Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина

Марсагишвили, Лия Гивиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина"

На правах рукописи

Марсагншвшш Лпп Гшшевна

ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОИДНЫХ СВОЙСТВ САРКОМЕРНЫХ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА ТАЙТИНА

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□ЗОВ1У16

Пущино - 2007

003061716

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций мышечных белков Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Подлубная Зоя Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Погорелов Александр Григорьевич

Защита состоится " 19 " сентября 2007 г. в 13 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

кандидат биологических наук Накипова Ольга Васильевна

Ведущая организация: Уральский Государственный

университет, (г. Екатеринбург)

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарастающий интерес к проблеме амилоидозов связан с ее многогранностью. Эта проблема не только медико-биологическая, но и экологическая, социальная и экономическая. Амилоидозы - большая группа информационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson, 2001).

Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, Aß-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarro et al., 1998; Chiti et al., 1999; Fandrich et al., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства; ß-складчатую структуру с отдельными ß-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа "а-спираль - ß-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).

К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как к наименее изученным. Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна.

лг

представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (X-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennet et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми АР-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание Р-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.

Цель работы.

Выяснение способности саркомерных белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы и изучешге их амилоидогенных свойств in vitro.

Задачи исследования.

1. Изучить агрегационные свойства саркомерных белков семейства тайтина (тайтин, X-, С- и Н-белки) in vitro.

2. Изучить агрегационные свойства АР(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка.

3. Проверить амилоидную природу агрегатов, образуемых исследуемыми белками, поляризационной, флуоресцентной микроскопией и спектральными методами.

4. Изучить скорость образования амилоидных фибрилл.

5. Изучить действие тетрациклина и фуллерена на амилоиды Х-белка.

6. Изучить влияние амилоидных фибрилл на ферментативные свойства актомиозина.

7. Исследовать клеточную токсичность амилоидных фибрилл Х-белка.

Научная повизна работы. Открыты новые белки-предшественники амилоидов и возможные участники амилоидогенеза in vivo - саркомерные белки семейства тайтина (тайтин, X-, С-, и Н-белки). Показано, что саркомерные белки семейства тайтина скелетных мышц кролика, а также С-белок миокарда человека при ДКМП и С-белок миокарда кролика формируют в условиях, близких к физиологическим (ионная сила, рН, температура), амилоиды, сходные по структуре с амилоидами, найденными в мозге при болезни Альцгеймера и при других амилоидозах. На примере Х-белка была изучена скорость фибриллогенеза in vitro. В отличие от других амилоидогенных белков, наличие 90% р-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo. С помощью электронной микроскопии впервые in vitro продемонстрирован ингибирующий эффект фуллерена Cé0 на фибриллогенез Х-белка и Ар(25-35)-пептида, а также

тетрациклина на фнбриллогенез Х-белка (подобный его действию на амилоиды А(3-пептида и тау-белка при болезни Альцгеймера). Показано прямое влияние амилоидных фибрилл на ферментативные свойства основного сократительного белка миозина. Фибриллы исследуемых белков почти в два раза снижали АТФазу актомиозина, а разрушение амилоидных фибрилл антибиотиками приводило к восстановлению исходного уровня АТФазы актомиозина. Обнаружен токсический эффект амилоидных фибрилл Х-белка на фагоцитирующие клетки крови in vitro и его снижение после разрушения фибрилл тетрациклином.

Научная н практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о способности тайтина и белков его семейства легко формировать амилоидные фибриллы, создавая системы, удобные для изучения амилоидогенеза in vitro. Вследствие показанного сходства подходов к разрушению амилоидов разных белков открываются перспективы для тестирования эффективности лекарственных препаратов на системе амилоидных фибрилл белков семейства тайтина. Это тестирование можно успешно проводить параллельно с оценкой клеточной токсичности самих лекарств и продуктов распада амилоидов для разработки терапевтических подходов к предотвращению или замедлению амилоидозов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на Международных конференциях "Биологическая подвижность " (Пущино, 2004, 2006); 34-ой, 35-ой Европейских мышечных конференциях (Хортобаги, Венгрия, 2005; Гейдельберг, Германия, 2006); 30-ом FEBS конгрессе (Будапешт, Венгрия, 2005); 9-ой, 10-ой Международных Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006); XVII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2005); Ш-ей Всероссийской школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2005); ХП Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2005" (Москва, 2005); 4-ой Российской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005); международной конференции "Стресс и висцеральные системы" (Минск, Беларусь, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); 9-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2006); международной конференции "Медико-биологические аспекты действия физических факторов" (Минск, Беларусь, 2006); XX Съезде Физиологического общества им И.П. Павлова, (Москва, 2007), П1 Международном и Междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психология", (Судак, Крым, Украина, 2007), ХШ Международной конференции «Фуллерены и атомные кластеры» (Санкт-Петербург, 2007), на заседании секции Ученого совета ИТЭБ РАН "Биологическая подвижность" от 18 мая 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 24 печатные работы, в том числе 4 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 101 странице, иллюстрирована 28 рисунками и 5 таблицами. Список цитируемой литературы включает 219 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный и клинический материал. Экспериментальный материал: скелетные мышцы и миокард кролика. Клинический материал: образцы миокарда пациента при ДКМП, взятые при проведении операции по пересадке сердца. Образцы миокарда человека были предоставлены ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава (г. Москва).

Выделение и очистка белковых препаратов. Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993). Х-белок, С-белок и Н-белок получали по методу (Star & Offer, 1982). Для изучения влияния тайтина и белков его семейства в молекулярной и фибриллярной форме на структурные и функциональные свойства миозиновых нитей использовали миозин из скелетных мышц кролика, полученный по методу (Offer et al., 1973). Актин из скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка, приготовленного согласно (Feuer et al., 1948) по методу, описанному в работе (Pardee & Spudich, 1982). Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помощью спектрофотометра SPECOD UV VIS, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Егш1 мг/мл): 0.543 для доколоночного миозина (Kielley & Harrington, I960); 0.52 для колоночного миозина (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актина (Rees & Young, 1967); 1.37 для тайтина (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка (Starr & Offer, 1982). Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970). Чистоту тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза по методу (Fritz et al., 1989).

Условия формирования амилоидных агрегатов. Амилоиды формировали диализом растворов белков в течение 20 часов при 4-37°С против растворов, содержащих: 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, рН 7.0; 50 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, рН 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0. Для исследования скорости амилоидообразования раствор Х-белка диализовали против буфера, содержащего 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для электронно-

микроскопических и спектральных исследований. Дтя экспериментов по исследованию цитотокснчности амилоидных образований Х-белок также инкубировали в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4°С.

Электронная микроскопия. Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрацией 0.1 мг/мл. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой (2 % коллодий в амилацетате фирмы SPI-СНЕМ, USA), укрепленной углеродом. После удаления избытка суспензии полоской фильтровальной бумаги образцы окрашивали 2% водным раствором уранилацетата. Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении ЗООООх. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.

Поляризационная и флуоресцентная микроскопия. Исследуемые образцы наносились на предметные стекла и высушивались на воздухе. Образовавшиеся белковые пленки окрашивались 1% водным раствором Конго красного (фирма SIGMA, USA) и затем исследовались на поляризационном микроскопе МКУ-1. Образцы также окрашивались 1% водным раствором тиофлавина Т (фирма SIGMA, USA) и исследовались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ.

Метод кругового дихроизма. Исследование вторичной структуры белка проводили методом кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма исследуемых белков, до и после образования ими фибрилл, регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-600, используя кварцевые кюветы с оптической длиной 0.1 см. Спектры КД измерены в области 200-250 нм. Обсчет спектров КД в далекой ультрафиолетовой области производился с использованием программы CONTINLL (http:Mamar.coIostate.edu/~sreeram/CDPro/).

Метод флуоресцентного анализа. Исследование амилоидной природы фибрилл, а также исследование скорости амилоидообразования было проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур тиофлавина Т (ТТ). Измерения флуоресценции проводили в растворе красителя (250 мкл) и суспензии фибрилл (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Интенсивность флуоресценции раствора регистрировали с помощью спекггрофлуориметра PERKIN-ELMER -44В при длине волны 488 нм и длине волны возбуждения 420 нм. Ширина щели при возбуждении - 5 нм, а при регистрации - 10 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в буфере в присутствии белка вычитали значения интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в отсутствие белка, получая интенсивность флуоресценции ТТ, связанного с белком.

Спектро фотометрический метод. Для подтверждения амилоидной природы фибрилл был также использован специфический краситель Конго красный (КК). Суспензию фибрилл (250 мкл) добавляли к раствору КК (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Спектры поглощения КК в отсутствие и в присутствии белка регистрировали при 450-650 нм с помощью спектрофотометра 8РЕС01Ш М 40.

Измерение АТФазной активности актомиозшш. АТФазная активность реконструированного актомнозина кролика в присутствии и в отсутствие тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка и их амилоидных фибрилл скелетных мышц кролика измерялась по выходу неорганического фосфата с использованием колориметрического метода (Ьапгейа е1 а1., 1979). Для измерений использовали актин и миозин из скелетных мышц кролика. Соотношение миозина к тайтину по весу составляло 4:1, соотношение миозина к Х-белку, С-белку и Н-белку по весу равнялось 6:1. Реакционная смесь содержала 0.05 мг/мл миозина, 0.05 мг/мл актина, 2 мМ АТФ, 0.12 М КС1,2 мМ М§С12, Ю мМ имидазола, рН 7.0. Реакцию проводили при температуре 25°С. По истечении заданного времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 0.2 мл и добавляли в 1.6 мл красящего реагента, содержащего 1 М НС1, 1.05% молибдата аммония, 0.034% малахитового зеленого, 2% Б1егох. Смесь тщательно перемешивалась. Через минуту для предотвращения дальнейшего развития окраски к смеси добавляли 0.2 мл 34%-ого цитрата натрия. Интенсивность окраски измерялась спектрофотометрическим методом (Х=660 нм). Предварительно строилась калибровочная кривая для растворов с фиксированным содержанием неорганического фосфата.

Исследование клеточной токсичности амилоидных фибрилл Х-белка. Цитотоксичность была исследована на культуре клеток полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ). Выделение ПМЯЛ из циркулирующей крови крыс Wisíar с трансплантированной в брюшную полость асцитной гепатомой Зайделя, было проведено по методу (Е§§1еЮп et а1., 1989; Поцелуева и др., 1995) с предварительным гемолизом эритроцитов хлористым аммонием (0.87%) и последующим дифференциальным центрифугированием. ПМЯЛ промывали 3 раза в среде, содержащей 0.15 М №С1, 5 мМ НЕРЕБ, 5 мМ глюкозу, 1 мМ СаС12, 1 мМ М§С12 (рН 7.4-7.6), и были суспендированы в среде ЯРМ1-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки. Цитотоксичность образцов была оценена по проценту выживших клеток ПМЯЛ (Аскегшапп й а1., 1989) в присутствии белка по отношению к контролю. В лунки 96-луночного планшета помещалось по 200 мкл среды 11РМ1-1640 с добавлением 20 мМ НЕРЕБ, 50 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной сыворотки и 10 мкл суспензии выделенных клеток (~20 тыс.кл/мкл). Среда также содержала определенную концентрацию (0.001-0.1 мг/мл) исследуемого образца. Клетки инкубировали при температуре 37°С, в атмосфере 5% С02. Через определенные промежутки времени отбирались пробы и проводился подсчет живых клеток. Выживаемость была оценена по окрашиванию витальным красителем трипановым синим,

подсчет проводился в счетной камере Горяева. Выживаемость клеток оценивалась по формуле:

Выживаемость (%) = К2 * 100/K¡, где К] - количество клеток в контроле, K¡ - количество клеток в присутствии исследуемых образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика. Изучение амилоидогенеза разных белков in vitro проводят в условиях, которые часто не совместимы с условиями in vivo. Для образования амилоидных фибрилл белками семейства тайтина мы использовали условия, близкие к физиологическим. С помощью электронной микроскопии было показано, что исследуемые белки способны формировать разные амилоидные агрегаты, как и другие известные амилоидогенные белки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O'Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink, 2004). Мы показали (см. также Bennett et al., 1985), что в растворе, содержащем 30 мМ КС1,10 мМ имидазола, рН 7.0 Х-белок образует спирально скрученные ленточные фибриллы с осевой периодичностью ~60-70 нм, шириной -40 нм и длиной более 1 мкм (рис. 1 В). Мы обнаружили, что такие же структуры Х-белок образует и в растворе, содержащем 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5. Кроме этого Х-белок, а также С-белок и Н-белок образуют аморфные агрегаты, протофибриллы, линейные фибриллы и пучки линейных фибрилл в растворах: 50 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, рН 7.0; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, рН 7.0; 50 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5 (рис. 2 А, Г, Д). Тайтин скелетных мышц кролика в растворе 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5 формирует плотные пучки линейных фибрилл длиной -3 мкм, шириной до 500 нм и аморфные агрегаты. Мы наблюдали, что аморфные агрегаты, протофибриллы длиной 100-200 нм и диаметром ~3 нм, линейные фибриллы диаметром ~7 нм и пучки линейных фибрилл длиной более 3 мкм и шириной до 500 нм могут присутствовать в одном и том же образце. Это, по-видимому, отражает разные стадии фибриллогенеза, характерные для формирования амилоидов (Kelly, 1998; Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000).

Для подтверждения амилоидной природы фибрилл тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка наши дальнейшие исследования были направлены на сравнение агрегатов, образуемых белками семейства тайтина, с агрегатами известных амилоидогенных белков и, в частности, Ар-пептида, играющего важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера.

Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств Ар(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка. Для сравнения спирально скрученных фибрилл Х-белка с другими амилоидными фибриллами мы изучили агрегационные свойства Ар(25-35)-пептида. Мы показали, что Ар(25-35)-пептид, инкубированный в течение 24 ч при 37°С образует подобно Х-белку (рис. 1 В) спирально скрученные липы нескольких микрон длиной и

диаметром 25-27 нм с вариабельным осевым периодом 170-250 нм (рис. 1 А, Б). Ленты построены из нескольких длинных и узких фибрилл диаметром 3-5 нм. На микрофотографиях они лучше видны, если смотреть вдоль ленты. Обнаруживаются также листовые агрегаты, сформированные за счет боковой агрегации более коротких узких фибрилл. Такие агрегаты достигают в ширину ~50 нм. Таким образом, с помощью электронной микроскопии нами было установлено морфологическое сходство фибрилл Х-белка с амилоидами Aß-пептада, найденными в мозге при болезни Альцгеймера.

Подтверждение амилоидной природы агрегатов, образуемых белками семейства тайтина (тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка) при их взаимодействии со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т. Основным методом выявления амилоидной природы фибрилл, образуемых разными белками, является их способность взаимодействовать со специфическими красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; LeVine, 1993, 1995; Krebs et al., 2005). Именно эти красители используют в клинической практике для определения амилоидных отложений in vivo и для исследования амилоидогенеза in vitro разными белками. При окрашивании Конго красным фибриллярных структур, формируемых исследуемыми белками, мы наблюдали двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, а при окрашивании их тиофлавином Т - желто-зеленую флуоресценцию в люминесцентном микроскопе. При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии фибрилл X-, Н- и С-белков и тайтина возрастала в ~10, ~9, ~7 и ~5 раз соответственно по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этих белков в молекулярной форме (рис. 3). Незначительное увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т наблюдается и в присутствии молекулярных форм тайтина, X-, С- и Н-белков, что согласуется с литературными данными для белков, содержащих ß-складчатую структуру (LeVine, 1993; 1995). При измерении спектральных характеристик раствора Конго красного в присутствии фибрилл тайтина, X-, С- и Н-белков наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от -490 нм к -500 нм (рис. 4), что также является характерной чертой при связывании амилоидных фибрилл с Конго красным (Klunk et al., 1989). Проведенные исследования указывают на специфичность связывания красителей с фибриллярными агрегатами, образуемыми белками семейства тайтина, подтверждая их амилоидную природу.

Изучение вторичной структуры тайтина и белков его семейства до и после образования амилоидных фибрилл. В работах по изучению образования амилоидных фибрилл белками in vitro часто используются условия, несовместимые с условиями in vivo (денатурирующие вещества, низкие значения pH, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.) (Stine et al., 2003). Как известно, эти условия приводят к трансформации структуры молекулы белка с образованием ß-складчатости, характерной для амилоидных фибрилл. (Juzczyk

et al., 2005). Согласно литературным данным (Labeit & Kolmerer, 1995; Weber et al., 1993; Vaughan et al., 1993), молекулы белков семейства тайтина уже содержат р-складчатую структуру. Нами были проведены исследования вторичной структуры белков до и после образования ими амилоидных фибрилл. Показано, что молекулярные и фибриллярные формы Х-, С- и Н-белков характеризуются сходными спектрами кругового дихроизма (КД). Это свидетельствует о том, что вторичная структура Х-, С- и Н-белков при образовании ими амилоидных фибрилл не претерпевает изменений. Форма спектров фибрилл свидетельствует в пользу того, что в их составе практически отсутствуют а-спиральные участки, а преобладающими элементами являются Р-складки. Молекулярная форма тайтина содержит ~10% а-спирали. После образования амилоидных фибрилл молекула тайтина содержит только р-структуру. Понятно, что при наличии у этих белков р-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидных фибрилл, облегчается процесс формирования ими амилоидов in vitro и создается опасность их быстрого роста в клетке.

Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка. Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью (Kim et al., 2002; Stine et al., 2003; Hwang et al., 2004). Скорость фибриллообразования может зависеть от многих факторов: состава растворов, температуры, рН и др. Наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий процент а-спирали, то требуется трансформация типа "а-спираль - р-складчатостъ". Так как белки семейства тайтина уже содержат р-складчатую структуру, то нет необходимости в изменении вторичной структуры. Скорость образования амилоидных структур белками семейства тайтина была продемонстрирована на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные структуры и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно скорость образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем тиофлавином Т, который широко используется в качестве маркера амилоидов (LeVine, 1993). В образцах белка происходило накопление iix амилоидных структур, о чем свидетельствует возрастание флуоресцентного сигнала тиофлавина Т. Не происходит значительного увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с X-белком в первые часы инкубации (1-4 часа), так как, согласно данным электронной микроскопии, фибриллы еще не сформированы, а присутствуют аморфные агрегаты (график 1). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастала, что соответствовало образованию амилоидных фибрилл, среди которых наблюдаются и аморфные агрегаты (график 1). После 22 часов диализа интенсивность флуоресценции красителя при связывании с фибриллами достигала плато флуоресцентной кривой, что согласуется с данными электронной микроскопии: отмечается присутствие уже хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (график 1). Они наблюдаются и после 26 часов диализа. Для многих

амилоидогенных белков также характерна временная зависимость образования амилоидных фибрилл. Например, мышечная ацилфосфатаза способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации в присутствии трифлуороэтанола при рН 5.5 и температуре 25°С, и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999). Ар(1-40)-пептвд при рН 7.2, температуре 37°С в присутствии 0.1% уксусной кислоты после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты и только после 48 часов - длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003). Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "а-спираль - (3-складчатость", что, как правило, требует жестких условий, несовместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Согласно результатам нашего исследования, образование амилоидных фибрилл Х-белком происходит в мягких условиях (рН 7.0, температура 4-37°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае мышечной ацилфосфатазы человека и АР(1-40)-пептида. Следует также отметать, что в отличие от других белков, наличие 90% р-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo.

i О 5 10 15 20 25 30 35

время, час

График 1. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка.

Рис. I. А, Ь — спирально скрученные ленточные фибриллы АР(25-35)-пешида, инкубированного в течение 24 часов при 37°С; В — спирально скрученные ленточные фибриллы X-белка скелетных мышц кролика, сформированные в растворе, содержащем 30 л(М КО, ]0 мМ имидазола, рИ 7.0 и его фрагментов (Г) после действия тетрациклина {весовое соотношение белка и тетрациклина 1:1); Д - фибриллы Х-белка в присутствии фуллерена {весовое соотношение белка и фуллерена 2:1). Негативное окрашивание 2% раствором уран ила цетата. Шкала 100 нм.

ЗДКжЬ

ШШ

Ж А

Рис. 2. А — пучки фибрилл С-белка скелетных мышц кролика, сформированные в растворе, содержащем 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5; Б - пучки фибрилл С-белка миокарда кролика, сформированные в растворе, содержащем 0.01 М К-фосфат, рН 7.0; В - пучки фибрилл С-белка миокарда человека с ДКМП, сформированные в растворе, содержащем 0.03 М СаСЬ, 10 мМ имидазола, рН 7.0; Г — пучки линейных фибрилл Н-белка скелетных мышц кролика (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5); Д — аморфные агрегаты Н-белка скелетных мышц кролика (25 мМ №С1, 10 мМ Иерея, рН 7.0). Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм (А-Г) и 200 нм (Д).

СО 00 -ч-

-е-

а я В к

Ё. о >.

о г а

ж ь

п№тГ" ■ ¡ЖЯр?^

ТТ+Хмол ТТ+Хфибр

- * I |

.«¡ШИИ^ВмЛвиВШ'''

ТТ+Смол ГТ+Сфибр

ТТ+Нмол ТТ-Нфцбр

ГГ+Тмол ТТ+Тфибр

Рис. 3. Интенсивность флуоресценции шофлавина Т (Т"Г): А - в присутствии молекулярного Х-белка (в растворе, содержащем 0.3 М КС1, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл Х-белка (0.15 М глиции-КОН, рН 7.5); Б - в присутствии молекулярного С-белка (0.3 М КО, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл С-белка (0.15 М глицнн-КОН, рН 7.5); В - в присутствии молекулярного 1-1-белка (0.3 М КО, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл Н-белка (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5); Г - в присутствии молекулярного тайтина (0.6 М КС1, 30 мМ КН2РО„, рН 7,0) и в присутствии фибрилл тайтина (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5). Молярное соотношение красителя и белка 1:2.

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры поглощения свободного красителя показаны линиями красного цвета. Спектры поглощения красителя Конго красного (линия синего цвета): А - в присутствии фибрилл Х-белка (в растворе, содержащем 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5); Б - в присутствии фибрилл С-белка (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5); В - в присутствии фибрилл Н-белка (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5); Г - в присутствии фибрилл тайтина (0.15 М глицин-КОН, рН 7.5). Молярное соотношение красителя и белка 1:2.

Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека с ДКМП н С-белком миокарда кролика. Амилоидные депозиты нередко обнаруживаются в сердце и кровеносных сосудах при кардиомиопатиях и миокардитах. Особо следует отметить амилоидоз сердца (кардиопатический амилондоз), который, как утверждают медицинские специалисты (Сторожаков и др., 2000), к сожалению, не включается в схему дифференциального диагноза даже при резистентной к лечению сердечной недостаточности и диагностируется посмертно. Учитывая все перечисленное выше, мы решили проверить, может ли С-белок, выделенный из сердца пациента с дилатационной кардиомиопатней, образовывать амилоидные фибриллы. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - заболевание миокарда неизвестной этиологии, диагностирующееся по расширению (дилатации) левого, правого или обоих желудочков. Нарушается систолическая функция желудочков, возможно развитие застойной сердечной недостаточности, часто наблюдается нарушение ритма желудочков и предсердий. В ходе развития ДКМП сердце постепенно, но необратимо, теряет свою функциональную активность (Шумаков и др., 2003). Наши исследования показали, «гго в разных растворах (30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.01 М К-фосфата, рН 7.0; 30 мМ СаС12, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl2,10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0) С-белок миокарда человека образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной до 3 мкм и шириной до 500 нм (рис. 2 В). С-белок миокарда кролика в тех же условиях образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной более 2 мкм и шириной до 500 нм (рис. 2 Б). Амилоидная природа фибрилл С-белка миокарда человека и кролика была подтверждена поляризационной и флуоресцентной микроскопией, а также спектральными методами при взаимодействии их с Конго красным и тиофлавином Т. Таким образом, с помощью разных специфических тестов мы показали, что белки семейства тайтина способны формировать амилоиды in vitro. Дальнейшие наши исследования были направлены на тестирование токсических свойств амилоидов этих белков, на поиск подходов к их разрушению и предотвращению их образования.

Разрушающее действие тетрациклина н фуллерена С^ на амилоидные фибриллы Х-белка и АР(25-35)-пептида. Для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых белками семейства тайтина, нами бьшо проведено in vitro тестирование эффекта тетрациклина и фуллерена на структуру их фибриллярных агрегатов. Мы показали, что антибиотик тетрациклин разрушает фибриллы, формируемые белками семейства тайтина. На электронно-микроскопических снимках видны фрагменты фибрилл Х-белка после действия тетрациклина, длиной ~30-60 нм (рис. 1 Г) и отдельные молекулы Х-белка. Действие тетрациклина на фибриллы Х-белка подобно его действию на амилоиды Ар-пептида и тау-белка при болезни Альцгеймера, на депозиты хантгшгшна при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы прионного белка (Forloni et al., 2001).

В последнее время фуллерены рассматривают как лекарственные препараты (Пиотровский и др., 2006), в том числе и при лечении нейродегенеративных болезней (Lee et all., 2006). Невизуальным методом показано ингибирующее влияние фуллерена на фибриллогенез А(5(11-25)-пептида и АР(1-40)-пептида in vitro (Kim & Lee, 2003). Методом электронной микроскопии in vitro мы впервые продемонстрировали антиамилоидогенную способность фуллерена С60 по отношению к фибриллам Ар(25-35)-пептида и X-белка. Добавление фуллерена С60 к спирально скрученным лентам Х-бежа в весовом соотношении 1:2 приводило к их декорации сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент. Сформированные фибриллы X-белка имеют осевую периодичность ~60-70 нм и ширину -40 нм, а при связывании с фуллереном ширина уменьшается до 10 нм (рис. 1 Д). Более того, в присутствии фуллерена C« Х-белок в молекулярной форме не формировал амилоидных фибрилл. Мы также обнаружили, что добавление фуллерена С^ к амилоидам АР(25-35)-пептида в молярном отношении 1:6 и инкубация их в течение 24 часов при 37°С приводит к декорации лент сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению их длины и количества по сравнению с контролем. Короткие узкие (~5 нм в диаметре) протофибриллы Ар(25-35)-пептида также появляются в таких образцах. В этом случае не наблюдается свободных агрегатов фуллерена, они все связаны с короткими лентами и протофибриллами. Увеличение количества фуллерена, добавленного к амилоидам Ар(25-35)-пептида (молярное отношение 15:6), приводит к увеличению количества протофибрилл АР(25-35)-пептида, декорированных сферическими частицами фуллерена С60. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению разных амилоидов в связи с их общими физико-химическими свойствами. Эти подходы могут быть разработаны с использованием саркомерных цитоскелетных белков семейства тайтина.

Недавно полученные данные показали, что введение в мозг крысам фуллерена Сво положительно влияет на когнитивные процессы в норме (Podolsky et al., 2006). Этот результат свидетельствует об отсутствии нейротоксичности фуллерена Сво- Более того, имеется соответствие между антиамилоидогенным действием фуллерена С60 in vitro и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное Ар(25-35)-пептидом. Эти данные позволяют рассматривать фуллерены С6о как потенциальные лекарства при лечении амилоидозов.

Таким образом, с помощью электронной микроскопии мы впервые in vitro продемонстрировали ингибирующий эффект фуллерена Сбо на амилоидогенез Х-белка и Ар(25-35)-пегггида, а также тетрациклина на амилоидогенез Х-белка. Такие вещества, не только разрушающие зрелые амилоидные фибриллы Х-белка и АР(25-35)-пептида, но и предотвращающие образование новых, более ценны в терапии амилоидозов. Следует также отметить, что антиамилоидогенная активность фуллеренов, наноразмерных частиц (диаметр фуллерена Сво -0.71 нм), открывает перспективы для

разработки новой медицинской нанотехнологии в терапии амилоидозов, и в частности, болезни Альцгеймера.

Влияние белков семейства тайтина в молекулярной форме и их амилоидных фибрилл на АТФазиую активность акгомиозина in vitro. До сих пор остается открытым вопрос о причинах, вызывающих гибель клеток амилоидами, поскольку нет строгих доказательств того, чем обусловлена цитотоксичность различных белков - механическим повреждением клеток в результате накопления амилоидных отложений или специфическими молекулярными механизмами. В случае образования амилоидных фибрилл белками семейства тайтина в мышечной клетке их накопление будет сказываться на сократительной способности мышцы. Для выполнения механической работы мышцей используется энергия, освобождающаяся при гидролитическом расщеплении АТФ в активных центрах миозина. Поэтому АТФазная активность миозина является главной его функциональной характеристикой. Тестирование влияния исследуемых белков в молекулярной форме и их амилоидных фибрилл на АТФазную активность акгомиозина in vitro показало, что фибриллы почти в два раза снижают АТФазу акгомиозина (таблица 1), что указывает на возможность их прямого негативного эффекта на сократительную функцию мышц.

Таблица 1. Влияние белков семейства тайтина в молекулярной форме и их амилоидных фибрилл на АТФазную активность акгомиозина in vitro.

Белок Активность актин-активируемой АТФазы миозина (%)

В отсутствие белка В присутствии белка В присутствии амилоидных фибрилл белка После разрушения амилоидных фибрилл белка тетрациклином

тайтин 100 12б±4.5 84±4.0 107±3.9

Х-белок 100 85±3.0 49±2.7 82±2.9

С-белок 100 106±4.2 81±4.0 102±3.8

Н-белок 100 90±3.0 59±3.5 87±3.0

Важно, что разрушение амилоидных фибрилл антибиотиком сопровождалось восстановлением АТФазы акгомиозина почти до исходного уровня. Следует еще раз отметить, что в случае тетрациклина мы имеем дело с лекарством, не только разрушающим зрелые амилоидные фибриллы, но и ингибирующим их образоваш!е (см. также Рог1ош сЧ а1., 2001).

Исследование клеточной токсичности амилоидных фибрилл Х-белка.

Токсичность амилоидных фибрилл белков семейства тайтина была показана на примере Х-белка. В связи с тем, что амилоидные отложения были найдены в сердце и кровеносных сосудах, клеточная токсичность амилоидных фибрилл X-белка была исследована на культуре клеток полиморфноядерных лейкоцитов. Как известно, полиморфноядерные лейкоциты являются активными фагоцитирующими клетками, представляющими собой наибольшую популяцию клеток периферической крови. Исследование цитотоксичности амилоидных фибрилл Х-белка показало, что выживаемость клеток в их присутствии начинает заметно снижаться уже после 8 часов инкубации и составляет ~70% и ~40% при концентрации фибрилл в инкубационной среде 0.01 мг/мл и 0.1 мг/мл, соответственно (график 2).

120

100 80 60 40 20

4 8 12

время, час

График 2. Изменение количества клеток крови (ПМЯЛ) в зависимости от времени инкубации и концентрации амилоидных фибрилл Х-белка (кружки -0.001 мг/мл; треугольники - 0.01 мг/мл; ромбы — 0.05 мг/мл; квадраты - 0.1 мг/мл, звездочки — контроль).

Выживаемость ПМЯЛ снижается дальше и после 16 часов составляет ~50% и ~20% при 0.01 мг/мл и 0.1 мг/мл, соответственно. Таким образом, показана концентрационная и временная зависимость выживаемости ПМЯЛ в присутствии амилоидных фибрилл Х-белка: чем больше концентрация фибрилл Х-белка, тем меньше выживаемость клеток. Х-белок, добавленный в молекулярной форме на ранних стадиях инкубации, не проявлял токсического действия, но после 6 часов инкубации выживаемость клеток начинала снижаться и после 10 часов она составляла -60% (график 3). Проявление X-белком токсического действия после 5 часов инкубации связано с тем, что он со временем формировал в этой среде амилоидные структуры. Этот факт

подтверждает предположение, что наличие р-складчатой структуры у Х-белка способствует его достаточно быстрой агрегации в фибриллы. Исследование цитотоксичности показало, что разрушение фибрилл тетрациклином приводит к увеличению выживаемости ПМЯЛ до -90-95% после 18 часов инкубации (график 3). Это свидетельствует о том, что тетрациклин не только разрушает зрелые фибриллы, но и препятствует образованию новых фибрилл, подобно его действию на другие амилоиды. При обработке клеток антибиотиком тетрациклином его токсическое действие по отношению к ПМЯЛ не наблюдалось.

120 -

о ^

О 100 -

{5 80 -о

ё 60 о

§ 40 га

£3

| 20-а

О 2 4 6 10 14 18

время, час

График 3. Изменение количества клеток крови (ПМЯЛ) в зависимости от времени инкубации в присутствии: ромбы — Х-белка в молекулярной форме (0.3 М КС1, 10 мМ К-фосфата, рН 7.0); квадраты -фибрилл Х-белка (30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0); треугольники - фибрилл Х-белка после действия тетрациклина; кружки - контроль.

Наши результаты показывают возможность использования метода определения цитотоксичности не только для демонстрации токсичности амилоидов и продуктов их распада, но и для оценки эффективности лекарственных препаратов, способных предотвращать разные амилоидозы или замедляггь их развитие. Такое тестирование можно успешно проводить на амилоидных системах цитоскелетных белков.

выводы

1. Показано, что белки семейства тайтина (тайтин, X-, С- и Н-белки) скелетных мышц кролика способны формировать амилоидные фибриллы in vitro. Их амилоидная природа подтверждена стандартными тестами на амилоиды (связывание с красителями тиофлавином Т и Конго красным).

2. С помощью электронной микроскопии показано морфологическое сходство сформированных in vitro амилоидных фибрилл С-белка миокарда кролика и С-белка миокарда человека, а также фибрилл Х-белка скелетных мышц кролика и Ар(25-35)-пептида.

3. Показан полиморфизм амилоидных структур, формируемых in vitro белками семейства тайтина, характерный для известных амилоидогенных белков, участвующих в патогенезе амилоидозов.

4. С помощью электронной микроскопии продемонстрировано антиамилоидогенное действие фуллерена С60 и тетрациклина на фибриллы Х-белка, а также антиамилоидогенное действие фуллерена С6о на фибриллы Ар(25-35)-пептида.

5. Показано ингибирующее влияние амилоидных фибрилл белков семейства тайтина на ферментативные свойства актомиозина как указание на возможность их прямого негативного эффекта на сократительную функцию мышц.

6. Обнаружен токсический эффект амилоидных фибрилл Х-белка на фагоцитирующие клетки крови in vitro и его снижение после разрушения фибрилл тетрациклином.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Marsagishvili L.G., Vikhlyantsev I.M., Alekseeva Y.A., Selezneva I.I., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Amyloid properties of the fibrils of X-protein from skeletal muscles of hibernating ground squirrels // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility", Pushchino, Russia, 2004, p. 227-228.

2. Марсагишвшга Л.Г., Вихлянцев И.М., Емельяненко В.И., Подлубная З.А. Спектральное тестирование амилоидной природы фибрилл, образуемых X-, С-, Н-белками скелетных мышц // Тезисы докл. 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), с. 155.

3. Марсагишвили Л.Г., Вихлянцев ИМ., Шпагина М.Д., Емельяненко В.И., Подлубная З.А. Новый тип белков-предшественников амилоидов и возможных участников амилоидогенеза в сердце, сосудах и мышцах // Тезисы докл. XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", (Москва, 7-10 февраля 2005 г.), с. 7.

4. Марсагишвили Л .Г., Вихлянцев И.М., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Полиморфизм амилоидных фибрилл X-, С-, Н-белков скелетных мышц //

Тезисы докл. Ш-ей Всероссийской школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 1-4 февраля 2005 г.), с. 21.

5. Марсагишвнли JIJT., Емельяненко В.И., Шпапша М.Д., Подлубная З.А. Новые амилоидогенные белки // Научные труды I Съезда физиологов СНГ (Сочи, 19-23 сентября 2005 г.), т. 1, с. 14.

6. Марсапшшшш Л.Г., Подлубная З.А. Изучение амилоидных агрегатов, образуемых фрагментами тайтана // Тезисы докл. ХП Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2005" (Москва, 12-15 апреля 2005 г.), с. 143-144.

7. Марсагишвнли Л.Г., Подлубная З.А. Стимулирует ли ацидоз и гипоксия образование амилоидных структур в мышцах при гибернации животных // Материалы 4-ой Российской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 12-14 октября 2005 г.), с. 75.

8. Марсагишвнли Л.Г., Шпагина М.Д., Емельяненко В.И., Подлубная З.А. Саркомерные белки семейства тайтина образуют амилоиды // Биофизика, 2005, т. 50, №5, с. 803-809.

9. Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Выяснение роли саркомерных цитоскелетных белков в образовании амилоидов и в патогенезе амилоидозов с целью разработки метода их ранней диагностики // Сб. "Стресс и висцеральные системы" (под редакцией В.А. Кульчицкого, Л. Навратила, К. Месслингера), Минск, Беларусь 2005, "Бизнесофсет", 2005, с. 146-148.

10. Подлубная З.А., Марсагишвили Л .Г., Шпагина М.Д., Емельяненко В.И., Вихлянцев И.М., Малышев С.Л., Ильинский ИМ., Федюшин A.A., Николаев-Пасухин В.Л. Выяснение роли саркомерных цитоскелетных белков в образовании амилоидов и в патогенезе амилоидозов с целью разработки метода их ранней диагностики // Сб.: "Фундаментальные науки -медицине", (под ред. О.Г. Газенко, М.В. Угрюмова), Москва, "Слово", 2005, с. 23-25.

11.Marsagishvili L.G., Podlubnaya Z.A. Amyloidogenic properties of X-, С- and H-proteins of sarcomeric cytoskeleton // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2005, v. 26(1), p. 78-79.

12.Marsagishvili L., Shpagina M., Emelyanenko V., Podlubnaya Z. New amyloid-forming proteins // FEBS Journal, 2005, v. 272, Iss. si, p. 297.

13.Марсагишвили Л.Г., Осипова Д.А., Вихлянцев И.М. С-белок миокарда человека образует амилоидные фибриллы // Тезисы докл. 9-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 22 апреля 2006 г.), с. 207.

14.Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Косенко Е.А., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А., Подольский ИЛ. Бета-амилоидная модель болезни Альцгеймера у крыс // Тезисы докл. 10-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля, 2006 г.), с. 151.

15.Podlubnaya Z.A., Shpagina MX)., Marsagishvili L.G., Kosenko E.A., Podolsky I.Ya. Inhibitory effect of fullerene on AP25.35 peptide fibrillazation electron

microscopic study // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility", Pushchino, Russia, 2006, p. 155-156.

16.Подлубная 3.A., Подольский И Л., Шпагииа М.Д., Марсагишвили Л.Г. Электронно-микроскопическое изучение влияния фуллерена на формирование амилоидных фибрилл АР25.35 пептидом // Биофизика, 2006, Т. 51, №5, С. 795-798.

17.Марсагишвили Л .Г., Шпагина М.Д., Шаталин Ю.В., Шубина B.C., Наумов А.А., Поцелуева М.М., Подлубная З.А. Исследование цитотоксичности амилоидных фибрилл Х-белка. // Биофизика, 2006, Т. 51, № 5, С. 799-803.

18.Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., З.А. Подлубная. Временная зависимость образования амилоидных фибрилл Х-белка // Сб. "Медико-биологические аспекты действия физических факторов" (под редакцией B.C. Улащика), Минск, Беларусь, 2006, "Бизнесофсет", с. 242-245.

19.Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Shatalin Yu.V., Shubina V.S., Naumov A.A., Potselueva M.M. and Podlubnaya Z.A. Tetracycline destroys amyloid fibrils of sarcomeric cytoskeletal X-protein and eliminates its cytotoxic effect on polymorphonuclear leucocytes in vitro // J. Muscle Res. Cell Motil., 2006. V. 27, № 5-7, p. 542-543.

20.Podolsky I.Ya., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A., Mugantseva E.A. Makarova E.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Kaminsky Yu. G., Andrievsky G.V., Klochkov V.K. Effects of Hydrated Forms of C60 Fullerene on Amyloid 0-Peptide Fibrillization in vitro and Performance of the Cognitive Task // Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2007, v. 7, № 4/5, p. 1479-1485.

21.Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Влияние фуллерена на формирование амилоидных фибрилл Х-белком // Тезисы XX Съезда Физиологического общества им ИЛ. Павлова, (Москва, 4-8 июня 2007 г.), с. 326.

22.Макарока Е.Г., Кордонец OJL, Муганцева Е.А., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А., Годухин О.В., Подольский И.Я. Влияние Ceo фуллерена на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера in vitro и in vivo // Тезисы Ш Международного и Междисциплинарного конгресса "Нейронаука для медицины и психология", (Судак, Крым, Украина, 12-20 июня 2007 г.), с. 149-150.

23.Podlubnaya Z.A., Podolsky I.Ya., Marsagishvili L.G., Shpagina MJD. Effects of hydrated forms of CM fullerene on amyloids of X-protein and AP-peptides // ХШ Biennial International Workshop "Fullerenes and atomic clusters", (St Petersburg, My 2-6,2007), p. 222.

24.Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Shatalin Yu. V., Potselueva M.M., Podlubnaya Z.A. Fullerene Сбо HyFn destroys amyloid fibrils of sarcomeric cytoskeletal X-protein and increases of cell viability // J. Muscle Res. Cell Motil., 2007 (в печати).

Список использованных сокращений: АТФаза - аденозинтрифосфатаза, ДКМП - дилатационная кардиомиопатия, КД - круговой дихроизм, КК - Конго красный, им - нанометр, ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты, ТТ — тиофлавин Т.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации "Ведущие научные школы" № 4981.2006.4; Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" 2004-2007; грантами РФФИ № 0304-48487, N° 06-04-48896 и грантом РФФИ-офи № 07-04-12228; проектом по заданию Рособразования № 1.1.06.

Принято в печать 29.07.2007. Заказ № 18. Тираж 100 экз. ООО «Фотон-век». ИНН 5039008988 г. Пущнно. Московская область. (4967) 73-94-32 beornot@rambler.ru

http://photon-vek.narod.ru - кварцевые кюветы

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марсагишвили, Лия Гивиевна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА

ТАЙТИНА.

1.1 Структура молекулы тайтина и его функции.

1.1.1. Структура и функции молекулы тайтина в разных зонах саркомера.

1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка.

1.2.1. Структура С-белка.

1.2.2. Структура Х-белка.

1.2.3. Структура Н-белка.

1.2.4. Функции С-белка, Х-белка и Н-белка.

1.3 Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии.

Глава 2. АМИЛОИДОЗЫ.

2.1. Актуальность проблемы.

2.2. История изучения амилоидозов.

2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл.

2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro.

2.5. Патологические проявления амилоидозов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина"

Амилоидозы - большая группа конформационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson, 2001).

Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, А|3-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarro et al., 1998; Chiti et al., 1999; Fandrich et al., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: |3-складчатую структуру с отдельными |3-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа "а-спираль - |3-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).

Данная работа посвящена изучению способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы. В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и другие), относящихся к саркомерным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. Хотя предположения о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых нитей высказывались давно (Рере, 1967; Huxley, 1967; Hanson et al., 1971), до начала 70-х годов прошлого века природа этих белков была неизвестна. Обнаружение с помощью ДСН-гель-электрофореза С-белка и Х-белка в качестве минорных примесей в препаратах миозина (Starr & Offer, 1971), а также открытие тайтина (= коннектина) (Maruyama et al., 1977; Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981) стимулировали их выделение и изучение. С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986; Soteriou et all., 1993), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных. До его открытия мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: тонких (актин-содержащих) и толстых (миозин-содержащих), скользящих относительно друг друга (Huxley & Hanson, 1954; Huxley & Niedergerke, 1954). Обнаружение тайтина и выяснение его локализации позволило выдвинуть гипотезу о трехнитевой модели саркомера (Wang, 1984; 1985).

Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять много разных функций в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Наличие 90% р-складчатой структуры в этих белках создает возможность формирования ими амилоидов. Поэтому изучение способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (Х-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennet et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми Ар-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание Р-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Марсагишвили, Лия Гивиевна

выводы

1. Показано, что белки семейства тайтина (тайтин, Х-, С- и Н-белки) скелетных мышц кролика способны формировать амилоидные фибриллы in vitro. Их амилоидная природа подтверждена стандартными тестами на амилоиды (связывание с красителями тиофлавином Т и Конго красным).

4. С помощью электронной микроскопии продемонстрировано антиамилоидогенное действие фуллерена С60 и тетрациклина на фибриллы X-белка, а также антиамилоидогенное действие фуллерена Сбо на фибриллы АР(25-35)-пептида.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации "Ведущие научные школы" № 4981.2006.4; Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" 2004-2007; грантами РФФИ № 03-04-48487, № 06-04-48896 и грантом РФФИ-офи № 07-04-12228; проектом по заданию Рособразования № 1.1.06.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Амилоидные депозиты были найдены в мышцах и в кровеносных сосудах при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах уже давно. Однако тестирование способности мышечных белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы проведено нами впервые. Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "а-спираль - Р-складчатость", что, как правило, требует жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.).

Молекулы саркомерных белков семейства тайтина, которые мы исследовали, состоят из иммуноглобулин- и фибронекгин-подобных доменов и уже содержат ~90% Р-складчатой структуры, необходимой для формирования амилоидных фибрилл in vitro и найденной in vivo в амилоидных депозитах при разных амилоидозах. Это стимулировало поиск белков-предшественников амилоидов в этом семействе. Нами было показано, что саркомерные белки семейства тайтина как скелетных, так и сердечных мышц кролика, а также С-белок миокарда человека могут формировать фибриллярные структуры. С помощью электронной, поляризационной, флуоресцентной микроскопии и спектральных методов мы доказали амилоидную природу фибриллярных агрегатов, образуемых тайтином, X-белком, С-белком и Н-белком. Отмечен также полиморфизм амилоидов исследуемых белков (аморфные агрегаты, протофибриллы, линейные фибриллы, спиральные ленточные фибриллы, пучки линейных фибрилл). Способность С-белка миокарда человека, формировать амилоидные фибриллы, подобные фибриллам С-белка миокарда кролика, указывает на вероятность образования амилоидов белками семейства тайтина у человека. На примере Х-белка была изучена скорость фибриллогенеза. В отличие от других амилоидогенных белков, наличие 90% Р-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo. Поскольку амилоидные фибриллы, образуемые разными белками как in vivo, так и in vitro, обладают структурным сходством, то, вероятно, и подход к их разрушению может быть сходным. С помощью электронной микроскопии мы впервые in vitro продемонстрировали ингибирующий эффект фуллерена Сбо на амилоидогенез X-белка и А(3(25-35)-пептида, а также тетрациклина на амилоидогенез Х-белка, подобно его действию на амилоиды А|3-пептида и тау-белка при болезни Альцгеймера и на депозиты хантингтина при болезни Хантингтона. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению разных амилоидов и позволяют рассматривать тетрациклин и фуллерены как потенциальные препараты для лечения амилоидозов. Они указывают на возможность проведения скрининга лекарств на системе амилоидных фибрилл белков семейства тайтина для терапии не только мышечных, но и других амилоидозов. В этой связи следует отметить, что регистрация антиамилоидогенной активности фуллеренов, наноразмерных частиц, открывает перспективы для разработки новой нанотехнологии в терапии амилоидозов человека и животных.

В наших исследованиях был использован новый подход к выяснению возможных негативных эффектов амилоидных фибрилл на сократительную способность мышц - тестирование их прямого влияния на ферментативные свойства актомиозинового комплекса. Фибриллы исследуемых белков почти в два раза снижали АТФазу акгомиозина, что указывает на возможность их прямого негативного действия на сократительную функцию мышц, а разрушение амилоидных фибрилл антибиотиками приводило к восстановлению исходного уровня актомиозиновой АТФазы. Эксперименты показали эффективность такого теста, свидетельствуя о том, что даже, не достигая критической массы в клетке, приводящей к ее гибели, амилоиды исследуемых белков способны подавлять функциональные свойства сократительной системы.

В экспериментах по исследованию цитотоксичности амилоидов нами была продемонстрирована концентрационная и временная зависимость снижения выживаемости полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в присутствии амилоидных фибрилл Х-белка, а также ее увеличение при разрушении фибрилл тетрациклином.

Оценка клеточной токсичности амилоидов исследуемых белков позволит проводить скрининг препаратов, разрушающих зрелые амилоидные фибриллы и/или ингибирующих рост новых фибрилл для разработки терапевтических подходов к предотвращению или замедлению амилоидогенеза in vivo. Отсутствие токсичности у тетрациклина и фуллерена Сбо - необходимое свойство кандидатов для терапии амилоидозов.

В результате проведенных исследований нами открыты новые белки-предшественники амилоидов и возможные участники амилоидогенеза in vivo -саркомерные белки семейства тайтина (тайтин, Х-, С-, и Н-белки), которые в связи с высоким содержанием Р-складчатости не нуждаются в драматических изменениях их молекулярной структуры в жестких условиях для формирования амилоидов. Это облегчает процесс формирования ими амилоидов и увеличивает опасность их быстрого роста в клетке. Несмотря на то, что в норме тайтин, Х-, С-, Н-белки прочно связаны с миозиновыми нитями, что не позволяет им формировать амилоидные фибриллы, при изменении условий внутриклеточной среды сродство этих белков к миозину может снижаться и процесс их агрегации с образованием амилоидных фибрилл и фибриллярных пучков становится вполне вероятным. Если учесть также, что по количеству эти белки занимают третье место в саркомере после миозина и актина, то все это может представлять опасность для быстрого роста их амилоидных депозитов in vivo. Полученные нами результаты открывают перспективы для дальнейшего успешного изучения амилоидогенеза этих белков как основы для разработки подходов к замедлению или предотвращению развития амилоидозов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марсагишвили, Лия Гивиевна, Пущино

1. Барсуков А., Шустов С., Шкодкин И., Воробьев С., Пронина Е. (2005) Гипертрофическая кардиомиопатия и амилоидоз сердца // Врач Вып. 10. С. 4246.

2. Виноградова О.М. (1980) Первичный и генетические варианты амилоидоза // М. Медицина 224 с.

3. Вихлянцев И.М. (2005) Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации // диссертационная работа. Пущино. 105 с.

4. Вихлянцев И.М., Макаренко И.В., Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Малышев С.Л., Подлубная З.А. (2000) Изменения изоформного состава цитоскелетного белка тайтина адаптационный процесс при гибернации // Биофизика. Т. 45. Вып. 5. С. 831-835.

5. Вихлянцев И.М., Алексеева Ю.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2002) Изучение свойств С-белка скелетных и сердечных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика. Т. 47. Вып. 4. С. 701-705.

6. Туровский Н.Н., Еремин А.В., Газенко О.Г., Егоров А.Д., Брянов И.И., Генин A.M. (1975) Медицинские исследования в космических полетах кораблей «Союз-12, 13, 14,» и орбитальной станции «Салют-3» // Космич. Биол. и мед. № 2. С. 48-53.

7. Ю.Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структуры и функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Биофизика. Т. 47. Вып. 4. С. 706-710.

8. П.Макаренко И.В. (2004) Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии // Диссертационная работа. Пущино. 107 с.

9. Мягкова Л.П. (2000) Энтеропатический амилоидоз: особенности клинических проявлений, место среди других форм амилоидоза. // Клиническая медицина. № 1. С. 11-14.

10. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. (2006) Фуллерены в биологии // СПб. ООО "Росток" с. 336.

11. Подлубная З.А. (1981) Формирование сократительных структур в миогенезе // В кн.: Проблемы миогенеза. Л. с. 51-74.

12. Поцелуева М.М., Чухлова Э.А., Медведев Б.И., Евтодиенко Ю.В. (1995) Условия оптимальной продукции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами крысы. // Биофизика. Т. 40. С. 1259-1264.

13. Сторожаков Г.И., Гендлин Г.Е. (2000) Амилоидоз сердца // Сердечная недостаточность. Т. 1. № 1.

14. Фрейдина Н.А. (1987) Исследование С- и F- минорных белков толстых нитей скелетных мышц кролика// Диссертационная работа. Пущино. 164 с.

15. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация // М.: Мир. 568 с.

16. Хубутия М.Ш. (2001) Дилатационная кардиомиопатия // Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 3-4. С. 32-40.

17. Шпагина М.Д., Орлова А.А., Лацабидзе И.Л., Подлубная З.А., Леднев В.В. (1983) Исследование структуры толстых нитей в изолированных А-дисках и продольных срезах скелетных мышц позвоночных методом оптической дифракции // Биофизика. Т. 28. С. 306-310.

18. Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. (2001) Мышечные ткани // М: Медицина. 240 с.

19. Шумаков В.И., Хубутия М.Ш., Ильинский И.М. (2003) Дилатационная кардиомиопатия И ООО «Издательство Триада». 448 с.

20. Ackermann M.F., Lamm K.R., Wiegand G.W., Luster M.I. (1989) Antitumor activity of murene neutrophils demonstrated by cytometric analysis // Cancer Research. V. 49 P. 528-532.

21. Andersson K., Olofsson A., Nielsen E.H., Svehag S.E., Lundgren E. (2002) // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 294. P. 309-314.

22. Bahler M., Moser H., Eppenberger H.M., Wallimann T. (1985) Heart C-protein is transiently expressed during skeletal muscle development in the embryo, but persists in cultured myogenic cells // Develop. Biol. V. 112. P. 345-352.

23. Bauer H.H., Aebi U., Haner M., Hermann R., Muller M, Merkle H.P. (1995) Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies prodused by in vitro aggregation of human calcitonin. // J. Struct. Biol. V. 115. P. 1-15.

24. Bennett P., Craig R., Starr R., Offer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle // J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. 550-567.

25. Bennett P., Starr R., Elliott A., Offer G. (1985) The structure of C-protein and X-protein molecules and a polymer of X-protein // J. Mol. Biol. V. 184. P. 297-309.

26. Blake C.C.F., Serpel L.C. (1996) Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transtyretin amyloid fibrils is a continuous P-sheet helix // Structure V. 4. P. 989998.

27. Blake C.C.F., Serpel L.C. Sunde M., Sangren 0., Lundgren E. (1996) A molecular model of the amyloid fibrils. The nature and origin of amyloid fibrils.// Ciba Found. Simp. V. 199. P. 6-21.

28. Callaway J.E., Bechtel P.J. (1981) C-protein from rabbit soleus (red) muscle // Biochem. J. V. 195. P. 463-469.

29. Chamberlain A.K., MacPhee C.E., Zurdo J., Morozova-Roche L.A., Hill H.A., Dobson C.M., Davis J.J. (2000) Ultrastructural organization of amyloid fibrils by atomic force microscopy // Biophys. J., V. 79. P. 3282-3293.

30. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M„ Ramponi G., Dobson Ch. (1999) Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils // PNAS V. 96. P. 3590-3594.

31. Craig R. (1977) Structure of A-segments from frog and rabbit skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 109. P. 69-81.

32. Craig R., Megerman J. (1979) Electron microscopy studies on muscle thick filaments // In: Motility and Cell Function. New York. P. 97-102.

33. Craig R., Offer G. (1976) Localization of C-protein in rabbit skeletal muscle // Proc. Roy. Soc. Lond. B. V.192. P. 451-461.

34. Dennis J.E., Shimizu Т., Reinach F.C., Fischman D.A. (1984) Localization of C-protein isoforms in chicken skeletal muscle: ultrastructural detection using monoclonal antibodies II J. Cell Biol. V. 98. P. 1514-1522.

35. Dobson C.M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci. V. 9. P. 329-332.

36. Dobson C.M. (2001) The structural basis of protein folding and its links with human disease // Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. В. V. 356. P. 133-145.

37. Draper M. H., Hodge A.J. (1949) Electron microscopy of muscle // Austr. J. Exp. Biol. Med. Sci. V. 27. P. 465-483.

38. Eggleton P., Gargan R., Fisher D. (1989) Rapid methods for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. // J. Immunol. Meth. V. 121. P. 105-113.

39. Einheber S, Fischman D.A. (1990) Isolation and characterization of a cDNA clone encoding avian skeletal muscle C-protein: an intracellular member of the immunoglobulin superfamily // Proc Natl Acad Sci USA. V. 87 (6). 2157-2161.

40. Fandrich M, Fletcher M.A, Dobson S.M. (2001) Amyloid fibrils from muscle myoglobin // Nature V. 410. P. 165-166.

41. Feuer G, Molnar F, Pettko E, Straub F.B. (1948) Studies on the composition and polymerization of actin // Hung. Acta Physiol. V. 1 (4-5). P. 150-163.

42. Flashman E, Redwood C, Moolman-Smook J, Watkins H. (2004) Cardiac myosin binding protein C: its role in physiology and disease // Circ. Res. V. 94 (10). P. 12791289.

43. Forloni G, Colombo L, Girola L, Tagliavini F, Salmona M. (2001) Anti-amyloidogenic activity of tetracyclines: studies in vitro // FEBS Lett. V. 487. P. 404407.

44. Franzini-Armstrong G, Porter K.R. (1964) Sarcolemmal invaginations constituting the T-system in fish muscle tiber // J. Cell Biol V. 22. P. 675-696.

45. Freiburg A, Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy // Eur. J. Biochem. V. 235. P. 317-323.

46. Fritz J.D, Swartz D.R, Greaser M.L. (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins // Analyt. Biochem. V. 180. P. 205-210.

47. Funatsu T, Higuchi H, Ishiwata S. (1990) Elastic filaments in skeletal muscle revealed by selective removal of thin filaments with plasma gelsolin // J. Cell Biol V. 110. P. 53-62.

48. Fiirst D.O., Osborn M., Weber K. (1989 a) Myogenesis in the mouse embryo: differential onset of expression of myogenic proteins and the involvement of titin in myofibril assembly IIJ Cell Biol V. 109 (2). P. 517-527.

49. Fiirst D.O., Vinkemeier U., Weber K. (1992) Mammalian skeletal muscle C-protein: purification from bovine muscle, binding to titin and the characterization of a full-length human cDNA //J Cell Sci. V. 102. P. 769-778.

50. Gautel M., Leonard K., Labeit S. (1993) Phosphorylation of KSP motifs in the C-terminal region of titin in differentiating myoblasts // EMBO J. V. 12. P. 3827-3834.

51. Gautel M., Zuffardi 0., Freiburg A., Labeit S. (1995) Phosphorylation switches specific for the cardiac isoform of myosin binding protein-C: a modulator of cardiac contraction? // EMBO J. V. 14 (9). P. 1952-1960.

52. Gilbert R., Cohen J.A., Pardo S., Basu A., Fischman D.A. (1999) Identification of the A-band localization domain of myosin binding proteins С and H (MyBP-C, MyBP-H) in skeletal muscle IIJ Cell Sci. V. 112 (Pt 1). P. 69-79.

53. Gilbert R., Kelly M.G., Mikawa Т., Fischman D.A. (1996) The carboxyl terminus of myosin binding protein С (MyBP-C, C-protein) specifies incorporation into the A-band of striated muscle // J Cell Sci. V. 109. (1). P. 101-111.

54. Glenner G., Eanes E., Bladen H., Linke R. (1974) 0-plated sheet fibrils. A comparison of native amyloid with synthetic protein fibrils // J. Histochem. Cytochem. V. 22. P. 1141-1158.

55. Godfrey J.E., Harrington W.F. (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimmer equilibrium // Biochemistry. V. 9 (4). P. 894-908.

56. Goedert M. (2001) a-Synuclein and neurodegenerative diseases // Nature Rev. Neurosci. V. 2. P. 492-501.

57. Goers J., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Uversky V.N., Fink A.L. (2002) Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation // Biochem. V. 41. P. 12546-12551.

58. Goldsbury C.S., Cooper G.J., Goldie K.N., Muller S.A., Saafi E.L., Gruijters W.T. et al. (1997) Polymorphic fibrillar assembly of human amylin. // J. Struct. Biol. V. 119. P. 17-27.

59. Goldsbury C.S., Wirtz S., Muller S.A., Sunderji S., Wicki P., Aebi U., Frey P. (2000) studies on the in vitro assembly of AP(l-40): implications for the search for Ap fibril formation inhibitors//./ of Struct. Biol. V. 130. P. 217-231.

60. Granzier H. & Labeit S. (2002) Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring // J. Physiol. V.541. P. 335-342.

61. Granzier H. & Labeit S. (2004) The giant protein titin. A major player in myocardial mechanics, signaling and disease // Circ. Res. V. 94. P. 284-295.

62. Granzier H., Kellermayer M., Helmes M., Trombitas K. (1997) Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. V. 73. P. 2043-2053.

63. Granzier H.L. & Irving T.C. (1995) Passive tension in cardiac muscle: contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments // Biophys J. V. 68. P. 10271044.

64. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.

65. Guijarro J.I., Sunde M., Jones J.A., Campbell I.D., Dobson C.M. (1998) Amyloid fibril formation by an SH3 domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 95. P.4224-4228.

66. Hanson J., O'Brien E. J., Bennett P. M. (1971) Structure of the myosin-containing filament assembly (A-segment) separated from frog skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 58. P. 865-871.

67. Hare J.F. (2006) Intracellular pathways of folded and misfolded amyloid precursor protein degradation // Arch. Biochem. and Biophys. V. 451. P. 79-90.

68. Harper J.D., Lansbury P.T. (1997) Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins // Annu. Rev. Biochem. V 66. P. 385-407.

69. Harrison R.F., Hawkins P.N., Roche W.R., MacMahon R.F.T., Hubscher S.G., Buckels J.A.C. (1996) "Fragile" liver and massive hepatic hemorrhage due to hereditary amyloidoses // Gut V. 38. P. 151-152.

70. Hartzell H.C. (1985) Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase IIJ. Moll. Biol. V. 186. P. 185-195.

71. Hartzell H.C., Glass D.B. (1984) Phosphorylation of purified cardiac muscle C-protein by purified cAMF-dependent and endogenous Ca -calmodulin-dependent protein kinases // J. Biol. Chem. V. 259. P. 15587-15596.

72. Hartzell H.C., Titus L. (1982) Effect of cholinergic and adrenergic agonists on phosphorylation of a 165000-dalton myofibrillar protein in intact amphibian cardiac muscle // J. Biol. Chem. V. 257. P. 2111-2120.

73. Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. (2003) Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases // Neuromolekular Med. V. 4. P. 21-36.

74. Horowits R., Kempner E.S., Bisher M.E., Podolsky RJ. (1986) A physiological role for titin and nebulin in skeletal muscle // Nature. V. 323. P. 160-164.

75. Horowits R., Podolsky R.J. (1987) The positional stability of thick filaments in activated skeletal muscle depends on sarcomere length: evidence for the role of titin filaments // J. Cell Biol. V. 105. P. 2217-2223.

76. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. V. 131. P. 1471-1481.

77. Huxley A.F. & Niedergerke R. (1954) Structural changes in muscle during contraction. Interference microscopy of living muscle cells // Nature. V. 173. P. 971973.

78. Huxley H. E. (1967) Recent X-ray diffraction and electron microscopic studies of striated muscle // J. Gen. Physiol. V. 50 (Suppl). P. 71-83.

79. Huxley H.E. & Hanson J. (1954) Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation // Nature. V. 173. P. 973976.

80. Hwang W., Zhang Sh., Kamm R.D., Karplus M. (2004) Kinetic control of dimmer structure formation in amyloid fibrillogenesis // PNAS V. 101. P. 12916-12921.

81. Improta S., Politou A.S., Pastore A. (1996) Immunoglobulin-like modules from titin I-band: extensible components of muscle elasticity // Structure V. 4. P. 323-337.

82. Itoh Y., Kimura S., Suzuki Т., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle II J. Biochem. V. 100. P. 439-447.

83. Jeacocre S.A., England P.J. (1980) Phosphorylation of a myofibrillar protein of Mr 150000 in perfused rat heart, and the tentative identification of this as C-protein // FEBS Letters. V. 122. P. 129-132.

84. Jimenez J.L., Nettleton E.J., Bouchard M., Robinson C.V., Dobson C.M., Saibil H.R. (2002) The protoflament structure of insulin amyloid fibrils. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. 99. P. 9196-9201.

85. Jobansson J. (2003) Molecular determinants for amyloid fibril formation: lessons from lung surfactant protein С // Swiss Med. WKLY. V. 133. P. 275-282.

86. Juszczyk P., Kolodziejczyk A.S., Grzonka Z. (2005) Circular dichroism and aggregation studies of amyloid |3 (11-28) fragment and its variants // Acta Biochim. Pol. V. 52. P. 425-431.

87. Kelly J.W. (1998) The alternative conformations of amyloidogenic proteins and their multi-step assembly pathways // Curr. Opin. Struct. Biol. V. 8. P. 101-106.

88. Kielley W.W., Harrington W.F. (1960) A model for the myosin molecule // Biochim. Biophys. Acta. V. 41 (3). P. 401-421.

89. Kim J.E., Lee M. (2003) Fullerene inhibit p-amyloid peptide aggregation // BBRC V. 303 P. 576-579.

90. Kim Y., Randolph T.W., Stevens F.J., Carpenter J.F. (2002) Kinetics and energetics of assembly, nucleation, and growth of aggregates and fibrils for an amylodogenic protein H J. Biol. Chem. V. 277. P. 27240-27246.

91. Kimura S., Maruyama K., Huang Y.P. (1984) Interactions of muscle |3-connectin with myosin, actin, and actomyosin at low ionic strengths // Biochem. J. V. 96. P. 499-506.

92. Klajnert В., Cortijo-Arellano M., Bryszewska M., Cladera J. (2006) Influence of heparin and dendrimers on the aggregation two amyloid peptides related to Alzheimer's and prion diseases // BBRC V. 339. P. 577-582.

93. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. (1989) Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation // J. Histochem. Cytochem. V. 37. P. 1273-1281.

94. Kolmerer В., Olivieri N., Witt C.C., Herrmann B.G., Labeit S. (1996) Genomic organization of the M-line titin and its tissue-specific expression in two distinct isoforms II J. Mol. Biol. V. 256. P. 556-563.

95. Koretz J.F. (1979) Effect of C-protein on synthetic myosin filament structure // Biophys. J. V. 27. P. 433-446.

96. Koretz J.F., Coluccio L.M., Bertasso A.M. (1982) The aggregation characteristics of column-purified rabbit skeletal myosin in the presence and absence of C-protein at pH 7.0 II Biophys. J. V. 37. P. 433-440.

97. Koretz J.F., Irving T.C., Wang K. (1993) Filamentous aggregates of native titin and binding of C-protein and AMP-desaminase // Arch. Biochem. Biophys. V. 304 (2). 305-309.

98. Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. (2005) The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. // J. Struct. Biol. V. 149. P. 30-37.

99. Kulikovskaya I., McClellan G„ Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2003) Effect of MyBP-C binding to actin on contractility in heart muscle // J. Gen. Physiol. V. 122 (6). 761-774.

100. Labeit S. & Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science. V. 270. P. 293-296.

101. Labeit S., Gautel M., Lakey A., Trinick J. (1992) Towards a molecular understanding of titin // EMBOJ. V. 11. P. 1711-1716.

102. Labeit S., Kolmerer В., Linke W.A. (1997) The giant protein titin. Emerging roles in physiology and pathophysiology // Circ. Res. V. 80. P. 290-294.

103. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head ofbacterophage ТА//Nature. V. 227 (5259). P. 680-685.

104. Lansbury P.T. (1999) Evolution of amyloid: what normal protein folding may tell us about fibrillogenesis and disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 33423344.

105. Lanzetta P.A, Alvarez L.J, Reinach P.S, Candia O.A. (1979) An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate // Analyt. Biochem. V. 100. P. 95-97.

106. Lashuel H.A, Hartley D.M, Balakhaneh D, Aggarwal A, Teichberg S, Callaway D.J.E. (2002) New class of inhibitors of amyloi-P fibril formation // J. Biol. Chem. V. 277. P. 42881-42890.

107. Lee E.K, Park Y.W., Dong Y.Sh, Mook-Jung I, Yoo Yu. J. (2006) Cytosolic amyloid-P peptide 42 escaping from degradation induces cell death // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 344. P. 471-477.

108. LeVine III H. (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease P-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution // Prot. Sci. V. 2. P. 404-410.

109. LeVine III H. (1995) Thioflavine T interactions with amyloid p-sheet structures // Amyloid. V. 2. P. 1-6.

110. Lim M.S., Sutherland C, Walsh M.P. (1985) Phosphorylation of bovine cardiac C-protein by protein kinase С // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 132. P. 11871195.

111. Linke W.A, Ivemeyer M, Olivieri N, Kolmerer B, Rtiegg J.C, Labeit S. (1996) Towards a molecular understanding of the elasticity of titin // J. Mol. Biol. V. 261. P. 62-71.

112. Linke W.A, Kulke M„ Li H, Fujita-Becker S, Naegoe C, Manstein D.J, Gautel M, Fernandez J.M. (2002) PEVK domain on titin: an entropic spring with actin-binding properties II J. Struct. Biol. V. 137. P. 194-205.

113. Liversage A.D, Holmes D, Knight P.J, Tskhovrebova L, Trinick J. (2001) Titin and the sarcomere symmetry paradox // J. Mol. Biol. V. 305. P. 401-409.

114. Liihrs Th, Ritter Ch, Adrian M, Riek-Lohen D, Bohrmann B, Dobeli H, Schubert D, Riek D. (2005) 3D structure of Alzheimer's amyloid P(l-42) fibrils // PNAS. V. 102. P. 17342-17347.

115. Malinchik S.B, Lednev V.V. (1992) Interpretation of the X-ray diffraction pattern from relaxed skeletal muscle and modeling of the thick filament structure // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 13 (4). P. 406-419.

116. Margossian S.S. (1985) Reversible dissociation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis // J. Biol. Chem., V. 260. № 25. P. 13747-13754.

117. Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin // J. Biochem. V. 89. P. 701-709.

118. Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., Ohashi K., Murakami F., Handa S., Eguchi G. (1977) Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. V. 82. P. 317-337.

119. Mayans 0., Van der Ven P.F., Wilm M., Mues A., Young P., Furst D.O., Wilmanns M., Gautel M. (1998) Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillogenesis // Nature. V. 395 (6705). P. 863-869.

120. McClellan G., Kulikovskaya I., Winegrad S. (2001) Changes in cardiac contractility related to calcium-mediated changes in phosphorylation of myosin-binding protein С // Biophys. J. V. 81 (2). P. 1083-1092.

121. McClellan G„ Kulikovskaya I., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2004) Effect of cardiac myosin-binding protein С on stability of the thick filament // J. Mol. Cell Cardiol. V. 37 (4). P. 823-835.

122. Miyahara M., Noda H. (1980) Interaction of C-protein with myosin // J. Biochem. V. 87. P. 1413-1420.

123. Mohamed A.S., Dignam J.D., Schlender K.K. (1998) Cardiac myosin-binding protein С (MyBP-C): identification of protein kinase A and protein kinase С phosphorylation sites // Arch. Biochem. Biophys. V. 358 (2). P. 313-319.

124. Moos C. (1981) Fluorescence microscope study of the binding of added C-protein to skeletal muscle myofibrils II J. Cell Biol. V. 90 P. 25-31.

125. Moos C., Dubin J., Mason C., Besterman J. (1976) Binding of C-protein to F-actin II Biophys. J. V. 16. P. 47a.

126. Moos C., Feng I-N.M. (1980) Effect C-protein on actomyosin ATPase // Biochem. Biophys. Acta. V. 632. P. 141-149.

127. Moos С., Mason C.M., Besterman J. M., Feng I-N. M., Dubin J.H. (1978) The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 // J. Mol. Biol. V. 124. P. 571-586.

128. Moos C., Offer G., Starr R., Bennett P. (1975) Interaction of C-protein with myosin, myosin rod and light meromyosin // J. Mol. Biol. V. 97. P. 1-9.

129. Morimoto K., Harrington W.F. (1974) Substructure of the thick filament of vertebrate striated muscle II J. Mol. Biol. V. 83. P. 83-97.

130. Mues A., Van der Ven P.F., Young P., Furst D.O., Gautel M. (1998) Two immunoglobulin-like domains of the Z-disc portion of titin interact in a conformation-dependent way with telethonin // FEES Lett. V. 428. P. 111-114.

131. Muhle-Goll C., Pastore A., Nilges M. (1998) The 3D structure of a type I module from titin: a prototype of intracellular fibronectin type III domains // Structure. V. 6. P. 1291-1302.

132. Nave R., Furst D.O., Weber K. (1989) Visualization of the polarity of isolated titin molecules: a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain? II J. Cell Biol. V. 109. P. 2177-2187.

133. Offer G. (1972) C-protein and the periodicity in the thick filaments of vertebrate skeletal muscle // Cold. SpringHarb. Symp. Quant. Biol. V. 37. P. 87-95.

134. Offer G., Moos C., Starr R., (1973) A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extraction, purification and characterization // J. Mol. Biol. V. 74. P. 653-676.

135. Ohtsuka H., Yajima H., Maruyama K., Kimura S. (1997) The N-terminal Z repeat 5 of connectin/titin binds to the C-terminal region of alpha-actinin // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 235. P. 1-3.

136. Okagaki Т., Weber F.E., Fischman D.A., Vaughan K.T., Mikawa Т., Reinach F.C. (1993) The major myosin-binding domain of skeletal muscle MyBP-C (C protein) resides in the COOH-terminal, immunoglobulin C2 motif///Cell Biol V. 123 (3). P. 619-626.

137. ONuallain В., Williams A.D., Westermark P., Wetzel R. (2004) Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils // J. Biol. Chem. V. 279. P. 17490-17499.

138. Pardee J.D., Spudich J.A. (1982) Purification of muscle actin // In: Methods in Cell Biology. (Wilson L. eds.) Acad. Press. New York. London. V. 24 (part A). P.271-289.

139. Peckham M., Young P., Gautel M. (1997) Constitutive and variable regions of Z-disk titin/connectin in myofibril formation: a dominant-negative screen // Cell Struct. Fund. V. 22. P. 95-101.

140. Pepe F. A. (1967) The myosin filament. I. Structural organization from antibody staining observed in electron microscopy // J. Mol. Biol. V. 27. P. 203-225.

141. Pepe F. A., Drucker B. (1975) The myosin filament. III. C-protein // J. Mol. Biol. V. 99. P. 609-616.

142. Pepe F. A., Drucker B. (1979) The myosin filament. IV. Myosin content // J. Mol. Biol. V. 130. P. 379-393.

143. Pepys M.B. (2001) Pathogenesis, diagnosis and treatment of systemic amyloidosis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. V. 365. P. 203-210.

144. Person V., Kostin S., Suzuki K., Labeit S., Schaper J. (2000) Antisense oligonucleotide experiments elucidate the essential role of titin in sarcomerogenesis in adult rat cardiomyocytes in long-term culture // J. Cell Sci. V. 113 (21). P. 38513859.

145. Podlubnaya Z.A., Freydina N.A., Lednev V.V. (1990) The axial repeats in paracrystals of light meromyosin and its complex with C-protein // Gen. Physiol. Biophts. V. 9. P. 301-310.

146. Podolsky I.Ya., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A., Kaminsky Yu.G. (2006) Impairment of spatial memory in the performance of probabilistic task and fullerenes. // Abstr. Intern. Symp. "Hippocampus and Memory", Pushchino, Russia. P. 44.

147. Qahwash I., Weiland K., Lu Yi., Sarver R., Kletzien R., Yan R. (2003) Identification of a mutant amyloid peptide that predominantly forms neurotoxic protofibriliar aggregates II J. Biol. Chem. V. 278. P. 23187-23195.

148. Rees M.K., Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure // J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449-4458.

149. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. (1994) The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis // Cell Motil. Cytoskeleton. V. 28 (1). P. 1-24.

150. Rome E., Offer G., Pepe F.A. (1973) X-ray diffraction of striated muscle labeled antibody to C-protein // Nature New Biol. V. 244. P. 152-154.

151. Safer D., Pepe F.A. (1980) Axial packing in light meromyosin paracrystals // J. Mol. Biol. V. 136. P. 343-358.

152. Salviati G., Betto R., Ceoldo S., Pierobon-Bormioli S. (1990) Morphological and functional characterization of the endosarcomeric elastic filament // Am. J. Physiol. V. 259 (lPt 1). P. 144-149.

153. Shirahama Т., Cohen A.S. (1967) High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril. IIJ. Cell. Biol. V. 33. P. 679-708.

154. Sipe J.D., Cohen A.S. (2000) History of the amyloid fibril. // J. Struct. Biol. V. 130. P. 88-98.

155. Siragelo I., Malmo C., Iannuzzi C., Mezzogiorno A., Bianco .R., Papa M., Irace G. (2004) Fibrillogenesis and cytotoxic activity of the amyloid-forming apomyoglobin mutant W7FW14F H J. Biol. Chem. V. 279. P. 13183-13189.

156. Sjostrom M., Squire J.M. (1977) Fine structure of the A-band in cryo-section. The structure of the A-band of human skeletal muscle fibers from ultrathin cryo-sections negatively stained// J. Mol. Biol. V. 109. P. 49-68.

157. Solaro R.J., Pang D.C., Briggs F.N. (1971) The purification of cardiac myofibrils with triton X-protein-100 II Biochem. Biophys. Acta., V. 245. P. 259-262.

158. Sommerville L.L. & Wang K. (1983) Phosphorylation of titin and nebulin in vitro and in vivo // Biophysical Journal. V. 41. P. 96a.

159. Sommerville L.L. & Wang K. (1987) In vivo phosphorylation of titin and nebulin in frog skeletal muscle // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 147 (3). P. 986-992.

160. Sommerville L.L. & Wang K. (1988) Sarcomere matrix of striated muscle: in vivo phosphorylation of titin and nebulin in mouse diaphragm muscle // Archiv. Biochem. Biophys. V. 262 (1). P. 118-129.

161. Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made by the giant protein titin // J. CellSci. V. 14. P. 119-123.

162. Squire J.M. (1981) The structural basis of muscular contraction // New York. London. P. 349.

163. Squire J.M., Luther P.K., Knupp C. (2003) Structural evidence for the interaction of C-protein (MyBP-C) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain // J Mol Biol. V. 331 (3). P. 713-724.

164. Starr R. & Offer G. (1971) Polypeptide chains of intermediate molecular weight in myosin preparations // FEBS Lett. V. 15. P. 40-44.

165. Starr R. & Offer G. (1983) H-protein and X-protein. Two new components of the thick filaments of vertebrate skeletal muscle II J. Mol. Biol. V. 170. P. 675-698.

166. Starr R., Almond R., Offer G. (1985) Location of C-protein, H-protein and X-protein in rabbit skeletal muscle fibre types IIJ. Muscle Res. Cell Mot. V. 6. P 227256.

167. Starr R., Bennett P., Offer G. (1979) X-protein and its polymers // Proc. Europ. Cong. Muscle Motil. Heidelberg. 1979. P. 29.

168. Starr R., Offer G. (1978) Interaction of C-protein with heavy meromyosin and subfragment-2 II Biochem. J. V. 171. P. 813-816.

169. Starr R, Offer G. (1982) Preparation of C-protein, H-protein, X-protein and phosphofructokinase // In: Methods in enzymology. New York. London. V. 85. Part B. P. 130-138.

170. Stine W.B, Dahlgren K.N, Krafft G.A, LaDu M.J. (2003) In vitro characterization for amyloid-P peptide oligomerization and fibrillogenesis // J. of Biol. Chem. V. 278. P. 11612-11622.

171. Stelzer J, Patel J, Moss R. (2006) Protein kinase A-medieted acceleration of the stretch activation responce in murine skinned myocardium is eliminated by ablation of cMyBP-C // Circ. Res. V. 13. P. 884-890.

172. Sunde M, Blake C.C.F. (1997) The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. II Adv. Prot. Chem. V. 50. P. 123-159.

173. Suzuki J, Kimura S, Maruyama K. (1994) Electron microscope filament lengths of connectin and its fragments // J. Biochem. V. 116. P. 406-410.

174. Suzuki K, Terry R.D. (1967) Fine structural localization of acid phosphatase in senile plaques in Alzheimer's presenile dementia. // Acta Neuropathol. (Berl.). V. 8. P. 276-284.

175. Takano-Ohmuro H, Nakauchi Y, Kimura S, Maruyama K. (1992) Autophosphorylation of P-connectin (titin 2) in vitro // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 183 (1). P. 31-35.

176. Tan S.Y, Perys M.B. (1994) Histopahtology // Amyloidosis. V. 25. P. 403-414.

177. Trinick J, Cooper J. (1980) Sequential disassembly of vertebrate muscle thick filaments II J. Mol. Biol. V. 141. P. 315-321.

178. Trinick J, Knight P, Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin II J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.

179. Trinick J.A. (1981) End-filaments: a new structural element of vertebrate skeletal muscle thick filaments II J. Mol. Biol. V. 151. P. 309-314.

180. Tskhovrebova L, Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules II J. Mol. Biol. V. 265. P. 100-106.

181. Uversky V.N., Fink A.L. (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta. V. 1698. P. 131-153.

182. Van der Ven PFM, Bartsch J.W., Gautel M., Jockusch H., Furst D.O. (2000) A functional knock-out of titin results in defective myofibril assembly // J. Cell Sci. V. 113. P. 1405-1414.

183. Wang К &Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line //J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.

184. Wang K. (1984) Cytoskeletal matrix in striated muscle: The role of titin, nebulin and intermediate filaments II Advances in experimental medicine and biology. V. 170. Contractile mechanisms in muscle ed. By G. Pollack and H. Sug.P. 285-305.

185. Wang K. (1985) Sarcomere-Associated Cytoskeletal Lattice in Striated Muscle. Review and Hypothesis // Cell and Muscle Motility. V. 6. P. 315-369.

186. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle // Proc.Natl Acad. Sci.USA. V. 76(8). P. 3698-3702.

187. Wang К & Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line //J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.

188. Weisberg A., Winegrad S. (1996) Alteration of myosin cross bridges by phosphorylation of myosin-binding protein С in cardiac muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93 (17). P. 8999-9003.

189. Weisberg A., Winegrad S. (1998) Relation between crossbridge structure and actomyosin ATPase activity in rat heart // Circ Res. V. 83 (1). P. 60-72

190. Whiting A., Wardale J., Trinick J. (1989) Does titin regulate the length of muscle thick filaments? II J. Mol. Biol. V. 205. P. 263-268.

191. Yamamoto K. & Moos K. (1983) The C-protein of rabbit red, white, and cardiac muscles //J. Biol. Chem. V. 258 (13). P. 8395-8401.

192. Yamamoto K. (1984) Characterization of H-protein, a component of skeletal muscle myofibrils II J. Biol. Chem. V. 259. P. 7163-7168.

193. Yasuda M., Koshida S., Sato N., Obinata T. (1995) Complete primary structure of chicken cardiac C-protein (MyBP-C) and its expression in developing striated muscles IIJ Mol Cell Cardiol. V. 27 (10). P. 2275-2286.

194. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin // EMBO J. V. 17. P. 1614-1624.

195. Zerovnik E. (2002) Amyloid fibril formation // Eur. J. Biochem. V. 269. P. 33623371.

Информация о работе

Марсагишвили, Лия Гивиевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марсагишвили, Лия Гивиевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Марсагишвили, Лия Гивиевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марсагишвили, Лия Гивиевна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика