Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков

Кузнецова, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков"

На травах рукописи

КУЗНЕЦОВА Ирина Михайловна

МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ, НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТЫХ И АГРЕГИРОВАННЫХ ФОРМ БЕЛКОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

Доктор физико-математических наук ТУРОВЕРОВ Константин Константинович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН

Зашита состоится "03" марта 2006 года я 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте циюлогии РАН но адресу: 194064. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4, факс 7(812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института антологии РАН (194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр.. 4).

Лторефераг разослан "02" февраля 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного сонет».

Доктор биологических наук, профессор ВОРОБЬЕВ Владимир Иосифович

Доктор биологических наук, профессор ЛЕВИЦКИЙ Дмитрий Иванович,

Доктор биологических наук, профессор ПЕРМЯКОВ Евгений Анатольевич

%C>OG& 1S& Ъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное, компактное, высокоорганизованное, функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов современной молекулярной и клеточной биологии. По современным представлениям аминокислотная последовательность каждого конкретного белка, возникшая в результате эволюционного отбора, такова, что в ней запрограммирована структура нативного состояния, путь ее достижения и существование свободноэнергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями белка. Последнее означает, что макромолекула белка может находиться либо в нативном, либо в денатурированном состоянии. При этом все макромолекулы нативного белка идентичны, если не считать различий структуры, обусловленных броуновским движением входящих в их состав атомов. Денатурированных состояний может быть несколько. Идентичность всех молекул каждого конкретного белка в нативном состоянии исключительно важна для его правильного функционирования. Каждому денатурированному состоянию отвечает ансамбль молекул, отличающихся друг от друга по структуре.

Хотя в клетке имеется много факторов, вовлеченных в процесс правильного сворачивания полипептидной цепи (ферменты, ответственные за цис-транс изомеризацию пролина и образование "правильных" дисульфидных связей, и шапероны), ни один из этих факторов не несет той информации, которая необходима для приобретения полипептидной цепью уникальной нативной структуры, и присутствие этих факторов не всегда является необходимым условием правильного сворачивания белка. Многие белки могут правильно сворачиваться из полностью развернутого состояния in vitro. Несмотря на огромное число работ, посвященных фолдингу белков, вопрос о том, каким образом в аминокислотной последовательности белка закодирована его уникальная третичная структура (то, что называют иногда второй частью генетического кода), остается открытым. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их разворачивания-сворачивания и характеристика возникающих при этом промежуточных денатурированных частично-свернутых и неправильно свернутых состояний. Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодоменных белках, для которых процесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей разворачивания-сворачивания более сложных мультидоменных белков, выяснение вопроса о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует

Принятые сокращения: АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфонат, CD - круговой дихроизм, GdnHCl - гуанидинхлорвд, ФКТ - фосфоресценция при яимна гной-температуре.

ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ , БИБЛИОТЕКА {

с размером и мультидоменностью белка, а также то, насколько путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных чистично-свернутых состояний белка зависит от характера денатурирующего воздействия.

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. В настоящее время совершенно очевидно, что изучение агрегации белков в процессе фолдинга имеет не только фундаментальное научное, но и большое практическое значение. Оказалось, что биотехнологический процесс получения ре-комбинантных белков очень часто осложнен возникновением аморфных агрегатов, накапливающихся в телах включения [1-3]. Возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл, является причиной так называемых "конформационных болезней" - многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др. [4 -12].

Успех исследований всегда в значительной степени зависит от наличия хорошо отработанных и адекватных методов. Флуоресцентный краситель тиофлавин Т специфически взаимодействует только с белками в состоянии амилоидных фибрилл, и при этом интенсивность его флуоресценции возрастает на несколько порядков. Благодаря этим уникальным свойствам тиофлавин Т является прекрасным средством для диагностики возникновения амилоидных фибрилл в различных тканях и органах и, кроме того, для изучения фибриллозенеза и свойств амилоидных фибрилл in vitro [13, 14, 15]. Однако свойства этого красителя остаются мало изученными (см. Воро-пай и др., 2003)'. В связи с этим представлялось чрезвычайно актуальным выполнить исследования спектральных свойств этого красителя, которые бы позволили понять причины существенного (на несколько порядков) увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей разворачивания-сворачивания однодоменных и двухдоменных белков и свойств возникающих при этом промежуточных состояний, а также агрегированных форм белков, приводящих к необратимости процесса их денатурации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач: 1) Выяснить, насколько одностадийность и обратимость разворачивания- сворачивания коррелирует с размером и мультидоменностью белка. С этой целью изучить процессы разворачивания-сворачивания ряда двухдоменных белков (глобулярного актина, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и одно-доменного белка - карбоангидразы П;

' Здесь и далее в круглых скобках приводятся ссылки на работы, представленные в списке публикаций по теме диссертации.

2) Выяснить, насколько путь разворачивания каждого конкретного белка, последовательность и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний зависит от характера денатурирующего воздействия;

3) Изучить кинетику разворачивания-сворачивания глобулярного актина, механизмы образования инактивированного актина, охарактеризовать свойства кинетических ин-термедиатов, возникающих в процессе разворачивания этого белка;

4) Исследовать, на примере глутамин-связывающего белка, роль лигандов в стабилизации структуры белков к денатурирующему воздействию GdnHCl и нагревания;

5) Выяснить, на примере флуоресцентных белков EGFP, DsRed и их мутантных форм, особенности процессов разворачивания-сворачивания белков типа р-бочонка и роль четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса;

6) Осуществить разработку новых методических подходов для изучения процессов разворачивания-сворачивания белков и для исследования свойств возникающих при этом интермедиатов и агрегированных форм белков и, в частности, выяснить причины существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т при взаимодействии с амилоидными фибриллами.

Научная новизна. Ряд результатов, полученных при изучении процессов разворачивания-сворачивания конкретных белков, получен впервые, в частности, впервые установлено одностадийное, обратимое разворачивание дисульфидизомеразы С, муль-тистадийное, но обратимое разворачивание креатинкиназы и глутамин-связывающего белка под действием GdnHCl. Физико-химическими методами впервые прямо показаны изменения структуры креатинкиназы под воздействием небольших концентраций GdnHCl (0.1 М), ранее обнаруженные по изменению каталитической активности фермента. Предложена и обоснована принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания актина, учитывающая существование вновь обнаруженных кинетических интермедиатов N* и U*, а также то, что инактивированный актин, ранее считавшийся интермедиатом на пути разворачивания белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. Впервые на примере инактивированного актина показано, что GdnHCl может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков. Впервые флуоресцентные свойства тиофлавина Т (низкий квантовый выход в водных и спиртовых растворах и существенное возрастание квантового выхода при инкорпорации в амилоидные фибриллы) ассоциированы с принадлежностью этого красителя к классу соединений, известных как молекулярные роторы.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. Путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не зависит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры белка при связывании лиганда.

2. Способность белков к одностадийному обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностью.

3. Вновь обнаруженные промежуточные состояния актина N* и U* являются кинетическими интермедиатами на пути разворачивания-сворачивания актина, в то время как инактивированный актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. На основании этих данных предложена принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания глобулярного актина.

4. Четвертичная структура зеленых и красных флуоресцентных белков EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), "dimer2" (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) не является единственным фактором, определяющим различия в их стабильности.

5. Химический денатурант GdnHCl, часто используемый при изучении фолдинга белков, может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков.

6. Причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофла-вина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец друг относительно друга в возбужденном состоянии. Флуоресцентные свойства тиофла-вина Т характерны для соединений, относящихся к классу молекулярных роторов.

Теоретическая и практическая значимость. Сформулированная на основе полученных в работе экспериментальных результатов концепция универсального характера механизма разворачивания-сворачивания каждого конкретного белка, согласно которой путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний белка не зависит от характера денатурирующего воздействия, а также заключение о том, что способность белков к одностадийному и обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностью обогащают представления о процессах разворачивания-сворачивания белков и могут быть использованы при дальнейших исследованиях процесса их фолдинга.

Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного актина в процессе разворачивания-сворачивания

могут являться основой для понимания процессов фолдинга актина in vivo и для проведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации полностью развернутого актина in vitro с участием факторов, способствующих сворачи-ваниию актина в клетке (шаперонина ССТ и префолдина).

Обнаруженную на примере инактивированного актина способность GdnHCl при определенных условиях вызывать агрегацию белков следует учитывать в дальнейшем при использовании GdnHCl в качестве денатуранта в работах по изучению фолдинга белков.

Механизм существенного возрастания интенсивности флуоресценции тиофлави-на Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы объяснен на основании представления о том, что тиофлавин Т относится к классу молекулярных роторов. Этот результат имеет существенное значение при проведении работ по исследованию фиб-риллогенеза и изучению свойств амилоидных фибрилл.

Введен в практику исследований фолдинга белков метод, основанный на параметрическом представлении экспериментальных данных, предложенный еще в 1975 г. Бурштейном [16-17], но долгое время практически не использовавшийся. Метод уже широко используется не только в нашей Лаборатории, но и в других лабораториях (см. например, [18-19]).

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов Кафедры биофизики СТТбГПУ.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 15 Международном симпозиуме биохимиков и молекулярных биологов стран Азии и Океании (FAOBMB) "Биохимия и молекулярная биология 21 века" (Пекин, Китай, 2000); Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые направления исследований" (Пущино 2001, 2004); 9-й Международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Прага, Чехия, 2001); Международных научных конференциях "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, Беларусь, 2002, 2004); Ш Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2002); Национальной итальянской конференции по биохимии (Рим, Италия, 2003), Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), П Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, 2006, пленарный доклад).

ГФЕН-Китай, 02-04-81013 Бел, 02-04-81018 Бел, 04-04-49290), Программы РАН "Молекулярная и клеточная биология", COBAS, INT-0002341(USA), INTAS (грант 012347), NATO Collaborative Linkage Grant PST.NR.CLG 981025 (Italy).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 28 статей в рецензируемых журналах (11 - в отечественных и 17 - в международных журналах), а также тезисы 16 докладов на всероссийских и международных конференциях, совещаниях и съездах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, четырех Глав, Выводов и Списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении сформулированы цели и задачи исследований, обоснована их актуальность, приводятся основные положения, выносимые на защиту, рассмотрен вопрос о новизне, теоретической и практической значимости сделанных выводов.

Глава 1. Современные представления о процессах фолдинга белков

В этой главе дан краткий обзор современных представлений о фолдинге белков in vivo и in vitro. Рассмотрена роль шаперонов при фолдинге белков в клетке, особое внимание уделено роли АТФ-зависимых шаперонов Hsp70 и шаперонина ССТ в клетках эукариот. Обсуждаются различные модели сворачивания белка in vitro (модель "нуклеации - роста", "стадийного сворачивания" и модель "энергетической воронки"), роль промежуточных денатурированных частично-свернутых состояний белков и переходного состояния в образовании нативного белка. Рассмотрены механизмы возникновения агрегированных форм белков и, в частности, амилоидных фибрилл (Кузнецова и др., 2005о).

Глава 2. Материалы и методы

В этой главе дано краткое описание использованных в работе материалов и методов. Сведения о новых собственных методических разработках, использованных при проведении исследований, а также о тех результатах работы, учет которых может быть полезным при проведении исследований процессов разворачивания-сворачивания белков в дальнейшем, представлены в Главе 4.

Глава 3. Факторы, определяющие стабильность и особенности процессов разворачивания-сворачивания одиодомениых и двухдоменных белков

В этой главе приведены результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания ряда двухдоменных белков: глутамин-связывающего белка, дисульфи-

дизомеразы С, актина и креатинкиназы. Цель этих исследований состояла в том, чтобы выявить особенности разворачивания-сворачивания этого класса белков и, в частности, рассмотреть вопрос о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует с размером, мультидоменностью и наличием лигацдов, стабилизирующих белок. В этой же главе, на примере карбоанщдразы П, показана возможность мультистадийного необратимого разворачивания белка, имеющего однодомен-ную структуру. Результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания карбоанщдразы П интересны также в связи с тем, что при переходе этого белка в состояние расплавленной глобулы проявляется эффект агрегирующего действия GdnHCl (см. раздел 4.4). Представлены также результаты сравнительного изучения устойчивости к денатурирующему воздействию GdnHCl ряда зеленых и красных флуоресцентных белков, отличающихся по их принадлежности к различным олиго-мерным формам: мономера (EGFP) и тетрамера (zFP506) зеленого флуоресцентного белка, мономера (mRFPl), димера ("dimer 2") и тетрамера (DsRedl) красного флуоресцентного белка предпринятые для выяснения роли четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса.

3.1. Обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка. Роль ли-ганда в стабилизации структуры. Глутамин-связывающий белок из Е. coli относится к обширному классу двухдоменных лиганд-связывающих белков периплазмы, участвующих в процессе активного транспорта различных молекул через цитоплазматическую мембрану. Все белки этого класса имеют сходную структуру. Они состоят из двух глобулярных доменов, между которыми в глубокой щели расположен сайт связывания лиганда (рис.3.1.1, вставки).

Равновесные зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции и параметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции, от концентрации GdnHCl свидетельствуют о существовании по крайней мере двух переходов в области концентраций от 0 до 3 М GdnHCl (рис. 3.1.2, а). Первый переход начинается при 0.2 М и заканчивается при 0.7 М, второй - при 1.4 М и заканчивается при 2.1 М GdnHCl. В то же время величина анизотропии флуоресценции остается неизменной вплоть до 1.4 М GdnHCl, т.е. до начала второго перехода (рис. 3.1.2, б).

Параметрическое представление результатов стационарных измерений зависимости интенсивностей флуоресценции /32о и 1Ш от концентрации GdnHCl показало существование двух промежуточных состояний при разворачивании глутамин-связывающего белка: N=^1, з=?12=?и (рис.3.1.1). Существенное увеличение флуоресценции АНС в области первого перехода (рис.3.1.2, г) можно связать с возникновением состояния типа "расплавленной глобулы". Хотя при переходе N=^11 наблюдается уменьшение эллиптичности в дальней УФ-области спектра, в состоянии

Рис. 3.1.1. Параметрические зависимости между интенсивно-стями флуоресценции, измеренными при длинах волн регистрации 320 нм (/зю) и 365 нм (/збз), характеризующие процесс разворачивания глутамин-свя-зьшающего белка (кривая 7, открытые символы) и его комплекса с глутамином (кривая 2, открытые символы) под действием GdnHCl. Параметр - концентрация GdnHCl. Закрытые символы отвечают процессу ре-натурации глутамин-связываю-щего белка. Числа - концентрации GdnHCl.

Вставки: Пространственная структура глутамин-связывающего белка (левый верхний угол) и его комплекса с глутамином (правый нижний угол).

Показаны триптофановые остатки, тирозиновые остатки; и Lys 166, входящий в состав микроокружения Тгр 220, и Gin (сферы). Образование комплекса GlnBP/Gln приводит к схлопыванию макромолекулы белка вокруг Gin и к закрытию щели. Использованы данные Protein Data Bank [20], файлы lGGG.ent [21] и lWDN.ent [22]. При подготовке рисунка использованы графические программы VMD [23] и Raster 3D [24].

огаед.

Рис. 3.1.2. Конформационные переходы глутамин-связывающего белка (кривые 1) и его комплекса с глутамином (кривые 2) под действием GdnHCl.

а - изменение параметра А = hnJhfa, 'Котб =297 нм; б - изменение анизотропии флуоресценции, ^■•<»6 = 297 нм, Хрег = 365 нм; в -изменение эллиптичности при 222 нм; г - изменение интенсивности флуоресценции АНС, Хюзв = 365 нм, Хрет = 480 нм. Открытые символы - разворачивание, закрытые

1 2 3 [GdnHCl], M

Ii сохраняется выраженная вторичная структура (рис.3.1.2, в). Несмотря на сложный характер разворачивания глутамин-связвающего белка под действием GdnHCl, его денатурация полностью обратима (рис.3.1.1 и 3.1.2).

Так как глутамин-связывающий белок является двухдоменным, нельзя не учитывать возможность того, что домены разворачиваются последовательно. В то же время, переход N—-1| нельзя объяснить разворачиванием малого домена (который не имеет триптофановых остатков), так как он сопровождается существенными изменениями флуоресцентных характеристик. С помощью метода FT1K была показана более низкая термочувствительность а-спиралей белка по сравнению с ^-листами [25]. Возможно, а-спирали глутамин-связвающего белка также менее устойчивы к денатурирующему действию GdnHCl. Таким образом, мы можем предположить, что в нашем случае, переход N—-I, сопровождается разворачиванием а-спиралей, тогда как переход I, —► 12 связан с разрушением р-листов.

Связывание лиганда приводит к тому, что изменения в структуре белка начинаются при гораздо больших концентрациях GdnHCl. Создается впечатление, что разворачивание комплекса происходит с образованием лишь одного (второго) промежуточного состояния (рис. 3.1.2). Параметрическая зависимость, построенная для комплекса белка с лигандом, однако, однозначно свидетельствует о том, что разворачивание комплекса происходит по такому же сценарию с образованием двух промежуточных состояний, что и для глутамин-связвающего белка. Таким образом, разворачивание глутамин-связвающего белка под действием GdnHCl является трехстадий-ным и обратимым. Связывание лиганда (Gin) приводит к тому, что структура становится более устойчивой к денатурирующему действию GdnHCl. Это, в свою очередь, приводит к кооперативному разворачиванию структуры по достижении соответствующей концентрации денатуранта (Степаненко и др., 2005а; Staiano et al., 2005).

3.2. Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы. Креатинкиназа, относящаяся к классу фосфотрансфераз, играет важную роль в быстрой регенерации АТР в клетках. Цитоплазматическая креатинкиназа из мышц кролика - димер. Мономер белка состоит из двух доменов: а-спираль-ного N-концевого домена из 100 аминокислотных остатков и большого С-концевого домена из 250 аминокислотных остатков, соединенных между собой длинным лин-керным участком (рис.3.2.1). Интерес к исследованию креатинкиназы был обусловлен тем, что изменение ферментативной активности этого белка [29] начинается при концентрациях денатурирующих агентов значительно меньших чем те, при которых были зарегистрированы изменения структуры фермента физико-химическими методами. Поэтому при изучении процессов разворачивания-сворачивания предполагалось обратить особое внимание на изменения структуры белка при малых концентрациях

-10000

^-120

190 200 210 220 230 240 250 Длина волны, им

Рис. 3.2.4

260 280 300 320 340 Длина волны, нм

Рис. 3.2 J

0.5 0.6 0 7 0.8 0 9 10 1.1

огн. ед.

Рис. 3.2.6

Рис. 3.2.1. Пространственная структура макромолекулы креатинкиназы. Показана локализация триптофановых и тирозиновых остатков. Использованы данные Банка белковых структур [20], файл 2СЮС.е1й [28]. Для построения изображений использовали графические программы УЖ) [23] и Каз(егЗО [24].

Рис. 3.2.2. Спектры флуоресценции креатинкиназы при различных концентрациях ШпНС1. Хщотб = 297нм. Числа - концентрации (Зс1пНС1.

Рис. 3.2.3. Изменение спектра СИ креатинкиназы в ближней УФ-области при денатурации СМпНС1. Спектры измерены при 0.00, 0.50, 0.75, 1.15, 1.35, 1.60, 1.90, 2.20, 2.60, 2.90, 3.25, 3.60, 4.00, 4.50, 5.00, 5.50, 6.00 и 6.50 М (Зс1пНС1. Вставка: зависимость величины эллиптичности при 222 нм от концентрации Ос)пНС1. Закрытые символы - денатурация, открытые -ренатурация.

Рис. 3.2.4. Изменение спектра СО креатинкиназы в дальней УФ-области при денатурации СИпНС1. Спектры измерены при 0.00, 0.12, 0.29, 0.39, 0.49, 0.63,0.92, 1.50 и 2.30 М 6<1пНС1.

Вставка: зависимость величины эллиптичности при 280 нм от концентрации (МпНС!. Закрытые символы - денатурация, открытые - ренатурация.

Рис. 3.2.5. Изменение гидродинамических размеров креатинкиназы под действием СИпНС1. Вставка: характерные профили элюции. Числа - концентрации (ИпНС1.

Рис. 3.2.6. Параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресценции креатинкиназы, измеренными при 320 нм (/320) и 365 нм (/365), построенная на основании стационарных зависимостей изменения интенсивности флуоресценции от концентрации Ос1пНС1. Закрытые и открытые символы соответствуют процессам денатурации и ренатурации, соответственно. Параметр - концентрация ОМлНО. Показаны флуоресцентные характеристики, соответствующие нативному (14), промежуточным (Т| и Ь) и полностью развернутому (Ц) состояниям. Числа - концентрации ОйпНО. Вставка: Зависимость параметра А = (Ьт/Ьь^гп (1) и анизотропии флуоресценции (2) от концентрации 0ИпНС1.

Рис. 3.2.7. Зависимость содержания а-спиралей (кривая 1), р-структур (кривая 2) и бесструктурных областей (кривая 3), определенного на основании анализа спектров СО, измеренных при разных концентрациях СМпНС1.

денатурата. К моменту начала проведения этой работы в литературе не было единого мнения относительно числа и свойств промежуточных состояний, возникающих при разворачивании креатинкиназы под действием Ос1пНС1. В то же время было известно, что процесс разворачивания креатинкиназы осложнен ассоциацией частично-свернутых интермедиатов. В связи с этим одна из задач работы состояла в том, чтобы выявить и охарактеризовать возникающие в процессе разворачивания-сворачивания

промежуточные состояния и агрегированные формы белка (см. Кшийвоуэ ег а1., 2002а).

Даже беглый взгляд на изменение спектра флуоресценции креатинкиназы под действием Ос1пНС1 (рис.3.2.2) позволяет судить о сложности происходящих в белке структурных превращений. На основании анализа изменений величины СП в ближней и дальней УФ-областях спектра (рис. 3.2.3 и 3.2.4) и изменения гидродинамического объема (рис.3.2.5), происходящих под действием ОёпНО, можно сделать заключение о том, что процесс разворачивания-сворачивания креатинкиназы происходит с образованием по крайней мере двух частично-свернутых промежуточных состояний. Первый интермедиат возникает в области 0.5-0.6 М Ос1пНС1. Белок в этом состоянии элюирует с колонки одним пиком, отвечающим радиусу Стокса Ях=33.7 А, в то время как нативная креатинкиназа также элюирует с колонки одним пиком, соответствующим Лг=35.3А, что хорошо согласуется с литературными данными (см. Кигг^здуа Л а1., 2002а ) и подтверждает данные о том, что в нативном состоянии креатинкиназа является димером. Изменение радиуса Стокса при денатурации Ос5пНС1 объяснено диссоциацией белка на мономеры, имеющие больший объем, чем в составе димера нативного белка. Белок в этом состоянии является компактным ин-термедиатом, имеющим вторичную структуру, сходную со вторичной структурой нативного белка, но несколько нарушенную третичную структуру, т.е. напоминает интермедиат типа расплавленной глобулы. Интересно, однако, отметить, что криатин-киназа уже в нативном состоянии связывает АНС и интенсивность флуоресценции красителя лишь незначительно возрастает при увеличении концентрации С<ЗпНС1, причем максимальная интенсивность АНС наблюдается в растворах 0.3 М Ос1пНС1. Второй интермедиат наблюдается в области 2.0-2.5 М Ос1пНС1 и характеризуется нарушением вторичной структуры и увеличением т.е. имеет свойства, характерные для состояния тала "предшественник расплавленной глобулы".

С помощью метода собственной УФ-флуоресценции удалось также зафиксировать изменения структуры белка при небольших концентрациях денатуранта (0.1 М С<1пНС1). Зависимости величины параметра А и анизотропии флуоресценции (рис. 3.2.6, вставка) свидетельствуют о существовании двух интермедиатов 1| и 12 при 0.1 и 0.6 М ОтдпНС1, соответственно. Обращает на себя внимание тот факт, что с помощью метода собственной УФ-флуоресценции впервые удалось показать возникновение промежуточного состояния под действием малых концентраций ОйпНС1, ранее зафиксированного по изменению каталитической активности фермента [29], но не удалось зарегистрировать промежуточное состояние в области 2.0-2.5 М 0<!пНС1, существование которого было показано с помощью методов СП и гельпропикающей хроматографии. Однако все три промежуточных состояния креатинкиназы удалось за-

фиксировать с использованием метода, основанного на построении параметрических зависимостей (рис.3.2.6).

Интересно отметать, что промежуточное состояние, возникающее при 2.0-2.5 М ОсЗпНС1, обогащено (3-структурами (рис.3.2.7), наличие которых является явной предпосылкой к образованию агрегатов. Дальнейшее подтверждение существования агрегатов было получено методом гельпроникающей хроматографии (см. Кигпйвоуа е1 а1., 2002а). Надо подчеркнуть, что агрегация, наблюдаемая при разворачивании креатинкиназы, необычна. Хорошо известно, что агрегация частично-свернутых белков является основной причиной того, что процессы денатурации необратимы. Однако в случае креатинкиназы показана высокая обратимость процессов разворачивания. Более того, было установлено, что растворимые агрегаты, накапливающиеся при разворачивании креатинкиназы, полностью ренатурирутот после удаления денатурирующих агентов.

3.3. Множественность денатурированных частично-свернутых состояний одиодоменного белка - карбоангидразы П. Карбоангидраза - небольшой однодо-менный цинк-содержащий белок с выраженной р-складчатой структурой (рис. 3.3.1), единственная полипептидная цепь которого состоит из 259 аминокислотных остатков. Карбоангидраза является ферментом, относящимся к классу карбонат-дегидротаз. Относительно небольшие размеры карбоангидразы (29 кБа), отсутствие дисульфид-пых связей и свободных ЯН-групп сделали карбоангидразу предметом интенсивного изучения процессов разворачивания-сворачивания ([31], см также ссылки в ВшЬша-ппа й а1., 2001). Изучение разворачивания-сворачивания этого фермента было предпринято, в связи с надеждой выявить (используя параметрическое представление экспериментальных данных по разворачиванию-сворачиванию) новые, ранее неустановленные промежуточные состояния и, в частности, состояние, обусловленное стабилизирующим действием на структуру белка малых концентраций Ос)лНС1, подобно промежуточному состоянию, обнаруженному для креатинкиназы при 0.1 М 0<Зп11С1.

С помощью метода собственной УФ-флуоресценции установлено существование трех конформационных превращений карбоангидразы под действием Сс!пНС1: N —-1| при изменении концентрации 0<ЗпНС1 от 0 до 0.1 М, 1| при изменении

концентрации Ос1пНС1 от 0.1 до 1.0 М, и Т2 -=:=г и в области концентрации йс1пНС1 от 1.0 до 2.2 М (рис. 3.3.2 и 3.3.3).

Регистрация интенсивности флуоресценции АНС, однако, показала, что разворачивание карбоангидразы под воздействием 0(1пНС1 в области концентраций 1.0-2.2 М проходит через образование промежуточного состояния, максимальное содержание которого наблюдается при 1.5 М СсЗпНС1. В этом состоянии белок имеет более высокое значение анизотропии флуоресценции по сравнению с нативным ферментом,

Рис. 3.3.1. Пространственная структура карбоангидразы II.

Показана локализация триптофано-вых и тирозиновых остатков, а также иона цинка Использованы данные Банка белковых структур [20], файл 1У9Е.егй [30]. Для построения изображений использовали графические программы УМ1) [23] и {ЪШегЗЭ [24].

Рис. 3.3.2. Денатурация карбоангидразы II гуанидингидрохлоридом.

Показаны изменения параметра А = Л20//365 (кривые 1, 2), анизотропии флуоресценции (кривые 3, 4) и интенсивности флуоресценции АНС (кривые 5, б). Кривые 1, 3, 5 - денатурация (закрытые символы), кривые 2, 4,6- рена-турация (открытые символы).

Рис.3.3.3. Параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресценции 1ш и 1зб5, характеризующая разворачивание-сворачивание карбоангидразы II под действием СИпНО.

Параметр - концентрация 0(1пНС1. N -нативное состояние, 11; 12 и 13 — промежуточные состояния, возникающие при 0.1,1.0 и 1.5 М С<1пНС1, и - развернутое состояние при 3.0-6.0М в(1пНС1. Закрытые символы - денатурация, открытые и серые - ренатурация из 6.0 М и 1.2 М СМлНС!, соответственно.

а также существенно (в 100 раз) более высокую интенсивность флуоресценции АНС (рис.3.3.2). Это промежуточное состояние (13) никак не проявляется на кривых зависимости интенсивностей флуоресценции /320, Ьы и параметра А от концентрации GdnHCl, а также при параметрическом представлении изменения интенсивности флуоресценции при длинах волн 320, 365 нм. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что величины характеристик /32о, Ььь и А для состояния 13 имеют промежуточные значения по сравнению с соответствующими значениями для состояний 12 и U (Kuznetsova et al., 2002 b; Turoverov et al., 2002 b; Kuznetsova et al., 2004).

3.4. Одностадийный обратимый характер разворачивания-сворачивания дисульфидизомеразы С. Дисульфидизомераза С из Escherichia coli — это растворимый белок бактериальной периплазмы, который отвечает за образование "правильных" дисульфидных связей во вновь синтезированных белках. В связи с этим дисульфидизомераза С считается бактериальным аналогом изомеразы дисульфидных связей (PDI) эндоплазматического ретикулума эукариот. Подобно PDI, дисульфидизомераза С обладает шаперонной активностью даже более выраженной, чем у PDI (см. ссылки в работах Кузнецова и др., 20056; Stepanenko et al., 2004 а). Макромолекула дисульфидизомеразы С имеет V-образную форму, в которой каждая ветвь представляет собой одну субъединицу гомодимера. Каждая субъединица состоит из N-концевого домена, ответственного за ассоциацию субъединиц, и С-концевого тиоредоксинподоб-ного (Тгх) домена, которые связанны между собой подвижной спиралью [32] - рис. 3.4.1.

Нами было установлено, что стационарные зависимости всех флуоресцентных характеристик дисульфидизомеразы С (/32(ь /зв5, Л) от содержания в растворе GdnHCl имеют S-образный характер, причем все изменения происходят в узком интервале концентраций денатуранта (рис. 3.4.2) (Stepanenko et al., 2004; Кузнецова и др. 2005 б). Наличие изобестической точки при 340 нм для спектров флуоресценции (рис. 3.4.3), свидетельствует о том, что разворачивание дисульфидизомеразы С под действием GdnHCl является одностадийным.

Для подтверждения этого предположения на основании измерения стационарных зависимостей интенсивности флуоресценции /320 и /зб5 от концентрации GdnHCl была построена параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресценции /320 и 1365 (параметр - концентрация GdnHCl). Аналогичная параметрическая зависимость была построена на основании кинетических измерений интенсивностей флуоресценции /32о и /365 при переводе белка в раствор GdnHCl с концентрацией 2.4 М (параметр - время). Оказалось, что обе параметрические зависимости хорошо аппроксимируются прямыми и совпадают друг с другом (рис. 3.4.4).

Рис. 3.4.1. Пространственная структура ОяЬС.

Показаны атомы серы дисульфидных связей. При подготовке рисунка использованы графические программы УЖ) [23] и Ка^егЗБ [24]. Использованы данные Банка белковых структур [20], файл ШЕ-Г.еШ [38].

Рис. 3.4.2. Денатурация ОвЬС под действием (5<1пНС1.

Интенсивность флуоресценции, измеренная при 320 нм (кривая 7) и при 365 нм (кривая 2).

Длина волны, нм

Рис. 3.4.3. Изменение спектра флуоресценции Г)зЬС при денатурации СйпНС1.

1- усредненный спектр флуоресценции при 0.0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 и 1.75 М СйпНС1; 2, 3, 4, 5 и б, спектры флуоресценции при 2.0, 2.2, 2.4, 2.6 и 2.8 М СМпНС1, соответственно; 7 - усредненный спектр флуоресценции при 3.0, 4.0, 5.0 и 6.0 М СМпНС!. Я« = 297 нм.

0.4 0.6 0.8 1.0 /320, отн.ед.

Рис. 3.4.4. Параметрическая зависимость между /320 и /365 им ОвЬС.

Открытые символы - данные стационарных зависимостей интенсивности флуоресценции от концентрации СйпНС1. Точки - данные кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции под действием 2.4 М СИпНС1 (параметр - время). Хт = 297 нм.

Эксперименты по ренатурации дисульфидизомеразы С свидетельствуют об обратимом характере процесса денатурации. Таким образом, денатурация этого двух-доменного димерного белка под действием Ос1пНС1 является обратимой и осуществляется по принципу "все или ничего".

3.5. Кинетические иитермедиаты на пути разворачивания-сворачивания белков. Новое представление о процессах разворачивания-сворачивания актина. Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения, является глобулярным двух до менньтм белком. При низкой ионной силе актин является мономером (О-актин), в присутствии нейтральных солей он полимеризуется с образованием двухнитевой спирали (Р-актин). Р-актин является основным компонентом тонких фи-ламентов мышечной ткани. В состав макромолекулы актина входит одна молекула АТФ и прочно связанный двухвалентный катион Са2+ ([33], рис. 3.5.1).

До недавнего времени считалось, что процесс разворачивания-сворачивания актина проходит через стадию образования промежуточного состояния, получившего название инактивированного актина [34-37]. Было показано, что денатурированное состояние, в котором актин не способен к полимеризации (инактивированный актин), возникает при отщеплении катиона кальция, в результате тепловой денатурации, под воздействием умеренных концентраций мочевины или С(ЗпНС1, путем диализа из растворов 8 М мочевины или 6 М Ос1пНС1 и даже спонтанно при длительном хранении препаратов (см. [37-42]).

Характер равновесных (а точнее квазиравновесных) зависимостей ряда флуоресцентных характеристик актина от концентрации С(ЗпНС1, казалось бы однозначно свидетельствует о существовании двух последовательных конформационных переходов и о существовании области концентраций Ос1пНС1, в которой актин находится преимущественно в инактивированном состоянии (рис. З.5.2.). На основании подобного рода данных во всех без исключения работах, посвященных денатурации актина, считалось, что инактивированный актин (I) является промежуточным состоянием между нативным (Ы) и полностью развернутым (Ц) состоянием белка: N—-1 -—- И. В эту схему, однако, совершенно не укладывались данные о том, что инактивированный актин является термодинамически стабильным монодисперсным ассоциатом, состоящим из 15 мономерных единиц [40, 41]. В связи с этим в настоящей работе было предпринято более тщательное, с привлечением новых методических подходов, исследование равновесных (квазиравновесных) денатурационных зависимостей, а также кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина.

Характер кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции (рис.3.5.2), параметра А и анизотропии триптофановой флуоресценции (кривые с минимумом при концентрациях всМНС! 1.2 - 1.5 М; свидетельствует о том, что переход из нативного

Рис. 3.5.1. Пространственная структура молекулы актина

Показаны триптофановые остатки, тиро-зиновые остатки катиона Са2' и молекула АТФ Римские цифры - субдомены актина Использованы данные Protein Data Bank [20], файл lATNent [33] При подготовке рисунка использовали графические программы VMD [23] и Raster 3D [24]

_I-1-1_I_У/-* и_1_1_1_1_L-

0 100 200 300 400 24 0 1 2 3 4 5 Время, с ч [GdnHCl], М

Рис. 3.5.2. Изменение интенсивности собственной флуоресценции актина при его денатурации (К,* = 297 нм; Хр«г = 320 нм).

а - Кинетика денатурации актина под действием (МпНС1 Числа - концентрации Ос1пНС1, М, б - зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации &1пНС1, зарегистрированная после 24 ч инкубации белка в вМО ; открытые и закрытые символы соответствуют экспериментам по денатурации и ренагурации, соответственно Вставка' Спектры флуоресценции нативного (И), инактивированного (I), и полностью развернутого (Ц) актина А«^ = 297 нм

0.35 0 40 0.45 0.50 0 55 /363, отн. ед.

Рис. 3.53. Параметрические зависимости между интенсивностями флуоресценции /32о и 5, характеризующие кинетику разворачивания нативного актина под действием (МпНС1

Параметр - время, прошедшее после добавления к нативному актину растворов (МпНС1 различной концентрации, числа - концентрация СИпНС1, М Большая часть экспериментальных точек соответствует первым 10 мин после перевода белка в растворы вдпНС! соответствующей концентрации. Конечные точки (символы большего размера) - зарегистрированы после 24 ч инкубации. За единицу принята интенсивность флуоресценции нативного актина, Хрег =320 нм.

состояния в инактивированное осуществляется через некоторое промежуточное состояние, в котором интенсивность флуоресценции, параметр А и величина анизотропии флуоресценции меньше, чем в нативном и в инактивированном состояниях: N —► и" -—' I, где Ц* - существенно развернутый кинетический интермедиат, флуоресцентные свойства которого сходны со свойствами полностью развернутого актина (Тигоуегоу е1 а1., 2002 а; Поварова и др., 2005).

Для выяснения природы кинетического интермедиата и*, предшествующего образованию инактивированного актина, кинетические зависимости интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм, были использованы для построения параметрических зависимостей (рис. 3.5.3). Характер параметрической зависимости при денатурации актина под действием 1.8 М вс1пНС1 однозначно свидетельствует о существовании кинетического интермедиата между нативным и инакти-вированным актином. Точка на диаграмме, в которой пересекаются прямые, отвечающие процессу разворачивания нативного актина (ЪГ—-и*) и процессу образования инактивированного актина из существенно развернутого состояния (и*—»I), характеризует свойства кинетического интермедиата (и*). Величина параметра А для кинетического интермедиата и* оказалась выше соответствующей величины для полностью развернутого актина. Этот результат позволил сделать заключение о том, что свойства кинетического интермедиата не идентичны свойствам полностью развернутого актина в 6М Ос1пНС1.

Несколько неожиданным результатом построения параметрических зависимостей явилось то обстоятельство, что зависимости, отвечающие процессам разворачивания актина под воздействием С<ЗпНС1 различной концентрации, исходят не из одной точки, соответствующей нативному белку (N1), а из разных точек (см. рис. 3.5.3). Эксперименты по изучению быстрой кинетики структурных превращений актина под действием Сс1пНС1 различной концентрации с использованием оборудования стоп-флоу позволили показать существование интермедиата предшествующего образованию существенно развернутого кинетического интермедиата и*. Результаты работы Альтшулера и др. [18] позволили предположить, что кинетический интермедиат И* - это интермедиат типа расплавленной глобулы, возникающий при диссоциации иона кальция. Тогда и* - это, скорее всего, интермедиат типа "предшественник расплавленной глобулы" (Кигпйвоуа е1 а1., 2002 Ъ).

На основании всех экспериметальных данных была предложена следующая схема разворачивания актина под воздействием Ос1пНС1 (см. Поварова и др., 2005,

Kuznetsova et al., 20026; Turoverov et al., 2003):

[GdnHCl] < 1 SM [OdnHOH) 2M

N-► N* -- U* I,... I Iw

[gahcij>3om

1=1,5 при [GdnHCl]=0M.

Согласно этой схеме, вновь обнаруженные кинетические интермедиа™ N* и U* являются промежуточными состояниями на пути разворачивания-сворачивания актина, в то время как инактивированный актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. Получены новые данные о свойствах инактивированного актина. Показано, что присутствие в растворе небольших концентраций GdnHCl приводит к агрегации инактивированного актина (агрегации ассоциатов) - см. раздел 4.4. Этот эффект, объясненный в работе изменением заряда инактивированного актина за счет взаимодействия катионов GdnHCl (GuH4) с группами С=0, необходимо учитывать в работах по изучению фолдинга белков при использовании GdnHCl в качестве денатурата.

3.6. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. Термин "флуоресцентные белки" или "GFP-подобные белки" используется для обозначения обширного класса белков, характерной особенностью которых является наличие у них уникального хромофора, образующегося в результате трехстадийной аутокаталитической циклизации трех аминокислотных остатков в положении 65-67. Все белки этого класса представляют собой цилиндр, образованный 11 /Глистами (fiesta), в центре которого проходит a-спираль, содержащая хромофор. Большой интерес к флуоресцентным белкам вызван их интенсивным использованием в клеточной биологии в качестве биологических маркеров для изучения динамики генной экспрессии и транспорта белков в живых клетках и тканях ([43]; см. также Степаненко, 20056; Verkhusha et al., 2003; Stepanenko et al., 2004 b).

Измерены кинетические и квазиравновесные зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации денатуранта. Показано, что тетрамер зеленого белка (zFP506) обладает большей стабильностью по сравнению с мономером (EGFP). Показано также, что димер красного белка (dimer2) обладает меньшей стабильностью по сравнению с тетрамером (DsRedl). Однако стабильность мономера красного бежа (mRFPl) оказалась приблизительно такой же, как стабильность тетрамера (DsRedl). На основании совокупности полученных результатов сделан вывод о том, что, хотя четвертичная структура имеет существенное значение в стабилизации флуоресцентных белков, она не является единственным фактором, определяющим существенные

различия их конформационной стабильности (Степаненко, 2005 б; 81ерапепко й а1.,2004 Ь). Это говорит о том, что стабильность белка может быть значительно увеличена в результате введения соответствующим образом подобранных аминокислотных замен, при этом нет необходимости сохранять присущую многим флуоресцентным белкам тетрамерную организацию. Этот результат может представлять интерес при создании новых флуоресцентных биомаркеров.

3.7. Влияние денатурирующего воздействия на процесс разворачивания-сворачивания белка. Результаты, полученные для ряда двухдоменных белков (актина, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и од-нодоменного белка карбоангидразы П, свидетельствуют о том, что способность белков к обратимому одностадийному разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультиплетностью. В тоже время, если 1) обратиться к истории развития представлений о процессах разворачивания-сворачивания акина; 2) проанализировать результаты изучения разворачивания карбоангидразы II с учетом впервые выдвинутого в настоящей работе представления о возможности 0(1пНС1 оказывать агрегирующее действие на белки (раздел 4.4); 3) учесть влияние лигандов на характер процесса денатурации глутамин-связывающего белка; 4) принять во внимание, что значительная по величине интенсивность флуоресценции АНС наблюдается для креатинкиназы в отсутствие вАгНО, когда белок является димером, то можно сделать некоторые обобщающие заключения.

Представления о том, как разворачивается актин сильно изменялось по мере того, как для изучения разворачивания-сворачивания этого белка использовались более адекватные методы исследования. Действительно, измерение стационарных зависимостей интенсивности флуоресценции, параметра А, интенсивности флуоресценции АНС, СО в дальней и ближней УФ-областях спектра [40] от концентрации 0(ЗпНС1 создает полную иллюзию того, что инактивированный актин, образующийся в области концентраций Ос1пНС1 от 0.8 до приблизительно 1.8 М, является промежуточным состоянием со свойствами близкими к свойствам состояния типа расплавленной глобулы (Тигоуегоу е1 а1., 2002). Однако, необратимость процесса денатурации актина, существенное возрастание анизотропии флуоресценции в этой области концентраций всйНО, наличие выраженного спектра СИ в ближней УФ-области заставило усомниться в справедливости такого представления [37]. Сочетание метода седиментации и гельпроникающей хроматографии позволило сделать заключение о том, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом, состоящим из 15 (15+1) мономерных единиц [42].

Измерение кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции, параметра А и анизотропии флуоресценции позволило заключить, что инактивированный

актин образуется из нативного через стадию образования существенно развернутого кинетического интермедиата U* (Turoverov et al., 2002). Существенным при проведении этих экспериментов было то, что измерялись кинетические кривые при переводе нативного белка в растворы GdnHCl различной концентрации. Изучение кинетики превращения N—-U при переводе нативного актина в растворы с концентрацией GdnHCl больше 3 М не позволило бы обнаружить интермедиат U*.

Использование параметрического подхода для представления результатов кинетических экспериментов позволило заключить, что состояние U* отличается от полностью развернутого состояния U (Kuznetsova et al., 2002). Более того, характер параметрических зависимостей, измеренных при переводе белка в растворы GdnHCl различной концентрации, позволил предсказать существование еще одного кинетического интермедиата N*, существование которого затем было подтверждено нами с использованием оборудования типа stopped flow (Поварова и др., 2005), а также в работе Альтшулера и др. [18]. Авторы этой работы считают, что путем использования в экспериментах очень низкой концентрации белка (0.01 мг/мл) им удалось избежать агрегации (ассоциации) продукта, возникающего при отщеплении иона Са под действием ЭДГА. Однако величина параметра А для этого продукта, определенная нами на основании спектра флуоресценции, приведенного в их работе, оказалась равной приблизительно 1.3, что соответствует величине, характерной для инактивированного актина (ассоциата). Обратимость процесса денатурации актина, о которой сообщают авторы этой работы, обусловлена, по-видимому, не тем, что удалось получить мономерный продукт, а присутствием в их системе шаперонина ССТ.

Результаты изучения кинетики разворачивания актина при переводе белка в растворы с различным содержанием GdnHCl позволяют нам заключить, что процесс разворачивания актина при его переводе в раствор GdnHCl с концентрацией более ЗМ также проходит через стадии образования состояний N* и U*, хотя и создается впечатление, что этот переход (N—«-U) является одностадийным, поскольку скорости процессов N—►N*, N*—► U* и U*—-U велики. Отщепление иона Са под действием GdnHCl при малых концентрациях денатуранта - медленный процесс (Kuznetsova et al., 2002). Под действием ЭДТА этот процесс будет осуществляться очень быст- > ро. В то же время, в отсутствие GdnHCl процесс U* —-1 также должен происходить с большой скоростью. Таким образом, хотя разворачивание актина под действием ЭДГА представляется как одностадийный переход N—-I, на самом деле имеет место мультистадийный процесс N—- N*—-U*-- I. Использование аппаратуры

stopped flow позволило наблюдать процесс N—-N* [18].

Процесс разворачивания карбоангидразы выглядит как одностадийный или как проходящий через образование промежуточного состояния типа расплавленной гло-

булы в зависимости от того, насколько адекватными были методы, используемые для изучения процессов разворачивания-сворачивания и даже от того, какой денатурант был при этом использован: Ос1пНС1 или мочевина (см. раздел 3.3, ВшЬтагша е1 а1., 2001). На самом деле процесс разворачивания карбоангидразы под действием Ос1пНС1, мочевины, а также под действием изменения рН проходит через стадию образования промежуточного состояния типа расплавленной глобулы (ВизЬтаппа е1 а1., 2001).

Интересную пшцу для размышлений дает сравнительный анализ денатурации глутамин-связывающего белка и его комплекса и глутамином. Связывание лиганда стабилизирует структуру белка. Процессы разворачивания структуры белка, по-видимому, начинаются после диссоциации комплекса. Это создает иллюзию того, что разворачивание комплекса осуществляется по принципу "все или ничего", хотя на самом деле процесс денатурации комплекса осуществляется по тому же сценарию, что и процесс денатурации глутамин-связывающего белка. Этот пример показывает, что одностадийный характер разворачивания макромолекулы белка может быть результатом того, что в структуре имеется какой-то элемент, удерживающий всю структуру от разворачивания. В случае комплекса глутамин-связвающего бежа с глутамином, структура "выдерживает" денатурирующее действие 6<1пНС1 до тех пор, пока не происходит диссоциации комплекса. Похожая ситуация известна в литературе, например, актин защищает тропомиозин, находящийся на его поверхности, от тепловой денатурации, которая начинается только после диссоциации актина в узком температурном интервале [26].

В случае глобулярного актина таким стабилизирующим элементом является ион кальция, присутствие которого, крайне существенно для поддержания структуры и функционирования многих белков [27]. Отщепление иона Са, по-видимому, является тем "спусковым крючком", который запускает цепь конформационных превращений актина, приводящих к образованию существенно развернутого интермедиата, а затем к образованию инактивированного актина (см. раздел 3.5). Интересно отметить, что разворачивание дисульфидизомеразы С происходит при достаточно высокой концентрации 6(ЗпНС1 (начинается при 1.75 М ОЛгНО, в отличие от актина и глутамин-связывающего белка, для которых процесс денатурации начинается при минимальных концентрациях денатурата) и происходит в узком интервале концентраций денатурата. Можно полагать, что чем большую концентрацию денатуранта выдерживает белок до денатурации, тем более кооперативно он будет разворачиваться.

Представленные выше данные позволили нам сформулировать концепцию о том, что путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих

денатурированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не зависит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры при связывании лиганда.

Инактивированный актин оказался исключительно интересной моделью, позволившей открыть принципиально новое свойство GdnHCl - его способность вызывать при определенных условиях агрегацию белков (см. раздел 4.4). В случае инакти-вированного актина обнаружить факт его агрегации под действием GdnHCl оказалось очень просто ввцду того, что агрегация инактивированного актина (агрегация ассо-циатов) приводит к возникновению крупных образований и, как следствие, к существенному возрастанию интенсивности светорассеяния. Способность GdnHCl вызывать ассоциацию (агрегацию) актина позволяет по-новому взглянуть на процессы развара- ,

чивания-сворачивания других белков.

Наше внимание уже давно привлекал процесс образования под действием GdnHCl состояния типа расплавленной глобулы для карбоангидразы II [31]. По способности связывать АНС промежуточное состояние 13 карбоангидразы (см. раздел 3.3) можно считать состоянием типа расплавленной глобулы. Однако очень странно, что образование этого интермедиата сопровождается возрастанием анизотропии триптофановой флуоресценции, если иметь в виду, что одним из основных признаков состояния типа расплавленной глобулы является увеличение подвижности боковых цепей аминокислотных остатков. Учитывая данные, полученные для инактивированного актина (см. раздел 4.4), этот эффект можно объяснить ассоциацией молекул карбоангидразы после их перехода в состояние типа расплавленной глобулы. При этом становится понятным, почему растет величина анизотропии триптофановой флуоресценции вплоть до той концентрации GdnHCl, которая отвечает максимальному содержанию молекул в состоянии расплавленной глобулы.

Подтверждением справедливости этого предположения является то, что разворачивание карбоангидразы под действием мочевины также проходит через образова- ( ние состояния типа расплавленной глобулы [31], хотя в этом случае и не наблюдается увеличения интенсивности флуоресценции АНС. Во всей области концентраций мочевины от 0 до 8 М для растворов карбоангидразы сохраняется низкий уровень ин- ► тенсивности флуоресценции АНС (Bushmarina et al., 2001).

Интересно отметить, что в случае креатинкиназы значительная по величине интенсивность флуоресценции АНС наблюдается для белка в отсутствие GdnHCl, когда белок является димером (Kuznetsova et al., 2002 а). Возрастание интенсивности флуоресценции АНС при разворачивании глутамин-связывающего белка под действием GdnHCl (переход N—-Ть раздел 3.1), по-видимому, также связано с образованием ассоциатов макромолекул белка после их перехода в состояние типа расплав-

ленной глобулы. Об этом свидетельствует тот факт, что анизотропия флуоресценции в этой области концентраций GdnHCl остается неизменной, несмотря на достаточно значительное изменение эллиптичности и величины параметра A (Staiano et al., 2005; Степаненко и др., 2005 а).

Представленные выше экспериментальные данные позволяют нам выдвинуть гипотезу о том, что АНС, на самом деле, связывается не с гидрофобными кластерами на поверхности белка в состоянии расплавленной глобулы, а с ассоциатами макромолекул белка в состоянии расплавленной глобулы, образующимися в результате "слипания" макромолекул за счет гидрофобных взаимодействий в отсутствие электростатического отталкивания.

Глава 4. Новые методические разработки

Большинство исследований выполнено с использованием стандартных физико-химических методов: кругового дихроизма в дальней и ближней УФ-области спектра, собственной УФ-флуоресценции (интенсивность и спектр флуоресценции, параметр А = hifJhbi, характеризующий положение спектра флуоресценции, анизотропия флуоресценции, кривые затухания флуоресценции и времена жизни возбужденного состояния, константы тушения внешним тушителем акрил амидом), флуоресценции АНС и тиофлавина Т, гельпроникающей хроматографии. Измерения собственной флуоресценции всегда сочетались с анализом информации о свойствах микроокружения и особенностях локализации триптофановых (тирозиновых) остатков исследуемых белков (Туроверов и др., 2001; Kuznetsova et al., 2000). При этом была использована информация о пространственной структуре белков, содержащаяся в Банке белковых структур [20].

Измерение стационарных (равновесных или квазиравновесных) зависимостей различных физико-химических характеристик от концентрации денатуранта сочеталось с изучением кинетики разворачивания и(или) сворачивания белка. Изучение кинетики разворачивания актина под действием GdnHCl позволило, в частности, коренным образом пересмотреть представления о роли инактивированного актина в процессах разворачивания-сворачивания этого белка, а также выявить возникающие в процессе разворачивания белка ранее неизвестные кинетические интермедиаты (раздел 3.5). Широко использован при исследовании фолдинга белков и получил существенное развитие метод, основанный на параметрическом представлении экспериментальных данных (раздел 4.1). Результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания белков под действием GdnHCl позволили выявить ряд особенностей во взаимодействии этого денатуранта с белками, которые необходимо учитывать в дальнейшей работе (раздел 4.4). Для развития метода собственной УФ-флуоресцен-

ции белков существенное значение могут иметь результаты, свидетельствующие о зависимости триптофановой флуоресценции глутамин-связвающего белка от длины волны возбуждающего света (раздел 4.3). В работе продемонстрированы перспективы использования метода триптофановой ФКТ для изучения процессов разворачивания-сворачивания и свойств возникающих при этом аморфных и фибриллярных агрегированных форм белков (раздел 4.2).

4.1. Параметрический метод представления экспериментальных данных

по разворачиванию-сворачиванию белков. Впервые подход, основанный на по>

строении параметрических зависимостей интенсивностей флуоресценции, зарегистрированных при двух длинах волн для изучения конформационных превращений белков, был предложен Бурштейном [16, 17] и назван им методом фазовых диаграмм. В последующие годы этот метод использовался крайне редко (см., например, [44]).

Этот метод основан на том, что если переход между состояниями 1 и 2 происходит по принципу "все или ничего", т. е. без образования промежуточных состояний, то регистрируемая экспериментально параметрическая зависимость между любыми двумя экстенсивными характеристиками (X и Y) должна быть линейной: Y(0) = а + Ъ Х((7), где в- любой параметр, в зависимости от величины которого изменяется относительная доля компонент «,((?) и а2{в) в системе, al(ff)+a2(ff) = 1. Если параметрическая зависимость двух экстенсивных характеристик системы не является линейной, то это однозначно свидетельствует о том, что регистрируемый процесс превращения исследуемого объекта из начального в конечное состояние не является одностадийным и происходит с образованием одного или нескольких промежуточных состояний (Turoverov et. al., 2002b; Kuznetsova et al., 2004).

Этот подход был использован нами для доказательства существования нескольких промежуточных состояний, которые возникают в процессе денатурации карбоан-гидразы (Bushmarina et al., 2001), креатинкиназы (Kuznetsova et al., 2002 а) и дисуль-фцдизомеразы С (Stepanenko et al., 2004a; Кузнецова и др., 20056; Степаненко и др., >

2005а) под воздействием GdnHCl. В работе по изучению процессов разворачивания-сворачивания актина этот метод впервые был использован для анализа данных, полученных в ходе выполнения кинетических экспериментов (Kuznetsova et al., 2002b; * Turoverov and Kuznetsova, 2003; Поварова и др., 2005]). В настоящее время метод широко используется уже не только в нашей, но и в других лабораториях (см., например, [18,19]).

4.2. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре. Перспективы использования метода для изучения фолдинга белков. Основным механизмом тушения фосфоресценции в среде, не содержащей кислорода, является дезактивация возбужденных триплетных состояний в результате непланарной деформации

структуры хромофора при соударении с молекулами окружающей среды. Поэтому фосфоресценцию обычно наблюдают в жестких матрицах при низкой температуре. В то же время установлено, что некоторые белки в растворе фосфоресцируют при комнатной температуре [45, 46]. Это обусловлено тем, что в этих условиях достигается необходимая для возникновения фосфоресценции жесткость микроокружения трип-тофановых (тирозиновых) остатков.

В работе показано, что интенсивность ФКТ и время жизни возбужденного три-плетного состояния для инактивированного актина (ассоциата, состоящего из 15 мономерных единиц) больше, чем для нативного актина (Мажуль и др., 2001; 2003; 2005; Mazhul' et al., 2003), и что образование амилоидных фибрилл на основе а-лакт-альбумина и инсулина приводит к увеличению жесткости микроокружения трипто-фановых и тирозиновых остатков и появлению триптофановой (тирозиновой) ФКТ (Мажуль и др., 2005). Таким образом, было показано, что измерение интегральной интенсивности (относительного квантового выхода) и времени затухания ФКТ естественных хромофоров белка - триптофановых и тирозиновых остатков - может стать перспективным методическим подходом для изучения свойств аморфных агрегатов, фибриллогенеза и свойств амилоидных фибрилл.

4.3. Зависимость характеристик триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждающего света в нативном и развернутом состояниях. Обычно принимается, что характеристики триптофановой флуоресценции каждого конкретного белка в нативном состоянии не зависят от длины волны возбуждающего света. Это предположение, в частности, лежит в основе существующего подхода оценки вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка. Однако для глутамин-связвающего белка оказалось, что интенсивность триптофановой флуоресценции нативного белка при Х8ОТб = 280 нм меньше интенсивности флуоресценции, измеренной при = 297 нм. Эффект объяснен спектральной зависимостью относительного вклада Тгр 32 и Tip 220 в поглощение этого белка ([47], Степаненко и др., 2005а; Kuznetsova et al., 2005). Такая ситуация может иметь место и для других белков. Предложена методика нормировки спектров нативного белка, позволяющая учитывать это обстоятельство. Методика основана на том, что в полностью развернутом белке все особенности микроокружения отдельных триптофановых и тирозиновых остатков нивелируются. Зависимость триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждения должна приниматься в расчет при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка.

4.4. Особенности использования GdnHCl в качестве денатуранта. Общепринятым приемом исследования фолдинга белков in vitro является регистрация процессов их разворачивания-сворачивания под действием химических денатуранатов - мо-

чевины или ОйпНС1. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что при использовании в качестве денатуранта ОсЛпНС1 необходимо учитывать некоторые особенности его взаимодействия с белками. Ряд полученных нами результатов (см. также Главу 3) подтверждает литературные данные о том, что ОЛтНС! при небольших концентрациях может оказывать на белки стабилизирующее действие [48, 49] за счет того, что он снимает существующие напряжения в белке, обусловленные электростатическим взаимодействием заряженных групп на его поверхности.

Наряду с фактами, свидетельствующими о стабилизирующем влиянии небольших добавок Ое1пНС1 на структуру белков, на примере инактивированного актина показано, что этот денатурат может оказывать на белки агрегирующее действие (Пова-

рова и др., 2005). Эффект резкого возрастания флуоресценции А НС и интенсивности светорассеяния для инактивированного актина в присутствии небольшой концентрации Ос1пНС1 (рис. 4.4.1) объяснен взаимодействием катионов вс1пНС1 (ОиН+) с группами С=0 остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, глута-мина и аспарагина макромолекул актина, входящих в состав ассоциата. При этом происходит нейтрализация отрицательных зарядов карбоксильных групп глутаминовых и аспарагино-вых аминокислот, а в местах локализации амидных групп глутамина и аспарагина возникают положительные заряды ОиН+. С ростом числа ионов ОиН+, связанных с ассоциатом, увеличивается количество положительных групп на его поверхности, и при некоторой (

концентрации ОйпНО в целом исходно отрицательно заряженный ассоциат (р1 = 5.07) становится нейтральным. При этом создаются ус- • ловия агрегации ассоциатов между собой. Это и является причиной возрастания светорассеяния и связывания молекул АНС, которые встраиваются в гидрофобные полости между ассоциатами, образующими агрегаты. При дальнейшем увеличении концентрации 0<ЙНС1 число положительно заряженных групп на поверхности ассоциата начинает превышать число отрицательно заряженных групп. Наличие положительно заряженных групп на поверхности ассоциа-

[СЙпНС1],М

Рис. 4.4.1. Зависимость величины параметра А (1), интенсивности флуоресценции АНС (2) и светорассеяния (3) от концентрации СИпНС1 для исходно инактивированного актина.

тов препятствует их агрегации. Агрегаты, возникшие при меньших концентрациях ОсЗпНС1, при этом диссоциируют.

Несомненно, существенную роль при образовании агрегатов инактивирован-ного актина в присутствии С<!пНС1 играют гидрофобные взаимодействия. Интенсивность флуоресценции А НС в присутствии инактивированного актина приблизительно в 20 раз больше по сравнению с интенсивностью флуоресценции АНС в присутствии нативного актина той же концентрации. Это означает, что инактивированный актин (ассоциат) уже содержит гидрофобные кластеры на поверхности, но при этом эти ас-социаты не "слипаются", поскольку этому, на наш взгляд, препятствует отрицательный заряд на поверхности ассоциатов. Увеличение интенсивности флуоресценции АНС свидетельствует о связывании большего количества молекул АНС при агрегации инактивированного актина, что может быть как результатом более сильного экспонирования гидрофобных участков белка, так и возникновением новых гидрофобных карманов между ассоциатами, входящими в состав агрегатов инактивированного актина.

Подобного рода эффект, по-видимому, приводит к ассоциации (агрегации) молекул карбоангидразы при переходе в состояние типа расплавленной глобулы и проявляется в существенном возрастании интенсивности флуоресценции АНС и анизотропии собственной флуоресценции (ВивЬтаппа е! а1., 2001, см. также раздел 3.3). В то же время эффект не носит универсального характера для белков, имеющих изо-электрическую точку в кислой области рН. Для агрегации необходимо, чтобы имелись гидрофобные кластеры на поверхности, взаимодействие между которыми, по-видимому, и приводит к слипанию макромолекул в отсутствие электростатического отталкивания.

4.5. Спектральные свойства тиофлавина Т в растворителях различной вязкости и в составе амилоидных фибрилл. Тиофлавин Т как молекулярный ротор. Нарушение фолдинга белков в клетке может приводить к возникновению ряда тяжелых заболеваний, которым сопутствует (а, скорее, является причиной) переход определенного белка в особое состояние, обогащенное Р-структурами, в котором этот белок образует так называемые амилоидные фибриллы. Исследования последних лет показали, что при соответствующих условиях в это состояние могут переходить очень многие белки, в том числе белки, изменение конформации которых пока не связывают с какими-либо заболеваниями. Морфологически, амилоидные фибриллы, образованные на основе самых разнообразных белков, имеют сходную структуру. Они представляют длинные неразветвленные структуры диаметром несколько нанометров, образованные перевитыми между собой протофибриллами, в которых Р-слои ориентированы перпендикулярно оси фибриллы [9, 50]. Общепринятым приемом тестирова-

ния возникновения амилоидных фибрилл стало использование для этих целей флуоресцентного красителя тиофлавина Т (рис. 4.5.1), образующего с амилоидными фибриллами интенсивно флуоресцирующий комплекс (см. например, [13]; Воропай и др., 2003, и ссылки в этих работах; рис. 4.5.2). При этом тиофлавин Т не взаимодействует с белками в нативном, полностью развернутом и денатурированных частично-свернутых состояниях типа расплавленной глобулы, а также с аморфными агрегированными формами белков и специфически взаимодействует лишь с белками в состоянии амилоидных фибрилл. Благодаря уникальным флуоресцентным свойствам тиофлавин Т используется не только для диагностики возникновения амилоидных фибрилл в различных тканях и органах, но и при проведении исследования фибриллоге-неза и свойств амилоидных фибрилл in vitro (см. например, [14-15, 51-52]).

Остается невыясненным, каков механизм взаимодействия тиофлавина Т с амилоидными фибриллами и что является при этом причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т. Для того, чтобы ответить на эти вопросы, в настоящей работе было предпринято детальное изучение влияния диэлектрических характеристик и вязкости растворителя на флуоресценцию тиофлавина Т, выполнен квантово-химический расчет геометрии молекулы тиофлавина Т в основном и возбужденном состоянии, проведены исследования взаимодействия тиофлавина Т с циклодекстринами, моделирующего встраивание тиофлавина Т в амилоидные фибриллы.

Квантово-химический расчет молекулы тиофлавина Т в основном состоянии показал, что наличие метальной группы, присоединенной к атому азота бензтиазоль-ного кольца, препятствует существованию строго планарной конформации колец, обуславливает существование барьера при (р= 0 (180)° и увеличивает энергию молекулы тиофлавина Т в основном состоянии, тем самым уменьшая величину энергетического барьера при <р = 90 (270)° между конформациями тиофлавина Т, отвечающими минимуму энергии (рис. 4.5.3). При <р близких к 90 и 270° система сопряженных связей тиофлавина Т распадается на я-сопряженные системы бензтиазольного и ами-нобензольного колец, которые могут при этом выступать как независимые хромофоры. Барьер невысок и, поэтому в основном состоянии значительная доля молекул будет иметь конформацию с несвязанными бензтиазольным и аминобензольным кольцами. Известно, что по мере увеличения размеров системы я-сопряженных связей спектр сдвигается в длинноволновую сторону. Поэтому любой из фрагментов тиофлавина Т, например бензтиазольное кольцо, должен иметь более коротковолновый спектр поглощения (и флуоресценции) по сравнению с тиофлавином Т.

Значительное содержание молекул тиофлавина Т с нарушенной системой it-сопряженных связей в основном состоянии позволяет объяснить ряд, до сих пор не

понятых и объясняемых существованием примесей, особенностей спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции красителя (см., например, Воропай и др. 2003; [13]). В частности, существование у тиофлавина Т в водном растворе и в спиртах полосы флуоресценции с максимумом около 440 им, имеющей спектр возбуждения флуоресценции с максимумом при приблизительно 340-350 нм, а также сложный характер спектра возбуждения флуоресценции при регистрации в области 480 нм (рис. 4.5.4), можно объяснить сосуществованием молекулы тиофлавина Т и ее фрагментов в основном состоянии.

Есть все основания полагать, что низкая величина энергетического барьера при <р - 90 (270)° между состояниями, отвечающими минимуму энергии в основном состоянии, будет присуща молекулам тиофлавина Т также и в возбужденном состоянии. В таком случае поворотная релаксация фрагментов молекулы тиофлавина Т друг относительно друга в возбужденном состоянии, приводящая к нарушению системы сопряженных связей, должна являться основным процессом безызлучательной дезактивации возбужденного состояния тиофлавина Т. Молекулы, у которых безызлучатель-ная дезактивация возбужденного состояния связана с поворотами фрагментов молекулы друг относительно друга, получили название молекулярнах роторов.

Константа скорости преодоления активационного барьера внутреннего вращения в 700 см"1 при Т= 300 К составляет к = 2.1810" сек"', т.е. отдельная молекула преодолевает такой барьер в среднем 200 раз за одну наносекунду. Эта оценка справедлива, конечно, только для изолированных молекул в вакууме. В растворителе вращательная релаксации фрагментов молекулы тиофлавина Т друг относительно друга требует одновременного кооперативного движения молекул растворителя, препятствующего вращению фрагментов, т.е. будет определяться вязкостью растворителя и гидродинамическими характеристиками фрагментов тиофлавина Т.

Исследование зависимости квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т (<£>) от вязкости (77) и температуры (7) позволило определить характерное время достижения молекулой конформации с <р близким к 90 или 270° и энергию активации процесса безызлучательного перехода тиофлавина Т в основное состояние. Для тиофлавина Т в 99 % глицерине энергия активации ДЕ = 4700 ± 300 см'1 оказалась близкой к энергии активации вязкого течения глицерина АД 7) = 5200 см'1 [53]. Линейный характер зависимости 1 /Ф - 1 для тиофлавина Т в вводно-глицериновых растворах при 293 К от Т/г] (рис. 4.5.5) также свидетельствует о том, что константа скорости достижения молекулой тиофлавина Т конформации, при которой нарушается единая система я-со пряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец, определяется не барьером внутреннего вращения, а вязкостью растворителя.

О 60 120 180 240 300 360 <р, град Рис. 4.5.3

5 10 15 20 25 30 Т/л, его'1 К рис. 4.5.5

440 460 480 500 520 540 Длина волны, нм

250 300 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

Рис. 4.5.2

250 300 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

Рис. 4.5.4

Рис. 4.5.7

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Г, НС

Рис. 4.5.6

Рис. 4.5.1. Пространственная модель молекулы тиофлавина Т (ThT). Показаны атомы S, С и N. Выделены два фрагмента молекулы ThT: бензтиазольное (I) и аминобензольное кольцо (II). Угол <р между бензтиазольным и аминобензольным кольцами определяется как угол между плоскостями, в которых лежат атомы 1, 2, 3 и 2, 3,4.

Рис. 4.5.2. Спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы. Представлены спектры возбуждения флуоресценции (^рег = 480 нм ) и флуоресценции (^.„„6 = 440 нм ) ThT в присутствии инсулиновых фибрилл в концентрации от 0.02 до 0.14 мг/мл с шагом 0.02 мг/мл (кривые 1-7, соответственно). Вставка: зависимость интенсивности флуоресценции (ХМ1б = 440 нм, = 480 нм ) от концентрации амилоидных фибрилл. Концентрация ThT - 0.5 мкМ.

Рис. 4.5.3. Влияние присоединения метильной группы к атому азота бензтиазольного кольца на зависимость потенциальной энергии молекулы ThT от угла <р между плоскостями бензтиазольного и аминобензольного колец. Расчет выполнен с помощью метода AMI для ThT (1) и для ThT в отсутствие метильной группы (2). Метальная группа придает молекуле ThT свойства, присущие молекулярным роторам.

Рис. 4.5.4. Спектры возбуждения флуоресценции (1- = 480 нм; 2 - Хрег = 440 нм) и флуоресценции (3 - X,ois = 340 нм; 4 - = 440 нм) ThT и этаноле. Концентрация ThT - 0.5 мкМ.

Рис. 4.5.5. Зависимость квантового выхода флуоресценции ThT от вязкости растворителя (водно-глицериновые смеси).

Рис. 4.5.6. Распределение молекул ThT по времени затухания флуоресценции. Растворитель -99% глицерин. Кривые 1, 2 и 3 измерены при температуре 300, 289.5, и 278 К. Кривая 4 -распределение по времени затухания флуоресценции для ThT в пропаноле при 77 К. Xi03e = 440 нм, Хрег = 480 нм.

Рис. 4.5.7. Зависимость среднего времени затухания флуоресценции ThT в глицерине (99%) при температуре 278 (1), 293 (2) и 296 К (3).

Однако, время, необходимое для достижения тиофлавином Т конформации, при которой угол (р становится близким к 90° или 270° (3.0 не), в десятки раз меньше времени вращательной релаксации фрагмента молекулы тиофлавина Т, которое, по нашим оценкам, составляет приблизительно 220 не. Но, это вполне понятно, поскольку фотофизические свойства молекул тиофлавина Т будут определяться не временем вращательной релаксации фрагментов молекулы друг относительно друга, а временем, в течение которого в среднем каждая молекула тиофлавина Т за счет торсионных колебаний достигает конформации, при которой угол <р между бензтиазольным и аминобензольным кольцами примет значе

БИБЛИОТЕК/ \ СПетарбург 08 М щ

Флуоресцентные свойства тнофлавнна Т должны определяться в значительной степени соотношением времени достижения молекулой конформации со значением ф близким к 90 или 270° (г^), радиационного времени жизни (гг) и времени вращательной релаксации растворителя (гяо/1,). Если т„«гг (вода, спирты) или т„»тг (пропнол, 77 К), то распределение молекул тиофлавина Т по времени жизни возбужденного состояния а (х) будет узким (рис. 4.5.6, кривые 1 и 4).

В водно-глицериновых растворах (с достаточно низким содержанием воды) при соответствующей температуре могут создаваться условия, когда г^ будет сопоставимо по величине с гг. При этом за излучение будут ответственны молекулы тиофлавина Т, существенно различающиеся по величине угла ф между бензтиазольным и ами-нобезольными кольцами и по времени жизни в возбужденном состоянии (рис. 4.5.6, кривые 2 и 3). Если, к тому же, г$Ыу по величине близко к тг и тог, то для флуоресценции тиофлавина Т будут наблюдаться эффекты, характерные для систем с так называемым неоднородным уширением спектра. В частности, будет иметь место значительное изменение среднего времени жизни возбужденного состояния в пределах спектра флуоресценции, что реально и наблюдается (рис. 4.5.7). Необходимо отметить, что в этих условиях, несмотря на существенные изменения среднего времени жизни флуоресценции по спектру излучения, величина степени поляризации остается при этом неизменной и высокой (Р = 0.4). Это означает, что время вращательной релаксации молекулы тиофлавина Т много больше времени торсионных колебаний фрагментов молекулы тиофлавина Т друг относительно друга, приводящих к безыз-лучательной дезактивации, а направление дипольного момента перехода молекулы тиофлавина Т совпадает с осью вращения фрагментов молекулы друг относительно друга.

Все представленные выше данные позволяют сделать вывод о том, что флуоресцентные свойства тиофлавина Т характерны для соединений, получивших название молекулярных роторов, и что причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и амино-бензольного колец друг относительно друга в возбужденном состоянии (Воропай и др., 2003; Маскевич и др., 2004).

Выводы

4. При определенных условиях GdnHCl может вызывать агрегацию белков. Этот эффект, обнаруженный при исследовании инактивированного актина и объясненный изменением заряда инактивированного актина за счет взаимодействия катионов GdnHCl (GuH+) с группами С=0, необходимо учитывать в работах по изучению фол-динга белков при использовании GdnHCl в качестве денатурата.

5. Четвертичная структура является существенным, но не единственным фактором, определяющим различия в стабильности зеленых и красных флуоресцентных белков.

6. Малые концентрации GdnHCl (около 0.1 М) вызывают изменение структуры креа-тинкиназы, актина, флуоресцентных белков. Эффект объяснен стабилизирующим действием денатуранта. В случае креатинкиназы - это первое подтверждение физико-химическими методами изменения структуры фермента в этой области концентраций денатурата, ранее установленное по изменению его каталитической активности.

7. Причиной значительного возрастания (на несколько порядков) квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т при его встраивании в амилоидные фибриллы является жесткость окружения, препятствующая повороту фрагментов молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т характерны для соединений, относящихся к классу молекулярных роторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Кузнецова И.М., и Туроверов К.К. 2001. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре нативного и инактивированного актина. Биофизика 46, 988-996.

2. Туроверов К.К., Бушмарина Н.А., Малова Л.Н., Кузнецова И.М. 2001. Собственная УФ-флуоресценция лизоцима и микроокружение его триптофановых остатков. Биофизика 46,978-987.

3. Воропай Е.С., Самцов М.П., Каплевский К.Н., Маскевич А.А., Степуро В.И., Пова-рова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Финк А.Л. и Уверский В.Н. 2003. Спектральные свойства тиофлавина Т и его комплексов с амилоидными фибриллами. Ж. прикл. спектр. 70, 767-773.

4. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2003. Кинетика инактивации актина: анализ методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре. Биофизика. 48, 837-843.

5. Маскевич А.А., Легеда М.В., Туроверов К.К., Кузнецова И.М. 2004. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т при его встраивании в у-циклодестрин. В сб.: Молекулярные мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Ред. И.Д.Волотовский и С.Н.Черенкевич. ч. II., стр.30-32.

6. Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К. 2005 а. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков. Цитология. 47, 943-952.

7. Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2005. Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания - разворачивания. Цитология. 47, 953-977.

8. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2005. Фосфоресценция при комнатной температуре аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл, образующихся в результате неправильного фол-динга белков. Цитология. 47, 978-987.

9. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В. , Стая-но М. и Д'Ариа С. 2005 а. Структура и стабильность глутамин-связывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47, 988-1006.

10. Кузнецова И.М., Степаненко Ольга В., Туроверов К.К., Хуанг Ч., Вант Ч.-Ч. 20056. Конформацнонные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуа-нидингидрохлорида. Цитология 47, 1007-1016.

11. Степаненко Олеся В., Верхуша В.В., Шавловский М.М., Алейникова Т.Д., Увер-ский В.Н., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2005 б. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. Цитология 47,1017-1027.

12. Kuznetsova I. M., A.G. Biktashev, L.N. Malova, N.A. Bushmarina, V.N. Uversky, and K.K.Turoverov. 2000. Understanding the contribution of individual tryptophan residues to intrinsic lysozyme fluorescence. Protein and Peptide Letters 7,411-420.

13. Bushmarina N.A., Kuznetsova I.M., Biktashev A.G., Turoverov K.K., and Uversky V.N. 2001. Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic an-hydrase П: a fluorescence spectroscopic analysis. ChemBioChem 2, 812-821.

14. Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Turoverov K.K., Zhu L.,. Zhou J.-M, Fink A.L., and Uversky V.N. 2002 a. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase. Biochem. Biophys. Acta. 1596,138-155.

15. Turoverov K.K., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Biktashev A.G., Povarova O.I., and Kuznetsova I.M. 2002 a. Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochloride. Biochemistry 41,1014-1019.

16. Kuznetsova I.M, Stepanenko Olga V., Stepanenko Olesia V., Povarova O.I., Biktashev A.G., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., and Turoverov K.K. 2002 b. The place of inactivated actin and its kinetic predecessor in actin folding-unfolding. Biochemistry 41, 13127-13132.

17. Turoverov K.K., Kuznetsova I.M., and Uversky V.N. 2002 b. Capture of intermediates in protein unfolding-refolding reactions by fluorescence diagram method. Recent Res. Devel. Biophys. 1,101-119.

18. Turoverov K.K. and Kuznetsova LM. 2003. Intrinsic fluorescence of actin. J. Fluorescence. 13, 41-57.

19. Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Nevzglyadova O.V., Gaivoronsky A.A., Artemov A.V., Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., and Turoverov K.K. 2003 a. Expression of recombinant fusion protein GFP-actin in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris. FEMS Yeast Res. 3,105-111.

20. Verkhusha V.V., Kuznetsova LM., Stepanenko OlesiaV., Zaraisky A.G., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K., and Uversky V.N. 2003 b. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 42, 7879-7884.

21. Mazhul' V.M., Zaitseva E.M., Shavlovsky M.M., Stepanenko Olesia V., Kuznetsova LM., and Turoverov K.K. 2003. Monitoring of Actin Unfolding by Room Temperature Tryptophan Phosphorescence. Biochemistry. 42,13551-13557.

22. Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Chunjuan H. and Wang C.-C. 2004 a. Conformational change of dimeric DsbC molecule induced by GdnHCl - A study by intrinsic fluorescence. Biochemistry 43,5296-5303.

23. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Uversky V.N. 2004. Use of phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates. J. Proteome Res. 3, 485-494.

24. Giordano A., Raia C.A., Kuznetsova LM., Stepanenko Olga V., Turoverov K.K. 2004. Highly absorbing in UV region complex in selenomethionine-substituted Alcohol Dehydrogenase from Sulfolobus sol/ataricus. J. Proteome Res. 3, 613-620.

25. Stepanenko Olesia V., Verkhusha V.V., Kazakov V. I., Shavlovsky M. M., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2004 b. Understanding the Effect of Quaternary Structure on Conformational Stability of Fluorescent Proteins: Comparative Studies on EGFP, zFP506, mRFPl, "dimer2", andDsRedl. Biochemistry. 43, 14913-14923.

26. D'Auria S., Staiano M., Kuznetsova I.M. , Turoverov K.K. 2005. How the combined use of fluorescence spectroscopy and X-ray crystallography contributes to elucidate structure and dynamics of proteins. Reviews in Fluorescence. 25-61.

27. Staiano M., Scognamiglio V., Rossi M., D'Auria S., Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2005. Unfolding-refolding of glutamine-binding protein from Escherichia coli and its stabilization by glutamine. Biochemistry 44, 5625-5633.

28. Kuznetsova I.M., Stepanenko Olga V., Turoverov K.K., Scognamiglio V., Staiano M., Rossi M., and D'Auria S. 2005. Fluorescence properties of glutamine-binding protein from Escherichia coli and its complex with glutamine. J. Proteome Res. 4,417-423.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Frankel S., Condeelis J., Leinwand L. 1990. J. Biol. Chem. 265,17980-17987.

2. Wetzel IL 1994. Trends Biotechnol. 12,193-198.

3. Speed M. A., Wang D. I., King J. 1996. Nat. Biotechnol. 14,1283-1287.

4. Fink A.L. 1998. Fold Des. 3,9-23.

5. Kelly J. W. 1997. Structure 5, 595-600.

6. Kelly J. W. 2000. Nature Struct. Biol. 7, 824-826.

7. Uversky V. N., Talapatra A., Gillespie J. R., Fink, A. L. 1999. Med. Sei. Monitor. 5,1001-1012,

1238-1254.

8. Carrell, R W., Gooptu, B. 1998. Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 799-809.

9. Dobson C.M. 2003. Nature 18, 884-890. ' 10. Dobson C.M. 2004. Methods 34,4-14.

11. Harper J. D., Lansbury P. T. Jr. 1997. Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407.

12. Гусев Н.Б. 2004. СОЖ, 8,15-23.

13. LeVine H. 3«l 1999. Methods Enzymol. 309,274-84.

14. Goers J., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Uversky V.N., Fink A.L. 2002. Biochemistry 41,

12546-12551.

15. Ban Т., Hamada D., Hasegawa K„ Naiki H„ Goto Y. 2003. J Biol Chem. 278,16462-16465.

16. Каппанас Р.И, Буколова Т.Г., Бурштейн Э.А. 1975. Мол. биол., 9,795-804.

17. Бурштейн Э. А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофш, Т.7, ВИНИ-

ТИ, Москва

18. Altschuler G. М„ Klug D.R., Willison K.R. 2005. J Mol. Biol. 353, 385-%.

19. Das P., Wilson С. J., Fossati G., Wittung-Stafshede P., Matthews K.S., and Clementi C. 2005.

PNAS 102 (41), 14569-14574.

20. Bernstein F.C., et al. 1977. J. Mol. Biol. 112, 535-542.

21. Hsiao C.-D., Sun Y-J., Rose J., Wang B.-C. 1996. J. Mol. Biol. 262,225-242.

22. Sun Y.J., Rose J., Wang B.C., Hsiao C.D. 1998. J. Mol. Biol. 278,219-229.

23. Humphrey W., Dalke A., Schulten К. 1996. J.Molec. Graphics. 14, 33-38.

24. Merritt E.A., Bacon D.J. 1977. Methods Enzymol. 277, 505-524.

25. D'Auria S., et al., 2005. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 58,80-87.

26. Levitsky D.I., Kremneva E., Nikolaeva O., Maytum R, Geeves M.A. 2005. Biophys.J., 88,

p.657.

27. Пермяков E.A. 1993. Капьций-связывающие белки. Наука, Москва, 190стр.

28. Rao J.K., Bujacz G., Wlodawer A. 1998. FEBS Lett, 439, 133-137.

29. Fan Y.-X., Zhou J.-M., Kihara H., Tsou C.-L.1998. Protein Sei. 7, 2631-2641.

30. Saito R, Sato Т., Ikai A., Tanaka N. 2004. Acta Crystallogr D Biol Ciystallogr. 60, 792-795.

31. Родионова НА., Семисотнов Г.В., Кутьпиенко В.П., Уверский B.H., Болотина И.А. , 1989-Мол. биол. 23, 683-692.

32. McCarthy A.A., Haebel P.W., Torronen A., Rybin V., Baker E.N., Metealf P. 2000. Nat.

Struct. Biol.7,196-199.

33. Kabsch W., Mannherz H. G., Suck D., Pai E. F., Holmes H. C. 1990. Nature 347, 37-44.

34. Lewis et al., 1963; Lehrer S. L., Kerwar G. 1972. Biochemistry. 11,1211-1217.

35. Bertazzon A., Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. 1990. Biochemishy 29, 291-298.

36. Schuler H., Lindberg U., Schutt С. E., Karlsson R 2000. Eur. J. Biochem. 267, 476-486.

37. Turoverov К. K., Biktashev A. G., Khaitlina S. Yu., Kuznetsova I. M. 1999a. Biochemistry. 38,

6261-6269.

38. Turoverov К. K., Kuznetsova I. M., Khaitlina S. Yu., and Uversky V.N. 1999b. Protein and

Peptide Letters. 6, 73-78.

39. Kuznetsova I. M., Khaitlina S. Yu., Konditerov S. N., Surin A. M., Turoverov К. K. 1988. Bio-

phys. Chem. 32,73-78.

40.Kuznetsova I. M., Biktashev A.G., Khaitlina S.Yu., Vassilenko K.S., Turoverov K.K., Uversky V. N. 1999a. Biophys. J. 77, 2788-2800.

41. Kuznetsova I. M., Turoverov К. К., Uversky V. N. 1999b. Protein Peptide Lett. 6,173-178.

42. Kuznetsova I. M., Yakusheva T. A., Turoverov К. K. 1999c. FEBS Lett. 452, 205-210.

43. Tsien R Y. 1998. Aimu. Rev. Biochem. 67, 509-544.

44. Permyakov E.A., Yarmolenko V.V., Emelyanenko V.l., Burstein E. A., Closset J., Gerday C.

1980. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

45. Мажуль B.M., Конев C.B., Ермолаев Ю.С., и др. 1983. Биофизика. 28, 980 -983.

46. Vanderkooi J.M. 1992. In: Topics in fluorescence spectroscopy. New York: Plenum Press, 3,

113-136.

47. Axelsen P.H., Bajzer Z, Prendergast F.G., Cottam P.F., Ho C. 1991. Biophys J. 60, 650-659.

48. Monera O.D., Kay C.M., Hodges RS. 1994. Protein Sei. 3,1984-1991.

49. Bhuyan A.K., 2002. Biochemistiy, 41, 13386-13394.

50. Dumoulin M. and Dobson C.M. 2004. Biochimie. 86, 589-600.

51. Kumita J. R, Weston C. J., Choo-Smith L. P., Woolley G. A., O. S. Smart. 2003. Biochemistry.

42,4492-4498.

52. Zhu L„ Zhang X. J., Wang L. Y„ Zhou J. M., Perrett S. 2003. J Mol Biol. 328, 235-254.

53. Loutfy RO., Arnolds B. A. 1982. J. Phys. Chem. 86: 4205-4211.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 31.01.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 120. Заказ 270Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 247-57-76

JLQûGft

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кузнецова, Ирина Михайловна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПРОЦЕССАХ ФОЛ

ДИНГА БЕЛКОВ.

1.1. Сворачиваиие белков в клетке, роль шаперонов.

1.2. Шапероиин цитоплазмы эукариот ССТ: структура, строение субе-дипиц, механизм действия, взаимодействие с актином и тубули

1.3. Факторы, определяющие формирование нативной структуры белка 33 ф. 1.4. Стабильность структуры белка в нативном состоянии.

1.5. Модели сворачивания белков.

Переходное состояние и ядро сворачивания.

Развернутое состояние белка.

Нативное состояние - отвечает ли оно глобальному минимуму свободной энергии ?.

1.6. Промежуточные состояния и их роль в сворачивании белка.

Амилоидные фибриллы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Флуоресцентные измерения.

Тушение флуоресценции.

Регистрация кривых затухания флуоресценции.

Анализ кривых затухания флуоресценции.

Анализ кривых затухания флуоресценции с использованием метода максимума энтропии.

Кваптово-химические методы.

Фосфоресцентпые измерения.

Круговой дихроизм. ф Измерение равновесных кривых денатурации.

Измерение кинетических кривых разворачивания-сворачивания белков.

• ГЛАВА 3. ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СТАБИЛЬНОСТЬ И ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ РАЗВОРАЧИВАНИЯ-СВОРАЧИВАНИЯ ОД

НОДОМЕННЫХ И ДВУХДОМЕННЫХ БЕЛКОВ.

3.1. Обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка. Роль лиганда в стабилизации структуры.

Разворачивание-сворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием

GdnHCl. Равновесные зависимости.

Кинетика разворачивания- сворачивания. ф Параметрическое представление процессов разворачиваниясворачивания

Разворачивание - сворачивание GlnBP и комплекса GlnBP/ Gin. Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом

3.2. Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы.

3.3. Множественность денатурированных частично-свернутых состояний однодоменного белка - карбоангидразы II.

3.4. Одностадийный обратимый характер разворачивания-сворачивания дисульфидизомеразы С. ф Денатурация DsbC под действием GdnHCl. Стационарные зависимости

Денатурация DsbC под действием GdnHCl. Кинетические зависимости.

Ренатурация DsbC: кинетические зависимости.

3.5. Кинетические интермедиаты на пути развоарчивапия-сворачивания белков. Новое представление о процессах разворачивания

Ф сворачиваиия актина. ф 3.5.1. Инактивированный актин и его свойства.

Диэлектрические и релаксационные свойства микроокружепия триптофановых остатков пативпого и инактивированного актина.

Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине.,

Жесткость микроокружения триптофановых остатков.

Вторичная структура инактивированного актина.

Гидродинамические характеристики инактивированного актина.

Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков пативного и инактивированного актина.

Свойства поверхности инактивированного актина.

3.5.2. Кинетика денатурации актина.

Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина.

Кииетические константы процесса денатурации актина гуапидингидрохлоридом.

Кинетика разворачивания актина формамидом.

Кинетика образования инактивированного актина.

Кинетика перехода ипактивированный актин - полностью развернутый актин.

3.5.3. Новая кинетическая схема процессов разворачивания-сворачивания актина.

Свойства кинетического предшественника инактивированного актина.

3.6. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных бел® ков.

Спектральные свойства мономерных и олигомерных флуоресцентных белков.

Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков.

Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя.

Особенности триптофановой флуоресценции.

Кинетика денатурации под действием гуапидингидрохлорида.

Стационарные кривые денатурации.

3.7. Влияние денатурирующего воздействия на процесс разворачивания-сворачивания белка.

ГЛАВА 4. НОВЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ РАЗРАБОТКИ.

4.1. Параметрический метод представления экспериментальных данных по разворачиванию-сворачиванию белков.

4.2. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре - перспективы использования метода для изучения фолдинга белков.

Триптофановая ФКТ актина в различных структурных состояниях. 210 Изменение характеристик ФКТ при денатурации актина GdnHCl. 212 Триптофановая и тирозиновая ФКТ белков в состоянии амилоидных фибрилл. ф 4.3. Зависимость характеристик триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждающего света в нативном и развернутом состояниях.

Триптофановая флуоресценция GlnBP и его комплекса с Gin в нативном и полностью развернутом состояниях.

Микроокружение триптофановых остатков GlnBP.

Флуоресценция и микроокружение триптофановых остатков в комплексе GlnBP с Gin.

Тирозиновая флуоресценция GlnBP.

Зависимость триптофановой флуоресценции GlnBP от длины волны ф возбуждения.

4.4. Особенности использования GdnHCl в качестве денатуранта.

4.5. Спектральные свойства тиофлавина Т в растворителях различной вязкости и в составе амилоидных фибрилл. Тиофлавин Т как молекулярный ротор.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков"

Актуальность проблемы. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное, компактное, высокоорганизованное, функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов современной молекулярной и клеточной биологии. По современным представлениям аминокислотная последовательность каждого конкретного белка, возникшая в результате эволюционного отбора, такова, что в пей запрограммирована структура нативного состояния, путь ее достижения и существование свободноэнергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями белка. Последнее означает, что макромолекула белка может находиться либо в нативном, либо в денатурированном состоянии. При этом все макромолекулы нативного белка идентичны, если не считать различий структуры, обусловленных броуновским движением входящих в их состав атомов. Идентичность всех молекул каждого конкретного белка в нативном состоянии исключительно важна для его правильного функционирования. Денатурированных состояний может быть несколько. Каждому денатурированному состоянию отвечает ансамбль молекул, отличающихся друг от друга по структуре.

Хотя в клетке имеется много факторов, вовлеченных в процесс правильного сворачивания полипептидной цепи (ферменты, ответственные за цис-транс изомеризацию пролила и образование "правильных" дисульфидных связей, и шаперопы), ни один из этих факторов не песет той информации, которая необходима для приобретения полипептидной цепью уникальной нативной структуры, и присутствие этих факторов ие всегда является необходимым условием правильного сворачивания белка. Многие белки могут правильно сворачиваться из полностью развернутого состояния in vitro. Несмотря на огромное число работ, посвященных фолдингу белков, вопрос о том, каким образом в аминокислотной последовательности белка закодирована его уникальная третичная структура (то, что называют иногда второй частью генетического кода), остается открытым. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их разворачивания-сворачивания и характеристика возникающих при этом промежуточных денатурированных частично-сверну/тых и неправильно свернутых состояний. Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодомен-ных белках, для которых процесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей разворачивания-сворачивания более сложных муль-тидомепных белков, выяснение вопроса о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует с размером и мультидоменностыо белка, а также то, насколько путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний белка зависит от характера денатурирующего воздействия.

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. В настоящее время совершенно очевидно, что изучение агрегации белков в процессе фолдинга имеет не только фундаментальное, но и большое практическое значение. Оказалось, что биотехнологический процесс получения рекомбинантных белков очень часто осложнен возникновением аморфных агрегатов, накапливающихся в телах включения (Frankel et al., 1990; Wetzel, 1994; Speed et al., 1996). Возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл, является причиной так называемых "конформационных болезней" - многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегеперативные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др. (Fink, 1998; Kelly, 1997; Kelly, 2000; Uversky et al., 1999; Carrell, and Gooptu, 1998; Dobson, 2003, 2004; Harper and Lansbury 1997; Гусев, 2004).

Успех исследований всегда в значительной степени зависит от наличия хорошо отработанных и адекватных методов. Поэтому одной из задач работы стало исследование спектральных свойств тиофлавипа Т. Этот флуоресцентный краситель специфически взаимодействует только с белками в состоянии амилоидных фибрилл, и при этом интенсивность его флуоресценции возрастает на несколько порядков. Благодаря этим уникальным свойствам тиофлавип Т является прекрасным средством для диагностики возникновения амилоидных фибрилл в тканях и органах и, кроме того, для изучения фибриллогенеза и свойств амилоидных фибрилл in vitro (LeVine, 1999; Goers et al., 2002; Ban et al., 2003). Однако свойства этого красителя остаются мало изученными (см. Воропай и др., 2003). В связи с этим представлялось чрезвычайно актуальным выполнить исследования спектральных свойств этого красителя, которые бы позволили понять причины существенного (на несколько порядков) увеличения интенсивности флуоресценции тио-флавина Т при его иикорпорации в амилоидные фибриллы.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей разворачивания-сворачивания однодоменных и двухдомепных белков и свойств возникающих при этом промежуточных состояний, а также агрегированных форм белков, приводящих к необратимости процесса их денатурации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач: 1) Выяснить, насколько одностадийность и обратимость разворачивания- сворачивания коррелирует с размером и мультидоменностыо белка. С этой целью изучить процессы разворачивания-сворачивания ряда двухдоменных белков (глобулярного актина, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и однодомеиного белка - карбоаигидразы II;

3) Изучить кинетику разворачивания-сворачивания глобулярного актина, механизмы образования инактивированного актина, охарактеризовать свойства кинетических интермедиатов, возникающих в процессе разворачивания этого белка;

5) Выяснить, па примере флуоресцентных белков EGFP, DsRed и их мутантных форм, особенности процессов разворачивания-сворачивания белков типа 0-бо-чонка и роль четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса;

6) Осуществить разработку новых методических подходов для изучения процессов разворачивания-сворачивания белков и для исследования свойств возникающих при этом интермедиатов и агрегированных форм белков и, в частности, выяснить причины существенного возрастания квантового выхода флуоресценции ти-офлавина Т при взаимодействии с амилоидными фибриллами.

Научная новизна. Ряд результатов, полученных при изучении процессов разворачивания-сворачивания конкретных белков, получен впервые, в частности, впервые установлено одностадийное, обратимое разворачивание дисульфидизомеразы С, мультистадийное, но обратимое разворачивание креатинкиназы и глутамин-связывающего белка под действием GdnHCl. Физико-химическими методами впервые прямо показаны изменения структуры креатинкиназы под воздействием небольших концентраций GdnHCl (0.1 М), ранее обнаруженные по изменению каталитической активности фермента. Предложена и обоснована принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания актина, учитывающая существование вновь обнаруженных кинетических интермедиатов N* и U*, а также то, что инактивированпый актин, ранее считавшийся иптермедиатом па пути разворачивания белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. Впервые на примере инактивированного актина показано, что GdnHCl может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков. Впервые флуоресцентные свойства тиофла-вина Т (низкий квантовый выход в водных и спиртовых растворах и существенное возрастание квантового выхода при инкорпорации в амилоидные фибриллы) ассоциированы с принадлежностью этого красителя к классу соединений, известных как молекулярные роторы.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

2. Способность белков к одностадийному обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидомепностыо.

3. Вновь обнаруженные промежуточные состояния актина N* и U* являются кинетическими интермедиатами на пути разворачивания-сворачивания актина, в то время как инактивированпый актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием белка, на самом деле является моподисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. На основании этих данных предложена принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания глобулярного актина.

6. Причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиоф-лавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольиого и аминобензольного колец друг относительно друга в возбужденном состоянии. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т характерны для соединений, относящихся к классу молекулярных роторов.

Теоретическая и практическая значимость. Сформулированная на основе полученных в работе экспериментальных результатов концепция универсального характера механизма разворачивания-сворачивания каждого конкретного белка, согласно которой путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний белка не зависит от характера денатурирующего воздействия, а также заключение о том, что способность белков к одностадийному и обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностью, обогащают представления о процессах разворачивания-сворачивания белков и могут быть использованы при дальнейших исследованиях процесса их фолдинга.

Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного актина в процессе разворачивания-сворачивания могут являться основой для понимания процессов фолдинга актина in vivo и для проведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей репатурации полностью развернутого актина in vitro с участием факторов, способствующих сворачиваниию актина в клетке (шаперонина ССТ и префолдина).

Механизм существенного возрастания интенсивности флуоресценции тиоф-лавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы объяснен на основании представления о том, что тиофлавин Т относится к классу молекулярных роторов. Этот результат имеет существенное значение при проведении работ по исследованию фибриллогенеза и изучению свойств амилоидных фибрилл.

Введен в практику исследований фолдинга белков метод, основанный на параметрическом представлении экспериментальных данных, предложенный еще в 1975 г. Бурштейном (Бурштейп, 1976; Капланас и др. 1975), но долгое время практически не использовавшийся. Метод уже широко используется не только в нашей Лаборатории, по и в других лабораториях (см. например, Altschuler et al., 2005; Das et al., 2005 ).

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов Кафедры биофизики СПбГПУ.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 15 Международном симпозиуме биохимиков и молекулярных биологов стран Азии и Океании (FAOBMB) "Биохимия и молекулярная биология 21 века" (Пекин, Китай, 2000); Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые направления исследований" (Пущино 2001, 2004); 9-й Международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Прага, Чехия, 2001); Международных научных конференциях "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, Беларусь, 2002, 2004); III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2002); Национальной итальянской конференции по биохимии (Рим, Италия, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, 2006, пленарный доклад).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях" при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04-39106 ГФЕН-Китай, 00-04-49224, 00-04-81082 Бел, 01-04-49308, 02-0439009 ГФЕН-Китай, 02-04-81013 Бел, 02-04-81018 Бел, 04-04-49290), Программы РАН "Молекулярная и клеточная биология", СОВ AS, INT-0002341(USA), INTAS (грант 01-2347), NATO Collaborative Linkage Grant PST.NR.CLG 981025 (Italy).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 28 статей в рецензируемых журналах (11 - в отечественных и 17 - в международных журналах), а также тезисы 16 докладов па всероссийских и международных конференциях, совещаниях и съездах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, четырех Глав, Выводов и Списка цитируемой литературы. В Главе 1 дан краткий обзор современных представлений о фолдинге белков in vivo и in vitro. Рассмотрена роль ша-перонов при фолдинге белков в клетке, особое внимание уделено роли АТФ-за-висимых шаперонов Hsp70 и шаперонина ССТ в клетках эукариот. Обсуждаются различные модели сворачивания белка in vitro (модель "нуклеации - роста", "стадийного сворачивания" и модель "энергетической воронки"), роль промежуточных денатурированных частично-свернутых состояний белков и переходного состояния в образовании нативного белка. Рассмотрены механизмы возникновения агрегированных форм белков и, в частности, амилоидных фибрилл. В Главе 2 дано краткое описание использованных в работе материалов и методов. В Главе 3 приведены результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания ряда двухдо-менных белков: глутамин-связывающего белка, дисульфидизомеразы С, глобулярного актина и креатинкиназы и однодоменпого белка карбоапгидразы II. Цель этих исследований состояла в том, чтобы выявить особенности разворачивания-сворачивания этого класса белков и, в частности, рассмотреть вопрос о том, насколько одностадийпость и обратимость разворачивания коррелирует с размером, мультидоменностью и наличием лигандов, стабилизирующих белок. В этой же главе, на примере карбоапгидразы II, показана возможность мультистадийпого необратимого разворачивания белка, имеющего одиодоменную структуру. Результаты ис

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кузнецова, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

2. Способность белков к одностадийному обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностыо.

4. При определенных условиях GdnHCl может вызывать агрегацию белков. Этот эффект, обнаруженный при исследовании инактивированного актина и объясненный изменением заряда инактивированного актина за счет взаимодействия катионов GdnHCl (GuH+) с группами С=0, необходимо учитывать в работах по изучению фолдинга белков при использовании GdnHCl в качестве денатуранта.

6. Малые концентрации GdnHCl (около 0.1 М) вызывают изменение структуры креатинкиназы, актина, флуоресцентных белков. Эффект объяснен стабилизирующим действием денатуранта. В случае креатинкиназы - это первое подтверждение физико-химическими методами изменения структуры фермента в этой области концентраций денатуранта, ранее установленное по изменению его каталитической активности.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кузнецова, Ирина Михайловна, Санкт-Петербург

1. Бурштейн Э. А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва

2. Гильманшин Р. И., Долгих Д. А., Птицин О. Б., Финкельштейн А. В., Шахнович Е. И. 1982. Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель. Биофизика. 27 (6):1005-1016.

3. Гусев Н.Б. 2004. Нейродегенеративиые болезни и проблема правильного сворачивания белка. СОЖ, 8, 15-23.

4. Капланас Р.И, Буколова Т.Г., Бурштейн Э.А. 1975. Флуоресценция Р-лактоглобулина в различных физико-химических условиях. Мол. биол., 9, 795-804.

5. Кузнецова, И. М., Хайтлина С. Ю., Туроверов К К, Пинаев Г. П. 1981. Поляризация УФ-флуоресценции актина. Биофизика. 26 (4): 762-764.

6. Кузнецова И. М., Туроверов К. К 1983. Поляризация собственной флуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков. Мол. биол. 17(4): 741-754.

7. Кузнецова И. М., Туроверов К. К 1998. Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружепия и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40(8/9): 747-762.

8. Кузнецова И. М., Хайтлина С. 10., Туроверов К. К. 1998. Структурные свойства инактивированного актина: интермедиат формируется в процессе сворачивания-разворачивания актина. Биоорганическая химия. 24 (12): 783-791.

9. Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К. 2005 а. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков. Цитология. 47, 943-952.

10. Кузнецова И.М., Степаненко Ольга В., Туроверов КК, Хуанг Ч, Ванг Ч.-Ч. 20056. Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология 47, 1007-1016.

11. Мажуль В. М., Конев С. В., Ермолаев Ю. С., Мартынова М. А., Никольская В. П., Прокопова Ж. В. 1983. Исследование равновесной динамики структуры белков методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре. Биофизика. 28(6): 980-983.

12. Мажуль В. М., Щербин Д. Г. 1998. Низкотемпературная фосфоресценция продуктов перекисного окисления липидов. Биофизика. 43 (3): 456-462.

13. Мажуль В. М., Зайцева Е. М., Мицкевич Л. Г., Федуркина Н. В., Курганов Б. И. 1999. Фосфоресцентный анализ внутримолекулярной динамики мышечной гликогенфосфорилазы Ь. Биофизика. 44(6): 1010-1016.

14. Маясуль В. М., Зайцева Е. М., Щербин Д. Г. 2000. Внутримолекулярная динамика и функциональная активность белков. Биофизика. 45(6): 965-989.

15. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Кузнецова И.М., и Туроверов К.К. 2001. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре нативного и инактивированного актина. Биофизика 46, 988-996.

16. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Кузнецова ИМ., Туроверов К.К. 2003. Кинетика инактивации актина: анализ методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре. Биофизика. 48, 837-843.

17. Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов КК 2005. Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания разворачивания. Цитология. 47, 953-977.

18. Птицын О.Б. 1973. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. Докл. Акад. Наук СССР, 210, 1213-1215.

19. Родионова Н. А., Семисотнов Г. В., Кутышенко В. П., Уверский В. Н., Болотина И. А. 1989. Стадийность равновесного разворачивания карбоапгидразы В сильными денатурантами. Мол. биол. 23 (3): 683-692.

20. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов КК, Скогнамиглио В., Стаяно М. иД'Ариа С. 2005 а. Структура и стабильность глутамин-связывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47, 988-1006.

21. Степаненко Олеся В., Верхуша В.В., Шавловский М.М., Алейникова Т.Д., Уверский В.Н., Кузнецова И.М., Туроверов КК 2005 б. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. Цитология 47, 1017-1027.

22. Татунашвили Л. В., Привалов П. Л. 1984. Калориметрическое исследование денатурации G-актина. Биофизика. 29 (4): 583-585.

23. Туроверов К. К, Кузнецова И. М. 1983. Поляризация собственной флуоресценции белков. II. Использование для изучения равновесной динамики триптофановых остатков. Мол.биол. 17 (3): 468-473.

24. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40 (8/9): 806-817.

25. Туроверов К.К., Кузнецова И.М. 1998. Собственная УФ флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 40 (8/9): 735-746.

26. Тенфорд Ч. 1965. Физическая химия полимеров. Изд. "Химия". М.

27. Уверский В.Н. 1998. Разнообразие компактных форм денатурированных белков. Дисс. на соискание уч. степени докт. физ. мат. наук, Пущино.

28. Финкелыитейн А.В., Птицын О.Б. 2005. Физика белка. М: Книжный дом "Университет", 455 с.

29. Эфтинк М.Р. 1998. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия. 63 (3): 327-337.

30. Agekyan Т. V., Bezborodova S. I., Kuznetsova I. М., Polyakov К. М., Turoverov К. К. 1988. Spectral and polarizational characteristics of ribonuclease C2. Unusual fluorescence of tyrosine residues. Mol.Biol. 22: 612-623.

31. Alfimov M. V., Fedorova O. A., Gromov S. P. 2003. Photoswitchable molecular receptors. J. Photochem. Photobiol. A .158: 183-198.

32. AllsopD., SwansonL., Moore S., Davies Y., York A., El-Agnaf О. M., Soutar I. 2001. Fluorescence anisotropy: a method for early detection of Alzheimer beta-peptide (Abeta) aggregation. Biochem Biophys Res Commun. 285: 58-63.

33. Altschuler G. M., Klug D.R., Willison K.R. 2005. Unfolding energetics of G-a-Actin: а discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J Mol. Biol. 353(2):385-96

34. Anfinsen C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181: 223230.

35. Aral M., Kuwajima K. 2000. Role of the molten globule state in protein folding. Adv. Protein Chem. 53, 209-282.

36. Ami M., Inobe Т., Maki К., Ikura Т., Kihara H., Amemiya Y., Kuwajima K. 2003. Denaturation and reassembly of chaperonin GroEL studied by solution X-ray scattering, Protein Sci. 12: 672-680.

37. Axelsen P.H., BajzerZ., Prendergast F.G., Cottam P.F., Ho C. 1991. Resolution of fluorescence intensity decays of the two tryptophan residues in glutamine-binding protein from Escherichia coli using single tryptophan mutants. Biophys. J. 60: 650659.

38. Bader M. V., Bardwell J.C.A. 2002. Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv. Protein. Chem. 59: 283-301.

39. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. 2000. Biochemistry, mutagenesis, andoligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 11984- 11989.

40. Baldwin R.L., Rose G.D. 1999. Is protein folding hierarchic? Trends Biochem. Sci. 24: 2633; 77-83.

41. Ban Т., Hamada D., Hasegawa K., Naiki H., Goto Y. 2003. Direct observation of amyloid fibril growth monitored by thioflavin T fluorescence. J Biol Chem. 278: 16462-16465.

42. Bender M.L., and Komiyama M. 1978. Cyclodextrin Chemistry, Springer, Berlin.

43. Bernstein F. С., Koetzle Т. F., Williams G. J. В., Meyer Jr. E. F., Brice M. D., Rodgers J. R., Kennard O., Shimanouchi Т., Tasumi M. 1977. The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecules structures. J. Mol. Biol. 112: 535-542.

44. Bertazzon A., Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. 1990. Enthalpic and entropiccontributions to actin stability: calorimetry, circular dichroism and fluorescence study and effect of calcium. Biochemistry. 29: 291-298.

45. Bevis B.J., Glick B.S. 2002. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat. Biotechnol. 20: 83-87.

46. Bhuyan A.K., 2002. Protein stabilization by urea and guanidine hydrochloride.

47. Biochemistry, 41, 45, 13386-13394.

48. Bilsel O., Matthews C.R. 2000. Barriers in protein folding reactions. Adv. Protein Chem. 53: 153-207.

49. Bodenreider C., Kellershohn N., Goldberg M. E., MejeanA. 2002. Kinetic analysis ofR67 dihydrofolate reductase folding: from the unfolded monomer to the native tetramer. Biochemistry. 41: 14988-14999.

50. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantization of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

51. Braig, K., Otwinowski, Z, Hegde, R., Boisvert, D.C., Joachimiak, A., Horwich, A.L. and Sigler, P.B. 1994. The crystal structure of the bacterial chaperonln GroEL at 2.8 A. Nature 371, 578-586.

52. Buckle, A.M., Zahn, R. andFersht, A.R. 1997. A structural model for GroEL-polypeptide recognition. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94, 3571-3575.

53. Bushmarina N. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Turoverov К. K., Uversky V. N. 2001. Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analysis. ChcmBioChem. 2: 813-821.

54. Bychkova, V. E., Ptitsyn О. B. 1993. The molten globule in vitro and in vivo. Chemtracts -Biochem. Mol. Biol. 4:133-163.

55. Campbell R. E., Tour O., Palmer A. E., Steinbach P. A., Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. 2002. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 78777882.

56. Capaldi A. P., Shastry M. C., Kleanthous C., Roder H., Radford S. E. 2001. Ultrarapid mixing experiments reveal that Im7 folds via an on-pathway intermediate. Nat Struct Biol. 1:68-72.

57. CarrascosaJ.L., Llorca O., Valpuesta J.M. 2001. Structural comparison of prokaryotic and eukaryotic chaperonins. Micron, 32, 43-50.

58. Carrell, R. W., Gooptu, B. 1998. Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799-809.

59. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Prasher D. C. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263: 802-805.

60. Chen Y., Liu В., YuH.-T., Barkley M. D. 1996. The peptide bond quenches indole fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 118: 9271-9278.

61. Chen Y., Barkley M. D. 1998. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37. 9976-9982.

62. Chen J., Walter S., Horwich A.L., Smith D.L. 2001. Folding of malate dehydrogenase inside the GroEL-GroES cavity. Nature Struc.Biol. 8: 721-728.

63. Cody С. W., PrasherD. С., Westler W. M., Prendergast F.G., Ward W. W 1993. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry. 32: 1212-1218.

64. Contaxis С. C., Bigelow С. C., Zarkadas C. G. 1977. The terminal denaturation of bovine cardiac G-actin. Can. J. Biochem. 55: 325-331.

65. Corish P., Tyler-Smith C. 1999. Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Eng. 12: 1035-1040.

66. CormackB. P., Valdivia R. H., Falkow S. 1996. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173: 33-38.

67. Csermely P., Schnaider Т., Soti C., Prohaszka Z., Nardai G. 1998. The 90-kDa molecular chaperone family. Structure, Function, and Clinical Applications. Pharmacology and Therapeutics. 79: 129-168.

68. Cubitt А. В., Heim R, Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. 1995.

69. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20: 448-455.

70. Dale R. E., EisingerJ. 1974. Intramolecular distances determined by energy transfer. Dependence on orientational freedom of donor and acceptor. Biopolymers. 13: 15731605.

71. Das P., Wilson C. J., Fossati G., Wittung-Stafshede P., Matthews K.S., and Clementi C. 2005. Characterization of the folding landscape of monomeric lactose repressor: Quantitative comparison of theory and experiment. PNAS 102 (41), 14569-14574.

72. Dattelbaum J.D., LakowiczJ. R. 2001. Optical determination of glutamine using a genetically engineered protein. Anal. Biochem. 291: 89-95.

73. DAuria S, Lakowicz J.R. 2001. Enzyme fluorescence as a sensing tool: new perspectives in biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 12: 99-104.

74. Dinner A.R., Sali A., Smith L.J., Dobson C.M., Karplus M. 2000. Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment. Trends Biochem Sci. 25: 331-339.

75. Ditzel, L., Lowe, J., Stock, D., Stetter, K.O., Huber, H., Huber,R. and Steinbacher, S. 1998. Crystal structure of the thermosome, the archaeal chaperonin and homolog of CCT. Cell 93, 125-138.

76. Dobson C.M. 1992. Unfolded proteins, compact states and molten globules.

77. Curr.Opin.Struct.Biol. 2: 6-12. Dobson C.M. 2003. Protein folding and misfolding. Nature. 18: 884-890. Dobson C.M. 2004. Experimental investigation of protein folding and misfolding. Methods. 34:4-14.

78. Dolgikh D. A., Gilmanshin R. I., Brazhnikov E. V., Bychkova V. E., Semisotnov G. V.,

79. EftinkM., Ghiron C. A. 1981. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal.

80. Biochem. 114: 199-227. Eftink M. R. 1994. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions inproteins, Biophys. J. 66: 482-501. Eisinger, J., Feuer В., Lamola A. A. 1969. Intramolecular singlet excitation transfer.

81. Fenton, W.A., Kashi, Y., Furtak, K. and Horwich, A.L. 1994. Residues in ehaperonin GroEL required for polypeptide binding and release. Nature 371, 614-619.

82. Fersht A. 1998. Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding. N.Y.: W.H. Freeman and Company, 631 p.

83. Fink A. L. 1995. Molten globules. Methods Mol. Biol. 40: 343-360.

84. Fink A.L. 1998. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold Des. 3: R9-23.

85. Fischer C. J., Schauerte J. A., Wisser К. C., GafniA., Steel D. G. 2000. Hydrogen exchange at the core of Escherichia coli alkaline phosphatase studied by room-temperature tryptophan phosphorescence. Biochemistry. 39:1455-1461.

86. Fischer C. J., GafniA., Steel D. G., Schauerte J. A. 2002. The triplet-state lifetime of indole in aqueous and viscous environments: significance to the interpretation of room temperature phosphorescence in proteins. J. Am. Chem. Soc. 124: 10359-66.

87. Forster Th. I960. Transfer mechanisms of electronic excitation energy. Rad. Res. Suppl. 2: 326-339.

88. FradkovA. F., Chen Y., Ding L., Barsova E. V., Matz M. V., Lukyanov S. A. 2000. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence. FEBS Lett. 479: 127-130.

89. Frankel S., Condeelis J., LeinwandL. 1990. Expression of actin in Escherichia coli:

90. Aggregation, solubilization, and functional analysis. J. Biol. Chem. 265: 17980-17987.

91. Fukuda H., Arai M., Kuwajima K. 2000. Folding of green fluorescent protein and cycle3 mutant. Biochemistry 39: 12025-12032.

92. Gilbert H.F. 1994. Protein chaperones and protein folding. Cur. Opin. Struct. Biol. 5: 534539.

93. Biochemistry 34: 13847-13857. Grallert, H. and Buchner, J. 2001. Review: a structural view of the GroE chaperone cycle.

94. Gutsche, /., Essen, L.O. andBaumeister, W. 1999. Group II chaperonins: new TRiC(k)s and turns of a protein folding machine. J. Mol. Biol. 293, 295-312.

95. Hamasaki К., Ikeda H., Nakamura A., Ueno A., Toda F, Suzuki I., Osa T. 1993.

96. Fluorescence sensors of molecular recognition. Modified cyclodextriins capable of exhibiting guest-responsive twisted intramolecular charge transfer fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 115: 5035-5040.

97. Harper J. D., Lansbury P. T. Jr. 1997. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Ann. Rev. Biochem. 66: 385-407.

98. Hartl F.U., Martin J. 1995. Molecular chaperones in cellular protein folding. Cur. Opin. Struct. Biol. 5:92-102.

99. Hashimoto M., Masliah E. 1999. Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease. Brain Pathol. 9: 707-720.

100. Heim R., Prasher D. C., Tsien R. Y. 1994. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 1250112504.

101. Heim R., CubittA. В., Tsien R. Y. 1995. Improved green fluorescence. Nature. 373: 663664.

102. Herrmann H., Aebi U. 1998. Intermediate filament assembly: fibrillogenesis is driven by decisive dimmer-dimer interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 177-185.

103. HershkoA., Ciechanover A. 1998. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67: 425-479.

104. Hiniker A., Bardwell C. A. 2003. Disulfide bond isomerization in prokaryotes. Biochemistry. 42: 1179-1185.

105. Holmgren A. 1979. Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254: 9627-9632.

106. Holmes K.C., Popp D., Gebhard W„ Kabsch W. 1990. Atomic model of the actin filament. Nature. 347: 44-49.

107. Horie Т., Vanderkooi J. M. 1982. Phosphorescence of tryptophan from parvalbumin and actin in liquid solution. FEBS Lett. 147:69-73.

108. Horovitz, A., Fridmann, Y., Kafri, G. and Yifrach, O. 2001. Review: allostery in chaperonins. J. Struct. Biol. 135, 104-114.

109. Hsiao C.-D., Sun Y-J., Rose J., Wang B.-C. 1996. The crystal structure of glutamine-binding protein from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 262: 225-242.

110. Humphrey W., DalkeA., Schulten K. 1996. VMD: visual molecular dynamics, J. Molec. Graphics. 14: 33-38.

111. Jaenicke R., Lilie H. 2000. Folding and association of oligomeric and multimeric protein. Adv. Protein Chem. 53: 329-401.

112. JolyM. 1965. A Physico-Chemical Approach to the Denaturation of Proteins. In Molecular Biology an International Series of Monographs and Textbooks. Horecker В., Kaplan N. O. Scheraga H. A., editors. Vol. 6. Academic Press. London. New York.

113. Kabsch W., Mannherz H. G., Suck D., Pai E. F., Holmes H. C. 1990. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature. 347: 37-44.

114. Kafri, G., Willison, K.R. and Horovitz, A. 2001. Nested allosteric interactions in the cytoplasmic chaperonin containing TCP-1. Protein Sci. 10, 445-449.

115. KayL.E. 2005. NMR studies of protein structure and dynamics. J. Magn. Reson. 173:193207

116. Kelly J. W. 1997. Amyloid fibril formation and protein misassembly a structural quest for insight into amyloid and prion diseases. Structure 5: 595-600.

117. Kelly J. W. 2000. Mechanisms of amyloidogenesis. Nature Struct. Biol. 7: 824-826.

118. Kim P .S., Baldwin R. L. 1990. Intermediates in the folding reactions of small proteins. Ann. Rev. Biochem. 59: 631-660.

119. Klumpp, M., Baumeister, W. and Essen, L.O. 1997. Structure of the substrate binding domain of the thermosome, an archaeal group II chaperonin. Cell 91,263-270.

120. Koo E. H„ LansburyP. T. Jr, Kelly J. W. 1999. Amyloid disease abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 9989-9990.

121. Kondo H., Nakatani H., Hiromi K. 1976. Interaction of cyclodextrins with fluorescent probes and its application to kinetic studies of amylase. J. Biochem. 79: 393-405.

122. Kubota, H., Hynes, G.M., Kerr, G.M. and Willison, K.R. 1997. Tissue-specific subunit of the mouse cytosolic chaperonin-containing TCP-1. FEBS Lett. 402, 53-56.

123. Kumita J. R., Weston C. J., Choo-Smith L. P., Woolley G. A., O. S. Smart. 2003. Prevention of peptide fibril formation in an aqueous environment by mutation of a single residue to Aib. Biochemistry. 42: 4492-4498.

124. Kuznetsova I. M., KhaitlinaS. Yu., Konditerov S. N., SurinA. M., Turoverov К. K. 1988. Changes of structure and intermolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophys. Chem. 32: 73-78.

125. Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Khaitlina S. Yu., Vassilenko K. S., Turoverov К. K.,

126. Uversky V. N. 1999a. Effect of self-association on the structural organization of partially folded proteins: inactivated actin. Biophys. J. 77: 2788-2800.

127. Kuznetsova I. M., Turoverov К. K., Uversky V. N. 1999b. Inactivated actin, and aggregate comprised of partially-folded monomers, has a overall native-like packing density. Protein Peptide Lett. 6: 173-178.

128. Kuznetsova I. M., Yakusheva T. A., Turoverov К. K. 1999c. Contribution of separatetryptophan residues to intrinsic fluorescence of actin. Analysis 3D structure. FEBS Lett. 452:205-210.

129. Kuznetsova I. M., Stepanenko Olga V, Turoverov К. K., ZhuL.,. ZhouJ.-M., Fink A. L., Uversky V. N. 2002b. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase. Biochem. Biophys. Acta. 1596: 138-155.

130. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Uversky V.N. 2004. Use of phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates. J. Proteome Res. 3: 485-494.

131. Vine H. 111. 1993. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution. Protein Sci. 2: 404410.

132. Vine III, H. 1995. Thioflavine T interaction with amyloid P-sheet structures. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., 2, 1-6.

133. Vine HIII. 1997. Stopped-flow kinetics reveal multiple phases of thioflavin T binding to Alzheimer beta (1-40) amyloid fibrils. Arch Biochem. Biophys. 342: 306-16.

134. Marquardt D. W. 1963. An algorithm for least-squares estimation of non linear parameters.

135. J. Soc. Ind. Appl. Math. 11:431-441.

136. Martensson, L.G., P. Jonasson, P.O. Freskgard, M. Svensson, U. Carlsson, and B.H.

137. Jonsson. 1995. Contribution of individual tryptophan residues to the fluorescence spectrum of native and denatured forms of human carbonic anhydrase II. Biochemistry. 34:1011 -1021.

138. Martinez-Galisteo, E., Padilla, C. A., Garcia-Alfonso, C., Lopez-Barea, J., and Barcena, J. A. (1993) Purification and properties of bovine thioredoxin system, Biochimie 75, 803-809

139. Matouschek A., Kellis J.T. Jr, Serrano L., By с r oft M., Fersht A.R. 1990. Transient folding intermediates characterized by protein engineering. Nature. 346: 440-445.

140. Matouschek A., Kellis J.T. Jr, Serrano L., Fersht A.R. 1989. Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering. Nature. 340: 122-126.

141. Matveyev, V. V., Usmanova A. M., Morozova A. V., Collins J.H., Khaitlina S.Yu. 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP 32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 1296: 55-62.

142. Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., Lukyanov S. A. 1999. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol. 17: 969-973.

143. Mazhul' V. M., Shcherbin D. G.1997. Tryptophan phosphorescence as a monitor of flexibility of membrane proteins in cells. Proc. SPIE 2980: 507-514

144. Mazhul' V. M., Zaitseva E. M., Shavlovsky M. M., Stepanenko Olesia V., Kuznetsova I. M., Turoverov К. K. 2003. Monitoring of Actin Unfolding by Room Temperature Tryptophan Phosphorescence. Biochemistry. 42: 13551-13557.

145. McCarthy A. A., Haebel P. W, Torronen A., Rybin V., Baker E. N„ MetcalfP. 2000. Crystal structure of the protein disulfide bond isomerase, DsbC, from Escherichia coli. Nat Struct Biol. 7: 196-199.

146. McLaughlin P. J., Gooch J. Т., Mannherz H. G., Weeds A. G. 1993. Structure of gelsolin segment 1-actin complex and the mechanism of filament severing. Nature. 364: 685-692.

147. Melanie R. N. 2004. Techniques to study amyloid fibril formation in vitro. Methods. 34: 151-160.

148. Merrit E. A., Bacon D. J. 1977. Raster3D: Photorealistic molecular graphics. Methods in enzymol. 277: 505-524.

149. Missiakas D., Georgopoulos C., Raina S. 1994. The Escherichia coli. dsbc (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulphide bond formation. EMBO J. 13: 2013-2020

150. Nolting В. 1999. Protein folding kinetics. Biophys. Methods. Berlin-Haidelberg: Springer-Verlag, 145 p.

151. Permyakov E. A., Yarmolenko V. V., Emelyanenko V. I., Burstein E. A., ClossetJ., Gerday C. 1980. Fluorescence study of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

152. Plotkin S.S., Onuchic J.N. 2002. Understanding prtein folding with energy landscape theory. Part I: Basic concepts Quart. Rev. Biophys. 35: 111-167.

153. Pollack, L. Tate M.W., Darnton N.C., Knight J. В., Gruner S.M., Eaton W.A., Austin

154. R.H.1999. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle X-ray scattering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 1011510117.

155. Pollard T.D., Blanchoin L., Mullins R.D. 2000. Molecular mechanism controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 545576.

156. Privalov P.L., Potekhin S.A. 1986. Scanning microcalorimetry in studing temperature-induced changes in proteins. Methods enzymol. 131: 4-51.

157. Ptitsyn О. B. 1995. Molten globule and protein folding. Adv. Protein. Chem. 47:83-229.

158. Rao J.K., Bujacz G., Wlodawer A. 1998. Crystal structure of rabbit muscle creatine kinase. FEBS Lett., 439, 133- 137.

159. Radford S. 2000. Protein folding: progress made and promises ahead. Trends Biochem. Sci. 25: 611-618.

160. ReidB. G., Flynn G. C. 1997. Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry. 36: 6786-6791.

161. Ritco-Vonsovici, M. and Willison, K.R. 2000. Defining the eukaryotic cytosolic chaperonin-binding sites in human tubulins. J. Mol. Biol. 304, 81-98.

162. Robinson R. G., Mejillano M., Le V. P., BurtnickL. D., Yin H. L., Choe S. 1999. Domain movement in gelsolin: a calcium-activated switch. Science. 286: 1939-1942.

163. Roder H., Shastry M.C.R. 1999. Methods for exploring early events in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 620-626.

164. Rommelaere, H., de Neve, M., Melki, R., Melki, R., Vandekerckhove, J. andAmpe, C. 1999. The cytosolic class II chaperonin CCT recognizes delineated hydrophobic sequences in its target proteins. J. Biol. Chem. 38, 3246-257.

165. Roseman, A.M., Chen, S., White, H., Braig, K. andSaibil, H.R. 1996. The chaperonin

166. ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. Cell 87, 241-251.

167. Schoehn, G., Hayes, M., Clil, M., Clarke, A.R. andSaibil, H.R. 2000. Domain rotations between open, closed and bullet-shaped forms of the thermosome, an archaeal chaperonin. J. Mol. Biol. 301, 323-332.

168. Schoehn, G., Quaite-Randall, E., Jime.nez, J.L., Joachimiak, A. and Saibil, H.R. 2000. Three conformations of an archaeal chaperonin, TF55 from Sulfolobus shibatae. J. Mol. Biol. 296, 813-819.

169. Schauerte J. A., SteelD. G., GafniA. 1997. Time-resolved room temperature tryptophan phosphorescence in proteins. Methods Enzymol. 278:49-71.

170. Scheffner M., Werness B. A., Huibregtse J. M., Levine A. J., Howley P. M. 1990. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation ofP53. Cell. 63: 1129-1136.

171. SchmidF. X. 2002. Prolyl isomerases. Adv. Protein.Chem. 59: 243-282.

172. Schuler H., Lindberg U., Schutt С. E., Karlsson R. 2000. Thermal unfolding of G-actin monitored with DNase-I-inhibition assay stabilities of actin isoforms. Eur. J. Biochem. 267: 476-486.

173. Schutt С. E., MyslikJ. C., Rozycki M. D., Goonesekere N. C., Linberg U. 1993. The structure of crystalline profiling-p-actin. Nature. 365: 810-816.

174. Selkoe D.J. 2003. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426: 900-904.

175. Semisotnov G. V., Rodionova N. A., Razgulyaev О. I., Uversky V. N., Gripas'A. F.,

176. Gilmanshin R. I. 1991. Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers. 31:119-128.

177. Sheterline P., Clayton J., Sparrow J. 1998. Actin. Protein Profile. Oxford University Press, Oxford.

178. Shortle D., Ackerman M.S. 2001. Persistence of native-like topology in a denatured protein in 8 M urea. Science. 293 : 487-489.

179. Shtilerman, M., Lorimer, G.H. and Englander, S.W. 1999. Chaperonin function: folding by forced unfolding. Science 284, 822-825.

180. Sigler, P.В., Xu, Z.H., Rye, H.S., Burston, S.G., Fenton, W.L.andHorwich, A.L. 1998. Structure and function in GroEL-mcdiated protein folding. Annu. Rev. Biochem. 67, 581-608.

181. Smith G. R., Sternberg M. J., Bates P. A. 2005. The relationship between the flexibility of proteins and their conformational states on forming protein-protein complexes with an application to protein-protein docking. J. Mol. Biol. 347: 1077-1101.

182. Speed M. A., WangD. I., King J. 1996. Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition, Nat. Biotechnol. 14: 12831287.

183. Strambini G. В., Lehrer S. S. 1991. Tryptophan phosphorescence of G-actin and F-actin. Eur

184. Sun L., Kantrowitz E. R., Galley W. C. 1998. Recent advances in protein room-temperature phosphorescence spectroscopy Proc. SPIE 3256: 236-242.

185. Sun Y. J., Rose J., Wang В. C., Hsiao C. D. 1998. The structure of glutamine-bindingprotein complexed with glutamine at 1.94 A resolution: comparisons with other amino acid binding proteins. J Mol. Biol. 278: 219-229.

186. Sun X. X, Wang C.C. 2000. The N-terminal sequence (residues 1-65) is essential for dimerization, activities, and peptide binding of Escherichia coli DsbC. J. Biol. Chem. 275: 22743-22749.

187. Tanford C. 1968. Protein denaturation. Adv. Protein Chem. 23: 121-282.

188. TerskikhA., FradkovA., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., KajavaA. V., Zhao X., Lukyanov S., MatzM., KimS., Weissman I., Siebert P. 2000. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290: 1585-1588.

189. Tsien R. Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544.

190. Turoverov К. K., Khaitlina S. Yu., Pinaev G. P. 1976. Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62: 4-7.

191. Turoverov К. K, Kuznetsova I. M., Zaitsev V. N. 1985. The environment of tryptophan residue in pseudomonas aeruginosa azurin and its fluorescence properties. Biophys. Chem. 23: 79-89.

192. Turoverov К. K., Biktashev A. G., Khaitlina S. Yu., Kuznetsova I. M. 1999a. The structure and dynamics of partially folded actin. Biochemistry. 38: 6261-6269.

193. Turoverov К. К., Kuznetsova I. M., Khaitlina S. Yu., and Uversky V.N. 1999b. Unusual combination of the distorted structure and frosen mobility in inactivated actin molecule. Protein and Peptide Letters. 6: 73-78.

194. Turoverov К. K., Verkhusha V. V., Shavlovsky M. M., Biktashev A. G., Povarova О. I., Kuznetsova I. M. 2002. Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochloride. Biochemistry. 41: 1041-1019.

195. Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2003. Intrinsic fluorescence of actin. J. Fluorescence 13: 41-57.

196. Uversky V. N. 1993. Use of fast-protein size-exclusion chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochem. 32: 13288-13298.

197. Uversky V. N., Ptitsyn O.B. 1996. Further evidence on the equibrium "pre-molten globule state": four-state GdmCl-induced unfolding opf carbonic anhydrase В at low temperature. J. Mol. Biol. 255: 215-228.

198. Uversky V.N., WinterS., Lober G. 1996. Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transition in proteins which unfold through the molten globule state. Biophys. Chem. 60: 79-88.

199. Uversky V. N., WinterS., Lober G. 1998. Self-association of 8-anilino-l-naphthalenesulfonate molecules: spectroscopic characterization and application to the investigation of protein folding. Biochim Biophys Acta. 1388: 133-142.

200. Uversky V. N., Talapatra A., Gillespie J. R., Fink, A. L. 1999. Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. Med. Sci. Monitor. 5: 1001-1012, 1238-1254.

201. Valpuesta J.M., Martin-Benito J., Gomez-Puertas P., Carrascosa J.L., Willison K.R. 2002. Structure and function of a protein folding machine: the eukaryotic cytosolic chaperonin CCT. FEBS Letters. 259, 11-16.

202. Vanderkooi J. M. 1992. Tryptophan phosphorescence from proteins at room temperature. In: Topics in fluorescence spectroscopy. New York: Plenum Press, 3: 113-136.

203. Verkhusha V V, Otsuna H., Awasaki Т., Oda H., Tsukita S., Ito K. 2001. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276: 29621-29624.

204. Verkhusha V. V., Kuznetsova I. M., Stepanenko О. V., Zaraisky A. G., Shavlovsky M. M., Turoverov К. K., Uversky V. N. 2003. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry. 42: 7879-7884.

205. VisserN. V, HinkM. A., BorstJ. W., van der Krogt G. N., Visser A. J. 2002. Circular dichroism spectroscopy of fluorescent proteins. FEBS Lett. 521: 31-35.

206. Vrzhershch P. V, Akovbian N. A., Varfolomeyev S. D., Verkhusha V V. 2000. Denaturation and renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett. 487: 203-208.

207. Wachter R. M., KingB. A., Heim R., Kallio K, Tsien R. Y., Boxer S. G., Remington S. J. 1997a. Crystal structure and photodynamic behavior of the blue emission variant Y66H/Y145F of green fluorescent protein. Biochemistry. 36: 9759-9765.

208. Wachter R. M., Yarbrough D., Kallio K, Remington S. J. 1997b. Crystallographic and energetic analysis of binding of selected anions to the yellow variants of green fluorescent protein. J. Mol. Biol. 301: 157-171.

209. Ward W. W., Bokman S. H. 1982. Reversible denaturation of Aequorea Green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 21: 4535-4540.

210. Weiner J. H., Heppel L. A. 1971. A binding protein for glutamine and its relation to active transport in E.coli. J. Biol. Chem. 246: 6933-6941.

211. West J. J., Nagy В., GergelyJ. 1967. Free adenosine diphosphate as an intermediary in the phosphorylation by creatine phosphate of adenosine diphosphate bound to actin. J. Biol. Chem. 242: 1140-1145.

212. Wetzel R. 1992. in Protein Engineering. A Practical Approach (Rees A. R., Sternberg A. R., Wetzel R., Eds.) pp 191-219, IRL Press, Oxford.

213. Wetzel R. 1994. Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol. 12: 193-198.

214. Willison, K.R. and Horwich, A.L 1996. in: The Chaperonins (Ellis, R.J., ed.), pp. 107-136, Academic Press, San Diego, CA.

215. Willison, K.R. 1999. in: Molecular Chaperones and FoldingCatalysts (Bukau, В., Ed.), pp. 555-571, Harwood Academic Publishers, Amsterdam.

216. Willison, K.R. and Grantham, J. 2001. in: Molecular Chaperones: Frontiers in Molecular Biology (Lund, P., Ed.), pp. 90-118, Oxford University Press, Oxford

217. Wouters F. S., Verveer P. J., Bastiaens P. I. 2001. Imaging biochemistry inside cells. Trends Cell Biol. 11:203-211.

218. Xu, Z., Honvich, A.L. and Sigler, P.B. 1997. The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature 388, 741-750.

219. Yamomoto Yu., TanakaJ. 1970. Spectroscopic studies on the configurational structures of ribonuclease Tl. Biochim. Biophys. Acta. 207: 522-531.

220. Yanushevich Y. G., Staroverov D. В., Savitsky A. P., Fradkov A. F., Gurskaya N. G., Bulina M. E., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A. 2002. A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett. 511: 11-14.

221. Yarbrough D., Wachter R. M., Kallio K., Matz M. V., Remington S. J. 2001. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 462-467.

222. Yoshiike Y., ChuiD. H., Akagi Т., TanakaN., Takashima A. 2003. Specific compositions of amyloid-beta peptides as the determinant of toxic beta-aggregation. J. Biol. Chem. 278: 23648-23655

223. Zahn R. 1999. Prion propagation and molecular chaperones. Quart. Rev. Biophys. 32: 309370.

224. Я благодарна Б.Н.Кудрявцеву, в состав Лаборатории которого длительное время входила наша группа, за благожелательное отношение и внимание.

225. Я благодарна Дирекции за доброжелательную атмосферу в Институте чрезвычайно способствующую работе.

226. Я признательна моей семье за постоянную поддержку, понимание и терпение.

Информация о работе

Кузнецова, Ирина Михайловна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы