Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга

Бобылёв, Александр Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга"

На правах рукописи

Бобылёв Александр Геннадьевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОИДНЫХ СВОЙСТВ МЫШЕЧНЫХ БЕЛКОВ И АР(1-42)-ПЕПТИДА МОЗГА

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2011

1 СЕН 2011

4852449

Работа выполнена в лаборатории Структуры и функции мышечных белков Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: Заслуженный деятель наук РФ, доктор

биологических наук, профессор Подлубная Зоя Александровна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

кандидат биологических наук Накипова Ольга Васильевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН (г. Москва).

Защита состоится " 21 " СЕНТЯБРЯ 2011 г. в /3 час. $0 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат диссертации разослан и " ЯП густл_2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Панина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Амилоидные агрегаты - основной признак амилоидозов, конформационных болезней человека и животных, наступающих в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белка. Амилоидные агрегаты можно разделить на два класса: амилоидные фибриллы, представляющие собой высокоупорядоченные структуры и аморфные агрегаты, не имеющие упорядоченной структуры. Известно, что амилоидные агрегаты имеют ряд специфических тинкториальных и физико-химических характеристик (способность связываться с красителями Конго красным и тиофлавином Т, богатая ß-складчатостью вторичная структура, двойное лучепреломление в поляризованном свете, нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к протеазам) (Dobson, 2004; Ross & Poirier, 2004; Uversky & Fink, 2004). Накопление белка в виде амилоидных агрегатов связано более чем с 25 разными тяжелыми и неизлечимыми заболеваниями человека. Эти заболевания включают амилоидоз, связанный с гемодиализом, диабет II типа, болезни Паркинсона, Хантингтона, Альцгеймера и др. (Dobson, 2004; Uversky & Fink, 2004; Wang & Good, 2005; Gruden et al., 2004; Wilhelm et al„ 2007).

Интерес к проблеме амилоидозов мозга объясняется тем, что сейчас эти болезни - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а по данным ВОЗ неврологические и психические заболевания в ближайшие 10-15 лет по числу больных могут выйти на первое место.

Изучение амилоидозов приобрело особую актуальность в связи с распространением прионных болезней (прионных амилоидозов) таких, как смертельные трансмиссивные энцефалопатии и среди них болезнь Куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба, фатальная семейная бессонница у людей, а также энцефалопатии у крупного рогатого скота (бешенство коров, имеющее эпидемический характер), скрепи у овец, коз и прион-зависимые энцефалопатии у других животных и птиц.

Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна. Установление белковой природы депозитов и их свойств, выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Одним из эффективных подходов к решению этих задач является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, открытие факторов, регулирующих их образование и разрушение, эффектов на жизнедеятельность клеток и т.д.

Марсагишвили, 2008). Легкость, с которой эти белки формируют амилоиды обусловлена наличием у них -90% ß-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидов. В связи с тем, что амилоидные отложения находят в кровеносных сосудах, нашей задачей было продолжить исследования, направленные на поиск новых амилоидных белков в мышцах и в частности, изучить амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина (аналога тайтина скелетных и сердечной мышц). Поскольку смитин имеет молекулярную структуру, подобную тайтину скелетных и сердечной мышц (Kim & Keller, 2002), мы предположили, что смитин также может легко формировать амилоиды. Подтверждению этого предположения посвящена первая часть диссертационной работы.

Основная стратегия терапии амилоидозов — разрушение амилоидных фибрилл или предотвращение их образования, поэтому вторая часть диссертационной работы посвящена in vitro исследованию способности фуллерена С60 и его производных разрушать амилоиды Ар(1-42)-пептида мозга, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера, и амилоиды мышечного X-белка. Важность использования фуллерена С6о в этих исследованиях обусловлена наличием у него таких положительных свойств, как нейропротекция и сильные антиоксидантные свойства (Dugan et al., 1996; Chiang et al., 1995; McEwen et al., 1992). Для тестирования антиамилоидного эффекта фуллерена С6о и его производных был выбран мышечный Х-белок, благодаря его способности in vitro строить спирально скрученные амилоидные фибриллы, подобные фибриллам Aß-пептидов мозга, разрушение которых можно легко оценивать с помощью электронной микроскопии. С помощью этого метода была показана способность гидратированного фуллерена С6о разрушать амилоидные фибриллы Х-белка и АР(25-35)-пептида мозга (Подлубная и Марсагишвили, 2008). Однако низкая растворимость гидратированного фуллерена С6о затрудняла его использование как потенциального препарата для эффективной антиамилоидной терапии. Это стимулировало наши исследования антиамилоидного эффекта водорастворимых производных фуллерена Сбо на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка в сравнении с их эффектом на амилоидные фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга.

Цель работы.

Поиск новых амилоидных мышечных белков и тестирование подходов к разрушению амилоидов.

Задачи исследования.

1. Выяснить способность гладкомышечного белка смитина формировать амилоиды in vitro.

2. Изучить антиамилоидное действие фуллерена С60 и его водорастворимых производных на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и Aß(l-42)-пептида мозга.

3. Изучить влияние антиамилоидных веществ на филаментообразование актина.

4. Исследовать цитотоксичность фуллерена С6о и его водорастворимых

производных.

5. Провести сравнительную оценку эффективности антиамилоидных

веществ.

Научная новизна работы. Открыты амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина - аналога тайтина скелетных и сердечной мышц. С помощью электронной микроскопии показано, что смитин способен in vitro формировать агрегаты в условиях, близких к физиологическим. Амилоидная природа агрегатов смитина подтверждена спектральными методами по связыванию их со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т.

Проведена оценка антиамилоидных свойств восьми водорастворимых производных фуллерена Сбо и их цитотоксичности. Оценка антиамилоидных свойств производных фуллерена С60 была проведена на амилоидных фибриллах мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, разрушение которых можно легко оценить с помощью визуальных методов.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о способности натриевой соли поликарбоксилыюго производного фуллерена С6о, комплексов фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном (м.м. поливинилпирролидона 10000 и 25000), фуллеренола, С6о-Ы02-пролина, С6о-(М02)2-пролина, С6о-Ы02-пролин-Ы02, а также гидратированного фуллерена Сбо не только разрушать амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, но и предотвращать их образование.

На основании отобранных критериев (высокая антиамилоидная способность, отсутствие токсичности, низкие агрегационные свойства) сделано заключение о том, что фуллеренол и комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном являются наиболее эффективными и нетоксичными антиамилоидными веществами, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на Международных конференциях "Биологическая подвижность" (Пущино, 2010); 38-ой Европейской мышечной конференции (Лилль, Франция, 2009); II Съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдова, 2008); 12-ой, 13-ой, 14-ой Международных Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008, 2009, 2010); VII «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН (Москва, 2008); Международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009); Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии

в живых системах» (Красновидово, 2009); V, VI, VII Международных и Междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии», (Судак, Крым, Украина, 2009, 2010, 2011); Конференции по программе «Фундаментальные науки — медицине» (Москва, 2010); Докладах совещаниях «Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении» (Москва, 2010); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010); XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); Школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 29 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на НО страницах, иллюстрирована 3% рисунками и 5" таблицами. Список цитируемой литературы включает 807 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный и клинический материал. Экспериментальный материал: скелетные мышцы кролика, гладкие мышцы желудка кролика. Используемые производные фуллерена С6о: комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном (ПВП) с молекулярными массами ПВП 10000 и 25000 и содержанием в них фуллерена 0,21%, и 0,7% соответственно, натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о, фуллеренол, метиловый эфир Ь-Ы-[(2-нитроглицерил)фуллерепил]пролина), метиловый эфир L-N-[(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролин, 2-нитроксиэтиловый эфир L-N-{[2-(нитрокси)этил]фуллеренил}пролина, гидратированный фуллерен С6о-

Выделение и очистка белковых препаратов. Смитин из гладких мышц желудка кролика выделяли по методу (Kim & Keller III, 2002). Х-белок, С-белок и Н-белок получали по методу (Star & Offer, 1982). Актин из скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка, приготовленного согласно (Feuer et al., 1948) по методу, описанному в работе (Pardee & Spudich, 1982). Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помощью спектрофотометра SPECORD UV VIS, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Е28о' мг/мл): 0.52 для колоночного миозина (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актина (Rees & Young, 1967); 1.37 для смитина (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка (Starr & Offer, 1982). Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле

по методу (Laemmli, 1970). Чистоту тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза по методу (Fritz et al., 1989).

Электронная микроскопия. Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрацией 0.1 мг/мл. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой (2% коллодий в амилацетате фирмы SPI-СНЕМ, USA), укрепленной углеродом. После удаления избытка суспензии полоской фильтровальной бумаги образцы окрашивали 2% водным раствором уранилацетата. Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100B при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении ЗООООх. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.

Метод флуоресцентного анализа. Исследование амилоидной природы фибрилл белков семейства тайтина, а также исследование разрушения амилоидных фибрилл Х-белка и Ар(1-42)-пептида проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур тиофлавина Т (ТТ). Измерения флуоресценции при исследовании амилоидной природы фибрилл проводили в растворе красителя (5мкМ тиофлавина Т) и суспензии фибрилл (5мкг/мл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками при изложении результатов). Измерения флуоресценции при исследовании разрушения амилоидных фибрилл Х-белка и АР(1-42)-пептида проводили в растворе красителя (5мкМ ТТ) и суспензии фибрилл (5мкг/мл АР(1-42)-пептида и Х-белка в растворе, содержащем 30 мМ КС1 и 10 мМ имидазола рН 7.0. Интенсивность флуоресценции раствора регистрировали с помощью спектрофлуориметра CARY Eclipse, Varían при длине волны 488 нм и при длине волны возбуждения 440 нм. Ширина щели при возбуждении и при регистрации 5 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в присутствии белка вычитали значения интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в отсутствие белка, получая интенсивность флуоресценции ТТ, связанного с белком.

Спектрофотометрнческий метод. Для подтверждения амилоидной природы фибрилл был также использован специфический краситель Конго красный (КК). Суспензию фибрилл (250 мкл) добавляли к раствору КК (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками при изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Спектры поглощения КК в отсутствие и в присутствии белка регистрировали при 450-650 нм с помощью спектрофотометра CARY 100, Varían.

Исследование клеточной токсичности производных фуллерена Сбо- Клетки карциномы гортани человека НЕр-2 выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 10% FBS, 40 мкг/мл гентамицина, 2.1 г/л бикарбоната натрия при 37°С и в атмосфере 5% С02- Исследуемые вещества добавляли в среду через 24 часа

после посева клеток (50 тыс. кл./мл). Цитотоксическое действие веществ оценивали по окраске кристаллическим фиолетовым (Nomizu et al., 1995). Клетки высевали на 96-луночные микропланшеты и через 1 сутки после посева добавляли комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном (м.м. ПВП 25000 и 10000) и поливинилпирролидон с молекулярными массами 10000 и 25000, а также фуллеренол и натриевую соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о- Цитотоксичность оценивали по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных исследуемыми веществами) культурах после 48 часов инкубирования. Цитотоксический эффект оценивали по отношению разности между оптической плотностью в опыте и фоном к разности между оптической плотностью в контроле и фоном. Оптическая плотность была пропорциональна количеству живых клеток. Измерение проводили с использованием планшетного спектрофлуориметра Infinite F200, Тесап.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ВЫЯСНЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ГЛАДКОМЫШЕЧНОГО БЕЛКА СМИТИНА ФОРМИРОВАТЬ АМИЛОИДЫ IN VITRO

1.1. Изучение агрегационных свойств молекул смитина гладких мышц кролика in vitro.

Изучение амилоидогенеза разных белков in vitro проводят в условиях, которые часто несовместимы с условиями in vivo. Для образования амилоидов смитином мы использовали условия, близкие к физиологическим. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) было показано, что смитин способен формировать аморфные агрегаты, как и другие известные амилоидогенные белки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O'Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink, 2004; Подлубная и Марсагишвили, 2008). Мы показали, что в растворе, содержащем 0,15 М глицина-КОН, рН 7.0, смитин образует аморфные агрегаты (рис. 1).

ф Щ h

Рис. 1. Аморфные агрегаты смитина гладких мышц желудка

кролика, сформированные в растворе, содержащем 0.15 М глицина-КОН, рН 7.0, при 4°С. Негативное окрашивание 2%

водным раствором

уранилацетата. Шкала 100 нм.

Легкость, с которой смитин способен формировать амилоиды, объясняется преобладанием в его структуре ß-складчатости, благодаря наличию которой, может облегчаться процесс формирования им амилоидов in vitro и увеличивается опасность их быстрого роста в клетке.

Основным методом выявления амилоидной природы агрегатов, образуемых разными белками, является их способность взаимодействовать со специфическими красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; LeVine, 1993,1995; Krebs et al., 2005).

При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии аморфных агрегатов смитина возрастала в ~2 раза соответственно по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этого белка в молекулярной форме (рис. 2). Незначительное увеличение интенсивности флуоресценции TT наблюдается и в присутствии молекулярных форм смитина, что согласуется с литературными данными для белков, содержащих ß-складчатую структуру (LeVine, 1993; 1995).

.....

тиофлавин Т

смкгин в молекулярной форме амилоъшные аморфные агрегаты смитина

490 500

Длина волны, нм

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии смитина в молекулярной форме и амилоидных аморфных агрегатов смитина.

При измерении спектральных характеристик раствора Конго красного в присутствии аморфных агрегатов смитина наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от -490 нм к -500 нм (рис. 3), что также является характерной чертой при связывании Конго красного с амилоидами (К1ипк е1 а1., 1989).

о о,

i 0 z

О о,

S о,

¥ о,

о о,

- конго красный ■ конго красный + смитин

410 430 450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 650

Длина волны,нм

Рис. 3. Спектры поглощения красителя Конго красного в отсутствие (сплошная линия) и в присутствии (пунктирная линия) амилоидных аморфных агрегатов смитина.

Проведенные исследования указывают на специфичность связывания красителей с агрегатами смитина, подтверждая их амилоидную природу. По-видимому, небольшое увеличение интенсивности флуоресценции ТТ в присутствии аморфных агрегатов смитина обуславливается более низкой амилоидогенностью этих агрегатов по сравнению с амилоидными фибриллами. Поиск условий, при которых смитин способен формировать фибриллы является отдельной задачей. Нашей целью было доказать, что смитин образует амилоиды in vitro и, как открытые нами ранее амилоидные белки семейства тайтина, может быть потенциальным участником развития амилоидозов in vivo.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИАМИЛОИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ФУЛЛЕРЕНА С60 И ЕГО ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА АМИЛОИДНЫЕ ФИБРИЛЛЫ МЫШЕЧНОГО Х-БЕЛКА И Ар(1-42)-ПЕПТИДА МОЗГА

2.1. Антиамилондное действие гидратированного фуллерена С60 на амилоидные фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга.

Накопление амилоидов в клетках и тканях организма может приводить к их гибели, поэтому важно не допустить агрегацию амилоидов и их накопление в организме. Наши исследования были направлены на поиск подходов к разрушению амилоидов и предотвращению их образования.

В качестве тест-системы для изучения разрушающего действия антиамилоидных веществ in vitro мы использовали амилоиды мышечного X-белка (рис. 4, а). Данный белок является наиболее удобной моделью для этих экспериментов благодаря способности строить упорядоченные спирально-скрученные ленты, сходные с амилоидными фибриллами Ар(1-42)-пептида мозга (рис 4, б). В связи со структурным сходством амилоидов Х-белка и амилоидов Ар(1-42)-пептида мозга, нами было высказано предположение о возможности использования сходных подходов к их разрушению.

i ___t—: - -";> 1 ■S . -

i... '•"■ 'ШШ,-... . ШШШ f i

Рис. 4. Электронные

микрофотографии: (а) -спирально-скрученные ленточные фибриллы мышечного Х-белка, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при 4°С; (б) -спирально-скрученные ленточные фибриллы Ар(1-42)-пептида

мозга, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при 37°С. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетета. Шкала 100 им.

Для подтверждения этого предположения мы исследовали in vitro антиамилоидное действие ряда производных фуллерена С6о на фибриллы мышечного Х-белка и АР(]-42)-пептида мозга. В качестве антиамилоидных веществ в этих экспериментах были использованы водорастворимые производные фуллерена С6о-

В последнее время фуллерены рассматривают как лекарственные препараты (Пиотровский и Киселев, 2006), в том числе и для лечения нейродегенеративных болезней (Lee et all., 2006). Невизуальным методом показано ингибирующее влияние производного фуллерена С6о (1,2-(диметоксиметано)фуллерен) на фибриллогенез Ар(11-25)-пептида и А(3(1-40)-пептида in vitro (Kim & Lee, 2003).

Ранее для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых белками семейства тайтина, нами было проведено in vitro тестирование эффекта гидратированного фуллерена (С60 HyFn) на структуру их фибриллярных агрегатов. С помощью ЭМ было показано, что фуллерен разрушает фибриллы, формируемые Х-белком семейства тайтина и Ар(25-35)-пептидом мозга (Подлубная и Марсагишвили, 2008). Мы провели электронно-микроскопическое исследование антиамилоидного эффекта С6о HyFn на фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга. Согласно нашим наблюдениям, в препаратах фуллерена С6о HyFn присутствуют сферические агрегаты диаметром 5-90 нм. Действие гидратированного фуллерена на фибриллы АР(1-42)-пептида и Х-белка подобно его действию на амилоиды мышечного Х-белка и АР(25-35)-пептида мозга (Подлубная и Марсагишвили, 2008). Добавление фуллерена С60 HyFn к ленточным фибриллам АР(1-42)-пептида приводило к их декорации сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент. Эти данные свидетельствуют о разрушении амилоидов АР(1-42)-пептида гидратированным фуллереном. Более того, С6о HyFn не только разрушал зрелые фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга, но и препятствовал образованию новых амилоидных фибрилл. Данные по антиамилоидному эффекту С6о HyFn на фибриллы Х-белка и Ар-пептидов мозга подтвердили наше предположение о

возможности использования сходных подходов к разрушению амилоидов мышечных белков и пептидов мозга.

Полученные нами данные об антиамилоидном эффекте гидратированного фуллерена С6о на фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга in vitro согласуются с полученными ранее in vivo данными. В частности, введение в мозг крысам фуллерена С60 HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме (Podolsky et al., 2006), что свидетельствует об отсутствии нейротоксичности фуллерена С60 HyFn. Более того, имеется соответствие между антиамилоидным действием фуллерена С60 HyFn in vitro (Подлубная и др., 2006) и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное АР(25-35)-пептидом. Всё это позволяет рассматривать гидратированный фуллерен как потенциальный препарат для терапии амилоидозов. Однако этому препятствует его низкая растворимость в воде. В связи с этим нами были исследованы антиамилоидные свойства ряда водорастворимых производных фуллерена С6о

2.2. Антиамилоидное действие натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С6(1 на амилоидные фибриллы мышечного X-белка и Ар(1-42)-пептида мозга.

Методом электронной микроскопии мы исследовали антиамилоидные свойства натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С6о (С6оС1(СбН4СН2СООНа)5) (рис. 5). Данное производное фуллерена С«), в отличие от С60 HyFn, имеет высокую растворимость в полярных растворителях и не образует агрегаты in vitro (рис. 6, а).

В отличие от С6о НуРп добавление С60С1(С6Н4СН2СООЫа)5 к спирально-скрученным ленточным амилоидным фибриллам мышечного Х-белка приводило к их полному разрушению (рис. 6, в). Производное фуллерена СбоС1(С6Н4СН2СООЫа)5 не только разрушало амилоидные фибриллы, но и предотвращало образование новых фибрилл (рис. 6, б). Аналогичный эффект это производное оказывало на амилоидные фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга. В ходе ЭМ исследования было показано, что данное производное фуллерена разрушало фибриллы АР(1-42)-пептида мозга и предотвращало их образование (рис. 6, г, д).

Антиамилоидный эффект СбоС1(С6Н4СН2СООЫа)5 был подтвержден флуоресцентным анализом, поскольку у С6оС1(С6Н4СН2СООЫа)5 не было выявлено способности поглощать свет в той же области, что и ТТ. По данным

•NaOOC

"COONa*

•COONa*

Рис. 5. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С60 C60Cl(C6H4CH2COONa)5.

флуоресцентного анализа натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С60 разрушала амилоидные фибриллы А|3(1-42)-пептида и Х-белка.

Рис. 6. Электронные

микрофотографии:

(а) - Cf,oCl(Cf,H4CH2COONa)5;

присутствии добавленной амилоидных присутствии

(б) - Х-белок С61)С1(С6Н4СН2СООЫа)5, до формирования фибрилл (в) - Х-белок С60С1(С6Н4СН2СООЫа)5, добавленной после формирования амилоидных фибрилл. Весовое соотношение X-белка и С60С1(СйН4СН2СОСЖа)5 1:1; (г) - А|3(1-42)-пептид в присутствии С60С1(С6Н4СН2СООЫа)5, добавленной до формирования амилоидных фибрилл (д) - А(3(1-42)-пептид в присутствии С60С1(СбН4СН2СОО№)5, добавленной после формирования амилоидных фибрилл. Весовое соотношение А(3(1-42)-пептида и С60С1(С6Н4СН2СООЫа)5 1:1. Время инкубации 24 ч. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.

Разрушение амилоидных фибрилл А|3(1-42)-пептида и Х-белка данным производным приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции ТТ (рис. 7, а, б). А(3(1-42)-пептид и Х-белок в присутствии СбоС1(С6Н4СН2СО(Жа)5, добавленной до формирования ими амилоидных фибрилл, после 24 ч инкубации не увеличивали интенсивность флуоресценции тиофлавина Т. Это также свидетельствует о способности С6оС1(СбН4СН2СООНа)5 предотвращать образование амилоидных фибрилл.

• - Тиофлавин Т

^ Х-белок до формирования амилоидных фибрилл

Фибриллы Х-белка

Х-белок в присутствии С60С1(С6Н4СН2000Ыа)5 до формирования фибрилл

#- Х-белок в присутствии С60С1(С6Н4СН2ССЮ Ма)5 после формирования фибрилл

450 460 470 480 490 500 Длина волны, нм

14 12 10

-9-

-Тиофлавин Т

- Фибриллы А-6ета(1-42)-пептид

—'■•■А-6ета(1-42)-петид в присутствии

СБОС1(С6Н4СН2СООМа)5 до формирования фибрилл

-»- А-бета(1-42)-пегттид в присутствии

С60С1(С6Н4СН2СООМа)5 после формирования фибрилл

У 4

г -I 2

У-X

450 460 470 480 490 500

Длина волны, нм

Рис 7. Интенсивность флуоресценции тиофлавина Т: (а) - в присутствии мышечного Х-белка и натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60, добавленной до и после формирования амилоидных фибрилл; (б) - в присутствии А|3(1-42)-пептида и натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена Сбо до и после формирования амилоидных фибрилл (Ех 440 пш, Егп 482 пт).

2.3. Антиамилоидное действие фуллеренола на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и Ар(1-42)-пептида мозга.

Антиамилоидное действие на фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга было показано для фуллеренола (полигидроксилированного производного фуллерена С6о (На4[С6о(ОН)-зо])) (Рис. 8). Фуллеренол, как и натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о, хорошо растворим в воде и не образует в водных растворах агрегаты (Рис. 9, а).

Рис. 8. Полигидроксилированное производное фуллерена СГ)0 (Ка,[С6„(ОН)-3,)]).

С помощью ЭМ мы показали, что фуллеренол разрушал зрелые фибриллы АР(1-42)-пептида мозга, а также предотвращал их образование (Рис. 9, в, г). Аналогичный эффект фуллеренол оказывал на амилоиды Х-белка.

