГУ) им. В.И. Ленина-Ульянова (кафедра физиологии, к.б.н. Балтина Т.В.). В качестве модели гравитационной разгрузки у человека использовали 7-суточную «сухую» иммерсию по методу (Шульженко, Виль-Вильямс, 1975). Все эксперименты по моделированию условий гравитационной разгрузки у человека были проведены в ГНЦ РФ -ИМБП РАН (г. Москва). Результаты проведенных исследований опубликованы в совместных работах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ИЗУЧЕНИЕ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ТАЙТИНА В СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ

1.1. Электрофоретическое изучение изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах человека и животных

Тайтин (коннектин) был открыт электрофоретическим методом двумя независимыми группами исследователей, которые на электрофореграммах скелетных мышц кролика и цыпленка, полученных в 3^1% полиакриламидном геле, полимеризованном в вертикальной трубке, обнаружили две неизвестных белковых полосы с молекулярной массой более 1000 кДа (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981). Белки оказались иммунологически идентичными и получили название тайтин-1 (а-коннектин) и тайтин-2 (Р-коннектин), последний из которых, как показано позже, является протеолитическим фрагментом тайтина-1 (а-коннектина) (Maruyama et al., 1984; К. Wang et al., 1984; Itoh et al., 1986). По первоначальным оценкам молекулярная масса интактного тайтина-1 (Т1) и его фрагмента тайтина-2 (Т2) в зависимости от их электрофоретической подвижности в геле составила -1400 кДа и ~1200 кДа соответственно (Wang et al., 1984). Однако более точные оценки их молекулярной массы с использованием в качестве стандарта «сшитых» поперечными связями тяжелых цепей миозина показали, что м.м. а- и р-коннектина может составлять -2800 кДа и -2100 кДа соответственно (Maruyama et al., 1984). Дальнейшие электрофоретические исследования тайтина, проведённые с использованием аппаратов для ДСН-электрофореза с вертикальным расположением пластинки геля, полимеризованного между двумя стёклами, выявили на электрофореграммах поперечно-полосатых мышц животных в 3-12% полиакриламидном геле различия в электрофоретической подвижности T1 (Wang et al., 1988; 1991; Horowits, 1992; Tatsumi, Hattori, 1995; Trombitâs et al., 1995; Granzier, Irving, 1995; Spierts et al., 1997). На основании

полученных данных было сделано предположение о существовании изоформ тайтина (Wang et al., 1991; Horowits, 1992). В зависимости от электрофоретической подвижности изоформ Т1 в градиентном геле были получены следующие значения их молекулярных масс: ~2400-2500 кДа (сердечная мышца) и ~2800-2900 кДа (скелетные мышцы) (К. Wang et al., 1991; Granzier, Wang, 1993).

Открытие изоформ тайтина произошло в 1995 году после секвенирования гена тайтина и определения последовательности его кДНК (Labeit, Kolmerer, 1995). Дальнейшие исследования показали, что транскрипты тайтина скелетных мышц содержат экзон Ы2А-уникальной последовательности, расположенной в I-области тайтина. Транскрипты тайтина сердечных мышц содержат экзон ШВ-уникальной последовательности, но могут содержать и N2A-3K30H. По названию уникальных последовательностей, присутствующих в тайтине скелетных или сердечных мышц, и были названы изоформы тайтина: N2A, N2B и N2BA (Labeit, Kolmerer, 1995). К настоящему времени установлено, что в медленной скелетной мышце soleus животных и человека экспрессируется длинный вариант Ы2А-изоформы тайтина (м.м. 3700 кДа), а в быстрой мышце psoas - короткий вариант ША-изоформы (м.м. 3400 кДа) (Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001; Labeit et al., 2006). В разных отделах сердца взрослых животных и человека экспрессируются две основные изоформы тайтина: короткая Ы2В-изоформа, с молекулярной массой 2970 кДа, и длинная Ы2ВА-изоформа, с молекулярной массой её вариантов от 3200 до 3350 кДа (Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001). Дальнейшие электрофоретические исследования, проведённые с использованием 2.0-2.5% полиакриламидного вертикального геля с добавлением агарозы или градиентного 2.5-9.0% полиакриламидного вертикального геля, выявили на электрофореграммах скелетных и сердечных мышц животных и человека полосы Т1 с разной электрофоретической подвижностью, которые были приняты за N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформы этого белка (Helmes et al., 1999; Trombitas et al., 2000; Cazorla et al., 2000; Bell et al., 2000; Freiburg et al., 2000; Trombitas et al., 2001; Neagoe et al., 2003; Warren et al., 2003; 2004; Makarenko et al., 2004; Opitz et al., 2004; Nagueh et al., 2004; Lahmers et al., 2004; Greaser et al., 2005; Prado et al., 2005; Greaser et al., 2008; Udaka et al., 2008; Jaber et al., 2008). Поскольку методом Вестерн-блоттинга с использованием антител к разным участкам молекулы тайтина (в том числе к N- и С-концам) была подтверждена интактность N2A-, N2BA- и ШВ-изоформ тайтина, выявляемых электрофоретическим методом (Cazorla et al., 2000; Nagueh et al., 2004; Lahmers et al., 2004) их стали считать интактными изоформами тайтина с м.м. 30003700 кДа. Однако оценки молекулярной массы этих форм тайтина в зависимости от их электрофоретической подвижности в геле не проводились.

С использованием модифицированной нами методики крупнопористого 2.0-2.3% полиакриламидного вертикального геля с добавлением агарозы мы провели исследование изоформного состава тайтина в поперечно-полосатых мышцах человека и животных (кролик, суслик, крыса, мышь). Наряду с известными N2A-, N2BA-, №В-изоформами тайтина, а также Т2, на электрофореграммах мышц исследуемых животных и человека было выявлено

присутствие более высокомолекулярных изоформ этого белка (рис. 1, дорожки 1-3), что подтверждается данными Вестерн-блоттинга (рис. 1, дорожки 4-6). При этом на электрофореграммах скелетных мышц животных и человека часто присутствовали две новых высокомолекулярных формы тайтина (рис. 1, дорожка 3), однако содержание одной из них (Т3800) было незначительное. С использованием в качестве стандартов молекулярной массы тяжёлых цепей миозина (ТЦМ, 205 кДа), небулина (700-900 кДа), Т2 (2400 кДа), а также Ы2А-изоформы тайтина (3700 кДа) скелетных мышц млекопитающих мы показали, что молекулярные массы новых изоформ тайтина могут составлять -3800 кДа в сердечной и -3800-3900 кДа в скелетных мышцах человека и животных (рис. 1). Содержание новых изоформ тайтина (% от общего содержания тайтина) по нашим подсчетам составило в среднем 30-40% в скелетных и 10-30% в сердечных мышцах.

Рис. 1. Изоформный состав тайтина в сердечной и скелетных мышцах млекопитающих. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле (8x10 см) с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.0-2.3%. Электрофореграммы с денситометрическими профилями: 1 - m. soleus (суслик); 2 - левый желудочек сердца (суслик); 3 - т. soleus (человек). Вестерн-блоттинг: 4 - левый желудочек сердца (кролик); 5 - m. soleus (человек); б - предсердие (суслик). Вестерн-блоттинг тайтина проведён с использованием моноклональных антител BD6 (4) и АВ5 (5,6). Указаны белковые полосы: Т2-фрагментов, N2B-, N2BA- №А-изоформ тайтина, новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина с м м. -3800-3900 кДа (Т3800, Т3900).

Вероятность существования изоформ тайтина с м.м. более 3700 кДа не исключается, поскольку ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200 кДа (Bang et al., 2001; Guo et al., 2010). Однако экспрессия геном тайтина изоформ этого белка с молекулярной массой более 3700 кДа в мышцах до сих пор не показана, что ставит под сомнение их существование. Поскольку ранее высказывалось предположение о возможной агрегации Т1 и Т2 (Granzier, Wang, 1993), мы не исключали вероятности того, что высокомолекулярные формы тайтина, обнаруженные нами, являются продуктом агрегации известных форм этого белка. Существовала также и вероятность агрегации тайтина с нуклеиновыми кислотами (Макаренко И.В., персональное сообщение). Проведённая нами окраска гелей бромистым этидием не выявила присутствия в новых, более высокомолекулярных изоформах тайтина нуклеиновых кислот (данные не показаны). Однако эти данные не исключили вероятности агрегирования разных форм тайтина с образованием более высокомолекулярных форм этого белка, выявляемых в геле. Полагая, что

молекулярные массы агрегатов тайтина должны значительно превышать полученные нами значения (3800-3900 кДа), мы задались целью выявить большие различия в электрофоретической подвижности обнаруженных нами новых изоформ этого белка. Для достижения этой цели была разработана методика ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном (1.01.3%) геле с агарозой с использованием аппарата с горизонтальным расположением геля. Результаты электрофоретического тестирования изоформного состава тайтина в мышцах млекопитающих с использованием горизонтального геля с добавлением агарозы, представленные на рисунке 2, показали существенные различия в электрофоретической подвижности новых изоформ тайтина.

Рис, 2. Изоформный состав тайтина в поперечно-полосатых мышцах

млекопитающих. Электрофорез проведен в горизонтальном полиакриламидном геле с содержанием полиакриламида 1.3% и агарозы 0.6%.

Электрофореграмма: 1 — m. vastus lateralis (человек); 2 - т. soleus (кролик); 3 - левый желудочек сердца (суслик), 4 - т. psoas (кролик). Для оценки молекулярных масс новых изоформ тайтина были использованы значения молекулярных масс следующих белков: ТЦМ (205 кДа), небулина m. psoas кролика (800 кДа) и небулина скелетной мышцы человека (900 кДа) (Kruger et al., 1991; Granzier, Wang, 1993). Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина (ТЦМ), небулина (белка тонких нитей) Т2-фрагментов, известных N2B- и Ы2А-изоформ тайтина, новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина с м.м. -3200-3700 кДа.

С использованием в качестве стандартов молекулярной массы ТЦМ (205 кДа), небулина скелетных мышц животных (800 кДа) и человека (900 кДа) были проведены оценки м.м. новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина, а также известных изоформ этого белка (N2A, N2B, N2BA) и Т2. Результаты этого исследования оказались весьма неожиданными (рис. 2). В частности, по нашим оценкам значения м.м. известных N2B- и ША-изоформ тайтина, которые принимают на гелях за интактные изоформы, составили ~2400-2800 кДа (рис. 2), что соответствует значениям м.м. изоформ Т1, выявляемых в градиентном 3-12% полиакриламидном вертикальном геле (Wang et al., 1991; Granzier, Wang, 1993). Значения молекулярных масс новых изоформ тайтина по нашим оценкам составили: 3230-3300 кДа в левом желудочке сердца суслика, 3380-3500 кДа в m. psoas кролика, 3600-3680 кДа в т. soleus кролика и 36503730 кДа в т. vastus lateralis человека (рис. 2). Заметим, что полученные значения м.м. открытых нами более высокомолекулярных изоформ тайтина с большой точностью совпали со значениями м.м. N2B (-3000 кДа), N2BA (3200-3350 кДа) и N2A (3400-3700 кДа) изоформ тайтина, образующихся в результате альтернативного сплайсинга и экспрессирующихся в мыщцах (Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001). Учитывая эти результаты мы сделали

Иптактный Т.

3650-1730_

3600-368(1—

МЛ Т2

2750-2800_ 2670-2700" 2270-2.100 — 2200-2250

>/00_ Hi'ftv.linl ~ 840-850

205_ ТЦМ

щ п

Щ 'if.

Шё mm

* ' •'ri w Щ* :

• •. V

- ■ ■ 'mm ж ж

Иитактный Т.

NIA

— 2560-2600

— 2120-2450 N211

— 2080-2120 Т2

«W

предположение о том, что открытые нами более высокомолекулярные изоформы тайтина являются интактными изоформами этого белка, тогда как известные его изоформы (N2A, N2BA, N2B), выявляемые на гелях, являются лишь фрагментами интактных изоформ тайтина. Результаты других наших электрофоретических исследований подтверждают это предположение. В частности, при использовании полиакриламидных (1.9-2.1%) вертикальных гелей с агарозой размером 14.5><16.0 см (рис. 3), а не мини-гелей (8x10 см) (рис. 1) на электрофореграммах сердечной мышцы животных в наших исследованиях обнаружено присутствие двух полос новых форм тайтина с м.м. -3300-3400 кДа (рис. 3, дорожка 1).

Иктактняя ЮВА-цзоформя : Иитактняя МВ-июфпрма — f*"r Иктактняа МВЛ-изоформя, 3405 кДя Щ] Интакшая .\2В-итф(фма, 3330 кД*<

Х2ВА-фрагмснт, 2580 кДа Х2В-фрачиент, 2400 кДя —' Т2-фрягменты, 2035-2100 кДа=

Иитастпая N2A-язоформя, 3675 кДа — 1У2А-фрагмепт, 2940 кДа

Небулик, 800 кДя

Рис. 3. Интактные N2A-, N2BA- и ШВ-изоформы тайтина в поперечнополосатых мышцах суслика. Электрофорез проведен в вертикальном геле размером 14.5x16.0 см с содержанием агарозы 0.55% и

полиакриламида 1.9%. 1 - левый желудочек сердца суслика, 2 - m. soleus суслика.

На электрофореграммах скелетных мышц человека и животных мы всегда наблюдали только одиночную полосу новой формы тайтина с м.м. -3600-3700 кДа (рис. 3, дорожка 2). Полученные результаты согласуются с данными о коэкспрессии двух (N2BA и N2B) изоформ тайтина с м.м. -3000-3400 кДа в сердечной мышце и экспрессии одного изоварианта И2А-изоформы тайтина с м.м. -3400-3700 кДа в скелетных мышцах млекопитающих (Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001; Greaser et al., 2005) и подтверждают наше предположение о том, что новые, более высокомолекулярные изоформы тайтина являются интактными N2A-, N2BA- и N 2 В - и чо фо р м а м и этого белка.

Цитатный тайтнн —I

N2A-

Z1/Z2

heN- ' а»

ЛВ5

Ишактимн тайтин ~

N2BA—. - N2B

Интакшьгй 1> I ' Mgg — тайтин

N2A

Рис. 4. Вестерн-блоттинг с антителами Z1/Z2 и АВ5 kN- и С-концам молекулы тайтина. 1,4 - т. soleus суслика, 2,3 - левый желудочек сердца суслика.

Результаты проведённого Вестерн-блоттинга тайтина с антителами к N- и Суконцам молекулы этого белка, показавшие окраску указанными выше антителами новых изоформ тайтина (рис. 4, дорожки 1-4, см полосы "Интактный тайтин") при отсутствии окраски антителами к N-концу молекулы

тайтина известной Ы2ВЛ-изоформы этого белка (рис. 4, дорожка 2), с одной стороны подтверждают правильность нашего предположения. Однако с другой стороны, полученные результаты, показавшие окраску указанными выше антителами известных N2B- и Ы2А-изоформ тайтина (рис. 4, дорожки 1-4), противоречат нашему предположению о том, что эти формы тайтина являются фрагментами и указывают на то, что они тоже являются интактными изоформами этого белка. Таким образом, анализируя полученные результаты, можно сделать следующее заключение. В поперечно-полосатых мышцах животных и человека наряду с известными интактными изоформами тайтина (в частности, N2A и N2B) присутствуют более высокомолекулярные интактные изоформы этого белка. Учитывая данные о коэкспрессии двух изоформ тайтина (N2BA и N2B) на уровне половины саркомера в сердечной мышце (Trombitas et al., 2001), можно полагать, что новые, более высокомолекулярные изоформы тайтина вместе с известными изоформами этого белка также коэкспрессируются в отдельно взятом саркомере. Вопрос о том, каким образом разные по длине интактные изоформы тайтина располагаются и функционируют в саркомере, требует дальнейших исследований. Однако можно предположить, что более длинные (с большими м.м., -3200-3700 кДа) новые изоформы тайтина располагаются в саркомере от М-линии до Z-диска, тогда как более короткие (с меньшими м.м., -2400-2900 кДа) известные изоформы тайтина не перекрывают полностью расстояние в половину саркомера. Такое предположение вполне допустимо, учитывая данные об экспрессии в саркомерах сердечной мышцы млекопитающих короткого варианта ШВ-изоформы тайтина Novex-З с м.м.~700 кДа (Bang et al., 2001). Показано, что N-конец Novex-З расположен в Z-диске саркомера, а С-конец, предположительно, связывается в I-зоне саркомера с обскурином. Предполагается, что присутствие в саркомере укороченных изоформ тайтина Novex-З, не достигающих А-зоны саркомера, и длинных изоформ тайтина, пересекающих половину саркомера, может приспосабливать молекулы тайтина к трехтяжевой и двутяжевой симметриям толстых и тонких нитей (Bang et al., 2001).

Однако, несмотря на полученные результаты и сделанное заключение, мы до конца не были уверенными в том, что новые изоформы тайтина не являются результатом агрегации его более низкомолекулярных форм. В этом случае протеолитическое расщепление тайтина, сопровождающееся увеличением содержания его фрагментов, должно приводить к увеличению содержания более высокомолекулярных агрегатов этого белка. С целью проверки этого предположения нами были проведены эксперименты по протеолитическому расщеплению тайтина в мышечной ткани под действием эндогенных протеаз. Для этого небольшие кусочки мышечной ткани весом 20-30 мг выдерживались в течение 30-120 минут при температуре 25-30°С. По истечении заданного времени от мышечного образца брались кусочки весом 2-3 мг и помещались в солюбилизирующий раствор, содержащий ДСН, для экстракции белков с целью их дальнейшего электрофоретического тестирования. Результаты этого исследования представлены на рисунке 5.

m. solcu*

ЛЖ сердца

Ингак-гнмй T.

Иитактный T.

IBM-

Рис. 5. Изменения содержания тайтина в мышцах суслика под действием эндогенных протеаз. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.1 % Электрофореграмма: 1 - m. soleus (контроль); 2 - m soleus (протеолиз, 1 час); 3 - левый желудочек сердца (контроль); 4 - левый желудочек сердца (протеолиз, 30 мин.). Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина; Т2-фрагментов тайтина; N2B-, N2BA- и №А-иэоформ тайтина; тайтина с м.м. -3300 кДа (Т3300); новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина.

Протеолитические изменения в тайтине m. soleus суслика под действием эндогенных протеаз в течение 1 часа сопровождались уменьшением (в 6-7 раз) содержания новой изоформы интактного тайтина и двукратным уменьшением содержания известной №А-изоформы этого белка (рис. 5, дорожки 1-2). Эти изменения сопровождались появлением на электрофореграммах Т2-фрагмента, а также полосы тайтина с м.м. ~3300 кДа (Т3300), которая, предположительно, является продуктом деградации более высокомолекулярного интактного тайтина. Протеолитические изменения в тайтине сердечной мышцы суслика под действием эндогенных протеаз в течение 30 минут сопровождались уменьшением содержания в 2-3 раза новых интактных изоформ тайтина, а также известной Ы2ВА-изоформы этого белка. При этом наблюдалось увеличение содержания известной М2В-изоформы тайтина и его Т2-фрагментов (рис. 5, дорожки 3-4). Поскольку общее содержание тайтина (относительно содержания ТЦМ) в исследуемых мышцах в результате протеолиза не изменялось можно утверждать, что деградация более высокомолекулярных форм тайтина (в частности, новых изоформ этого белка, а также известных N2A- и Ы2ВА-изоформ тайтина) приводила к увеличению содержания более низкомолекулярных форм этого белка (в частности, N2B и Т2). Во-первых, полученные нами результаты показывают, что новые изоформы тайтина не являются агрегатами более низкомолекулярных форм этого белка (в частности, агрегатами Т1 и Т2, Granzier, Wang, 1993). Во-вторых, учитывая увеличение содержания известной ШВ-изоформы тайтина в процессе протеолитической деградации этого белка (рис. 5, дорожки 3-4), полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что новые, более высокомолекулярные формы тайтина являются интактными изоформами этого белка, тогда как известные изоформы тайтина являются его фрагментами. Окраску Ы2В-полосы тайтина антителами к N- и С-концам молекулы этого белка, полученную методом Вестерн-блоттинга (рис. 4, дорожки 2-3), можно объяснить тем, что в этой полосе присутствуют фрагменты интактных изоформ, содержащие как один, так и другой концы молекулы тайтина.

Протеолитические изменения в тайтине левого желудочка сердца суслика под действием эндогенных протеаз в течение двух часов сопровождались

полной деградацией новых интактных изоформ тайтина и известной N2BA-изоформы этого белка, а также уменьшением содержания (в ~2 раза) известной Ы2В-изоформы тайтина. При этом наблюдалось значительное увеличение содержания (в 5-7 раз) Т2-фрагментов тайтина (данные не показаны). В т. soleus после двухчасового протеолиза наблюдалось практически полное разрушение новой интактной изоформы тайтина и тайтина с м.м. -3300 кДа (Т3300), что сопровождалось появлением большого содержания Т2-фрагмента (данные не показаны). Однако при этом не было выявлено ожидаемого более значительного снижения содержания известной ША-изоформы тайтина, содержание которой хоть и было снижено (в -1.5 раза) по сравнению с контрольной мышцей, но было выше, чем в m. soleus после одночасового протеолиза (рис. 5, дорожки 1-2). Полученный результат можно объяснить тем, что в полосе известной Ы2А-изоформы тайтина (как и в Ы2В-изоформе, рис. 5, дорожка 4) содержатся фрагменты разрушения более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка.

Таким образом, результаты проведённых экспериментов подтверждают наше предположение о том, что известные изоформы тайтина, выявляемые электрофоретическими методами, могут являться фрагментами более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина. Почему эти формы тайтина были открыты в наших исследованиях? Ниже приведены результаты, в которых предлагаются ответы на этот вопрос.

1.2. Влияние нагревания и кипячения электрофоретических проб на содержание тайтина

Известно, что с целью лучшей солюбилизации белков в растворе, содержащем ДСН, а также для предотвращения возможной белковой агрегации проводится кипячение электрофоретических проб в течение нескольких минут перед проведением электрофореза. Многие исследователи тайтина также проводят кипячение электрофоретических проб перед тестированием этого белка методом ДСН-гель-электрофореза (Granzier, Irving, 1995; Cazorla et al. 1999; Trombitas et al., 2000; Tatsumi et al., 2001; Wu et al., 2002; Neagoe et al., 2002; 2003; Hunter et al., 2003; Opitz et al., 2004; Lahmers et al., 2004; Prado et al., 2005; Van Heerebeek et al., 2006; Jaber et al., 2008). При этом чтобы исключить вероятность протеолиза тайтина эндогенными мышечными протеазами при нагревании мышечного ДСН-экстракта, в солюбилизирующий раствор добавляются ингибиторы протеаз, в частности, леупептин или Е-64. Однако было показано, что кипячение электрофоретических проб приводит к разрушению тайтина, что сопровождается уменьшением содержания этого белка на электрофореграммах поперечно-полосатых мышц (King, Kurth, 1980; Granzier, Wang, 1993; Warren et al. 2003). Учитывая это, авторы рекомендовали исследователям, проводящим электрофоретическое изучение тайтина, не кипятить электрофоретические пробы, а только нагревать их при температуре 57-65°С (Granzier, Wang, 1993; Warren et al. 2003). Подобная термическая обработка электрофоретических проб, по данным этих авторов, не сопровождается температурными артефактами в содержании тайтина, а также необходима для лучшей экстракции тайтина из мышечной ткани и для разрушения возможно формирующихся более высокомолекулярных агрегатов

этого белка (Granzier, Wang, 1993). Не исключая до конца вероятность того, что более высокомолекулярные изоформы тайтина, обнаруженные нами, могут быть агрегатами этого белка, разрушение которых должно происходить при 57-65°С (Granzier, Wang, 1993), мы изучили влияние нагревания и кипячения электрофоретических проб (экстрактов мышечной ткани, полученных после 40-минутной инкубации мышц в солюбилизирующем буфере, содержащем ДСН), на содержание в них тайтина (рис. 6). Наши электрофоретические исследования показали, что 20-минутное выдерживание при 60-65°С ДСН-экстрактов мышечной ткани сердечной или скелетных мышц сопровождалось уменьшением (в ~2 раза) содержания, но не разрушением новых изоформ тайтина (рис. 6а), что не согласуется с данными зарубежных авторов (Granzier, Wang, 1993). Разрушение новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина, сопровождающееся их отсутствием на электрофореграммах изученных мышц, наблюдалось после предварительного нагревания электрофоретических проб в течение 5-10 минут при 75-80°С (данные не показаны). При этом наблюдалось, также, и значительное снижение (в 2-3 раза) содержания известных N2A-, N2B-и М2ВА-изоформ тайтина.

Иитатый Т.

, Интактиый 1.j N2BA

Тимш:р;п vjnt ( С) Время инкубации | мн ii.j

+25 30

+60-6Î 10

*> S

3SS ësÀTi

ИптйктяЫЙ Т.

тцм-

Тсмтрятуря ( С) +20 Время ннкубацни (мни.) 30

шщМ Р

N2BA — N2B

Рис. 6 Влияние нагревания и кипячения ДСН-экстрактов мышечной ткани (электрофоретических проб) на содержание тайтина. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида2.1 %. а - электрофореграмма левого желудочка сердца суслика. Справа приведены денситометрические профили полос тайтина. б - электрофореграмма предсердия суслика. Сверху приведены

денситометрические профили полос тайтина. Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина; Т2-фрагментов тайтина; Ы2В- и Ы2В/\-ичоформ тайтина; новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина.

Предварительная инкубация мышечных образцов проводилась в течение 30-40 минут при комнатной температуре (+20-25°С) в солюбилизирующем буфере, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1%ДСН, 10% глицерина, 80 мМ ДТТ, 8-10 мкг/мл леупептина и/или Е64, рН 6.8-7.0.

Полученные результаты, показывающие, что разрушение новых изоформ тайтина происходит наряду со значительным уменьшением содержания известных изоформ этого белка при температуре +80°С, не подтверждают «агрегатную» версию (Granzier, Wang, 1993) происхождения обнаруженных нами более высокомолекулярных изоформ тайтина. Следует обратить внимание на другой важный результат, полученный нами, который показал, что рекомендуемая зарубежными авторами предварительная термическая обработка электрофоретических проб при 60-65°С также^ как и кипячение^ сопровождается появлением артефактов в содержании тайтина. В частности, 20-минутное выдерживание при 60-65°С ДСН-экстрактов мышечной ткани

сердечной мышцы суслика сопровождалось изменением в соотношении известных N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина на электрофореграммах этой мышцы (рис. ба, см. денситограммы). Рекомендуемая нами максимальная температура нагревания электрофоретических проб, при которой на электрофореграммах исследуемых мышц не было выявлено изменений в содержании тайтина, составляет 35°С.

Кипячение электрофоретических проб приводило к уменьшению (в 3-7 раз) содержания известных N2A-, N2B- и №ВА-изоформ тайтина, а также разрушению более высокомолекулярных изоформ этого белка, что регистрировалось нами на электрофореграммах сердечной и скелетных мышц животных (рис. 66). При этом была выявлена прямая зависимость между продолжительностью кипячения электрофоретической пробы и снижением содержания известных изоформ тайтина (рис. 66).

Таким образом, результаты наших исследований показали, что не только кипячение, но и рекомендуемое зарубежными авторами (Granzier, Wang, 1993; Warren et al. 2003) нагревание электрофоретических проб при 60-65°С сопровождается появлением артефактов в содержании тайтина, выявляемых электрофоретическими методами. По нашим данным максимальная температура нагревания электрофоретических проб, при которой исключаются артефакты в содержании тайтина, составляет 35°С. При этом температура 25-30°С является оптимальной для проведения ДСН-экстракции белков из мышечной ткани с целью дальнейшего электрофоретического тестирования тайтина. Учитывая полученные нами результаты можно говорить о необходимости критического пересмотра имеющихся в научной литературе данных о качественном и количественном составе тайтина в мышцах человека и животных в норме и его изменениях при адаптационных и патологических процессах.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТАЙТИНА СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРОЛИКА И СУСЛИКА В НОРМЕ

Обнаружение нами в поперечно-полосатых мышцах животных и человека более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина определило наш интерес к изучению in vitro их структурно-функциональных свойств. Результаты этих экспериментов описаны ниже.

2.1. Электронно-микроскопическое изучение молекулярных параметров и агрегационных свойств молекул тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика

Первые электронно-микроскопические исследования молекулярных параметров (формы и размеров молекул) тайтина скелетных мышц животных были проведены в середине 80-х годов прошлого века (Trinick et al., 1984; Wang et al., 1984; Maruyama, 1986). Было показано, что молекула тайтина имеет вид длинной гибкой нити диаметром 3-4 нм с глобулярной головкой на одном конце. Большая часть молекул тайтина имела длину 600-700 нм (Trinick et al., 1984; Wang et al., 1984; Maruyama, 1986). Однако разброс длин выделенных молекул тайтина составлял -0.2-1.1 микрона (Wang et al., 1984), что

свидетельствовало о значительной деградации тайтина во время выделительных процедур. Один из первооткрывателей коннектина (тайтина) К. Маруяма писал: «К настоящему моменту все наши попытки выделить интактную молекулу альфа-коннектина оказались безуспешны.... Всё, что было выделено группами из Японии, Великобритании и США является протеолитическими продуктами - бета-коннектином» (Maruyama, 1986). В последующие годы попытки выделения интактных изоформ тайтина не прекращались и, по заявлению ряда авторов, интактный тайтин (а именно, Т1 или альфа-коннектин) был успешно выделен из сердечной и скелетных мышц кролика (Kimura et al., 1992; Soteriou et al., 1993; Suzuki et al., 1994; Tskhovrebova, Trinick, 1997; Leake et al., 2004), а также из сердечной мышцы быка (Pan et al., 1994). Поводом для такого утверждения послужили результаты измерений длины одиночных выпрямленных молекул тайтина, полученных методом электронной микроскопии, которые показали, что средняя длина молекул тайтина составляет 850-950 нм (Tskhovrebova, Trinick, 1997). При этом длина отдельных молекул тайтина была 1.0-1.2 мкм. Успешное выделение интактного тайтина связано с использованием при выделении этого белка ингибиторов Са2+-зависимых протеаз (леупептина и Е-64). Однако разброс длин выделенных молекул тайтина оставался высоким и составлял 0.7-1.2 микрона (Tskhovrebova, Trinick, 1997).

Рис. 7. Электронные микрофотографии одиночных выпрямленных молекул тайтина скелетных мышц кролика в растворе 0.5 М КС1, 10 мМ имидазол, 50% глицерин, рН 7.0, полученных методом кругового оттенения платиной. Шкала - 200 нм.

Основной нашей целью в этой серии экспериментов являлось выделение новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина, обнаруженных нами в поперечно-полосатых мышцах человека и животных, и изучение их структурно-функциональных свойств. Для этого мы провели выделение и очистку тайтина из быстрой (m. psoas) и медленной (т. soleus) скелетных мышц кролика, из скелетных мышц спины и нижних конечностей суслика, а также из сердечной мышцы этих животных по методу (Soteriou et al., 1993), позволяющему получать интактный тайтин. По данным электронной микроскопии при низких значениях ионной силы (jj<0. 12) тайтин образует плотные пучки линейных фибрилл или аморфные агрегаты, что согласуется с данными других авторов (Koretz et al., 1993). Одиночные выпрямленные

молекулы тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика имеют вид длинной гибкой нити диаметром 3-4 нм с глобулярной головкой на одном конце (рис. 7), что согласуется с литературными данными для тайтина кролика (Tskhovrebova, Trinick, 1997). По нашим данным длина одиночных молекул тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика варьировала в диапазоне 0.6-1.1 мкм, однако большинство молекул имело длину 800-900 нм, что также согласуется с литературными данными для интактного Т1 (Tskhovrebova, Trinick, 1997). Разброс в длинах молекул тайтина можно объяснить вероятностью запыления металлом концевых частей тайтиновых молекул при подготовке препаратов к электронной микроскопии.

С помощью ДСН-электрофореза в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et al., 1989) с нашими модификациями, а также Вестерн-блоттинга была подтверждена интактность выделенного нами тайтина (рис. 8). Полученные результаты согласуются с данными других авторов, которые, используя выше указанный электрофоретический метод, показали, что молекулы тайтина, выделенные как из скелетных мышц кролика (Soteriou et al., 1993), так и сердечной мышцы быка (Pan et al., 1994) со средней длиной -800-900 нм, являются интактными молекулами этого белка, электрофоретическая подвижность которых соответствует таковой для интактного Т1. Однако поскольку 7% полиакриламидные гели непригодны для исследования высокомолекулярных изоформ интактного тайтина, мы провели электрофоретический анализ очищенных препаратов тайтина в 2% полиакриламидном вертикальном мини-геле с добавлением агарозы. Результаты этого исследования оказались неожиданными.

Рис. 8. Электрофоретическое тестирование очищенного препарата тайтина в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et al., 1989) с нашими модификациями и Вестерн-блоттинг.

Электрофореграмма: 1 - m. soleus кролика; 2 -очищенный препарат тайтина m. soleus кролика. Вестерн-блоттинг (3) препарата очищенного тайтина m. soleus кролика с моноклональными антителами Til (Sigma) к участку молекулы тайтина, расположенной в I-зоне саркомера. ТЦМ - тяжйлые цепи миозина; Т1 - интактный тайтин-1; Т2 - протеолитический фрагмент Т1.

подвижность тайтина, выделенного как из быстрой (m. psoas), так и медленной (m. soleus) скелетных мышц кролика, а также из скелетных мышц суслика, соответствует электрофоретической подвижности Т2-фрагментов тайтина с м.м. ~2000-2100 кДа (данные не показаны). Электрофоретическим методом в выделенных препаратах тайтина скелетных мышц указанных животных не было обнаружено присутствия известной Ы2А-изоформы тайтина, а также более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка. Препараты сердечного

Т1_

Небулин

ТЦМ

Х-бч-.мж

■ :! i 3

1 2

Было обнаружено, что элект)

тайтина содержали -95% Т2-фрагментов и -5% известной NlB-изоформы этого белка. Перефразируя слова К. Маруямы, можно сказать, что к настоящему моменту все наши попытки выделить новые, более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина оказались безуспешны. Более того, можно сделать заключение о том, что до сих пор остаются безуспешными попытки выделения известных (N2A, N2BA, N2B) изоформ тайтина в количестве, достаточном для изучения их структурно-функциональных свойств. Наши результаты показывают, что все in vitro исследования структуры и функции тайтина проведены на препаратах этого белка, состоящих на -95% из Т2-фрагментов с незначительным содержанием (-5%) известных изоформ этого белка (в частности, N2B).

Таким образом, вследствие невозможности выделения открытых нами более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина, изучение их структурно-функциональных свойств является пока невыполнимой задачей. Однако мы впервые провели сравнительные in vitro исследования функциональных свойств (в частности, влияния на АТФазную активность и Са2+-чувствительность актомиозина) Т2-фрагментов, выделенных из сердечной и скелетных (m. psoas и т. soleus) мышц кролика, а также изучили связывание этих форм тайтина с актином. Результаты этих исследований представлены ниже.

2.2. Влияние тайтина поперечно-полосатых мышц кролика п суслика на структуру миозиновых нитей и на АТФазную активность и Са2+-чувствителыюсть реконструированного актомиозина

Миозин поперечно-полосатых мышц кролика и суслика при диализе в условиях, близких к физиологическим, образует биполярные веретенообразные нити с осевым периодом -14 им, свойственным толстым нитям in vivo. Добавление тайтина как сердечной, так и скелетных мышц исследуемых животных приводит к пучкованию миозиновых нитей, что указывает на in vitro связывание этих белков, которое имеет место и в мышце. Наши электронно-микроскопические наблюдения подтверждают данные других авторов о связывании тайтина с миозиновыми нитями (Kimura et al., 1984; Maruyama, 1986). Результаты этих исследований совместно с данными о локализации тайтина в саркомере (Fürst et al., 1988; 1989), а также с данными о связывании тайтина с лёгким меромиозином, формирующим ствол миозиновых нитей (Houmeida et al., 1995), указывают на структурную роль этого белка в мышцах позвоночных.

С целью проверки предположения об участии тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце мы провели эксперименты по его влиянию на основные свойства реконструированного актомиозина (AM): АТФазную активность и Са2+-чувствительность. Из литературных данных известно, что при ц=0.08 тайтин скелетных мышц цыплёнка оказывает незначительный активирующий эффект на АТФазу AM (Kimura et al., 1984). Однако при условиях, близким к физиологическим, подобных исследований с тайтином скелетных, а также сердечных мышц проведено не было. Более того, не было исследовано влияние тайтина поперечно-полосатых мышц на Са2+-чувствительность актомиозиновой системы. На этом свойстве AM следует

остановиться более подробно. Известно, что in vivo запуск сокращения скелетных и сердечных мышц инициируется присоединением Са2+ к тропонину С тропонин-тропомиозинового комплекса, локализованного на тонких нитях (Ebashi, Endo, 1968). Как следствие, исследователи Са2+-регуляции мышечного сокращения акцентируют основное внимание на тонких нитях и уточняют ту или иную модель регуляции «актинового типа». В то же время, роль миозина в регуляции сокращения поперечно-полосатых мышц позвоночных до сих пор не выяснена. Предполагается, что в этих мышцах он выполняет «модулирующую» функцию, т.е., не имея принципиального значения при Са2+-запуске сокращения, он способен при определенных условиях контролировать динамику сократительного акта. Полученные в нашей лаборатории данные показали, что при физиологической ионной силе (ц=0.12) и pH 7.0 актин-активируемая АТФаза миозина поперечно-полосатых мышц обладает Са2+-чувствительностью при изменении рСа от 7.5 до 4.6 (Малышев и др., 2010). В частности, Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы скелетного миозина в большинстве случаев составляла 30-50% (т.е. наблюдалась активация в -1.3-1.5 раза актин-активируемой АТФазной активности миозина in vitro при увеличении концентрации Са2+ в растворе). Электронно-микроскопические исследования эффектов Са2+ на структурное поведение миозиновых мостиков показали, что скелетный и сердечный миозин обладают также и структурной Са2+-чувствительностью (Podlubnaya et al., 1999; 2000). Она выражается в отходе миозиновых мостиков от ствола реконструированной нити при изменении рСа от 7.5 до 4.6, в результате чего нарушается осевая периодичность в расположении ярусов миозиновых мостиков на поверхности нити (переход «порядок-беспорядок»).

Мы изучили влияние тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика на основные свойства реконструированного актомиозина: АТФазную активность и Са2+-чувствительность. Показано, что в присутствии тайтина как сердечной, так и скелетных (m. psoas, т. soleus) мышц кролика и суслика наблюдается увеличение АТФазной активности AM в -1.2-1.7 раза. При этом только в присутствии тайтина скелетных мышц исследуемых животных наблюдалось увеличение Са2+-чувствительности актин-активируемой АТФазы миозина. Необходимо отметить, что активирующий эффект тайтина на основные свойства AM проявлялся только в том случае, когда миозиновые нити формировались диализом (р=0.12) в присутствии тайтина. В случае добавления тайтина к сформированным нитям миозина непосредственно перед измерением ферментативной активности и Са2+-чувствительности миозина наблюдался ингибирующий эффект тайтина на эти свойства AM. Учитывая эти результаты можно предположить, что обнаруженный нами активирующий эффект тайтина на основные свойства реконструированного актомиозина связан не с прямым влиянием самого тайтина на заряд или структуру миозиновых мостиков, а проявляется через опосредованное участие тайтина в формировании миозиновых нитей с более нативной структурой, чем таковая у нитей, состоящих из одного миозина. Однако непосредственного влияния тайтина на движение миозиновых мостиков в реконструированных нитях миозина исключить нельзя. В поддержку этого предположения можно

привести данные in vitro экспериментов, показывающие связывание FnlH доменов А-области тайтина с субфрагментом-1 миозина (Muhle-Goll et al., 2001). Авторами высказывается предположение, что это связывание может вносить вклад в снижение Са2+-чувствительности актомиозинового взаимодействия при укорочении мышцы.

Итак, обнаруженное нами влияние тайтина на основные функциональные свойства миозина подтверждает предположение об участии этого белка в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце. Ниже приведены результаты наших исследований по связыванию тайтина с актиновыми нитями, которые также подтверждают важную роль тайтина в регуляции мышечного сокращения.

2.3. Взаимодействие тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика с Ф-актином

Ранее было высказано предположение, что тайтин способен слабо связываться с тонкими нитями (Maruyama et al., 1987; Funatsu et al., 1993). Данные электронно-микроскопических исследований, включающих избирательное удаление тонких нитей из миофибрилл, показали, что с актиновыми нитями может взаимодействовать часть тайтиновой молекулы, расположенная вблизи Z-диска саркомера (Trombitäs, Pollack, 1993; Trombitäs et al., 1997). Несколько проведенных in vitro исследований показали способность фрагментов I-области тайтина скелетных и сердечных мышц связываться с актином (Astier et al., 1998; Jin, 2000; Gutierrez-Cruz et al., 2001; Kulke et al., 2001; Linke et al., 2002; Raynaud et al., 2004; Niederlander et al., 2004; Bianco et al., 2008). Однако прямого подтверждения связывания выделенных молекул тайтина с актином in vitro предоставлено не было. Нами было проведено электронно-микроскопическое изучение in vitro взаимодействия тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика с упорядоченными пучками Ф-актина, т.е. паракристаллами (ПК), сформированными в растворе 50 мМ MgCl2, 5 мМ имидазол-HCl, pH 7.0. По данным электронной микроскопии паракристаллы имеют ширину 50-200 нм и достигают в длину нескольких микрон. Они образованы бок-о-бок упакованными нитями актина и имеют тупые концы. Наблюдается плотная упорядоченная упаковка субъединиц актина в нитях с периодом 36-38 нм. Связывание тайтина с ПК актина должно было приводить к изменению их структуры. Действительно, добавление тайтина, выделенного как из сердечной, так и скелетных мышц животных, к актину в весовом соотношении 1:2, 1:1 во время формирования ПК или к уже сформированным ПК приводило к снижению размеров паракристаллов, нарушению упорядоченной упаковки нитей в ПК и образованию рыхлых агрегатов с заостренными концами. Также отмечалось большое количество одиночных актиновых нитей.

Наблюдаемое нами in vitro связывание тайтина с актином может быть реализовано в мышце, и быть даже более сильным, чем связывание этих белков в in vitro экспериментах. Для формирования плотной упаковки актиновых нитей в паракристаллы нами использованы достаточно высокие концентрации ионов Mg2+ (50 мМ). Наши эксперименты показали, что тайтин успешно конкурирует с магнием за связывание с актином и нарушает упорядоченную

структуру ПК. Вследствие этого можно предположить, что при низких концентрациях иона магния в клетке (всего несколько мМ) взаимодействие тайтина с актином будет сильнее. Физиологическое значение связывания тайтина с актиновыми нитями в саркомерах сердечной и скелетных мышц может заключаться в его влиянии на регуляцию актин-миозинового взаимодействия. В частности, в искусственных системах подвижности показано, что связывание PEVK-фрагмента сердечного тайтина с актином замедляет скольжение актиновых нитей относительно миозина (Kulke et al., 2001; Linke et al., 2002). Это взаимодействие in vitro ингибируется Ca2+-связывающим белком S100/A1 (Yamasaki et al., 2001). На основании полученных данных высказывается предположение о существовании в сердечной мышце Са2+-зависимого механизма регуляции тайтин-актинового взаимодействия (Kulke et al., 2001; Yamasaki et al., 2001; Linke et al., 2002). Предполагается также, что в случае связывания тайтина с актином в 1-диске саркомера, упруго-эластичные свойства тайтина могут быть задействованы в запуске мышечного сокращения. В частности, полагают, что развитие I-областью тайтина, соединяющей концы миозиновых нитей с нитями актина, пассивного натяжения при растяжении саркомера может приводить к уменьшению расстояния между толстыми и тонкими нитями, вследствие чего возрастёт вероятность взаимодействия головок миозина с актином (Cazorla et al., 1999; Le Guennec et al., 2000; Cazorla et al., 2001; Helmes et al., 2003; Fukuda et al., 2005a; E. Lee et al., 2010). При этом, как мы полагаем, нельзя исключить прямого влияния тайтина на движение миозиновых мостиков. Результаты наших in vitro экспериментов, выявивших увеличение Са2+-чувствительности актин-активируемой АТФазы миозина в присутствии тайтина (см. пункт 2.2), не противоречат этому предположению.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТАЙТИНА В СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ SPERMOPHILUS UNDULATUS

Исследования структурно-функциональных свойств тайтина в мышцах млекопитающих в норме, описанные выше, определили наш интерес к изучению сезонных изменений свойств этого белка в мышцах зимоспящих сусликов и их вклада в адаптацию мышечной системы к условиям гибернации. Особое внимание было уделено изучению изменений качественного и количественного состава открытых нами более высокомолекулярных изоформ тайтина в мышцах сусликов. Проведённые сравнительные исследования структурно-функциональных свойств тайтина, выделенного из сердечной и скелетных мышц сусликов в разных состояниях активности (спячка, пробуждение, зимняя и летняя активность), не выявили сезонных различий в форме, размерах и агрегационных свойствах молекул этого белка, а также в эффектах тайтина на структуру паракристаллов актина in vitro. Не было также обнаружено различий в структуре миозиновых нитей, сформированных в присутствии тайтина, выделенного из сердечной и скелетных мышц сусликов в разных физиологических состояниях. Не выявлено сезонных различий в активирующем эффекте тайтина сердечной мышцы сусликов на АТФазную

зо

активность AM. Однако обнаружены сезонные различия влияния тайтина скелетных мышц сусликов на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина.

3.1. Сезонные изменения функциональных свойств тайтина скелетных мышц сусликов: влияние на АТФазную активность и Са2+-чувствителыюсть реконструированного актомиозина

Подобно эффектам тайтина скелетных мышц кролика на основные функциональные свойства AM, в присутствии тайтина скелетных мышц активных сусликов также обнаружено увеличение актин-активируемой АТФазы миозина в -1.2-1.5 раза (при рСа 7.5) и в -1.3-1.7 раза (при рСа 4.6) и повышение её Са2+-чувствительности. Аналогичные эффекты на основные функциональные свойства AM оказывал тайтин, выделенный из скелетных мышц пробуждающихся сусликов с ректальной температурой 25-27°С. В присутствии тайтина скелетных мышц спящих, а также пробуждающихся сусликов с ректальной температурой 10-15°С наблюдалось уменьшение его активирующего эффекта на АТФазу AM и снижение чувствительности системы к кальцию. В ряде случаев выявлено ингибирующее влияние тайтина на АТФазу AM. Полученные результаты могут свидетельствовать о вкладе тайтина в ингибирование сократительной активности скелетных мышц сусликов при зимней спячке. Поскольку известна способность тайтина поперечно-полосатых мышц животных фосфорилироваться в условиях in vivo (Sommerville, Wang, 1987; 1988), мы предположили, что изменение степени фосфорилирования тайтина в мышцах суслика при зимней спячке могло быть причиной различий в эффектах этого белка на основные функциональные свойства AM. Результаты проверки этого предположения представлены в следующем разделе.

3.2. Сезонные изменения степени фосфорилирования тайтина скелетных мышц сусликов

Известно, что часть тайтина, расположенная в М-линии саркомера, содержит фосфорилируемые участки (KSP-последователыюсти), фосфорилирование которых может иметь значение при сборке М-линии во время миогенеза (Gautel et al., 1993; Obermann et al., 1996). Учитывая способность Т2, связанного в М-линии и A-диске саркомера с миозиновыми нитями, фосфорилироваться in vitro (Takano-Ohmuro et al., 1992), мы провели эксперименты по фосфорилированию выделенных препаратов Т2 скелетных мышц сусликов в присутствии радиоактивного изотопа 7-[32Р]АТФ с использованием каталитической субъединицы протеинкиназы А. С помощью авторадиографии показана способность тайтина скелетных мышц сусликов к фосфорилированию in vitro и выявлены сезонные различия в степени фосфорилирования этого белка. Денситометрия белковых полос на электрофореграммах и пятен на авторадиограммах показала, что препараты тайтина из скелетных мышц активных сусликов содержат в —1.7 раза больше радиоактивного изотопа у-[32Р]АТФ, чем препараты тайтина из мышц спящих животных (данные не показаны). На основе полученных данных было сделано предположение об увеличении степени фосфорилирования тайтина in vivo в

мышцах сусликов в период зимней спячки. Вследствие этого тайтин, выделенный из скелетных мышц спящих сусликов, имеет меньше свободных участков связывания для неорганического фосфата и потому в меньшей степени фосфорилируется in vitro, чем тайтин скелетных мышц активных сусликов. Результаты проведенного анализа содержания фосфата, связанного с тайтином скелетных мышц активных и спящих сусликов, по методу, описанному в работе (Somerville, Wang, 1988), полностью подтвердили это предположение. Обнаружено, что тайтин из мышц гибернирующих сусликов содержит в ~1.5 раза (п=3) больше связанного с ним фосфата, чем тайтин из мышц активных животных. Полученные нами данные свидетельствуют об увеличении уровня фосфорилирования тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке, что, в свою очередь, может являться причиной сезонных изменений функциональных свойств этого белка. Для подтверждения этого предположения было изучено влияние фосфорилированного in vitro тайтина, выделенного из скелетных мышц и активных, и спящих сусликов, на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина. Результаты наших измерений показали ожидаемое уменьшение активирующего эффекта тайтина, фосфорилированного in vitro, на основные свойства реконструированного AM.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что увеличение степени фосфорилирования тайтина при гибернации вносит вклад в подавление двигательной активности скелетных мышц сусликов в этот период. Эти результаты согласуются с полученными в нашей лаборатории данными, свидетельствующими об увеличении степени фосфорилирования Х-белка (Вихлянцев, Подлубная, 2003) и снижении степени фосфорилирования ЛЦ2 миозина (Зуйкова и др., 2005) в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке, что также направлено на угнетение АТФазных свойств миозина в этот период.

В наших исследованиях не было обнаружено сезонных различий в степени фосфорилирования тайтина, выделенного из сердечной мышцы сусликов. Однако мы выявили сезонные изменения качественного и количественного состава известных N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина и более высокомолекулярных изоформ этого белка в миокарде сусликов. Результаты этих исследований представлены ниже.

3.3. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах сусликов

На рисунках 9, 10 и в таблицах 1,2 представлены результаты исследования сезонных изменений качественного и количественного состава тайтина в разных отделах сердца зимоспящих сусликов. В предсердиях и желудочках сердца спящих сусликов выявлено двукратное увеличение содержания известной Ы2ВА-изоформы тайтина по отношению к содержанию известной ШВ-изоформы этого белка в сравнении с содержанием этих форм тайтина в сердце активных летних животных (рис. 9; табл. 1,2). Подобные изменения в содержании были характерны и для более высокомолекулярных интактных N2BA- и Ы2В-изоформ этого белка (рис. 10).

Шггаьлный тайгин

N2BA__

■ т —Т2 '12

Рис. 9. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в левом желудочке сердца сусликов. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.3%. Электрофореграммы левого желудочка сердца сусликов: 1-активный летний суслик; 2-активный осенний суслик; 3-спящий суслик; 4-пробуждающийся суслик (температура сердечной мышцы +30°С); 5-активныЙ зимний суслик (сутки после выхода из спячки); 6-входящий в спячку суслик. Вестерн-блоттинг с антителами AB5 к тайтину: 7-активный летний суслик; 8-спящий суслик. Указаны белковые полосы: Т2-фрагментов тайтина; N2B- и Ы2ВА-изоформ тайтина; более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина. Над электрофореграммами приведены денситометрические профили полос тайтина.

Ин гактиан Х2ВА-изоформа Иитактпаи ^^ N2 В-и зоформ л

Иш актам Г^ВА-пзофор.ма Иптактман ШВ~изоформа

Рис. 10. Сезонные изменения в соотношении новых более высокомолекулярных интактных Ы2ВА- и Ы2В-изоформ тайтина в левом желудочке сердца суслика. Электрофорез проведен в вертикальном геле размером 14.5*16.0 см с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 1.9 %.

1-левый желудочек активного летнего суслика. По данным денситометрии отношение содержания интактной Ы2ВА-изоформы тайтина к содержанию интактной Ы2В-изоформы составило -0.221; отношение содержания известной Ы2ВА-формы тайтина к содержанию известной Ы2В-формы составило -0.210.

2-левый желудочек спящего суслика. По данным денситометрии отношение содержания интактной Ы2ВА-изоформы тайтина к содержанию интактной №В-изоформы составило -0.326; отношение содержания известной №ВА-формы тайтина к содержанию известной М2В-формы составило -0.320.

Каков физиологический смысл обнаруженной нами перестройки изоформного состава тайтина в сердце сусликов при гибернации? Известно, что высокое содержание Ы2ВА-изоформы тайтина, имеющей более длинную последовательность из иммуноглобулин-подобных доменов в 1-диске саркомера, чем Ы2В-изоформа, коррелирует с большей эластичностью и, следовательно, растяжимостью сердечной мышцы, что, по закону Франка-Старлинга, приводит к увеличению силы сердечных сокращений (СагоНа й а!., 2000). Мы полагаем, что увеличение доли длинной Ы2ВА-изоформы тайтина в разных отделах сердечной мышцы сусликов имеет адаптационное значение, направленное на усиление сократительного ответа миокарда с целью выброса более вязкой крови (МсАпЬиг й а1., 1992; Кличханов, 2001) из камер сердца в период гибернации и при пробуждении животного. Наш вывод согласуется с данными других авторов, показывающими, что, несмотря на падение частоты

сокращений сердца, сила единичного сокращения у спящего суслика немного больше, чем у суслика в период активности (Wang et al., 2002). Усиление сократительного ответа сердечной мышцы у спящего суслика авторы объясняют повышением вязкости крови и увеличением периферического сопротивления сосудов в условиях гипотермии.

Табл. 1. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в предсердиях сусликов

Циклы сезонной активности сусликов Интактный т./тцм N2BA/ ТЦМ N2B/ ТЦМ N2BA/ N2B Т2/ ТЦМ

Летняя активность (май-сентябрь), п= 5 0.031± 0.007 0.041± 0.003 0.067± 0.009 0.618± 0.062 0.046± 0.014

Осенняя активность (октябрь-середина ноября), л= б 0.036± 0.008 0.046± 0.006 0.062± 0.012 0.755± 0.089* 0.060± 0.017

Спячка (гибернация) (конец ноября-март), п= 11 0.032± 0.008 0.03 8± 0.007 0.043± 0.011* 0.908± 0.166* 0.026± 0.009*

Пробуждение (температура сердечной мышцы +25-32°С), п= 6 0.029± 0.006 0.044± 0.009 0.048± 0.010* 0.942± 0.144* 0.029± 0.013

Зимняя активность (2 часа после пробуждения), п= 5 0.030± 0.004 0.046± 0.006 0.051± 0.006 0.902± 0.051* 0.042± 0.012

Зимняя активность (1-2 суток активности между баутами спячки), п= 6 0.034± 0.007 0.050± 0.004 0.056± 0.006 0.893± 0.076* 0.045± 0.009

Вход в спячку, п=5 0.033± 0.006 0.056± 0.012* 0.061± 0.005 0.929± 0.256* 0.048± 0.018

Табл. 2. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в правом желудочке сердца сусликов

Циклы сезонной активности сусликов Интактный Т./ТЦМ N2BA/ ТЦМ N2B/ ТЦМ N2BA/ N2B Т2/ ТЦМ

Летняя активность (май-сентябрь), п= 5 0.037± 0.008 0.015± 0.004 0.082± 0.011 0.182± 0.036 0.024± 0.009

Осенняя активность (октябрь-середина ноября), п= 4 0.03 8± 0.008 0.022± 0.002* 0.072± 0.008 0.320± 0.021* 0.028± 0.006

Спячка(гнбернация) (конец ноября-март), п=8 0.040± 0.010 0.023± 0.010 0.054± 0.011 0.422± 0.145* 0.018± 0.010

Пробуждение (температура сердечной мышцы +25-32°С), п= 4 0.042± 0.004 0.032± 0.007* 0.067± 0.007 0.494± 0.162* 0.036± 0.005

Зимняя активность (2 часа после пробуждения), п= 4 0.039± 0.005 0.033± 0.003* 0.077± 0.004 0.438± 0.051* 0.030± 0.006

Зимняя активность (1-2 суток активности между баутами спячки), п= 4 0.040± 0.006 0.032± 0.006* 0.078± 0.006 0.422± 0.102* 0.030± 0.003

Вход в спячку, п=4 0.041± 0.007 0.032± 0.005* 0.070± 0.004 0.463± 0.058* 0.030± 0.004

Примечание: * — уровень значимости р<0.05 (сравнение с группой активных летних сусликов).

Интактный Т. - более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина.

Увеличение доли длинной Ы2ВА-изоформы тайтина в предсердиях и желудочках сердца спящих сусликов будет приводить к увеличению эластичности сердечной мышцы, что может адаптировать работу миокарда к повышенной нагрузке в период выхода животного из спячки, когда частота сердечных сокращений достигает более 400 уд/мин (Игнатьев и др., 2001). Это предположение подтверждается данными, показывающими, что увеличение ЧСС и сердечного выброса вследствие ß-адренергической стимуляции сопровождается снижением жёсткости сердечных изоформ тайтина посредством фосфорилирования их уникальных N2B- и N2A-последовательностей (Yamasaki et al., 2002; Fukuda et al., 2005; Krüger et al., 2009). Эти изменения приводят к уменьшению пассивной силы, развиваемой тайтином при растяжении кардиомиоцитов, и, по мнению авторов, способствуют более быстрому и полному наполнению камер сердца кровью при ß-адренергической стимуляции (Fukuda et al., 2005; Krüger et al., 2009).

На фоне выявленного нами увеличения доли длинных И2ВА-изоформ тайтина в разных отделах сердечной мышцы спящих сусликов обнаружено снижение в -1.3-1.5 раза общего содержания известных N2BА- и Ы2В-изоформ тайтина, а также в -1.5-2 раза содержания Т2 в сравнении с содержанием этих форм тайтина в миокарде активных летних животных (рис. 9; табл. 1,2). Подобное снижение в -1.3-1.5 раза содержания известной NlA-изоформы тайтина и в -3 раза содержания Т2 обнаружено в скелетных мышцах soleus и psoas спящих сусликов (данные не показаны). При этом в исследуемых сердечной и скелетных мышцах спящих сусликов не изменялось содержание более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина (табл. 1,2).

Почему в мышцах сусликов при спячке происходит уменьшение содержания тайтина, в частности, известных N2A-, N2BA-, Ы2В-изоформ и Т2? Известно, что при гибернации в разных органах сусликов процесс трансляции ингибируется как за счёт инактивации факторов инициации (eIF-2) и элонгации (eEF-2) путем обратимого фосфорилирования (Frerichs et al., 1998; Chen et al., 2001), так и за счёт уменьшения фракции полисом (Knight et al., 2000). Эти данные согласуются с результатами in vivo исследования включения меченых аминокислот в белки, показавшими сильное ингибирование (более чем в 200 раз) синтеза белка в сердце сусликов в период спячки (Zhegunov et al., 1988). Во время спячки ингибируется также и протеолитическая активность на уровне протеосом (Velickovska et al., 2005). Однако развитие атрофических процессов в мышцах (в частности, в скелетных) гибернирующих животных (Wickler et al., 1991; Steffen et al., 1991; Agostini et al., 1991) свидетельствует о преобладании катаболических процессов над анаболическими в гибернационный период. Учитывая, что полупериод жизни тайтина составляет 3 суток (Isaacs et al., 1989), можно предположить, что выявленное нами снижение (в -1.5 раза) содержания N2A-, N2BA-, N2В-форм тайтина и Т2 в мышцах гибернирующих сусликов является следствием заингибированного, но не подавленного полностью протеолиза тайтина при отсутствии синтеза этого белка в период баута спячки, длящегося 7-14 суток. Ферменты, ответственные за протеолиз тайтина, это, по всей вероятности, Са2+-зависимые протеазы кальпаины (Göll et al., 2008).

Каковы возможные последствия снижения содержания тайтина в мышцах спящих сусликов? Показано, что уменьшение (в -1.5-2 раза) содержания Т1 в скинированных волокнах скелетных мышц кролика в результате действия ионизирующей радиации сопровождалось нарушениями упорядоченной структуры саркомеров (в частности, смещением А-дисков к Z-линии, появлением более широких А-зон саркомера с неровными краями), а также снижением силы при развитии сокращения (Horowits et al., 1986). Подобные нарушения структурно-функциональных свойств наблюдались в скинированных волокнах скелетной мышцы лягушки после протеолитической деградации коннектина (тайтина) (Higuchi, 1992). Учитывая эти данные, можно было ожидать нарушения структурно-функциональных свойств и в мышцах спящих сусликов, вследствие уменьшения содержания тайтина. Однако, по данным литературы, в мышцах зимоспящих животных подобных негативных изменений не наблюдается. В частности, в поперечно-полосатых мышцах

гибернантов (в том числе и зимоспящих сусликов) не обнаружено нарушений упорядоченной структуры миофиламентов в период спячки (Клика, Зайцова, 1984; Хромов и др., 1987; Steffen et al., 1993; Козлова, Юрченко, 1996). Не обнаружено изменений сократительных параметров (максимальной скорости сокращения, времени сокращения, полупериода расслабления мышцы, латентного периода), измеренных при температурах 22°С и 37°С, медленных и быстрых скелетных мышц активных и спящих хомяков (Mesocricetus auratus) (Viskocil, Gutmann, 1977). Не было выявлено достоверных отличий в указанных выше параметрах мышечного сокращения, а также значительного снижения силы сокращения скелетных мышц чёрного медведя {Ursus americanus) в состояниях спячки и активности (Tinker et al., 1998; Lohuis et al., 2007). He обнаружено изменений Са2+-активируемого напряжения, развиваемого одиночными демембранизированными волокнами скелетной мышцы psoas вышедшего из спячки суслика (Spermophilus undulatus), по сравнению с таковым параметром, измеренным на волокнах указанной мышцы активных животных (Хромов и др., 1987). Не зарегистрировано изменений сократительных параметров, в частности, силы сокращения, измеренных при 25°С, скелетных мышц активных, спящих и пробуждающихся летучих мышей (Murina leucogaster ognevi) (Lee et al., 2008). Показано, что, несмотря на 25% снижение массы миокарда и -10-15% снижение общего содержания известных N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина у гибернирующего медведя (Ursus arctos horribilis), такие характеристики сокращения сердечной мышцы, как диастолический объём, ударный объём и фракция выброса ЛЖ не изменялись в период спячки (Nelson et al., 2008). Известны данные, показывающие, что сила единичного сокращения сердечной мышцы спящего суслика (Citellus dauricus) немного больше, чем у суслика в период активности (Wang et al., 2002). Эти данные могут свидетельствовать об отсутствии структурных нарушений в миокарде этих животных в период спячки. Не выявлено снижения сократительной способности папиллярной мышцы сердца у пробуждающихся (температура сердечной мышцы +25-30°С) и вышедших из спячки сусликов Spermophilus undulatus (Nakipova et al., 2007), что также может свидетельствовать об отсутствии структурных нарушений в этой мышце. Как объяснить явное противоречие, заключающееся в том, что, несмотря на уменьшение содержания тайтина, в мышцах зимоспящих сусликов не наблюдается нарушений структурно-функциональных характеристик? Поскольку в наших исследованиях на фоне уменьшения содержания известных N2A-, N2BA- и ШВ-изоформ тайтина в мышцах спящих сусликов не было выявлено уменьшения содержания более высокомолекулярных изоформ этого белка (табл. 1,2), перекрывающих расстояние от М-линии до Z-диска саркомера, можно предположить, что сохранение именно этих изоформ тайтина является причиной отсутствия нарушений структуры и функциональных свойств мышц зимоспящих животных. Полученные результаты показывают, что главную роль в поддержании структурно-функциональных характеристик мышц могут играть открытые нами более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина, а не известные N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформы этого белка. Результаты исследования не

противоречат нашему предположению о том, что известные N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформы тайтина могут быть или фрагментами этого белка, или более короткими интактными изоформами тайтина, не перекрывающими расстояние от М-линии до Z-диска саркомера. Поэтому снижение их содержания в период гибернации не сопровождается нарушением структурно-функциональных свойств в мышцах спящих, а также пробуждающихся и вышедших из спячки сусликов. Таким образом, можно полагать, что адаптационное значение сохранения более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина заключается в поддержании упорядоченной саркомерной структуры и необходимого уровня сократительной активности мышц сусликов в разные периоды гибернационного сезона и, главным образом, в период пробуждения, когда мышцы функционируют при повышенной механической нагрузке. Сохранение в этот период более высокомолекулярных (более эластичных) изоформ тайтина будет снижать вероятность механических повреждений в мышцах пробуждающихся сусликов, и способствовать выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий.

3.4. Сезонные изменения экспрессии гена тайтина в миокарде сусликов

Учитывая полученные нами результаты на белковом уровне, свидетельствующие об увеличении N2BA/N2B соотношения в миокарде сусликов в течение всего гибернационного сезона (рис. 9; табл. 1,2), мы предположили, что в сердечной мышце сусликов в этот период будет наблюдаться увеличенное содержание мРНК М2ВА-изоформы тайтина. Однако результаты ПЦР в режиме реального времени не подтвердили нашего предположения. В частности, обнаружено снижение содержания мРНК как для N2B-, так и для Ы2ВА-изоформы тайтина (в 3-5 раз) в миокарде спящих, пробуждающихся, активных зимних и входящих в спячку сусликов по сравнению с содержанием мРНК тайтина в сердечной мышце активных летних животных. Поскольку известно, что синтез РНК является энергоёмким процессом (от 1% до 10% клеточной энергии в зависимости от типа ткани расходуется на поддержание процесса транскрипции) (Rolfe, Brown, 1997), обнаруженное нами снижение экспрессии гена тайтина в миокарде зимоспящих сусликов на протяжении всего гибернационного сезона можно рассматривать как адаптацию, направленную на минимизацию энергетических затрат в этот период.

В наших исследованиях не было выявлено достоверных различий в содержании мРНК тайтина в миокарде спящих, пробуждающихся, активных зимних и входящих в спячку сусликов, что свидетельствует о поддержании стабильного уровня мРНК тайтина на протяжении всего гибернационного сезона. Однако расчёты показывают, что при отсутствии транскрипции в период гибернации, мРНК с полупериодом жизни равным б часам может быть наполовину разрушена РНКазами за 54 часа при 5°С, а через 12 дней спячки содержание мРНК может составить менее 4% от её содержания у активного животного (Epperson, Martin, 2002). В действительности, такого катастрофического снижения содержания мРНК в разных органах и тканях зимоспящих животных в течение гибернации не наблюдается (Boyer, Barnes, 1999; Carey et al., 2003; Storey, 2003), о чём свидетельствуют результаты и

наших исследований. Снижение деградации мРНК при спячке может происходить вследствие повышенной экспрессии РНК-связывающихся белков, которые защищают РНК от расщепления и ингибируют трансляцию в этот период (Van Breukelen, Martin, 2002). Показано также, что в тканях гибернирующего арктического суслика Spermophilus parryii преобладает популяция мРНК с длинными ро1у(А)-хвостами, которые её стабилизируют (Knight et al., 2000). Подобная защита РНК-транскриптов во время спячки необходима, по мнению авторов, для возобновления синтеза белка при пробуждении суслика. Полученные нами результаты, указывающие на поддержание сниженного, но стабильного уровня мРНК тайтина в миокарде сусликов в течение всего гибернационного сезона, также могут свидетельствовать о защите мРНК от деградации в период спячки. Это, в свою очередь, необходимо для восстановления нормального содержания тайтина в миокарде сусликов при пробуждении и в первые часы межбаутной активности, что мы и наблюдали в наших исследованиях (рис. 9; табл. 1,2).

ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ТАЙТИНА И НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ В МЫШЦАХ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ МИКРОГРАВИТАЦИИ

Известно, что атрофические изменения наблюдаются как в мышцах зимоспящих животных во время гибернации (Lee et al., 2008), так и в мышцах человека и животных в условиях моделируемой или реальной микрогравитации (В laber et al., 2010). Однако степень выраженности атрофических изменений в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации в 2-3 раза выше, чем в мышцах гибернирующих животных после одинаковых временных периодов мышечной невостребованности (Lee et al., 2008). Более того, в отличие от сохранения упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и нормальной сократительной способности атрофированных мышц у гибернирующих животных после выхода из спячки, в атрофированных в условиях микрогравитации мышцах человека и животных после восстановления нагрузки в условиях земной гравитации, наблюдаются драматические нарушения упорядоченной структуры миофиламентов (вытянутые А-зоны и широкие Z-диски с неровным краями) и ухудшения сократительных свойств (в частности, снижение силы мышечных сокращений) (Anzil et al., 1991; Riley et al., 1995). При этом восстановление структурно-функциональных характеристик атрофированных в условиях микрогравитации мышц происходит в течение нескольких недель или месяцев (Hudson, Franklin, 2002). В частности, показано, что после 3-месячной невостребованности мышц у крыс в результате иммобилизации задней конечности, потребовалось 4 месяца восстановительного периода в течение которых структурно-функциональные свойства мышц пришли в норму (Booth, Seider, 1979).

Показано, что атрофические изменения в m. soleus крыс после 14-суточного моделирования гравитационной разгрузки сопровождались двукратным уменьшением содержания известной Ы2А-изоформы тайтина, что приводило к снижению жёсткости мышечных волокон указанной мышцы (Toursei et al., 2002). Учитывая полученные нами результаты, описанные в

разделе 3.3, показывающие, что главную роль в поддержании структурно-функциональных свойств в мышце играют более высокомолекулярные изоформы тайтина, мы предположили, что их разрушение будет вносить больший вклад (по сравнению с разрушением известных изоформ тайтина) в развитие описанных выше нарушений в мышцах при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома». Результаты исследований по проверке этого предположения представлены ниже.

4.1. Изменения изоформного состава тайтина и нарушения структурно-функциональных свойств в скелетной мышце soleus человека и крысы в условиях моделируемой микрогравитации

На рисунке 11 ив таблице 3 представлены результаты наших исследований изменений качественного и количественного состава тайтина в m. soleus крысы и человека на разных сроках моделируемой микрогравитации (от 3 до 30 суток). На электрофореграммах m. soleus крыс после 3-суточного вывешивания при отсутствии изменений в содержании известной N2A-изоформы тайтина наблюдалось снижение (в -1.6 раза) содержания более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка (табл. 3). Эти изменения сопровождались увеличением содержания Т2-фрагмента, а нередко и появлением на электрофореграммах формы тайтина с м.м. -3300 кДа, которая, предположительно, является фрагментом более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка. При этом в m. soleus крыс после 3-суточного вывешивания не было зарегистрировано атрофических изменений, в частности, уменьшения площади поперечного сечения (ППС) мышечных волокон (Пономарёва и др., 2008).

Иитактный Т, Рис. 11. Изменения изоформного состава тайтина в m. soleus человека в условиях моделируемой микрогравитации. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.2%.

1 - m. soleus человека (контроль); 2 - m. soleus человека (7-суточная иммерсия). Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина; Т2-фрагментов тайтина; №А-изоформы тайтина; тайтина с м.м. -3300 кДа (Т3300); более высокомолекулярной интактной изоформы тайтина.

Табл. 3. Изменение содержания разных форм тайтина относительно содержания ТЦМ в m. soleus

крыс в условиях моделируемой микрогравнгации (3-30 суток вывешивания)

Интактный тайтин/ТЦМ Ы2А/ТЦМ Т2/ТЦМ

Контроль, п=35 0.039±0.004 0.127±0.010 0.016±0.005

3-суточное вывешивание, п=7 0.024±0.003* 0.125±0.014 0.025±0.008

7-суточное вывешивание, п=13 0.014 ±0.004* 0 078±0.010* 0.078±0.028*

14-суточное вывешивание, п=21 0.008±0.004* 0.067±0.008» 0.057±0.015*

30-суточное вывешивание, п=7 0.010±0.004* 0.0б2±0.010* 0.049±0.014*

Примечание: * - уровень значимости р<0.05 (сравнение с группой «Контроль»)

В проведённом ранее исследовании не было зарегистрировано уменьшения ППС и изменений структуры саркомеров мышечных волокон т. soleus крыс после 3-суточного вывешивания (Goto et al., 2003). Однако были

обнаружены структурные различия в m. soleus контрольных и вывешенных крыс при растяжении мышцы. В частности, с помощью иммуноэлектронной микроскопии было показано, что при растяжении m. soleus контрольных и вывешенных крыс, расстояние между Z-диском и полосой, окрашенной антителами к I-области тайтиновой молекулы, было меньше (в -1.35 раза) в саркомерах мышцы вывешенных крыс (Goto et al., 2003). На основании полученных данных авторы сделали заключение о снижении эластичности коннектиновых (тайтиновых) нитей в m. soleus крыс после 3-суточного вывешивания. Поскольку на электрофореграммах m. soleus контрольных и вывешенных крыс выше указанными авторами не было выявлено различий в содержании и молекулярной массе а-коннектина (т.е. Т1 или Ы2А-изоформы тайтина) и р-коннектина (т.е. Т2), причина снижения эластичности тайтина после 3-суточной гравитационной разгрузки осталось необъяснённой. Однако авторы сделали предположение, что снижение эластичности m. soleus вывешенных крыс может вносить вклад в нарушение контрактильной функции мышцы. Это предположение подтвердилось результатами проведённых нами совместно с коллегами из Москвы и Санкт-Петербурга исследований, выявивших снижение (в среднем на 15%) абсолютной силы Са2+-индуцированного сокращения скинированных волокон m. soleus крыс после 3-суточного вывешивания (Пономарёва и др., 2008). Принимая во внимание отсутствие изменений в содержании известной Ы2А-изоформы тайтина в т. soleus вывешенных крыс, можно утверждать, что причиной снижения силы мышечных сокращений и эластичности тайтиновых нитей в m. soleus этих животных после 3-суточной гравитационной разгрузки является обнаруженное нами уменьшение содержания новой, более высокомолекулярной и более длинной (и, тем самым, более эластичной, чем известная Ы2А-изоформа) изоформы тайтина (табл. 3). Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что открытые более высокомолекулярные изоформы тайтина играют главную роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц. Дальнейшие наши исследования подтвердили правильность этого предположения. В частности, в m. soleus крыс после семисуточного вывешивания наблюдалось более значительное уменьшение (в ~3 раза) содержания новой интактной изоформы тайтина (табл. 3). При этом наблюдалось уменьшение (в -1.6 раза) содержания и известной Ы2А-изоформы тайтина (табл. 3). Эти изменения сопровождались увеличением (в среднем в 5 раз) содержания Т2-фрагментов в m. soleus вывешенных крыс (табл. 3), а также появлением на электрофореграммах этой мышцы фрагмента тайтина с м.м. -3300 кДа. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании процессов протеолитической деградации тайтина над процессами синтеза этого белка в m. soleus крыс после 7-суточной гравитационной разгрузки. Подобные изменения качественного и количественного состава тайтина были зарегистрированы и в m. soleus человека после 7-суточного пребывания в условиях моделируемой микрогравитации (модель «сухой» иммерсии) (рис. 11).

Обнаруженные значительные деструктивные изменения тайтина в m.soleus человека и крысы в условиях 7-суточной гравитационной разгрузки

сопровождались нарушением структуры и сократительных свойств мышцы. В частности, наблюдалось уменьшение на ~25% ППС мышечных волокон, а также снижение на ~32% максимальной изометрической силы мышечных волокон ш. soleus человека после 7-суточной иммерсии (Шенкман и др., 2004). Полученные результаты согласуются с данными других авторов, которые наблюдали подобное уменьшение ППС мышечных волокон m. soleus кролика и мыши после 7-суточной гравитационной разгрузки (Anzil et al., 1991; Däpp et al., 2004). При этом в m. soleus кролика были выявлены нарушения упорядоченной структуры миофибрилл (Anzil et al., 1991). Принимая во внимание данные, показывающие, что разрушение тайтина сопровождается нарушением упорядоченной саркомерной структуры и снижением сократительной способности мышцы (Horowits et al., 1986; Higuchi, 1992), можно утверждать, что обнаруженное нами уменьшение в -1.6-1.7 раза содержания известной Ы2А-изоформы тайтина и в -3 раза содержания более высокомолекулярной изоформы этого белка в m. soleus человека и крысы после 7-суточной гравитационной разгрузки является основной причиной нарушения структуры и сократительных свойств указанной мышцы. Однако заметим, что подобное уменьшение (в -1.5 раза) содержания известной N2A-изоформы тайтина в скелетных мышцах спящих сусликов (см. раздел 3.3) не сопровождалось нарушениями структурно-функциональных свойств этих мышц (Хромов и др., 1987; Steffen et al., 1993; Козлова, Юрченко, 1996; К. Lee et al., 2008). Обнаруженные различия можно объяснить сохранением в мышцах гибернирующих животных во время зимней спячки нормального содержания более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина, в отличие от значительного уменьшения их содержания в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации. Таким образом, полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что ведущую роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц играют не известные изоформы тайтина, а открытые более высокомолекулярные изоформы этого белка.

Более длительное пребывание крыс в условиях гравитационной разгрузки (14- и 30-суточное вывешивание) сопровождалось дальнейшими значительными деструктивными изменениями в тайтине. В частности, на электрофореграммах rn. soleus крыс наблюдалось двукратное уменьшение содержания Ы2А-изоформы тайтина и четырёхкратное уменьшение содержания более высокомолекулярной изоформы этого белка (табл. 3). После 30-суточного вывешивания на электрофореграммах m. soleus крыс, при сохранении незначительного содержания Ы2А-тайтипа, часто отсутствовала более высокомолекулярная изоформа этого белка. Результаты наших исследований нашли подтверждение в одной из недавних работ зарубежных авторов, обнаруживших двукратное уменьшение содержания известной N2A-изоформы тайтина в m. soleus крысы после 6-недельной иммобилизации задней конечности (Udaka et al., 2008). Уменьшение содержания тайтина, по мнению авторов, приводило к нарушению упорядоченной саркомерной структуры (наблюдались более широкие А-диски с неровными краями), а также вносило вклад в снижение Са2+-чувствителыюсти мышечных волокон m. soleus крысы при развитии сокращения (Udaka et al., 2008). Полученные нами результаты

дают основания утверждать, что основной вклад в нарушение структурно-функциональных характеристик m. soleus человека и животных в условиях гравитационной разгрузки вносит разрушение не известной Ы2А-изоформы тайтина, а более высокомолекулярной изоформы этого белка.

4.2. Изменения изоформного состава тайтина и структурно-функциональных свойств в скелетных мышцах монгольских песчанок после 12-суточного космического полёта

Учитывая полученные нами и описанные выше результаты, показывающие, что атрофические изменения в ш. soleus крысы и человека в условиях моделируемой микрогравитации сопровождаются значительным уменьшением содержания тайтина и, в первую очередь, более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка, мы ожидали обнаружить подобные изменения и в мышцах монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) после 12-суточного космического полёта. Однако наши ожидания не оправдались. Не было обнаружено уменьшения содержания более высокомолекулярной изоформы интактного тайтина в скелетных (m. tibialis anterior и т. soleus) мышцах песчанок полётной группы (данные не показаны). Наблюдалось только недостоверное уменьшение (в -1.15 раза) содержания известной ША-изоформы тайтина в m. soleus и двукратное уменьшение содержания Т2 в ш. tibialis anterior песчанок группы «Полёт». По данным наших коллег из ГНЦ РФ - ИМБП РАН не было выявлено атрофических изменений, а также снижения сократительной способности и кальциевой чувствительности мышечных волокон tibialis anterior песчанок полётной группы (Липец и др., 2009). В m. soleus песчанок полётной группы наблюдалось уменьшение (на 33.7%) ППС волокон, но эти изменения были в 2 раза менее выраженные, чем таковые в m. soleus крыс после 14-суточного космического полёта (Szilgyi et al., 1980). Атрофические изменения в m. soleus песчанок полётной группы сопровождались снижением (на 21.8%) максимальной силы сокращения (Липец и др., 2009), но поскольку ППС волокон m. soleus песчанок уменьшилась на 33.7%, полученные данные свидетельствуют о некотором увеличении удельной силы волокон этой мышцы в условиях космического полёта. Следует отметить, что полёт подобной длительности у крыс вызывал снижение максимальной силы сокращения волокон m. soleus на 65% (Szilgyi et al., 1980).

Не было выявлено снижения Са2+-чувствительности развития силы волокон m. soleus песчанок полётной группы (Липец и др., 2009), что противоречит данным о снижении Са2+-чувствительности развития силы волокон m. soleus крысы и человека в условиях функциональной разгрузки (Szilgyi et al., 1980; Шенкман и др., 2004). Следует обратить внимание на тот факт, что изменения тайтина в скелетных мышцах песчанок в условиях невесомости (а именно, снижение содержания известной ША-изоформы и Т2 и сохранение содержания более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина) подобны таковым в скелетных мышцах сусликов при гибернации (см. раздел 3.3). Учитывая это, можно говорить об адаптационном, а не патологическом характере изменений в мышцах песчанок в условиях реальной невесомости.

Подводя итог сравнительному исследованию изменений изоформного состава тайтина и структурно-функциональных свойств мышц человека и животных в условиях реальной и моделируемой микрогравитации необходимо отметить, что снижение сократительной способности мышц наблюдаются в случае значительного уменьшения содержания более высокомолекулярных изоформ интактного тайтина. Полученные результаты подтвердили наше предположение о том, что ведущую роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц играют не известные изоформы тайтина (в частности, Ы2А), а открытые нами более высокомолекулярные изоформы этого белка.

4.3. Оценка эффективности разных подходов, направленных на предотвращение или снижение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»

Одной из важных задач космической медицины является поиск подходов к снижению или устранению негативного влияния микрогравитации на мышцы человека. Проведенные нами исследования показали, что иммобилизация т. яокиэ крысы в растянутом состоянии, тенотомия (перерезка сухожилий) мышц-антагонистов т. зо1еиз крысы, применение хелаторов кальция, стимуляция опорных зон стопы человека и крысы в условиях моделируемой микрогравитации снижают или предотвращают повышенную деградацию тайтина (ТМ2А-изоформы и более высокомолекулярной изоформы) и развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» в камбаловидной мышце. Результаты этих исследований подтвердили важную роль открытых более высокомолекулярных изоформ тайтина в поддержании структурно-функциональных характеристик мышцы. Тестирование изменений изоформного состава тайтина может быть использовано в космической медицине для диагностики развития «гипогравитационного мышечного синдрома» и оценки эффективности подходов к его коррекции.

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ТАЙТИНА В МЫШЦАХ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ ПРИ ПАТОЛОГИИ

Учитывая наши результаты, показывающие значительное уменьшение содержания тайтина и, в первую очередь, более высокомолекулярной изоформы этого белка в т. воЬиз человека и крыс при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома», мы предположили, что подобные изменения в содержании тайтина будут наблюдаться в мышцах человека и животных при развитии патологических процессов.

5.1. Изменение изоформного состава тайтина и экспрессии гена этого белка в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии

Известно, что гипертрофия сердца у спонтанно-гипертензивных крыс (линия 577Л) в возрасте от 4 до 11 месяцев обусловлена в большей степени гипертрофией левого желудочка (Лушникова, Непомнящих, 2003). При этом одним из основных событий, определяющих характер ремоделирования гипертрофированного сердца у крыс линии 57Ж, является значительное уменьшение численности кардиомиоцитов (КМЦ) в левом желудочке.

Морфологические исследования гипертрофированного миокарда крыс линии SHR выявили большое количество КМЦ с контрактурными повреждениями и субсегментарными контрактурами. Показано, что в одной и той же клетке одни миофибриллярные пучки находились в состоянии сокращения, другие - в состоянии расслабления (Лушникова, Непомнящих, 2003). При этом в некоторых КМЦ миофибриллярные пучки располагались под прямым углом друг к другу, что свидетельствовало о нарушении пространственной ориентации миофибрилл (Лушникова, Непомнящих, 2003). Учитывая важную роль тайтина в поддержании высокоупорядоченной саркомерной структуры в мышцах (Horowits et al., 1986; Higuchi, 1992), мы ожидали обнаружить в миокарде крыс линии SHR значительные деструктивные изменения этого белка. Наши ожидания оправдались. В частности, обнаружено уменьшение (в ~1.8 и в ~1.5 раза) содержания известных N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина, а также уменьшение (в ~2 раза) содержания более высокомолекулярных изоформ этого белка в гипертрофированной сердечной мышце 15-недельных и 26-недельных SHR крыс (данные не показаны). В ряде случаев на электрофореграммах левого желудочка сердца крыс линии SHR более высокомолекулярные изоформы интактного тайтина отсутствовали.

Обсуждая вклад разных форм тайтина в структурные нарушения в миокарде SHR крыс, необходимо обратить внимание на следующие данные. Заметим, что уменьшение в -1.2 раза (Nelson et al., 2008) и в 1.3-1.5 раза (рис. 9; табл. 1,2) содержания известных N2BA- и Ы2В-изоформ тайтина в сердечной мышце зимоспящих животных в период гибернации, подобное таковому (в -1.5-1.8 раза) в левом желудочке сердца SHR крыс, не сопровождалось у гибернантов нарушениями структурно-функциональных свойств миокарда (Клика, Зайцова, 1984; Wang et al., 2002; Nakipova et al., 2007; Nelson et al., 2008). Объяснить эти данные позволяют наши результаты, показывающие сохранение в сердечной мышце гибернирующих сусликов при спячке более высокомолекулярных изоформ интактного тайтина, разрушение которых наблюдается в миокарде SHR крыс, что, по всей вероятности, и является главной причиной нарушения упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата сердечной мышцы этих животных. Несомненно, что следствием этих нарушений будет снижение сократительных возможностей гипертрофированной сердечной мышцы крыс линии SHR. Полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что открытые более высокомолекулярные изоформы тайтина играют первостепенную роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц.

На фоне сниженного содержания тайтина, неожиданными оказались результаты, показывающие повышение экспрессии гена этого белка в миокарде 15-недельных крыс линии SHR. В частности, содержание мРНК тайтина в миокарде 15-недельных SHR крыс было увеличено в среднем в 19 раз по сравнению с её содержанием в миокарде контрольных нормотензивных крыс. Дальнейшее развитие патологического процесса сопровождалось снижением экспрессии гена тайтина в сердечной мышце SHR крыс. В частности, в миокарде 26-недельных спонтанно-гипертензивных крыс наблюдалось уменьшение (в среднем в 25 раз) содержание мРНК тайтина по сравнению с её

содержанием у контрольных животных. Одной из причин снижения экспрессии гена тайтина в патологическом миокарде может являться активация транскрипционного фактора NF-kB (Ahmad et al., 2010). Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития патологических изменений в гипертрофированной сердечной мышце и могут быть использованы для диагностики развития сердечной гипертрофии.

5.2. Изменение изоформного состава тайтина в мышцах человека при развитии дилатационной кардиомиопатии и синдрома «ригидного человека»

Учитывая полученные нами данные, показывающие уменьшение содержания известных изоформ тайтина, а также уменьшение содержания или разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка в гипертрофированной сердечной мышце SHR крыс, мы полагали обнаружить подобные изменения в содержании разных форм тайтина и в мышцах человека при развитии патологических процессов. Результаты проведённого нами электрофоретического исследования изменений изоформного состава тайтина в мышцах человека при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) и синдрома «ригидного человека» подтвердили наше предположение.

Рис. 12. Изменение изоформного состава тайтина в спинной мышце пациента с синдромом «ригидного человека». Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.3%. 1 - m. soleus человека (контроль); 2 -мышца, выпрямляющая позвоночник (т. erector spinae) пациента с синдромом «ригидного человека». Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина; небулина (белка тонких нитей) Т2-фрагментов тайтина; Ы2А-изоформы тайтина; более высокомолекулярной интактной изоформы тайтина.

На электрофореграммах скелетной мышцы erector spinae двух пациентов с синдромом «ригидного человека» обнаружено уменьшение в 1.5-2 раза содержания известной Ы2А-изоформы тайтина и в 4-5 раз содержания более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка (рис. 12). На электрофореграмме спинной мышцы третьего пациента с синдромом «ригидного человека» обнаружено уменьшение в ~2.5 раза содержания известной Ы2А-изоформы тайтина, при этом отсутствовала более высокомолекулярная изоформа этого белка. Обнаруженные изменения в содержании изоформ тайтина сопровождались увеличением в ~3 раза содержания протеолитических Т2-фрагментов этого белка (рис. 12). На электрофореграммах миокардиальной ткани левого желудочка сердца четырёх пациентов с конечной стадией развития ДКМП отсутствовали более высокомолекулярные изоформы интактного тайтина (данные не показаны). При этом наблюдалось уменьшение (в -2-2.5 раза) содержания известных N2BA-H Ы2В-изоформ тайтина и увеличение (в -2-3 раза) содержания

протеолитических Т2-фрагментов этого белка. Полученные результаты согласуются с данными, показывающими значительную деградацию Т1 в миокарде человека при развитии ДКМП (Morano et al., 1994; Макаренко и др., 2002). Несомненно, что разрушение или значительное уменьшение содержания интактных изоформ тайтина, перекрывающих расстояние от М-линии до Z-диска, играющих важную роль в поддержании структуры саркомера, а также участвующих в регуляции актин-миозинового взаимодействия и процессов внутриклеточной сигнализации (Linke, Krüger, 2010), будет приводить к нарушению структурно-функциональных свойств патологической мышцы. Этот вывод подтверждается электронно-микроскопическими и иммуноцитохимическими данными, показывающими, что снижение содержания тайтина в кардиомиоцитах человека при развитии ДКМП и в дилатированном сердце у хомяка приводит к нарушению упорядоченной саркомерной структуры и снижению сократительной способности мышечных волокон миокарда (Hein et al., 1994; Kawaguchi et al., 1995; Hein et al., 2000).

Таким образом, результаты проведённых нами исследований показывают, что развитие патологических процессов в поперечно-полосатых мышцах человека и животных сопровождается уменьшением содержания известных изоформ тайтина, а также уменьшением содержания или разрушением более высокомолекулярных изоформ этого белка, что вносит основной вклад в развитие патологических нарушений в указанных мышцах. Полученные результаты вместе с данными по изменению тайтина в мышцах зимоспящих сусликов в условиях зимней спячки и в мышцах животных и человека в условиях микрогравитации подтверждают наше предположение о том, что ведущую роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц играют не известные N2A-, N2BA- и ШВ-изоформы тайтина, а открытые более высокомолекулярные изоформы этого белка.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод ДСН-электрофореза в горизонтальном геле и модифицированы известные методы ДСН-электрофореза в вертикальных гелях для исследования полиморфизма гигантского белка тайтина, с помощью которых в поперечно-полосатых мышцах животных и человека наряду с известными N2A-, N2BA- и Ы2В-изоформами тайтина были обнаружены более высокомолекулярные изоформы этого белка.

2. Обнаружено, что при сохранении содержания более высокомолекулярных изоформ тайтина в поперечно-полосатых мышцах сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации, уменьшение (в -1.3-1.5 раза) содержания известных изоформ этого белка не сопровождается нарушением структурно-функциональных свойств мышц спящих животных. Сделано заключение об адаптационном значении сохранения в мышцах гибернирующих сусликов более высокомолекулярных изоформ тайтина для поддержания упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и необходимого уровня сократительной активности мышц при спячке и пробуждении, что способствует выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий.

3. В поперечно-полосатых мышцах человека и крысы при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы у SHR,

дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека»), а также при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома» наряду с уменьшением (в -1.5-2.5 раза) содержания известных изоформ тайтина обнаружено уменьшение (в -2-5 раз) или полное разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка, что вносит основной вклад в нарушение структурно-функциональных свойств мышц. Сделано заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-функциональных характеристик мышц играют не N2A-, N2BA- и N2B-изоформы тайтина, а открытые более высокомолекулярные изоформы этого белка.

4. При развитии гипертрофии сердечной мышцы у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) обнаружено увеличение экспрессии гена тайтина в миокарде 15-недельных крыс и снижение экспрессии гена этого белка в миокарде 26-недельных крыс. Полученные результаты могут быть использованы в диагностике развития гипертрофии сердечной мышцы.

5. Показано, что иммобилизация m. soleus крысы в растянутом состоянии, тенотомия мышц-антагонистов m. soleus крысы, применение хелаторов кальция, стимуляция опорных зон стопы человека и крысы в условиях моделируемой микрогравитации снижают или предотвращают повышенную деградацию тайтина и развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» в камбаловидной мышце, что подтверждает важную роль тайтина и, в частности, открытых более высокомолекулярных его изоформ в поддержании структурно-функциональных свойств мышцы. Тестирование изменений изоформного состава тайтина может быть использовано в космической медицине для диагностики развития «гипогравитационного мышечного синдрома» и оценки эффективности подходов к его коррекции.

6. Проведены исследования структурно-функциональных свойств тайтина, выделенного из поперечно-полосатых мышц кролика и суслика. Показана способность тайтина связываться in vitro с актиновыми нитями и обнаружен его активирующий эффект на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина скелетных мышц спящих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния этого белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина in vitro. Полученные результаты указывают на участие тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышцах.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Вихлянцев И.М.. Макаренко И.В., Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Малышев С.Л., Подлубная З.А. Изменения изоформного состава цитоскелетного белка тайтина -адаптационный процесс при гибернации // Биофизика. 2000. т. 45. № 5. с. 831-835.

2. Podlubnaya Z.A., Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Vikhlvantsev I.M. Myosin, titin and C-protein of skeletal and cardiac muscles during hibernation // Proc. of the Natl. Academy of Sciences of Belarus, Ser. Medical-Biological Sei., 2003, № 3, с. 93-100.

3. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Vikhlvantsev I.M.. Udaltsov S.N., Muchina A.M., Podlubnaya Z.A. Myosin phenotype and sarcomeric cytoskeletal proteins behavior in stretched soleus of hindlimb suspended rats // J. Gravit. Physiol. 2003. v. 10. № 1. p. 53-54.

4. Вихлянцев И М.. Подлубная З.А. Фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков - адаптационный фактор ингибировання сократительной активности мышц при зимней спячке // Биофизика. 2003. т. 48. № 3. с. 499-504.

5. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Vikhlvantsev I.M.. Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Ziegler C., Beinbrech G. Comparative electron microscopic study on projectin and titin binding to F-actin // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2003. v. 33. № 8. p. 789-793.

6. Вихлянцев И.М.. Малышев C.JI., Шенкман B.C., Подлубная З.А. Поведение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах сусликов (Citellus undulatus) при зимней спячке и крыс в условиях моделируемой микрогравитации // Биофизика. 2004. т. 49. № 6. с. 995-1002.

7. Подлубная З.А., Вихлянцев И.М.. Мухина A.M., Немировская Т.Л., Шенкман Б.С. Белки саркомерного цитоскелета и миозиновый фенотип волокон m. soleus при её хроническом растяжении на фоне вывешивания задних конечностей крысы // Биофизика. 2004. т. 49. № 3. с. 424-429.

8. Litvinova K.S., Vikhlvantsev I.M.. Kozlovskaya I.B., Podlubnaya Z., Shenkman B.S. Effect of artificial support stimulation on fiber and molecular characteristics of soleus muscle in men exposed to 7-day dry immersion//J. Gravit. Physiol. 2004. v. 11. № 2. p. 131-132.

9. Vikhlvantsev I.M.. Podlubnaya Z.A. // Titin Isoform Composition of Skeletal and Cardiac Muscle in the Arctic Ground Squirrel Citellus undulatus: Adaptation to Hibernation // Biophysics. 2004. v.49. № 3. p. 408-413.

10. Вихлянцев И.М.. Подлубная 3.A., Козловская И.Б. Новые изоформы тайтина в скелетных мышцах млекопитающих // Доклады Академии Наук. 2004. т. 395. № 6. с. 828831.

11. Шенкман Б.С., Подлубная З.А., Вихлянцев И М.. Литвинова К.С., Удальцов С.Н., Немировская Т.Л., Лемешева Ю.С., Мухина A.M., Козловская И.Б. Сократительные характеристики и белки саркомерного цитоскелета волокон m. soleus человека в условиях гравитационной разгрузки. Роль опорного стимула // Биофизика. 2004. т. 49. № 5. с. 881890.

12. Shenkman B.S., Litvinova K.S., Nemirovskaya T.I., Podlubnaya Z.A., Vikhlvantsev I.M.. Kozlovskaya I.B. Afferent and peripheral control of muscle fiber properties during gravitational unloading//J. Gravit. Physiol. 2004. v. 11.№2. p. 111-114.

13. Шенкман Б.С., Немировская Т.Л., Мухина A.M., Подлубная 3.A., Вихлянцев И М.. Ардабьевская А.В., Козловская И.Б., Григорьев А.И. Влияние инактивации мышц-антагонистов на атрофические процессы в m. soleus крысы в условиях гравитационной разгрузки // Доклады Академии Наук. 2005. т. 400. №6. с. 840-843.

14. Litvinova K.S., Vikhlvantsev I.M.. Podlubnaya Z.A., Shenkman B.S. Effects of Ca -binding agent EGTA on fiber contractility and content of sarcomeric cytoskeletal proteins of hindlimb suspended rats. //J. Gravit. Physiol. 2005. v. 12. №. 1. p .159-160.

15. Вихлянцев И.М.. Подлубная 3.A., Шенкман Б.С., Козловская И.Б. Полиморфизм тайтина скелетных мышц при экстремальных условиях зимней спячки и микрогравитации: диагностическая ценность изоформ тайтина для выбора подходов к коррекции гипогравитационного мышечного синдрома // Доклады Академии Наук. 2006. т. 407. №. 5. с. 692-694.

16. Вихлянцев И М.. Подлубная З.А. К вопросу об изоформах тайтина // Биофизика. 2006. т. 51. №5. с. 951-958.

17. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Shapovalova К.В., Podlubnaya Z.A., Vikhlvantsev I.M.. Moukhina A.M., Kozlovskaya I.B. Afferent control mechanisms involved in the development of soleus fiber alterations in simulated hypogravity // Acta Astronautika. 2007. v. 60. P. 307-312.

18. Вихлянцев И М.. Подлубная З.А. Структура и функции тайтина - гигантского белка скелетных и сердечных мышц: доказательства и предположения // Биофизика. 2007. т. 52. №6. с. 1030-1040.

19. Вихлянцев ИМ.. Подлубная З.А., Карадулева Е.В., Храмов Р.Н., Мурашев А.Н., Козловская И.Б. Изменения изоформного состава тайтина в сердечной мышце спонтанно-гипертензивных крыс и его восстановление после курса низкоинтенсивного красно-оранжевого облучения // Доклады Академии Наук. 2007. т. 417. №3. с. 403-406.

20. Вихлянцев И.М.. Подлубная З.А. К вопросу об участии тайтина в процессах внутриклеточной сигнализации // В сб. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (под ред. В.П. Зинченко, ISBN 5-201-14596-8). Пущино. ОНТИ. 2007. с. 81-83.

21. Яхно Н.Н., Голубева В.В., Мозолевский Ю.В., Зиновьева О.Е. Катушкина Э.А., Шенкман Б.С., Чистяков И.Н., Подлубная З.А., Вихлянцев ИМ. Синдром ригидного человека с глазодвигательными и мозжечковыми нарушениями // Анналы экспериментальной и клинической неврологии. 2007. т.1. №4.с. 15-22.

22. Vikhlvantsev 1.М.. Podlubnaya Z.A. Electrophoretic study on titin: evidence and suppositions // In: "Biological Motility: achievements and perspectives" (eds. Podlubnaya Z.A. and Malyshev S.L., ISBN 978-5-903789-06-1). Pushchino. Foton-Vek. 2008. Volume 1. p. 5456.

23. (I.) Вихлянцев ИМ.. Подлубная З.А. Изоформный состав тайтина в мышцах при патологических процессах // Биофизика. 2008. т. 53. № 6. с. 1058-1065.

24. (II.) Вихлянцев И.М.. Карадулева Е.В., Подлубная З А. Сезонные изменения изоформного состава тайтииа в мышцах зимиеспящих сусликов // Биофизика. 2008. т. 53. № 6. с. 1066-1072.

25. E.N. Lipets, E.V. Ponomareva, I.V. Ogneva, I.M. Vikhliantsev. E.V. Karaduleva, N.L. Kartashkina, S.L. Kuznetsov, Z.A. Podlubnaia, and B.S. Shenkman The Fiber Contractility and Cytoskeleton Losses in Space are Less Pronounced in Mongolian Gerbils // J. Gravit. Physiol.

2008. v. 15(1). p. 99-100.

26. Пономарева E.B., Кравцова В.В., Качаева Е.В., Алтаева Э.Г., Вихлянцев И.М.. Подлубная З.А., Крутой И.И., Шенкман Б.С. Сократительные свойства изолированной мышцы soleus и ей скинированных волокон на ранних этапах гравитационной разгрузки: факты и гипотезы. // Биофизика. 2008. т. 53. № 6, с. 1087-1094.

27. Зиновьева О.Е., Катушкина Э.А., Мозолевский Ю.В., Голубева В.В.,. Шенкман Б.С., Чистяков И.Н., Подлубная З.А., Вихлянцев ИМ.. Яхно Н.Н. Синдром ригидного человека: вопросы патогенеза и лечения. // Неврологический журнал. 2009. т. 14. № 1. с. 11-17.

28. Липец Е.Н., Пономарева Е.В., Огнева И.В., Вихлянцев И.М.. Карадулева Е.В., Карташкина Н.Л., Кузнецов С.Л., Подлубная З.А., Шенкман Б.С. Сократительные характеристики волокон и цитоскелетные белки мышц задних конечностей монгольских песчанок после космического полета // Авиакосмическая и экологическая медицина.

2009. т. 43. №3. с. 34-39.

29. Шумилина Ю.В., Вихлянцев И.М.. Подлубная З.А., член-корреспондент РАН. Козловская И.Б. Изоформный состав белков миозиновых нитей в миокарде монгольских песчанок "Meriones unguiculatus" после космического полета // Доклады Академии Наук.

2010. т. 430. №2. с. 264-267.

30. Вихлянцев И.М.. Теренгьева А.В., Балтина Т.В., Подлубная З.А. Влияние вибростимуляции опорных зон стопы крысы и опорной нагрузки на содержание N2A-изоформы и Т2-фрагмента тайтина в m. soleus в условиях моделируемой микрогравигации // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. т. 44. № 2. с. 4549.

31. Карадулева Е.В, Вихлянцев И М.. Подлубная З.А. Экспрессия тайтина в миокарде спонгакно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии // Биофизика. 2010. т. 55. №. 4. с. 612-618.

32. Vikhlvantsev I.M.. Shumilina Yu.V., Карадулева Е.В., Kozlovskaya I.B., Podlubnaya Z.A. Titin isoform switching is a major cardiac adaptive response in mongolian gerbils (.Meriones Unguiculatusj after space flight // In: "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", (ISBN 978-5-91874-029-3). Pushchino. 2010. p. 310-314.

33. Карадулева E.B., Вихлянцев И.М.. Тугукина M.H., Подлубная ЗА. Сезонные изменения экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus Undulatus // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова 2010. т. 6. №4. с. 5-12.

Тезисы:

34. Vikhlvantsev I.M.. Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Titin cytoskeleton of vertebrate striated muscle: behavior upon hibernation // J. Muscle Res. Cell Motil. 2000. v. 21(8). p. 824 (Abstr. 29 Europ. Muscle Conf. 8-13 September, 2000, Berlin, Germany).

35. Vikhlvantsev I.. Podlubnaya Z. Phosphorylation of sarcomere cytoskeletal proteins -adaptive factor of inhibiting the contractile activity of muscles upon hibernation // J. Muscle Res. Cell Motil. 2003. v. 24(4-6). p. 378 (Abstr. 32 Europ. Muscle Conf., 6-10 September 2003. Montpellier, France).

36. Vikhlvantsev I.M.. Shenkman B.S., Podlubnaya Z.A. The changes in titin isoforms composition of ground squirrel m. soleus upon hibernation as compared with human and rat m. soleus under conditions of simulated microgravity // J. Muscle Res. Cell Motil. 2004. v. 25(3). p. 264 (Abstr. 33 Europ. Muscle Conf., 19-23 September, 2004, Isola d'EIba, Italy).

37. Vikhlvantsev I.. Podlubnaya Z. Study of titin behavior in hibernation: new approach to estimation a stage of human cardiac diseases // Europ. Biophys. J. 2005. v. 34(6). p. 775 (Abstr. 15 Intern. Biophys. Congress, 2005, Montpellier, France).

38. Вихлянцев И.М.. Подлубная З.А. Изоформы легких цепей миозина и изоварианты Ы2А-изоформы тайтина в мышце soleus при моделируемой и реальной микрогравитации // Тезисы докл. XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2005». Москва. 12-15 апреля 2005. с. 49.

39. Vikhlvantsev I.M.. Podlubnaya Z.A. New isovariant of cardiac titin: disappearance in dilated cardiomyopathy//J. Muscle Res. Cell Motil. 2006. v. 27(5-7). p. 511 (Abstr. 35 Europ. Muscle Conf., 9-12 September, 2006. Heidelberg, Germany).

40. Vikhlvantsev I.M.. Podlubnaya Z.A, Marsagishvili L.G., New high-molecular bands in electrophoresis gels: intact titin forms or titin aggregates? // J. Muscle Res. Cell Motil. 2007. v. 26. p. 439 (Abstracts of 36 Europ. Muscle Conf., 8-12 September, 2007, Stocholm, Sweden).

41. Вихлянцев И.М.. Карадулева E.B., Подлубная З.А. Электрофоретическое изучение тайтина в норме, при адаптации и патологии // Тезисы XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 4-8 июня, 2007. с. 179.

42. Nemirovskaya T.L., Zelesnjakova A.V. Kitina J.N., Vikhlvantsev I.M.. Shenkman B.S. Muscle cytoskeletal proteins and HSP27 under eccentric exercise and hindlimb suspension (HS) of rats: Effects of calcium L-type channels blockade. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2007. v. 26. p. 471 (Abstracts of 36 Europ. Muscle Conf., 8-12 September, 2007, Stocholm, Sweden).

43. Vikhlvantsev I.M.. Karaduleva E.V., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A Changes in titin isoform composition of skeletal and cardiac muscles upon adaptation and pathology. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2008. v. 29. p. 306. (Abstracts of 37 Europ. Muscle Conf., 13-16 September, 2008, Keble College, Oxford).

44. Шумилина Ю.В., Карадулева E.B., Вихлянцев И М.. Подлубная З.А. Адаптационные изменения изоформного состава белков семейства тайтина в мышцах зимоспящих сусликов в условиях гипоксии // Патогенез. 2008. № 3. с. 97 (тезисы 5-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 9-11 октября, 2008).

45. Karaduleva E.V., Vikhlvantsev I.M.. Shumilina J.V., Podlubnaya Z.A. Protein and mRNA expression levels of titin in myocardium of hibernating ground squirrels and SHR // European Biophysics Journal with Biophysics Letters, v. 38 suppl. 1. p. S151 (Abstracts 7 EBSA European Biophysics Congress, July 11-15,2009, Genova, Italy).

46. Karaduleva Elena, Vikhlvantsev Ivan. Shumilina Julia, Podlubnaya Zoya Comparison of protein and mRNA expression levels of titin isoforms in cardiac muscles of hibernating ground squirrels // FEBS J. 2009. v. 276. suppl. 1. p. 108 (Abstract 34 FEBS Congress, 4-9 July, 2009, Prague, Czech Republic).

47. Карадулева E.B., Вихлянцев ИМ.. Подлубная З.А. Изменения уровня экспрессии сердечных изоформ тайтина при гибернации, микрогравитации и патологии // Тезисы XXI съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. 19-25 сентября 2010. Калуга. 2010. с. 262.

Работа выполнена при финансовой поддержке: грантов РФФИ (00-04-48200; 02-04-06919-мас; 03-04-48487; 03-04-06454-мас; 04-04-48599; 06-04-48896; 07-04-01448; 07-04-00479) грантов Президента Российской Федерации "Ведущие научные школы" № 4981.2006.4 и № 217.2008.4, Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" 2004-2010; грантов Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0301, 02.740.11.0710; Программы фундаментальных исследований Отделения биологических наук РАН «Физиологические механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем».

Подписано в печать:

17.06.2011

Заказ № 5687 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вихлянцев, Иван Милентьевич

Список используемых сокращений

Введение

Цель и задачи работы

I. Обзор литературы

Глава 1. Структурно-функциональные свойства тайтина

1.1. История открытия тайтина

1.2. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в 2-диске саркомера

1.3. Изоформы тайтина и их изоварианты в 1-зоне саркомера

1.4. Структура и функциональные свойства растяжимой области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера

1.5. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в А-диске саркомера

1.6. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в М-линии саркомера

1.7. Роль тайтина в механических свойствах миокарда

Глава 2. Зимняя спячка млекопитающих

2.1. Общие представления о зимней спячке млекопитающих

2.2. Сезонные изменения в мышцах зимоспящих животных

2.3. Сезонные изменения экспрессии генов в мышцах зимоспящих животных

Глава 3. Изменения в мышцах при патологии и в условиях микрогравитации

3.1. Исполнительный аппарат кардиомиоцитов при гипертрофии сердца

3.2. Ремоделирование миокарда спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии

3.3. Ремоделирование миокарда при ДКМП 46 3.4 Изменения в тайтине миокарда при ДКМП 48 3.5. Изменения в мышцах при синдроме «ригидного человека»

3.6. Изменения в скелетных мышцах человека и животных в условиях микрогравитации

3.7. Изменения в миокарде человека и животных в условиях микрогравитации 53 Резюме

II. Экспериментальная часть

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Экспериментальный и клинический материал

4.2. Выделение и очистка мышечных белков

4.2.1. Выделение тайтина из сердечной и скелетных мышц

4.2.2. Выделение миозина из скелетных мышц кролика

4.2.3. Выделение миозина из сердечной мышцы кролика

4.2.4. Выделение актина из скелетных мышц кролика

4.3. Электронно-микроскопические исследования

4.4. Измерение АТФазной активности актомиозина в присутствии тайтина

4.5. Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия

4.6. Вестерн-блоттинг

4.7. Фосфорилирование in vitro тайтина сердечной и скелетных мышц сусликов

4.8. Исследование экспрессии тайтина методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

4.8.1. Выделение геномной ДНК из образцов миокарда

4.8.2. Выделение тотальной РЫК и проведение реакции обратной транскрипции

4.8.3. Количественная ПЦР

4.8.4. Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле

4.8.5. Клонирование фрагментов ПЦР в pAL-TA вектор

4.8.6. Выделение плазмиды и секвенирование

4.9. Моделирование условий гравитационной разгрузки

4.10. Применение различных подходов, направленных на снижение или устранение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»

III. Результаты и обсуждение

Глава 5. Изучение изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах человека и животных в норме

5.1. Электрофоретическое изучение изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах человека и животных

5.2. Влияние нагревания и кипячения электрофоретических проб на содержание тайтина

Глава 6. Изучение in vitro структурно-функциональных свойств тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика в норме

6.1. Электронно-микроскопическое изучение молекулярных параметров и агрегационных свойств молекул тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика

6.2. Влияние тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика на структуру миозиновых нитей и на АТФазную активность и Са -чувствительность реконструированного актомиозина М4'

6.3. Взаимодействие тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика с Ф-актином '

Глава 7. Изучение сезонных изменений структурно-функциональных свойств тайтина в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus

7.1. Сезонные изменения функциональных свойств тайтина скелетных мышц сусликов: влияние на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного актомиозина

7.2. Сезонные изменения степени фосфорилирования тайтина скелетных мышц сусликов

7.3. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах сусликов

7.4. Сезонные изменения экспрессии гена тайтина в миокарде сусликов

Глава 8. Изменения изоформного состава тайтина и нарушения структурно-функциональных свойств в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации

8.1. Изменения изоформного состава тайтина и нарушения структурно-функциональных свойств в скелетной мышце soleus человека и крысы в условиях моделируемой микрогравитации

8.2. Изменения изоформного состава тайтина и структурно-функциональных свойств в мышцах монгольских песчанок после 12-суточного космического полёта

8.3. Оценка эффективности разных подходов, направленных на предотвращение или снижение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»

Глава 9. Изменения изоформного состава тайтина в мышцах человека и животных при патологии

9.1. Изменение изоформного состава тайтина и экспрессии гена этого белка в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии

9.2. Изменение изоформного состава тайтина в мышцах человека при развитии дилатационной кардиомиопатии и синдрома «ригидного человека»

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии"

До открытия; тайтина мышечное сокращение рассматривалось с позиции; \ • , взаимодействия двух типов нитей: толстых (миозиновых) и тонких (актиновых).

Открытие тайтина (коннектина) (К. Wang et al1979; Maruyama et al 1981); не только разрушило старые представления; о^двунитевой; структуре саркомера, но и определило. интерес многих исследователей к выяснению!, роли этого; белка в поддержании струкгуры и функционировании саркомера: и мышцы в целом. В настоящее время известно, что тайтин гигантский эластичный белок в саркомерах поперечно-полосатых мышц позвоночных (Labeit; Kolmerer, 1995; Tskhovrebova,

Trinick, 2010); Молекулярные массы; известных, изоформ тайтина; (N2Ä,; N2B? и

N2BA) составляют 3000000-3700000 Да (Freiburg et al., 2000; Guo et al:, 2010).

Молекулы тайтина, перекрывая расстояние от М-линии до Z-диска, формируют третью филаментную систему в миофибриллах и составляют по количеству. ~15% от массы саркомерных белков (Tskhovrebova, Trinick, 2010). В А-зоне саркомера тайтин связан с миозиновыми нитями. В 1-диске, саркомера тайтин проходит свободно, соединяя концы миозиновых нитей: с Z-мембрапой (Granzier, Laheit, 2004).

Исследования, проведенные за последние 20 лет, показали; что тайтин является одним из ключевых компонентов саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных, играющим важную роль в сборке толстых нитей, формировании высокоупорядоченной структуры саркомера, регуляции актин-миозинового взаимодействия и процессов внутриклеточной сигнализации (Granzier, Labeit, 2004;

Lange et al., 2005; Linke, Krüger, 2010; LeWinter, Granzier, 2010; Gautel, 2011). Однако огромная молекулярная масса тайтина; а также способность этого белка легко деградировать во время препаративных процедур сильно затрудняют исследование его структурно-функциональных свойств, вследствие чего не все свойства тайтина в норме до конца изучены. Необходимо выяснение роли тайтина в регуляции актинмиозинового взаимодействия и, в частности, вклада этого белка в Са2+чувствительность развития силы. Остается нерешенным вопрос о связывании тайтина с актином в саркомере и функциональной значимости такого взаимодействия. Недостаточно* широко исследован изоформный состав тайтина в мышцах животных и человека, и не открыты изоформы тайтина с м.м. более 3700 кДа, хотя ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200' кДа (38138 аминокислотных остатка) (Guo et al., 2010). Не совсем ясно, как на уровне половины саркомера функционируют изоформы тайтина, имеющие разную длину растяжимой I-области молекулы этого белка. Несомненно, что присутствие в- саркомере разных изоформ* тайтина имеет важное физиологическое значение для функционирования мышцы.

Не изучена роль тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды, включая экстремальные, в частности, при зимней спячке и микрогравитации. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к неблагоприятным условиям среды за счёт снижения активности^ всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (L. Wang, 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животного. Проведённые исследования показали, что изменения структурно-функциональных свойств миозина и связанных с ним белков (С-белка, Х-белка) вносят вклад в адаптацию поперечно-полосатых мышц зимоспящих животных к условиям гибернации (Morano et al., 1992; Лукоянова и др., 1997а,б; Вихлянцев и др., 2002; Osipova et al., 2004; Rourke et al., 2004; Зуйкова и др., 2005; Малышев и др., 2006). Исследования роли тайтина в адаптации мышц к условиям зимней спячки не проводились. Не изучен вклад тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома», который наблюдается у человека и животных в условиях моделируемой или реальной невесомости. Этот синдром проявляется в развитии атрофии скелетных позно-тонических мышц, сопровождающейся уменьшением объёма мышечных волокон, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Григорьев и др., 2004). На фоне описанных изменений выявлено уменьшение содержания К2А-изоформы тайтина в m. soleus крысы после 14-суточного пребывания б условиях моделируемой микрогравитации (Toursel et all, 2002), что сопровождалось изменением эластичных свойств; мышцы. Однако исследования возможных изменений;: сократительных свойств мышцы, вследствие уменьшения содержания^ тайтина не проводились. Известны данные, свидетельствующие об^атрофии сердечной мышцьг человека и животных в условиях реальной или моделируемой микрогравитации?(Baranska et al., 1990; Goldstein et al., 1992; Perlioncn ct al., 2001). Однако' какие при этом происходят изменения качественного и количественного состава тайтина в сердечной мышце, и * каково функциональное значение этих изменений, остаётся неясным. Следует обратить, внимание на отличительную* особенность атрофических изменений в мышцах при гибернации/и микрогравитации. В отличие: от негативных последствий атрофии мышц в условиях микрогравитации, приводящих к длительному нарушению сократительных свойств и выносливости мышц, атрофические изменения в мышцах в .период зимней спячки легко обратимы при пробуждении животного и не влекут за собой патологических последствий (К. Lee at al;, 2008). Однако причина подобных различий неясна.

Тайтин играет важную роль не только в физиологии, но и в патофизиологии мышц. Исследования последних лет показали, что патогенез, ряда мышечных , заболеваний: сопровождается- изменениями в изоформном составе,, содержании тайтина и экспрессии гена этого белка (LeWinter, Granzier, 2010;;0ttenheijm, Granzier, 2010). Однако имеющиеся литературные данные противоречивы. В частности, выявлены противоположные изменения в содержании N2BA- и Т^2В-изоформ тайтина при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) у человека (Makarenko et al., 2004; Nagueh et al., 2004) и собаки (Wu et al., 2002;.Jaber et al., 2008). В гипертрофированном сердце спонтанно-гипертензивных. крыс (SHR) выявлено уменьшение содержания И2ВА-изоформы тайтина (Warren et al., 2003а), тогда как при-развитии гипертрофической; кардиомиопатии (ГКМП) у человека не

Ю . было выявлено изменений в содержании и изоформном составе этого белка (Hoskins et al., 2010). В скелетных мышцах человека при развитии миодистрофий одними авторами обнаружено уменьшение содержания тайтина (Matsumura et al., 1990; Cullen et al., 1992), тогда как другими исследователями подобных изменений в содержании этого белка не зарегистрировано (Horowits et al., 1990). Противоречивость имеющихся литературных данных не позволяет сделать чётких заключений о роли разных изоформ тайтина в патогенезе исследуемых заболеваний. Несомненно, что для лучшего понимая роли тайтина при патологии необходимо более детальное исследование структурно-функциональных свойств этого белка в норме и при адаптации. Поэтому сравнительное исследование структурно-функциональных свойств тайтина в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах является актуальной фундаментальной задачей и имеет важное прикладное значение.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Цель данной работы: исследование структурно-функциональных свойств тайтина сердечной и скелетных мышц животных и человека в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах.

Задачи работы:

1. Провести электрофоретическое исследование тайтина сердечной и скелетных мышц человека и животных для выявления новых высокомолекулярных изоформ этого белка;

2. Изучить in vitro молекулярные параметры и агрегационные свойства тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика; его связывание с актиновыми и миозиновыми нитями и влияние на ферментативные и регуляторные свойства миозина;

3. Исследовать сезонные изменения изоформного состава тайтина и степени его фосфорилирования в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов 8регторЫ1ив ипйиШш',

6. Изучить изменения изоформного состава тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс (БНК) при развитии гипертрофии, в миокарде человека с конечной стадией развития ДКМП и в спинной мышце человека с синдромом «ригидного человека».

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ТАЙТИНА

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Вихлянцев, Иван Милентьевич

выводы

1. Разработан метод ДСН-электрофореза в горизонтальном геле и модифицированы известные методы ДСН-электрофореза в вертикальных гелях для исследования полиморфизма гигантского белка тайтина, с помощью которых в поперечно-полосатых мышцах животных и человека» наряду с известными N2A-, N2BA- и К2В-изоформами тайтина были обнаружены более высокомолекулярные изоформы этого белка.

2. Обнаружено, что при сохранении содержания более высокомолекулярных изоформ тайтина в поперечно-полосатых мышцах сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации, уменьшение (в -1.3-1.5 раза) содержания известных изоформ этого белка не сопровождается нарушением структурно-функциональных свойств мышц спящих животных. Сделано заключение об адаптационном значении сохранения в мышцах гибернирующих сусликов, более высокомолекулярных изоформ тайтина для поддержания упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и необходимого уровня сократительной активности мышц при спячке и пробуждении, что способствует выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий.

3. В поперечно-полосатых мышцах человека и крысы при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы у SHR, дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека»), а также при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома» наряду с уменьшением (в -1.5-2.5 раза) содержания известных изоформ тайтина обнаружено уменьшение (в ~2-5 раз) или полное разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка, что вносит основной вклад в нарушение структурно-функциональных свойств мышц. Сделано заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-функциональных характеристик мышц играют не N2A-, N2BA- и ШВ-изоформы тайтина, а открытые более высокомолекулярные изоформы этого белка.

6. Проведены исследования структурно-функциональных свойств тайтина, выделенного из поперечно-полосатых мышц кролика и суслика. Показана способность тайтина связываться in vitro с акгиновыми нитями и обнаружен о I его активирующий эффект на Са -чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина скелетных мышц спящих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния этого белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са -чувствительность миозина in vitro. Полученные результаты указывают на участие тайтина в регуляции аюгин-миозинового взаимодействия в мышцах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые нами с помощью разработанной методики ДСН-электрофореза в горизонтальном геле, а также модифицированных методик ДСН-электрофореза в вертикальных гелях и Веетерн-блоттинга исследования изоформного состава тайтина в поперечно-полосатых мышцах человека и животных в норме показали, что наряду с известными N2A-, N2BA- и К2В-изоформами тайтина в мышцах присутствуют более высокомолекулярные изоформы этого белка, перекрывающие расстояние от М-линии до Z-диска саркомера. Невозможность выделения новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина известными, методами изоляции этого белка не позволила нам провести изучение их структурно-функциональных свойств. Однако были проведены исследования вклада изменений качественного и количественного состава новых изоформ тайтина в изменения структурно-функциональных свойств в мышцах млекопитающих при адаптации к экстремальным условиям среды (гибернация, микрогравитация) и при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы, ДКМП, синдром «ригидного человека»). Результаты проведённых исследований позволили нам сделать заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-функциональных свойств мышц играют не известные изоформы тайтина, а открытые нами более высокомолекулярные интактные изоформы этого белка, разрушение которых приводит к нарушению структуры миофибриллярного аппарата и снижению сократительной способности мышц. Полученные результаты, помимо фундаментальной ценности, имеют важное практическое значение, поскольку тестирование изменений качественного и количественного состава тайтина в мышцах и, главным образом, новых изоформ этого белка, может быть использовано в медицинской практике с целью диагностики развития патологических процессов и оценки эффективности подходов к их коррекции.

Са2+ -чувствительность миозина in vitro. Сделано предположение о вкладе фосфорилировашЫ тайтина в ингибирование сократительной активности скелетных мышц сусликов в период гибернации. Эти данные также свидетельствуют о важной роли тайтина в регуляции мышечного сокращения. При развитии гипертрофии сердечной мышцы у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) обнаружено увеличение экспрессии гена тайтина в миокарде 15-недсльных крыс и снижение экспрессии гена этого белка в миокарде 26-недельных крыс. Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития патологических изменений в гипертрофированной сердечной мышце и могут быть использованы в диагностике развития этого заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вихлянцев, Иван Милентьевич, Пущино

1. Абдрешов С.Н., Булекбаева Л.Э., Демченко Г.А. (2008) Морфофункцнональное состояние шейных лимфатических узлов в условиях микрогравитации // Бюллетень СО РАМН. № 2 (130). С. 30-34.

2. Адо А.Д., Ишимова Л.М. в книге: «Патологическая физиология», 1973, М.: Медицина, 536 с.

3. Белостоцкая Г.Б., Захаров Е.А., Клюева Н.З., Петрова Е.И., Наследов Г.А. (2008) Нарушения в работе рианодиновых рецепторов кардиомиоцитов спонтанно-гипертензивных крыс, выявленные с помощью 4-хлор-м-крезола // Биофизика. Т. 53. вып. 6. С. 1033-1037.

4. Бронников Г.Е. (1987) Возможные пути регуляции энергетического метаболизма у зимоспящих. Кинетический подход // В сб. «Механизмы зимней спячки», Пущино, с. 25-32.

5. Вихлянцев И.М., Алексеева Ю.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2002) Изучение свойств С-белка скелетных и сердечных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика, т. 47, № 4, с. 701-705.

6. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2003) Фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков адаптационный фактор ингибирования сократительной активности мышц при зимней спячке // Биофизика, т. 48, № 3, с. 499-504.

7. Ю.Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С. (2004) Роль опорной афферентации в организации тонической мышечной системы // Российский физиологический журнал им. ИМ. Сеченова. № 5. С. 508-521.

8. П.Гуровский H.H., Еремин A.B., Газенко О.Г., Егоров А.Д., Брянов И.И., Генин А.М. (1975) Медицинские исследования в космических полетах кораблей «Союз-12, 13, 14,» и орбитальной станции «Салют-3» // Космич. Биол. и мед. №'2. С.48-53.

9. Жегунов Г.Ф., Микулинский Ю.Е. (1987) Активация синтеза белка в тканях сусликов при пробуждении после зимней спячки. // Украинский биохимический журнал. Т.59. №3. С. 69-73.

10. В.Захарова Н.М., Накипова О.В., Аверин A.C., Тихонов К.Г., Соломонов Н.Г. (2009) Модификация ритмоинотропных характеристик при охлаждении папиллярных мышц сердца гибернирующих сусликов // Доклады Академии Наук. Т. 424. № 5. С. 696-699.

11. Н.Зуйкова О.В., Осипова Д.А., Вихлянцев И.М., Малышев C.JL, Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2005) Легкие цепи миозина скелетных и сердечных мышц суслика Citellus undulatus в разные периоды зимней спячки // Биофизика. Т. 50. № 5. С. 797-802.

12. Игнатьев Д. А., Загнойко В. И., Сухова Т. С., Баканева В.Ф., Сухов В.П. (1995) К вопросу о биологически активных веществах в тканях зимоспящих // Журн. общ. биологии. Т. 56 №4. С. 450-469.

13. Игнатьев Д.А., Сухова Г.С., Сухов В.П. (2001) Анализ изменений частоты сердцебиений и температуры суслика Citellus undulatus в различных физиологических состояниях // Журн. общ. биологии. Т. 62. № 1. С. 66-77.

14. П.Игнатьев Д.А., Воробьёв В.В., Зиганшин Р.Х. (2005) Влияние синтетического аналога пептида TSKY, выделенного из мозга зимнеспящего суслика, на крыс и мышей // Журнал Высшей Нервной Деятельности. Т. 55. № 1. С. 84-90.

15. Калабухов Н. И. (1985) Спячка млекопитающих. Москва, «Наука», 285 с.

16. Какурин Л.И., Черепахин М.А., Первушин В.Н. (1971) Влияние факторов космического полета на мышечный тонус у человека // Косм. Биол. и мед. Т. 5. №2. С. 63-68.

17. Карманова И.Г. (1977) Эволюция сна (этапы формирования цикла бодрствование-сон в ряду позвоночных) // Л.: Наука. 174 с.

18. Карманова И.Г., Оганесян Г.А. (1994) Физиология и патология цикла бодрствование-сон. Эволюционные аспекты // СПб: Наука. 200 с.

19. Клика Э., Зайцова А. (1984) Изменения структурных элементов органов у летучих мышей в периоды активности и гибернации // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. Т. 87 (9). С. 47-52.

20. Кличханов Н.К. (2001) Метаболические и структурно-функциональные изменения в плазме крови и эритроцитах при гипотермии // Науч. мысль Кавказа. Приложение. Спецвыпуск. С. 38-50.

21. Козлова В.Ф., Юрченко Т.Н. (1996) Структурные аспекты адаптации зимнеспящих животных // Проблемы криобиологии. № 3. С. 44-51.

22. Козловская И.Б., Григорьева Л.С., Гевлич Г.И. (1984) Сравнительный анализ влияния невесомости и её моделей на скоростно-силовые свойства и тонус скелетных мышц человека // Космическая биология и авиакосмическая медицина. № 6. С. 12-15.

23. Команденко Н.И., Валикова Т.А., Алиферова В.М. и др. (1998) Синдром ригидного человека // Журн. неврол. и психиатрии им. С.С. Корсакова. Т. 11. С. 49-50.

24. Котовская А.Р., Фомина Г.А. (2010) Особенности адаптации и дезадаптации сердечно-сосудистой системы человека в условиях комического полёта // Физиология человека. Т. 36. №2. С. 78-86.

25. Лукоянова H.A., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. (1997а) Изучение АТФазных и регуляторных свойств миозина скелетных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика, т. 42, № 1, с. 343-348.

26. Лушникова Е.Л., Непомнящих Г.И., Туманов В.П., Непомнящих Л.М., Гончар A.M. (1983) Ультраструктурный стереологический анализ кардиомиоцитов у крыс со спонтанной генетической гипертонией // Бюллют. эксперимент, биолог. № I. С. 97-100.

27. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. (2003) Морфологическая и стереологическая характеристика ремоделирования миокарда стареющих спонтанпо-гипертензивных крыс SHR // Бюллют. эксперимент, биолог, и мед. Т. 135 (2). С. 208-214.

28. Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структурно-функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Биофизика. Т. 47. № 4. С. 706-710.

29. Малышев C.JI., Оеипова Д.А., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2006) Сезонные изхменения фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина и С-белка в миокарде зимнеспящего суслика Citellus undulatus И Биофизика, Т. 51, №5, С. 929-933.

30. Мальберг С.А. (2005) Синдром ригидного человека. В кн.: Болезни нервной системы (под ред. Н.Н. Яхно) М.: Медицина. Т.1: 637 с.

31. Моисеев B.C. (2000) Сердечная недостаточность и достижения генетики. Достижения в изучении генома человека делают все более и более значимой оценку различных генетических аспектов при конкретных видах патологии // Consilium Mudicum. Т. 1.№4: 121-131.

32. Морман Д., Хеллер Л. (2000) Физиология сердечно-сосудистой системы // (пер. с англ.). СПб. Питер. 256с.

33. Мравян С.Р., Канвар С., Голухова Е.З. (1997) Клинико-инструментальные показатели в оценке прогноза миокардита и дилатационной кардиомиопатии // Кардиология. № 7. С. 67-72.

34. Подлубная З.А. Минорные белки толстых нитей (1987) // В кн.: Структура и функция белков сократительных систем, Л., Наука, 1987, с.32-70.

35. Подлубная З.А. (1992) Ферменты в толстых нитях поперечно-полосатых мышц позвоночных//Биохимия. Т. 57 (12). С. 1785-1814.

36. Постникова Г. Б., Целикова С. В., Игнатьев Д. А., Колаева С. Г. (1997) Сезонные изменения содержания миоглобина в мышцах зимоспящего якутского суслика. Биохимия Т. 62. С. 167 170.

37. Рубцов A.M. (2005) Сезонные изменения активности кальций-транспортирующих систем в сердце и скелетных мышцах гибернирующих животных // Российский физиол. журн. им. И.М. Сеченова. Т. 91(2). С. 141151.

38. Семёнова Т.П., Медвинская Н.И., Колаева С.Г., Соломонов* Н.Г. (1998) Сезонные изменения интегративной деятельности мозга зимнеспящих животных // Доклады Академии Наук. Т. 363. № 4. С. 567-569.

39. Семёнова Т.П., Аношкина И.А., Долгачёва Л.П., Абжалелов Б.А., Колаева С.Г. (2000) Сезонные особенности моноаминергической регуляции поведения гибернирующих животных // Росс. Физиол. Жур. им. И.М. Сеченова. Т. 86. № 9. С. 1188-1194.

40. Слоним А.Д. (1986) // В кн.: «Эволюция терморегуляции», Л.: Наука, 76 с.

41. Смирнов К.В. (1990) // В* кн.: «Пищеварение и гипокинезия». Изд. «Медицина». 1990.

42. Соколов В. Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д. А. (1995) Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика Citellus undulates. Докл. Акад. Наук. Т. 344. С. 282-286.

43. Фрейдина H.A. (1987) Исследование С- и F- минорных белков толстых нитей скелетных мышц кролика // Диссертационная работа. Пущино. 164 с.

44. ХалинаЯ.Н., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2002) Изменение состава легких цепей сердечного миозина при дилатационной кардиомиопатии: влияние на функциональные свойства // Биофизика. Т. 47. № 2. С. 361-366.

45. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация // М.: Мир. 568 с.

46. Хубутия М.Ш. (2001) Дилатационная кардиомиопатия. Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 3-4: 32-40.

47. Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф. (1975) Имитация детренированности организма методом "сухого" погружения // В кн.: X чтения К.Э. Циолковского. Секц. «Пробл. космич. мед. биол.» с. 39-47.

48. Adams G.R., Caiozzo V.J., Baldwin К.М. (2003) Skeletal muscle unweighting: spaceflight and ground-based models. // J Appl Physiol. V. 95(6). P. 2185-2201.

49. Agarkova I., Ehler E., Lange S., Schoenauer R., Perriard J.C. (2003) M-band: a safeguard for sarcomere stability? // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 24(2-3). P. 191203.

50. Agarkova I., Schoenauer R., Ehler E., Carlsson L., Carlsson E., Thornell L.E., Perriard J.C. (2004) The molecular composition of the sarcomeric M-band correlates with muscle fiber type // Eur J. Cell Biol. V. 83(5). P. 193-204.

51. Agostini В., De Martino L., Soltau В., Hasselbach W. (1991) The modulation of the calsium transport by skeletal muscle sarcoplasmic reticulum in the hibernating European hamster // Z. Naturforsch., C. J. Biosci. V. 46. P. 1109-1126.

52. Akopova I.S., Shpagina M.D., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. (1998) Light chains of myosin in dilated cardiomyopathy: markers of adaptive and pathological stages. J. Mol. Cell Cardiol., v.30, p.A29.

53. Anzil A.P., Sancesario G., Massa R., Bernardi G. (1991) Myofibrillar disruption in the rabbit soleus muscle after one-week hindlimb suspension // Muscle Nerve. V. 14(4). P. 358-369.

54. Arata Y. Geshi E., Nomizo A., Aoki S., Katagiri T. (1999) Alterations in Sarcoplasmic Reticulum and Angiotensin II Receptor Type 1 Gene Expression in Spontaneously Hypertensive Rat Hearts // Jpn. Circ. J. V. 63. P. 367 -372.

55. Arber S., Haider G., Caroni P. (1994) Muscle LIM protein, a novel* essential regulator of myogenesis, promotes myogenic differentiation // Cell. V. 79(2). P. 221-231.

56. Arber S., Hunter J. J., Ross J J., Hongo M., Sansig G. et al. (1997) MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure // Cell. V. 88. P. 393-403.

57. Astier C., Raynaud F., Lebart M.C., Roustan C., Benyamin Y. (1998) Binding of a native titin fragment to actin is regulated by PIP2 // FEBS Lett. V. 429 (1). P. 95-98.

58. Averianov Iu.N., Ilina N.A., Vinogradova N.V., Potomskaia L.Z., Sokolina N.A. (1981) Rigid spine syndrome Article in Russian. // Zh. Nevropatol. Psikhiatr. Im. S. S. Korsakova. V. 81(10). P. 1457-1461.

59. Ayoob J.C., Turnacioglu K.K., Mittal B., Sanger J.M., Sanger J.W. (2000) Targeting of cardiac muscle titin fragments to the Z-bands and dense bodies of living muscle and non-muscle cells // Cell. Motil. Cytoskeleton. V. 45. P.67-82.

60. Sl.Barariska W., Skopinski P., Kaplanski A. (1990) Morphometrical evaluation of myocardium from rats flown on biosatellite Cosmos-1887 // Mater Med. Pol. V. 22(4), P. 255-257.

61. Bell S.P., Nyland L., Tischler M.D., McNabb M., Granzier H., LeWinter M.M. (2000) Alteration in the determinants of diastolic suction during pacing tachycardia //Circ. Res. V. 87. P. 235-240.

62. Bennett P., Craig R., Starr R., ffer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle // J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. 550-567.

63. Bianco P., Nagy A., Kengyel A., Szatmari D., Martonfalvi Z., Huber T. Kellermayer M.S. (2008) Interaction forces between F-actin and titin PEVK domain measured with optical tweezers // Biophys J. V. 93(6). P. 2102-2109.

64. Blaber E., Mar?al H., Burns B.P. (2010) Bioastronautics: the influence of microgravity on astronaut health // Astrobiology. V. 10(5). P. 463-473.

65. Bocharova L.S., Gordon R.Y., and Arkhipov V.I. (1992) Uridine uptake and RNA synthesis in the brain of torpid and awakened ground squirrels. // Comp. Biochem. Physiol. V. 101. P. 189-192.

66. Bonne G., Muchir A. (1999) Spectrum of mutation in laminin A/C gene implicated in a new form of DCM with conduction defects and muscular dystrophy // Circulation. V. 100 (18). P. 255-262.

67. Booth F.W., Seider M.J. (1979) Recovery of skeletal muscle after 3 mo of hindlimb immobilization in rats // J. Appl. Physiol. V. 47(2). P. 435-439.

68. Boyer B.B., Barnes B.M. (1999) Molecular and metabolic aspects of mammalian hibernation. // Bioscience. V. 49. P. 713-724.

69. Brauch K.M., Dhruv N.D., Hanse E.A., Andrews M.T. (2005) Digital transcriptome analysis indicates adaptive mechanisms in the heart of a hibernating mammal // Physiol Genomics. V. 23(2). P. 227-234.

70. Brigham R.M., Ianuzzo C.D., Hamilton N., Fenton M.B. (1990) Histochemical and biochemical plasticity of muscle fibers in the little brown bat (Myotis lucifugus) // J. Comp. Physiol. V. 160. P. 183-186.

71. Bronnikov, G.E., Vinogradova, S.O., Mezentseva, V.S. (1990) Changes in kinetics of ATP-synthase and in concentration of adenine nucleotides in ground squirrel liver mitochondria during hibernation // Comp. Biochem. Physiol. V. B97. P. 411415.

72. Bullard B., Ferguson C., Minajeva A., Leake M.C., Gautel M., Labeit D., Ding L., Labeit S., Horwitz J., Leonard K.R., Linke W.A. (2004) Association of the chaperone alphaB-crystallin with titin in heart muscle // J. Biol. Chem. V. 279(9). P. 7917-7924.

73. Butler M.H., Hayashi A., Ohkoshi et al. (2000) Autoimmunity to gephyrin in Stiff-Man syndrome //Neuron. V. 26. P. 307-312.

74. Carey H.V., Andrews M.T., Martin S.L. (2003) Mammalian hibernation: cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. // Physiol. Rev. V. 83. P. 1153-1181.

75. Carlsson L., Thornell L.E. (2001) Desmin-related myopathies in mice and man // Acta Physiol. Scand. V. 171. P. 341-348.

76. Cazorla O., Vassort G., Gamier D., Le Guennec J.Y (1999) Lenght modulation of active force in rat cardiac myocytes: is titin the sensor? // J. Mol. Cell. Cardiol. V. 31. P. 1215-1227.

77. Cazorla O., Freiburg A., Helmes M., Centner T., McNabb M.5 Wu Y., Trombitas K., Labeit S., Granzier H. (2000) Differential expression of cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness // Circ. Res.V. 86. P. 59-67.

78. Chang A.N., Potter J.D. (2005) Sarcomeric protein mutations in dilated cardiomyopathy // Heart Fail Rev. V. 10(3). P. 225-235.

79. Chen Y., Matsushita M., Nairn A.C., Damuni Z., Cai D., Frerichs K.U. Hallenbeck J.M. (2001) Mechanisms for increased levels of phosphorylation of elongation factor-2 during hibernation in ground squirrels // Biochem. V. 40. P. 11565-11570.

80. Chopard A., Leclerc L., Muller J., Pons F., Leger J.J., Marini J.F. (1998) Effect of a 14-day spaceflight on dystrophin associated proteins complex in rat soleus muscle // J. Gravit. Physiol. V. 5(1). P. 67-68.

81. Collins J.F., Pawloski-Dahm C., Davis M.G., Ball N., Dorn G.W. 2nd, Walsh R.A. (1996) The role of the cytoskeleton in left ventricular pressure overload hypertrophy and failure // J. Mol. Cell Cardiol. V. 28(7). P. 1435-1443.

82. Cox G.F., Kunkel L.M. (1997) Dystrophies and heart disease // Curr. Opin. Cardiol. V. 12. P. 329-343.

83. Cullen M.J., Fulthorpe J.J., Harris J.B. (1992) The distribution of desmin and titin in normal and dystrophic human muscle // Acta Neuropathol. V. 83. P. 158169.

84. Cutilletta A.F., Benjamin M., Culpepper W.S., Oparil S. (1978) Myocardial hypertrophy and ventricular performance in the absence of hypertension in spontaneously hypertensive rats // J. Mol. Cell Cardiol. V. 10(8). P. 689-693.

85. Dapp C., Schmutz S., Hoppeler H., Flück M. (2004) Transcriptional reprogramming and ultrastructure during atrophy and recovery of mouse soleus muscle // Physiol. Genomics. V. 20(1). P. 97-107.

86. De-Doncker L. Picquet F., Falempin M. (2000) Effects of cutaneous receptor stimulation on muscular atrophy developed in hindlimb unloading condition // J. Appl. Physiol. V. 89. P. 2344-2351.

87. Desplanches D. (1997) Structural and functional adaptations of skeletal muscle to weightlessness // Int. J. Sports Med. V. 18. Suppl 4. P.S259-264.

88. Ebashi S. and Endo M. (1968) Calcium ion and muscle contraction // Prog. Biophys. Mol. Biol. V. 18, P. 123-183.

89. Enns D.L., Raastad T., Ugelstad L., Belcastro A.M. (2007) Calpain/calpastatin activities and substrate depletion patterns during hindlimb unweighting and reweighting in skeletal muscle // Eur. Journ. Appl. Physiol. V. 100. P. 445-455.

90. Epperson L.E., Martin S.L. (2002) Quantitative assessment of ground squirrel mRNA levels in multiple stages of hibernation. // Physiol. Genomics. V. 10(2). P. 93-102.

91. Fahlman A., Storey J.M., Storey K.B. (2000) Gene up-regulation in heart during mammalian hibernation // Cryobiology V. 40(4). P. 332-342.

92. Fährmann M., Erfmann M., Beinbrech G. (2002) Binding of CaMKII to the giant muscle protein projectin: stimulation of CaMKII activity by projectin // Biochim. Biophys. Acta. V. 1569 (1-3). P. 127-134.

93. Feuer G., Molnar F., Pettko E., Straub F.B. (1948) Studies on the composition and polymerization of actin // Hung. Acta Physiol. V. 1 (4-5). P. 150163.

94. Fitzsimons D. P., Bodell P. W., Baldwin K. M. (1989) Phosphorylation of rodent cardiac myosin light chain 2: effects of exercise // J. Appl. Physiol. V. 67. P. 2447-2453.

95. Franz W.M., Müller O.J., Katus H.A. (2001) Cardiomyophathies: from genetics to the prospect of treatment // The Lancet. V. 358 (9293). P. 1627-1637.

96. Freiburg A., Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin-binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy // Eur. J. Biochem. V. 235(1-2). P. 317-323.

97. Frey N., Olson E.N. (2002) Calsarcin-3, a novel skeletal muscle-specific member of the calsarcin family, interacts with multiple Z-disc proteins // J. Biol. Chem. V. 277(16). P. 13998-14004.

98. Fritz J.D., Swartz D.R., Greaser M.L. (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight' myofibrillar, proteins // Analyt. Biochem. V. 180. P. 205-210.

99. Fukuda N., Wu Y., Farman G., Irving T.C., Granzier H. (2005a) Titin-based modulation of active tension and interfilament lattice spacing in skinned rat cardiac muscle // Pflugers Arch. V. 449(5). P. 449-457.

100. Fukuda N., Wu Y., Nair P., Granzier H.L. (2005b) Phosphorylation of titin modulates passive stiffness of cardiac muscle in a titin isoform-dependent manner // J. Gen. Physiol. V. 125(3). P. 257-271.

101. Furukawa T., Ono Y., Tsuchiya H., Katayama Y., Bang M.L., Laheit D., Labeit S., Inagaki N., Gregorio C.C. (2001) Specific interaction of the potassium

102. Channel beta-subunit minK with the sarcomeric protein T-cap suggests a T-tubule-myofibril linking system // J. Mol. Biol. V. 313(4). P. 775-784.

103. Gasnikova N.M., Shenkman B.S. (2005) Influence of rat hindlimb suspension on sarcolemmal dystrophin and its sensitivity to mechanical damage // J. Gravit. Physiol. V. 12. P. 125-126.

104. Gautel M., Leonard K., Laheit S. (1993) Phosphorylation of KSP motifs in the C-terminal region of titin in differentiating myoblasts // EMBO J. V. 12. P. 3827-3834.

105. Gautel M., Goulding D., Bullard B., Weber K., Fürst D.O. (1996) The central Z-disk region of titin is assembled from a novel repeat in variable copy numbers // J. Cell Sei. V. 109. P. 2747- 2754.

106. Gautel M. (2011) Cytoskeletal protein kinases: titin and its relations in mechanosensing // Pflugers Arch. Mar 18. Epub ahead of print.

107. Gerull B., Grämlich M., Atherton J., McNabb M., Trombitas K., et al. (2002) Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cardiomyopathy // Nat. Genet. V. 30. P. 201-204.

108. Godfrey J.E., Harrington W.F. (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimer equilibrium // Biochemistry. V. 9 (4). P. 894-908.

109. Goldspink D.F. (1977) The influence of denervation and stretch on the size and protein turnover of rat skeletal muscle // J. Physiol. V. 269 (1). P. 87P-88P.

110. Goldstein M.A., Edwards R.J., Schroeter J.P. (1992) Cardiac morphology after conditions of microgravity during COSMOS 2044 // J. Appl. Physiol. V. 73(2 Suppl), P. 94S-100S.

111. Goll D.E., G. Neti, S.W. Mares, V.F. Thompson (2008) Myofibrillar protein turnover: the proteasome and the calpains // J. Anim. Sci.V. 86 (E. Suppl.): El 9-E35.

112. Goto K., Okuyama R., Honda M., Uchida H., Akema T., Ohira Y., Yoshioka T. (2003) Profiles of connectin (titin) in atrophied soleus muscle induced by unloading of rats // J. Appl. Physiol. V. 94(3). P. 897-902.

113. Granzier H.L., Wang K. (1993) Gel electrophoresis of giant proteins: solubilization and silver-staining of titin and nebulin from single fiber segments // Electrophoresis. V. 14. P. 56-64.

114. Granzier H.L., Irving T.C. (1995) Passive tension in cardiac muscle: contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments // Biophys J. V. 68. P. 1027-1044.

115. Granzier H., Kellermayer M., Helmes M., Trombitas K. (1997) Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. V. 73. P. 2043-2053.

116. Granzier H., Labeit S. (2004) The giant protein titin. A major player in myocardial mechanics, signaling and disease // Circ. Res. V. 94. P. 284-295.

117. Granzier H.L., Labeit S. (2006) The giant muscle protein titin is an adjustable molecular spring // Exerc. Sport Sci. Rev. V. 34(2). P. 50-53.

118. Granzier H., Wu Y., Siegfried L., LeWinter M. (2005) Titin: physiological function and role in cardiomyopathy and failure // Heart Fail. Rev. 10(3):211-223.

119. Gregorio C.C., Trombitas K., Centner T., Kolmerer B., Stier G., et al. (1998) The NH2 terminus of titin spans the Z-disc: its interaction with a novel 19-kD ligand (T-cap) is required for sarcomeric integrity // J. Cell Biol. V. 143. P. 1013— 1027.

120. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.

121. Guo W., Bharmal S.J., Esbona K., Greaser MI. (2010) Titin diversity-alternative splicing gone wild // J. Biomed. Biotechnol. V. 2010. P. 753675

122. Gutierrez-Cruz G., Van Heerden A.FI., Wang K. (2001) Modular motif, structural folds and affinity profiles of the PEVK segment of human fetal skeletal muscle titin // J. Biol. Chem. V. 276. P. 7442-7449.

123. Hanson J., Huxley H.E. (1953) Structural basis of the cross-striations in muscle // Nature. V. 172. P. 530-532.

124. Hanson J., Huxley H.E. (1955) The structural basis of contraction in striated muscle // Symp. Soc. Exp. Biol. V. 9. P. 228-264.

125. Hartshorne D.J., Ito M., Erdodi F. (2004) Role of protein phosphatase type 1 in contractile functions: Myosin phosphatase // J. Biol. Chem. V. 279P. 3721137214.

126. Hem S., Scholz D., Fujitani N., Rennollet H., Brand T., Friedl A., Schaper J. (1994) Altered expression of titin and contractile proteins in failing human myocardium // J. Mol. Cell Cardiol. V. 10. P. 1291-1306.

127. Hein S., Kostin S., Heling A., Maeno Y., Schaper J. (2000) The role of the cytoskeleton in heart failure // Cardiovasc. Res. V. 45. P. 273-278.

128. Helmes M., Trombitas K., Granzier H. (1996) Titin develops restoring force in rat cardiac myocytes // Circ. Res. V. 79. P. 619-626.

129. Helmes M., Lim C.C., Liao R., Bharti A., Cui L., Sawyer D.B. (2003) Titin determines the Frank-Starling relation in early diastole // J. Gen. Physiol. V. 121(2). P. 97-110.

130. Herring B.P., England P.J. (1986) The turnover of phosphate bound to myosin light chain-2 in perfused rat heart // Biochem. J. V. 240. P. 205—214.

131. Iiiguchi H. (1992) Changes in contractile properties with selective digestion of connectin (titin) in skinned fibers of frog skeletal muscle // J. Biochem. V. 111(3). P. 291-295.

132. Horowits R., Kempner E.S., Bisher M.E., Podolsky R.J. (1986) A physiological role for titin and nebulin in skeletal muscle // Nature. V. 323. P. 160164.

133. Horowits R., Dalakas M.C., Podolsky R.J. (1990) Single skinned muscle fibers in Duchenne muscular dystrophy generate normal force // Ann. Neurol. V. 27(6). P. 636-641.

134. Horowits R. (1992) Passive force generation and titin isoforms in mammalian skeletal muscle // Biophys J. V. 61(2). P. 392-398.

135. Hoshijima M. (2006) Mechanical stress-strain sensors embedded in cardiac cytoskeleton: Z disk, titin, and associated structures // Am J Physiol Heart Circ Physiol. V. 290(4). P. H1313-1325.

136. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. V. 131. P. 1^71-1481.

137. Hudson N.J., Franklin C.E. (2002) Maintaining muscle mass during extended disuse: aestivating frogs as a model species // J. Exp. Biol. V. 205(Pt 15). P. 22972303.

138. Hunter R.J., C. Neagoe, H.A. Jarvelainen, Martin C.R., Lindros K.O., Linke W.A., Preedy V.R. (2003) Alcohol Affects the Skeletal Muscle Proteins, Titin and Nebulin in Male and Female Rats // J. Nutr. V. 133. P. 1154-1157.

139. Huxley A.F.,'Niedergerke R. (1954) Structural changes in muscle during contraction. Interference microscopy of living muscle cells // Nature. V. 173. P. 971-973.

140. Pluxley H.E., Hanson J. (1954) Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation //Nature. V. 173. P. 973-976.

141. Huxley H.E. Hanson J. (1960) In: Structure and function of muscle, Ed. G. H. Bourne (Acad. Press, New-York and London, 1960). P. 183-227.

142. Huxley H.E. (1972) In: Structure and function of muscle, Ed. G. H. Bourne (Acad. Press, New-York and London, 1972). V. 1. Part 1. 301 p.

143. Inagaki N, Hayashi T, Arimura T, Koga Y, Takahashi M, Shibata H, Teraoka K, Chikamori T, Yamashina A, Kimura A. (2006) Alpha B-crystallin mutation in dilated cardiomyopathy // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 342(2). P. 379-86.

144. Ingalls C.P., Warren G.L., Armstrong R.B. (1999) Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading // J. Appl. Physiol. V. 87(1). P. 386-390.

145. Isaacs W. B., Kim I. S., Struve A., Fulton A. B. (1989) Biosynthesis of Titin in Cultured Skeletal Muscle Cells // J. Cell. Biol. V. 109. P: 2189-2195.

146. Itoh Y. Kimura S., Suzuki T., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle // J. Biochem. V. 100(2). P. 439-447.

147. Itoh-Satoh M., Hayashi T., Nishi H., Koga Y., Arimura T., et al. (2002) Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 291. P. 385-393.

148. Jaspers S.R., Fagan J.M., Satarug S., Cook P.H., Tischler M.E. (1988) Effects of immobilization on rat hind limb muscles under non-weight-bearing conditions // Muscle Nerve. V. 11(5). P. 458-466.

149. Jin J.P. (2000) Titin-thin filament interaction and potential role in muscle function //Adv. Exp. Med. Biol. V.481. P. 319-333. discussion 334-335.

150. Karpakka J., Virtanen P., Vaananen K., Orava S., Takala T.E. (1991) Collagen synthesis in rat skeletal muscle during immobilization and remobilization // J. Appl. Physiol. V. 70(4), P. 1775-1780.

151. Kasper E.K., Agema W.R., Hutchins G.M., Deckers J.W., Hare J.M., Baughman K.L. (1994) The causes of dilated cardiomyopathy: a clinicopathologic review of 673 consecutive patients // J. Am. Coll. Cardiol. V. 23 (3). P. 586-590.

152. Kawaguchi N., Fujitani N., Schaper J., Onishi S. (1995) Pathological changes of myocardial cytoskeleton in cardiomyopathic hamster // Mol.Cell Biochem. V. 144. P. 75-79.

153. Kim M.H., Park K., Gwag B.J., Jung N.P., Oh Y.K., Shin H.C., Choi I.H. (2000) Seasonal biochemical plasticity of a flight muscle in a bat, Murina leucogaster // Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. V. 126(2). P. 245250.

154. Kimura S., Maruyama K., Huang Y.P. (1984) Interactions of Muscle p-Connectin with Myosin, Actin, and Actomyosin at Low Ionic Strengths // Biochem. J. V. 96. P. 499-506.

155. Kimura S., Matsuura T., Ohtsuka S., Nakauchi Y., Matsuno A., Maruyama K. (1992) Characterization and localization of alpha-connectin (titin 1): an elastic protein isolated from rabbit skeletal muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 13(1). P. 39-47.

156. King N.L., Kurth L. (1980) SDS gel electrophoresis studies of connectin // In: Fibrous proteins (Parry D., Creamer L.K. eds.) V. 2. Acad. Press. London. P. 5767.

157. Knight J.E., Narus E.N., Martin S.L., Jacobson A., Barnes B.M., Boyer B.B. (2000) mRNA stability and polysome loss in hibernating Arctic ground squirrels (Spermophilusparryii) II Mol. Cell. Biol. V. 20(17). P. 6374-6379.

158. Koerner C., Wieland B., Richter W., Meinck H. (2004) Stiff-person syndromes: motor cortex hyperexcitability correlates with anti-GAD autoimmunity //Neurology. V. 62 (8). P. 1357-1362.

159. Kong Y., Flick M.J., Kudla A.J., Konieczny S.F. (1997) Muscle LIM protein promotes myogenesis by enhancing the activity of MyoD // Mol. Cell Biol. V. 17(8). P. 4750-4760.

160. Kontrogianni-Konstantopoulos A., Jones E.M., Van Rossum D.B., Bloch R.J. (2003) Obscurin is a ligand for small ankyrin 1 in skeletal muscle // Mol. Biol. Cell. V. 14(3). P. 1138-1148.

161. Koretz J.F., Irving T.C., Wang K. (1993) Filamentous aggregates of native, titin and binding of C-protein and AMP-deaminase // Arch. Biochem.Biophys. V. 304 (2). P. 305-309.

162. Krüger M., Wright J., Wang K. (1991) Nebulin as a length regulator of thin filaments of vertebrate skeletal muscles: correlation of thin filament length, nebulin size, and epitope profile // J. Cell Biol. V. 115(1). P. 97-107.

163. Krüger M., Linke W.A. (2006) Protein kinase-A phosphorylates titin in human heart muscle and reduces myofibrillar passive tension // J. Muscle Res. Cell Motil. V. V. 27(5-7). P. 435-444.

164. Kulke M., Fujita-Becker S., Rostkova E., Neagoe C., Labeit D., Manstein D.J., Gautel M., Linke W.A. (2001). Interaction between PEVK-titin and actin filaments: origin of a viscous force component in cardiac myofibrils // Circ. Res.V. 89. P. 874-881.

165. Kurabayashi M., Shibasaki Y., Komuro I., Tsuchimochi H., Yazaki Y. (1990) The myosin gene switching in human cardiac hypertrophy // Jpn. Circ. J.V. 54(9). P. 1192-1205.

166. Labeit S., Gautel M., Lakey A., Trinick J. (1992) Towards a molecular understanding of titin // EMBO J. V. 11(5). P. 1711-1716.

167. Labeit S., Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science. V. 270. P. 293-296.

168. Labeit S., Kolmerer B., Linke W.A. (1997) The giant protein titin. Emerging roles in physiology and pathophysiology // Circ. Res. V. 80(2). P. 290-294.

169. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 //Nature. V. 227 (5259). P. 680-685.

170. Lahmers S., Wu Y., Call D.R., Labeit S., Granzier H. (2004) Developmental control of titin isoform expression and passive stiffness in fetal and neonatal myocardium // Circ Res. V. 94(4). P. 505-513.

171. Lange S., Auerbach D., McLoughlin P., Perriard E., Schafer B.W., Perriard J.C., Ehler E. (2002) Subcellular targeting of metabolic enzymes to titin in heart muscle may be mediated by DRAL/FHL-2 // J. Cell Sci. V. 115(Pt 24). P. 49254936.

172. Lange S„ Ehler E., Gautel M. (2006) From A to Z and back? Multicompartment proteins in the sarcomeres // Trends Cell Biol. V. 16(1). P. 1118.

173. Lanzetta P.A., Alvarez L.J., Reinach P.S., Candia O.A. (1979) An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate // Analyt. Biochem. V. 100. P. 95-97.

174. Leake M.C., Wilson D., Gautel M., Simmons R.M. (2004) The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay // Biophys J. V. 87(2). P. 1112-1135.

175. Le Guennec J.Y., Cazorla O., Lacampagne A., Vassort G. (2000) Is titin the length sensor in cardiac muscle? Physiological and physiopathological perspectives //Adv. Exp. Med. Biol. V. 481. P. 337-348.

176. Lee E.J., Peng J., Radke M., Gotthardt M., Granzier H.L. (2010) Calcium sensitivity and the Frank-Starling mechanism of the heart are increased in titin N2B region-deficient mice // J. Mol. Cell Cardiol. V. 49(3). P. 449-458.

177. Lee K., Park J.Y., Yoo W., Gwag T., Lee J.W., Byun M.W., Choi I. (2008) Overcoming Muscle Atrophy in a Hibernating Mammal Despite Prolonged Disuse in Dormancy: Proteomic and Molecular Assessment // J. Cell. Biochem. V. 104. P. 642-656.

178. Lehman W., Szent-Gyorgyi (1975) Regulation of muscular contraction. Distribution of actin control and myosin control in the animal kingdom // J. Gen. Physiol. V. 66. P. 1-30.

179. Leterme D., Cordonnier C., Mounier Y., Falempin M. (1994) Influence of chronic stretching upon rat soleus muscle during non-weight-bearing conditions// Pflugers Arch. V. 429 (2). P. 274-279.

180. Levy L.M., Dalakas M.C., Floeter M.K. (1999) The stiff-person syndrome: an autoimmune disorder affecting neurotransmission of gamma-aminobutyric acid // Ann. Intern. Med. V. 131. P. 522-530.

181. Le Winter M.M., Granzier H. (2010) Cardiac titin: a multifunctional giant // Circulation. V. 121(19). P. 2137-2145.

182. Li D., Tapscoft T., Gonzalez O., Burch P.E., Quinones M.A. Zoghbi W.A., Hill R., Bachinski L.L., Mann D.L., Roberts R. (1999) Desmin mutation responsible for idiopathic dilated Cardiomyopathy // Circulation. V. 100. P. 461-464.

183. Li Z., Bing O.H.L. Long X., Robinson K.G., and Lakatta E.G. (1997) Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 272. P. H2313-H2319.

184. Lim C.C., Zuppinger C., Guo X., Kuster G.M., Helmes M., Eppenberger H.M., Suter T.M., Liao R., Sawyer D.B. (2004) Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes // J. Biol Chem. V. 279(9). P. 8290-8299.

185. Linke W.A., Ivemeyer M., Olivieri N., Kolmerer B., Ruegg J.C., Labeit S. (1996) Towards a molecular understanding of the elasticity of titin // J. Mol. Biol. V. 261. P. 62-71.

186. Linke W.A., Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Neagoe C., Manstein D.J., Gautel M., Fernandez J.M. (2002) PEVK domain of titin: an entropic spring with actin-binding properties // J. Struct. Biol. V. 137 (1-2). P. 194-205.

187. Linke W. (2008) Sense and stretchability: The role of titin and titin-associated proteins in myocardial stress-sensing and mechanical dysfunction // Cardiovascular Research. V. 77. P. 637-648.

188. Linke W.A., Kruger M. (2010) The giant protein titin as an integrator of myocyte signaling pathways // Physiology (Bethesda). V. 25(3). P. 186-98.

189. Livak K.J., Schmittgen T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods V. 25 (4). P. 402-408.

190. Liu B., Wang L.C.H., Belke D. (1993) Effect of temperature and pH on cardiac myofilament Ca2+ sensitivity in rat and ground squirrel // American Journal of Physiology V. 264. P. R104-R108.

191. Liu Z.X., Ma T.M., Yang H.H., Wu D.W., Wang D.S., Zhang S.J. (2003) Impact of simulated microgravity on the expression and distribution of cardiac gap junction protein CX43 Article in Chinese. Space Med. Med. Eng. (Beijing). V. 16(6), p: 448-51.

192. Liu X., Rao L., Zhou B., Zhang B.L., Wang Y.Y., Chen B., Wu Y., Huang P. (2008) ■ Titin gene mutations in Chinese patients with dilated cardiomyopathy Article in Chinese. // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. V. 36(12). PI 10661069.

193. Lohuis T.D., Harlow H.J., Beck T.D., Iaizzo P.A. (2007) Hibernating bears conserve muscle strength and maintain fatigue resistance // Physiol. Biochem. Zool. V. 80(3). P. P. 257-269.

194. Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. (1996) Binding of rabbit skeletal muscle phosphofructokinase to the filaments formed by skeletal myosins from ground squirrel at different stages of hibernstion // Biophys. J. V. 70 (2). P. A162.

195. Luther P.K., Squire J.M. (2002) Muscle Z-band ultrastructure: titin Z-repeats and Z-band periodicities do not match // J. Mol. Biol. V. 319(5). P. 1157-1164.

196. Lyman C. P. (1982) Who is Who among the Hibernators. In: Hibernation and torpor in Mammals and Birds. (Lyman C. P., Willis J. S., Malan A., Wang L. C. H., eds.). Academic Press, New York, p. 12-31.

197. Maeda M., Holder E., Lowes B., Valent S., Bies R.D. (1997). Dilated cardiomyopathy associated with deficiency of the cytoskeletal protein metavinculin // Circulation. V. 95. P. 17-20.

198. Manso A.M., Encabo A., Ferrer M., Balfagon G., Salaices M., Marin J. (1999) Changes of cardiac calcium homeostasis in spontaneously hypertensive rats //J. Autonomic Pharmacology. V. 18. P. 123-130.

199. Margossian S.S. (1985) Reversible dissociation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis // J. Biol. Chem., V. 260. №25: 13747-13754.

200. Margossian S.A., White H.D., Caulfield J.B., Norton P., Taylor S., Slayter H.S. (1992) Light chain 2 profile and activity of human ventricular myosin during dilated cardiomyopathy // Circulation. V. 85 (5). P. 1720-1733.

201. Maruyama K. (1976) Connectin, an elastic protein from myofibrils // J. Biochem. V. 80(2). P. 405-407.

202. Maruyama K., Natori R., Nomomura Y. (1976) New elastic protein from muscle //Nature. V. 262 (5563). P. 58-60.

203. Maruyama K., Kimura S., Kuroda M., Handa S. (1977a) Connectin, an elastic protein of muscle. Its abundance in cardiac myofibrils // J. Biochem. V. 82(2). P.347-350.

204. Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., Ohashi K., Murakami F., Handa S., Eguchi G. (1977b) Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. V. 82. P. 317-337.

205. Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin // J. Biochem. V. 89. P. 701-709.

206. Maruyama K., Kimura S., Yoshidomi H., Sawada H., Kikuchi M. (1984) Molecular size and shape of beta-connectin, an elastic protein of striated muscle // J. Biochem. V. 95(5). P.1423-1433.

207. Maruyama K. (1986) Connectin, an Elastic Filamentous, Protein of Striated Muscle // Int. Rev. Cytol. V. 104. P. 81-114.

208. Maruyama K., Hu D.H., Suzuki T. and Kimura S. (1987) Binding of Actin Filaments to Connectin // J. Biochem. V. 101. P. 1339-1.346.

209. Matsubara S., Maruyama K. (1977) Role of connectin in the length-tension relation of skeletal and cardiac muscles // Jpn. J. Physiol: V. 27(5). P.589-600.

210. Mayans O., van der Ven P.F., Wilm M., Mues A., Young P., Furst D.O:, Wilmanns M., Gautel M. (1998) Structural basis for activation of the titin kinase-domain during myofibrillogenesis //Nature. V. 395 (6705). P. 863-869.

211. McArthur M.D., Jourdan M.L., Wang L.C.H. (1992) Prolonged stable hypothermia: effect on blood gases and pH in rats and ground squirrels // Am. J. Physiol. V.262. P. R190-R197.

212. McClellan G., Kulikovskaya I., Winegrad S. (2001) Changes in Cardiac Contractility Related to Calcium Mediated Changes in Phosphorylation of Myosin Binding Protein-C // Biophys. J. V. 81. P. 1083-1092.

213. Meyer M., Trost S.U., Bluhm W.F., Knot H.J., Swanson E., Dillmann W.H. (2001) Impaired sarcoplasmic reticulum function leads to contractile dysfunctionand cardiac hypertrophy // Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol. V. 280(5). P. H2046-2052.

214. Millman B.M. (1998) The filament lattice of striated muscle // Physiol. Rev. V. 78. P. 359-391.

215. Moersch F.P., Woltman H.W. (1956) Progressive fluctuating muscular rigidity and spasm ("stiff-man" syndrome); report of a case and some observations in 13 other cases // Proc. Staff Meet Mayo Clin. V. 31(15). P. 421-427.

216. Molkentin J.D. (2004) Calcineurin-NFAT signaling regulates the cardiac hypertrophic response in coordination with the MAPKs // Cardiovascular Research. V. 63. P.467-475.

217. Mollnau H., Munkel B., Schaper J. (1995) Collagen VI in the extracellular matrix of normal and failing human myocardium // Herz. V. 20. P. 89-94.

218. Morano I., Hofmann F., Zimmer M., Ruegg J.C. (1985) The influence of Plight chain phosphorylation by myosin light chain kinase on the calcium sensitivity of chemically skinned heart fibres // FEBS Lett. V. 189 (2). P. 221-224.

219. Morano I., Hadicke K., Grom S., Koch A., Schwinger R.H. et al. (1994) Titin, myosin light chains and C-protein in the developing and failing human heart // J. Moll. Cell Cardiol. V. 26. P. 361-368.

220. Morano I. (1999) Tuning the human heart molecular motors by myosin light chains // J. Mol. Med. V. 77. P. 544-555.

221. Morey-Holton E.R., Globus R.K. (2002) Hindlimb unloading rodent model: technical aspects // J. Appl. Physiol. V. 92 (4). P. 1367-1377.

222. Morin PJr., Storey K.B. (2006) Evidence for areduced transcriptional state during hibernation in ground squirrels // Cryobiology. V. 53(3). P.' 310-318.

223. Morin P. Jr., Dubuc A., Storey K.B. (2008) Differential expression of microRNA species in organs of hibernating ground squirrels: a role in translational suppression during torpor // Biochim. Biophys. Acta. V. V. 1779(10). P. 628-633.

224. Mues A., van der Ven, P.F.M., Young P., Furst D.O., Gautel M. (1998) Two immunoglobulin-like domains of the Z-disc portion of titin interact in a conformation-dependent way with telethonin // FEBS Lett. V. 428. P. 111-114.

225. Musa PI., Meek S., Gautel M., Peddie D., Smith A.J., Peckham M. (2006) Targeted homozygous deletion of M-band titin in cardiomyocytes prevents sarcomere formation // J. Cell Sci. V. 119(Pt 20). P. 4322-4331.

226. Neagoe C., Kulke M., del Monte F., Gwathmey J.K., de Tombe P.P., Hajjar R.J., Linke W.A. (2002) Titin isoform switch in ischemic human heart disease // Circulation. V. 106(11). P: 1333-1341.

227. Neagoe C., Opitz C., Makarenko I., Linke W. (2003) Gigantic variety: expression patterns of titin isoforms in striated muscles and consequences for myofibrillar passive stiffness // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 24 (2-3). P. 175-189.

228. Nelson O.L., Robbins C.T., Wu Y., Granzier H. (2008) Titin isoform switching is a major cardiac adaptive response in hibernating grizzly bears // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 295(1). P. PI366-371.

229. Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S. (2002) Effect of support stimulation on unloaded soleus in rat// Eur. J. Appl. Physiol. P. 87. P. 120-126.

230. Nicholas G., Thomas M.,. Langley B., Somers W., Patcl K., Kemp C.F., Sharma M., Kambadur R. (2002) Titin-cap associates with, and regulates secretion of Myostatin //J: Cell Physiol. V. 193(1). P. 120-131.

231. Oganov V.S., Skuratova S.A., Murashko L.M., Shirvinskaya M.A., Szilagyi T., Szoor A., RapcakM., Tacacs O. (1982) Postflight changes in the composition and properties of contractile proteins of muscles // Biophysics. V. 27 (1). P. 26-31.

232. O'Hara B.F., Watson F.L., Srere H.K., Kumar H., Wiler S.W., Welch S.K., Bitting L, Heller H.C., Kilduff T.S. (1999) Gene expression in, the brain across the hibernation cycle // J. Neurosci. V. 19(10). P. 3781-3790.

233. Ohira Y„ Yasui W., Roy R.R., Edgerton V.R. (1997) Effects of muscle length on the response to unloading // Acta Ana. (Basel). V. 159. P. 90-98.

234. Ohtsuka H., Yajima H., Maruyama K., Kimura S. (1997) Binding of the N-terminal 63 kDa portion of connectin/titin to alpha-actinin as revealed by the yeast two-hybrid system//FEBS Lett. V. 401(1). P. 65-67.

235. Ojima K„ Ono Y., Hata S., Koyama S., Doi N., Sorimachi H. (2005) Possible functions of p94 in connectin-mediated signaling pathways in skeletal muscle cells // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 26(6-8). P. 409-417.

236. Okada H., Kawaguchi H., Kudo T. et ah (1996) Alteration of extracellular matrix in dilated cardiomyopathic hamster heart // Mol. Cell Biochem. 156: 9-15.

237. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. (1998) Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure // Science. V. 280. P. 750-752.

238. Olson T.M., KishimotoN.Y., Whitby F.G., Michels V.V. (2001) Mutations ,that alter the surface charge of alpha-tropomyosin are associated with dilated cardiomyopathy // J. Mol. Cell.'Cardiol. V. 33. P. 723-732.

239. Opitz C.A., Kulke M., Leake M.C., Neagoe C., Hinssen H., Hajjar R.J., Linke W.A. (2003) Damped elastic recoil of the titin spring in myofibrils of human myocardium // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 100(22). P. 12688-12693.

240. Opitz C.A., Leake M.C., Makarenko I., Benes V., Linke W.A. (2004) Developmentally regulated switching of titin size alters myofibrillar stiffness in the perinatal heart // Circ. Res. V. 94. P. 967-975.

241. Osipova D.A., Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A. (2006b) Changes in phosphorylation extent of cardiac myosin and C-protein of ground squirrels is an adaptive factor upon hibernation // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 27. № 5-7. P. 504.

242. Ottenheijm C.A., Granzier H. (2010) Role of Titin in Skeletal Muscle Function and Disease. Adv Exp Med Biol. V. 682. P. 105-122.

243. Pan K.M., Damodaran S., Greaser M.L. (1994) Isolation and characterization of titin T1 from bovine cardiac muscle // Biochemistry. V. 33(27). P. 8255-8261.

244. Pardee J.D., Spudich J.A. (1982) Purification of muscle actin // In: Methods in Cell Biology. (Wilson L. eds.) Acad. Press. New York. London. V. 24 (part A). P.271-289.

245. Pauschinger M., Knopf D., Petschauer S., Doerner A., Poller W. et al. (1999) Dilated Cardiomyopathy Is Associated With Significant Changes in Collagen Type I/III ratio // Circulation. V. 99. P. 2750-2756.

246. Peckham M., Young P., Gautel M. (1997) Constitutive and variable regions of Z-disk titin/connectin in myofibril formation: a dominant-negative screen // Cell Struct. Funct. V. 22 (1).P. 95-101.

247. Pehowich D.J. (1994) Modification of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum fatty acyl composition during arousal from hibernation // Comp. Biochem. Physiol. V. 109 B (4) P. 571-578.

248. Peng J., Raddatz K., Molkentin J.D., Wu Y., Labeit S., Granzier PI., Gotthardt M. (2007) Cardiac hypertrophy and reduced contractility in hearts deficient in the titin kinase region // Circulation. V. 115(6). P. 743-751.

249. Pengelley E.T., Asmundson SJ. (1974) Circannual rhythmicity in hibernating mammals // In: Circannual Clocks. Annual Biological Rhythms. (Pengelley E.T. eds.) London. Academic Press. 325 p.

250. Perhonen M.A., Franco F., Lane L.D., Buckey J.C., Blomqvist C.G., Zerwekh J.E., Peshock R.M., Weatherall P.T., Levine B.D. (2001) Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight // J. Appl. Physiol. V. 91(2), P. 645-653.

251. Perrie W.T., Perry S.V. (1970) An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin // Biochem. J. V. 119 (1). P. 31-38.

252. Person V., Kostin S., Suzuki K., Labeit S., Schaper J. (2000) Antisense oligonucleotide experiments elucidate the essential role of titin in sarcomerogenesis in adult rat cardiomyocytes in long-term culture // J. Cell Sci. V. 113 (21). P. 3851— 3859.

253. Petrovic V.M., Racic O., Janic-Sibalic V. (1985) Accelerated gluconeogenic processes in the ground squirrel (Citellus citellus) during the arousal from hibernation // Comp. Biochem. Physiol. V. 80 A (4) P. 477-480.

254. Pierobon-Bormioli S, Betto R, Salviati G. (1989) The organization of titin (connectin) and nebulin in the sarcomeres: an immunocytolocalization study // J Muscle Res Cell Motil. V. 10 (6). P. 446-456.

255. PodlubnayaZ.A., Kakol I., Moczarska A., Stepkowski D., Udaltsov S. (1999) Calcium-induced structural changes in synthetic myosin filaments of vertebrate striated muscles // J. Struct. Biol. V. 127 (1).P. 1-15.

256. Popova N.K., Voronova I.P., Kulikov A.V. (1993) Involvement of brain tryptophan hydroxylase in the mechanism of hibernation // Pharmacol. Biochem. Behav. V. 46(1). P. 9-13.

257. Prado L.G., Makarenko I., Andresen C., Kruger M., Opitz C.A., Linke W.A. (2005) Isoform diversity of giant proteins in relation to passive and active contractile properties of rabbit skeletal muscles // J. Gen. Physiol. V. 126(5). P. 461480.

258. Radke M.H., Peng J., Wu Y., McNabb M., Nelson O.L., Granzier H., Gotthardt M. (2007) Targeted deletion of titin N2B region leads to diastolic dysfunction and cardiac atrophy // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 104(9). P. 34443449.

259. Rapcsak M., Oganov V.S., Szoor A., Skuratova S.A., Szilagyi T., Takacs O. (1983) Effect of weightlessness on the function of rat skeletal muscles on the biosatellite "Cosmos-1129" //Acta Physiol. Hung. V. 62(3-4). P. 225-228.

260. Ray C.A., Vasques M., Miller T.A., Wilkerson M.K., Delp M.D. (2001) Effect of short-term microgravity and long-term hindlimb unloading on rat cardiacmass and function // J. Appl. Physiol. V. 91(3), P. 1207-1213.i

261. Raynaud F., Astier C., Benyamin Y. (2004) Evidence for a direct but sequential binding of titin to tropomyosin and actin filaments // Biochim. Biophys. Acta. V. 1700 (2). P. 171-178.

262. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. (1994) The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis // Cell Motil. Cytoskeleton 28(1): 1-24.

263. Rees M.K., Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of gomogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure // J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449-4458.

264. Reid W.D., Ng A., Wilton R., Milsom W.K. (1995) Characteristics of diaphragm muscle fibre types in hibernating squirrels // Respir Physiol. V. 101(3). P. 301-309.

265. Riley D.A., Thompson J.L., Krippendorf B.B., Slocum G.R. (1995) Review of spaceflight and hindlimb suspension unloading induced sarcomere damage and repair // Basic Appl. Myol. V. 5(2). P. 139-145.

266. Riley D.A., Bain J.L., Thompson J.L., Fitts R.H., Widrick J.J., Trappe S.W., Trappe T.A., Costill D.L. (1998) Disproportionate loss of thin filaments in human-soleus muscle after 17-day bed rest // Muscle Nerve. V.21(10). P. 1280-1289.

267. Ritter O., Haase H., Schulte H.D., Lange P.E., Morano I. (1999) Remodeling of the hypertrophied human myocardium by cardiac bHLH transcription factors // J. Cell. Biochem. V. 74. P. 551-561.

268. Rolfe D.F., Brown G.C. (1997) Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. // Physiol. Rev. V. 77. P. 731-758.

269. Rourke B.C., Yokoyama Y., Milsom W.K., Caiozzo V.J. (2004) Myosin isoform expression and MAFbx mRNA levels in hibernating golden-mantled ground squirrels (Spermophilus lateralis) // Physiol. Biochem. Zool. V. 77 (4). P. 582-593.

270. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. (N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.). P. 1626.

271. Schaub M.C., Hirzel H.O. (1987) Atrial and ventricular isomyosin composition in patients with different forms of cardiac hypertrophy // Basic Res. Cardiol. V. 82 Suppl. 2. P. 357-367.

272. Schaub M.C., Hefti M.A., Zuellig R.A., Morano I. (1998) Modulation of contractility in human cardiac hypertrophy by myosin essential light chain isoforms // Cardiovasc. Res. V. 37. P. 381-404.

273. Schulz R.A., Yutzey K.E. (2004) Calcineurin signaling and NFAT activation in cardiovascular and skeletal muscle development // Dev. Biol. V. 266(1). P. 1-16.

274. Sebestyen M.G., Wolff J.A. & Greaser M.L. (1995) Characterization of a 5.4 kb cDNA fragment from the Z-line region of rabbit cardiac titin reveals phosphorylation sites for praline-directed kinases // J.Cell Sci. V. 108. P. 30293037.

275. Shenkman B.S., Kozlovskaya I.B., Kuznetsov S.L., Nemirovskaya T.L., Desplanches D. (1994) Plasticity of skeletal muscle fibres in space-flown primates // J. Gravit. Physiol. V. 1 (1). P. 64-66.

276. Silver P.J., Buja L.M., Stull J.T. (1986) Frequency-dependent myosin light chain phosphorylation in isolated myocardium // J. Mol. Cell Cardiol. V. 18. P. 3137.

277. Siu S.C., Sole M. J. (1994) Dilated cardiomyopathy // Curr. Opin. Cardiol. V. 9 (3). P. 337-343.

278. Sommer C. (2005) Paraneoplastic stiff-man syndrome: passive transfere to rats by means of IgG antibodies to amphyphysin // Lancet. V. 365. p. 1406-1411.

279. Sommerville L.L., Wang K. (1987) In vivo phosphorylation of titin and nebulin in frog skeletal muscle // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 147 (3). P. 986-992.

280. Sommerville L.L., Wang K. (1988) Sarcomere matrix of striated muscle: in vivo phosphorylation of titin and nebulin in mouse diaphragm muscle // Archiv. Biochem. Biophys. V. 262 (1). P. 118-129.

281. Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made by the giant protein titin // J. Cell Sci. V. 14. P. 119-123.

282. Soukri A., Valverde F., Hafid N. Elkebbaj M.S., Serrano A. (1995)

283. Characterization of muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoformifrom euthermic and induced hibernating Jaculus orientalis // Biochim. Biophys. Acta,.V. 1243. P. 161-168.

284. South F.E., House W.A. (1967) Energy metabolism in hibernation // In: Mammalian hibernation (Fisher K.C., Dawe A.R., Lyman C.P., Schonbaum E., South F.E., Eds.) NewYork. Elsevier. V. 111. P. 305-324.

285. Southgate R., Ayme-Southgate A. (2001) Alternative splicing of an amino-terminal PEVK-like region generates multiple isoforms of Drosophila projectin // J. Mol. Biol. V. 313(5). P. 1035-1043.

286. Spierts I.L., Akster H.A., Granzier H.L. (1997) Expression of titin isoforms in red and white muscle fibres of carp (Cyprinus carpio L.) exposed to different sarcomere strains during swimming. J Comp Physiol B. V. 167(8). P. 543-551.

287. Spry C.J. and Tai P.C. (1991) Dilated cardiomyopathy and myocarditis: monoclonal antibodies to diseased heart tissues // Eur. Heart. J. V. 12, Suppl. D. P. 130-133.

288. Srere H.K., Wang L.C.H., and Martin S.L. (1992) Central role for differential gene expression in mammalian hibernation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 89. P. 7119-7123.

289. Steffen J.M., Koebel D.A., Mussacchia X.J., Milsom W.K. (1991) Morphometric and metabolic indices of disuse in muscles of hibernating ground squirrels // Comp. Biochem. Physiol. V. 99B (4). P. 815-819.

290. Storey K. B. (1997) Metabolic regulation in mammalian hibernation: enzyme and protein adaptation // Comp. Biochem. Physiol. V. 118A (4). P. 1115-1124.

291. Storey K.B., Storey J.M. (2000) Gene expression and protein adaptation in mammalian hibernation // In: Life in the cold. (Heldmaier G. & Klingenspor M. eds.). Springer-Verlag. P. 303-313.

292. Storey K.B. (2003) Mammalian hibernation. Transcriptional and translational controls // Adv. Exp. Med. Biol. V. 543. P. 21-38.

293. Storey K.B. and Storey J.M. (2007) Tribute to P. L. Lutz: putting life on 'pause' molecular regulation of hypometabolism // The Journal of Experimental Biology V. 210. P. 1700-1714.

294. Storey K.B. (2010) Out cold: Biochemical regulation of mammalian hibernation a mimi-review // Gerontology. V. 56 (2). P. 220-230.

295. Summers R.L., Martin D.S., Meek J.V., Coleman T.G. (2007) Computer systems analysis of spaceflight induced changes in left ventricular mass // Comput Biol Med. V. 37(3), P. 358-63.

296. Suzuki J., Kimura S., Maruyama K. (1994) Electron microscopic filament lengths of connection and its fragments // J. Biochem. V. 116(2). P. 406-410.

297. Sweeney H.L., Bowman B.F., Stull J.T. (1993) Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function // Am. J. Physiol. V. 264(5 Pt 1). P. CI085-1095.

298. Szilgyi T., Szoor A., Takacs O. et al. (1980) Study of contractile properties and composition of myofibrillar proteins of skeletal muscles in the COSMOS-1129 experiment//Adv. Physiol. Sci. V. 19.

299. Takano-Ohmuro H., Nakauchi Y., Kimura S., Maruyama K. (1992) Autophosphorylation of fS-connectin (titin 2) in vitro // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 183 (1). P. 31-35.

300. Talmadge R.J. Roy R.R., Edgerton V.R. (1996) Distribution of myosin heavy chain isoforms in non-weight-bearing rat soleus muscle fibers // J. Appl. Physiol. V.81 (6). P. 2540-2546.

301. Tatsumi R., Hattori A. (1995) Detection of giant myofibrillar proteins connectin and nebulin by electrophoresis in 2 % polyacrylamide slab gels strengthened with agarose // Anal. Biochem. V. 224. P. 28-31.

302. Tatsumi R, Maeda K, Hattori A., Takahashi K (2001) Calcium binding to an elastic portion of connectin/titin filaments // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 22. P. 149-162.

303. Thomason D.B., Booth F.W. (1990) Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting // J. Appl. Physiol. V. 68 (1). P. 1-12.

304. Thomason D.B., Morrison P.R., Oganov V., Ilyina-Kakueva E., Booth F.W., Baldwin K.M. (1992) Altered actin and myosin expression in muscle during exposure to microgravity // J. Appl. Physiol. V. 73(2 Suppl), P.90S-93S.

305. Tinker D.B., Harlow H.J., Beck T.D. (1998) Protein use and muscle-fiber changes in free-ranging, hibernating black bears // Physiol. Zool. V. 71(4). P. 414424.

306. Tompson P.D. (1994) Stiff people. In: Movement disorders 3. (eds. Marsden C.D., Fahn S) Cambridge: Butterworth Heinemann, P. 373-405.

307. Toursel T., Stevens L., Granzier H., Mounier Y. (2002) Passive tension of rat skeletal soleus muscle fibers: effects of unloading conditions // J. Appl. Physiol. V. 92. P. 1465-1472.

308. Towbin H., Staehlin T., Gordon J. (1970) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 76. P. 4350-4354.

309. Toyoda N., Maruyama K. (1978) Fine structure of connectin nets in cardiac myofibrils // J. Biochem. V. 84(1). P. 239-241.

310. Trahair T., Yeoh T., Keogh A., Spratt P., Chang V., dosRemedios C., Ganniog P. (1993) Myosin Light Chain Gene Expression Associated with Disease States of the Human Heart // J. Mol. Cell Cardiol. V. 26. P. 577-585.

311. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin // J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.

312. Trinick J., Tskhovrebova L. (1999) Titin: a molecular control freak // Trends in Cell Biology. V. 9. P. 377-380.

313. Trombitas K., Pollack G.I I. (1993) Elastic properties of the titin filament in the Z-line region of vertebrate striated muscle // J Muscle Res Cell Motil. V. 14(4). P. 416-42.

314. Trombitas K., Jin J.P., Granzier H. (1995) The mechanically active domain of titin in cardiac muscle. Circ Res. V. 77(4). P. 856-861.

315. Trombitas K., Greaser M.L., Pollack G.H. (1997). Interaction between titin and thin filaments in intact cardiac muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 18. P. 345-351.

316. Trombitas K., Wu Y., Labeit D., Labeit S., Granzier H. (2001) Cardiac titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 281. P. H1793-H1799.

317. Tskhovrebova L., Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules // J. Mol. Biol. V. 265. P. 100-106.

318. Tskhovrebova L., Trinick J. (2004) Properties of titin immunoglobulin and fibronectin-3 domains // J. Biol. Chem. V. 279(45). P. 46351-46354.

319. Tskhovrebova L., Trinick J. (2005) Muscle disease: a giant feels the strain // Nat Med. V. 11(5). P. 478-479.

320. Tskhovrebova L., Trinick J. (2010) Roles of titin in the structure and elasticity of the sarcomeres // J. Biomed. Biotechnol. V. 2010. Article ID 612482.

321. Tsubata S. et al. (2000) Mutations in the human S-sarcoglycan gene in familial and sporadic dilated cardiomyopathy // J. Clin. Invest. V. 106. P. 655-662.

322. Turnacioglu K.K., Mittal B., Sanger J.M., Sanger J.W. (1996) Partial characterization of zeugmatin indicates that it is part of the Z-band region of titin. Cell Motil. Cytoskeleton // V. 34(2). P. 108-121.

323. Van Breukelen F., Martin S.L. (2002) Reversible depression of transcription during hibernation // J. Comp. Physiol B. V. 172(5). P. 355-361.

324. Van der Ven P.F.M., Bartsch J.W., Gautel M., Jockusch H., Furst D.O. (2000) A functional knock-out of titin results in defective myofibril assembly // J. Cell Sci. V. 113. P. 1405-1414.

325. Velickovska V., Lloyd B.P., Safdar Qureshi, Frank van Breukelen (2005)

326. Proteolysis is depressed during torpor in hibernators at the level of the 20S coreprotease // The Journal of Comparative Physiology B. V. 175. P. 329-335.i

327. Viskocil F., Gutmann E. (1977) Contractile and histochemical properties of skeletal muscles in hibernating and awake golden hamsters // J. comp. Physiol. V. 122. P. 385-390.

328. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle'// Proc.Natl Acad. Sci.USA. V. 76 (8). P. 3698-3702.

329. Wang K. (1984) Cytoskeletal matrix in striated muscle: the role of titin, nebulin and intermediate filaments. In: Contractile mechanisms in muscle, Eds. G. H. Pollack and PI. Sugi (Plenum. Press, New-York and London, 1984). P. 285-305.

330. Wang K., Ramirez-Mitchell R., Palter D. (1984) Titin is an extraordinarily long, flexible, and slender myofibrillar protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. V. 81(12). P. 3685-3689.

331. Wang K., Forbes J.G., Jin A.J. (2001) Single molecule measurements of titin elasticity 11 Prog. Biophys. Mol. Biol. V. 77. P. 1—44.

332. Wang L.C.H. (1984) Ecological, physiological and biochemical aspects of torpor in mammals and berds. In: Advances in experimental medicine and biology (Eds. Wang L.C.H.) Springer-Verlag Berlin-Heidelderg. V. 4 (Animal adaptation to cold). P. 361-403.

333. Wang L.C.H. (1987) Mammalian hibernation. In: The effects* of low temperatures on biological systems (Eds. Grout B.W.W., Morris G.J.), Edward Arnold Publ. London, p. 349-386.

334. Wang S.Q., Lakatta E.G., Cheng H., Zhou Z. (2002) Intracellular calcium homeostasis: adaptive mechanisms in mammalian hibernators // J. Exp. Biol. V. 205. P. 2957-2962.

335. Warren C.M., Jordan M.C., Roos K.P., Krzesinski P.R., Greaser M.L. (2003 a) Titin isoform expression in normal and hypertensive myocardium // Cardiovasc Res. V. 59(1). P. 86-94.

336. Warren C.M., Krzesinski P.R., Greaser M.L. (2003b) Vertical agarose gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight proteins // Electrophoresis. V. 24(11). P. 1695-1702.

337. Warren C.M., Krzesinski P.R., Campbell K.S., Moss R.L., Greaser M.L. (2004) Titin isoform changes in rat myocardium during development // Mech Dev. V. 121(11). P. 1301-1312.

338. Wickler S.J., Horowitz B.A., Kott K.S. (1987) Muscle function in hibernating hamsters: a natural analog to bed rest? // J. therm. Biol. V. 12. P. 163-166.

339. Wickler S.J., Hoyt D.F., Van Breukelen F. (1991) Disuse atrophy in the hibernating golden-mantlend ground squirrel, Spermophilus lateralis //Am. J. Physiol. V.261. P. R1214-R1217.

340. Williams D.R., Epperson L.E., Li W., Hughes M.A., Taylor R., Rogers J., Martin S.L., Cossins A.R., Gracey A.Y. (2005) Seasonally hibernating phenotype assessed through transcript screening // Physiol. Genomics. V. 24(1). P. 13-22.

341. Wilmann M. Gautel M., Mayans O. (2000) Activation of calcium/calmodulin regulated kinases // Cell Mol. Biol. V. 46 (5). P. 883-894.

342. Wu Y., Bell S.P., Trombitas K., Witt C.C., Labeit S., LeWinter M.M., Granzier H. (2002) Changes in titin isoform expression in pacing-induced cardiac failure give to increased passive muscle stiffness // Circulation. V. 106 (11). P. 1384-1389.

343. Xu X., Meiler S.E., Zhong T.P., Mohideen M., Crossley D.A., et al. (2002) Cardiomyopathy in zebrafish due to mutation in an alternatively spliced exon of titin // Nat. Genet. V. 30. P. 205-209.

344. Yamasaki R., Wu Y., McNabb M., Greaser M., Labeit S., Granzier H. (2002) Protein kinase A Phosphorylates titn's cardiac-specific N2B domain and reduces passive tension in rat cardiac myocytes // Circ. Res. V. 90. P. 1181-1188.

345. Yan J., Barnes B.M., Kohl F., Marr T.G. (2008) Modulation of gene expression in hibernating arctic ground squirrels // Physiol. Genomics.V. 32(2). P. 170-181.

346. Young P. Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin // EMBO J. V. 17. P. 1614-1624.

347. Young P., Ehler E., Gautel M. (2001) Obscurin, a giant sarcomeric Rho guanine nucleotide exchange factor protein involved in sarcomere assembly // J Cell Biol. V. 154(1). P. 123-136.

348. Yu Z.B., Bao J.X., Ma J., Zhang L.F., Jin J.P. (2000) Changes in myocardial contractility and contractile proteins after four weeks of simulated correction of simulate. weightlessness in rats // J. Gravit. Physiol. V. 7(2), P. 147-148.

349. Yu Z.B., Zhang L.F., Jin J.P. (2001) A proteolytic NH2-terminal truncation of cardiac troponin I that is up-regulated in simulated microgravity // J. Biol. Chem. V. 276(19). p. 15753-15760.

350. Zhegunov G.F., Mikulinsky Y.E., Kudokotseva E.V. (1988) Hyper-activation of protein synthesis in tissues of hibernating animals on arousal // Cryo-Lett. V. 9. P. 236-245.

Информация о работе

Вихлянцев, Иван Милентьевич
доктора биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы