Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие тиофлавина T с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие тиофлавина T с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя"

На правах рукописи

СУЛАЦКАЯ Анна Игоревна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОФЛАВИИА Т С АМИЛОИДНЫМИ ФИБРИЛЛАМИ: МЕХАНИЗМ ВСТРАИВАНИЯ, ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ, ИЗМЕНЕНИЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КРАСИТЕЛЯ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005062367

. ": І 1 '-■О и

Санкт-Петербург 2013

005062367

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН), Санкт-Петербург

доктор биологических наук Ирина Михайловна КУЗНЕЦОВА, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург

доктор физико-математических наук Константин Константинович ТУРОВЕРОВ, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург

доктор физико-математических наук Андрей Леонидович ТИМКОВСКИЙ Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики їм. Б.П.Константинова, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Алексей Николаевич Скворцов Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится "28" июня 2013 года в 12 ч. на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе ИНЦ РАН по адресу: 194064, Санкт-

Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: ууцчу.су^рЬ.rssi.ru

Электронный адрес: се11Ьіо@таі1.rssi.ru

Факс: 8(812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЦ РАН. Автореферат разослан "27" мая 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, /хі!' '

кандидат биологических наук I Е. В. Каминская

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Вопрос о том, как полипептидная цепь глобулярных белков сворачивается в уникальную, компактную, высокоорганизованную, функционально-активную структуру, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Уже давно было замечено, что при сворачивании белков могут возникать частично-свернутые состояния, содержащие элементы структуры, которых нет в нативном белке и возникновение которых определяет склонность белка к образованию агрегатов.1 Кроме того, необходимо учитывать, что жизненный цикл белка проходит в условиях густонаселенной среды клетки, т.е. в условиях молекулярного краудинга, что стимулирует процессы, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, в том числе процессы агрегации белков.2'3

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. Ситуация резко изменилась, когда стало очевидным, что возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл сопряжено с возникновением многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др., которые часто называют "конформационными болезнями".4"10 Дальнейшие исследования показали, что образование амилоидных фибрилл - свойство, присущее не только тем белкам, фибриллогенез которых связан с возникновением болезней, но и многим другим (если не всем) белкам.""'5 Оказалось также, что, несмотря на многообразие структур ами-лоидогенных белков, все амилоидные фибриллы имеют сходную архитектуру: они представляют собой неразветвленные образования, богатые бета-складчатой структурой, в которой антипараллельные бета-листы направлены перпендикулярно оси фибриллы.'6'17 В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных фибрилл, полученных на основе разных белков, идентична. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так: были обнаружены различия в структуре амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков18 '9 и даже фибрилл, полученных при разных условиях на основе одного и того же белка. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, по-видимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амилоидных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков.

Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro давно и эффективно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ThT).20"27 Это обусловлено высокой специфичностью взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Краситель не взаимодействует с белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. При взаимодействии с белками в состоянии амилоидных фибрилл, его квантовый выход флуоресценции возрастает в несколько тысяч раз, тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый

выход флуоресценции. Несмотря на широкое использование ТИТ в качестве флуоресцентного зонда до сих пор нет единого мнения о механизме встраивания ТИТ в амилоидные фибриллы и о фотофизических свойствах этого красителя.28'29

В последнее время стало очевидно, что ТИТ можно использовать не только для диагностики образования амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В связи с этим актуальной задачей является определение параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании взаимодействия флуоресцентного зонда ТЬТ с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков. В задачи исследования входило:

1. Изучение спектральных свойств свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ и выяснение причин возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы.

2. Определение механизма встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы.

3. Разработка методики определения параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами (числа центров связывания с различным сродством к ТЬТ (мод связывания), констант связывания и числа мест связывания) и фотофизических свойств красителя, связанного с амилоидными фибриллами (спектров поглощения, коэффициентов молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции).

4. Получение амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков и сравнение их структуры с использованием разработанного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. «Коротковолновые» полосы флуоресценции (Я„,ш=440 нм) и возбуждения флуоресценции (А,„„,=340 нм) водных растворов ТЬТ обусловлены тем, что часть молекул имеет кон-формацию с нарушенной системой тг-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензоль-ного колец красителя.

2. Максимум спектра поглощения ТЬТ, встроенного в амилоидные фибриллы, сдвинут относительно максимума спектра поглощения свободного ТЬТ в водном растворе (/,„„,=412 нм) в длинноволновую область, в то время как максимумы спектров флуоресценции свободного и связанного с фибриллами красителя близки (А„шх=480 нм).

3. Значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ТЬТ (бензтиазольного и аминобензольного колец) друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

4. Существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ТЬТ в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ТЬТ встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

5. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определить параметры связывания ТИТ с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл.

Научная новизна работы. Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на фотофизические свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТИТ. Дано новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ТЬТ в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ТЬТ с нарушенной системой п-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ТЬТ в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Впервые показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено не только подвижностью бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ТЬТ друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и ее конформацией в основном состоянии. Были проанализированы существующие гипотезы о механизме встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы и сделано заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл не обоснованы.

Впервые для определения параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами использован метод, основанный на прямом спектрофотометрическом определении концентрации свободного и связанного с фибриллами красителя в растворах, полученных методом равновесного микродиализа. Этот подход позволяет также определять спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ТЬТ (при измерении интенсивности флуоресценции тех же растворов), взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания.

Показано что, параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида и характеристики встроенного в них красителя существенно различаются. Подход, разработанный в настоящей работе, может быть использован для изучения полиморфизма амилоидных фибрилл и сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл, полученных на основе различных белков.

Теоретическое и практическое значение работы. В связи с эффективным применением ТЬТ в качестве флуоресцентного зонда и перспективами его использования для изучения структуры амилоидных фибрилл, а его аналогов - в качестве терапевтических агентов, выяснение специфических особенностей этого красителя и формирование представлений о его фотофизических свойствах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и квантовом выходе флуоресценции связанного красителя, является важным шагом на пути изучения структуры амилоидных фибрилл, что, в свою очередь, может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих фибриллообразованию, и о механизмах этого процесса. Таким образом, результаты проведенной работы могут быть существенны для понимания фундаментальных основ фолдинга и агрегации (нарушения фолдинга) белков.

Проведенные исследования имеют существенное прикладное значение в виду широкого распространения заболеваний, вызванных или сопровождающихся образованием амилоидных фибрилл. Показано, что образованием амилоидных бляшек сопровождаются все нейро-дегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Пика. Известны также амилоидозы, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осложнениями лечебных мероприятий. К этому виду патологии можно отнести ин-сулиновый амилоидоз и так называемый гемодиализный амилоидоз, которые приводят к существенному снижению качества жизни больных. Изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики заболеваний, сопровождаемых различного рода амилоидозами.

Поскольку разработанный нами подход к исследованию взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами универсален, он может быть востребован в молекулярной фармакологии при определении параметров связывания белков с активными веществами (лигандами), в том числе с лекарствами. В частности, чрезвычайно важно правильное определение константы связывания красителей, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер. Кроме того, результаты работы могут быть использованы для анализа взаимодействия амилоидных фибрилл с химическими веществами (в том числе нефлуоресцирующими), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 37-й и 38-й Неделе науки СПбГПУ (Санкт-Петербург, 2008, 2009), Политехническом симпозиуме: «Молодые учёные - промышленности Северо-Западного региона», (Санкт-Петербург, 2008, 2010); XIII Европейской конференции спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), II и III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010, 2012); 6-й и 8-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых (Санкт-

Петербург, 2010, 2012), III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизики" (Санкт-Петербург, 2011), 17-м Международном биофизическом конгрессе (Китай, 2011), VI Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Украина, 2011), 37-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Испания, 2012) и семинарах Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков ИНЦ РАН.

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 11 статей в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Министерства образования и науки (Соглашение № 14.132.21.1311), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 07-04-01454, 08-04-90052_Бел, 10-04-90038_Бел, 12-04-01651, 12-04-90022_Бел, 1304-02068, 13-04-01842), Президента РФ (стипендия № СП - 776.2012.4), фонда «Династия» (грант № ДП-Б-35/10) и Правительства Санкт-Петербурга (гранты ПСП № 10652, ПСП № 11566, ПСП № 12360).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, трех Глав, Выводов, Списка публикаций по теме диссертации и Списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Для проведения исследований были использованы следующие материалы: ThT (Sigma-Aldrich and AnaSpec, США), ATTO-425 (ATTO-TEC, Германия), глицерин (Merk, Германия), ацетилхолинэстераза Electrophorus electricus (AChE), инсулин, уксусная кислота и NaCl (Sigma, США), лизоцим (Fluka, США), Абета-пептид (GL Biochem Ltd., China), КН2Р04 и NaOH (Реахим, Россия), GdnHCl (ICN Biomedicals, США).

Подготовка образцов. Амилоидные фибриллы на основе инсулина получали путем инкубирования инсулина (10 мг/мл) в 20%-ной уксусной кислоте в присутствии 100 мМ NaCl (pH 2.0) при температуре 37° С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч.30 Амилоидные фибриллы на основе лизоцима получали путем инкубирования лизоцима (2 мг/мл) в 0.05 М буфере KH2P04-Na0H в присутствии ЗМ GdnHCl, pH 6.3 при температуре 50° С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч.31 Концентрацию GdnHCl проверяли рефрактометрически с использованием рефрактометра Abbe фирмы Ломо. Амилоидные фибриллы на основе Абе-та-пептида получали путем инкубирования Абета-пептида (2 мг/мл) в 50%-ном hexafluoro-2-propanol (HFIP)/H20 и 0.02%-ном азиде натрия в течение 7 сут.32 Затем НИР был выпарен в потоке азота, и образцы инкубировались при постоянном перемешивании еще 7 сут. AChE была растворена в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7.0) в концентрации 1.5 мг/мл.33

Измерение спектров поглощения было выполнено с использованием спектрофотометра U-3900H (Hitachi, Япония). Для того чтобы охватить широкий диапазон концентраций красителя измерения проводились в кюветах фирмы Helma (Германия) с разной длиной оптического пути (0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 см).

При обработке измеренных спектров поглощения растворов ThT с амилоидными фибриллами исключение из зарегистрированного спектра кажущейся оптической плотности, обусловленной светорассеянием амилоидных фибрилл, проводили с помощью стандартной процедуры.34

Измерение спектров флуоресценции проводили с использованием спектрофлуоримет-рической установки собственного изготовления и установки фирмы Сагу Eclipse (Varían, Австралия) со стационарным возбуждением. Для определения квантового выхода ThT в качестве эталона был использован раствор флуоресцентного красителя АТТО-425 (АТТО) с известным квантовым выходом флуоресценции (0.9), спектры поглощения и флуоресценции которого по положению совпадают со спектрами ThT. Флуоресценция ThT и АТТО возбуждалась при длине волны 450 нм, а регистрировалась при длине волны 480 нм.

При определении квантового выхода флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях была учтена зависимость коэффициента молярной экстинкции красителя и коэффициента преломления раствора от вязкости раствора.35 Вязкость водно-глицериновых смесей была определена на основании данных о концентрации глицерина, полученных рефрактомериче-ски с использованием рефрактометра Abbe фирмы LOMO.

Равновесный микродиализ проводился с использованием приспособления фирмы Harvard Apparatus/Amika (USA), которое состоит из двух камер равного объема (500 мкл), разделенных мембраной. В одну из камер помещались амилоидные фибриллы в буфере, в котором они были получены, в другую - краситель в том же растворителе. При проведении экспериментов использовали мембраны, непроницаемые для частиц с молекулярной массой больше 10000 Da.

Метод электронной микроскопии был использован для визуализации амилоидных фибрилл. Эксперименты были выполнены с использованием электронного микроскопа Carl Zeiss Libra 120. Для негативного контрастирования препаратов использовали 1%-ный водный раствор уранил-ацетата (Миронов и др. 1994). Белок наносили на медные сетки, покрытые кол-лодиевой пленкой-подложкой, напыленной углем.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на широкое и эффективное использование флуоресцентного красителя тио-флавина Т (ThT) в качестве флуоресцентного зонда в тот момент, когда мы начинали эту работу, не существовало однозначного представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в фибриллы, о его спектральных свойствах,

а также о способах связывания ThT с амилоидными фибриллами.28,29 В связи с этим целью данной работы стало исследование взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков.

Спектральные свойства ThT и механизм связывания красителя с амилоидными фибриллами

Объяснение существования коротковолновых спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе. В первых работах, посвященных исследованию спектральных свойств ThT, было отмечено, что спектры возбуждения флуоресценции и спектры флуоресценции красителя, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, существенно сдвинуты в длинноволновую сторону по сравнению с аналогичными спектрами для свободного красителя в водном растворе (рис.1, б). В связи с этим рядом авторов были выдвинуты предположения о том, что длинноволновый сдвиг спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции, а также высокое значение квантового выхода флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены димерами или даже мицеллами молекул красителя.28,29

Однако коротковолновый спектр возбуждения флуоресценции ThT в воде не совпадает с длинноволновой полосой спектра поглощения красителя, как это должно быть, а сдвинут относительно длинноволновой полосы поглощения в коротковолновую область так, что максимум спектра возбуждения приходится на минимум в спектре поглощения. При этом спектр возбуждения флуоресценции ThT, связанного с амилоидными фибриллами, спектрально совпадает с длинноволновой полосой поглощения свободного красителя в водном растворе (рис. 1, б). Таким образом, специального объяснения требует не длинноволновое положение спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ThT в фибриллах, а коротковолновые спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ThT в водном растворе. Для того чтобы понять природу аномальных коротковолновых спектров красителя в водном растворе, необходимо обратить внимание на тот факт, что молекула ThT относится к классу молекулярных роторов, поскольку бензтиазольное и аминобензольное кольца красителя способны поворачиваться друг относительно друга (рис.1, а). Согласно результатам квантово-химических расчетов, наличие метальной группы у атома азота бензтиа-зольного кольца красителя препятствует существованию строго планарной конформации колец красителя.36 Стерическое взаимодействие этой группы с атомом водорода бензольного кольца определяет существование энергетического барьера при конформации с углом между бензтиазольным и аминобензольным кольцами ср, равным 0° (180°) (рис.1, в). Существование энергетического барьера при (р=90° (270°) связано с нарушением сопряжения между бензтиазольным и аминобензольным кольцами ThT. Результаты квантово-химических расчетов свидетельствуют о том, что в основном состоянии минимуму энергии соответствует конфор-мация красителя с углом между кольцами, равным 37° (145°, 217°, 325° и т.д.), а максимуму

/ \ // \\ водный

It

О 60 120 180 240 300 360

<Р

300 350 400 450 500 550 Длина волны

Рис. 1. (а) Структура молекулы ThT: I - бензтиазольное кольцо, II - аминобензольное кольца, III - диметиламино группа, (б) Спектры поглощения (кривые черного цвета), возбуждения флуоресценции (кривые синего цвета) и флуоресценции (кривые красного цвета) ThT в водном растворе (верхняя панель) и при инкорпорации в амилоидные фибриллы (нижняя панель), (в) Зависимость энергии молекулы ThT в основном состоянии от угла ф между бензтиазольной и аминобензольной группами (красным показаны данные для ThT, зеленым -для аналога ThT с заменой метильной группы атомом водорода). 36

энергии - с углом между кольцами, равным ф=0° и 90° (180°, 270° и т.д.). Наличием метильной группы можно объяснить относительно низкие величины энергетических барьеров при Ф=0С и 90°(180°, 270° и т.д.). Это означает, что часть молекул ThT имеет в основном состоянии конформацию с нарушенной системой л-сопряженных связей бензтиазольного и амино-бензольного колец, которые в этом случае выступают в качестве отдельных хромофоров. Увеличение размера системы л-связей, как известно, сопровождается длинноволновым сдвигом спектра, поэтому любой изолированный фрагмент ThT должен иметь более коротковолновое положение спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с целой молекулой красителя. Таким образом, появление коротковолновых спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ThT обусловлено существованием в основном состоянии фракции молекул красителя с ф, близкими к 90° (270°). Коротковолновую флуоресценцию можно зарегистрировать только в растворах с низкой вязкостью, когда интенсивность длинноволновой флуоресценции ThT низка. При встраивании в амилоидные фибриллы происходит существенное увеличение квантового выхода длинноволновой флуоресценции (из-за ограничения вращения фрагментов ThT друг относительно друга), на фоне которой коротковолновая флуоресценция становится незаметной.

Флуоресцентные свойства 77; Т в растворителях с различной вязкостью и температурой. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции ТИТ при его встраивании в амилоидные фибриллы. Были измерены зависимости квантового выхода флуоресценции ТИТ от вязкости водно-глицериновых смесей 7 (содержание глицерина изменялось от 13 до 99%) и от температуры растворов Г (от 3 до 50° С). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что нагревание раствора или уменьшение его вязкости сопровождается существенным уменьшением квантового выхода флуоресценции ТИТ. Это означает, что существует процесс безызлучательной дезактивации возбужденного состояния молекулы ТЬТ, величина константы которого зависит от температуры и вязкости растворителя.

Согласно данным квантово-химических расчетов минимуму энергии в возбужденном состоянии соответствует конформация молекул красителя с углом ф = 90 (270)°. Такие молекулы с высокой вероятностью переходят в основное состояние безызлучательно. Мы полагаем, что возможность перехода молекул в такую конформацию (а значит, и величина квантового выхода флуоресценции) обусловлена поворотом фрагментов молекул красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии. Линейный характер зависимости квантового выхода флуоресценции от температуры и вязкости растворителя, представленной в координатах (1/ц-1) от Т/ц (рис. 2), подтвердил нашу гипотезу о том, что возрастание квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением подвижности колец красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии.

Кроме того, полученные данные (рис. 2 (вставка)) свидетельствуют о том, что квантовый выход флуоресценции ТЬТ в жестких изотропных растворах (Т 0, ц —> ее), ограничивающих подвижность фрагментов красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии, существенно меньше 1.0 (составляет 0.28). Мы полагаем, что это обусловлено безызлучательной дезактивацией возбужденного состояния молекул ТЬТ, имеющих в основном состоянии (при поглощении света) непланарную конформацию. Вероятность безызлуча-тельного перехода таких молекул в основное состояние будет тем выше, чем ближе значение угла <р к 90°. В связи с этим было сделано предположение (получившее затем экспериментальное подтверждение37) о том, что поскольку конформация красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, может существенно отличаться от его конформации в жестких изотропных средах, величина квантового выхода флуоресценции связанного ТЬТ может быть как больше, так и меньше 0.28.

Модель встраивания ТИТ в амилоидные фибриллы. В ряде работ, посвященных изучению спектральных свойств ТЬТ, существуют противоречивые гипотезы о том, что длинноволновое положение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции и высокое значение квантового выхода флуоресценции ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибрил-

Т/г), сп 1

Рис 2. Зависимость квантового выхода флуоресценции ТЬТ от температуры и вязкости растворителя; на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температурам и высокой вязкости растворителя.

лы, обусловлены димерами или даже мицеллами молекул красителя. Однако мы уже показали, что спектральные свойства и значение квантового выхода флуоресценции ТЬТ, определяются другими причинами.

Нами был проведен ряд дополнительных экспериментов для того, чтобы подтвердить необоснованность гипотезы об образовании ТЬТ димеров и мицелл. Были измерены спектры поглощения растворов ТЬТ в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 3, а). Полученные результаты свидетельствуют о том, что положение и форма спектров поглощения, а также величина коэффициента молярной экстинкции ТЬТ в диапазоне концентраций от 7.5- 10"бдо 3.7-10"4 М не зависит от концентрации красителя, а значит, образования агрегатов ТЬТ не происходит.

В работе29 на основании того, что зависимость интенсивности флуоресценции ТЬТ от его концентрации, построенная в полулогарифмическом масштабе, имеет точку перегиба (вставка на рис. 3, б), была выдвинута гипотеза об образовании молекулами ТИТ мицелл.

Нами показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ТЬТ от его концентрации, построенная в обычных координатах (рис. 3, б), ничем не отличается от зависимостей для любого другого флуоресцирующего вещества, которые в полулогарифмическом масштабе аналогично будут состоять из двух участков, имеющих существенно различный наклон (вставка на рис. 3, б). Нами сделано заключение, что характер зависимости, представленной в работе24, связан не с агрегацией молекул красителя, а с особенностями представления экспериментальных данных. Это означает, что представления об образовании красителем мицелл в водном растворе и при связывании с амилоидными фибриллами не обоснованы. Наши экспериментальные данные хорошо согласуются с моделью Кребса38, согласно которой ТЬТ

Оптическая^ плотность 0.0 0.2 0.4 ~ 0.6 0.8 1.0

350 400 450 500 550 0 20 40 60 80

Длина волны, нм [ThT], мкМ

Рис. З.(а) спектры поглощения ThT в воде для разных концентраций красителя: от 10"6 до 10 4 М (кривые 1—5); (б) зависимость интенсивности флуоресценции ThT от концентрации красителя, на вставке эта зависимость представлена в полулогарифмическом масштабе.

в мономерной форме встраивается в бороздки, образованные боковыми цепями аминокислот и ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно ß-листам.39 41

Структурные параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами

Выбор подхода для определения параметров связывания TUT с амилоидными фибриллами. В последние годы в литературе появилось около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами (см., например, обзор Groenning М.42). Поскольку раствор ThT с амилоидными фибриллами представляет собой равновесную систему свободного и связанного с фибриллами красителя, а флуоресцирует только связанный краситель, казалось бы, при определении параметров связывания можно основываться исключительно на измерении зависимости интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации в растворах, содержащих амилоидные фибриллы, как это и делалось ранее. Авторы работ, результаты которых обобщены в обзоре40, основывались на предположении, что измеренная интенсивность флуоресценции всегда пропорциональна концентрации связанного с фибриллами красителя и что эта зависимость выходит на плато, когда все сайты связывания заняты. На самом деле даже теоретическая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для любого флуоресцирующего вещества (независимо от присутствия амилоидных фибрилл) не является линейной и представляет собой кривую с насыщением. Более того экспериментально регистрируемая интенсивность флуоресценции может даже уменьшаться с увеличением оптической плотности раствора. Это происходит за счет того, что при увеличении суммарной оптической плотности все большую часть возбуждающего света поглощают слои раствора, прилегающие к передней стенке кюветы, в то время как приемная система спектрофлуориметра "видит" центральную часть кюветы, до которой доходит все меньшая доля возбуждающего света. Таким образом, зарегистрированные значения интенсивности флуоресценции могут быть использованы для

определения параметров связывания только при введении коэффициентов, корректирующих описанные эффекты.

Кроме того, концентрация свободного красителя не равна суммарной концентрации ThT в растворе, как это предполагалось практически во всех работах. Нами было показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от общей концентрации красителя в растворе может быть использована только для случая существования одного набора центров с различным сродством к ThT (одной моды связывания). При этом данный подход сам по себе не позволяет оценить число мод связывания красителя. В связи с этим появилась необходимость разработать универсальный подход для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.43'44 Для решения этой задачи нами впервые был использован прямой метод изучения связывания ThT с амилоидными фибриллами, - метод абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных методом равновесного микродиализа, позволивший впервые определить концентрацию свободного и концентрацию связанного с фибриллами красителя. Применимость предложенного подхода была продемонстрирована при изучении взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида. Исследуемые амилоидные фибриллы были визуализированы с использованием электронной микроскопии (рис.4).

Определение спектров поглощения TUT, связанного с амилоидными фибриллами. Равновесный микродиализ был выполнен с использованием приспособления, состоящего из двух камер равного объема, разделенных мембраной, проницаемой для красителя и непроницаемой для фибрилл (рис.5). В одну из камер (#2) помещался раствор красителя с концентрацией (Со), в другую (#1) - амилоидные фибриллы в том же растворителе. Содержание амилоидных фибрилл в камере #1 можно охарактеризовать концентрацией раствора белка, используемого для получения фибрилл с учетом последующего разведения (С,,). Спектр поглощения раствора в камере #2 после достижения равновесия представлял собой спектр пглощения свободного ThT (D/(X)), а спектр поглощения раствора в камере #1 - суммарный

Рис. 4. Амилоидные фибриллы на основе инсулина (данные электронной микроскопии) через 1.5 (а) и 3 (б) ч. после начала эксперимента (после растворения инсулина в буфере).

камера#1 камера#2

Рис. 5. Приспособление для проведения равновесного микродиализа. Показаны две камеры, разделенные мембраной, проницаемой для красителя и непроницаемой для амилоидных фибрилл. Условия проведения эксперимента см. в разделе «Материалы и методы исследования».

350 400 450 500 550 Длина волны, нм

350 400 450 500 Длина волны,нм

н 0.0 -

с -

° 350 400 450 500 Длина волны, нм

350 4П0 450 500 550

Длина волны,нм

о 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

Рис. 6. Определение спектра поглощения ТИТ, инкорпорированного в фибриллы на основе инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в). Кривые 1 и 2 - спектры поглощения раствора Т1)Т в камере #2 (свободный ТИТ в водном растворе) и в камере #1 (наложение спектров свободного и связанного с фибриллами ТИТ, а также светорассеяния амилоиднных фибрилл). Кривая 3 представляет собой оптическую плотность, которая определяется светорассеянием фибрилл, Кривая 4 - суммарный спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя после исключения вклада светорассеяния фибрилл. Кривая 5 - спектр поглощения связанного с фибриллами красителя. Кривая 6 - спектр поглощения свободного красителя в концентрации, равной концентрации связанного красителя.

спектр поглощения свободного ТЬТ (О/(А.)) и связанного с фибриллами красителя (О/, (X)) на фоне "кажущегося поглощения", обусловленного светорассеянием фибрилл (0!са1(Х)) (рис.6).

Предлагаемый нами подход позволил впервые определить спектры поглощения ТЬТ, инкорпорированного в фибриллы на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида (рис. 6). Полученные данные свидетельствуют о том, что спектр поглощения красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, является существенно более длинноволновым по сравнению со спектром свободного красителя в водном растворе. Положение спектров поглощения ТЬТ в водном растворе определяется существенным ориентационным диполь-дипольным взаимодействием молекул красителя с молекулами полярного растворителя.

Определение параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами. Для каждого эксперимента по микродиализу были определены концентрация свободного (С/) и концентрация связанного с фибриллами (Сь) красителя. Для того чтобы получить наглядное представление о количестве мод связывания красителя с фибриллами экспериментальные результаты были представлены в координатах Скетчарда (рис. 7). Нелинейный характер экспериментальных зависимостей однозначно свидетельствует о том, что в фибриллах на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида существуют как минимум две моды связывания (/), с различными значениями константы связывания (Кы). Концентрация связанного с амилоидными фибриллами красителя определяется соотношением:

Т^ + С, 1

где =--константа диссоциации, «/-число мест связывания в пересчете на молекулу

кы

белка. Величины констант связывания и числа мест связывания, наилучшим образом описывающие экспериментальные данные, были определены в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии. Полученные значения Кы, Кь2, п/ и п2 приведены на рис. 7. Оказалось, что константы связывания красителя с фибриллами на основе различных белков существенно различаются. Можно отметить, что число мест связывания в пересчете на молекулу белка для всех исследуемых фибрилл меньше единицы. Это означает, что для образования одного места связывания молекулы ТЬТ необходимо взаимодействие нескольких молекул белка, что согласуется с литературными данными. Нужно отметить, что с использованием предложенного нами подхода было также исследовано взаимодействие ТЬТ с ацетилхолинэстеразой (рис. 7, в). Активный центр этого фермента располагается в углублении, или так называемом «ущелье», в которое, согласно существующим представлениям, встраивается ТЬТ. Полученные нами результаты, свидетель-

1 1 45,16

ствующие о стехиометрии связывания 1:1, соответствуют этому представлению.

Кь,, = (2.0±0.5)-107 ИГ1 п, = (1.2±0.3)1(Г2 К„,2=(1.2±0.4)-105 \Г' п2=(8.4±2.2)-1(Г2

0.0 ;_

0.00

б

А = (7.5±0.5)-106 ИТ'

(1.1±0.1)КГ'

А К" = (5.6 ±1.2)-10'М-'

"2 = (2.4±0.3)-10г'

0.04 0.06 Сь/Ср

0.12 0.18

Сь/С„

15

Ъ 12

г 9

1 в

Кь,1 = (2.4±0.7)-10'' м'

п, = (6.0±1.1)-1<Г3

КЬ,2 = (2.5 ±0.6)-1&М~'

- У (2.1±0.3)1(Г'

у и

Кь= (8.1±0.6)-103 дг' г

о п = 1.0±0.1

о0 о

о —

11111

0.10

с./с„

С./С Ь р

Рис. 7. Зависимости Скетчарда, характеризующие связывание ТИ I с амилоидными фибриллами на основе инсулина (а), лизоцима (б), Абета-пептида (в) и с глобулярным белком ацетилхолинэстеразой (г). На рисунке показаны экспериментальные значения (точки) и расчетные кривые (линии), построенные С использованием констант П], П2, Кы И Кь2, определенных с использованием ОгарИРаё Рпгш5.

Определение коэффициентов молярной экстинкции ТИТ, связанного с амилоидными фибриллами. С использованием полученных значений параметров связывания ТЪТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида была определена концентрация красителя, связанного с каждой из мод связывания:

СЬ1 =

п.С„С

р /

И 0.2 =

пгС„С1

кл +С/

(2)

Принимая во внимание, что

еь\ (А)СМ/ + Еь2 62 ' (3)

где / - это длина оптического пути, а еЬ1 (X) и еьг (X) - коэффициенты молярной экстинкции красителя, связанного с сайтами каждой из мод связывания, значения ем (X) и еьг (X) были определены методом множественной линейной регрессии (81§таР1о1:) с использованием известных величин £>ДЯ), С4| и СЬ1. На рис. 8 показаны спектры поглощения красителя, взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания, представленные в единицах коэффициента молярной экстинкции. Полученные данные свидетельствуют о том, что величина коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, суще ственно

Рис. 8. Спектры поглощения ТИТ, связанного с сайтами каждой из мод связывания амилоидных фибрилл основе инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в), представленные в единицах коэффициента молярной экстинкции (еы и еы)- На рисунке также представлен спектр поглощения свободного красителя в водном растворе (е/).

превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, по-видимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиа-зольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

Определение квантового выхода флуоресценции ТИТ, связанного с амилоидными фибриллами. Как уже упоминалось выше, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации красителя может быть использована для определения параметров связывания лишь в случае существования одной моды связывания. Однако измерение интенсивности флуоресценции растворов, полученных методом равновесного микродиализа, в сочетании с данными, полученными с использованием абсорбционной спектрофотометрии тех же растворов, позволяют определить квантовый выход флуоресценции ТЫ, связанного с сайтами, принадлежащими каждой из мод связывания (ды, <уьг)'-

коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, существенно превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, по-видимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиа-зольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

Определение квантового выхода флуоресценции ТИТ, связанного с амилоидными фибриллами. Как уже упоминалось выше, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации красителя может быть использована для определения параметров связывания лишь в случае существования одной моды связывания. Однако измерение интенсивности флуоресценции растворов, полученных методом равновесного микродиализа, в сочетании с данными, полученными с использованием абсорбционной спектрофотометрии тех же растворов, позволяют определить квантовый выход флуоресценции ТИТ, связанного с сайтами, принадлежащими каждой из мод связывания (ды, дь2)'-I = СИе]1дЬ1+СЬ2£21дЬ2,

где I - это зарегистрированное значение интенсивности флуоресценции, скорректированное на эффект внутреннего фильтра. Значения ды и цы, рассчитанные методом множественной линейной регрессии, свидетельствуют о том, что квантовый выход флуоресценции ТИТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы на основе разных белков, а также квантовый выход красителя, связанного с сайтами, принадлежащими разным модам, различен. Это может быть обусловлено разной конформацией связанного красителя. В частности, молекулы красителя, имеющие более высокое значение квантового выхода флуоресценции, скорее всего, являются более плоскими по сравнению с молекулами с более низким значением квантового выхода флуоресценции.

Величины параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида, а также характеристики связанного с фибриллами красителя, представленные в Таблице, существенно различаются. Этот факт подтверждает данные о том, что фибриллы, полученные на основе разных белков, различны и что предлагаемый нами подход может использоваться для изучения их структуры.47

Таблица. Параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами и ацетлхолинэстеразой, характеристики свободного и связанного красителя

Объект исследования Мода связывания £';. шахХ 10"4, М'сгп"1 К,„ х 1 (Т\ М-1 Пі <7.

Амилоидные фибриллы на основе инсулина 1 8.7 200 0.01 0.83

2 3.5 1.2 0.08 0.30

Амилоидные фибриллы на основе лизоцима 1 5.1 75 0.11 0.44

2 6.7 0.56 0.24 0.0005

Амилоидные фибриллы на основе Абета-пептида 1 8.0 23.8 0.01 0.17

2 1.7 0.25 0.21 0.0001

Ацетилхолинэстераза 1 2.4 0.081 1.0 0.036

Свободный ТЬТ в водном растворе - 3.2 - - 0.0001

ВЫВОДЫ

1. На основании измерения спектров поглощения и спектров возбуждения флуоресценции свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ, с учетом результатов кванто-во-химических расчетов молекулы красителя, сделан вывод о том, что существование «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ТЬТ в водных растворах обусловлено наличием в растворе молекул ТЬТ с нарушенной системой л-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец.

2. На основании измерения зависимости квантового выхода флуоресценции ТЬТ от температуры и вязкости растворителя сделано заключение о том, что квантовый выход флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ТЬТ друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

3. Показано, что существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ТЬТ в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ТЬТ встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

4. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определять параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для изучения структуры амилоидных фибрилл.

5. Параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизо-цима и Абета-пептида, а также фотофизические характеристики связанного с фибриллами красителя, существенно различаются, что свидетельствует о различии их структуры.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Sulatskaya A.I., Turoverov К.К., Kuznetsova I.M. 2010. Spectral properties and factors determining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. Spectroscopy. 24: 169171.

2. Sulatskaya A.I., Maskevich A.A., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2010. Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into the amyloid fibrils. PLoSONE. 5(10): el5385 1-7

3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Цитология 52 (11): 955-959.

4. Сулацкая А.И. 2011. Взаимодействие флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Научно-технические ведомости СПбГПУ. 3 (129): 123-127.

5. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Вестник Санкт-Петербургского университета. 4(4): 152-160

6. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M. and Turoverov K.K. 2011. Interaction of Thioflavin T with amyloid fibrils: stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. Journal of Physical Chemistry ß. 115: 11519-11524

7. Sulatskaya A.I., Kuznetsova 1.М., Turoverov K.K. 2012. Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: fluorescence quantum yield of bound dye. Journal of Physical Chemistry B. 116(8): 2538-2544

8. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Analyzing Thioflavin T binding to amyloid fibrils by an equilibrium microdialysis-based technique. PLoS ONE. 7(2): e30724

9. Sulatskaya A. I., Povarova O.I., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Binding stoichiometry and affinity of fluorescent dyes to proteins in different structural states. In Intrinsically Disordered Proteins: Volume I. Experimental Techniques. In the series "Methods in Molecular Biology" (Humana Press, series editor John Walker). 1: 441 -460.

10. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A. I., Uversky V.N., Turoverov K.K.. 2012. A new trend in the experimental methodology for the analysis of the Thioflavin T binding to amyloid fibrils. Molecular Neurobiology. 45: 488-498.

11. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I, Povarova O.I., Turoverov K.K. 2012. Réévaluation of ANS binding to human and bovine serum albumins. Key role of equilibrium microdialysis in ligand - receptor binding characterization. PLoS ONE. 7(7): e40845

Тезисы:

1. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2008. Связывание тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. 37-я Неделя науки СП6ГПУ. Материалы Всероссийской межвузовской научной конференции студентов и аспирантов. (Санкт-Петербург). Стр. 9-10

2. Сулацкая А.И. 2008. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции бензтиа-зольного красителя тиофлавина Т при его встраивании в амилоидные фибриллы. Политехнический симпозиум: Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона. Мате-рисшы конферощий политехнического симпозиума. (Санкт-Петербург). Стр. 130-131

3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2009. Изучение взаимодействия тиофлавина Т с амилоидными фибриллами с помощью метода равновесного микродиализа. 38-я Неделя науки СПбГПУ. Материачы международной научно-практической конференции. (Санкт-Петербург). Стр. 11-13

4. Sulatskaya A.I., Turoverov К.К., Kuznetsova I.M. 2009. Spectral properties and factors determining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. XIII European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. Book abstracts (Palermo, Italy). P. 114

5. Сулацкая А.И., Туроверов K.K., Кузнецова И.М. 2010. Стехиометрия взаимодействия флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Спектральные свойства связанного красителя. Сборник тезисов Политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона». Стр. 194-195

6. Сулацкая А.И. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 508-509

7. Sulatskaya АЛ., Turoverov К.К., Kuznetsova I.M. 2010. Thioflavin T as an instrument for studying amyloid fibrils structure. Abstract book of 6th Saint-Petersburg Young Scientists Conference. P. 59

8. Сулацкая А.И. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Тезисы докладов III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизики". Стр. 58.

9. Sulatskaya АЛ., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2011. Thioflavin T - a tool for amyloid fibrils studies: mechanism of specific interaction and binding parameters. The 17,h International Biophysics Congress (IUPAB) and the 12th Chinese Biophysics Congress abstracts.(Beijing, China). P. 502

10. Sulatskaya A.I. 2011. Characteristics of the interaction of fluorescent dye thioflavin T with amyloid fibrils. Сборник тезисов VI Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы». Стр.502

11. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Встраивание флуоресцентного красителя тиофлавина Т в амилоидные фибриллы: стехиометрия взаимодействия и константы связывания. Цитология. Тезисы докладов и сообщений, представленных на 111 конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 357-358

12. Фонин А.В., Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Интенсивность флуоресценции как мера произведения оптической плотности флуорофора и квантового выхода его флуоресценции. Материалы докладов IV Съезда биофизиков России и IV Симпозиума «Новые тенденции и методы в биофизике». Стр. 95.

13. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov К.К. 2012. A new trend in the experimental methodology of amyloid fibril structural investigation with the use of thioflavin T. FEBS Journal (Suppl. 1). 279:415.

14. A. Fonin, A. Sulatskaya, O. Povarova, I. Kuznetsova, K. Turoverov. 2012. Pitfalls in the use of fluorescence for determination ligand-receptor binding stoichiometry and binding constants. Weak Protein-Ligand Interaction: New Horizons in Biophysics and Cell Biology. Abstract book. P. 54.

15. Sulatskaya A.I. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Investigation of the interaction of amyloid fibrils on the basis of different amyloidogenic proteins with fluorescent probe thioflavin T. 8th Saint-Petersburg young scientists conference. Abstract book. (Saint-Petersburg), p. 60.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jahn T.R.; Radford S.E. FEBS J 2005, 272, 5962-5970. 2. Чеботарева H.A. и др., Биохимия 2004, 69, 1522-1536. 3. Чеботарева Н.А., Автореферат диссертации 2006, 50 стр. 4. Harper J. D. et.al, Chem Biol 1997, 4, 951-959. 5. Kelly J.W. Structure 1997, 5, 595-600. 6. Carrell R.W.; Gooptu B. Curr Opin Struct Biol 1998, 8, 799-809. 7. Hashimoto M.; Masliah, E. Brain Pathol 1999, 9, 707-720. 8. Koo E.H et.al, Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 9989-9990. 9. Uversky V.N. et.al, Med Sci Monitor 1999, 5, 1238-1254. 10. Uversky V.N. et.al,. Med Sci Monitor 1999, 5, 1001-1012. 11. Dobson С. M. Trends Biochem Sci 1999, 24, 329-332. 12. Uversky V.N., Fink A. L. Biochim Biophys Acta 2004, 1698, 131-153. 13. Chiti F., Dobson C.M. Annu Rev Biochem 2006, 75. 333-366. 14. Fandrich M. et.al, Nature 2001, 410, 165-166. 15. Pertinhez T. A. et.al, FEBS Lett 2001, 495, 184-186. 16. Dobson C.M. Nature 2003, 426, 884-890. 17. Dobson C.M. Methods 2004, 34, 4-14. 18. Makin O.S., Serpell L.C. FEBS J 2005, 272, 5950-5961. 19. Nielsen L. et.al, Biochemistry 2001, 40, 6036-6046. 20. Naiki II. et.al, Lab Invest 1990, 62, 768-773. 21. Naiki H. et.al, Amyloid 2005, 12, 15-25. 22. LeVine H., 3rd. Protein Sci 1993, 2, 404-410. 23. Levine H., 3rd. Neurobiol Aging 1995, 16, 755-764. 24. LeVine H., 3rd. Arch Biochem Biophys 1997, 342, 306-316. 25. LeVine H., 3rd. Methods Enzymol 1999, 309, 274-284. 26. Yoshiike Y. et.al, J Biol Chem 2003, 278, 23648-23655. 27. Allsop D. et.al, Biochem Biophys Res Commun 2001, 285, 5863. 28. Schirra R. Chem Phys Letters 1985, 119, 229-238. 29. Khurana R. et.al, J Struct Biol 2005, 151, 229-238. 30. Goers J. et.al, Biochemistry 2002, 41, 12546-12551. 31. Vernaglia B. A. et.al, Biomacromolecules 2004, 5, 1362-1370. 32. Kayed R. et.al, Molecular neurodegeneration 2007, 2, 18. 33. De Ferrari G. V. et.al, Rosenberry T. L. J Biol Chem 2001, 276, 23282-23287. 34. Владимиров Ю. А.; Литвин Ф. Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования; Издательство "Высшая школа": Москва, 1964. 35. Lakowicz J. R. Springer, New York 2006. 36. Turoverov К. K. et.al, Proc of SPIE 2007, 6733. 37. Sulatskaya A. I. et.al, PLoS One 2010, 5, el5385. 38. Krebs M. R. et.al, J Struct Biol 2005, 149, 30-37. 39. Сулацкая А. И.; Кузнецова И. M. Цитология 2010, 52, 65-69. 40. Сулацкая А. И. Научно-технические ведомости СПбГПУ 2011, 3, 123-127. 41. Сулацкая А.И. и др., Вестник Санкт-Петербургского университета 2011, 4, 152-160. 42. Groenning М. J Chem Biol 2009, DOI 10.1007/s 12154-12009-10027-12155. 43. Kuznetsova I. M. et.al, PLoS One 2012, 7, e40845. 44. Kuznetsova I. M. et.al, Molecular neurobiology 2012, 45, 488-498. 45. Kuznetsova I.M. et.al, PLoS One 2012, 7, e30724. 46. Sulatskaya A.I. et.al, J Phys Chem В 2011, 115, 11519-11524. 47. Sulatskaya, A. I. et.al, J Phys Chem В 2012, 116, 2538-2544.

Подписано в печать 24.05.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10693Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сулацкая, Анна Игоревна, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

СУЛАЦКАЯ АННА ИГОРЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОФЛАВИНА Т С АМИЛОИДНЫМИ ФИБРИЛЛАМИ: МЕХАНИЗМ ВСТРАИВАНИЯ, ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ, ИЗМЕНЕНИЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КРАСИТЕЛЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.03 - Молекулярная биология

Научные руководители:

доктор биологических наук Ирина Михайловна Кузнецова

доктор физ.-мат. наук, проф. Константин Константинович Туроверов

Санкт-Петербург

На правах рукописи

О4?0ПА0144

2013

/

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................................................................5

Актуальность исследования............................................................................................................................................................5

Цели и задачи исследования..........................................................................................................................................................7

Основные положения, выносимые на защиту..................................................................................................7

Научная новизна исследований..............................................................................................................................................8

Теоретическое и практическое значение работы........................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Современные представления о фолдинге белков. Амилоидные

фибриллы............................................................................................................................................................................................................................12

1.1.1. Фолдинг белков................................................................................................................................................................................12

1.1.2. Возможные пути возникновения белковых агрегатов....................................................17

1.1.3. Амилоидные фибриллы in vivo............................................................................................................................21

1.1.4. Амилоидные фибриллы in vitro............................................................................................................................25

1.1.5. Структурный полиморфизм амилоидных фибрилл............................................................26

1.2. Флуоресцентный зонд тиофлавин Т - структура, фотофизические

свойства, взаимодействие с амилоидными фибриллами..................................................................29

1.2.1.Строение молекулы тиофлавина Т. Результаты квантово-химических расчетов молекулы красителя в основном и возбужденном состояниях..................................................................................................................................................................................................................29

1.2.2. Спектральные свойства тиофлавниа Т в растворителях с

различной полярностью и вязкостью..........................................................................................................................34

1.2.3. Природа «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT. Модели связывания ThT с амилоидными фибриллами........................................................................................................................................................37

1.2.4. Определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами и спектральных свойств связанного с фибриллами

красителя......................................................................................................................................................................................................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

2.1. Препараты........................................................................................................................................................................................................40

2.2. Подготовка образцов....................................................................................................................................................................40

2.3. Измерение спектров поглощения..............................................................................................................................41

2.4. Определение истинных спектров поглощения растворов со

значительным светорассеянием..................................................................................................................................................41

2.5 Измерение спектров флуоресценции......................................................................................................................42

2.6 Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции....................................................42

2.7 Электронная микроскопия........................................................................................................................................................43

2.8 Равновесный микродиализ........................................................................................................................................................43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

3.1. Спектральные свойства ТИТ и механизм связывания красителя с амилоидными фибриллами..................................................................................................................................................................48

3.1.1.Объяснение существования коротковолновых спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе..................................................................................................................................................................................................................^

3.1.2. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции ТЪТ при его встраивании в амилоидные фибриллы Флуоресцентные свойства ТЬТ в растворителях с различной вязкостью и температурой.................................................................................................

3.1.3. Модель встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы..............................................59

3.2. Структурные параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами

и фотофизические характеристики связанного красителя..............................................................61

3.2.1. Методика определения параметров связывания ТІїТ с амилоидными фибриллами.......................................................................... 63

3.2.2. Получение амилоидных фибрилл и их визуализация..................... 64

3.2.3. Определение спектров поглощения ТЬТ, связанного с амилоидными фибриллами.......................................................................... 67

3.2.4. Определение параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами......................................................................................................................................................................................................70

3.2.5. Взаимодействие ТЬТ с ацетилхолинэстеразой................................ 73

3.2.6. Универсальность предложенного подхода и возможность его использования для определения параметров связывания

поглощающих лигандов с рецепторами..........................................................................................................75

3.2.7. Определение коэффициентов молярной экстинкции ТЬТ,

связанного с амилоидными фибриллами......................................................................................................77

3.2.8. Корректировка зарегистрированной интенсивности

флуоресценции связанного с фибриллами ТЬТ..................................................................................80

3.2.9. Определение квантового выхода флуоресценции ТЪТ,

связанного с амилоидными фибриллами......................................................................................................87

3.3 Протокол определения параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами и фотофизических характеристик связанного красителя......................90

3.1.1.Определение числа мест связывания (я;) и констант связывания (Кь,) ТЪТ с амилоидными фибриллами....................................................... 90

3.1.2.Определение коэффициентов молярной экстинкции ТЪТ,

связанного с фибриллами (еь,).................................................................... 92

3.1.3. Определение квантового выхода ТЬТ, связанного с фибриллами

(Яь,)................................................................................................................. 94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................... 96

ВЫВОДЫ............................................................................................................. 99

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................. 100

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Вопрос о том, как полипептидная цепь глобулярных белков сворачивается в уникальную, компактную, высокоорганизованную, функционально-активную структуру, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Уже давно было замечено, что при сворачивании белков могут возникать частично-свернутые состояния, содержащие элементы структуры, которых нет в нативном белке и возникновение которых определяет склонность белка к образованию агрегатов [1]. Кроме того, необходимо учитывать, что жизненный цикл белка проходит в условиях густонаселенной среды клетки. При этом стимулируются процессы, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, в том числе процессы фолдинга и агрегации белков [2,3].

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. Ситуация резко изменилась, когда стало очевидным, что возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл сопряжено с возникновением многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др., которые часто называют "конформационными болезнями" [4-10]. Дальнейшие исследования показали, что образование амилоидных фибрилл - свойство, присущее не только тем белкам, фибриллогенез которых связан с возникновением болезней, но и многим другим (если не всем) белкам [11-15]. Оказалось также, что, несмотря на многообразие структур амилоидогенных белков, все амилоидные фибриллы имеют сходную архитектуру: они представляют собой неразветвленные образования, богатые бета-складчатой структурой, в которой антипараллельные бета-листы направлены перпендикулярно оси фибриллы [16,17]. В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных

фибрилл, полученных на основе разных белков, идентична. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так: были обнаружены различия в структуре амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков [18,19] и даже фибрилл, полученных при разных условиях на основе одного и того же белка [20]. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, по-видимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амилоидных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков.

Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro давно и эффективно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ThT) [21-28]. Это обусловлено высокой специфичностью взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Принято считать, что краситель не взаимодействует с белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. При взаимодействии с белками в состоянии амилоидных фибрилл, его квантовый выход флуоресценции возрастает в несколько тысяч раз, в то время как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. Несмотря на широкое использование ThT в качестве флуоресцентного зонда до сих пор нет единого мнения о механизме встраивания ThT в амилоидные фибриллы и о фотофизических свойствах этого красителя [29,30].

В последнее время стало очевидно, что ThT можно использовать не только для диагностики образования амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В связи с этим актуальной задачей является определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в исследовании взаимодействия флуоресцентного зонда ТЬТ с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков. В задачи исследования входило:

1. Изучение спектральных свойств свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ и выяснение причин возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы.

2. Определение механизма встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы.

3. Разработка методики определения параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами (числа центров связывания с различным сродством к ТИТ (мод связывания), констант связывания и числа мест связывания) и фотофизических характеристик красителя, связанного с амилоидными фибриллами (спектров поглощения, коэффициентов молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции).

4. Получение амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков и сравнение их структуры с использованием разработанного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту

1. «Коротковолновые» полосы флуоресценции (^^=440 нм) и возбуждения флуоресценции (Атах=340 нм) водных растворов ТЬТ обусловлены тем, что часть молекул имеет конформацию с нарушенной системой я-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец красителя.

2. Максимум спектра поглощения ТЬТ, встроенного в амилоидные фибриллы, сдвинут относительно максимума спектра поглощения свободного ТЬТ в водном растворе (^^=412 нм) в длинноволновую область, в то время как максимумы спектров флуоресценции свободного и связанного с фибриллами красителя близки (А^^^БО нм).

3. Значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ТЬТ (бензтиазольного и аминобензольного колец) друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

4. Существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ТЬТ в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ТЬТ встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

5. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определить параметры связывания ТЪТ с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл.

Научная новизна исследований

Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на фотофизические свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ. Дано новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ТЬТ в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ТЬТ с нарушенной системой я-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ТЬТ в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Впервые показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные

фибриллы обусловлено не только подвижностью бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ТЬТ друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и ее конформацией в основном состоянии. Были проанализированы существующие гипотезы о механизме встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы и сделано заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл не обоснованы.

Впервые для определения параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами использован метод, основанный на прямом спектрофотометрическом определении концентрации свободного и связанного с фибриллами красителя в растворах, полученных методом равновесного микродиализа. Этот подход позволяет также определять спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ТЬТ (при измерении интенсивности флуоресценции тех же растворов), взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания.

Показано что, параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида и характеристики встроенного в них красителя существенно различаются. Подход, разработанный в настоящей работе, может быть использован для изучения полиморфизма амилоидных фибрилл и сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл, полученных на основе различных белков.

Теоретическое и практическое значение

В связи с эффективным применением ТЬТ в качестве флуоресцентного зонда и перспективами его использования для изучения структуры амилоидных фибрилл, а его аналогов - в качестве терапевтических агентов, выяснение специфических особенностей этого красителя и формирование

представлений о его фотофизических свойствах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и квантовом выходе флуоресценции связанного красителя, является важным шагом на пути изучения структуры амилоидных фибрилл, что, в свою очередь, может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих фибриллообразованию, и о механизмах этого процесса. Таким образом, результаты проведенной работы могут быть существенны для понимания фундаментальных основ фолдинга и агрегации (нарушения фолдинга) белков.

Проведенные исследования имеют существенное прикладное значение в виду широкого распространения заболеваний, вызванных или сопровождающихся образованием амилоидных фибрилл. Показано, что образованием амилоидных бляшек сопровождаются все нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Пика. Известны также амилоидозы, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осл