ЙИ

.да

. •■ ' 11 Р

цдрци

Рис. 9. Электронные микрофотографии: (а) - фуллеренол; (6) - спирально-скрученные ленточные фибриллы А|3(1-42)-пептида, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0; АР(1-42)-пептид в присутствии фуллеренола, добавленного до (в) и после (г) формирования амилоидных фибрилл. Инкубация 24 ч при 37°С. Весовое соотношение А(5(1-42)-пептида и фуллеренола 1:1. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.

По данным флуоресцентного анализа фуллеренол, как и натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сбо, разрушал амилоидные фибриллы АР(1-42)-пептида, что приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции ТТ.

При добавлении фуллеренола к АР(1-42)-пептиду и Х-белку до формирования ими амилоидных фибрилл не происходило увеличение интенсивности флуоресценции ТТ после 24 часов инкубации. Это

свидетельствует о способности фуллеренола предотвращать образование амилоидных фибрилл этим пептидом и белком.

Таким образом, с помощью электронной микроскопии и флуориметрии было показано, что фуллеренол не только разрушал зрелые амилоидные фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, но и предотвращал их образование.

2.4. Антиамилоидное действие комплексов фуллерена С60 с поливинилпирролидоном на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга.

Для поиска подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых Ар(1-42)-пептидом мозга и мышечным Х-белком, было проведено in vitro изучение антиамилоидного эффекта комплексов фуллерена С6о с поливинилпирролидоном (С60 ПВП) (м.м. ПВП 25000 и 10000) (Рис. 10).

По данным электронной микроскопии СбоПВП в солевом растворе образует редкие сферические агрегаты, подобные агрегатам C6oHyFn. Однако в отличие от них, агрегаты С6оПВП имеют меньший диаметр (-5-60 нм).

По данным ЭМ оба комплекса оказывали разрушающее действие на амилоидные фибриллы Х-белка и Ар(1-42)-пептида. Они также предотвращали образование амилоидов этим белком и пептидом.

Антиамилоидное действие С6о ПВП (м.м. ПВП 25000) на фибриллы X-белка и АР(1-42)-пептида было подтверждено флуоресцентным методом.

Таким образом, с помощью электронной микроскопии и флуоресцентного анализа мы показали, что комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном способны не только разрушать амилоиды Х-белка и АР(1-42)-пептидов, но и предотвращать их образование.

2.5. Антиамилоидное действие нитроксипроизводных фуллерена С6о на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и Ар(1-42)-пептида мозга.

Нами были проведены также ЭМ исследования антиамилоидного действия на фибриллы Х-белка семейства тайтина и АР(1-42)-пептида мозга трех нитроксипроизводных фуллерена С6о: С60-МО2-пролин, С6о-^02)2-пролин, Сбо-ИОг-пролин-ЫОг (Рис. 11). В ходе этих исследований было выяснено, что Сбо-МОг-пролин и С6о-(М02)2-пролин в солевом растворе образуют агрегаты диаметром до 100 нм и более.

—сн2—сн—

Рис. 10. Комплекс фуллерена С6о с поливинилпирролидоном.

Рис. 11. Структурные формулы и электронные микрофотографии:

(а) - С60^О2-пролина (метилового эфира Ь-Ы-[(2-

нитроглицерил)фуллеренил]пролина);

(б) - Сбо-О^ТОгЭг-пролина (метилового эфира Ь-М-[(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролина);

(в) - С60-МО2-пролин-МО2 (2-нитроксиэтилового эфира (нитрокси)этил]фуллеренил}пролина). Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.

Согласно ЭМ наблюдениям, добавление С60-МО2-пролина к амилоидным фибриллам Х-белка и Ар(1-42)-пептида приводило к снижению их количества относительно контроля, а также к уменьшению их длины. На ЭМ снимках видно, как ассоциаты С60-ЫО2-пролина декорируют ленты Х-белка и Ар(1-42)-пептида. Добавление данного производного фуллерена С60 к Х-белку и АР(1-42)-пептиду до формирования ими амилоидных фибрилл приводило к аналогичному эффекту. Зрелых фибрилл со свойственной для них структурой в данных образцах не наблюдалось.

Аналогичные результаты были получены и для С6о-(М02)2-пролина.

При исследовании антиамилоидной активности Сбо-Ы02-пролин->Ю2 выявлена способность разрушать зрелые амилоидные фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида, а также предотвращать их образование.

Антиамилоидный эффект для C(l0-NO2-npo.rinH-NO2 был подтвержден флуоресцентным анализом.

Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать исследованные водорастворимые производные фуллерена С6о в качестве потенциальных антиамилоидных препаратов. Электронно-микроскопический метод является наиболее эффективным для оценки способности разных веществ разрушать амилоидные фибриллы и/или ингибировать рост новых фибрилл in vitro. Электронная микроскопия в комплексе с флуоресцентным анализом повышает объективность отбора наиболее эффективных антиамилоидных веществ.

Мы показали, что фуллерен С6о и его водорастворимые производные разрушали амилоидные фибриллы мышечного Х-белка. Нам необходимо было проверить, как исследованные вещества действуют на другие фибриллярные системы мышц. Так как фибриллы актина являются одним из структурных

элементов еаркомера сократительного аппарата мышц, мы исследовали способность фуллерена С6о и его производных влиять на формирование фибрилл актина и взаимодействовать с ними in vitro.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АНТИАМИЛОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ФИЛАМЕНТООБРАЗОВАНИЕ АКТИНА

3.1. Исследование влияния комплексов фуллерена С60 с поливинилпирролидоном на филаментообразование актина.

Мышечный актин является глобулярным белком с преобладанием у него в структуре а-спирали. Актин способен строить длинные нити (Рис. 12). В мышечном саркомере их длина составляет около 1 мкм. Однако сформированные in vitro нити актина могут достигать нескольких микрометров.

При исследовании способности С6оПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) влиять на структуру нитей актина, показано, что данные комплексы не разрушали нити актина в течение 24ч. Мы также показали, что глобулярный актин в присутствии С60ПВП способен строить нити. То есть, С60ПВП не влияет на филаментообразование актина.

Эти данные свидетельствуют о специфическом взаимодействии С60 с амилоидами белков семейства тайтина и Ар-пептидами с последующим их разрушением, а не с фибриллами актина.

3.2 Исследование влияния натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60 на филаментообразование актина.

Было также исследовано влияние растворимой в воде натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60 на фибриллообразование актина. В ходе этого исследования выяснилось, что C6oCl(C6H4CH2COONa)5 разрушала нити актина. Кроме того, в присутствии данного производного фуллерена С6о, актин не формировал нити после 24 ч инкубации (Рис. 13).). Это можно объяснить тем, что молекула натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена Сбо имеет пять отрицательно заряженных (СОО~) групп, которые могут связываться с нитями актина, приводя к их разрушению.

г' KCl, pH 7.0. Негативное окрашивание 2%

■

. .1' »s«! водным раствором

|8 уранилацетата. Шкала

gä t Рис. 12. Электронная .'*.■■. микрофотография нитей актина в 0.1М растворе

100 нм.

'ЙШШ*

Рис. 13. Электронные микрофотографии: актина в присутствии СбоС1(СбН4СН2СООЫа)5, добавленной до (а) и после (б) образования филаментов.

Весовое соотношение актина и С6оС1(С6Н4СН2СООЫа)5 1:1. Инкубация 24 ч. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата.

Шкала 100 нм.

Анализируя полученные электронно-микроскопические данные о влиянии исследованных производных фуллерена С60 на филаментообразование актина, можно заключить, что гидрофобные взаимодействия вносят основной вклад в способность фуллерена Сбо связываться с патологическими для клетки амилоидными фибриллами и разрушать их, не нарушая структуры фибрилл актина. Однако результаты, полученные для C6oCl(C6H4CH2COONa)5, которая препятствовала формированию нитей актина и разрушала их, вызывают сомнения по поводу возможности её применения на биологических объектах. Окончательный вывод можно сделать после исследования токсичности этого производного фуллерена С60, также как и других его производных.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ФУЛЛЕРЕНА С60 И ЕГО ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

4.1. Исследование цитотоксичности натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С6о> фуллеренола и комплексов фуллерена С6о с поливинилпирролидоном.

Несмотря на множество данных, указывающих на отсутствие токсичности у фуллерена С6о, существют работы, свидетельствующие о его токсичности (Oberdorster, 2004; Sayes et al., 2005; Sayes, Gobin et al., 2005; Lyon et al., 2006; Fortner et al., 2005), что не позволяет рассматривать фуллерен и его производные как потенциальные антиамилоидные препараты. Мы изучили токсическое действие водорастворимых производных фуллерена С6о на культуре клеток карциномы гортани человека НЕр-2.

Исследование цитотоксичности фуллеренола и натриевой соли поли карбоксильного производного Сбо показало, что фуллеренол не оказывал токсического действия на клетки НЕр-2 в диапазоне концентраций 2 - 0,016 мг/мл в среде ДМЕМ с сывороткой, в то время как C6oCl(C6H4CH2COONa)5

оказывала выраженное токсическое действие в диапазоне исследуемых концентраций (Рис. 14).

Рис. 14. Исследование цитотоксического действия производных фуллерена Сй0: натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена Сбо> фуллеренола, а также комплексов фуллерена Сбо с

поливинилпирролидоном.

Концентрация, мг/мл

При исследовании цитотоксичности комплексов фуллерена С6о с поливинилпирролидоном выяснено, что оба комплекса С6оПВП (м.м. ПВП 25000 и 10000) не оказывали токсического действия на культуру клеток НЕр-2. В культуре клеток наблюдалась их 100% выживаемость при добавлении как комплексов С6оПВП, так и самих ПВП с молекулярными массами 25000 и 10000 в диапазоне концентраций 2-0,016 мг/мл (Рис. 14).

4.2. Исследование цитотоксичности С6(гМ02-пролина.

Нами также проведено исследование цитотоксичности одного из нитроксипроизводных фуллерена С60 - С60-НО2-пролина. Данное производное фуллерена С6о не оказывало токсического действия на культуру клеток НЕр-2 в диапазоне концентраций 0,2-0,001 мг/мл.

К сожалению, нам не удалось получить данные по цитотоксичности гидратированного фуллерена С6о и двух нитроксипроизводных фуллерена С60: Сбо-^ОгЬ-пролина и С6о-Н02-пролин-М02. Это связано с недостаточной для проведения данных исследований растворимостью препаратов. Однако есть данные для C6oHyFn, которые косвенно подтверждают отсутствие у него токсичности (Podolsky et al., 2006).

Таким образом, полученные данные о токсичности натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С6о наряду с её способностью разрушать актиновые нити исключают её дальнейшее использование этого производного на биологических объектах.

Комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном, фуллеренол и С6о-М02-пролин не проявили токсических эффектов в диапазоне исследуемых концентраций, что в сочетании с их выраженным антиамилоидным действием на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и А(3(1-42)-пептида мозга по

к 1П0 -

о а 30-

.т.

т-

о 60-

ьо-

о 40 -

<11

k 30-

о с 20-

10-

—»—ся пвп юооо

—•— С„ ПВП 25000 —ПВП 10000 —г-ПВП 25000 —4— C„CI(C(H4CH COONa), —&—Фуллеренол

данным ЭМ и флуориметрни открывает перспективы для дальнейших исследований этих веществ как потенциальных антиамилоидных препаратов.

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИАМИЛОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ

5.1. Сравнительная оценка эффективности фуллерена С60 и его водорастворимых производных на основе полученных экспериментальных данных.

В результате исследования антиамилоидного действия фуллерена С60 и его производных на фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга показана их способность разрушать амилоиды указанных белка и пептида и предотвращать их образование. Однако, как выяснилось, не для всех производных фуллерена антиамилоидный эффект можно определять флуоресцентным анализом. Это связано с тем, что многие производные фуллерена С6о способны поглощать свет в той же области, что и сам флуоресцентный краситель ТТ.

Для некоторых производных фуллерена С60 не удалось исследовать токсичность. Это связано с тем, что молекулы фуллерена способны быстро и необратимо агрегировать друг с другом, что сильно затрудняет или делает невозможным исследование токсичности на клеточной культуре. Способность фуллеренов агрегировать также может препятствовать его выведению из организма. Поэтому мы выделили наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества среди исследованных производных фуллерена С6о- В сводной таблице представлены основные свойства, на наш взгляд, определяющие эффективность изучаемых веществ. Среди них основным является антиамилоидный эффект, оказываемый фуллереном или его производными на амилоиды Х-белка и АР(1-42)-пептида, а также их токсические свойства. В данную таблицу не вошли другие исследованные нами препараты (ноопепт, дилепт, карнозин и др.), так как они не оказывали антиамилоидного действия на амилоиды Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга.

Из таблицы следует, что фуллеренол является наиболее эффективным и нетоксичным антиамилоидным веществом. Он не образует агрегатов, способен разрушать амилоиды и предотвращать их образование, нетоксичен и его антиамилоидный эффект можно регистрировать по интенсивности флуоресценции ТТ. Также в группу наиболее эффективных и нетоксичных антиамилоидных веществ можно отнести комплексы фуллерена Сбо с ПВП, поскольку наряду с сильными антиамилоидными свойствами эти комплексы обладают низкой токсичностью и низкой агрегационной способностью. Мы также показали, что оба комплекса не препятствуют филаментообразованию актина и не разрушают его нити in vitro.

Таким образом, среди всех исследованных производных фуллерена С6о были отобраны фуллеренол и комплексы фуллерена С60 с ПВП как наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты.

Фуллерен Сбо или его производное Анти амилоидный эффект на фибриллы мышечного X-белка и АР(1-42)-пептида мозга Токсичность Способность агрегировать Возможн ость исследова ния антиамил оидного эффекта флуоресц ентным методом

Гидратированн ый фуллерен (Cgo HyFn) Разрушает зрелые фибриллы и предотвращает их формирование Токсичность не могла быть исследована. Образуют сферические агрегаты -101 Юнм нет

Натриевая соль поликарбоксил ьного производного фуллерена Сбо Разрушает амилоидные фибриллы и предотвращает их образование Токсична на культуре клеток НЕр-2 в диапазоне концентраций 20,16 мг/мл нет да

Фуллеренол (полигидроксилиров анное производное фуллерена Сбо) Разрушает амилоидные фибриллы и предотвращает их образование Нетоксичен на культуре Нер-2 в диапазоне концентраций 20,16 мг/мл нет да

Комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролид оном (м.м. ПВП 10000 и 25000) Разрушают амилоидные фибриллы и предотвращают их образование Нетоксичны на культуре Нер-2 в диапазоне концентраций 20,16 мг/мл Образуют сферические агрегаты ~50-бОнм да'

Сбо-КОг-пролии (метиловый эфир L-N-[(2- нитроглицерил)фулл еренил]пролина) Снижает количество фибрилл и их длину относительно контроля Нетоксичен на культуре Нер-2 в диапазоне концентраций 0,20,0016 мг/мл Образуют агрегаты до 100 нм и более нет

Сбо-(КОг)2-пролин (метиловый эфир L-N-[(2,3- динитроглицерил)фу ллеренил]пролин) Снижает количество фибрилл и их длину относительно контроля Токсичность не могла быть исследована. Образуют агрегаты до 100 нм и более нет

Сбо^Ог-пролин-ЫОг (2- нитроксиэтилового эфира L-N-{[2-(нитрокси)этил]фулл еренил}пролина) Разрушает амилоидные фибриллы и предотвращает их образование Токсичность не могла быть исследована. нет да

1 Антиамилоидный эффект комплекса фуллерена С6о с ПВП (м.м. ПВП 10000) невозможно исследовать с помощью флуоресцентного анализа.

выводы

1. Обнаружены амилоидные свойства смитина - белка гладких мышц позвоночных.

2. Натриевая соль поликарбоксилыюго производного фуллерена С6о, комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном (м.м. ПВП 10000 и 25000), фуллеренол, C6o-N02-npojiHH, C60-(NO2)2-npo.™i, C6o-N02-npoJinii- N02 разрушали амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга и предотвращали их образование.

3. Комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном не препятствовали филаментообразованию актина и не разрушали его нити in vitro. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о разрушала нити актина, а также препятствовала их формированию.

4. Фуллеренол, С6о^02-пролин, а также комплексы фуллерена С60 с поливинилпирролидоном не обладали цитотоксическими свойствами, в то время как натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о проявляла цитотоксическое действие на культуре клеток НЕр-2.

5. На основании отобранных критериев (высокая антиамилоидная способность, отсутствие токсичности, низкие агрегационные свойства) сделано заключение о том, что фуллеренол и комплексы фуллерена С6о с поливинилпирролидоном являются наиболее эффективными и нетоксичными антиамилоидными веществами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Марсагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д., Трошин П.А., Подлубная З.А. Влияние фуллеренов на амилоиды Х-белка // Биофизика. 2009. Т. 54. выпуск 2. с. 202-205.

2. Бобылёв А.Г.. Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Амилоиды мышечного Х-белка семейства тайтина и Aß-пептидов мозга: тестирование эффективности антиамилоидных препаратов // Технологии живых систем. 2009. Т. 6. № 7. с. 46-53.

3. Бобылев А.Г.. Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Романова B.C., Котельникова P.A., Подлубная З.А. Действие нитропроизводных фуллерена С6о на фибриллы АР(1-42)-пептида мозга и мышечного Х-белка // Биофизика. 2010. Т. 55. вып. 3. с. 394-399.

4. Бобылёв А.Г.. Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А. Флуоресцентный анализ действия водорастворимых производных фуллерена С6о на амилоидные фибриллы Aß (1-42)-пептида мозга. // Биофизика. 2010. Т. 55. вып. 5. с. 780784.

5. Бобылёва Л.Г., Бобылёв А.Г.. Шпагина М.Д., Вихлянцев И.М., Фрейдина H.A., Подлубная З.А. Изучение амилоидных свойств гладкомышечного белка смитина. // Технологии живых систем. 2010. Т 7. № 8. с. 64-68.

6. Bobylev A.G., Kornev А. В., Bobyleva L. G., Shpagina М. D., Fadeeva I. S., Fadeev R. S., Deryabin D. G., Balzarini J., Troshin P. A., Podlubnaya Z. A.

Fullerenolates: Metallated Polyhydroxylated Fullerenes with Potent Antiamyloid Activity // Organic & Biomolecular Chemistry. 2011. V. 9. P. 5714-5719.

Тезисы.

7. Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Бобылёв А.Г.. Швецов Ю.А., Подлубная З.А. Влияние поликарбоксильного производного фуллерена на формирование амилоидных фибрилл А0(25-35) пептидом. // VII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Москва, 9 апреля, 2008. с. 38-39.

8. Марсагишвили Л.Г. Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А Антиамилоидогенное действие поликарбоксильного производного фуллерена на фибриллы Х-белка // Научные труды II съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», (под ред. А.И. Григорьева, Р.И. Сепиашвили, Ф.И. Фурдуй), «Медицина-здоровье». Кишинев, Молдова, 2931 октября 2008. с. 135.

9. Марсагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г. Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Разрушение амилоидных фибрилл Х-белка in vitro // Тезисы 12-й Международной Пущинской школы-конференции «Биология-наука 21 века». Пущино, 10-14 ноября, 2008. с. 40-41.

Ю.Бобылев А.Г.. Марсагишвили Л.Г., Пиотровский Л.Б., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Изучение антиамилоидной способности фуллеренов в in vitro системах. (Bobylev A.G., Marsagishvili L.G., Piotrovsky L.B., Shpagina M.L., Podlubnaya Z.A.' Study on antiamyloidogenic ability of fullerenes in in vitro systems) // Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология». Пущино, 25-28 июля, 2009. с. 110-111.

11.Марсагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д. Подлубная З.А. Роль тайтина и белков его семейства в образовании амилоидных фибрилл // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2-4 июня, 2009. с. 135-137.

12.Марсагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д. Подлубная З.А. Амилоиды Х-белка - модель для тестирования антиамилоидных препаратов // 1-я Международная научная школа Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Красновидово, 29 июня - 4 июля, 2009. с. 286-289.

13.Подлубная З.А., Марсагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г.. Шпагина М.Д. Электронно-микроскопическое тестирование антиамилоидных препаратов // 5-ый Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронауки для медицины и психологии». Судак, (Крым, Украина), 3-13 Июня, 2009. с. 181182.

14.Marsagishvili L.G. Bobylev A.G., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Concentration-dependent antiamyloid effect the sodium salt of the fiillerene polycarboxylic derivative C60C1(C6II4CII2COONa)5 on amyloids of muscle X-protein // Abstracts of XXXVII European Muscle Conference, Lille, France, 12th-16th September, 2009, p. 71.

15.Bobylev A.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A Effect of the fullerene C6oPVP on amyloids of muscle X-protein of the titin family // Abstracts of XXXVIII European Muscle Conference, Lille, France, 12th-16 September,

2009, p. 67.

16.Бобылёв А.Г.. Марсагишвили JI.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Эффект фуллерена С60 HyFn на амилоиды АР(1-42)-пептиды мозга // 13-ая Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 28 сентября - 2 октября, 2009. с. 92.

17.Podlubnaya Z.A., Marsagishvili L.G., Bobvlev A.G.. Shpagina M.D. Antiamyloidogenic preparations: in vitro testing // Fifth International Interdisciplinary Congress "Neuroscience for medicine and psychology". Sudak, Crimea, Ukraine, June 3-13,2009. p. 181-183.

18.Подлубная 3.A., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подольский И.Я., Вихлянцев И.М., Бобылёв А.Г., Федюшин А.А., Гордиенко Т.В., Островская Р.У., Гехт А.Б. Выяснение роли новых амилоидных саркомерных цитоскелетных белков в патогенезе амилоидозов с целью разработки методов их ранней диагностики и коррекции. // Сб. «Фундаментальные науки — медицине», (под ред. М.В. Угрюмова, А.А. Макоско, В.В. Круговых), «Слово». Москва, 2009. с. 30-31.

19.Бобылёв А.Г.. Фадеева И.С., Фадеев Р.С., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Пиотровский Л.Б., Трошин П.А., Подлубная З.А. Цитотоксическое действие водорастворимых производных фуллерена С6о Н 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века». Сб. тезисов, том 1, Москва, «ИП Скороходов В .А.». Пущино, 19-23 апреля, 2010. с. 106.

2Q.Bobvlev A.G.. Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Fadeeva I.S., Podlubnaya Z.A. Effect of derivative of fullerenes C60 on amyloid fibrils of brain AP(l-42)-peptide and X-protein. // In: Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies. Pushchino, Synchrobook, 2010. p. 49-51.

21.Podlubnaya Z.A. Bobvlev A.G.. Shpagina M.D., Romanova V.S., Kotelnikova R.A., Marsagishvili L.G. Effect of nitroderivative fullerenes C6o on amyloid fibrils of brain AP(l-42)-peptide // Abstr. Sixth International Interdisciplinary Congress "Neuroscience for medicine and psychology". Sudak, Crimea, Ukraine, June 5-15,

2010. p. 238.

22.Подлубная 3.A., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Бобылев А.Г., Гордиенко Т.В., Гехт А.Б., Котельникова Р.А., Пиотровский Л.Б., Островская Р.У., Трошин П.А. Сравнительное изучение in vitro амилоидогенеза мышечных белков и Ар-пептидов мозга для разработки методов ранней диагностики и терапии амилоидозов // Тезисы докладов совещания «Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении». Москва, 11-12 мая, 2010 с. 38-39.

23.Подольский И.Я., Подлубная З.А., Гордон Р.Я., Макарова Е.Г., Кордонец О.Л., Муганцева Е.А., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Бобылев А.Г., Годухин О.В., Гехт А.Б., Пиотровский Л.Б. Фуллерены С6о для разработки антиамилоидной терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона) // Тезисы докладов совещания

«Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении». Москва, 11-12 мая, 2010. с. 40-41.

24.Бобылёв А.Г.. Фадеева И.С., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Пиотровский Л.Б., Трошин П.А., Подлубная З.А. // Изучение антиамилоидного эффекта водораствворимых производных фуллерена С60 и их цитотоксичности // Сб.: «Медицинская физика-2010», III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии. Москва, МГУ, 21-25 июня, 2010. с. 357-359.

25.Бобылёв А.Г., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Фадеева И.С., Подлубная З.А. Исследование in vitro антиамилоидного действия комплексов фуллерена С6о с поливинилпирролидоном на амилоиды Aß(l-42) пептида мозга // XXI съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Калуга, 19-25 сенября,

2010. с. 73.

26.Подлубная З.А., Бобылёва Л.Г., Бобылёв А.Г.. Вихлянцев И.М., Шпагина М.Д. Новые амилоидные белки скелетных, сердечных и гладких мышц позвоночных: их возможное участие в мышечных амилоидозах. // Тезисы к школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности». Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова, 1-4 февраля,

2011. с. 83.

27,Окунева А.Д., Бобылёва Л.Г., Бобылёв А.Г.. Шпагина М.Д., Вихлянцев И.М., Фрейдина H.A., Подлубная З.А. Изучение амилоидных свойств гладкомышечного белка смитина//Тезисы к 15-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино, 18-22 апреля, 2011. с. 195.

28.Podlubnaya Z.A., Bobylev A.G.. Bobyleva L.G. Comparative study amyloidogenesis of brain Abeta peptides and muscle proteins // Abstr. Seventh International Interdisciplinary Congress "Neuroscience for medicine and psychology". Sudak, Crimea, Ukraine, June 3-13, 2011. c. 338.

29.Бобылева Л.Г., Окунева А.Д., Бобылёв А.Г., Подлубная З.А. Возможность участия смитина в процессах сигнализации в гладких мышцах // Сб.: (Международная конференция) «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (под ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесникова, A.B. Бережнова). Пущино, 24-26 мая, 2011. с. 4.

Список использованных сокращений: ДМЕМ - модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, КК - Конго красный, мкл - микролитр, мМ -миллимоль, мкМ - микромоль, мкм - микрометр, нм - нанометр, ПВП -поливинилпирролидон, TT - тиофлавин Т, ЭМ — электронная микроскопия, HyFn - гидратированный фуллерен, FBS - эмбриональная бычья сыворотка.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации «Ведущие научные школы», НШ-217.2008.4, программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грантов РФФИ № 0904-01161, РФФИ № 10-04-00141 и гранта Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0710.

Подписано в печать:

12.08.2011

Заказ № 5775 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобылёв, Александр Геннадьевич

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. АМИЛОИДОЗЫ.

1.1. Распространенность амилоидозов и их проявление.

1.2. История изучения амилоидозов.

1.3. Современные представления о строении и формировании амилоидов.

1.4. Изучение амилоидных агрегатов in vitro.

Глава 2. МЫШЕЧНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА

ТАЙТИНА.

2.1. Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка.

2.2. Структура и функции смитина гладких мышц.

Глава 3. ФУЛЛЕРЕНЫ.

3.1. Открытие фуллеренов.

3.2. Методы получения фуллеренов.

3.3. Строение молекулы фуллерена С60.

3.4. Водорастворимые производные фуллеренов.

3.5. Применение фуллеренов в биологии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга"

Амилоидные агрегаты - основной признак амилоидозов, конформационных болезней человека и животных, наступающих в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белка. Амилоидные агрегаты можно разделить на два класса: амилоидные фибриллы, представляющие собой высокоупорядоченные структуры и аморфные агрегаты, не имеющие упорядоченной структуры. Известно, что амилоидные агрегаты имеют ряд специфических тинкториальных и физико-химических характеристик (способность связываться с красителями Конго красным и тиофлавином Т, богатая ß-складчатостью структура, двойное лучепреломление в поляризованном свете, нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к протеазам) (Dobson, 2004; Ross & Poirier, 2004; Uversky & Fink, 2004). Накопление белка в виде амилоидных агрегатов связано более чем с 25 разными тяжелыми и неизлечимыми заболеваниями человека. Эти заболевания включают амилоидоз, связанный с гемодиализом, диабет II типа, болезни Паркинсона, Хантингтона, Альцгеймера и др. (Dobson, 2004; Uversky & Fink, 2004; Wang & Good, 2005; Gruden et al., 2004; Wilhelm et al., 2007).

Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна. Установление белковой природы амилоидных депозитов и их свойств, выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Одним из эффективных подходов к решению этих задач является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, открытие факторов, регулирующих их образование и разрушение, и эффектов на жизнедеятельность клеток и т.д.

Ранее в нашей лаборатории были открыты амилоидные свойства четырех белков скелетных и сердечной мышц. Показано, что белки семейства тайтина (тайтин, С-, X-, Н-белки), составляющие около 15% от общего количества саркомерных белков, способны формировать амилоидные фибриллы в условиях, близких к физиологическим (Марсагишвили и др., 2005; Подлубная и Марсагишвили, 2008). Легкость, с которой эти белки формируют амилоиды, обусловлена наличием у них -90% ß-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидов. В связи с тем, что амилоидные отложения находят в кровеносных сосудах, нашей задачей было продолжить исследования, направленные на поиск новых амилоидных белков в мышцах, и в частности, изучить амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина (аналога тайтина скелетных и сердечной мышц). Поскольку смитин имеет молекулярную структуру, подобную тайтину скелетных и сердечной мышц (Kim & Keller, 2002); мы предположили, что смитин также может легко формировать амилоиды. Подтверждению этого предположения посвящена первая часть диссертационной работы.

Основная стратегия терапии амилоидозов - разрушение амилоидных фибрилл или предотвращение их образования, поэтому вторая часть диссертационной работы посвящена in vitro исследованию способности фуллерена С6о и его производных разрушать амилоиды Aß( 1 -42)-пептида мозга, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера, и амилоиды мышечного Х-белка. Важность использования фуллерена С60 в этих исследованиях обусловлена наличием у него таких положительных свойств, как нейропротекция и сильные антиоксидантные свойства (Dugan et al., 1996; Chiang et al., 1995; McEwen et al., 1992). Для тестирования антиамилоидного эффекта фуллерена Сбо и его производных был выбран мышечный Х-белок, благодаря его способности in vitro строить спирально скрученные амилоидные фибриллы, подобные фибриллам Aß-пептидов мозга, разрушение которых можно легко оценивать с помощью электронной микроскопии. С помощью этого метода была показана способность гидратированного фуллерена Сбо разрушать амилоидные фибриллы Х-белка и А(3(25-35)-пептида мозга (Подлубная и Марсагишвили, 2008). Однако низкая растворимость гидратированного фуллерена Сбо затрудняла его использование как потенциального препарата для эффективной антиамилоидной терапии. Это стимулировало наши исследования антиамилоидного эффекта водорастворимых производных фуллерена С6о на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка в сравнении с их эффектом на амилоидные фибриллы АР(1-42)-пептида мозга.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поиск новых амилоидных мышечных белков и тестирование подходов к разрушению амилоидов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выяснить способность гладкомышечного белка смитина формировать амилоиды in vitro.

2. Изучить антиамилоидное действие фуллерена С60 и его водорастворимых производных на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга.

3. Изучить влияние антиамилоидных веществ на филаментообразование актина.

4. Исследовать цитотоксичность фуллерена С60 и его водорастворимых производных.

5. Провести сравнительную оценку эффективности антиамилоидных веществ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бобылёв, Александр Геннадьевич

выводы

1. Обнаружены амилоидные свойства смитина - белка гладких мышц позвоночных.

2. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о, комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном (м.м. ПВП 10000 и 25000), фуллеренол, Сбо-Ж)2-пролин, С6о-(М02)2-пролин, C6o-N02-npoflHH-N02 разрушали амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга и предотвращали их образование.

3. Комплексы фуллерена С60 с поливинилпирролидоном не препятствовали филаментообразованию актина и не разрушали его нити in vitro. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о разрушала нити актина, а также препятствовала их формированшо.

4. Фуллеренол, Сб<г^Ю2-пролин, а также комплексы фуллерена С60 с поливинилпирролидоном не обладали цитотоксическими свойствами, в то время как натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С6о проявляла цитотоксическое действие на культуре клеток НЕр-2.

5. На основании отобранных критериев (высокая антиамилоидная способность, отсутствие токсичности, низкие агрегационные свойства) сделано заключение о том, что фуллеренол и комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном являются наиболее эффективными и нетоксичными антиамилоидными веществами.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации «Ведущие научные школы», НШ-217.2008.4, программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грантов РФФИ № 09-0401161, РФФИ № 10-04-00141 и гранта Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0710.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "а-спираль - р-складчатость", что, как правило, требует жестких условий, несовместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и др.). Белки семейства тайтина скелетных мышц, открытые нами ранее, способны быстро формировать амилоиды благодаря наличию в их структуре около 90% Р-складчатости.

Поскольку амилоидные отложения также находят в гладкомышечной ткани, в том числе и в сосудах, мы изучили амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина — аналога тайтина скелетных мышц. Молекулы смитина гладких мышц, которые мы исследовали, состоят также как тайтин и Х-белок из иммуноглобулин -и фибронектин-подобных доменов и содержат ~90% Р-складчатой структуры, необходимой для формирования амилоидных фибрилл in vitro. Нами впервые было показано, что смитин гладких мышц желудка кролика может формировать аморфные амилоидные агрегаты, подобные аморфным агрегатам, которые формируют белки семейства тайтина скелетных мышц. Амилоидная природа аморфных агрегатов смитина была нами подтверждена спектральными методами по связыванию их с красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т, пополнив тем самым ряд открытых нами ранее белков-предшественников амилоидов семейства тайтина. Способность таких высокомолекулярных белков как тайтин формировать амилоиды в течение короткого времени в мягких условиях вызывает опасения в связи с их возможным участием в патогенезе мышечных амилоидозов, как наименее изученных.

Нами показано также, что благодаря структурному сходству разных амилоидных фибрилл возможны сходные подходы к их разрушению, а вероятно, и к терапии амилоидозов. С помощью электронной микроскопии был продемонстрирован in vitro антиамилоидный эффект гидратированного фуллерена Сбо на амилоиды Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга. Это свойство фуллерена С6о открывает перспективы для его использования как эффективного антиамилоидного препарата в терапии амилоидозов. Однако этому препятствует низкая растворимость гидратированного фуллерена Сбо в полярных растворителях. Поэтому мы исследовали антиамилоидный эффект водорастворимых производных фуллерена С6о: натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С6о, фуллеренола, комплексов фуллерена С60 с поливинилпирролидоном (м.м. ПВП 25000 и 10000), Сбо-МОг-пролина, Сб0-(МО2)2-пролина, Сб0-Ж)2-пролин-МО2. С помощью электронной микроскопии нами показано, что натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С60, фуллеренол, C60-NO2-nponmi-N02 и оба комплекса фуллерена Сбо с ПВП способны не только разрушать амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, но и предотвращать их образование. Показано также, что C60-NO2-npojiHH и C6o-(N02)2-пролин разрушали амилоидные фибриллы Х-белка и Ар(1-42)-пептида, уменьшая их длину и количество относительно контроля.

Антиамилоидный эффект, открытый нами с помощью ЭМ для натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена Сб0, фуллеренола, комплекса фуллерена С60 с ПВП (м.м. ПВП 25000) и С6о-Ж)2-пролин-Ж)2 был подтвержден флуоресцентным анализом, что повышало надежность оценки наиболее эффективных антиамилоидных веществ.

Для того, чтобы проверить возможность связывания фуллерена и его производных с неамилоидными фибриллярными агрегатами мышечных белков, нами было исследовано влияние натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60 и комплексов фуллерена С60 с ПВП (м.м. ПВП 25000 и 10000) на фибриллообразование актина. С помощью электронной микроскопии было показано, что комплексы фуллерена С6о с ПВП не препятствовали агрегации актина и не разрушали его нити. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сбо, напротив, препятствовала образованию нитей актина и разрушала его нити. Способность к разрушению нитей актина натриевой солью поликарбоксильного производного фуллерена С6о вызывает опасения по поводу его возможности использования на биологических объектах.

В литературе часто встречаются работы, описывающие токсические свойства фуллеренов. Поэтому мы исследовали цитотоксические эффекты производных фуллерена Сбо- В результате этих исследований было выяснено, что натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сбо обладала цитотоксичностью в культуре клеток НЕр-2. Напротив, фуллеренол, C6o-N02пролин, С6(галанин, а также оба комплекса фуллерена С6о с ПВП не проявляли цитотоксических свойств.

Основываясь на данных электронно-микроскопического и спектрального анализа антиамилоидного действия исследованных производных фуллерена С60, а также на оценке их цитотоксичности нами были отобраны фуллеренол и комплексы фуллерена с ПВП, как наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества.

Таким образом, нами был разработан комплексный подход к тестированию антиамилоидных препаратов, в результате которого были выбраны нетоксичные производные фуллерена с наиболее выраженными антиамилоидными свойствами. Отобранные нами вещества можно рассматривать как возможные препараты для замедления или предотвращения развития амилоидозов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобылёв, Александр Геннадьевич, Пущино

1. Барсуков А., Шустов С., Шкодкин И., Воробьев С., Пронина Е. (2005) Гипертрофическая кардиомиопатия и амилоидоз сердца // Врач Вып. 10. С. 42-46.

2. Бочвар Д.А., Гальперн Е.Г. (1973) О гипотетических системах карбо до декаэдре, s-икосаэдре и карбо-Б-икосаэдре II Докл. Акад. Наук СССР, Т. 209. № 3. С. 610-612.

3. Виноградова О.М. (1980) Первичный и генетические варианты амилоидоза // М. Медицина 224 с.

4. Вихлянцев И.М. (2005) Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации // диссертационная работа. Пущино. 105 с.

5. Зейналов Э.Б. (2007) Фуллерены: Информационный сборник (1991-2006) // Под ред. М.И. Рустамова. Баку: «Нурлан», 521с.

6. Ю.Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Емельяненко В.И., Подлубная З.А. (2005) Саркомерные белки семейства тайтина образуют амилоиды // Биофизика. Т. 50. № 5. С. 803-809.

7. П.Мягкова Л.П. (2000) Энтеропатический амилоидоз: особенности клинических проявлений, место среди других форм амилоидоза // Клиническая медицина. № 1. С. 11—14.

8. Пиотровский Л.Б. (2005) Фуллерены в биологии и медицине: проблемы и перспективы // Сб. статей. «Фундаментальные направления молекулярной медицины» Спб.: Росток., С. 195-268.

9. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. (2006) Фуллерены в биологии // СПб. ООО "Росток" с. 336.

10. Подвысоцкий В.В. (1905) Основы общей и экспериментальной патологии // СПБ. Изд. К.Л. Риккера. 780 с.

11. Подлубная З.А., Подольский И.Я., Шпагина М.Д., Марсагишвили Л.Г. (2006) Электронно-микроскопическое изучение влияния фуллерена на формирование амилоидных фибрилл Ар25-35 пептидом // Биофизика. Т. 51. № 5. С. 795-798.

12. Подлубная З.А., Марсагишвили Л.Г. (2008) Новые амилоидные белки семейства тайтина и их свойства: перспективы для диагностики амилоидозов //Технологии живых систем. Т. 5. № 5-6. С 11-21.

13. Сидоров Л.Н., Болталина О.В. (2002) Эндоэдральные и экзоэдральные фторпроизводные фуллеренов// Успехи химии. Т. 71. С. 611-640.

14. Akaishi T., Morimoto T., Shibao M., Watanabe S., Sakai-Kato К., Utsunomiya-Tate N., Abe К. (2008) Structural requirements for the flavonoid fisetin in inhibiting fibril formation of amyloid beta protein // Neurosci Lett. V. 444, P. 280285.

15. Ali F., Pare P.D., Seow C.Y. (2005). Models of contractile units and their assembly in smooth muscle // Can. J. Physiol Pharmacol. V. 83. P. 825-831.

16. Andersson K., 01ofsson,A., Nielsen E.H., Svehag S.E., Lundgren E. (2002) Only amyloidogenic intermediates of transthyretin induce apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 294. P. 309-314.

17. Andersson T., Westman G., Wennerstrom 0.5 Sundahl M. (1994) NMR and UV-VIS investigation of water-soluble fullerene-C60-g-cyclodextrin // J. Chem. Soc. Perkin Trans. V. 2. P. 1097-1101.

18. Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S., Vaschenko L.A. (1995) On the product of an aqueous colloidal solution of fullerenes // J. Chem. Soc. Chem. Commun. V. 12. P. 1281-1282.

19. Bagby, R. (1986). Toward a comprehensive three-dimensional model of the contractile system of vertebrate smooth muscle cells // Int. Rev. Cytol. V. 105. P. 67-128.

20. Bahler M., Moser H., Eppenberger H.M., Wallimann T. (1985) Heart C-protein is transiently expressed during skeletal muscle development in the embryo, but persists in cultured myogenic cells II Develop. Biol. V. 112. P. 345-352.

21. Bauer H.H., Aebi U., Haner M., Hermann R., Muller M, Merkle H.P. (1995) Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies prodused by in vitro aggregation of human calcitonin. II J. Struct. Biol V. 115. P. 1-15.

22. Beck M., Mandy G. 1(997) Solubility of C60 // Full. Sci. Technol. V. 5. P. 291310.

23. Begum N., Song Y., Rienzie J., Ragolia L. (1998). Vascular smooth muscle cell growth and insulin regulation of mitogen-activated protein kinase in hypertension

24. II Am. J. Physiol. V. 275. P. C42-C49.

25. Bennhold H. (1922) Eine spezifische Amyloidfarbung mit Kongorot // Miinchen Med Wochenschr V. 69. P. 1537-1538.

26. Bennett P., Starr R., Elliott A., Offer G. (1985) The structure of C-protein and X-protein molecules and a polymer of X-protein // J. Mol. Biol. V. 184. P. 297-309.

27. Bensasson R.V., Bienvenue E., Dellinger M., Leach S., Seta P. (1994) C60 in model biological systems a visible-UV absorption study of solvent-dependent parameters and solute aggregation // J. Phys. Chem. V. 98. P. 3492-3500.

28. Berson J.F., Theos A.C., Harper D.C., Tenza D., Raposo G., Marks M.S. (2003) Proprotein convertase cleavage liberates a fibrillogenic fragment of a resident glycoprotein to initiate melanosome biogenesis // J. Cell Biol V. 161. P. 521-533.

29. Blake C.C.F., Serpel L.C. (1996) Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transtyretin amyloid fibrils is a continuous P-sheet helix // Structure V. 4. P. 989-998.

30. Blake C.C.F., Serpel L.C. Sunde M., Sangren O., Lundgren E. (1996) A molecular model of the amyloid fibrils. The nature and origin of amyloid fibrils // Ciba Found. Simp. V. 199. P. 6-21.

31. Bullard-Dillard R., Creek K.E., Scriwens W.A., Tour J.M. (1996) Tissue sites of uptake of 14C-labeled Cm II Bioorg. Chem. V. 24. P. 376-385.

32. Byeon S.R., Lee J.H., Sohn J.H., Kim D.C., Shin K.J., Yoo K.H., Mook-Jung I., Lee W.K., Kim DJ. (2007) Bis-styrylpyridine and bis-styrylbenzene derivatives as inhibitors for Abeta fibril formation // Bioorg. Med. Chem. Lett. V. 17. P. 14661470.

33. Byun J.H., Kim H., Kim Y., Mook-Jung I., Kim D.J., Lee W.K., Yoo K.H. (2008) Aminostyrylbenzofuran derivatives as potent inhibitors for Abeta fibril formation II Bioorg. Med. Chem. Lett. V. 18. P. 5591-5593.

34. Callaway J.E., Bechtel P.J. (1981) C-protein from rabbit soleus (red) muscle // Biochem. J. V. 195. P. 463-469.

35. Cataldo F., Haymann D. (1999) Effects of intense ultrasound treatment of C60 solutions // Full. Sci. Technol. V. 7. P. 725-732.

36. Chamberlain A.K., MacPhee C.E., Zurdo J., Morozova-Roche L.A., Hill H.A., Dobson C.M., Davis J.J. (2000) Ultrastructural organization of amyloid fibrils byatomic force microscopy // Biophys. J. V. 79. P. 3282-3293.

37. Chapman M.R., Robinson L.S., Pinkner J.S., Roth R., Heuser J., Hammar M., Normark S., Hultgren S.J. (2002) Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation // Science V. 295. P. 851-855.

38. Chi R.J., Olenych S.G., Kim, K., Keller T.C., III (2005) Smooth muscle alpha-actinin interaction with smitin // Int. J.Biochem.CellBiol. V. 37. P. 1470-1482.

39. Chiang L.Y., Lai Y.-L., Tsai M.-C., Lee Y.-T., Huang H.-C., Lai M.-K., Lu F.-J. (1999) Therapeutic use of water-soluble fullerene derivatives // U.S. Patent 5994410, November 30.

40. Chiang L.Y., Lu F.-J., Lin J.-T. (1995) Free radical scavenging activity of water-soluble fullerenols // J. Chem. Soc. Chem. Commun. V.12. P. 1283-1284.

41. Chiang L.Y., Swirczewski J.W., Hsu C.S., Chowdhury S.K., Cameron S., Creegan K. (1992) Multi-hydroxy additions onto C6o fullerene molecules // J. Chem. Soc. Chem. Commun. P. 1791-1793.

42. Chiang L.Y., Upasani R.B., Swirczewski J.W. (1993) Evidence of hemiketals incorporated in the structure of fullerenols derived from aqueous acid chemistry // J. Am. Chem. Soc. V. 115. P. 5453-5457.

43. Chiang L.Y., Wong L.Y., Swirczewski J.W., Soled S., Cameron S. (1994) Efficient synthesis of polyhydroxyated fiillerence derivatives via hydrolysis of polycyclosulfated precursors // J. Org. Chem. V. 59. P. 3960-3968.

44. Chien P., Weissman J.S., DePace A.H. (2004) Emerging principles of conformation-based prion inheritance // Annu. Rev. Biochem. V. 73. P. 617-656.

45. Chiron J., Lamande J., Moussa F., Trivin F., Ceolin R. (2000) Effect of «micronized» C6o fullerene on the microbial growth in vitro in French. // Ann. Pharm. Fr. V. 58. P. 170-175.

46. Chiti F., Dobson C.M. (2006) Protein misfolding, functional amyloid, and human disease // Annu. Rev. Biochem. V. 75. P. 333-366.

47. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson C. (1999) Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils // PNAS V. 96. P. 3590-3594.

48. Clark K.A., McElhinny A.S., Beckerle M.C., Gregorio C.C. (2002). Striated muscle cytoarchitecture: an intricate web of form and function // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. V. 18. P. 637-706.

49. Conway K.A., Rochet J.C., Bieganski R.M., Lansbury P.T. (2001) Kinetic stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine-alpha-synuclein adduct // Science V. 294. P. 1346-1349.

50. Cooke P. (1983) Organization of contractile fibers in smooth muscle // Cell Muscle Motil. V. 3. P. 57-77.

51. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. (1997) The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog // Proc. Natl. Acad. Set USA V. 94. P. 9773-9778.

52. Craig R., Offer G. (1976) Localization of C-protein in rabbit skeletal muscle // Proc. Roy. Soc. Lond. B. V. 192. P. 451-461.

53. Da Ros T., Prato M. (1999) Medicinal chemistry with fullerenes and fullerene derivatives chemical communications // Chem. Commun. P. 663-669.

54. Deguchi S., Alargova R.G., Tsujii K. (2001) Stable dispersion of fullerenes, C6o and C70 in water. Preparation and characterization // Langmuir V. 17. P. 60136017.

55. Dobson C.M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci. V. 9. P. 329-332.

56. Dobson C.M. (2004) Principles of protein folding, misfolding and aggregation // Semin. Cell Dev. Biol. V. 15. P. 3-16.

57. Draper M.H., Hodge A.J. (1949) Electron microscopy of muscle // Austr. J. Exp. Biol. Med. Sci. V. 27. P. 465-483.

58. Dugan L.L., Gabrielsen J.K., Yu S.P., Lin T.S., Choi D.W. (1996) Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and apoptotic death of cultured cortical neurons // Neurobiology of Disease. V. 3. P. 129-135.

59. Dugan L.L., Lovett E.G., Quick K.L., Lotharius J., Lin T.T., O'Malley K.L. (2001) Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders // Parkinsonism Relat. Disord. V. 7. P. 243-246.

60. Dugan L.L., Turetsky D.M., Du C., Lobner D., Wheeler M., Almli C.R., Shen C.K.F., Luh T.-Y., Choi D.W., Lin T.-S. (1997) Carboxyfullerenes as neuroprotective agents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 94. P. 9434-9439.

61. Eaglestone S.S., Cox B.S., Tuite M.F. (1999) Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae.by environmental stress through a prion-mediated mechanism // EMBO J. V. 18. P. 1974-1981.

62. Einheber S., Fischman D.A. (1990) Isolation and characterization of a cDNA clone encoding avian skeletal muscle C-protein: an intracellular member of the immunoglobulin superfamily II Proc Natl Acad Sei USA. V. 87 (6). 2157-2161.

63. Feuer G., Molnar F., Pettko E., Straub F.B. (1948) Studies on the composition and polymerization of actin // Hung. Acta Physiol. V. 1 (4-5). P. 150-163.

64. Fortner J.D., Lyon D.Y., Sayes C.M., Boyd A.M. (2005) C60 in water: Nanocrystal formation and microbial response // Environ. Sei. Technol. V. 39. P. 4307-4316

65. Franzini-Armstrong G., Porter K.R. (1964) Sarcolemmal invaginations constituting the T-system in fish muscle tiber // J. Cell Biol. V. 22. P. 675-696.

66. Friedman S.H., DeCamp D.L., Sijbesma R.P., Srdanov G., Wudl F., Kenyon G.L. (1993) Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives: model binding studies and experimental verification // J. Am. Chem. Soc. V. 115. P. 6506-6509.

67. Friedman S.H., Ganapathi P.S., Rubin Y, Kenyon G.L. (1998) Optimizing the binding of fullerene inhibitors of the HIV-1 protease thought predicted increases in hydrophobic desolvation // J. Med. Chem. V. 41. P. 2424-2429.

68. Friedman S.H., Schinazi R.F. Wudl F., Hill C.L., DeCamp D.L., Sijbesma R.P., Kenyon G.L. (1998) Water soluble fiillerenes with antiviral activity // U.S. Patent 5811460. September 22.

69. Friedman S.H., Schinazi R.F., Wudl F., Hill C.L., DeCamp D.L., Sijbesma R.P., Kenyon G.L. (2001) Water soluble fullerenes with antiviral activity // U.S. Patent 6204391. March 20.

70. Fritz* J.D., Swartz D.R., Greaser M.L. (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins // Analyt. Biochem. V. 180. P. 205-210.

71. Fürst D.O., Vinkemeier U., Weber K. (1992) Mammalian skeletal muscle C-protein: purification from bovine muscle, binding to titin and the characterization of a full-length human cDNA // J Cell Sei. V. 102. P. 769-778.

72. Glenner G., Eanes E., Bladen H., Linke R. (1974) p-plated sheet fibrils. A comparison of native amyloid with synthetic protein fibrils // J. Histochem. Cytochem. V. 22. P. 1141-1158.

73. Godfrey J.E., Harrington W.F. (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimmer equilibrium // Biochemistry. V. 9 (4). P. 894-908.

74. Goers J., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Uversky V.N., Fink A.L. (2002) Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation // Biochem. V. 41. P. 12546-12551.

75. Goldsbury C.S., Cooper G.J., Goldie K.N., Muller S.A., Saafi E.L., Gruijters W.T. et al. (1997) Polymorphic fibrillar assembly of human amylin. II J. Struct. Biol. V. 119. P. 17-27.

76. Goldsbury C.S., Wirtz S., Muller S.A., Sunderji S., Wicki P., Aebi U., Frey P. (2000) Studies on the in vitro assembly of AP(l-40): implications for the search for Ap fibril formation inhibitors II J. of Struct. Biol. V. 130. P. 217-231.

77. Granzier, H., Labeit, D., Wu, Y., & Labeit, S. (2002). Titin as a modular spring: emerging mechanisms for elasticity control by titin in cardiac physiology and pathophysiology. II J. Muscle Res. Cell Motil. V. 23. P. 457-471.

78. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.

79. Haas C., Mandelkow E. (2010) Fyn-tau-amyloid: a toxic triad. II Cell. V. 142. P. 356-358.

80. Hanson J., O'Brien E. J., Bennett P. M. (1971) Structure of the myosin-containing filament assembly (A-segment) separated from frog skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 58. P. 865-871.

81. Harper J.D., Lansbury P.T. (1997) Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins // Annu. Rev. Biochem. V 66. P. 385-407.

82. Harrison R.F., Hawkins P.N., Roche W.R., MacMahon R.F.T., Hubscher S.G., Buckels J.A.C. (1996) "Fragile" liver and massive hepatic hemorrhage due to hereditary amyloidoses // Gut V. 38. P. 151-152.

83. Hartzell H.C. (1985) Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase HJ. Moll. Biol. V. 186. P. 185-195.

84. Hartzell H.C., Glass D.B. (1984) Phosphorylation of purified cardiac muscle C-protein by purified cAMF-dependent and endogenous Ca -calmodulin-dependent protein kinases // J. Biol. Chem. V. 259. P. 15587-15596.

85. Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. (2003) Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases // Neuromolekular Med. V. 4. P. 21-36.

86. Hawkins J.M., Lewis T.A., Loren S.D., Meyer A., Heath J.R., Shibato Y., Saykally R.J. (1990) Organic chemistry of C60 (Buckminsterfullerene): chromatography and osmylation // J. Org. Chem. V. 55. P. 6250-6252.

87. Hirch A. (1995) Addition reactions of buckminsterfullerene (C60) // Synthesis. P. 895-913.

88. Hirch A. (1997) Aspects of organic chemistry of fullerenes // J. Phys. Chem. Solids. V. 58. P. 1729-1740.

89. Hirch A. (1996) Principles of fiillerene reactivity // Topics in Current Chemistry V. 199. P. 1-65.

90. Hirch A., Lampart I., Karfunkel H.R. (1994) Fullerene chemistry in three dimensions: isolation of seven regioisomeric bisadducts and chiral trisadducts of C60 and di(ethoxy-carbonyl) methylene // Angew. Chem. Int. Ed. V. 33. P. 437438.

91. Hodgkinson, J. L., Newman, T. M., Marston, S. B., Severs, N. J. (1995). The structure of the contractile apparatus in ultrarapidly frozen smooth muscle: freeze-fracture, deep-etch, and freeze-substitution studies. // J.Struct.Biol. V. 114. P. 93-104.

92. Iconomidou V.A., Vriend G., Hamodrakas S.J. (2000) Amyloids protect the silkmoth oocyte and embryo H FEBS Lett. V. 479. P. 141-145.

93. Isaacs N.S., Nicols P.J., Raston C.L., Sandoval C.A., Young D.L. (1997) Solution volume studies of a deep cavity inclusion complex of C60: p-benzyl calyx5.arene // J. Chem. Soc. Chem. Commun. P. 1839-1840.

94. Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I. (1996) Biological applications of fullerenes // Bioorg. Med. Chem. V. 4. P. 767-779.

95. Jimenez J.L., Nettleton E.J., Bouchard M., Robinson C.V., Dobson C.M., Saibil H.R. (2002) The protofilament structure of insulin amyloid fibrils // PNAS V. 99. P. 9196-9201.

96. Johansson J. (2003) Molecular determinants for amyloid fibril formation: lessons from lung surfactant protein C // Swiss Med. WKLY. V. 133. P. 275-282.

97. Kasermann F., Kempf C. (1998) Buckminsterfiillerene and photodynamic inactivation of viruses // Rev. Med. Virol V. 8. P. 143-151.

98. Keller T.C., III (1995). Structure and function of titin and nebulin // Curr. Opin .CellBiol.V. 7. P. 32-38.

99. Kenney J.M., Knight D., Wise M.J., Vollrath F. (2002) Amyloidogenic nature of spider silk // Eur. J. Biochem. V. 269. V. P. 4159-4163.

100. Kim K., Keller T.C., III (2002) Smitin, a novel smooth muscle titin-like protein, interacts with myosin filaments in vivo and in vitro // J. Cell Biol V. 156. P. 101-111.

101. Kim H., Park B.S., Lee K.G., Choi C.Y., Jang S.S., Kim Y.H., Lee S.E. (2005) Effects of naturally occurring compounds on fibril formation and oxidative stress of beta-amyloid // J. Agric. Food Chem. V. 53. P. 8537-8541.

102. Kim J.E., Lee M. (2003) Fullerene inhibit p-amyloid peptide aggregation // BBRC V. 303 P. 576-579.

103. Kim Y., Randolph T.W., Stevens F.J., Carpenter J.F. (2002) Kinetics and energetics of assembly, nucleation, and growth of aggregates and fibrils for an amylodogenic protein // J. Biol Chem. V. 277. P. 27240-27246.

104. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. (1989) Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation // J. Histochem. Cytochem. V. 37. P. 1273-1281.

105. Ko W.-B., Baek K.-N. (2002) The oxidation of fullerene C70. with various oxidants by ultrasonication // Ultrasonics V. 39. P. 729-733.

106. Koretz J.F. (1979) Effect of C-protein on synthetic myosin filament structure II Biophys. J. V. 27. P. 433-446.

107. Koretz J.F., Coluccio L.M., Bertasso A.M. (1982) The aggregation characteristics of column-purified rabbit skeletal myosin in the presence and absence of C-protein at pH 7.0 II Biophys. J. V. 37. P. 433-440.

108. Kratschmer W., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Huffinan D.R. (1990) Solid C60: a new form of carbon //Nature (London) V. 347. P. 354-358.

109. Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. (2005) The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications // J. Struct. Biol. V. 149. P. 3037.

110. Kroto H.W., Heath J.R., O'Brien S.C., Curl R.F., Smalley R.E. (1985) "C.sub.60: Buckminsterfullerene" //Nature V. 318. P. 162-163.

111. Krusic P.J., Wasserman P.N., Keizer P.N., Morton J.R., Preston K.F. (1991) Radical reactions of C60II Science V. 254. P. 1183-1185.

112. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 //Nature. V. 227 (5259). P. 680-685.

113. Lai Y.L., Chaing L.Y. (1997) Water-soluble fiillerene derivatives attenuate exsanguination-induced bronchoconstriction of guineapigs // J. Auton. Pharmacol. V. 17. P. 229-235.

114. Lansbury P.T. (1999) Evolution of amyloid: what normal protein folding may tell us about fibrillogenesis and disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 3342-3344.

115. Lee E.K., Park Y.W., Dong Y.S., Mook-Jung I., Yoo Y.J. (2006) Cytosolic amyloid-p peptide 42 escaping from degradation induces cell death // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 344. P. 471-477.

116. LeVine III H. (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease p-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution // Prot. Sci. V. 2. P. 404-410.

117. LeVine III H. (1995) Thioflavine T interactions with amyloid P-sheet structures // Amyloid. V. 2. P. 1-6.

118. Lin Y.-L., Lei H.-Y., Luh T.-Y., Chou C.-K., Liu H.-S. (2000) Light-independent inactivation of dengue-2 virus by carboxyfullerene C3 isomer // Virology V. 275. P. 258-262.

119. Lyon D.Y., Adams L.K., Falkner J.C., Alvarez P.J.J. (2006) Antibacterial activity of fullerene water suspensions: Effects of preparation method and particle size // Environ. Sci. Technol. V. 40. P. 4360-4366.

120. Mackay J.P., Matthews J.M., Winefield R.D., Mackay L.G., Haverkamp R.G., Templeton M.D. (2001) The hydrophobin EAS is largely unstructured in solution and functions by forming amyloid-like structures // Structure V. 9 P. 8391.

121. Marsagishvili L., Shpagina M., Emelyanenko V., Podlubnaya Z. (2005) New amyloid-forming proteins IIFEBS Journal V. 272. Iss. si, P. 297.

122. McEwen C.N., McKay R.G., Larsen B.S. (1992) C-60 as a radical sponge // J. Am. Chem. Soc. V. 114. P. 4412-44.

123. Mchedlov-Petrossyan N.O., Klochkov V.K., Andrievsky G.V. (1997) Colloidal dispersions of fullerene C6o in water: some properties and regularities of coagulation by electrolytes // J. Chem. Soc. Faraday Trans. V. 93. P. 4343-4346.

124. Miyahara M., Noda H. (1980) Interaction of C-protein with myosin // J. Biochem. V. 87. P. 1413-1420.

125. Moos C., Mason C.M., Besterman J. M., Feng I-N. M., Dubin J.H. (1978) The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 II J. Mol. Biol. V. 124. P. 571-586.

126. Moos C., Feng I-N.M. (1980) Effect C-protein on actomyosin ATPase // Biochem. Biophys. Acta. V. 632. P. 141-149.

127. Moos C. (1981) Fluorescence microscope study of the binding of added C-protein to skeletal muscle myofibrils // J. Cell Biol. V. 90 P. 25-31.

128. Morimoto K., Harrington W.F. (1974) Substructure of the thick filament of vertebrate striated muscle II J. Mol. Biol. V. 83. P. 83-97.

129. Moussa F., Trivin F., Cerolin R., Hadchouel M., Sizaret P.Y., Greugny V., Fabore C., Rassat A., Szwarc H (1996) Early effects of C60 administration in swiss mice: a preliminary account for in vivo Сбо toxiciti // Full. Sci. Technol. V. 4. P. 21-29.

130. Nakamura E., Tahara K., Matsuo K., Sawamura M. (2003) Synthesis, Structure, and Aromaticity of a Hoop-Shaped Cyclic Benzenoid 10.Cyclophenacene II J. Am.Chem. Soc. V. 125. P. 2834-2835.

131. Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.T., Hooser S.B., Fernando Q., Carter D.E. (1993) Effects of acute and subchronic exposure of topically applied fullerene extracts on the mouse skin // Toxicol. Ind Health. V. 9. P. 623-630.

132. Nihoyannopoulosl P., Dawson D. (2009) Restrictive cardiomyopathies // European Journal of Echocardiography V. 10. P. 23-33.

133. Oberdorster E. (2004) Manufactured nanomaterials (Fullerenes, C6o) induce oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass // Environmental Health Perspectives V. 112. P. 1058-1062.

134. Offer G., Moos C., Starr R. (1973) A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extraction, purification and characterization // J. Mol. Biol. V. 74. P. 653-676.4

135. Okagaki Т., Weber F.E., Fischman D.A., Vaughan K.T., Mikawa Т., Reinach F.C. (1993) The major myosin-binding domain of skeletal muscle MyBP-C (C protein) resides in the COOH-terminal, immunoglobulin C2 motif // J Cell Biol. V. 123 (3). P. 619-626.

136. O'Nuallain В., Williams A.D., Westermark P., Wetzel R. (2004) Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils II J. Biol. Chem. V. 279. P. 17490-17499.

137. Osawa E., Kagaku (Kyoto), (1970) V. 25. P. 854-863. In Japanese; Chem. Abstr. (1971) V. 74. 75698v.

138. Pardee J.D., Spudich J.A. (1982) Purification of muscle actin // In: Methods in Cell Biology. (Wilson L. eds.) Acad. Press. New York. London. V. 24 (part A). P.271—289.

139. Pepe F.A. (1967) The myosin filament. I. Structural organization from antibody staining observed in electron microscopy // J. Mol. Biol. V. 27. P. 203225.

140. Pepe F.A., Drucker B. (1979) The myosin filament. IV. Myosin content // J. Mol. Biol. V. 130. P. 379-393.

141. Pepys M.B. (2001) Pathogenesis, diagnosis and treatment of systemic amyloidosis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. V. 365. P. 203-210.

142. Piotrovsky L.B., Kiselev O.I. (2004) Fullerenes and viruses // Fullerenes, nanotubes, and carbon clusters V. 12. P. 397-403.

143. Podolsky I.Ya., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A., Kaminsky Yu.G. (2006) Impairment of spatial memory in the performance of probabilistic task and fullerenes. // Abstr. Intern. Symp. "Hippocampus and Memory", Pushchino, Russia. P. 44.

144. Qahwash I., Weiland K., Lu Yi., Sarver R., Kletzien R., Yan R. (2003) Identification of a mutant amyloid peptide that predominantly forms neurotoxic protofibrillar aggregates II J. Biol. Chem. V. 278. P. 23187-23195.

145. Rees M.K., Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure II J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449-4458.

146. Reinke A.A., Gestwicki J.E. (2007) Structure-activity relationships of amyloid beta-aggregation inhibitors based on curcumin: influence of linker length and flexibility // Chem. Biol. Drug Des. V. 70. P. 206-215.

147. Rio Y., Nierengarten J.-F. (2002) Water soluble supramolecular cyclotriveratrylene-60.fullerene complexes with potential for biological applications // Tetrahedron Lett. V. 43. P. 4321-4324.

148. Rohlfing E.A., Cox D.M., Kaldor A. (1984) Production and characterization ofsupersonic carbon cluster beams // J. Chem. Phys. V. 81. P. 3322-3330.

149. Ross C.A., Poirier M.A. (2004) Protein aggregation and neurodegenerative disease. //Nat. Med. V. 10. P. 10-17.

150. Ruoff R.S., Tse D.S., Malhotra M., Lorents D.C. (1993) Solubility of fullerene C60 in a variety of solvents //J. Phys. Chem. V. 97. P. 3379-3383.

151. Sayes C.M., Gobin A.M., Ausman K.D., Mendez J., West J.L., Colvin V.L. (2005) Nano-C6o cytotoxicity is due to lipid peroxidation // Biomaterials V. 26. P. 7587-7595.

152. Schinazi R.F., Sijbesta R., Srdanov G., Hill C.L., Wudl F. (1993) Synthesis and virucidal activity of water-soluble, configurationally stable, derivatized C6o fullerene // Antimicrob. Agents Chemother. V. 37. P. 1707-1710.

153. Scrivens W.A., Tour J.M. (1994) Synthesis of 14C-labeled C60, its suspension in water, and its uptake by human keratinocytes // J. Am. Chem. Soc. V. 116. P. 4517-4518.

154. Shirahama T., Cohen A.S. (1967) High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril///. Cell. Biol. V. 33: P. 679-708.

155. Si К.', Lindquist S., Kandel E.R. (2003) A neuronal isoform of the aplysia CPEB has prion-like properties // Cell V. 115. P. 879-891.

156. Sijbesta R., Srdanov G., Wudl F., Castoro J.A., Wilkins C., Friedman S.H., DeCamp D.L., Kenyon G.L. (1993) Synthesis of fullerene derivative for the inhibition of HIV enzymes II J. Am. Chem. Soc. V. 115. P. 6510-6512.

157. Sipe J.D., Cohen A.S. (2000) History of the amyloid fibril // J. Struct. Biol V. 130. P. 88-98.

158. Siragelo I., Malmo C., Iannuzzi C., Mezzogiorno A., Bianco .R., Papa M., Irace G. (2004) Fibrillogenesis and cytotoxic activity of the amyloid-forming apomyoglobin mutant W7FW14F И J. Biol. Chem. V. 279. P. 13183-13189.

159. Sivaraman N., Dhamodaran R., Kaliappan I., Srinivasan T.G., Vasudea rao P.R., Mathews C.K. (1992) Solubility of C60 in organic solvents // J. Org. Chem. V. 57. P. 6077-6079.

160. Small J.V., Gimona M. (1998). The cytoskeleton of the vertebrate smooth muscle cell /1 Acta Physiol Scand. V. 164. P. 341-348.

161. Small J.V. (1995) Structure-function relationships in smooth muscle: the missing links. II Bioessays V. 17. P. 785-792.

162. Squire J.M., Luther P.K., Knupp C. (2003) Structural evidence for the interaction of C-protein (MyBP-C) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain // JMol Biol. V. 331 (3). P. 713-724.

163. Starr R., Offer G. (1971) Polypeptide chains of intermediate molecular weight in myosin preparations // FEBS Lett. V. 15. P. 40-44.

164. Starr R., Offer G. (1983) H-protein and X-protein. Two new components of the thick filaments of vertebrate skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 170. P. 675698.

165. Starr R., Bennett P., Offer G. (1979) X-protein and its polymers // Proc. Europ. Cong. Muscle Motil. Heidelberg. 1979. P. 29.

166. Starr R., Offer G. (1982) Preparation of C-protein, H-protein, X-protein and phosphofructokinase // In: Methods in enzymology. New York. London. V. 85. Part B. P. 130-138.

167. Sunde M., Blake C.C.F. (1997) The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction // Adv. Prot. Chem. V. 50. P. 123-159.

168. Suzuki K., Terry R.D. (1967) Fine structural localization of acid phosphatase in senile plaques in Alzheimer's presenile dementia // Acta Neuropathol. (BerL). V. 8. P. 276-284.

169. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin II J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.

170. True H.L., Lindquist S.L. (2000) A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. // Nature V. 407. P. 477-483.

171. Tsai M.C., Chen Y.H., Chiang L.Y. (1997) Polyhydroxylated C60, fullerenol, a novel free radical trapper, prevented hydrogen peroxide-and cumene hydroperoxide-elicited changes in rat hippocampus in vitro // J. Pharm. Pharmacol. V. 49. P. 438-445.

172. Tskhovrebova L., Trinick, J. (2003). Titin: properties and family relationships // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 4. P. 679-689.

173. Ungurenasu C., Highly A. A. (2000) Stable C60/poly(vinylpyrrolidone)charge-transfer complexes afford new predictions for biological applications of underivatized fullerenes // J. Med. Chem. V. 43(16). P. 3186-3188.

174. Uversky V.N., Fink A.L. (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta. V. 1698. P. 131-153.

175. Wang K., Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line //J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.

176. Wang S.S., Good T.A. (2005) An overview of Alzheimer's disease // J. Chin. Inst. Chem. Eng. V 36. P. 533-559.

177. Wilson S.R., Kadish K., Ruoff R. (2000) The Fullerene Handbook // Wiley, New York P. 437-465.

178. Yamakoshi Y.N., Yagami T., Fukuhara K., Sueyochi S., Miyata N. (1997) Solubilization of fullerenes into water with polyvinylpyrrolidone applicable to biological tests // J. Chem. Soc. Chem. Commun. P. 1839-1840.

179. Yamamoto K., Moos K. (1983) The C-protein of rabbit red, white, and cardiac muscles //J. Biol. Chem. V. 258 (13). P. 8395-8401.

180. Yoshida Z., Takekura H., Takekura S., Matsubara Y. (1994) Molecular recognition of C60 with y-cyclodextrin // Angew. Chem. Int. Ed. V. 33. P. 15971599.

181. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin HEMBOJ. V. 17. P. 1614-1624.

182. Zastrow M.S., Flaherty D.B., Benian G.M., Wilson K.L. (2006). Nuclear titin interacts with A- and B-type lamins in vitro and in vivo. // J. Cell Sci. V. 119. P. 239-249.

183. Zerovnik E. (2002) Amyloid fibril formation // Eur. J. Biochem. V. 269. P. 3362-3371.

Информация о работе

Бобылёв, Александр Геннадьевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы