Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии

Макаренко, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии"

На правах рукописи

МАКАРЕНКО Ирина Викторовна

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ТАЙТИНА В РЕГУЛЯЦИИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ МИОКАРДА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций мышечных белков Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино и в Группе механики мышечных клеток Университета г. Гейдельберга, Германия

Научным руководнтель: доктор биологических наук, профессор

ЗА Подлубная

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.И. Кукушкин

доктор медицинских наук, профессор В.И. Кобрин

Ие/| щэя организация: Уральский Государственный университет

Защита состоится " 9 " июня 2004 г. в 13 час. 30 мин.

на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН 14229,0, г. Пущино Московской обл.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат диссертации разослан мая 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ:

Актуальность проблемы.

Первичные кардиомиопатии как заболевания были описаны в 1957 году (Brigden, 1957). Среди них наиболее часто встречается кардиомиопатия неизвестной этиологии - идиопатическая дилатационная кардиомиопатия (ДКМП). Клинические проявления заболевания возникают в различных возрастных группах, включая детский и пожилой возраст, но наиболее часто ДКМП развивается в возрасте 30-50 лет. В настоящее время для сохранения жизни больных безальтернативным методом лечения является ортотопическая трансплантации сердца (Шумаков и др., 2003).

ДКМП характеризуется дилатацией камер сердца, истончением стенок и снижением насосной функции сердца (Амосова, 1999). Основным клиническим проявлением кардиомиопатий является хроническая сердечная недостаточность, которая сопровождается ремоделированием сердца и проходит в своем развитии стадии компенсации и декомпенсации (Моисеев, 2000). Это заболевание с неопределенной этиологией и недостаточно изученным патогенезом. В связи с отсутствием полного понимания молекулярных механизмов развития и компенсации ДКМП, эта патология, как правило, выявляется уже на последней стадии развития. Несмотря на то, что из всех случаев ДКМП наследственные формы составляют более 20%, попытки оценить значимость генетического фактора в их развитии не привели к выяснению природы этого заболевания. Однако подавляющее большинство исследователей приходит к заключению, что причины развития идиопатической ДКМП лежат непосредственно в "нарушениях сократительной способности миокарда, обусловленной гибелью кардиомиоцитов и развитием обширного фиброза, что приводит к возрастанию жесткости сердечной мышцы (Амосова, 1999; Капелько, 2000). В молекулярном патогенезе ДКМП преимущественно обнаружены нарушения в экстраклеточных компонентах цитоскелета кардиомиоцитов (Franz et al., 2001; Towbin & Bowles, 2002).

Предполагают, что открытый сравнительно недавно саркомерный цитоскелетный эластичный высокомолекулярный белок тайтин может вносить значительный вклад в перестройку миокарда при патологии. Изучение структуры и функций этого белка показало, что тайтин играет важную роль не только в физиологии мышц, но также и в патофизиологии (Labeit et al., 1997). За последнее время в литературе представлены результаты о структурных изменениях в тайтине при ДКМП, полученные на основе генетического анализа семейных форм ДКМП и исследований, проводимых на экспериментальных моделях сердечной патологии у животных. Однако, несмотря на

области, имеющиеся данные разрознены и не дают возможности определить направленность молекулярных изменений тайтина при развитии ДКМП и роль тайтина в адаптационных процессах в миокарде.

Поэтому, сохраняется актуальность поиска закономерностей молекулярных изменений в миокарде, ведущих к развитию ДКМП, а также необходимость разработки тестов ранней диагностики этого заболевания. В настоящей работе исследован изоформный состав тайтина миокарда в норме и при ДКМП. Для объяснения вклада обнаруженных изменений тайтина в ремоделирование миокарда больных ДКМП была изучена роль этого эластичного саркомерного белка в сокращении нормального миокарда в контексте особенностей механических свойств разных отделов сердца млекопитающих, а также был исследован изоформный состав тайтина в эмбриональном миокарде. Цель исследования. Исследовать изоформный состав тайтина миокарда в норме и при ДКМП для выяснения его роли в развитии заболевания. Задачи исследования:

1. Исследовать изоформный состав тайтина в левом желудочке сердца в норме у разных млекопитающих.

2. Исследовать характер зонального распределения изоформ тайтина в норме в сердце млекопитающего для оценки роли тайтина в сокращении миокарда.

3. Определить изоформный состав тайтина в миокарде левого желудочка сердца крысы и свиньи в период эмбрионального и постэмбрионального развития.

4. Определить изоформный состав тайтина в миокарде левого желудочка человека при ДКМП.

5. Оценить влияние изменений состава тайтина при ДКМП на пассивное напряжение, развиваемое одиночными миофибриллами и пучками волокон миокарда.

Научная новизна работы:

1. Впервые идентифицированы эмбриональные формы сердечного тайтина и обнаружена сверхэкспрессия длинной (N2BA) изоформы тайтина в эмбриональном миокарде млекопитающих.

2. В миокарде крысы в процессе перинатального развития установлена поэтапная трансформация изоформ тайтина в сторону уменьшения их молекулярного веса и его стабилизация в миокарде взрослого животного.

3. Выявлена четкая направленность изменений в изоформном составе тайтина в сторону увеличения молекулярного веса и доли его длинной (N2BA) изоформы в миокарде человека с ДКМП.

Научная и практическая значимость работы. Настоящее исследование вносит вклад в понимание молекулярных основ механизмов сердечной

адаптации и выявляет роль эластичного саркомерного белка тайтина в ремоделировании миокарда, направленного на поддержание сократительной функции левого желудочка при ДКМП. Полученные данные об изменениях тайтина в миокарде больных ДКМП наряду с изменениями в миозине могут быть использованы при разработке диагностического теста и способствовать повышению его объективности. Новые данные о дифференциальной экспрессии тайтина в разных отделах сердца млекопитающих и разных зонах стенки желудочка могут быть использованы при изучении сокращения мышечной стенки сердца, а также при создании математической модели сокращения сердца. Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на 29-ой, 31-ой и 32-ой Европейских мышечных конференциях (Берлин, Германия, 2000; Люнтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003); 2-ой Российской конф. "Физика в биологии и медицине" (Екатеринбург, 2001); 2-ой конференции молодых ученых России с междунар. участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность - новые направления исследования" (Пущино, 2001); Междун. конф. "Сердечные патологии: от молекулярных механизмов к клинической практике" ( Стара Лесна, Словакия, 2002); 48-м Съезде Биофизического общества (Балтимор, США, 2004), заседании секции Ученого совета ИТЭБ РАН "Биологическая подвижность" от 8 апреля 2004.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 107 стр., содержит 27 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 191 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинический и экспериментальный материал.

Экспериментальный материал: сердца свиньи (3), овцы (2), козы (1), быка (1), кролика (2), мыши (3), крысы (4), хомяка (2).

Клинический материал (предоставлен Центром сердечнососудистых исследований при Массачусетском госпитале, Бостон): контрольная группа (19 образцов) состояла из миокарда доноров с черепно-мозговой травмой, для которых была установлена нормальная левожелудочковая функция на основе эхокардиографической диагностики, выполненной в течение 24 часов до эксплантации сердца.

Взятые от доноров здоровые сердца с процедурной точки зрения' не подошли для трансплантации. Группа с патологией состояла из миокарда эксплантированных сердец (8 образцов) с диагностированной IV стадией ДКМП, NYHA.

Электрофорез в 2% ДСН-полиакриламидном геле.

Для обнаружения изоформ тайтина с молекулярной массой более 3 МДа, использовали крупнопористый 2% ДСН-полиакриламидный гель с добавлением агарозы (Tatsumi & Hattorf, 1995). Количественный анализ электрофоретических гелей.

Полученные гели были отсканированы и оцифрованы для анализа интегральной оптической плотности белковых полос с использованием специальной компьютерной программы TotalLab версия 2.01 (Phoretix, Newcastle upon Tyne, UK). Интерполирование Гауссовым распределением профилей интенсивности оптической плотности типичных тайтиновых полос на гелях было выполнено с применением алгоритма симплексной минимизации Нелдера-Мида (Nelder & Mead, 1965). Иммуноблоттинг.

Идентификация групп белков, разделенных ДСН гель-электрофорезом, была выполнена методом электроблоттинга (Towbin et al., 1970).

Измерение пассивного напряжения, развиваемого неактивированными одиночными миофибриллами.

Изолированные миофибриллы готовились из замороженной сердечной ткани согласно протоколу (Linke et al., 1999; Kulke et al., 2001). Экспериментальная установка сконструирована на основе фазово-контрастного иммерсионного микроскопа «Zeiss Axiovert 135». Съем данных с экспериментальной установки и управление микромотором осуществлялось с помощью персонального компьютера и специального программного обеспечения (LabView, собственная разработка лаборатории). Изображение миофибрилл передавалось на экран персонального компьютера с помощью цветной CCD камеры, установленной на микроскопе. Измерение длины саркомера проводилось с помощью фотодиодной линейки с использованием 2048-элемента (Sony). Эксперимент проводился при комнатной температуре 25°С в релаксирующем растворе (рСа 8.0), содержащем 20 мМ бутадионмоноксима для купирования актин-миозинового взаимодействия (Kulke et al., 2001) и леупептин (ингибитор протеаз) в концентрации 40 м кг/мл.

Частота снятия показаний силы равнялась 1 кГц. При выбранной частоте в 1 кГц длительность фазы растяжения образца равнялась 1 с. Для измерения пассивного напряжения, развиваемого одиночными неактивированными миофибриллами, эксперимент выполнялся по схеме!,

а для выявления гистерезиса силы, возникающего в ходе эксперимента -по схеме-2.

Схема-1

Сила регистрировалась на каждом шаге ступенчатого растяжения миофибрилл (Рис. 1) от расслабленной (~1.8 мкм) до максимальной длины саркомера (~2.4 мкм). Единичный шаг по растяжению миофибрилл составлял 0.1 мкм/саркомер. Длительность фазы растяжения для всех шагов была одинаковой и равнялась 1с. После фазы растяжения следовала пауза - длина миофибриллы фиксировалась. Продолжительность каждой паузы была постоянной и составляла 19 с. После серии шагов нагрузка снималась, и миофибриллы возвращались к расслабленной длине. Затем следовал контроль базовой линии начала регистрации напряжения на возможное смещение уровня начального напряжения. Шесть таких идентичных циклов растяжение-освобождение были выполнены на каждой миофибрилле и данные были усреднены для уменьшения влияния случайных ошибок на результат. При регистрации силы на каждом шаге ступенчатого растяжения миофибрилл фиксировались следующие параметры: максимальное напряжение в конце каждой фазы растяжения; последующий спад напряжения и уровень стабилизации напряжения во время паузы растяжения. Данная схема эксперимента представлена на рис. 1, где пиковое значение напряжения есть вязко-упругость образца, часть кривой, которая проявляется спадом напряжения отражает вязкостную компоненту напряжения и стационарная часть кривой отражает его упругую компоненту.

время, сек

Рис. 1. Протокол эксперимента ступенчатого растяжения одиночной неактивированной миофибриллы.

Схема-2

На миофибрилле было выполнено 10 последовательных циклов растяжение-освобождение. По окончанию 10-ти циклов (продолжительность каждого цикла 1 с) выдерживалась пауза в 1-ну минуту. Диапазон изменения длины саркомера при этом составил 1.85-2.4 мкм. Восьмикратное повторение эксперимента показало полную воспроизводимость результатов. Усредненные значения силы были переведены в графическую форму. Площадь замкнутой области, образованная кривыми растяжения и освобождения, характеризовала гистерезис.

Пассивное напряжение, развиваемое миофибриллой, вычисляли, деля усилие, развиваемое образцом при каждом шаге растяжения, на площадь поперечного сечения миофибриллы с принятой оценкой 1 мкм для диаметра миофибриллы (Bartoo et al., 1993; Linke et al., 1994). Измерение пассивного напряжения, развиваемого неактивированными пучками волокон миокарда.

Экспериментальная установка состояла из рабочей камеры, заполняемой необходимым для эксперимента раствором; системы контроля изменения длины волокна (мотора); датчика силы и системы измерения длины саркомеров. Препараты были прикреплены к стальным стимулирующим электродам в виде клипс на концах. Электроды расположены на плечах мотора и датчика силы. Образцы миокарда были демебранизированны в течение 8-ми часов в ледяном релаксирующем растворе, содержащем 1% Triton X-100, (Wu et al., 2000), а затем тщательно отмыты в том же растворе без Triton Х-100.

Механическое напряжение в образцах миокарда измеряли при 25°С в релаксирующем буфере, содержащем 30 мМ бутадионмоноксима. Диаметр каждого образца (в нерастянутом состоянии) был измерен с помощью бинокулярного микроскопа. При этом нагрузка, воздействовавшая на образец, была пропорциональна площади его поперечного сечения, которое вычислялось исходя из диаметра образца. Длину саркомера измеряли по дифракционной картине на шкале экрана дифрактометра после прохождения лазерного луча через мышечный образец. В случае, когда толщина образца затрудняла достоверное измерение длины саркомера данным методом, образец растягивался на 30% от его расслабленной длины, которая во всех образцах, как правило, составляла 1.80-1.85 мкм. Эта величина растяжения полностью покрывала физиологический уровень длины саркомера от 1.8 до 2.4 мкм.

Следующая часть эксперимента была выполнена согласно нижеописанной схеме (Wu et al., 2000). Пассивная сила была измерена во время растяжения препарата при постоянной скорости растяжения от расслабленной длины саркомера ~1.8 мкм к длине напряжения ~2.4 мкм, с

последующим укорочением с той же скоростью. Было выполнено пять последовательных циклов растяжения-освобождения (продолжительность цикла 1 с), затем выдерживался период покоя 2 мин. Такая схема была применена к каждому образцу (норма и ДКМП) до и после воздействия трипсином. В мышечных образцах обеих групп (норма и ДКМП), тайтин подвергался деградации посредством обработки мышечных полосок трипсином (концентрация 0.25 мкг/мл) в течение 40 минут. При этом с 2-х минутными интервалами проходила регистрация циклов растяжение-укорочение. Для анализа силы, развиваемой индивидуальными образцами, были взяты значения зарегистрированной силы в каждом 5-ом цикле, когда петля гистерезиса квазистабилизировалась по своей форме и площади, что было установлено заранее.

Пассивное напряжение, развиваемое пучками мышечных волокон, вычисляли, деля развиваемое образцом усилие на площадь поперечного сечения образца. Площадь поперечного сечения образца определялась измерением диаметра пучка волокон с помощью фазово-контрастного микроскопа (с допустимой ошибкой пучок волокон, возможно, считать кругом). При таком подходе точность определения границы образца составляет 2 пикселя или 0.16 мкм. Статистическая обработка полученных данных.

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена на персональном компьютере с использованием программ "Origin 6.0" и "Excel 7.0". Экспериментальные данные выражены как M±SD (среднее ± стандартное отклонение) либо указано M±SEM (среднее ± стандартная ошибка средней величины). Достоверность различий средних величин (р) при межгрупповом сравнении устанавливали по t-критерию Стьюдента. Величины р<0.05, р<0.001 (в зависимости от эксперимента) считали достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Часть 1.' Изоформный состав тайтнна в сердечной мышце

в норме

1.1. Изоформный состав тайтнна в сердце у разных видов млекопитающих

Изоформный состав тайтина в разных отделах сердца у 8 видов млекопитающих был исследован методом гель-электрофореза. Результаты показали, что тайтин в сердце млекопитающих представлен двумя известными изоформами, длинной (N2BA) и короткой (N2B) с молекулярным весом 3200-3350 кДа и 3000 кДа, соответственно (Freiburg et al., 2000). Впервые показано, что миокард крысы, хомяка, свиньи

содержит не один, а два варианта длинной изоформы тайтина: ШВА-1 и №ВА-2 (Рис. 2, ЗБ). Денситометрирование полученных гелей установило значительное отличие в соотношении между длинной и короткой изоформами в миокарде левого желудочка (ЛЖ) у разных млекопитающих. В ряду исследованных животных доля короткой (№В) изоформы тайтина (% от К2В+ШВА) в ЛЖ убывает в следующем порядке: крыса (94%) - хомяк (90%) - кролик (84%) - мышь (80%) - овца (74%) - свинья (49%) - коза (44%) - бык (41 %).

Рис.2 . Электрофореграмма. Изоформный состав тайтина в миокарде разных млекопитающих ЛЖ - левый желудочек, ПЖ - правый желудочек. Стрелкой указана доля N2BA изоформы тайтина (% от N2BA+N2B). Справа отложено положение маркеров молекулярных весов.

Более того, было установлено, что изоформное соотношение тайтина варьирует в разных отделах сердца и даже в разных зонах стенки желудочков. На рис. ЗА представлены результаты, полученные для сердца свиньи. Доля №ВА тайтина в стенках обоих желудочков, как правило, возрастает от основания к экваториальной зоне и снова уменьшается в апикальной зоне сердца. Содержание длинной изоформы тайтина в правом желудочке (ПЖ) больше, чем в ЛЖ. А в межжелудочковой перегородке преобладает короткая изоформа. Тогда как предсердие содержит больше длинной изоформы, чем желудочки. Различия в трансмуральном распределении изоформ тайтина по толщине стенки ЛЖ от эпикарда к эндокарду не обнаружено. Подобное распределение изоформ тайтина наблюдалось в сердце других исследованных животных.

А Верхушка

Рис. 3. Содержание длинной (N2BA) изоформы тайтина в миокарде разных отделов сердца свиньи (% от N2BA+N2B).

А - схематическое распределение вариабельности изоформного состава тайтина в сердце свиньи. Б - Электрофореграмма. 1 — экваториальная зона ЛЖ; 2 - папиллярная мышца, ЛЖ; 3 - межжелудочковая перегородка; 4 - предсердие.

Обсуждение результатов. На основании сравнения литературных данных по механическому поведению разных отделов сердца и полученных нами результатов по преобладанию длинной или короткой изоформ тайтина в этих отделах, сделано предположение о том, что тайтин вносит важный вклад в насосную функцию сердца. Анализ данных показал, что содержание N2B изоформы тайтина коррелирует с частотой сердечных сокращений (ЧСС). У мелких животных (кролик, хомяк, мышь, крыса) с высокой ЧСС (в диапазоне 140-650 ударов/мин) содержание жесткой N2B изоформы тайтина в ЛЖ составляет 80-94%. У крупных животных с низкой ЧСС (60-80 ударов/мин) содержание N2B изоформы уменьшается до 41-76%. Установленная корреляция наглядно демонстрирует, что содержание N2B изоформы в ЛЖ отвечает механическому поведению сердца в целом. Исходя из того, что короткая изоформа развивает высокий уровень пассивного напряжения и того, что тайтин влияет на скорость укорочения саркомера (Opitz et al., 2003), логично предположить, что преобладание короткой изоформы тайтина в миокарде может увеличивать скорость активного сокращения миокарда во

время раннего систолического укорочения. Более того, преобладание короткой изоформы может также способствовать более быстрому расслаблению сердца. Было показано, что скорость укорочения саркомера влияет на процесс расслабления мышцы: чем больше скорость укорочения мышцы, тем значительнее снижается количество взаимодействующих поперечных мостиков в зоне перекрытия толстых и тонких нитей (Мархасин и др., 1994).

Обнаруженное различие в изоформном составе тайтина на уровне отделов сердца подтверждает функциональную значимость тайтина. Преобладание более длинных изоформ в предсердиях может предоставлять большую степень физиологического растяжения миокарда и наполнение предсердий в диастолу. Это в свою очередь может отражаться на механических свойствах активного миокарда в систоле: во-первых, через механизм Франка-Старлинга, согласно которому увеличение силы сердечных сокращений зависит от увеличения степени растяжения волокон миокарда, и во-вторых, через Са-регуляцию сокращения, т.к. с увеличением растяжения возрастают количество Са+2, участвующего в активации сокращения и Са-чувствительность сократительных белков (Hofman & Fuchs, 1988; McDonald & Moss, 1995; Konhilas et al., 2002).

Обнаруженная зональность распределения изоформ тайтина в стенке желудочков позволяет предположить, что вариабельность изоформного состава тайтина имеет значение для механического поведения стенки желудочков, а именно является частью механизма, обуславливающего асинхронное сокращение стенки (Бляхман, 1996). В пользу данного предположения указывают уже приведенные выше функциональные свойства тайтина (влияние на скорость укорочения саркомера и активацию сокращения растяжением), что вполне может обуславливать рассогласование во временном ходе активации регионов, основой которого может быть регуляция Са-чувствительности.

Таким образом, преобладание в миокарде длинной или короткой изоформ тайтина, может обуславливать продолжительность цикла сокращение-расслабление миокарда и силу сердечных сокращений через регулирование изоформами степени растяжения саркомера, скорости его укорочения и Са-регуляции сокращения. Следовательно, тайтин определяет не только пассивные свойства сердечной мышцы во время диастолы, определяя растяжимость миокарда, но и регулирует сократимость сердечной мышцы во время систолы.

1.2. Изоформный состав тайтина в эмбриональном сердце млекопитающих

Электрофоретический анализ изоформного состава тайтина в

развивающемся сердце свиньи и крысы показал, что для эмбрионального миокарда характерна экспрессия длинной (ШВА) изоформы тайтина с значительно большим молекулярным весом, чем в миокарде взрослого животного.

В ЛЖ новорожденной свиньи молекулярный вес тайтина ~ на 200 кДа выше чем у взрослого животного и на геле отмечаются три варианта длинной изоформы тайтина, а не два, как у взрослого животного (Рис. 4). . Различие в изоформном составе тайтина в желудочках, характерное для взрослого сердца, имеет место и в эмбриональном сердце: в ПЖ длинной изоформы больше, чем в ЛЖ (данные не приведены).

ЛЖ свиньи _ , _

Рис. 4. Элекгрофореграмма. Изо-Таптнн 1д 1гоД п формный состав тайтина в разви-

вающемся миокарде ЛЖ свиньи.

(1д) - первый день постэмбрио-нальногоразвития.

—3000

Изоформный состав тайтина в миокарде крысы в ходе эмбрионального развития претерпевает ещё более неожиданные изменения. Как показано выше, миокард желудочка взрослой крысы содержит более 90% короткой изоформы с молекулярным весом 3000 кДа. В противоположность, эмбриональное сердце крысы содержит более 90% длинной изоформы, с молекулярным весом, не характерным для сердечного тайтина (Рис. 5). Полоса этой изоформы тайтина на гелях находится на одном уровне с полосой скелетной изоформы тайтина, молекулярный вес 3700 кДа для которой установлен из аминокислотной последовательности (Labeit & Kolmerer, 1995). Так как по литературным данным наибольший молекулярный вес для сердечного тайтина млекопитающих предполагался не более 3350 кДа (Freiburg et al.,.2000), у нас возникло предположение о возможной экспрессии скелетных изоформ тайтина в эмбриональном миокарде. С помощью иммуноблоттинга было установлено, что обнаруженная полоса тайтина в эмбриональном сердце крысы с молекулярным весом 3700 кДа является сердечной N2BA изоформой. Сердечный тайтин с таким высоким молекулярным весом обнаружен впервые и это согласуется с данными по нуклеотидной последовательности гена тайтина, предполагающей его максимальный вес 4200 кДа (Bang et al. 2001). Результаты установленной поэтапной замены изоформного состава тайтина в сердце крысы на разных стадиях эмбрионального и постэмбрионального развития представлены на рис. 5А. Денситограмма на рис. 5Б отражает эту динамику: в миокарде эмбриона крысы за 6 дней до рождения (э16) отмечается почти 100% N2BA изоформы, затем на сроке за 3 дня до рождения (э19) наблюдаются уже

^.и? ^И?

Рис. 5 Динамика изоформных замен тайтина в миокарде ЛЖ крысы в процессе перинатального развития

А - Электрофоретический анализ изоформного состава тайтина в миокарде ЛЖкрысы в процессе перинатальногоразвития: э16, э19 - дни эмбрионального развития крысы; 1д, 2д, 7д, 12д - дни постэмбриональногоразвития крысы. Б-Денситограмма. Профили интенсивности оптической плотности полос N2BA и N2B изоформ тайтина на геле.

два варианта ШВА изоформы и отмечается слабая полоса короткой (N23) изоформы. В первый день после рождения (1д) доля ШВА уменьшается, а доля N23 значительно возрастает. С пятого по двенадцатый дни наблюдается постепенное возрастание доли короткой (N23) изоформы и она достигает уровня экспрессии, характерного для взрослого миокарда -94%.

Следует отметить, что в образцах развивающегося миокарда крысы отмечалось увеличение количества Т2 тайтина (часть молекулы тайтина, расположеная в А-диске саркомера и взаимодействующая с миозином) по сравнению со взрослым миокардом, где полоса Т2 практически не заметна (Рис. 5 А).

Предварительно было установлено, что при одинаковых длинах саркомера в процессе растяжения эмбриональный миокард крысы развивает в 15-20 раз меньшее пассивное напряжение, чем миокард взрослого животного.

Обсуждение результатов. Учитывая радикальные изменения

механических нагрузок на формирующееся сердце в ходе перинатального развития, обнаруженные поэтапные изменения, тайтина вполне обоснованны и, вероятно, соответствуют глобальной поэтапной перестройке миокарда, происходящей в ходе эмбриогенеза. Более того, обнаруженные замены в изоформах тайтина, имеющих разные механические характеристики, качественно подтверждают его роль в меняющихся механических свойствах развивающегося миокарда. В частности, это подтверждается зависимостью между содержанием жесткой (№В) изоформы тайтина в миокарде крысы и ЧСС (ЧСС у эмбриона в два раза меньше, чем у взрослого животного). Вероятно, наличие более длинных изоформ тайтина обуславливает большую растяжимость миокарда и аккумуляцию больших объёмов крови, характерных для эмбрионального сердца, а через механизм Франка-Старлинга обеспечиваются удовлетворительные ударный объём и фракция выброса. Функциональная значимость тайтина для сердца подчеркивается также и тем, что еще на эмбриональном этапе развития прослеживается различие в изоформном соотношении тайтина между ПЖ и ЛЖ миокарда свиньи, характерное для взрослого сердца.

Учитывая мультифункциональность тайтина, вполне допустимо, что его роль не ограничивается регулированием пассивного напряжения миокарда. Установленная поэтапная изоформная замена в тайтине может быть отнесена и к его участию в сборке саркомера или в процессе сигнализации, что также может оптимизировать развитие миокарда в перинатальный период. Увеличение количества. Т2 (часть молекулы тайтина, расположеная в А-диске саркомера) в развивающемся сердце свидетельствует о важности тайтина в сборке миофибрилл в формирующемся сердце. Стабильность Т2 тайтина в А-зоне саркомера критически необходима для сборки и стабилизации толстых миозин-содержащих нитей и, вероятно, для реорганизации самого тайтина (образования его изоформ).

Часть II. Изоформный состав тайтина в миокарде левого желудочка

человека при ДКМП

Сравнительное исследование 10-ти образцов здорового человека с нормой и 8 образцов миокарда больных ДКМП с помощью гель-электрофореза показало, что в больном миокарде увеличен молекулярный вес и количество длинной (N2BA) изоформы тайтина (Рис. 6). При денситометрировании полученных полос белка на гелях установлено, что содержание длинной изоформы (% от N2B+N2BA) в 7 из 8-ми образцах дилатированного ЛЖ повышено по сравнению с нормой. Гистограмма на рис. 7 демонстрирует, что в нормальном миокарде диапазон

вариабельности доли длинной изоформы составляет 25-40%, а в миокарде больных ДКМП вариабельность доли длинной изоформы тайтина увеличена от 30 до 55%. Доля длинной изоформы в ДКМП группе достоверно увеличена в среднем на 10% (р<0.001).

кДа

3700_ 3300-—;

3000" ^ ^

порчи ЛШП ЛА Л/К* (Л А ш. тсвска и к- ри ^ 14 и виньи)

тантин

_Ы2А

с=Ы2ВА —№В Т2

щ «оки& (ьро шьа)

г §

Е я

Рис. 6. Сравнение изоформного состава тайтина в нормальном и ДКМП миокарде человека с миокардом крысы и свиньи.

ДКМП

Ь.

20 25 30 35 40 45 50 55 60 1Ч2ВА(Ч 01 ГСВ+ГСВА)

Рис. 7. Гистограмма распределения относительного содержания ШВА изоформы тайтина в миокарде человека (норма и ДКМП)

Интерполирование Гауссовым распределением профилей интенсивности оптической плотности типичных тайтиновых полос на гелях позволило дать количественную оценку изменениям молекулярного веса тайтина при патологии. Мы получили высокую воспроизводимость одиночной кривой нормального распределения для К2В изоформы тайтина (Рис. 8). Однако Гауссово распределение оптической плотности полосы ШВА изоформы является суперпозицией двух кривых, отвечающих двум вариантам длинной изоформы: ШВА-1 и ШВА-2.

Молекулярный ве< таЛтина (МДа)

Рис.8 Гауссово распределение интенсивности оптической плотности полос ШВ и №ВА изоформ тайтина на гелях.

Действительно, на некоторых окрашенных гелях, визуально мы наблюдали дублет полосы длинной изоформы тайтина в образцах ДКМП, но, к сожалению, при сканировании гелей на получаемом изображении четкость разделения N2BA полосы утрачивалась. В результате примененного подхода установленный молекулярный вес для N2BA-1 и N2BA-2 тайтина в норме составил 3.22-3.23 МДа и 3.31-3.32 МДа, соответственно. В патологии отмечалось явное увеличение молекулярного веса N2BA-2, где он составил 3.31-3.53 МДа, т.е. на 210 кДа больше.

Обсуждение результатов. Установленное в настоящем исследовании появление более длинных изоформ тайтина при ДКМП отражает трансформацию его изоформного состава к таковому в эмбриональном сердце. Следует подчеркнуть, что при заболеваниях сердца реэкспрессию эмбриональных генов сократительных белков связывают с адаптацией (Schiaffino & Reggiani, 1996). Поэтому мы предполагаем, что появление более длинных изоформ тайтина и увеличение их доли в миокарде при ДКМП направленно на увеличение податливости миокарда к растяжению, увеличение конечно-диастолического объёма и реализацию компенсаторного механизма Франка-Старлинга.

Часть III. Влияние изменения изоформного состава сердечного тайтина у больных ДКМП на механические свойства пассивного миокарда

Для оценки вклада установленного изменения в изоформном составе тайтина в развитие пассивного напряжения неактивированным миокардом, т.е. в диастоле, сначала было проведено измерение напряжения, развиваемого неактивированными миофибриллами. Все одиночные миофибриллы, включенные в эксперимент, имели регулярную саркомерную структуру, содержали длинную изоформу тайтина, и изоформное соотношение в образцах было близкое к среднеустановленному для нормы и патологии (Рис. 9, вставка). Полученные кривые зависимости «длина-напряжение» для нормы и патологии (Рис. 9) отражают значительное снижение пассивного напряжения, развиваемое миофибриллами миокарда больных ДКМП при длинах саркомера 2.0-2.4 мкм. Уровень пассивного напряжения, развиваемого миофибриллами дилатированного миокарда, снижен от нормы в среднем на 25%. Упругая компонента пассивного напряжения значительно различается между нормой и ДКМП при длинах саркомера 2.3 и 2.4 мкм. Различия в вязкоупругом напряжении между образцами нормы и ДКМП при их растяжении в диапазоне физиологических длин

Рис. 9. Пассивное напряжение, развиваемое неактивированными одиночными миофибрилла-ми миокарда человека Суммарный результат трех составляющих пассивного напряжения представлен как среднее ±5£Л/; п-6: *р<0.05.

Вставка Тест миофиб-риллы на регулярность саркомерной структуры и иммунофлюоресция с антителами к длинной (N2BA) изоформе тай-тина, шкала - 5мкм.

саркомера не обнаружено, что говорит об отсутствии его влияния на конечные результаты измерения. Таким образом, на уровне миофибрилл обнаруженное нами увеличение доли длинных изоформ действительно обуславливает увеличение податливости миокарда.

Однако, в виду того, что на поздних стадиях ДКМП наблюдается активное развитие экстраклеточного матрикса и фибриллярной коллагеновой сети, повышающих жесткость кардиомиоцитов и вызывающих нарушение диастолического расслабления миокарда (Burlew & Weber, 2002), было проведено измерение пассивного напряжения, развиваемого неактивированными пучками волокон. С целью избирательного протеолиза тайтина образцы миокарда были обработаны трипсином. К каждому образцу (норма и ДКМП) до и после обработки трипсином были приложены циклы растяжение-освобождение в диапазоне физиологических длин саркомера. При анализе результатов использовались данные, зарегистрированные при каждом 5-ом цикле растяжения-освобождения, когда наблюдалась стабилизация гистерезиса. Было установлено, что после 5-ти циклов растяжение-освобождение гистерезис достигает 60% от начальной оценки, после чего наблюдается незначительное различие между кривыми последующих циклов.

Сравнение уровней пассивного напряжения в обеих группах (норма и ДКМП) между интактными образцами (до обработки трипсином) и

О 10 20 30 40

Время, мин.

Рис. 10. Относительный вклад тайтина в жесткость пассивного миокарда (данные представлены как среднес±5ЕМ)

7 - ПН образцов нормального миокарда человека после протеолиза тайтина, (п=15).

2- ПН образцов миокарда с ДКМП (содержание N2BA выше, чем в норме) после протеолиза тайтина, (п=10).

3 - ПН образцов миокарда с ДКМП (содержание N2BA равно таковому в норме) после протеолиза тайтина, (п =2).

4 - ПН контрольного образца миокарда (норма), к которому были приложены циклы растяжения-освобождения без обработки трипсинам, (п=2).

Гистограмма Сравнительный вклад тайтина в жесткость миокарда относительно экстраклеточных структур КМЦ.

а - жёсткость, обусловленная экстраклеточными структурами КМЦ, б— жёсткость, обусловленная тайтином. Для построения гистограммы использованы данные, зафиксированные при временной точке 40 мин.

образцами с деградированным тайтином (после обработки трипсином) позволило отразить вклад тайтина в общую жесткость пассивного миокарда относительно экстраклеточных цитоскелетных компонентов. В результате было получено,. что доля пассивного напряжения, обусловленного тайтином, выше в нормальном миокарде. На рис. 10 представлен суммарный результат эксперимента. Значение интеграла от 5-ой кривой цикла растяжение-освобождение, выражающего % от максимума пассивного напряжения (100%), развиваемого контрольным образцом, не подвергшимся обработке трипсином (первая кривая на графике), отражает снижение жесткости образцов (ДКМП и норма) при воздействии трипсином, продолжающемся 40 минут до полной деградации тайтина. Остаточная жесткость в образцах миокарда ДКМП и нормы, после полной деградации тайтина, обусловлена незатронутыми трипсином структурами цитоскелета - промежуточными нитями и коллагеном.

На гистограмме (Рис. 10) видно, что в нормальном миокарде жесткость, обусловленная тайтином составляет 62% от общей жесткости, а в миокарде больных ДКМП она составляет только 38%. В образцах миокарда больного ДКМП, где доля длинной N2BA изоформы тайтина не отличалась от установленного среднего значения для миокарда в норме, вклад тайтина в жесткость миокарда составлял 48%, т.е. в таком миокарде пассивная жесткость будет выше на 10%, чем в миокарде больных ДКМП, у которых увеличена доля длинной (N2BA) изоформы тайтина.

Обсуждение результатов. Полученные результаты показали, что, на фоне повышенной общей жесткости образцов пассивного миокарда человека с ДКМП по сравнению с образцами нормального миокарда, обнаруженное нами изменение в изоформном составе тайтина (увеличение длины и доли его длинных изоформ) может вносить значительный' вклад в увеличение диастолического расслабления миокарда. Несмотря на то, что зафиксированное снижение упругости миофибрилл может отражаться на сокращении миокарда при его активации, в целом, появление более длинных изоформ тайтина и снижение пассивного напряжения миофибрилл, несомненно, имеет позитивное значение для реализации компенсаторных механизмов. Во-первых, увеличивая в некоторой степени растяжение миокарда, длинные изоформы тайтина снижают его жесткость, способствуют лучшему наполнению желудочков и увеличению конечно-диастолического объема. Увеличение конечно-диастолического объёма является компенсаторным ответом на снижение сократимости и посредством механизма Франка-Старлинга позволяет поддерживать удовлетворительные ударный объем и фракцию выброса. Во-вторых, появление более длинных изоформ тайтина может оптимизировать зависимое от длины увеличение напряжения,

обусловленное ростом чувствительности сократительных белков к Са+2 и увеличением поступления Са+2 к миофибриллам. Более того, в качестве подтверждения значительной роли адаптационных перестроек в саркомерных белках и, в частности, рассматриваемого нами тайтина, можно привести данные о функционировании механизма Франка-Старлинга даже на последних стадиях ДКМП (Holubarsch et al., 1996; Weil etal., 1998).

ВЫВОДЫ

1. Для миокарда эмбриона крысы и новорожденной свиньи характерна экспрессия изоформ тайтина, молекулярный вес которых значительно выше по сравнению с таковым в миокарде взрослых животных.

2. В процессе перинатального развития в миокарде крысы происходит поэтапная трансформация изоформ тайтина в сторону уменьшения их молекулярного веса и его стабилизация в миокарде взрослого животного.

3. Экспрессия высокомолекулярных изоформ тайтина в эмбриональном миокарде крысы приводит к снижению его пассивного напряжения в 1520 раз, по сравнению с миокардом взрослого животного, что отвечает высоким нагрузкам, характерным для эмбрионального сердца.

4. Обнаруженное повышенное содержание Т2 фрагмента молекулы тайтина в развивающемся миокарде крысы по сравнению с миокардом взрослого животного подтверждает предположение о важности роли Т2 для формирования саркомеров и реорганизации изоформ тайтина.

5. Различное содержание длинной и короткой изоформ тайтина в левом желудочке у разных видов млекопитающих, в разных отделах сердца одного животного и в разных зонах стенки левого желудочка свидетельствует о том, что тайтин является частью тонко настроенного механизма регуляции жесткости сердечной мышцы, обеспечивающего её* адекватный механический ответ в процессе сокращения.

6. В миокарде левого желудочка человека при ДКМП зарегистрировано появление более длинных изоформ тайтина и увеличение их доли в среднем на 10%, что приводит к снижению уровня пассивного напряжения одиночных миофибрилл в среднем на 25% и снижению уровня пассивного напряжения, развиваемого пучками волокон на 10%.

7. Установленная направленность изменений в изоформном составе тайтина имеет адаптационную природу и на молекулярном уровне обеспечивает реализацию компенсаторных механизмов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вихлянцев И.М., Макаренко И.В., Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Малышев С.Л., Подлубная З.А. Изменения изоформного состава цитоскелетного белка тайтина - адаптационный процесс при гибернации/' Биофизика, 2000, т. 45, № 5, с. 831-835.

2. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Titin cytoskeleton of vertebrate striated muscle: behavior upon hibernation // Abstr. 29"'Europ. MuscleConf., Berlin, Germany, 2000, p. 114.

3. Макаренко И.В., Ильинский И.,М., Подлубная З.А. Изменения гигантского белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Тезисы 2-ой Росс. Конф. "Физика в биологии и медицине", Екатеринбург, 2001, с. 36-37.

4. Макаренко И.В., Халина Я.Н. Изменения цитоскелетного саркомерного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Тезисы 11 Конф. молодых ученых России с межд. участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001, Т. 1, с. 247.

5. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Myosin-associated protein titin of skeletal and cardiac muscles: behavior upon adaptation and pathology // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility: new trends in research", Pushchino, Russia, 2001, p. 167-169.

6. Khalina Ya.N., Makarenko I.V., Shpagina M.D., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. In vitro study on light chain 1 isoform replacement in ventricular myosin: perspectives for prognostic test of dilated cardiomyopathy development // J. Muscle Res. & CellMotil, 2002, v. 23(1), p. 36-37 (Abstr. 3lh Europ. Muscle Conf., Lunteren, Netherlands, 2002).

7. Makarenko I.V., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Changes in titin and development of dilated cardiomyopathy // Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2002, v. 34, № 6, p. A86 (Abstr. Intern. Conf "The Failing Heart: From Molecular Mechanisms to Clinical Applications", Stara Lesna, Slovac Republic, 2002).

8. Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. Изменение структурно-функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Биофизика, 2002, т. 47, № 4, с. 706-710.

9. Opitz C.A., Leake М.С., Makarenko I. & Linke W.A.. Titin isoform switch adjusts myocardial passive tension T0 changing condditions during perinatal heart development // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2003, v. 24(4-6), p. 338 (Abstr. 32h Europ. Muscle Conf, Montpellier, France, 2003).

10. Neagoe Q Opitz Q Makarenko I., Linke W. Gigantic variety: expression patterns of titin isoforms in striated muscles and consequences for myofibrillar passive stiffness. II J. Muscle Res. & Cell Motil, 2003, v. 24(2-3), p. 175-189.

11. Makarenko I., Leake M.C., Dussel R.J., Hajjar R.J. & Linle W.A. Titin-isoform shift in failing DCM hearts reduces myofibrillar passive stiffhes but is independent of hypertrophy signals // Biophys. J., 2004, v. 86 (№ 1, part 2), p. 207a (Abstr. 48th Biophysical Society Annual Meeting, Baltimore, USA, 2004).

12. Opitz CA. Leake MC, Makarenko I, Benes V, Linke WA. Developmentally Regulated Switching of Titin Size Alters Myofibrillar Stiffness in the Perinatal Heart /I Ore. Res., 2004, v. 94(7), p. 967-75.

Список сокращении: ДКМП - дилатационная кардиомиопатия; ЛЖ, ПЖ - левый, правый желудочек; ЧСС - частота сердечных сокращений; NYHA - Нью-Йоркская ассоциация кардиологов; ДСН -додецилсульфат натрия.

Исследование поддержано грантами РФФИ № 00-04-48200; ДААД А/02/24098; ДФГ Li690/6-2, Li690/2-3.

»11*43

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макаренко, Ирина Викторовна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. НОВАЯ, ТРЕХНИТЕВАЯ МОДЕЛЬ САРКОМЕРА.

Глава 2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ МОЛЕКУЛЫ ТАЙТИНА.

2.1. Структура и функции области молекулы тайтина, расположенной в Z-диске саркомера.

2.2. Структура и функции области молекулы тайтина, расположенной в I-зоне саркомера.

2.2.1. Изоформы сердечного тайтина в I-зоне саркомера.

2.2.2. Взаимодействие тайтина с тонкими нитями в I-зоне саркомера.

2.3. Структура и функции области молекулы тайтина, расположенной в А-диске саркомера.

2.4. Структура и функции области молекулы тайтина, расположенной в М-линии саркомера.

Глава 3. РОЛЬ ТАЙТИНА В МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВАХ

МИОКАРДА.

3.1. Молекулярная основа эластичности сердечного тайтина.

3.2. Тайтин и сократительные свойства миокарда.

Глава 4. ИЗМЕНЕНИЯ В ТАЙТИНЕ ПРИ ПАТОЛОГИИ

МИОКАРДА.

4.1. Ремоделирование миокарда при ДКМП.

4.2. Изменения в тайтине миокарда при ДКМП.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии"

ДКМП характеризуется дилатацией камер сердца, истончением стенок и снижением насосной функции сердца (Амосова, 1999). Основным клиническим проявлением кардиомиопатии является хроническая сердечная недостаточность, которая сопровождается ремоделированием сердца и проходит в своем развитии стадии компенсации и декомпенсации (Моисеев, 2000). Это заболевание с неопределенной этиологией и недостаточно изученным патогенезом. В связи с отсутствием полного понимания молекулярных механизмов развития и компенсации ДКМП, эта патология, как правило, выявляется уже на последней стадии развития. Несмотря на то, что из всех случаев ДКМП наследственные формы составляют более 20%, их изучение и попытки оценить значимость генетического фактора в их развитии не привели к выяснению природы этого заболевания. Однако подавляющее большинство исследователей приходит к заключению, что причины развития идиопатической ДКМП лежат непосредственно в нарушениях сократительной способности миокарда, обусловленной гибелью кардиомиоцитов и развитием обширного фиброза, что приводит к возрастанию жесткости сердечной мышцы (Амосова, 1999; Капелько, 2000). В молекулярном патогенезе ДКМП преимущественно обнаружены нарушения в экстраклеточных компонентах цитоскелета кардиомиоцитов (Franz et al., 2001; Towbin & Bowles, 2002).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Макаренко, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

3. Экспрессия высокомолекулярных изоформ тайтина в эмбриональном миокарде крысы приводит к снижению его пассивного напряжения в 15-20 раз, по сравнению с миокардом взрослого животного, что отвечает высоким нагрузкам, характерным для эмбрионального сердца.

5. Различное содержание длинной и короткой изоформ тайтина в левом желудочке у разных видов млекопитающих, в разных отделах сердца одного животного и в разных зонах стенки левого желудочка свидетельствует о том, что тайтин является частью тонко настроенного механизма регуляции жесткости сердечной мышцы, обеспечивающего её адекватный механический ответ в процессе сокращения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность руководителю работы профессору Подлубной З.А, заведующему отделением Клинической Анатомии НИИТиИО профессору Ильинскому И.М. за активное сотрудничество, доктору Линке В.А. за предоставленную возможность проведения исследований на базе его лаборатории (Гейдельберг, Германия) и участие в обсуждении работы.

А также искренне благодарю моих коллег из лаборатории структуры и функции мышечных белков ИТЭБ РАН: Вихлянцева И.М., Малышева С.Л, Удальцова С.Н., Шпагину М.Д., Халину Я.Н. и группы механики мышечных клеток (Гейдельберг, Германия): Лике М., Кулке М., Неаго С., Опиц К.

Макаренко И. В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установление молекулярной структуры тайтина и достаточно интенсивное изучение его функциональных свойств, таких как ответственность тайтина за развитие пассивного напряжения в миокарде и сборку саркомера в процессе миофибриллогенеза, поставило тайтин на одно из первых мест по важности в ряду саркомерных белков. Тем не менее, понимание определяющей роли тайтина в мышечной регуляции только формируется в настоящее время. Изучение структуры и функций этого саркомерного белка в интактной мышце и при патологии имеет большое значение. Такой двусторонний подход позволяет получить более широкое представление о диапазоне возможностей структурно-функциональных переходов изучаемого белка и установить важность данной структурной единицы для мышечного сокращения.

Результаты, представленные в первой части настоящего исследования, демонстрируют, что вариабельность изоформного состава тайтина в сердце, выражающаяся в различном соотношении длинной и короткой изоформ, во многом определяет механические свойства пассивного и активного миокарда. Это, в свою очередь, подтверждает важность вклада гигантского эластичного белка тайтина в насосную функцию сердца. Более того, установленные последовательные замены в изоформном составе тайтина в развивающемся миокарде полностью отражают поэтапно сменяющиеся механические свойства формирующейся сердечной мышцы. Таким образом, весь комплекс полученных данных о вариабельности изоформного состава тайтина в нормальном миокарде определяет тайтин как ключевой компонент, определяющий механические свойства сердечной мышцы.

Во второй части исследования представлены результаты о направленности качественных и количественных изменений в тайтине миокарда больных ДКМП и влиянии этих изменений на механические свойства пассивного миокарда. Как было отмечено выше, сократительная способность сердца в значительной мере зависит от механического поведения миокарда в стадии диастолы, которое, в свою очередь, в значительной степени определяется механическими свойствами тайтина. Анализируя роль обнаруженных нами изменений тайтина в развитии данной сердечной патологии, мы пришли к следующему заключению. Появление в миокарде больных ДКМП более длинных изоформ тайтина, по сравнению с нормальным миокардом, является адаптационным механизмом, направленным на увеличение податливости миокарда в диастоле с целью реализации механизмов компенсации.

Известно, что в основе морфогенеза ДКМП лежит распространенное необратимое повреждение КМЦ, что влечет за собой развитие обширных процессов склероза и фиброза (Амосова, 1999). Это, в свою очередь, нарушает эластические свойства миокарда, вызывая повышение его жесткости и ухудшение расслабления. Результатом этих изменений является значительное снижение конечно-диастолической податливости камер желудочков и их наполнения. Как известно, ремоделирование на начальных этапах патологии представляет собой компенсаторный процесс, направленный на поддержание сократительной функции ЛЖ за счет гипертрофии миокарда и расширения камер сердца. Увеличение размера ЛЖ приводит к объёмной перегрузке сердца, что сопровождается развитием адаптационной тоногенной дилатации и нарастанием мышечной массы без утолщения стенки ЛЖ (эксцентрическая гипертрофия миокарда).

При патологии часто наблюдается реактивация эмбриональных генов (Chien et al., 1993; Hunter & Chien, 1999; Капелько, 2000; Моисеев, 2000). В частности, наблюдается реэкспрессия сократительных белков и белков, ответственных за рост сердца в процессе эмбрионального развития. Предполагают, что их реэкспрессия во взрослом миокарде может способствовать дилатации. На клеточном уровне при ДКМП отмечается удлинение КМЦ, обусловленное удлинением волокон. Естественно, источником этих трансформаций прежде всего будут изменения в цитоскелетных белках, т.к. именно цитоскелет в основном определяет форму клеток. При ДКМП отмечается изменение экстраклеточных компонентов цитоскелета - появление форм коллагена, характерных для эмбрионального и растущего сердца (Капелько, 2000). Показано также, что начальная стадия ДКМП протекает в условиях снижения общего содержания коллагена и увеличения растяжимости сердечной мышцы (Maisch, 1996). Установленное нами изменение во внутриклеточном компоненте цитоскелета - тайтине, а именно появление более длинных его изоформ при ДКМП отражает трансформацию его изоформного состава к таковому в развивающемся, растущем сердце. Суммируя имеющиеся данные, можно предположить, что тайтин активно вовлечен в ремоделирование миокарда, направленное на развитие компенсаторной (тоногенной) дилатации для увеличения сердечного выброса. Повышение растяжимости камер является предпосылкой увеличения преднагрузки, т.е. увеличения конечно-диастолического напряжения стенки за счет увеличения объема крови. Этот процесс развивается в соответствии с компенсаторным механизмом Франка-Старлинга во избежание критического падения сердечного выброса. Как было отмечено в главе 3.2, увеличение степени растяжения сердечной мышцы сопровождается увеличением силы её сокращения. Следовательно, экспрессия более длинных изоформ тайтина в мйокарде больных ДКМП может обуславливать реализацию компенсаторного механизма Франка-Старлинга, направленного на оптимизацию сокращения сердечной мышцы.

Заметим, что адаптационная перестройка сократительного аппарата затрагивает как тайтин, так и миозин - важные белки, которые в саркомере находятся в тесном структурном и функциональном сопряжении друг с другом. В частности, была показана адаптационная роль структурной реорганизации основного сократительного белка миозина при ДКМП (Khalina et al., 2003; Подлубная и др., 2003). Авторы показали, что на стадии компенсации ДКМП в миозине желудочков до 30% желудочковых легких цепей-1 заменяется предсердными легкими цепями-1, не характерными для этого отдела взрослого сердца, но характерными для периода эмбрионального развития. Эти замены приводят к значительной активации ферментативных свойств миозина и как следствие к увеличению сократительной способности миокарда. В качестве подтверждения значительной роли адаптационных перестроек в саркомерных белках, и в частности рассматриваемого нами тайтина, можно также привести данные о функционировании механизма Франка-Старлинга даже на последней стадии ДКМП (Holubarsch et al., 1996; Weil et al., 1998).

Настоящее исследование вносит вклад в понимание молекулярных основ механизмов сердечной адаптации и выявляет роль эластичного саркомерного белка тайтина в ремоделировании миокарда, направленного на поддержание сократительной функции левого желудочка при ДКМП. Полученные данные об изменениях тайтина в миокарде больных ДКМП наряду с изменениями в миозине могут быть использованы при разработке диагностического теста, и способствовать повышению его объективности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макаренко, Ирина Викторовна, Пущино

1. Амосова Е.Н. (1999) Кардиомиопатии // К: Книга плюс, 425с.

2. Бляхман Ф.А. (1996) Асинхронизм как модулятор сократимости миокарда и насосной функции левого желудочка // Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук, Москва, 53с.

3. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2003) Фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков адаптационный фактор ингибирования сократительной активности мышц при зимней спячке II Биофизика, т. 48, № 3: 499-504.

4. Кантор Б.Я., Яблучанский Н.И., Шляховер В.Е. (1991) Нелинейнаякардиобиомеханика левого желудочка // Киев: Наукова думка, 212 с.

5. Капелько В.И. (2000) Внеклеточный матрикс миокарда и его изменения при заболеваниях сердца // Кардиология 9: 78-90.

6. Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структурно-функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии И Биофизика, т.47, № 4: 706-710.

7. Мархасин B.C., Изаков В.Я., Шумаков В.И. (1994) Физиологические основы нарушения сократительной функции миокарда// СПб: Наука, 256с.

8. Моисеев B.C. (2000) Сердечная недостаточность и достижения генетики. Достижения в изучении генома человека делают все более и более значимой оценку различных генетических аспектов при конкретных видах патологии //

9. Consilium Mudicum. T.l,№4: 121-131.

10. Морман Д., Хеллер Л. (2000) Физиология сердечно-сосудистой системы // пер. с англ. СПб: Питер, 256с.

11. Подлубная З.А., Халина Я.Н., Шпагина М.Д., Малышев С.Л. (2003) Изменение состава лёгких цепей миозина миокарда: влияние на функциональные свойства и связь с кардиомиопатиями // В кн. Горизонты биофизики: от теории к практике, Пущино, с. 126-130.

12. Пузик В.И., Харьков А.А. (1948) Возрастная морфология сердечно-сосудистой системы человека // М.: Академия Педагогических Наук РСФСР, 224 с.

13. Терещенко С.Н., Джаниани Н.А. (2001) Дилатационная кардиомиопатия сегодня // Consilium Medicum. Т.З, №2.

14. Фатенков B.II. (1990) Биомеханика сердца в эксперименте и клинике // М: Медицина, 160с.

15. Черныш A.M. (1993) Биомеханика неоднородностей сердечной мышцы // М.: Наука, 151с.

16. Шумаков В.И. и Толпекин В.Е. (1999) Искусственное сердце состояние проблемы и перспективы // Вестник трансплантологии и искусственных органов №1: 29-32.

17. Шумаков В.И., Хубутия М.Ш., Ильинский И.М. (2003) Дилатационная кардиомиопатия // ООО « Издательство Триада» 448 с.

18. Хубутия М.Ш. (2001) Дилатационная кардиомиопатия // Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 3-4: 32-40.

19. Allen D.G. & Kentish J.C. (1985) The cellular basis of the length-tension relation in . cardiac muscle II J. Mol. Cell Cardiol. 17: 821-840.

20. Arber S., Hunter J.J., Ross J.J., Hongo M., Sansig G. et al. (1997) MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure // Cell 88:393-403.

21. Ayme-Southgate A., Vigoreaux J., Benian G., Pardue M.L. (1991). Drosophila has a twitchin/titin-related gene that appears to encode projectin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7973-77.

22. Ayoob J.C., Turnacioglu K.K., Mittal В., Sanger J.M., Sanger J.W. (2000) Targeting of cardiac muscle titin fragments to the Z-bands and dense bodies of living muscle and non-muscle cells // Cell. Motil. Cytoskeleton 45:67-82.

23. Bartoo M.L., Popov V.I., Fearn L.A. and Pollack G.H. (1993) Active tension generation in isolated skeletal myofibrils // J. Muscle Res. Cell Motil. 14:498-510.

24. Bell S.P., Nyland L., Tischler M.D., McNabb M., Granzier H., LeWinter M.M. (2000) Alteration in the determinants of diastolic suction during pacing tachycardia // Circ. Res. 87: 235-240.

25. Benian G.M., Kiff J.E., Neckelmann N. Moerman D.G., Waterston R.H. (1989) Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in C. elegans II Nature 342:45-50.

26. Bennett P.M., Hodkin Т.Е. & Hawkins C. (1997) Evidence that the tandem Ig domains near the end of the muscle thick filament form an inelastic section of the I-band titin IIJ. Struct. Biol. 120: 93-104.

27. Bonne G. & Muchir A. (1999) Spectrum of mutation in laminin A/C gene implicated in a new form of DCM with conduction defects and muscular dystrophy // Circulation 100, 18: 255.

28. Brigden W (1957) Uncommon myocardial diseases. The non-coronary cardiomyopathies // Lancet. 2: 1179-1184, 1243-1249.

29. Burlew B.S. & Weber K.T. (2002) Cardiac Fibrosis as a Cause of Diastolic Dysfunction IIHerz 27:92-98.

30. Carlsson L. & Thornell L.E. {2001) Desmin-related myopathies in mice and man // Acta Physiol. Scand. 171:341-48.

31. Carrier L., Boheler K.R., Chassagne C., de la Bastie D., Wisnevsky C. et al. (1992) Expression of sarcomeric actin isogenes in rat heart with development and senescence // Circ. Res. 70: 999-1005.

32. Cazorla O., Pascarel C., Gamier D., Le Guennec J.Y. (1997) Resting tension participates in the modulation of active tension in isolated guinea pig ventricular myocytes II J. Mol. Cell Cardiol. 29: 1629-1637.

33. Cazorla O., Vassort G., Gamier D., Le Guennec J.Y (1999) Lenght modulation of active force in rat cardiac myocytes: is titin the sensor? // J. Mol. Cell Cardiol. 31: 1215-1227.

34. Cazorla О., Freiburg A., Helmes M., Centner Т., McNabb M., et al. (2000) Differential expression of cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness // Circ. Res. 86:59-67.

35. Cazorla O., Wu Y., Irving T.C., Granzier H. (2001) Titin-based modulation of calcium sensitivity of active tension in mouse skinned cardiac myocytes // Circ. Res. 88: 10281035.

36. Centner Т., Yano J., Kimura E., McElhinny A.S., Pelin K., et al. (2001) Identification of muscle specific ring finger proteins as potential regulators of the titin kinase domain II J. Mol. Biol. 306:717-26.

37. Cox G.F. & Kunkel L.M. (1997) Dystrophies and heart disease // Curr. Opin. Cardiol. 12: 329-43.

38. Davies M. J. (1975) The cardiomyopaties. In: The pathology of the heart// Ed. Pomerance A., Davies M.J. Oxford: Blackwell, 211-250.

39. Erickson H.P. (1997) Stretching single protein molecules: titin is a weird spring // Science 276: 1090-1092.

40. Fahrmann M., Fonk I., Beinbrech G. (20026) The kinase acrivity of the giant protein projectin of the flight muscle of Locusta migratoria // Insect. Biochem. Mol. Biol. 11:140-17.

41. Franz W-M., Miiller O.J., Katus H.A. (2001) Cardiomyophathies: from genetics to the prospect of treatment // The Lancet vol.358, 10:1627-1637.

42. Freiburg A. & Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosinbinding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy II Eur. J. Biochem. 235:317-23.

43. Freiburg A., Trombitas K., Hell W., Cazorla O., Fougerousse F., et al. (2000) Series of exonskipping events in the elastic spring region of titin as the structural basis for myofibrillar elastic diversity // Circ. Res. 86:1114-21.

44. Fukuda N., Sasaki D., Ishiwata S., Kurihara S. (2001) Length dependence of tension generation in rat skinned cardiac muscle // Circulation 104: 1639-1645.

45. Funatsu Т., Higuchi H., Ishiwata S. (1990) Elastic filaments in skeletal muscle revealed by selective removal of thin filaments with plasma gelsolin//./. Cell Biol. 110: 53-62.

46. Funatsu Т., Kono E., Higuchi H., Kimura S., Ishiwata S., et al. (1993) Elastic filaments in situ in cardiac muscle: deep-etch replica analysis in combination with selective removal of actin and myosin filaments // J. Cell Biol. 120:711-24.

47. Furukawa Т., Ono Y., Tsuchiya H., Katayama Y., Bang M. et al. (2001) Specific interaction of the potassium channel P-subunit mink with the sarcomeric protein T-cap suggests a T-tubule-myofibril linking system II J. Mol. Biol. 313: 775-784.

48. Gajdosik R.L. (2001) Passive extensibility of skeletal muscle: review of the literature with clinical implications // Clin. Biomech. 16, 87-101.

49. Gao M., Wilmanns M., Schulten K. (2002) Steered molecular dynamics of titin II domain unfolding // Biophys J. 83(6): 3435-45.

50. Gautel M., Leonard K., Labeit S. (1993) Phosphorylation of KSP motifs in the C-terminal region of titin in differentiating myoblasts // EMBOJ. 12: 3827-3834.

51. Gerull В., Gramlich M., Atherton J., McNabb M., Trombitas K., et al. (2002) Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cardiomyopathy // Nat. Genet. 30:201-204.

52. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. (1949) Determination of serum proteins by • means of the biuret reaction // J. Biol. Chem., v. 177, № 2: 751-766.

53. Granzier H.L. & Irving T.C. (1995) Passive tension in cardiac muscle: contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments // BiophysJ. 68: 1027-1044.

54. Granzier H., Kellermayer M., Helmes M., Trombitas K. (1997)Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. 73: 2043-2053.

55. Granzier H. & Labeit S. (2002) Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring II J. Physiol. 541:335-342.

56. Greaser M. (2001) Identification of new repeating motifs in titin // Proteins 43: 145149.

57. Gregorio C.C., Trombitas K., Centner Т., Kolmerer В., Stier G., et al. (1998) The NH2 terminus of titin spans the Z-disc: its interaction with a novel 19-kD ligand (T-cap) isrequired for sarcomeric integrity // J. Cell Biol. 143:1013-27.

58. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. 11:18-25.

59. Gutierrez-Cruz G., Van Heerden A.H., Wang K. (2001) Modular motif, structural folds and affinity profiles of the PEVK segment of human fetal skeletal muscle titin // J. Biol. Chem. 276:7442-49.

60. Hattori A., Ishii Т., Tatsumi R., Takahashi K. (1995) Changes in the molecular types of connectin and nebulin during development of chicken skeletal muscle // Biochimica et Biophysica Acta 1244, 179-184.

61. Heierhorst J., Probst W.C., Kohanski R.A., Buku A., Weiss K.R. (1995) Phosphorylation of myosin regulatory light chains by the molluscan twitchin kinase // Eur. J. Biochem. 233:426-31.

62. Hein S., Scholz D., Fujitani N., Rennollet H., Brand Т., Friedl A., Schaper J. (1994) Altered expression of titin and contractile proteins in failing human myocardium // J. Mol. Cell Cardiol 10: 1291-306.

63. Hein S., Kostin S., Heling A., Maeno Y., Schaper J. (2000) The role of the cytoskeleton in heart failure // Cardiovasc. Res. 45:273-78.

64. Helmes M., Trombitas K., Granzier H. (1996) Titin develops restoring force in rat cardiac myocytes // Circ. Res. 79: 619-626.

65. Helmes M., Trombitas K., Centner Т., Kellermayer M., Labeit S., Linke W., Granzier H. (1999) Mechanically driven contour-length adjustment in rat cardiac titin's unique N2B sequence: titin is an adjustable spring // Circulation Research 84, 1339-1352.

66. Higuchi H. (1992) Changes in contractile properties with selective digestion of connectin (titin) in skinned fibers of grog skeletal muscle II J. Biochem. Ill: 291-295.

67. Hofman P.A. & Fuchs F. (1988) Bound calcium and force development in skinned cardiac muscle bundles: effect of sarcomere length II J.Mol. Cell Cardiol. 20:667-677.

68. Hoh J.F., McGrath P.A., Hale P.T. (1978) Electrophoretic analysis of multiple forms of rat cardiac myosin: effects of hypophysectomy and thyroxine replacement // J. Mol. Cell Cardiol. 10: 1053-1076.

69. Holubarsch C„ Goldstein D.J., Ashton R.C., Nickl W., Pieske B. et al. (1996) Existence of the Frank-Starling mechanism in the failing human heart. Investigation on the organ, tissue and sarcomere levels // Circulation 94 (4): 683-9.

70. Horovvits R., Kempner E.S., Bisher M.E., Podolsky R.J. (1986) A physiological role for titin and nebulin in skeletal muscle // Nature 323: 160-164.

71. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. 131:1471-81.

72. Hunter J.J. & Chien K.R. (1999) Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure // The New England Journal of Medicine vol. 341, 17:1276-1283.

73. Huxley H.E. & Hanson J. (1954) Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation II Nature 173, 973-976.

74. Huxley A.F. & Niedergerke R. (1954) Structural changes in muscle during contraction. Interference microscopy of living muscle cells II Nature, 173: 971-973.

75. Huxley H.E. (1969) The mechanism of muscular contraction // Science, 164: 13561366.

76. Improta S., Politou A.S., Pastore A. (1996) Immunoglobulin-like modules from titin I-band: extensible components of muscle elasticity // Structure 4: 323-337.

77. Itoh-Satoh M., Hayashi Т., Nishi H., Koga Y., Arimura Т., et al. (2002) Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 291:385-93.

78. Jin J-P. (1995) Cloned rat cardiac titin class I and class II motifs II J. Biol. Chem. 270:6908-16.

79. Jewell B.R. (1977) A reexamination of the influence of muscle length on myocardial performance // Circulat. Res., v.40: 221-229.

80. Kamisago M., Sharma S.D., DePalma S.R. et al. (2000) Mutation in Sarcomere Protein Genes as a Cause of Dilated Cardiomyopathy // N.Engl. J. Med. 343:1688-96,

81. Kasper E. K., Agema W.R., Hutchins G.M., Deckers J.W., Hare J.M., Baughman K.L. (1994) The causes of dilated cardiomyopathy: a clinicopathologic review of 673 consecutive patients II J. Am. Coll. Cardiol., v. 23, № 3: 586-590.

82. Kawaguchi N., Fujitani N., Schaper J., Onishi S. (1995) Pathological changes of myocardial cytoskeleton in cardiomyopathic hamster IIMol.CellBiochem. 144:75-79.

83. Kellermayer M.S., Smith S.B., Granzier H.L., Bustamante C. (1997) Folding-unfolding transitions in single titin molecules characterized with laser tweezers // Science 276: 1113-1116.

84. Kimura S., Maruyama K., Huang Y.P. (1984) Interactions of Muscle P-Connectin with Myosin, Actin, and Actomyosin at Low Ionic Strengths // Biochem. J. 96: 499-506.

85. КпбИ R., Hoshijima M., Hoffman H.M., Person V. et al. (2002) The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy // Cell v. Ill: 943-955.

86. Kolmerer В., Olivieri N., Witt C.C., Herrmann B.G., Labeit S. (1996) Genomic organization of the M-line titin and its tissue-specific expression in two distinct isoforms // J. Mol. Biol. 256:556-63.

87. Konhilas J.P., Irving T.C., de Tombe P.P. (2002) Myofilament calcium sensitivity in skinned rat cardiac trabeculae: role of interfilament spacing // Circ.Res. 90:59-65.

88. Kulke M„ Fujita-Becker S., Rostkova E., Neagoe C., Labeit D., et al. (2001). Interaction between PEVK-titin and actin filaments: origin of a viscous force component in cardiac myofibrils // Circ. Res. 89:874-81.

89. Labeit S., Gautel M., Lakey A., Trinick J. (1992) Towards a molecular understanding . of titin // EMBO J. 11:1711-16.

90. Labeit S. & Kolmerer B. (1995a) The complete primary structure of human nebulin and its correlation to muscle structure II J. Mol. Biol. 248:308-15.

91. Labeit S. & Kolmerer B. (19956) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science 270:293-96.

92. Labeit S., Kolmerer В., Linke W.A. (1997) The giant protein titin. Emerging roles in physiology and pathophysiology // Circ. Res. 80: 290-4.

93. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 //Nature v. 227, № 5259: 680-685.

94. Li D., Tapscoft Т., Gonzalez O., Burch P.E., Quinones M.A. Zoghbi W.A. et al. (1999) Desmin mutation responsible for idiopathic dilated Cardiomyopathy // Circulation 100: 461-464.

95. Li H., Oberhauser A.F., Redick S.D., Carrion-Vazquez M., Erickson H.P., Fernandez J.M. (2001) Multiple conformations of PEVK proteins detected by single-molecule techniques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10682-86.

96. Li H., Linke W.A., Oberhauser A.F., Carrion-Vazquez M. et al. (2002) Reverse engineering of the giant muscle protein titin // Nature 418: 998-1002.

97. Linke W.A., Ivemeyer M., Labeit S., Hinssen H., Ruegg J.C., Gautel M. (1997) Actin-titin interaction in cardiac myofibrils: probing a physiological role // Biophys. J. 73: 905-919.

98. LinkeW.A., Rudy D.E., Centner Т., Gautel M.,Witt C. et al. (1999) I-band titin in cardiac muscle is a three-element molecular spring and is critical for maintaining thin filament structure И J. Cell Biol. 146:631-44.

99. LinkeW.A. (2000) Stretching molecular springs: elasticity of titin filaments in vertebrate striated muscle// Histol. Histopathol. 15:799-811.

100. Linke W.A. & Fernandez J.M. (2002) Cardiac titin: molecular basis of elasticity and cellular contribution to elastic and viscous stiffness components in myocardium // J.

101. Muscle Res. Cell Motil. 23: 483-497.

102. Lompre A.M., Nadal-Ginard В., Mahdavi V. (1984) Expression of the cardiac ventricular a- and J3- myosin heavy chain genes is developmentally and hormonally regulated // J. Biol. Chem. 260: 6437-6446.

103. Maeda M., Holder E., Lowes В., Valent S., Bies R.D. (1997). Dilated cardiomyopathy associated with deficiency of the cytoskeletal protein metavinculin // Circulation 95:17-20.

104. Maisch B. (1996) Ventricular remodeling// Cardiology 87, Suppl. 1:2-10.

105. Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., et al. (1977) Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. 82:317-37.

106. Maruyama K., Kimura S., Yoshidomi H., Sawada H., Kikuchi M. (1984) Molecular size and shape of (3-connectin, an elastic protein of striated muscle // J. Biochem. (Tokyo) 95: 1423-1493.

107. Maruyama K., Hu D.H., Suzuki T. and Kimura S. (1987) Binding of Actin Filaments to Connectin // J. Biochem. 101: 1339-1346.

108. Maruyama К. (1994) Connectin, an elastic protein of striated muscle // Biophys. Chem. 50:73-85.

109. Mayans O., van der Ven P.F.M., Wilm M., Mues A., Young P., et al. (1998) Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillogenesis // Nature395:863-69.

110. Mayans O., Wuerges J., Canela S., Gautel M., Wilmanns M. (2001) Structural evidence for a possible role of reversible disulphide bridge formation in the elasticity of the muscle protein titin // Structure (Camb) 4; 9(4): 331-40.

111. McDonald K.S. & Moss R.L. (1995) Osmotic compression of single cardiac myocytes eliminates the reduction in Ca+2 sensitivity at short sarcomere length HCirc. Res. 77: 199-205.

112. Metzger D.M., Michele D.E., Rust E.M., Borton A.R., Westfall M.V. (2003) Sarcomere thin filament regulatory isoforms: Evidence of a dominant affect of slow skeletal troponin I on cardiac contraction II J. Biol. Chem. 278: 13118-13123.

113. Mollnau H., Munkel В., Schaper J. (1995) Collagen VI in the extracellular matrix of normal and failing human myocardium // Herz 20: 89-94.

114. Morano I., Hadicke K., Grom S., Koch A., Schwinger R.H. et al. (1994) Titin, myosin light chains and C-protein in the developing and failing human heart // J. Moll. Cell Cardiol. 26: 361-368.

115. Moss R.L. 8c FitzsimonsD.P. (2002) Frank-Starling relationship: long on importance, short on mechanism // Circ. Res. 90:11-13.

116. Mues A., van der Ven, P.F.M., Young P., Furst D.O. & Gautel M. (1998) Two immunoglobulin-like domains of the Z-disc portion of titin interact in a conformation-dependent way with telethonin IIFEBS Lett. 428, 111-114.

117. Muhle-Goll С., Pastore A. and Nilges M. (1998) The 3D structure of a type I module from titin: a prototype of intracellular fibronectin type III domains // Structure 6: 1291-1302.

118. Nave R., Furst D.O., Weber K. (1989) Visualization of the polarity of isolated titin molecules: a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain? II J. Cell Biol. 109:2177-87.

119. Neagoe C., Kulke M., del Monte F., Gwathmey J.K., de Tombe P.P. et al. (2002) Titin isoform switch in ischemic human heart disease // Circulation 106: 1333-12341.

120. Nelder J.A., Mead R. (1965) A simplex method for function minimization // Computer J. 7: 308-313.

121. Ohtsuka H., Yajima II., Maruyama K., Kimura S. (1997) The N-terminal Z repeat 5 of connectin/titin binds to the C-terminal region of alpha-actinin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 235:1-3.

122. Olson T.M., KishimotoN.Y., Whitby F.G., Michels V.V. (2001) Mutations that alter the surface charge of alpha-tropomyosin are associated with dilated cardiomyopathy // J. Mol. Cell. Cardiol. 33:723-32.

123. Opitz C.A., Kulke M., Leake M.C., Neagoe C., Hinssen H. et al. (2003) Damped elastic recoil of the titin spring in myofibrils of human myocardium // Proc. Natl Acad. Sci. USA 100: 12688-12693.

124. Pauschinger M., Knopf D., Petschauer S., Doemer A., Poller W. et al. (1999) Dilated Cardiomyopathy Is Associated With Significant Changes in Collagen Type 1Л11 ratio // Circulation 99: 2750-2756.

125. Peckham M., Young P., Gautel M. (1997) Constitutive and variable regions of Zdisk titin/connectin in myofibril formation: a dominant-negative screen // Cell Struct. Funct. 22:95-101.

126. Person V., Kostin S., Suzuki K., Labeit S., Schaper J. (2000) Antisense oligonucleotide experiments elucidate the essential role of titin in sarcomerogenesis in adult rat cardiomyocytes in long-term culture II J. Cell Sci. 113(21):3851-59.

127. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Vikhlyantsev I.M., Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Ziegler C., Beinbrech G. (2003) Comparative electron microscopic study on projectin and titin bindings to F-actin // Insect Biochem. Mol. Biol. 8: 789-93.

128. Reiser P.J., Westfall M.V., Schiaffino S., Solaro R.J. (1994) Tension production and thin-filament protein isoforms in developing rat myocardium // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 267: H1589-1596.

129. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. (1994) The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis// Cell Motil. Cytoskeleton 28(1): 1-24.

130. Rief M., Gautel M., Oesterhelt F., Femandes J.M., Graub H.E. (1997) Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domans by AFM // Science 276: 1109-1112.

131. Saggin L., Gorza L., Ausoni S., Schiaffino S. (1989) Troponin I switching in the developing heart II J. Biol. Chem. 264: 16299-16302.

132. Salviati G., Betto R., Ceoldo S., Pierobon-Bormioli S. (1990) Morphological and functional characterization of the endosarcomeric elastic filament II Am. J. Physiol. 259 (lPt 1): C144-9.

133. Schaper J., Froede R., Hein S., Buck A., Hashizume H. et al. (1991) Impairment of the myocardial ultrastructure and changes of the cytoskeleton in dilated cardiomyopathy // Circulation 83: 504-514.

134. Schiaffino S. & Reggiani C. (1996) Molecular diversity of myofibrillar proteins: gene regulation and functional significance II Physiological Reviews vol. 76, 2:371-423.

135. Sebestyen M.G., Wolff J.A. & Greaser M.L. (1995) Characterization of a 5.4 kb cDNA fragment from the Z-line region of rabbit cardiac titin reveals phosphorylation sites for praline-directed kinases И J. Cell Sci. 108: 3029-3037.

136. Sommerville L.L., Wang K. (1987) In vivo phosphorylation of titin and nebulin in frog skeletal muscle // Biochem. Biopys. Res. Commun. 147: 986-992.

137. Sorimachi H., Freiburg A., Kolmerer В., Ishiura S., Stier G., et al. (1997) Tissue-specific expression and alpha-actinin binding properties of the Z-disc titin: implications for the nature of vertebrate Z-discs II J. Mol. Biol. 270:688-95.

138. Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made by the giant protein titin II J. Cell Sci. 14:119-23.

139. Strang K.T., Sweitzer N.K., Greaser M.L., Moss R.L. (1994) P-Adrenergic receptor stimulation increases unloaded shortening velocity of skinned single ventricular myocytes from rats // Circulation Research 74, 542-549.

140. Sutko J.L., Publicover N.G., Moss R.L. (2001) Titin An Elastic Link Between Length and Active Force Production in Myocardium // Circulation 104:1585-1587.

141. Swynghedauw B. (1986) Developmental and Functional of Contractile Protein in Cardiac and Skeletal Muscle II Physiological Reviews, v. 66, N°3: 710-771.

142. Tatsumi R. & Ilattori A. (1995) Detection of giant myofibrillar proteins connectin and nebulin by electrophoresis in 2 % polyacrylamide slab gels strengthened with agarose // Anal. Biochem. 224: 28-31.

143. Towbin H., Staehlin Т., Gordon J. (1970) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

144. Towbin J.A. & Bowles N.E. (2002) The failing heart IINature vol.415, 10:227-233.

145. Trinick J.A. (1981) End-filaments: a new structural element of vertebrate skeletal muscle thick filaments//./. Mol. Biol. 151: 309-314.

146. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin II J. Mol. Biol. 180: 331-356.

147. Trombitas K., Greaser M.L., Pollack G.H. (1997). Interaction between titin and thin filaments in intact cardiac muscle II J. Muscle Res. Cell Motil. 18:345-51.

148. Trombitas K., Freiburg A., Centner Т., Labeit S., Granzier H. (1999) Molecular dissection of N2B cardiac titin's extensibility II Biophys. J. 77:3189-96.

149. Trombitas K., Wu Y., Labeit D., Labeit S., Granzier H. (2001) Cardiac titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281: H1793-H1799.

150. Tskhovrebova L. & Trinick J. (1997) Direct visuliation of extensibility in isolated titin molecules// J. Mol. Biol. 265: 100-106.

151. Tskhovrebova L., Trinick J., Sleep J.A., Simmons R.M. (1997) Elasticity and unfolding of single molecules of the giant muscle protein titin // Nature 387: 308-311.

152. Tskhovrebova L. & Trinick J. (2003) Titin: properties and family relationships // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 679-689.

153. Tsubata S. et al. (2000) Mutations in the human 5-sarcoglycan gene in familial and sporadic dilated cardiomyopathy II J. Clin.Invest. 106: 655-662.

154. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle //Proc.Natl Acad. Sci. USA 76, 3698-3702.

155. Wang K. (1984) Cytoskeletal matrix in striated muscle: The role of titin, nebulin and intermediate filaments // Advances in experimental medicine and biology v. 170. Contractile mechanisms in muscle ed. By G. Pollack and H. Sugi; p. 285-305.

156. Wang K. (1985) Sarcomere-Associated Cytoskeletal Lattice in Striated Muscle. Review and Hypothesis I I Cell and Muscle Motility v. 6, 315-369.

157. Wang K., McCarter R., Wright J., Beverly J., Ramirez-Mitchell R. (1991) Regulation . of skeletal muscle stiffness and elasticity by titin isoforms: a test of the segmentalextension model of resting tension /I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7101-7105.

158. Wang X., Li F., Campbell S.E., Gerdes A.M. (1999) Chronic pressure overload cardiac hypertrophy and failure in guinea pigs:II. Cytoskeletal remodeling // J. Mol. Cell Cardiol. 31: 319-331.

159. Wang K., Forbes J.G., Jin A.J. (2001) Single molecule measurements of titin elasticity II Prog. Biophys. Mol. Biol. 77:1-44.

160. Whalen R.G. & Sell S.M. (1980) Myosin from fetal hearts contains the skeletal muscle embryonic light chain II Nature 286: 731-733.

161. Whiting A., Wardale J., Trinick J. (1989) Does titin regulate the length of muscle thick filaments? // J. Mol. Biol. 205:263-68.

162. Wu Y., Bell S.P., LeWinter M.M., Labeit S., Granzier H. (2002a) Titin: an endosarcomeric protein that modulates myocardial stiffnes // J. Cardiac. Failure 8: 276-286.

163. Wu Y., Bell S.P., Trombitas K., Witt C.C., Labeit S., LeWinter M.M., Granzier H. (20026) Changes in titin isoform expression in pacing-induced cardiac failure give toincreased passive muscle stiffness // Circulation 106: 1384-1389.

164. Xu X., Meiler S.E., Zhong T.P., Mohideen M., Crossley D.A., et al. (2002) Cardiomyopathy in zebrafish due to mutation in an alternatively spliced exon of titin // Nat. Genet. 30:205-209.

165. Yamasaki R., Berri M.,Wu Y., Trombitas K., Mc-Nabb M., et al. (2001) Titin-actin interaction in mouse myocardium: passive tension modulation and its regulation by calcium/SlOOAl IIBiophys. J. 81:2297-313.

166. Yamasaki R., Wu Y., McNabb M., Greaser M., Labeit S., Granzier H. (2002) Protein kinase A phosporylates titin's cardiac-specific N2B domain and reduces passive tension in rat cardiac myocytes // Circulation Research 90 (11): 1181-1188.

167. Yoshioka Т.Н., Higuchi S., Kimura K., Ohashi Y., Umazume Y., Maruyama K. (1986) Effects of mild trypsin treatment on the passive tension generation and connectin splitting in stretched skinned fibers frog skeletal muscle // Biomed. Res. 7:181-186.

168. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin // EMBOJ. 17:1614-24.

169. Young P., Ehler E., Gautel M. (2001) Obscurin, a giant sarcomeric Rho guanine nucleotide exchange factor protein involved in sarcomere assembly // J. Cell Biol. 154:123-36.

Информация о работе

Макаренко, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы