Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние 2-гидроксипропил-ß-циклодекстрина на термостабильность и агрегацию белков

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние 2-гидроксипропил-ß-циклодекстрина на термостабильность и агрегацию белков"

На правах рукописи

Малолеткина Ольга Игоревна

ВЛИЯНИЕ 2-ГИДРОКСИПРОПИЛ-р-ЦИКЛОДЕКСТРИНА НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ

специальность 03.01.04 - биохимия

1 2 ¿612

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005011944

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук К.А. Маркосян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.П. Юрина

доктор биологических наук, профессор Е.Н. Добров

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «Л 7- » иев&УП- 2012 г. в тО час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «££ » фг^^а^с^ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к проблеме агрегации белков возник в последние годы в связи с обнаружением большого числа наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни» и возникающих в тех случаях, когда те или иные белки подвергаются структурной перестройке, способствующей их агрегации (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, прионные энцефалопатии и др.). Агрегация белков является также важной проблемой для биотехнологии, т.к. агрегацией сопровождаются все стадии производства белковых лекарственных препаратов. Известно, что присутствие низкомолекулярных веществ (например, Сахаров, многоатомных спиртов, солей, аминокислот и т.д.) оказывает значительное влияние на стабильность белка в растворе. В связи с этим добавки, подавляющие агрегацию, часто используются во время производства, очистки и приготовления лекарственных форм и до настоящего времени являются наиболее эффективным способом борьбы с проблемой агрегации. Поскольку в продажу поступает все большее количество белковых препаратов, промышленность нуждается в новых антиагрегационных агентах для разработки технологии производства, позволяющей получать стабильные, правильно свернутые активные продукты.

Для подавления агрегации белков часто используют циклодекстрины (ЦЦ) и их производные. Способность ЦД подавлять агрегацию белков объясняется их способностью связываться с остатками гидрофобных аминокислот в негативных (частично развернутых) формах белков, что приводит к подавлению процесса агрегации. Однако имеются данные, демонстрирующие стимуляцию агрегации белков в присутствии ЦЦ. Действие ЦЦ и их производных испытывают в различных тест-системах, каждая из которых имеет свои ограничения. В тест-системах, основанных на рефолдинге белков, ренатурация идет через стадию образования интермедиатов, склонных к агрегации. Используемый агент может оказывать влияние на стадию образования интермедиага из денатурированного белка. Возможно наложение эффектов агента на эту стадию и на стадию агрегации интермедиата. Таким образом, не представляется возможным использовать модель рефолдинга для изучения влияния агентов на стадию агрегации. В качестве тест-систем, пригодных для испытания эффективности подавления агрегации белков ЦЦ и их производными, применяются также системы, основанные на тепловой агрегации белков. В таких тест-системах также возможно влияние агентов на стадию денатурации нативного белка, и исследование чистого эффекта на стадию агрегации невозможно без предварительной проверки термостабильности белка в присутствии агента.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является изучение механизмов разнонаправленного (подавляющего и ускоряющего) действия циклодекстринов (на примере 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина; ГПЦЦ) на процесс агрегации белков и разработка тест-системы, позволяющей оценивать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ГПЦЦ на термостабильность и кинетику тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика.

2. Изучить влияние ГПЦЦ на термостабильность и кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.

3. Исследовать агрегацию УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

4. Изучить влияние ГПЦЦ на кинетику агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Научная новизна. При изучении кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния установлено, что механизм тепловой агрегации креатинкиназы включает стадию образования стартовых агрегатов. Показано, что тепловая агрегация креатинкиназы протекает в реакционно-контролируемом режиме.

На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации креатинкиназы в присутствии ГПЦД сделан вывод о том, что ГПЦЦ не влияет на термостабильность белка. Методом динамического светорассеяния показано подавляющее действие ГПЦЦ на тепловую агрегацию креатинкиназы.

Показано, что стимуляция агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика в присутствии ГПЦЦ вызвана дестабилизацией белка под действием ГПЦЦ. Ускорение денатурации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в присутствии ГПЦЦ «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦЦ на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации.

Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Показано, что в результате УФ-облучения в растворе образуются развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 °С). С помощью такой

тест-системы показано защитное действие ГПЦД на агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Практическое значение работы. Новая тест-система, основанная на агрегации УФ-облученного белка, может быть использована для поиска антиагрегационных агентов и оценки их шапероноподобной активности. Результаты исследований механизма действия ГПЦД на агрегацию белков могут быть учтены при решении биотехнологических задач и создании белковых препаратов медицинского назначения. Понимание механизмов агрегации белков и механизмов, предотвращающих агрегацию, на молекулярном уровне открывает перспективы для исследования и лечения большого ряда наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008; 2009), конференции молодых ученых в рамках V Международного Симпозиума «Российско-Европейское сотрудничество в области «Биотехнология, сельское хозяйство и пища» в седьмой рамочной программе ЕС» (Пущино, 1-3 октября, 2008), VIII и IX Европейских Симпозиумах Общества Белка (Цюрих, Швейцария, 2009 и Стокгольм, Швеция, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах, статья в сборнике трудов и 5 тезисов).

Объем и структура работы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 46 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы (231 источник).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали лиофилизованный препарат цитоплазматической креатинкиназы (КФК; КФ 2.7.3.2) из скелетных мышц кролика («Sigma», США) и сухой коммерческий препарат ГПЦД (CycloLab, Венгрия). Препарат NAD-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД; КФ 1.2.1.12) из скелетных мышц кролика был любезно предоставлен к.б.н. P.A. Асриянц (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова). а-Кристаллин из

хрусталиков глаза молодых бычков был любезно предоставлен д.б.н. К.О. Мурановым (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук).

УФ-облучение ГАФД было выполнено совместно с д.б.н. К.О. Мурановым в лаборатории физико-химических основ рецепции (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук). УФ-облучение образцов (концентрация ГАФД 2 мг/мл, объем 2 мл) проводили в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см с помощью 1000 Вт ртутной лампы (ДРШ-1000, Россия). Температура образцов не превышала 10 °С.

Эксперименты по скоростной седиментации были выполнены совместно с д.б.н. Н.А. Чеботаревой (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук) на аналитической ультрацентрифуге «Spinco Е» (Beckman, США) с использованием абсорбционной оптической сканирующей системы при длине волны 280 нм, при 20-48 °С и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин. Коэффициенты седиментации рассчитывали с помощью программы SEDFIT. Полученные коэффициенты седиментации приводили к стандартным условиям (плотность и вязкость растворителя брали для водного раствора при 20 °С).

Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук) и к.б.н. В.Н. Орловым (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (ИБП РАН, Пущино). Растворы белка нагревали с постоянной скоростью 1 или 2 °С/мин в температурном интервале от 15 до 90 °С при постоянном давлении 2,2 атмосферы.

Кинетику агрегации белков изучали методом динамического светорассеяния. Измерения проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632,8 нм (Coherent, США, модель 31-2082). Температуру образцов поддерживали при помощи пропорционально-интегрально-дифференциального регулятора PhotoCor-TC в пределах ±0,1 °С. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов. Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rb проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние ГПЦЦ на тепловую инактивацию, денатурацию к агрегацшо креатинкиназы из скелетных мышц кролика

Для выяснения характера влияния ГПЦЦ на тепловую инактивацию КФК

(ОД мг/мл) нами была изучена кинетика инактивации фермента при 48 °С в присутствии ГПЦЦ. Концентрацию ГПЦЦ варьировали в диапазоне 10-76 мМ. Как видно из рис. 1, в присутствии ГПЦЦ кинетика инактивации не изменялась.

Термостабилыюсть КФК была исследована методом дифференциальной: сканирующей калориметрии (ДСК). Положение максимума на ДСК-профиле (Тюк) в отсутствие ГПЦЦ соответствует

100 200 300 t, мин

Рис. 1. Зависимость остаточной фермеюттивной активности КФК (0,2 мг/мл) от времени в

отсутствие (о) и в присутствии 76 мМ ГПЦЦ (•) 53,7 ± ОД °С (рис. 2). Имеются данные, что при 48 С. форма ДСК профилей КФК остается

неизменной при варьировании концентрации белка [Lyubarev et al., 1999]. Это означает, что процесс денатурации КФК не включает кинетически значимую стадию

обратимой диссоциации КФК на мономеры.

Для выяснения характера влияния ГПЦЦ на термостабилыюсть КФК мы сравнили ДСК профили в отсутствие и в присутствии ГПЦЦ (рис. 2). Значение Гшах в присутствии ГПЦЦ практически не изменялось и составило 53,8 ±0,1, 65 53,6 ±0,1 и 53,6 ±0,1 °С при концентрациях ГПЦЦ 15, 38 и 76 мМ, соответственно. Таким образом, ГПЦЦ в концентрациях вплоть до 76 мМ не оказывает влияния на тепловую денатурацию КФК.

45 50 55 60 Температура, °С

Рис. 2. Профили ДСК для КФК (0,5 мг/мл; 30 мМ Нерез-КаОН, 0,1 М КаС1, рН 8,0), полученные при различных концентрациях ГПЦД. Скорость нагревания раствора фермента 1 "С/мин.

10 20 30 4 0 50 60 70 и мин

Рис. 3. Зависимости интенсивности светорассеяния от времени для тепловой агрегации КК (0,2 мг/мл) при 48 °С, полученные в присутствии различных концентраций ГПЦД: (1) 0, (2) 8, (3) 38, (4) 61 и (5) 76 мМ.

Действие ГПЦД на агрегацию КФК было исследовано методом

динамического светорассеяния. На рис. 3 представлен прирост интенсивности светорассеяния для агрегации КФК при 48 °С в отсутствие и в присутствии ГПЦД. Добавление ГПЦД вызывает снижение прироста интенсивности светорассеяния. Как видно из рис. 3, кинетические кривые агрегации КФК характеризуются наличием лаг-периода. Для вычисления длительности лаг-периода (70), мы проанализировали начальные участки зависимости интенсивности

светорассеяния от времени с помощью эмпирического уравнения, предложенного ранее [Курганов, 1998; Егошпа е1 а!., 2009; Вшт^ша е1 а!., 2010Ь]:

I - А'а„„(г - /0)2, (1 > (а)

(1)

4 5 г, мин

Рис. 4. Начальные участки зависимостей гаггепсивности светорассеяния от времени для тепловой агрегации КФК при 48 °С в присутствии следующих концентраций ГПЦД: (А) 0 и (Б) 38 мМ. Сплошные кривые проведены в соответствии с уравнением (1). Вертикальные стрелки обозначают момент времени г = /0-

подавление агрегации КФК под действием

где / - интенсивность светорассеяния, А'а?„ - константа с размерностью (фотоотсчет/с) мин"2, характеризующая начальную скорость агрегации.

Применимость этого уравнения показана для начальных участков зависимостей I от времени, полученных в отсутствие (рис. 4А) и в присутствии 38 мМ ГПЦД (рис. 4Б). Величины параметров Г0 и А',,,,,, рассчитанные с помощью уравнения (1), приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, длительность лаг-периода (/0) увеличивается с ростом концентрации ГПЦД. Уменьшение значения А'а,,к в присутствии ГПЦД указывает на ГПЦД.

Таблица 1. Параметры тепловой агрегации КФК (0,2 мг/мл) при 48 °С в присутствии различных концентраций ГПЦД (30 мМ Нерс5-ХаОН, 0,1 М ХаС1, рН 8,0)

[ГПЦД], мМ МИН Кт„ (фотоотсчет/с) мин " Дь.о, им 1 Лж, мин '1

0 0,84 ±0.02 (132 ±4) х 102 32 ±2 0,81 ± 0,03

8 1,05 ±0,04 (44 ± 1) х 102 46 ±1 0,40 ±0,01

15 1,39 ±0,03 (69 ± 2) х Ю2 58 ±5 0,37 ± 0,03

31 2,07 ± 0,02 (38 ± 1) х Ю2 82 ±5 0,24 ± 0.02

38 2.07 ±0,02 (31 ± 1) х 102 74 ±4 0,28 ± 0,02

46 2,41 ±0,03 (22 ± 1) х ю2 89 ±4 0,20 ±0,01

61 2,44 ±0.05 (10.8 ± 0,3) х Ю2 129 ±7 0,102 ±0,015

76 2,69 ± 0,05 (2,0 ± 0,1) х Ю2 138 ± 6 0,081 ±0,007

Метод динамического

светорассеяния позволяет определить размер агрегатов, образующихся при нагревании КФК. На рис. 5 показано распределение по размеру частиц, полученных при различных временах инкубации КФК при 48 °С в отсутствие и в присутствии ГПЦЦ. Как видно, распределение частиц по размеру является унимодальным и средние величины гидродинамического радиуса агрегатов белка увеличиваются с увеличением времени инкубации. При одинаковых временах инкубации в присутствии ГПЦЦ образуются агрегаты меньшего размера.

На рис. 6 представлены зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов КФК от времени, полученные в отсутствие ГПЦЦ (кривая 1) и в присутствии ГПЦД в концентрациях 38 и 76 мМ (кривые 2 и 3, соответственно). Анализ начальных участков зависимостей от времени показал, что они следуют экспоненциальному закону:

Рис. 5. Тепловая агрегация КФК (0,2 мг/мл) при 48 °С в отсутствие (А) и в присутствии 76 мМ ГПЦД (Б). Распределения частиц по размеру получены при следующих временах инкубации: А - (1) 1,5, (2) 5, (3) 20, (4) 40 и (5) 60 мин; Б - (1) 5, (2) 20, (3) 40 и (4) 60 мин.

С > 'о)

(2)

А

2500 2000 1500 1000 500 0

• 1

• 2 * 3

¿^Sfr

■Jr.

0 10 20 30 40 50 60 70

4 мин

Рис. 6. Зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для тепловой агрегации КФК при 48 "С. (А) Зависимости Л, от времени, полученные в присутствии различных концентраций ГПЦД: (1) 0, (2) 38 и (3) 76 мМ. Сплошная кривая вычислена по уравнению (3). Начальные участки зависимостей Лк от времени, полученные в отсутствие (Б) и в присутствии 38 мМ ГПЦД (В). Кривые проведены в соответствии с уравнением (2), Вертикальные стрелки обозначают момент времени t =

Применимость данного уравнения показана для начальных участков зависимостей от времени, полученных в отсутствие (рис. 6Б) и в присутствии 38 мМ ГПЦД (рис. 6В). При известных значениях 1а могут быть найдены параметры уравнения (2), а именно -гидродинамический радиус стартовых агрегатов, т.е. агрегатов, присутствующих в системе в момент времени, в который регистрируется начальный прирост интенсивности светорассеяния, и 1Ж -интервал времени, на протяжении которого гидродинамический радиус агрегатов увеличивается в 2 раза. Величина характеризует начальную скорость агрегации. Полученные значения Ль о и 1/(211 представлены в таблице 1. Как видно, гидродинамический радиус стартовых агрегатов увеличивается с ростом концентрации ГПЦД от

R]

h,0

= 32 + 2

при [ГПЦД] = 0 до 138 +6 нм при [ГПЦД] = 76 мМ. В присутствии 76 мМ ГПЦД наблюдается десятикратное уменьшение значения параметра по сравнению с контролем ([ГПЦД] = 0). Уменьшите значения 1/(2ц отражает подавление агрегации КФК под действием ГПЦД.

Экспоненциальный характер

зависимости гидродинамического радиуса от времени на начальном участке

указывает на то, что процесс агрегации протекает в режиме reaction-limited cluster-cluster aggregation (RLCA), т.е. в режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении меньше единицы. Теория предсказывает, что с ростом размеров агрегатов режим RLCA сменяется режимом diffusion-limited cluster-cluster aggregation (DLCA), при котором скорость

агрегации определяется диффузией взаимодействующих частиц и каждое столкновение частиц приводит к их слипанию [Weitz and Lin, 1986]. Смена режимов агрегации происходит вследствие роста агрегатов, приводящего к увеличению поверхности сталкивающихся частиц, и, следовательно, к увеличению вероятности слипания. При выполнении режима DLCA зависимость гидродинамического радиуса от времени следует степенному закону [Khanova et al., 2005; Markossian et al., 2006]: K=KV+K{t-t)îd'At>t*) (3)

где Ль - значение Rh при t ~ t*, К - константа, dt - фрактальная размерность агрегатов. Для режима DLCA характерно универсальное значение dc, равное 1,8 [Weitz et al., 1985; Weitz and Lin, 1986]. Анализ зависимости Rh от времени для агрегации КФК в отсутствие ГПЦД показывает, что при довольно высоких значениях времени (о 10 мин) эта зависимость удовлетворительно описывается уравнением (3). При этом фрактальная размерность равна 1,81 ± 0,02.

Основные характеристики агрегации КФК также получены в режиме нагревания с постоянной скоростью. Агрегация КФК при нагревании с постоянной скоростью может быть использована для создания тест-системы скрининга агентов, оказывающих влияние на агрегацию белков.

Подавление тепловой агрегации КФК под действием ГПЦД согласуется с результатами работ, в которых защитное действие циклодекстринов было показано для тепловой агрегации цитратсинтазы, алкогольдегадрогеназы из печени лошади, гормонов роста норки и свиньи и а-амилазы [Toda et al., 2007; Sigurjonsdottir et al., 1999; Samra et al., 2010; Bajonmaite et al., 2009].

Представляло интерес сравнить эффективность подавления агрегации КФК шапероноподобным агентом ГПЦД с действием молекулярных шаперонов, представителем которых является а-кристаллин. Добавление в систему каждого из этих агентов вызывает значительное увеличение длительности лаг-периода и параметров K:i,.„ и I/^r, что количественно характеризует снижение начальной скорости агрегации. Однако при изучении действия ГПЦД приходится использовать значительно более высокие молярные концентрации, чем в случае а-кристаллина.

2. Влияние ГПЦД на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию ГАФД из скелетных мышц кролика

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

D 1 о 2 ¿ 3 V 4

■ Y ■ N. ^vTtC3 "^Чз- 1,2

\ ^—"

100

200 Í, мин

300

400

Рис. 7. Влияние ГПЦД на кинетику термоинактивации ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 °С (10 мМ Ха-фосфатный буфер, рН 7,5, 0,1 М №С1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ). Зависимости остаточной ферментативной активности Л/Ло от времени подучены в отсутствие ГПЦЦ (1) и в присутствии 4, 31, 76 мМ ГПЦД (2-4, соответственно).

Для выяснения характера влияния ГПЦД на термостабилыюсть ГАФД была изучена кинетика термоинактивации ГАФД и проведено исследование тепловой денатурации фермента методом ДСК в отсутствие и в присутствии ГПЦД. Зависимость остаточной ферментативной активности (A/Aq) ГАФД от времени инкубации при 45 °С в отсутствие и в присутствии различных концентраций ГПЦД представлена на рис. 7.

Скорость инактивации можно охарактеризовать с помощью параметра ?05, соответствующего времени падения

активности на 50%. Значите ?0,5> полученное в присутствии 4 мМ ГПЦД, не отличалось от контроля в отсутствие ГПЦД и составляло 240 мин. Полученный результат показывает, что низкие концентрации ГПЦД не влияют на термостабилыюсть ГАФД. Относительно высокие концентрации ГПЦД вызывают

ускорение инактивации. Значите /0,5

200

* 150 Тл о

5 100

£

50

1

з А

JJs

30

40 50 60 Температура, "С

70

Рис. 8. Профили ДСК для ГАФД (0,4 мг/мл), полученные при следующих концентрациях ГПЦЦ: (1) 0, (2) 4 и (3) 76 мМ. Скорость нагревании раствора фермента 1 °С/мин.

снижается до 125 и 25 мин в присутствии 31 и 76 мМ ГПЦД, соответственно (кривые 3 и 4 на рис. 7).

Термостабилыюсть ГАФД

исследовали методом ДСК. В отсутствие ГПЦЦ положение максимума на профиле ДСК (7'пт) равно 55,6 °С (кривая 1 на рис. 8). Форма ДСК профиля практически не изменяется в присутствии 4 мМ ГПЦД (кривая 2; Гпях -"■■ 55,4 °С). Для смеси ГАФД с 76 мМ ГПЦД наблюдается значительный сдвиг 7'ши в область более

низких температур (кривая 3; Гти = 52,8 °С). Полученные данные свидетельствуют, что относительно высокие концентрации ГПЦД снижают термостабилыюсть ГАФД.

Тепловая агрегация ГАФД в присутствии ГПЦД была изучена методом динамического светорассеяния. На рис. 9 показаны зависимости интенсивности светорассеяния от времени в присутствии различных концентраций ГПЦД. Как видно из рисунка, ГПЦД стимулирует тепловую агрегацию ГАФД. Следует отметить, что ускорение агрегации наблюдается даже при довольно низких концентрациях ГПЦД (4 мМ; кривая 2 на рис. 9А). На первый взгляд этот результат противоречит данным по термоннактивации и ДСК, согласно которым в присутствии 4 мМ ГПЦЦ

термостабилыюсть ГАФД не меняется. Это противоречие объясняется высокой чувствительностью метода регистрации белковых агрегатов по измерению интенсивности светорассеяния. Метод динамического светорассеяния позволяет регистрировать агрегаты белка при их содержании около 0,01% [Philo, 2006].

Начальные участки зависимостей интенсивности светорассеяшм от времени проанализированы с помощью уравнения (1) (рис. 9Б). Полученные значения параметров tä (длительность лаг-нериода) и Kägg (характеристика начальной скорости агрегации) приведены в таблице 2. Длительность лаг-периода уменьшается с увеличением концентрации ГПЦД. Рост значений с увеличением

концентрации ГПЦД свидетельствует о стимуляции агрегации ГАФД под действием ГПЦД.

Измерение гидродинамического радиуса агрегатов белка показало, что в присутствии ГПЦД образуются белковые агрегаты более крупных размеров. На рис. 10А представлены зависимости гидродинамического радиуса агрегатов ГАФД от времени, получешше при различных концентрациях ГПЦД. Анализ зависимости Äh от времени в отсутствие ГПЦД (кривая 1) показал, что, начиная с определенного момента (t > 10 мин), эта зависимость описывается уравнением (3) с cf{ = 1,78 ± 0,02. Это означает, что агрегация ГАФД протекает в диффузионно-контролируемом режиме (DLCA).

мин

Рпс. 9. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 °С. (Л) Зависимости интенсивности светорассеяния ог времени для агрегации в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 4, 31, 46 и 76 мМ ГПЦД (кривые 2-5). (Б) Анализ начальных участков зависимостей 1 от времени с помощью уравнения (1) при следующих концентрациях ГПЦД: (1) 0, (2) 4, (3) 31 и (4) 61 мМ.

Полученные результаты согласуются с ранее полученными данными [Магкояй^ап й а!., 2006; МагкоЕ81ап е1 а1., 2010].

Таблица 2. Параметры тепловой агрегации ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 °С в присутствии различных концентраций ГПЦД (10 мМ Na-фocфaтный буфер, 0,1 М КаС1, рН 7,5)

[ГПЦЩ.мМ »о, мин К№г, (фотоотсчет/с) мин"1 нм/мин

0 3,03 ± 0,05 (0,47 ± 0,01) х 104 34 ± 1

4 2,06 ±0,05 (0,77 ± 0,02) х Ю4 47 ± 1

8 1,78 ±0,04 (1,23 ± 0,06) х 104 53 ± 1

31 1,60 ±0,04 (1,53 ± 0,07) х 104 58 ± 1

46 1,62 ±0,04 (1.6 ± 0,1) х Ю4 62 ± 1

61 1,55 ±0,04 (2,1 ± 0,1) х ю4 70 ± 1

76 1,63 ±0,04 (2,3 ±0,1) х Ю4 72 ± 1

мин

Рпс. 10. Зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для тепловой агрегации ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 °С. (А) Полные кинетические кривые, полученные при различных концентрациях ГПЦЦ: (1) 0, (2) 4, (3) 31 и (4) 61 мМ. Сплошная кривая проведена в соответствии с уравнением (3). (Б) Начальные участки кинетических кривых. Прямые проведены в соответствии с уравнением (4).

Начальные участки зависимостей Ль от времени при различных концентрациях ГП1Щ (рис. 10Б) линейны и могут быть проанализированы с использованием уравнения:

+ «>!,) (4)

где /?ьо - гидродинамический радиус стартовых агрегатов, ?0 - момент времени появления стартовых агрегатов и Кл -константа, характеризующая скорость увеличения размеров белковых агрегатов. Параметр А", соответствует наклону начальных участков зависимости гидродинамического радиуса от времени (Кх = (с1Кь/с!0о). Полученные значения параметра представлены в таблице 2. Увеличение значения Кг характеризует стимуляцию агрегации ГАФД под действием ГПЦД.

При объяснении характера влияния ГПЦД на тепловую денатурацию и агрегацию ГАФД следует принимать во внимание, что денатурация ГАФД

протекает по диссоциативному механизму, согласно которому начальные стадии разворачивания белка включают диссоциацию исходного тетрамера на олнгомерные формы меньшего размера (димеры и мономеры). Таким образом, можно предположить, что уменьшение термостабилыюсти ГАФД в присутствии ГПЦЦ связано с диссоциацией тетрамерной формы ГАФД под действием ГПЦЦ.

Интересно сравнить влияние ГПЦЦ на тепловую агрегацию ГАФД с шаперошюй активность малых белков теплового шока (вНБрв). а-Кристаллин, представитель семейства БШрБ, подавляет тепловую агрегацию ГАФД, несмотря на то, что, судя по данным ДСК, а-кристаллин дестабилизирует молекулу белка [КЬапоуа й а1., 2007; Магкой51ап й а!., 2010]. Методом аналитического ультрацентрифугирования подтверждено образование комплексов между продуктами диссоциации ГАФД, с одной стороны, и продуктами диссоциации а-крнсталлина, с другой [Чеботарёва и соавт., 2009; Магкоз51ап й а1., 2010]. Согласно этим данным, а-кристаллин индуцирует диссоциацию ГАФД на более лабильные димеры и мономеры. Тем не менее, образование комплексов а-кристаллина с интермедиатами разворачивания ГАФД эффективно подавляет агрегацию. Логично предположить, что дестабилизация ГАФД в присутствии ГПЦЦ также вызвана образованием более лабильных мономерной н димерной форм. Однако, в отличие от а-кристаллнна, ускорение денатурации ГАФД в присутствии ГПЦЦ «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦД на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации. Таким образом, чтобы увидеть эффект ГПЦД непосредствешго на стадию агрегации, необходимо устранить его эффект на стадию денатурации. Для этого, в свою очередь, требуется разработка новой тест-системы, в которой под действием температуры будет агрегировать предварительно денатурированный белок.

3. Агрегация УФ-облученной глицеральдегнд-З-фосфатдегкдрогеназы из скелетных мышц кролика

УФ-облучение образцов ГАФД вызывает потерю ферментативной активности. Установлено, что процесс инактивации следует экспоненциальному закону.

Методом ДСК мы определили долю белка, оставшегося в нативном состоянии, в УФ-облученных препаратах. На рис. 11 показаны ДСК профили нативной ГАФД и фермента, облучешюго различными дозами УФ. Площадь под кривой дает общую теплоту денатурации и пропорциональна количеству дативного белка. Как видно из рисунка, УФ-облучепие приводит к уменыпешно площади под кривой, что свидетельствует об уменьшении доли нативного белка в УФ-облученных образцах. Уменьшение площади под кривой с увеличением дозы облучения сопровождается

40 50 60 70 80 Температура, °С Рис. П. Профили ДСК для ГАФД (2 мг/мл), облученной следующим! дозами УФ света: (1) 0, (2) 15, (3) 25, (4) 40 и (5) 60 Дж/см2.

С вычислено для тетрамера ГАФД.

сдвигом максимума (Т^) на ДСК профиле в область более низких температур. Значение Гтэх для необлученной ГАФД составило 63,8 °С. При дозе УФ 60 Дж/см2 максимум сдвигался до 53,5 °С.

По результатам

УФ-шщуцированной инактивации и данным ДСК для изучения агрегации УФ-облученной ГАФД мы выбрали дозу 40 Дж/см2.

На рис. 12 представлено

дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) для нативной (А) и УФ-облученной ГАФД (Б) при 20 °С. Основной пик с %>лу= 8,18 + 0,13 S соответствует тетрамерной форме ГАФД (рис. 12А). Распределения для УФ-облученной ГАФД (рис. 12Б) довольно широкие и полидисперсные, средневесовые значения коэффициента седиментации (iav) составили 8,6 ± 2,6 S и 9,0 ± 2,6 S для концентраций 0,2 и 0,8 мг/мл, соответствешю. По-видимому, увеличение полидисперности УФ-облученной ГАФД связано с тем, что облучение вызывает не только денатурацию фермента, но также диссоциацию тетрамера и агрегацию денатурированных форм. На присутствие диссоциированных форм указывает минорный пик с коэффициентом седиментации 5,0 S на распределениях ф). Основные пики на распределениях c(s) со значениями 8,06 и 8,13 S (рис. 12Б) не сильно отличаются от пика нативной ГАФД (8,18 S). Можно

Рпс. 12. Седиментационный анализ нативной ГАФД и фермента, облученного дозой УФ 40 Дж/см2, при 20 °С. Дифференциальные распределения по коэффициентам седиментации ф) нативной (А) и УФ-облученной ГАФД (Б). Концентрация нативного фермента 0,4 мг/мл, концентрации УФ-облученной ГАФД 0,8 (сплошная кривая) и 0,2 (пунктир) мг/мл. Скорость вращения ротора 48000 об/мин.

предположить, что часть УФ-облученной ГАФД существует в тетрамерной форме.

£ 1,6 Ф

I 1,2

о о

2 0,4

0,0

А

/' ~ 3

/ -У

■ / / / /

" Ч S 1 / / —

V / 1

10

20 30 t, мин

40

0,2 0,4 0,6 0,8 [УФ-ГАФД], мг/мл

0,2 0,4 0,6 0, [УФ-ГАФД], мг/мл

Рис. 13. Кинетика агрегации УФ-облученной ГАФД при различных концентрациях белка при 37 °С. (А) Зависимости интенсивности светорассеяния (/) от времени да я агрегации ГАФД, облученной дозой 40 Дж/см2, при следующих концентрациях фермента: (1) 0,2, (2) 0,4, (3) 0,6, (4) 0,8 и (5) 1 мг/мл. (Б и В) Зависимости параметров и КЧ1 от концентрации УФ-облученной ГАФД (УФ-ГАФД). Сплошная кривая на рис. В проведена в соответствии с уравнением (5) при л = 2,1.

Рассмотрим кинетику агрегации УФ-облученной ГАФД при различных концентрациях белка. На рис. 13 показаны зависимости интенсивности

светорассеяния от времени, полученные для концентраций УФ-облучениой ГАФД в диапазоне от 0,2 до 1,0 мг/мл при 37 °С. 50 Начальные участки этих кривых были проанализированы с помощью уравнения (1). Полученные значения параметров to и Кге& представлены на рис. 13 Б и В как функция от концентрации УФ-облученной ГАФД (УФ-ГАФД). Длительность лаг-периода (параметр t0) уменьшается с увеличением концентрации белка (рис. 13Б). Зависимость параметра Кш (мера начальной скорости агрегации) от концентрации белка (УФ-ГАФД) нелинейна и следует степенному закону: А'а„,, = const х [УФ-ГАФД]". (5)

Параметр и равен 2,1 ± 0,2. По сути, этот параметр представляет собой порядок агрегации по белку. Интересно сравнить полученное значение параметра п с соответствующим значением дня необлученной ГАФД. Зависимость K4i от [ГАФД] линейна вплоть до концентрации 1 мг/мл. Это означает, что порядок агрегации по белку (и) равен единице. Такая ситуация происходит, когда стадия разворачивания молекулы белка идет со значительно более низкой скоростью, чем стадия агрегации молекул

денатурированного белка.

В образцах УФ-облученной ГАФД присутствуют молекулы, предварительно денатурированные УФ излучением, т.е. в данной тест-системе отсутствует стадия

разворачивания белка. Следовательно, можно ожидать, что порядок агрегации по белку больше единицы. Найденное значение п для агрегации УФ-облученной ГАФД действительно близко к 2. Таким образом, тест-системы такого типа можно использовать для исследования влияния различных агентов непосредственно на стадию агрегации.

3.1. Влияние ГПЦД на

Рис. 14. Влияние ГПЦД на агрегацию ГАФД (0,4 мг/мя), облученной дозой 40 Дж/см2. (А) Зависимости интенсивности светорассеяния от времени при следующих концентрациях ГПЦД: (1) 0, (2) 4, (3) 15, (4) 38, (5) 61, (6) 76 и (7) 114 мМ. Температура 37 "С. (Б и В) Зависимости параметров Гц и Кчг от концентрации ГПЦД, соответственно.

грегацню УФ-облученной ГАФД

Мы исследовали влияние ГПЦД на агрегацию УФ-облученной ГАФД при 37 °С в разработанной тест-системе.

Как показано выше, стимуляция тепловой агрегации ГАФД в присутствии ГПЦД вызвана дестабилизацией молекулы белка. Поскольку процесс агрегации УФ-облучешюй ГАФД не содержит стадии разворачивания белка, можно ожидать, что в этой системе проявится защитный эффект ГПЦД. И действительно, ГПЦД подавляет агрегацию УФ-облучешюй ГАФД. Защитный эффект усиливайся с увеличением концентрации ГПЦД (рис. 14А). Начальные участки зависимостей интенсивности

светорассеяния от времени, полученные в присутствии различных концентраций ГПЦД, были проанализированы с помощью уравнения (1). Как видно из рис. 14Б, длительность лаг-периода (параметр /0) линейно возрастает с увеличением концентрации ГПЦД. С увеличением концентрации ГПЦД наблюдается также уменьшение значения параметра Кч„ (рис. 14В). Измерение размера белковых частиц в системе показало, что снижение прироста

интенсивности светорассеяния при добавлении ГПЦД связано с образованием

Показано, что а-кристаллин подавляет агрегацию УФ-облученной ГАФД, и эффективность подавления возрастает при увеличении концентрации а-кристаллина. Определение размера белковых частиц в системе показало, что снижение прироста интенсивности светорассеяния в присутствии а-кристаллина обусловлено образованием агрегатов меньшего размера.

Повышенная способность

УФ-облученных белков к агрегации позволяет создавать на их основе тест-системы для испытания действия различных агентов (например, белковых шаперонов, «искусственных шаперонов», таких как циклодекстрины и др.) на агрегацию белков. В настоящей работе предложена тест-система, основанная на агрегации УФ-облученной ГАФД. При изучении влияния УФ излучения на термостабильность ГАФД было показано, что УФ вызывает образование поврежденных молекул белка с меньшей термостабильностыо.

Главное преимущество тест-систем, основанных на агрегации УФ-облученных белков, заключается в том, что они позволяют исследовать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации. Порядок агрегации УФ-облученной ГАФД по белку близок к 2. Это свидетельствует о том, что скорость-лимитирующей стадией процесса агрегации является стадия агрегации денатурированных молекул. В настоящей работе показано защитное действие ГПЦД и а-кристаллина на агрегацию УФ-облученной ГАФД. Подавление агрегации ГПЦД особенно интересно, поскольку ГПЦД стимулировал агрегацию необлученной ГАФД в связи с дестабилизацией молекулы фермента. В соответствии с общепринятым мнением можно предположить, что подавление агрегации УФ-облученной ГАФД в присутствии ГПЦД вызвано комплексообразованием ГПЦД с гидрофобными боковыми цепями аминокислотных остатков в белках [АасЬтап е1 а1., 2003].

агрегатов меньшего размера (рис. 15).

Рис. 15. Зависимости гидродинамического радиуса (Ль) белковых агрегатов ог времени для агрегации УФ-облученной ГАФД (0,4 мг/мл; 40 Дж/см*) при 37 °С, полученные в отсутствие (о) и в присутствии 61 мМ ГПЦД (•).

выводы

1. На основании изучения кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния получены доказательства того, что механизм тепловой агрегации белка включает стадию образования стартовых агрегатов.

2. Показано, что 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрин подавляет тепловую агрегацию креатинкиназы и не влияет на термостабильность белка.

3. Установлено, что 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрин ускоряет тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика. Этот эффект связан с дестабилизацией белка под действием 2-1 идроксипропил-р-циклодекстрина.

4. Предложена новая тест-система для испытания соединений, обладающих шапероноподобной активностью, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при 37 °С. С использованием этой гест-системы продемонстрировано защитное действие 2-гидроксипропил-р-циклодекстрина непосредственно на стадию агрегации УФ-облученной глицераль дегид- 3 - фосфатдеги дрогеназы.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы" ГК № П1356 и Фонда некоммерческих программ Дмитрия Зимина «Династия».

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Малолеткина О.И.. Маркосян К.А., Асриянц Р.А., Орлов В.Н., Курганов Б.И. Антишаперонная активность производных циклодекстринов. Докл. Академ. Наук, 2009, т. 427, № 4, с. 549-552.

2. Maloletkina O.I.. Markossian К.А., Belousova L.V., Kleimenov S.Y., Orlov V.N., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Thermal stability and aggregation of creatine kinase from rabbit skeletal muscle. Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Biophys. Chem., 2010, v. 148, p.121-130.

3. Maloletkina O.I.. Markossian K.A., Asryants R.A., Semenyuk P.I., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Int. J. Biol. Macromol., 2010, v. 46, p. 487-492.

4. Eronina Т., Borzova V., Maloletkina O., Kleymenov S., Asryants R., Markossian K., Kurganov B. A protein aggregation based test for screening of the agents affecting thermostability of proteins. PLoS One, 2011, v. 6, e22154.

Статьи в сборниках:

1. Maloletkina O.T.. Muranov K.O., Poliansky N.B., Markossian K.A., Kleymenov S.Yu., Asryants R.A., Ostrovsky M.A., Kurganov B.I. Mechanism of aggregation of UV-irradiated proteins. Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и IX съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 2010, с. 98-100.

Материалы конференций:

1. Малолеткина О.И. Влияние 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина на тепловую денатурацию и агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 2008, с. 41.

2. Малолеткина О.И. Агенты, подавляющие агрегацию белков, для биотехнологических целей. Материалы конференции молодых ученых в рамках V Международного Симпозиума «Российско-Европейское сотрудничество в области «Биотехнология, сельское хозяйство и пища» в седьмой рамочной программе ЕС», 2008, с. 21-24.

3. Maloletkina O.I., Markossian К.А. and Kurganov B.I. Effect of 2-hydroxypropyl-p-cyclodextrin on thermostability of proteins. VIII European Symposium of The Protein Society, 2009, Final Program & Book of Abstracts, Abstract no. P 469, P. 61-62.

4. Малолеткииа О.И. Влияние 2-оксипропил-Р-циклодекстрина на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы из скелетных мышц кролика. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», 2009, с. 55-56.

5. Maloletkina О.Т.. Markossian К.А. and Kurganov B.I. Aggregation of UV-irradiated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscles. IX European symposium of The Protein Society, 2011, Abstract no. 1040, P. 29.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАФД — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия КФК — креатинкиназа

УФ-ГАФД — УФ-облученная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа NAD — никотинамидадениндинуклеотид RLCA — reaction limited cluster-cluster aggregation

Подписано в печать 17 февраля 2012 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 102 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малолеткина, Ольга Игоревна, Москва

61 12-3/552

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи

МАЛОЛЕТКИНА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

Влияние 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина на

термостабильность и агрегацию белков

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. К.А. Маркосян

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.......................................................................5

Введение...................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы..............................................................10

1.1. Агрегация белков.....................................................................10

1.2. Циклодекстрины.....................................................................14

1.2.1. Структура и свойства цнклодекстринов.......................................14

1.2.2. Влияние циклодекстринов на стабильность белков...........................16

1.2.3. Влияние цнклодекстринов на четвертичную структуру белков...............18

1.2.4. Влияние цикл о декстринов на агрегацию белков, сопровождающую рефолдинг...........................................................................19

1.2.5. Влияние цнклодекстринов на тепловую агрегацию белков.....................21

1.3. Креатинкиназа из мышц кролика: структура, термостабильность.....................23

1.4. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназаиз скелетных мышц кролика: структура, термостабильность........................................................................26

1.5. а-Кристаллин: структура, свойства и шаперонная активность........................29

Глава 2. Материалы и методы исследования..........................................32

2.1. Материалы...........................................................................32

2.1.1. Креатинкиназа................................................................32

2.1.2. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа......................................32

2.1.3. а-Кристаллин.................................................................32

2.1.4. 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин..........................................32

2.2. Методы исследования................................................................33

2.2.1. рН-метрический метод определения активности креатинкиназы..............33

2.2.2. Термоинактивация креатинкиназы............................................34

2.2.3. Определение ферментативной активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы...............................................................35

2.2.4. Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы..................35

2.2.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)......................36

2.2.6. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД....................................................................37

2.2.7. Динамическое светорассеяние................................................37

2.2.8. Изучение кинетики тепловой агрегации белков методом динамического светорассеяния......................................................................41

2.2.9. УФ-облучение ГАФД.........................................................41

2.2.10. Электрофоретический анализ белков в ПААГ................................42

2.2.11. Определение доли агрегированного белка....................................42

2.2.12. Аналитическое ультрацентрифугирование...................................42

2.2.13. Исследование собственной триптофановой флуоресценции белков..........43

Глава 3. Результаты и их обсуждение...................................................44

3.1. Влияние 2-гидроксипропил-р-циклодекстрина (ГПЦД) на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы из скелетных мышц кролика..................44

3.1.1. Влияние ГПЦД на тепловую инактивацию креатинкиназы....................44

3.1.2. Влияние ГПЦД на тепловую денатурацию креатинкиназы....................45

3.1.3. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию креатинкиназы.......................49

3.1.4. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (30 мМ Нерев-КаОН, ОД М ШС1, рН 8,0; 48 °С)..................51

3.1.5. Регистрация ассоциатов ГПЦД методом динамического светорассеяния......52

3.1.6. Изучение агрегации креатинкиназы при 48 °С методом динамического светорассеяния......................................................................53

3.1.7. Влияние а-кристалдина на тепловую агрегацию креатинкиназы...............61

3.1.7.1. Изучение кинетики агрегации креатинкиназы при различных концентрациях а-кристаллина................................................61

3.1.7.2. Изучение кинетики агрегации при различных концентрациях креатинкиназы.................................................................65

3.1.8. Изучение агрегации креатинкиназы методом динамического светорассеяния в режиме сканирования по температурам................................. ............67

3.2. Влияние 2-гидроксипропил-р-цикло декстрина (ГПЦД) на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика............................................................................76

3.2.1. Влияние ГПЦД на кинетику термоинактивации ГАФД.......................76

3.2.2. Влияние ГПЦД на тепловую денатурацию ГАФД.............................77

3.2.3. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (10 мМ Иа-фосфатный буфер, 0,1 М №С1, рН 7,5; 45 °С).........77

3.2.4. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД................................78

3.3. Агрегация УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика............................................................................84

3.3.1. Влияние УФ-облучения на ферментативную активность и термостабильность ГАФД...............................................................................84

3.3.2. Анализ спектров триптофановой флуоресценции УФ-облученной ГАФД......87

3.3.3. Электрофоретический анализ УФ-облученной ГАФД.........................88

3.3.4. Седиментациоиный анализ УФ-облученной ГАФД...........................89

3.3.5. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (50 мМ Ка-фосфатный буфер, рН 7,5; 37 °С)......................90

3.3.6. Кинетика агрегации УФ-облученной ГАФД...................................90

3.3.7. Подавление агрегации УФ-облученной ГАФД а-кристаллином и ГПЦД......96

Заключение.............................................................................102

Выводы.................................................................................104

Список литературы.....................................................................105

DLCA DTT GuHCl Hepes

NAD4"

NADH

Pipes

RLCA

sHsp

ГАФД

ГПЦД

ДСК

ДСН

КрФ

КФК

ПААГ

Трис

УФ

ФЭУ

цд

ЭДТА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

diffusion-limited cluster-cluster aggregation

дитиотреитол

гуанидингидрохлорид

N-(2-i идроксиэтил) пиперазин -Ы'-(2-этапосульфоновая кислота)

нико тинамид ад ен и иди ну кл со гид окисленный

никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

пиперазин-1ч[,№-бис(2-этаносульфоновая кислота)

reaction-limited cluster-cluster aggregation

small heat shock protein

глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

2-i идроксипропил-Р-циклодсксгрин

дифференциальная сканирующая калориметрия

додецилсульфат натрия

креатинфосфат

креатинкиназа

полиакриламидный гель

трис-(шдроксиметил)-метиламин

ультрафиолетовое излучение

фотоэлектронный умножитель

циклодекстрины

этилендиаминтетраацетат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Неблагоприятные условия в клетках (тепловой, осмотический и окислительный стрессы, облучение ультрафиолетом, локальное изменение рН) могуг приводить к разворачиванию и агрегации белков. Работы по изучению агрегации белков и механизмов, предотвращающих агрегацию, наряду с важностью фундаментальных знаний, имеют существенное практическое значение для медицины и биотехнологии. Такие заболевания, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона [Carrell and Lomas, 1997], болезнь Хантингтона [Busch et al., 2003], болезнь Мачадо-Джозефа (спинально-мозжечковая атаксия) [Goti et al., 2004], прионные энцефалопатии [Prusiner and Hsiao, 1994; Mishra et al., 2003], боковой амиотрофический склероз (болезнь Шарко) [Johnston et al., 2000; Julien, 2001], системный амилоидоз [Perutz, 1997], фиброзно-кистозная дегенерация [Johnston et al., 1998] и катаракта [Bloemendal et al., 2004], являются частью большого ряда наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни» [Carrell and Lomas, 1997] и возникающих в тех случаях, когда те или иные белки подвергаются структурной перестройке, способствующей их агрегации. Характерным признаком этих заболеваний является изменение конформации белков, приводящее к образованию белковых агрегатов с различной надмолекулярной организацией [Merlini et al., 2001]. Образование белковых агрегатов в клетках протекает по различным молекулярным механизмам и понимание этих процессов на молекулярном уровне открывает перспективы для исследования и лечения «конформационных болезней».

Агрегация белков может происходить на каждом из этапов процесса биофармацевтического производства, и к образованию агрегатов в какой-то степени склонны все белки и полипептиды [Roberts, 2007]. Наличие агрегатов при инъекции лекарственных препаратов белков даже в малом количестве может вызвать иммунный ответ, что не только может снизить эффективность лекарства, но и привести к возникновению побочных эффектов [Frokjaer and Otzen, 2005; Wang, 2005; Manning et al., 2010; Cromwell et al., 2006; Rosenberg, 2006]. Белки, эксирессируемые в Escherichia coli, обычно агрегируют сразу же после синтеза. Удается получить активный правильно свернутый белок с помощью солюбилизации и рефолдинга, но с невысоким выходом. При производстве рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, клеточные системы позволяют получать растворимые формы белков. Однако успешный синтез в биореакторе еще не гарантирует получение окончательного растворимого лекарственного препарата. Нежелательная агрегация часто сопровождает процесс очистки. Белковый продукт, прошедший стадию очистки, должен быть переведен в лекарственную форму для

продолжительного храпения стабильного лекарства до момента применения. Известно, что присутствие низкомолекулярных веществ (например, Сахаров, многоатомных спиртов, солей, аминокислот и т.д.) оказывает значительное влияние на стабильность белка в растворе [Chi et al., 2003; Davis-Searles et al., 2001; Timasheff, 1993; Wang, 1999]. В связи с этим добавки, подавляющие агрегацию (также называемые вспомогательными веществами), часто используются во время производства, очистки и приготовления лекарственной формы и до сих пор являются наиболее эффективным способом борьбы с проблемой агрегации [Cleland et al., 1993; Manning et al., 2010; Wang, 1999]. Поскольку в продажу поступает все большее количество белковых препаратов, промышленность нуждается в новых антиагрегационных агентах для разработки технологии производства, позволяющей получать стабильные, правильно свернутые активные продукты.

Для подавления агрегации белков часто используют циклодекс грины (ЦД) и их производные [Hamada et al., 2001; Otzen et al., 2002; Nomura et al., 2005]. Способность ЦД подавлять агрегацию белков объясняется их способностью связываться с остатками гидрофобных аминокислот в ненативных (частично развернутых) формах белков, что приводит к подавлению процесса агрегации. Однако имеются данные, демонстрирующие стимуляцию агрегации белков в присутствии ЦД. Действие ЦД и их производных испытывают в различных тест-системах, каждая из которых имеет свои ограничения. В тест-системах, основанных на рефолдинге белков, ренатурация идет через стадию образования интермедиатов, склонных к агрегации. Исследуемый агент может оказывать влияние на стадию образования интермедиата из денатурированного белка. Возможно наложение эффектов агента на эту стадию и на стадию агрегации интермедиата. Таким образом, не представляется возможным использовать модель рефолдинга для изучения агентов на стадию агрегации. В качестве тест-систем, пригодных для испытания эффективности подавления агрегации белков ЦД и их производными, применяются также системы, основанные на тепловой агрегации белков. В таких тест-системах также возможно влияние агентов на стадию денатурации нативного белка, и исследование чистого эффекта на стадию агрегации невозможно без предварительной проверки термостабильности белка в присутствии агента.

Целью настоящей работы является изучение механизмов разнонаправленного (подавляющего и ускоряющего) действия ЦД (на примере 2-гидроксипропил-Р-ЦД (ГПЦД)) на процесс агрегации белков и разработка тест-системы, позволяющей оценивать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

С помощью методов динамического светорассеяния, дифференциальной сканирующей калориметрии, измерения ферментативной активности, а также аналитического ультрацентрифугирования и ДСН-электрофореза

1. Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика.

2. Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.

3. Исследовать агрегацию УФ-облученной глицеральдешд-3-фосфатдегидрогеназы.

4. Изучить влияние ГПЦД на кинетику агрегации УФ-облучеиной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Научная новизна. При изучении кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния установлено, что механизм тепловой агрегации креатинкиназы включает стадию образования стартовых агрегатов. Показано, что тепловая агрегация креатинкиназы протекает в реакционно-контролируемом режиме.

На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации креатинкиназы в присутствии ГПЦД сделан вывод о том, что ГПЦД не влияет на термостабилъность белка. Методом динамического светорассеяния показано подавляющее действие ГПЦД на тепловую агрегацию креатинкиназы.

Показано, что стимуляция агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика в присутствии ГПЦД вызвана дестабилизацией белка под действием ГПЦД. Ускорение денатурации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в присутствии ГПЦД «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦД на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации.

Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Показано, что в результате УФ-облучения в растворе присутствуют развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 °С). С помощью такой тест-системы показано защитное действие ГПЦД на агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Практическое значение. Новая тест-система, основанная на агрегации УФ-облученного белка, может быть использована для поиска антиагрегационных агентов и оценки их

шапероноподобной активности. Результаты исследований механизма действия ГПЦД на агрегацию белков могут быть учтены при решении биотехнологических задач и создании белковых препаратов медицинского назначения. Понимание механизмов агрегации белков и механизмов, предотвращающих агрегацию, на молекулярном уровне открывает перспективы для исследования и лечения большого ряда наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Агрегация белков

Нативные, функционально активные белки образуются путем фолдинга из новосинтезированных полипептидных цепей, в результате чего информация, содержащаяся в линейных полимерах аминокислот, переходит в трехмерную структуру [Anfinsen, 1973]. Сворачивание белка представляет собой быструю последовательность конформационных изменений, направленных на образование нативной структуры белка, движущей силой которой является увеличение термодинамической стабильности свернутого белка [Anfinsen, 1973; Rossman and Argos, 1981]. Фолдинг больших глобулярных белков включает образование ряда частично свернутых форм (интермедиатов), часть гидрофобного ядра которых экспонирована во внешнюю среду. Процесс сворачивания интермедиатов в нативную структуру обратим. Если белки остаются в частично свернутом состоянии длительное время, то гидрофобные взаимодействия между несколькими интермедиатами могут привести к агрегации белка.

Индуцировать агрегацию белков в клетках могут различные воздействия, и, прежде всего, тепловой и окислительный стрессы. Ультрафиолетовое излучение (УФ) вызывает серьезные повреждения белков. Основными акцепторами УФ в белках являются остатки ароматических аминокислот (Tip. Туг и Phe), а также Cys and His [Lakowicz, 2006]. Высокая концентрация макромолекул в клетке (макромолекулярный краудинг, macromolecular crowding), 300-400 мг/мл (цитозоль Escherichia coli), 80-400 мг/мл (цитозоль эукариотических клеток), также способствует агрегации ненативных полипептидных цепей в основном в результате увеличения их фактической концентрации. In vitro нативные белки разворачиваются под действием высоких температур, pH, высокого давления, а также при добавлении органических растворителей или других денатурирующих агентов, таких как гуанидши идрохлорид или мочевина. Эти воздействия разрушают нековалеитные взаимодействия в белковой молекуле, стабилизирующие нативную конформацию. Частично или полностью развернутые белки могут взаимодействовать между собой, в основном посредством контактов гидрофобных поверхностей, с образованием аморфных или амилоидных агрегатов [Fink, 1998; Hur ti су and Helenius, 1989; Dobson, 1999; Wood et al., 2003]. Образующиеся структурированные или аморфные агрегаты [Kopito, 2000; Марко