Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Современная микрокалориметрия в изучении биохимических реакций

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Современная микрокалориметрия в изучении биохимических реакций"

Институт биомедицинской химии Российской академии медицинских наук

1 и;ол ш?

На правах рукописи УДК 577.15: 577.17

РЕХАРСКИЙ Михаил Владимирович

СОВРЕМЕННАЯ МИКРОКАЛОРИМЕТРИЯ В ИЗУЧЕНИИ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ.

Специальность: биохимия - 03.00.01

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в лаборатории аналитической биотехнологии Института биомедицшккой химии РЛМН.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН

доктор химических наук профессор Мироппшков А. И.

доктор биологических наук

профессор

Карякин А. В.

доктор биологических наук Гнучев Н. В.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится 26 июня 1997г. в 10 часов на заседании Диссертацношюго совета Д.001.10.01 при Институте биомедицннской хншш РАМН по адресу: 119832, Москва, Погодинская ул., 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан 24 мая 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

В. С. Былинкина

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость проблемы. Микрокалориметрия является одним из мощных физико-химических методов, широко применяемым для решения различных биохимических проблем. Это единственный прямой метод определения тепловых эффектов биохимических реакций. Внедрение в биохимические исследования нового высокочувствительного микроаалориметрического оборудования, способного работать в титрациотгом, проточном, ампульном и других экспериментальных режимах определяет актуальность разработки методических аспектов применения современной микрокалориметрии в биохимии.

Все биохимические реакции могут быть разделены с точки зрения использования микрокалориметрии на два класса. Первый класс - это реакции, которые в условиях эксперимента могут быть доведены практически до полного завершеши т.е. константа равновесия изучаемой реакции такова что допускает практически полное превращение исходггых веществ в продукты реакции. Под словами "практически полное превращение" мы в данном случае понимаем то, что точность микрокалориметрического метода недостаточна для подтверждения неполноты протекания реакции (например, если погрешность микрокалориметрического метода 1%, мы не можем достоверно сказать составляет ли глубина конверсии 99% или 99,9%). При микрокалориметрическом изучении первого класса реакций на основании результатов эксперимента может быть получен только один термодинамический параметр - энтальпия.

Ко втором классу реакций обычно относят процессы, которые в условиях эксперимента не могут быть доведены до полного завершения по термодинамическим причинам, т.е. это заведомо обратимые реакции. Если в первом случае (первый класс) один единственный эксперимент дает представление об энтальпии процесса, то во втором - только совокупность экспериментальных точек, полученная методом микрокалориметрического титрования позволяет рассчитать термодинамические параметры исследуемого процесса. Во втором случае мы сталкиваемся с необходимостью специальной математической обработки результатов и выбором модели, которая должна адекватно описывать рассматриваемый процесс.

Следует отметить, что указанное выше деление реакций на два класса весьма условно и всегда относится к данным конкретным условиям проведения

г.

эксперимента. При других физико-хнмитсских условиях, "необратимая" реакция может стать "обратимой" и наоборот.

Методологические аспекты использовашет мнкрокалор1шетрик для изучения необратимых реакций рассмотрены нами на примере различных типов энзимологических реакций. При исследовании многих энзимологических процессов представляется возможным подобрать физико-химические условия при которых степень конверсии исходных субстратов в конечные продукты будет превышать 99%. Поскольку, как уже отмечено выше, точность в определении энтальпии реакции после введения всех необходимых поправок редко превышает 1%, реакции, имеющие степень конверсии более 99%; можно рассматривать как необратимые.

Исследование различных типов энзимологических реакций позволило нам не только разработать методологические аспекты микрокалориметрического эксперимента в случае необратимых биохимических реакций, но и определить ряд ключевых термодинамических величин (например энтальпию реакции окисления-восстановления НАД), с помощью которых молено рассчитывать значения термодинамических параметров неизученных реакций на основе литературных данных.

Методологические аспекты использования микрокалориметрии прк исследовании обратимых реакций рассмотрены нами на примере реакций связывани* органических лигандов с водорастворимыми макроциклическими молекулами. Е качестве макроциклов, связывающихся преимущественно с алифатическим* фрагментами органических молекул, нами выбраны а- ,р- и у-циклодекстрины состоящих из 6, 7 и 8 глюкозидных остатков соответственно, (рис. 1). В качеств« макроциклов, образующих прочные связи преимущественно с ароматическим кольцами, входящими в состав молекул лнгандов, нами исследовань водорастворимый порфирин (рис. 2) и водорастворимый макроцикл, способный \ шггеркалированизо (рис. 3).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлас разработка методологии применения современной микрокалориметрии в изученл обратимых и необратимых биохимических реакций, а также экспериментально определение ключевых термодинамических величин и выявление взаимосвязи межд термодинамическими величинами и структурой веществ, участвующих в различны типах биохимических процессов.

Рис. 3. Структурная формула макроцикла способного к интеркалнрованию.

ч.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: разработать методологические аспекты применения со времензюй микрокалориметрии в биохимии при изучении необратимых реакций;

разработать принципы построения системы термодинамических параметров ферментативных реакций в соответствии со схемой класификации и номенклатуры ферментов Международного биохимического союза (МБС);

экспериментально определить ключевые термодинамические величины для ферментативных реакций с участием кофакторов (например, НАД) и средние термодинамические параметры для ферментативных реакций, протекающих без участия кофакторов (например, для гидролитических реакций);

разработать методологические аспекты применения современной микрокалориметрки в биохимии при изучении обратимых реакций;

экспериментально определить термодинамические параметры реакций комллексообразования различных по своей структуре органических лигандов с а- , р-и у-вдклодскстришши, связывающихся преимущественно с алифатическими фрагментами органических молекул, а также макроцшелов, образующих прочные связи преимущественно с ароматическими кольцами, входящими в состав молекул лигандов,.

Научная новизна. Основными результатами диссертационной работы

явились:

1. Создание системы термодинамических параметров ферментативных реакций и экспериментальное определение ключевых термодинамических величин для ферментативных реакций с участием кофакторов (специально следует отметить выполненное налог определение энтальпии реакции окисления-восстановления НАД) и средних термодинамических величин для ферментативных реакций, протекающих без участия кофакторов (нами были определены средние энтальпии реакций гидролиза амидных, пептидных, глюкозидных и других связей в различных биохимических соединениях; предложенная нами система средних термодинамических величин практически охватывает все процессы гидролиза, такю компонентов живой материи как белки, нуклеиновые кислоты, жиры \ полисахариды). Многие термодинамические параметры определены нами впервые

2. Впервые были определены термодинамические параметры комплексообразования водорастворимого порфнрина (см. рис. 2) и водорастворимого макроцикла, способного к шггеркадкрояанию (см. рис. 3), с широким кругом ароматических органических лигаадов. Значительно расширен круг органических лигацдов, исследованных микрокалориметрическим методом, при протекании их реакций с цихлодекстринами. Выполненные нами систематические термодинамические исследования охватывают следующие классы органических молекул-лигавдов: а) производные циклогексанола и другие алифатические циклические спирты, б) алифатические первичные и вторичные спирты, а также алифатические кислоты и амины, в) различные производные фенэтиламина, эфедрина и некоторые другие структурно сходные ароматические соединения, содержащие бензольное кольцо, г) ароматические соединения, содержащие пуриновые, пиримидиновые и имидазольные кольца и д) стереоизомеры различных органических соединений.

Теоретическая и практическая значимость работы. Систематический подход к выбору объектов исследования позволил нам выявить ряд закономерностей, характеризующих связь между термодинамическими параметрами реакции комплексообразования, с одной стороны, и особенностями структуры молекул-лигандов, с другой. На основе выявленных закономерностей представляется возможным с высокой надежностью оценивать термодинамические параметры связывания конкретного макроцикла с неисследованными лигандами, используя имеющейся экспериментальный материал.

Температурные зависимости термодинамических параметров реакций связывания гомологически близких лкгандов с циклодекстринами предоставили нам возможность оценить влияние вкладов различных фрагментов данной молекулы лиганда в суммарные термодинамические параметры и рассмотреть некоторые аналогии между термодинамикой реакций с участием макроциклов и биополимеров.

Отметим также, что полученный нами экспериментальный: материал был использован для построения графиков энталътшно-э1ггронийной компенеащш (как в случае ферментативных реакций, так и для реакций комплексообразования).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на семи международных конференциях по калориметрии и химической термодинамике в Роннебай (Швеция, 1976), Мерзебурге (Германия, 1980), Праге (Чехия, 1982), Санта-Фе (США, 1993), Гейверсбурге (США, 1994), Чикаго (США, 1995), Бефесде (США, 1996), а также на многих всесоюзных конференциях.

Публшсации. По материалам диссертации опубликовано 40 статей и одна монография.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи основных глав, в которых излагается наш: собственный экспериментальный материал, проводится его обсуждение и сравнение с литературными данными, и выводов. Работа наложена на 230 страницах текста и содержит, кроме того, 87 рисунков, а также 49 таблиц. Списки литературы приведены отдельно в каждой из семи глав.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В экспериментах использовали следующее микрокалориметричесш оборудование: микрокалориметрическая система LKB-2107, включающая в себ ампульный, проточный и сорбционный микрокалориметричесие блок; микрокалориметрическая система Монитор Биоактивности LKB-2277, включающая свой состав амцульный, проточный и титращюнный микрокалориметричесие блои титрациошшгй микрокалориметр ITC MicroCal.

Растворы исследуемых веществ приготовлялись гравиметрически использованием калиброванных электроных весов фирма "Ohio''. Плотности все использованных растворов контролировались на приборе Anton-Parr DMA-48.

ЯМР спектры были измерены при Т = 298,15 К с помощью 600 MI Bruker АМ-600 ЯМР-спектрометра в буферных растворах {D3PO4 (0,05 моль л"1) NaOD) тяжелой воды (D2O) при pD = 7,0. В качестве эталонного сигнала бь выбран сигнал протона в молекуле DOH при 4,75 ррт.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Система ключевых термодинамических величии и средних термодинамических величин для различных классов ферментативных реакций.

Система термодинамических параметров ферментативных реакций построена нами в соответствии со схемой кллсификдцми и номенклатуры ферментов Международного биохимического союза (МБС), согласно которой все ферменты делятся на шесть больших классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лкгазы (сиктетазы). Рассмотрим основные принципы построения системы термодинамических параметров ферментативных реакций отдельно для каждого класса ферментов.

Оксидоредуктазы. Основной принцип построения системы термодинамических параметров реакций, катализируемых оксидоредуктазами, - это определение ключевых термодинамических величин.

В качестве ключевых термодинамических величин для реакций, катализируемых оксидоредуктазами, целесообразно выбрать значения ЛНг и /Юг реакции окисления-восстановления НАД:

НАД+ + Н2 = НАД-Н + Н+ (1)

Такой выбор обусловлен двумя основными причинами: 1) кофактор НАД принимает участие в широком круге различных окислительно-восстановительных реакций, и поэтому для расчета термодинамических параметров всех этих реакций необходимы величины ЛИ а) и ЛО(]) ; 2) величины ЛПа) и ЛС^-,) определялись в различных лабораториях мира с помощью различных экспериментальных методов и известны в настоящее время достаточно надежно.

Обладая значениями ЛН(^) и ¿Ю^ , мы в состоянии рассчитывать термодинамические параметры различных окислительно-восстановительных НАД-зависимых реакций, используя как энтальпии и свободные энергии образования компонентов реакций в соответствующих состояниях, так и термодинамические параметры соответствующих реакций, протекающих без участия НАД. Рассмотрим в качестве примера следующее обобщенное уравнение:

НАД+ + АЫ2 = НАД-Н + А + Н+

(2)

где А и АН^ - соответственно окисленная и восстановленная формы некоторогс химического соединения.

Термодинамические параметры реакции (2) могут быть выражены нг основе величин А71(и и следующим образом:

а) как алгебраическая сумма термодинамических параметров реакции (1) I термодинамических параметров образования веществ А и А1Ь в состоянии раствора:

где АН{ (А) и й&! (А) - термодинамические параметры образования окислсшю формы химического Бещестда А; АН( (АН2) и АСт[ (АН¡) - термодинамически параметры образовашш восстановленной формы химического вещества А;

б) по закону Гесса как сумма термодинамических параметров реакции (1) реакции окисления-восстановления вещества А без кофактора НАД (АН2 = А + Н2Х В качестве вторичных ключевых термодинамических величин , т.< величин, к надежности которых предъявляются повышенные требования, но которь все же могут быть определены не столь тщательно, как термодинамически параметры реакции окисления-восстановления НАД, целесообразно рекомендовав АНГ и Ж?г реакций взаимодействия НАД с другими кофакторами, например

и АСГ любой НАД-зависимой реакции для реакции с участием требуемого кофактор Например, суммируя значения термодинамических параметров реакции (2) и реакщ

ЛН(2) = АН(1) + АН((А) - АН{(АН2) ЛС(2) = ЛС,(1) + ¿1С/ (А) - АО( (А Н2) ,

(3)

(4)

НАДФ.

Имея такие термодинамические величины, можно произвести пересчет А1

(5):

НАДФ+ +■ НАД-Н = НАДФ-Н +■ НАД

(5)

мы получаем АНТ и АО, для реакции окисления вещества АН2 при участии 1 фактора НАДФ.

Трапсферазы. В реакциях, катализируемых ферментами трансферазами, принимают участие несколько различных кофакторов, (например, кофакторы АТФ, КоА и УДФ участвуют в переносе фосфатных, ацетильных и глшсоэильных групп, соответственно). Поэтому, так же как и в случае оксидоредуктаз, при построении системы термодинамических параметров для реакций, катализируемых трансферазами, нашг использован принцип ключевых термодинамических величин.

В качестве ключевых величин выбраны термодинамические параметры реакции гидролиза АТФ, КоА и других кофакторов. Такой выбор обусловлен следующими обстоятельствами.

Во первых, зная ЛНг к AGr реакций гидролиза кофакторов, легко рассчзгтать термодинамические параметры реакций катализируемых трансферазами. Например, располагая величинам! ЛИг и AGT реакций гидролиза АТФ и глюкозо-б-фосфг.та, можно рассчитать на основании закона Гесса термодинамические параметры реакции переноса фосфатной группы с АТФ на глюкозу.

Во вторых, реакции гидролиза рассматриваемых кофакторов протекают с большими отрицательными изменениями свободной энергии и доходят практически до конца, что облегчает надежное экспериментальное определение энтальпий этих реакций.

Вторичные ключевые термодинамические величины целесообразно выбрать отдельно для каждого подкласса реакций, катализируемых ферментами трансферазами. Например, для реакций в которых осуществляется перенос фосфатной группы, вторичными ключевыми термодинамическими величинами выбраны АНГ и AGr реакций переноса фосфатной группы с АТФ на УДФ, ЦДФ и другие с образованием АДФ и соответствующего трифосфатнуклеотида.

Следует отметить, что кофакторы АТФ, АДФ и многие другие, участвующие в трансферазных ферментативных реакциях, функционируют обычно в виде комплексов с ионами Mg+2 или Са+2 . Свободные энергии и энтальпии реакций комплексообразования приведет! в ряде справочников.

Гидролазы. Гидролитические ферментативные реакции протекают без участия кофакторов. Отсутствие кофакторов не позволяет применить в этом случае принцип расчета, основанный на ключевых термодинамических величиных и использованный нами для ферментативных реакций, катализируемых окендоредуктазами и трансферазами.

ю.

Расчет термодинамических параметров гидролитических ферментативных реакций может быть облегчен, если использовать средние величины термодинамических параметров (ЛЯГ (aver.) и 4Gr (averj ) для реакций гидролиза соединений с одинаковым типом гидролизуемой связи, например сложные эфиры, пептиды и др.

Следует отметить, что при наличии большого экспериментального материала могут быть найдены не только средние величины энтальпий и свободных энергий реакций гидролиза для всего класса соединений (например, реакций гидролиза пептидной связи), но и AHr (aver.) и 4Gr (at>er.) Для более ограниченного круга соединений; соединений, которые характеризуются не только наличием пептидной связи, но и какой-либо другой сходной деталью химической структуры. Эти последние термодинамические величины будут, естественно, меньше отличаться от термодинамических параметров каждой индивидуальной реакции, чем AHr.(aver.) и AGr (¡¡our.) Для всего класса реакций.

Лназы. При расчете термодинамических параметров реакций, катализируемых лиазами и протекающих без участия кофакторов, следует, на наш взгляд, использовать подход, предложенный для гидролитических ферментативных реакций (т.е. создание, системы средних термодинамических величин). Исключение составляет подкласс лиаз, катализирующих превращение оксокислот, в этих реакциях пршпшает участие кофактор Ко А, Поэтому в данном случае, так же как я для ацетилтрансфераз (см. выше), целесообразно использовать величины ДНГ и AG, реакции гидролиза ацетил-КоА в качестве ключевых термодинамических величин.

Изамеразы. В реакциях, катализируемых изомеразами, таге же как и i гидролитических ферментативных реакциях, не принимают участие кофакторы Реакции рацемизации аминокислот и превращешет типа L-лактата в D-лактат, L ацетоина в .D-ацегоноин и им аналогичные имеют энтальпию рав1!ую нулю s изменение свободной энергии этих процессов определяется только энтропийны» фактором. Для расчета термодинамических параметров других катализируемы: изомеразами реакций (с энтальпией отличной от нуля) следует использовать подход предложенный нами для гидролитических ферментативных реакций.

Лигазы (сиитетазы). Источником свободной энергии для реакций катализируемых лигазами, служит процесс гидролиза АТФ или другой аналогичного трифосфата, сопряженный с основной реакцией синтеза. Участи*

кофактора ЛТФ и других аналогичных трнфосфатов определяет выбор ключевых термодинамических величин. Основными ключевыми термодинамическими величинами выбраны АНГ и реакции гидролиза АТФ. Вторичными ключевыми величинами - термодинамические параметры реакций переноса фосфатной группы с молекулы ЛТФ на такие кофакторы, как ГДФ, УДФ и другие с образованием АДФ и соответствующего трифосфатпуклеотида.

2. Взаимосвязь структуры органических лигандов и термодинамических параметров их взаимодействия с циклодекстринами.

Процесс взаимодействия лиганд-циклодекстрин включает в себя как составные части перегрупперовку молекул воды, находящихся в непосредственной близости от молекул макроцикла и лиганда, а также установление межмолекулярных взаимодействий (так например, ван-дер-Вальсовых контактов или водородных связей). Суммарный результат протекания этих перегруперовок растворетеля и образовать новых связей циклодекстрш-лигаид выражается в величинах термодинамических параметров рассматриваемых реакций комплексообразования.

Аналогичные микропроцессы протекают, естественно, при образовании комплексов с участием двух других исследованных нами макроциклов, может быть, за исключением микропроцесса вытеснения молекул воды из имеющейся только у циклодекстринов внутренней полости.

Величины термодинамических параметров реакций комплексообразованкя могут быть подвержены влиянию не только рН, но и природы используемого буферного раствора. Значение рН раствора определяет ионные формы реагирующих веществ и таким образом при изменении рН могут резко изменятся термодинамические параметры комшгексообразования.

Природа используемого буферного раствора влияет на термодинамические параметры в том случае, если некоторые компоненты буферного раствора участвуют в процессе комплексообразования. Так например, нами показано, что нейтральные молекулы уксусной кислоты образуют комплексы с а- и р-циклодекстринами и тем саным участвуют в реакциях лиганд-циклодекстрин. Поэтому для проведения экспериментов с участием циклодекстринов, всегда, где это возможно, нами использовался фосфатный буферный раствор {(КаН^РО^ 0.025 моль кг!) +

(Ма^ЯРО.), 0.025 моль кг"1), рН = 6.9} для которого было показано, что ни один компонент его не реагирует с циклодекстринами.

Выполненные нами эксперименты позволяют утверждать, что наименее полярная часть молекулы лиганда втягивается в процессе комплексообразования в внутрь полости, тогда как заряженная группа молекулы лигаида и после завершения процесса связывания макроцикл-лиганд продолжает оставаться экспонированной в массу растворителя.

Монотонность изменения термодинамических параметров (Д,0°, ¿^11° и Д^") как фунцпй Мс (число атомов углерода в молекуле органического лиганда) и схожесть вида функций для различных классов соединений позволяют достаточно достоверно проводить экстраполяцию и интерполяцию термодинамических параметров реакций комплексообразования с участием неисследованных лигандов па основе уже имеющегося экспериментального материала.

Величина д&1С°/дУ1с для реакций комплексообразования с участием циклодекстршгов приблизительно равная —3 кДж моль-1 общепринята в настоящее время как наиболее характерная для переноса СН^-группы, находящейся в алифатических углеводородных цепях из воды в шщеллярное окружение или из воды в жидкую углеводородную фазу. Более экзотермическое среднее значение ЗДгН'УбМс для реакций с участием а- циклодекстрина по сравнению с р-циклодекстрином: может служить свидетельством большей роли Ван-дер-Вальсовых взаимодействий в реакциях а- циклодекстрина, чем р-щжлодскстрида.

Подчеркнем, что величина ЗДгО°/<ЭМс приблизительно равная ~ -3 - 4 кДж моль"1 найдет нами не только для гомологических рядов алифатических соединений, но для некоторых пар ароматических соединений, различающихся б своем строении на одну СЫг-группу. В качестве такой пары мояшо привести 3-фенил-1-пропиламин и фенэтиламин (см. табл. 1)

Из геометрических размеров а- и р-цкклодекстринов можно заключить, что внутрь их полостей помещается только 5-6 метилных групп. Однако как мь: показали на примере зависимостей термодинамических параметров реакцгп комплексообразования циклодекстринов с алифатическими соединениями ка! функций числа атомов углерода в молекулах лигандов монотонный вид функцт сохраняется далеко за пределами размеров лигандов,которые могли бы гюлностьв поместится внутрь полости а- или р-циклодекстрина.

Таблица 1

Термодинамические величины К, ДГН°, ДГС, Дг3° дли реакций комплексообразования р-циклодекстрина с различными производными фенэтиламина, фенилэфрина, некоторыми другими структурно схожими ароматическими соединениями, содержащими бензольное кольцо, а также циклическими алифатическими спиртами.

т ДТГ ДгО° Дг5"

Лиганд рН N К

мода кг-1 кДж моль"1 кДж моль"1 Дж К'1 моль"1

1. Производные фенэтиламина и фенилэфрина

фенэтпдамин+ 0,200 6,9а 2 24,4±1,6 -6,4±0,3 -7,92+0,17 5,1±1,2

фенэтиламин+ 0,224 5,0Ь 2 20,0+1,9 -6,9+0,5 -7,43±0,25 2±2

М-метилфенэтиламин+ 0,153 6,9а 2 28,5±2,7 -6,33±0,47 -8,30±0,25 6,6±1,8

М-метилфенэтиламин4" 0,235 5,0Ъ 2 21,4*1,2 -7,3+0,3 -7,59±0,14 1,0±1,1

2-(4-аминофенил)этиламин+ 0,211 6,9а 2 31,3±2,0 -8,72±0,38 -8,54+0,16 -0,б±1,4

4-метидфенэтиламин+ 0,138 6,9а 2 88,3+3,1 -6,84+0,14 -11,11±0,09 14,3+0,6

4-метилфенэтиламин+ 0,186 5,0Ь 2 74,9±2,8 -7,23±0,14 -10,70+0,10 11,6±0,6

4-метоксифенэтшшшн+ 0,148 6,9а 1 92,8+1,3 -8,08±0,08 -11,23±0,04 10,6+0,3

4-метоксифекэтиламин+ 0,220 5,0Ь 2 77,3±1,5 -8,21+0,08 -10,78±0,05 8,6±0,3

3-метоксифенэтиламнн+ 0,199 6,9Ь 2 76,2+1,1 -11,7+0,1 -10,74±0,04 -3,2+0,4

3-метоксифенэтиламин+ 0,222 5,0Ь 2 66,1+0,85 -13,32+0,13 -10,39±0,04 -9,8±0,5

2-метоксифенэтиламин+ 0,221 6,9а 1 е

2-метоксифенэтиламин+ 0,236 5,0Ь 2 8,0±1,0 -13,5±1,6 -5,15±0,33 -28+6

2, 5-дкметоксифенэтиламнн+ 0,190 6,9а 2 38,9+1,0 -9,39±0,17 -9,08±0,07 -1,0+0,6

2,5-диметоксифенэтиламин+ 0,212 5,0Ь 2 36,8±1,0 -10,2±0,2 -8,94±0,07 -4,2±0,7

3,4-диметоксифенэтиламин+ 0,191 6,9а 2 13,9±6,1 -2,0+0,7 -6,52+1,4 15+5

3,4-диметоксифенэтиламин+ 0,202 5,0Ь 2

(±)-октапомин+ 0,196 6,9* 2 52,7+0,7 -13,68+0,14 -9,83+0,03 -12,9±0,5

(± ) -октапомит [+ 0,213 5,0Ь 2 44,3+0,6 -15,86±0,17 -9,40+0,04 -21,7+0,6

3-гидрокситирамин+ 0,193 6,9« 2 31,8±0,5 -16,52+0,17 -8,58+0,04 -26,6±0,6

3-гидрокситнрамин+ 0,202 5,0Ь 3 30,3+0,4 -18,3±0,2 -8,46+0,03 -33,0+0,7

3-0-метилдопамин+ 0,191 6,9а 2 10,7±3,8 -5,7+1,8 -5,88+1,1 1+7

3-0-метилдоггамик+ 0,217 5,0Ь 2 4,3+1,8 -13,4+5,5 -3,62±1,3 -33+19

4-0-метитгдопам1ш+ 0,193 6,9а 2 60,4+0,6 -13,41±0,07 -10,17+0,07 -10,9±0,3

4-0-метилдопамин+ 0,201 5,0Ъ 2 51,7+1,5 -15,3±0,3 -9,78±0,07 -18,5±1,0

(Ю-{-)-фенилэфрин+ 0,175 6,9а 2 46,6±0,5 -19,44+0,13 -9,52+0,03 -33,3±0,5

(Ю-(-)-фенилэфрин+ 0,191 5,0Ь 2 39,3±0,4 -21,90^0,22 -9,10+0,03 -42,9±0,8

(±)-норфеш£лэфрнн+ 0,171 6,9а 2 38,6+0,6 -18,16*0,18 -9,06+0,04 -30,5±0,6

(±)-норфенилэфрин+ 0,182 5,0Ь 2 32,7±0,6 -20,7+0,3 -8,65+0,05 -40,4±1,0

З-фенил-1 -пропиламин + 0,200 6,9а 2 108+3 -9,2+0,1 -И,61 ±0,07 8,1 ±0,4

З-фенил-1-пропнламин + 0,246 5,0Ь 2 95 ±3 -9,44+0,15 -11,29+0,08 б,2±0,6

тирамин*1" 0,222 6,9а 2 71,3+0.7 -13,8+0,2 -10,58±0,03 -10,8±0,7

тирамин+ 0,203 5,0Ь 2 63,0+0,7 -13,79+0,14 -10,27±0,03 -11,8±0,5

(15,2И)-(+)-эфедрин+ 0,213 6,9* 2 71,3±1,2 -8,71+0,09 -10,58±0,05 6,3+0,3

2. Другие ароматические соединения содержащие бензольное или имидазольной кольца

бензоат"

0,189 6,9а 1 15,9 ±1,2 -10,5 ± 0,7 -6,66 ± 0,20

-12,2+0,8

фенилацетат" идоо 1 / —

З-фешшбутаноат" 0,153 б,9а 1 379 ± 10 -9,41+0,10 -14,72±0,06 17,8+0,1

4-фенилбутаноат~ 0,144 6,9а 1 435 ± 26 -11,78±0,12 -15,06±0,15 11,0+0,2

2-метилфеиилацетаг" 0,152 6,9а 2 Й

3-метилфенилацетат" 0,150 6,9а 4 11,9 ± 1,4 -11,5 ± 1,1 -6,1 ± 0,3 -18,1+1,2

4-метилфенилацетат" 0,07-0,15 6,9а 6 40,4 ± 1,7 -12,1 ± 0,4 -9,17 + 0,11 -9,8+0,4

3-метоксифенилацетат" 0,160 б,9а 2 38,0 ± 1,1 -12,3 ± 0,2 -9,02 ± 0,08 -10,8+0,3

4-меток.сифенилацетат" 0,139 6,9а 2 69,3 ± 1,6 -8,22±0,11 -10,51+0,06 7,7 ± 0,2

4- бензилпипер1щин+ 0,115 6,9* 2 1987±219 -13,8+0,4 -18,83±0,29 17±2

гидрокоричная кислота" 0,191 6,95 2 141+3 -7,60±0,08 -12,27±0,06 15,7±0,3

феши-р-Б-глюкопуранозад0 0,076 6,9а 2 ~ 10 ~ -14

Ь-а- (-) -бензилглицерин0 0,169 б,93 2 128±3 -9,2+0,1 -12,03+0,06 9,5±0,4

н-гексил- (З-Б-глкжопу ранозид0 0,101' 6,9а 2 ~ 750 ~ 0,14

1 -фенилимидазол0 0,045 10,0е 2 25±14 -39±19 -8,0±2,0 -104+64

1-бензнли№сдазол° 0,062 10,0е 2 411+13 -15,9+0,2 -14,92±0,08 -3,3+0,7

1 -бутилимидазол0 0,102 10,0е 2 155+8 -10,7±0,3 -12,50+0,13 6,0±1,1

3. Циклические алифатические спирты

цшелобутанол0 0,227 6,9а 2 14 ±6 3,7 + 1,4 -6,5 ± 1,4 34,2±2,0

циклопентанол0 0,209 6,9а 2 172 + 5 -4,56±0,05 -12,76±0,08 27,5±0,1

циклогексанол0 0,06-0,21 6,9а 6 704+14 -6,6±0,1 -16,3±0,1 33±1

1-метшщиклогексанол° 0,145 б,9а 2 1150 + 36 -9,58±0,29 -17,47+0,08 26,5+1,0

(±)-цис-2 -метил-

циклогексанол0 0,110 6,9а

(±)-транс-2 -метил-

цшслогексанол0 0,114 6,9а

3-метилцшслогексанол0 0,064 6,Эа

цис-4 -метилциклогексанол0 0,080 6,9я

транс-4-метилциклогексанол° 0,072 б,9а

циклогептанол0 0,044 6,9а

циклооктанол0 0,01-0,02 6,9а

2 981 ± 22 -9,92*0,15 -17,08±0,06 24,0±0,6

2 741 ± 10 -8,66+0,09 -16,38±0,04 25,9^0,1

2 830 ± 16 -8,74±0,09 -16,66+0,05 26,6+0,1

2 1462 ± 26 -9,50+0,10 -18,07±0,05 28,7+0,1

2 2130 ± 61 -9,06+0,17 -19,00±0,07 33,3+0,6

2 2197 ± 73 -12,37±0,12 -19,08+0,09 22,5+0,2

2 4405 ± 484 -16,4 ± 0,5 -20,8 ± 0,3 14,8±0,6

а Фосфатный буфер {(КаН2РО.<. 0.025 моль кг"1) + (\та2НР04> 0.025 моль кг'1), рН = 6.9} ь Ацетатный буфер {<=-МаС2Нз02; 0.1 моль кг1) + С2Н402, рН = 5.0} с Глициновый, буфер {(С2Н5М02, 0.1 моль кг1) + НС1, рН = 10.0}

и/или ДГН° для этой реакции по всей видимости слишком малы чтобы быть достоверно измерены с помощью используемого калориметрического метода.

е Термодинамические параметры этой реакщш не могли быть намерены т.к. наблюдалось достаточно быстрое выпадение осадка со временем (начало выпадение осадка 10-15 мин после момента приготовления раствора). { н-гексил-р-В-глюкопуранозид" не является ароматическим соединением, но был включен в данную секцию таблицы для сравнения.

сл

Вероятно слудует предположить, что "эффект гидрофобной полости" простирается на некоторое расстояние за чисто геометротескпе рамки собственно молекулы циклодекстрина. Вполне возможно, что структура воды продолжает оставаться "деформированной" не только внутри полости, но также на некотором растоянии от нее, чем и вызвана наблюдаемая зависимость термодинамзгаеских параметров реакций комплексообразования от длины алифатической цепи лиганда.

С другой стороны, нами было показано, что наличие метальной группы в непосредственной близости от заряженной амино-группы практически не влияет на термодинамику связывания. Этот экспериментальный факт легко объяснить, если предположить, что, как уже отмечалось выше, наиболее гидрофобная часть молекулы включается внутрь полости циклодекстртгов, а заряженная группа и вероятно ее ближайшее окружение остаются экспонированными в общую массу растворителя. Таким образом, физико-химическое состояние заряженной или незаряженной гидрофильной части молекулы не изменяется до и после реакции комшгсксообразовашсг и тем самым не оказывает существенного влияния на термодинамические параметры связывания.

Еще одной весьма убедительной иллюстрацией неучастия гидрофильных групп в процессах взаимодействия лигандов с циклодекстринами могут служить реакции 1-гексанола и и-гексил-р-О-глгокопуранозида с а-циклодекстрином. Два указанных лиганда имеют идентичную гидрофобную часть, а именно остаток гексана, и различные гидрофилыше группы (в одном случае гидроксильную группу, а в другом - остаток р-В-глюкопуранозида). Для реакции 1-гексанола с а-циклодекстрином нами определено: К = 871+46 и ДГН° = -18,5+0,4 кДж моль-1. Термодинамические параметры для реакщш н-гексил-р-О-глшколуранозцда с а-циклодекстрином равны: К = 839±35 и Д,.Н° = -18,5+0,4 кДж моль'1 и совпадают в пределах погрешности с данными приведенными выше для реакции 1-гексанола и а-циклодекстрина.

Эффект природы заместителя, а также его положение в бензольном кольце также детально нами изучены (см. табл. 1). В порядке убывания констант равновесия реакций взаимодействия с а-циклодекстрином пара-производные фенэтиламшга располагаются следующим образом: СНз > ОСНз > фенэтиламин+ > ОН > N112; а с |3-циклодекстрином: ОСН3 > СН3 > ОН > N112 > фенэтиламин+. В то же самое время, в порядке убывания экзотермичности реакций взаимодействия с а-

циклодекстрином рассматриваемые производные фенэтиламина располагаются следующим образом: ОН < ОСНз < СН3 < фензтиламин1; а с р-циклодекстрином: ОН < ]\'Н2 < ОСН3 < СН3 ~ фенэтиламин+. И наконец, стандартные энтропии реакций производных фенэтиламина с а-циклодекстрином располагаются следующим образом в порядке убывания: ОН < ОСН3 < фенэтиламин+< СН3; а с р-циклодекстрином: ОН < КН2 < фенэтилаюш+ <.ОСНз < СН3 .

Гидроксильная группа и в меньшей степени амино-группа обеспечивают существенную дополнительную знтальташую стабилизацию комплекса лиганд-цикло декстрин. Однако этот стабилизационный эффект, также как это было отмечено для многих других реакций с участием циклодекстринов, компенсируется неблагоприятными изменениями энтропии.

Следует отметить, что тепловые эффекты для реакций почтя всех лигандов с а-циклодекстрином более экзотермичны чем тепловые эффекты для реакций соответствующих лигандов р-циклодекстрином. С другой стороны, величины Дг5° для реакций всех лигандов с а-циклодекстрином меньше, чем значения Д^-Б" для реакций соответствующих лигандов (З-циклодекстрином. Таким образом, именно более благоприятное изменение величин Дг5° для реакций с участием р-циклодекстршт по сравнению с соответствующей реакцией с участием а-циклодекстрина приводит к повышению стабильности комплекса одного и того же производного фенэтиламина при переходе от а- циклодекстрика к р циклодекстр1шу.

Специально следует остановиться на паре ароматических соединений фенэтиламин и тирамин, различающихся только на одну ОН-группу. В этом случае эффект присутствия гидроксильной группы выражается в увеличение экзотеркичкости реакций с а- и р-цизслодекстринами на -8,2+1,6 кДж моль"1 и -7,4±0,4 кДж моль*1, соответственно. В качестве средней приблизительной величинь в этом случае мы можем взять -8 кДж моль"1, как тепловой эффект взанмодействш ОН-группы при ароматическом кольце с ццклодекстринами. Доказательства наличиз водородного связывания получены нами при снятии спектров поглощения \ флюоресценции свободных лигандов и их комплексов. Все выше сказанию« относится в полной мере и к паре анион гидрокоричной кислоты и анион 3-(4 гидроксифенил) пропионовой кислоты.

Нами показано, что в отличии от гидрокильной группы, находящейся ) пара-положении, для гидроксильной группы в мета-положении образовать

«дородной связи с циклодекстрином связано по-исей видимости с некоторыми терияеекими трудностями, а для гцдроксилыгой группы в орто-положешш -фактически невозможно ввиду все тех же стерических трудностей.

Константы равновесия реакций эфедршюв и псевдозфедринов с р-[иклодекстрином в 2,5-4 раза больше чем константа равновесия аналогичной »еакции с участием фенэтиламюта. По-скольку стандартные энтропии реакций ■идроксил-содержащих соединений с р-цнклодекстрином в некоторых случаях более >лаготриятиы, а других - менее благоприятны, чем для реакции фенэтиламина, жопчательный эффект стабилизации комплекса обусловлен преимущественно )нтальпиЙ1шм фактором. Такая стабилизация практически не наблюдается для >еакций эфедринов и псевдоэфедринов с а-цшслодекстрином. Вероятно, -еометрические размеры полости а-цшслодекстрина не достаточны для полного югружеш!я в нее молекул эфедршюв и псевдоафедриноа и в следствии этого юдородные связи лиганд-мак^юцикл не могут быть образованы.

Весьсма интересна проблема завиигмости термодинамических параметров гомплексообразования ароматических лигандов с циклодекстринами от положения ¡аместителя в ароматическом кольце дпазда. Эта проблема была изучена нами гга тримере различных метокси-изомеров фенэтиламина. Стабилизация комплексов с а-далодегсстрином наблюдается для 4-метоксифенэтиламина и в несколько меньшей степени для 3-метоксифенэтиламика. Эта стабилизация вызвана более ^кзотермичным тепловым эффектом реакций а-циклодекстрина с 4-четоксифенэтиламином и 3-метоксифеготиламином по сравнением с аналогичной реакцией фенэтиламина.

Метокси-группа, находящаяся в орто-положешш, практически не эказывает влияния на прочность комплекса а-циклодекстрин - лнганд. Этот факт следует рассматривать как еще одно свидетельство того, что бензольное кольцо слишком велико для его полного погружения в полость а-циклодекстрина. Метокси-группа, находящаяся в орто-положении, остается вне полости после образования комплекса и не оказывает сколько-шабудь заметного эффекта на прочность комплекса.

Еще одно доказательство неучастия метокси-группы, находящейся в орто-положешш, в процессе образования комплекса можно получить на основании термодинамических параметров взаимодествия а-циклодекстрина со следующей

парой лигандов: З-меюксифенэтюшшш - 2,5-диметоксифенэтиламин. Эти де лигавда различаются на одну метокси-группу в орто-положении термодинамические параметры их реакций с а-циклодекстриком весьма близ» между собой.

В случае р-цикло декстрина также наблюдается стабилизация комгшексов • метоксифенэтиламина и в несколько меньшей степени для 3-метоксифенэтиламина г сравнению с фенэтиламином; причем, также как для а-циклодекстрина, стабилизащ обусловлена преимущественно энтальпийным фактором. Дестабилизирующий эффе] метокси-грушш в орто-положешш легко проследить на примере двух ш соединений: 1) фенэтиламин - 2-метоксифснзтиламин; и 2) 2-метоксифенэтиламин 2,5-диметоксифенэтиламин. Причем дестабилизирующий эффект обусловь негативным изменением энтропии. По-всей видимости метокси-группа в орт положении вызывается стерические затруднения при образовании комплекса ■ циклодекстрином.

Как отмечено выше, бензольное кольцо, ввиду своих геометричесю размеров, не может быть полностью прогружено в полость а-циклодекстрина. I всей видимости, только один из самых маленьких ароматических циклов - имида» достаточно мал для включения в полость а-циклодекстрина полностью. В этой свя: нами было изучено взаимодействияе а- и р-циклодекстринов с 1-бензилимидазолом 1 -феншшмидазолом.

Константы равновесия реакций 1-бензилимидазола с а- и циклодекстринами больше чем соответствующие значения констант равновес реакций 1-фенилимидазола. Особенно заметна эта закономерность в случае циклодекстрина, где переход от 1-фенилимидазола к 1-бензилимидазолу (молеку.* которых различаются на одну СН^-группу) вызывает увеличение констан-равновесия почти в 20 раз. Это исключительно энтропийный эффе! . проявляющийся не смотря неблагоприятное изменение шггальпии. Одним возможных объяснений может быть увеличение гибкости молекулы бензшшмидазола по отношению к 1-фенилимидазола, что позволяет молекуле бензилимидазола входить в состав комплекса ввиде значительно большего чис различных информационных форм чем молекула 1-фенилимидазола.

Другое интересное сравнение может быть осуществлено на примере бутанола и 1-бутилимвдазола. Соответствующие термодинамические парамет]

«акций указанных лигандов с а- и р-циклодскстринами значительно различаются гежду собой. Такое поседение термодинамических параметров легко объяснить, если гредположить участием имидазольного кольца в формировании комплексов «ссматршзаемых лигандов с циклодекстринамп. Следует отметить. что ермодинамические параметры реакций циклодекстринов с имидазолом, с одной ггороны, и 1-бензилимидазола или Ьфеншпгмида.юла, с другой, также сильно различаются между собой. Термодинамические данные сами по себе не могут дать гам однозначного ответа на вопрос какие нмсгаю ароматические кольца или атомы тигандов участвуют в формированиии комплексов с циклодекстршгами. Чтобы ответить на этот вопрос нами было проведено исследование структуры комплексов четодом ЯМР.

Детально структура комплекса 1-беизилиммдазола с р-циклодекстрином изучена нами методом ЛОЕБУ. Протоны как бензольного так имидазольного колец показывают межмолекулярный Ж5Е сигнал при селективном возбуждении Н5 и НЗ протонов р-циклодекстрина. Тем неменее следует подчеркнуть, что при селектшзном возбуждении Н5 протона р-циклодексгрина межмолекулярный КОЕ сигнал больше для бензольного кольца, чем для имидазольного. При селективном возбуждении НЗ протона р-циклодекстрина наблюдается обратная картина. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что бензольное кольцо располагается внутри полости циклодекстрина в непосредственной близости от Н5 протона. Одновременно полученные ЯМР спектры указывают на включение имидазольного кольца в полость

р-циклодекстрина

При изучении реакций с участием циклодекстринов общим правилом выбора объектов исследования для микрокалоримеитрических экспериментов было систематическое и по-возможности планомерное изменение структуры того или иного химического соединения. Например, изучение гомологических рядов различных классов ароматических и алифатических соединений или изомеров характеризующихся различным положением заместителей в ароматическом или алифатическом кольце. Для стерео-изомеров критерии выбора объектов исследования в основном обусловлены различиями в природе функциональных групп, расположенных вокруг ассиметрического или ассиметрическнх атомов углерода в молекуле органического лиганда.

Нами было найдено, что не наблюдается значимого различия в величина термодинамических параметров взаимодействия а- и р-щшлодекстриков различными стерео-изомерами каждого из изученных вторичных спиртов.

Термодинамические параметры взаимодействия р-циклодекстрина с й- и 5 стерео-изомерами 1-циклогексилэтиламина и 2-фенилбутановой кислоты соответствешю, также перекрываются в пределах погрешностей. Однако следуе отметить, что, в эхом случае, перекрывание происходит почти па пределе интервал погрешности. Вполне возможно, что если бы удалось уменьшить экспериментальну! погрешность в 2-3 раза мы увидели бы реально существующее различие термодинамических параметрах связывания внутри каждой из рассматриваемых па II- и 5- стерео-изомеров 1-щаслогексилэгиламина и 2-фе1Шл6утаиовой кислоты.

Значимое различие констант равновесия и стандартных энтропии реакци наблюдается для И- и Б-изомеров камфорных кислот. Следует подчеркнуть, чт тепловые эффекты реакций в обоих случаях одинаковы. Для Я- и З-изомеро камфорсульфоновых кислот все термодинамические параметры значимо различагатс. между собой. Надежно установленное стерео-дискримирование оптических изомеро камфорной и камфорсульфоновых кислот р-циклодекстрином вероятно возникав как следствие жесткой структуры камфорного кольца.

Уникальный случай изучения И- и З-стерео-изомеров химическог соединения с одним асимметрическим атомом углерода, у которого все заместител отлнчлы от атома водорода предоставляет а- метокси-о трифторометилфенилуксусной кислота. Нами показано, что все термодинамически параметры взаимодействия рассматриваемых стерео-изомеров с р-циклодекстрино; значимо различаются между собой в пределах погрешностей.

Так™ образом, что касается стерео-изомеров химических соединений одним асимметрическим атомом углерода, существенные различия термодинамических параметрах связывания с р-циклодекстрином обнаружены нами двух случаях, во-первых, когда асимметрический атом углерода включе: непосредственно в циклическое образование (камфорная и камфорсульфонова кислоты), и во-вторых, когда все четыре заместителя у асимметрического атом углерода отличны от атома водорода (а- метокси-а-трифторометилфенилуксусно: кислота).

Рассмотрим теперь соединения, содержащие в молекулах два и более гимметрических атома углерода. Эфедрины и псевдоэфедрины предоставляют никальную возможность узучения всех четырех стерео изомеров химического оединения с двумя асимметрическими атомами углерода. Для этих соединений уществугат значимые различия в термодинамических параметрах реакций заимодействия стерео-изомеров эфедрина и псевдоэфедрина с а- и р-дклодекстршгами. В случае реакций с а-циклодекстрином термодинамические араметры распадаются на два отдельные группы, соответственно, для стерео-зомеров эфедрина и псевдоэфедрина.

Относительная разность (например, выраженная в процентах) ермодинамических параметров для реакций взаимодейевия БЛ- и КБ-стерео-изомеров '-амино-1,2-дифеиклэтанола с р-циклодекстрином приблизительно гатя же как и в лучае соответствующих реакций стерео-изомеров эфедрина и псевдоэфедрина. Замена одной из метилышх групп в молекуле эфедрина (т.е. переход к 2-амино-1,2-Еифенилэтанолу) характеризуется некоторым уменьшением аффшшости, но вставляет величину стандартной энтальпии реакции приблизительно постоянной.

Увеличение симметричности молекулы при переходе от 2-амино-1,2-щфензшэтанола к дибегоошгоинной кислоте ведет к исчезновешш одного их двух яггически-активных центров. С точки зрения термодинамики это выражается в ¡ущественном различие величин стандартных энтальпий и стандартных энтропии >еакций каждого отдельного стерео-изомера дибензоилтш I той кислоты с р-даклодекстрином. Однако, энтропийно-энтальпийной компенсация делает константы равновесия и, соответственно, свободные энергии Гиббса практически одинаковыми к ювпадающнми в пределах погрешности.

На примере ЯБЙ- и НКН-2-гидрокси-3-пинанона можно убедится, что само ю себе число асимметрических атомов углерода в молекуле лиганда не является -аратом различие термодтимических параметров комплексообразования с -щклодекстринами. Не смотря на наличие трех асимметрических атомов углерода в молекуле 2-гидрокси-З-пинанона мы не можем уверенно утверждать о значимом различии термодинамических параметров.

При изучении явления энтальнийно-энтропийной комле нсацш! показано, что это явление имеет всеобемлящий характер и характеризуется следующими деумя эсобенностями

Во-первых, чем больше интервал значений термодинамических параметроЕ тем вероятнее получение удовлетворительной корреляции между ДгН" и ТДЗ0.

Во-вторых, чем более сходны структуры реагирующих молекул, те] меньше интервал значений термодинамических параметров необходим дл проявления корреляции между АгН° и ТЛ-Ь°.

Таким образом, чем больше разл1гчие в структурных особенностях природе физико-химических взаимодействий между молекулами, тем больше долже быть интервал рассматриваемых значений ДГН° и ТДгБ", для того чтобы на фон отдельных случайностей (т.е. структурных особенностей или природ? взаимодействия) отчетливо прожилась энтальшшно-энтропийной компенсация.

3. Взаимосвязь структуры органических лигандов и термодинамически параметров их взаимодействия с водорастворимыми порфирипом и макроцикло* способным к интеркалированшо.

Как правило наличие электрического заряда любого знака на молекул лиганда ухудшается взаимодействие с циклодекстрииами по сравнению аналогичной незаряженной молекулой. В корне отличающаяся картина наблюдаете для реакций комплексообразования органических лигандов с двумя другим исследованными нами макроциклами. По-скольку оба изученных макроцикл положительно заряжены при физико-химических условиях эксперимента, чем боле отрицательный заряд имеет молекула лиганда тем лучше ока связывается. Те неменее сам по себе отрицательный заряд молекулы-лиганда необязательн обеспечивает хорошее связывания с положительно заряженным, макроцикло» Особенно отчетливо это еидно на примере бис-интеркаляционного макроцикл; который практически не взаимодействует с бензилсульфоновой кислотой (заряд -1) тимидин-3' ,5'-циклическим монофосфатом (заряд -1).

В случае реакций с участием циклодекстринов, введение ароматичесшн кольца (например бензольного кольца) в молекулу лиганда не оказывало болышл влияния на прочность комплекса. Для водорастворимого порфирина и макроцикл; способного к интеркалировашпо, наблюдается обратим закономерность. Общ! правило заключается в том, что чем больше геометрические размеры ароматнческш кольца тем прочнее комплекс это соединение образует с макроциклами. Это правш выдерживается достаточно хорошо для реакций с участием водорастворимо!

зрфирипа. В случае реакций иитеркалкрования наблюдается ряд исключений из "ого правила. Гак например, имеющие приблизительно одинаковые по размерам зоматическне циклы уридин и никотинамид обладают тем не менее азлзгчающимися более чем в три раза константами связывания.

Остановимся на нескольких примерах влияния СНз-группьг, находящейся в ^посредственной близости от ароматического кольца, на термодинамику реакций с соматическими макроциклами. Для реакций комшгексообразования с эдорастворимым порфирином наблюдается общее правило, что добавление етильного заместителя а ароматическое кольцо приводит к образованию более рочного комплекса. При процессах интеркалтгрования это правило соблюдается не сегда. В двух случаях при переходе от шпеотшюмида к К-метилшшлтшамиду и ри переходе от пурина к 6-метилпурину мы наблюдаем некоторое увеличение онстант связывания с макроциклом.

Противоположная картина наблюдается в случае пары уридин-тимидин. 1ереход от уридшга к тимиднну, т.е. добавление к ароматическому кольцу уриднна Шз-группы, приводит к практически полному разрушешпо комплекса. Константа вязывания для тимлдина весьма мала (< 2-3) и не может быть определена [спользованным нами микрокалориметрическим методом.

Как отмечалось выше, метальный инкремент энтальпии для реакций ¡заимодействия различных органических соединетш с циклодекстринами достаточно лабилен и практически во всех случаях (будь то дополнительная СН2-группа в ишфатической цепи или СНз-гругта добавлешгая к ароматическому кольцу), когда добавляемая группа погружена в полость циклодекстрина, это приводит к зозрастанию экзотермичности процесса на несколько кДж моль"1. В случае ароматических макроциклов не представляется возможным сделать аналогичный зывод. Здесь влияние метельного замещения очень специфично и сильно зависит от ;труктуры молекулы лиганда. Например, стандартные энтальпии реакций янтеркалирования с участием пурина и 6-метилпуршга практически одинаковы, тогда как стандартные энтальпии аналогичных реакций с участием уридш1-5'-монофосфат и тимвдин-5'-монофосфат различаются между собой почти на 20 кДж моль"1.

Суммируя отличительные черты термодинамики реакций комплексообразования ароматических лигандов с бис-интеркаляционным макроциклом, с одной стороны, и мезо-тетра -( N -метил-4 пиридил)порфирином, с другой, следует сказать следующее.

Во-первых, следует подчеркнуть значительно большую роль стерическоп фактора в реакциях с участием бис-интеркаляционного макроцикла, чем в реакциям с участием мезо-тетра -( N -метил-4 пиридил)порфирина. Порфириновое кольцо являясь плоским, не предъявляет "особых" требований к геометрии молеку: лигандов, в то время как даже незначительное изменение геометрии молскуль лиганда может вызвать стерические трудности при "вписывании" этой молекулы ] трехмерную ажурную структуру бис-интеркаляционного макроцикла.

Во-вторых, положительный заряд на молекуле лиганда полкостьк препятствует взаимодействию этого лиганда с бис-интеркаляционным макроциклои (несущая на себе положительный заряд молекула триптамина не реагирует с ним) тогда как этот же катион может образовывать относительно устойчивые комплексы < мезо-тетра -( N -метил-4 пиридил)порфирином (константа равновесия д® положительно заряженной молекулы триптамина равняется 40,1 ±1,8).

В принципе из чисто имшгрических закономерностей следовало бь

ожидать образования комплекса между триптамином с зарядом +1 с бис

интеркаляционным макроциклом. Действительно, приведем величины констан:

равновесия для реакций некоторых лигандов с бис-интеркаляционным макроциклоь

и мезо-тетра -( N -метил-4 пиридшОпорфирином, соответственно,: 1) уридин -

34,2+0,4 и 72,4+1,0; 2) пурин - 72,2±0,6 и 131,0+0,6; 3) никотинамид - 9,8±0,б i

56,6+0,8; 4) N-метшшшсотинамид - 11,5+1,0 и 56,6+1,0. Основываясь на указанные с

чиенных данных следовало ожидать, что константа равновесия для реакцш триптамина с бис-интеркаляционным макроциклом должна находится в интервале 7 20, по-скольку константа равновесия его реакции с порфириновым макроцтии» равна 40,1±1,8.

В-третьих, прочность комплексов с участием мезо-тетра -( N -метил-? пиридил)порфирина зависит в первую очередь от размера ароматического кольцг лиганда и слабо - от природы ароматического кольца. Так например, близкие ш размерам, но сильно отличающиеся по химическим своствам пиримидиновое кольце уридииа и никотинамид имеют близкие константа связывания 72,4+1,0 и 56,6±0,8 соответственно. С другой стороны, при переходе от уридина или никотинамдца t гарину (т.е. при увеличении размеров ароматического кольца) аффинносп возрастает в два или более раз, а при переходе от тех же лигандов к имидазолу (т.е при уменьшении размеров кольца) аффинность резко падает. Для реакций (

гг.

иетием бис-интеркаляциошгого макроцикла природа ароматического кольца играет ряде случаев даже большую роль чем собственно размер кольца- Например, эистанты равновесия для уридина и пурина различаются в два раза, а для уридина никотинамвда более чем в три раза.

4. Зависимость термодинамических параметров реакций взаимодействия ргаяическпх лигандов с макроциклами от температуры.

При определении термодинамических параметров реакций омллексообразования органических лигандов при различных температурах ервостепенное внимание было уделено изучению водородного связывания и вдрофобных взаимодействий.

Величины ДДО° наглядно демонстируют уменьшение стабильности одородпого связывания с увеличением температуры, в то время как вклад идрофобных взаимодействий в стабильность комплексов остается приблизительно одинаковым [три различных температурах.

Неизменность стабилизирующего эффекта гидрофобных взаимодействий »бъясняется практически полной энтальгапшо-эптрошшной компенсацией. Графики, »тобрансакяцие изменение величин ДАН0 и А(ТД5°) с температурой, имеют щинаковый по абсолютной величине, но противоположный по знаку наклон, что и 1риводит к практически полной энтальгапгно-энтропийной компенсации.

В случае образования водородных связей, графики, отображающие гаменение величин ДДН° и Д(ТД5°) с температурой, также как в первой случае гмсют противоположный по знаку наклон, но достаточно сильно отличаются по 1бсолютной величине. Существенное различие в абсолютной величине наклона имеет :воим следствием уменьше1ше инкрементов ААО° при повышение температуры (т.е. ггабилизкруюпрпг эффект водородного связывашет падает с температурой).

Процесс "плавления" водородных связей при повышении температуры во многом определяет стабильность не только модельных комплексов, изученных в настоящей диссертации, но и нативиой структуры белков.

выводы

1. Разработаны методологические подходы использования современно микрокалориметрии при изучении обратимых и необратимых биохимически реакций, а также экспериментально определены ключевые термодинамичесы-величины и выявлены взаимосвязи между термодинамическими величинами структурой веществ, участвующих в различных типах биохимических процессов.

2. Проведен детальный анализ различных микрокалориметричесю методов с указанием наиболее предпочтительных и целесообразных метод определения термодинамических параметров реакций или процессов в зависимости конкретно поставленной задачи. Приведены примеры применен] микрокалориметрии для Изучения различных ферментативных реакций и реакц] комплесообразования органических веществ с макроциклами в водном раствор Проанализирован путь развития микрокалориметрического приборостроения отмечены тенденции развития микрокалориметрической техники в последи десятилетие.

3. Показано, что общим правилом для образования прочного комплек циклодекстрина с органическим соединением является соответствие геометрическ размеров молекулы органического вещества с размерами полости циклодекстрина найдено, что зависимости термодинамических параметров реакций взаимодейств различных классов алифатических органических соединений с а- и циклодекстринами от числа атомов углерода в алифатической цепи описывают простыми полиномиальными функциями первого или второго поряда Полиномиальный вид функций позволяет осуществлять обоснованный научи прогноз численных значений термодинамических параметров реакц комплексообразования с циклодекстринами для неисследованных веществ на оснс уже имеющегося экспериментального материала.

4. При изучении температурных зависимостей термодинамическ параметров комплексообразования циклодекстринов с органическими лиганда определены инкременты ДДО° ДДН° и Д(ТД5°), относящиеся к метальной

п

жсильной группам и показано, что стабилизирующий эффект, обусловленныи зованпем водородной связи быстро убывает с температурой тогда как эффект глизацни, вызванный гидрофобными взаимоденсгвгюмк с участием метнлыгой пы, остается практически неизменным при увеличении температуры.

5. Установлено, что общим правилом изменении термодинамических метров комллексообразовашвд органических лигандов с водорастворимым ^ирнном и бис-шггеркаляционным макроциклом является увеличите прочности втекса с увеличением геометрических размеров ароматического кольца лиганда и дазрастанием отрицателеного заряда на молекуле лиганда. Это правило подается лучше для реакций с участием водорастворимого порфирина, чем для сций кнтеркалирования.

6. Продемонстрировано наличие четко выраженной стерео-селективности в кгимости величин термодинамичесыгх параметров реакций комплексообразования лодекстршгов с различными классами органических оптически активных веществ, ержащта один или несколько ассиметрических атомов углерода и актеризующнхся различными по своей пр1гроде заместителями у мметрического атома углерода (в том числе и в том случае, когда все заместители химетрического атома углерода отличны от атома водорода).

7. При изучении явления энтальпшщо-энтрошптой компенсации показано,

> ее отчетливое лроявлешге на фоне различий в структуре реагирующих веществ и Ценностей в их природе взаимодействия, тем вероятнее, чем меньше различия в гуктуре и природе физико-химических взаимодействий между молекулами или чем 1ьше интервал рассматриваемых значений ДГН° и TArS°.

8. Установлено, что общим правилом является ослабление связывания клодекстринов с органическими лигандами при увеличение iex заряда, при ;денми в их структуру дополнительных гидрофильных групп, а также. при еличепие их "жесткости".

9. Установлено, что инкремент стандартной энергшг Гиббса ArG°, тяодящийся на одну СН^-группу, для реакций взаимодействия а- и р-

циклодскстринов с органическими веществами, представляющими co6i гомологические ряды различных классов алифатических соедине1шй, равняет приблизительно -3 кДж. моль"1, что соответствует общепринятому представлению гидрофобных взаимодействиях.

Основные результаты проведенных исследований опубликованы следующих работах:

1. Рехарский, М. В.; Егоров, А. М.; Гальченко, Г. Л.; Березин, И. В.; "Энтальп реакции окисления-восстановления никотинамид аденин динуклеотида"; Д/ СССР, 1979, 249, 1156-1158.

2. Рехарский, М. В.; Егоров, А. М.; Гальченко, Г. Л.; Березк

"Термодинамическое исследование ферментативного окисления формиаг-ион; Ж. Общ. Хим. 1980, 50, 2363-2369

3. Rekharsky, M.V.; Egorov, A.M.; Galchenko, G.L.; "Microcalorimet; determination of thermodynamic parameters of an enzymatic reaction catalyzed soluble and immobilized formate dehydrogenase"; Science Tools. 1980, 27, 51-53.

4. Egorov, A.M.; Rekharsky, M.V.; Berezin, I.V.; "Coal-derived liquid fuels provi hydrogen for fuel-cell power, vehicle propulsion"; Chemistry International, 19i No. 5, pp. 20-26.

5. Rekharsky, M.V.; Egorov, A.M.; Galchenko, G.L.; Berezin, I.V.; "Thermodynam of redox reactions involving nicotinamide adenine dinucleotide"; Therinochim. Acl 1981, 46, 89-101.

6. Рехарский, M. В.; Егоров, A. M.; Гальченко, Г. Л.; "Определение энтальп реакции окисления-восстановления ншмугинамид аденин дашуклеотида "; сборнике "Термодинамика оргашгческих соединений" (под ред. Гальченко, Г. . Изд-во Горьковского университета (1981) стр. 47-48.

7. Рехарский, М. В.; "Термохимическое исследование некоторых ферментативш

реакций с участием никотинамид адетш динуклеотида"; Авюрефер диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наз Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова. Моею Издательство Московского университета. 1982, стр. 1-18.

8. Рехарский, М. В.; "Термохимическое исследование некоторых ферментативы реакций с участием никотинамид адещш динуклеотида"; Диссертации соискание ученой степени кандидата химических наук. Московск государственный университет им. М.В.Ломоносова. Москва. Издательст Московского университета. 1982, стр. 1-176.

I. Попов, В.О.; Закс, A.M.; Рехарский, М. В.; Егоров, А. М.; Гоготов, ПЛ.; Зорин, Н.А.; "Получение водорода из формиата с использованием мульти-ферментпых систем"; Пршсдад. биохимия и югкробпология, 1982, 18, 199-507.

.0. Рехарский, М. В.; Гальченко, Г. Л.; Егоров, А. М.; "Микрокалориметрнчсское определешк энтальпий ионизации биологически важных буферных растворов"; Ж. Общ. Хим. 1984, 54 , 195-199.

.1. Rekharsky, M.V.; Rumsh, L.D.; Antonov, V.K.; Galchenko, G.L.; "Thermochemistry of the N-acety)phenylalanine methylester hydrolysis reaction catalyzed by chymotrypsin"; Thermochim. Acta, 1984, 81, 167-174.

a. Rekharsky, M.V.; Slozhcnikina, Y.B.; Skya, A.Z.; Egorov, A.M.; Galchenko, G.L.; "Thermochemistry of the L-asparagine hydrolysis reaction catalyzed by L-asparaginase"; Thermochim. Acta, 1985, 91, 79-85.

[3. Рехарский, M. В.; Сложеникина, Ю.Б.; Егоров, A. M.; Гальченко, Г. Л.; "Энтальпия ионизации уксусной кислоты и некоторых ее производных"; Вестник Московского университета, Серия 2(химил), 1985, 26, 368-371.

14. Рехарский, М. В.; Сложеникина, Ю.Б.; Егоров, А. М.; Гальченко, Г. Л.; "Микрокалориметрический метод определения активности L-аспарагиназы и некоторых других гидролитических ферментов"; Ж. Физ. Хим., 1986, 60,. 1548-1550.

15. Рехарский, М. В.; Тищенко, С.А.; Арене, А.К.; Егоров, А. М.; Гальченко, Г. Л.; "Энтальпия ионизации орто-фосфорной кислоты, пара-шпрофегошфосфата и пара-нитрофенола"; Вестник Московского университета, Серия 2(химия), 1986, 27, 375-378.

16. Rekharsky, M.V.; Skya, A.Z.; Lopatnev, S.V.; Slozhcnikina, У.В.; Egorov, A.M.; Galchenko, G.L.; "Simple industrial method for determination of hydrolytic enzymes activity"; J. Biochem. Biophys. Methods, 1986, 12, 247-249.

17. Rekharsky, M.V.; Galchenko, G.L.; Egorov, A.M.; Berezin, I.V.; "Thermodynamics of enzymatic reactions", in: "Thermodynamic data for biochemistry and biotechnology"; (ed. H.-J. Hinz), Springer-Veriag, Heidelberg (t986) pp. 431-444.

18. Rekharsky, M.V.; Egorov, A.M.; Galchenko, G.L.; "Thermochemistry of hydrolytic enzymatic reactions"; Thermochim. Acta, 1987, 112, 151-162.

19. Рехарский, M. В.; Тищенко, С.А.; Арене, A.K.; Егоров, А. М.; Гальченко, Г. Л.; "Энтальпии иош-гзации и константы диссоцтгащш аденозин-5'-монофосфата (5-АМФ)"; Вестник Московского университета, Серия 2(химия), 1988, 29,. 46-49.

20. Рехарский, М. В.; Гальченко, Г. Л.; "Термодинамика реакций гидролиза органических соединений, катализируемых ферментами" в сборнике 'Термодинамика органических соедшхеннй" (под ред. Гальченко, Г. Л) Изд-во Горьковского университета (1988) стр 29-30.

21. Rekharsky, M.V.; Egorov, A.M.; Bankovskaya, S.A.; Ozolina, R.K.; Vina, I.A Berzina-Berzite, R.K.; Lopatnev, S.V.; Galchenko, G.L.; "Microcalorimetr determination of substrate specificity of -L-asparagmase from E. coli and En carot."; J. Biochem. Biophys. Methods, 1988, 16, 319-322.

22. Rekharsky, M.V.; Rodionova, O.A.; Nemyklna, E.N.; Kharitonov, S.I.; Belyae S.V.; "Microcaiorimetric detection of sucrose admixture in glucose samples J. Biochem. Biophys. Methods, 1989, 19, 253-256.

23. Rekharsky, M.V.; "A simple microcaiorimetric analytical cell"; Thermochim. Act 1989, 156, 189-191.

24. Rekharsky, M.V.; Sikorenko, Y.B.; Politsa, E.N.; Belyaev, S.V.; "Microcalorimeti detection of L-asparagine and L-glutamine in solution using L-asparaginase fro E. coli"; Thermochim. Acta, 1989, 156, 193-195.

25. Рехарский, M. В.; Сикорешсо, Ю.Б.; Гальченко, Г. Л.; "Энтальпия реакпз ферментативного гидролиза К'-ащпнл-О, L-метиошта"; Ж. Физ. Химии, 198 63, 1403-1404.

26. Rekharsky, M.V.; Rodionova, О.A.; Tarasov, Y.I.; Mavrin, A.A.; Egorov, A.N Belyaev, S.V.; "Microcaiorimetric control of microbiological processes. I. Analytic detection of glucose and some other carbohydrates"; Thermochim. Acta, 1990, 17 239-244.

27. Rekharsky, M.V.; Rodionova, O.A.; Belyaev, S.V.; "Microcaiorimetric control microbiological processes. II. Analytical detection of the total concentration aminoacids"; Thermochim. Acta, 1990, 171, 245-252.

28. Тищешсо, С.А.; Рехарский, M. В.; Гальченко, Г. Л.; "Термохимическ определение активности щелочной фосфатазы"; Вестник Московскс университета, Серия 2(химия), 1991, 32, 531-533.

29. Рехарский, М. В.; Тшценко, С.А.; Гальченко, Г. Л.; "Энтальпия реакц гидролиза пара-нитрофосфата"; Вестник Московского университета, Сер 2<химия), 1991, 32, 460-463.

30. Rekharsky, M.V.; Nemykina, E.V.; Eliseev, A.A.; Yatsimirsky А.] "Thermodynamics of molecular recognition of nitrogen heterocycles. 1. Interact! of imidazole and imidazolium-cation with a- and fi-cyclodextrins"; Thennochi Acta, 1992, 202, 25-33.

31. Rekharsky, M.V.; Nemykina, E.V.; Erokhin, A.S.; "Thermochemistry of N-C boi hydrolysis in amides, peptides, N-acetyl amino acids and high-energy N-C boi hydrolysis in N-acetyl imidazole and urea"; Int. J. Biochem., 1992, 24, 861-867.

32. Rekharsky, M.V.; Belova, E.V.; Rumsh, L.D.; Egorov, A.M.; "Thermodynamics interaction of imidazole with nucleosides, monophosphates as well as with aroma amino acids"; Int. J. Biochem., 1992, 24, 1959-1965.

33. Rekharsky, M.V.; Schwarz, F.l\; Tcwari, Y.B.; Goldberg, R.N.; Tanaka, M.; Yamashoji, Y.; "A Thermodynamic and NMR Study of the Reactions of Cyclodextrins with Cyclohexane Derivatives"; J. Phys. Chem. 1994, 98, 4098-4103.

34. Rekharsky, M.V.; Schwarz, F.P.; Tewari, Y. B.; Goldberg, R.N.; "A Thermodynamic Study of the Reactions of Cyclodextrins with Primary and Secondary Aliphatic Alcohols, with D- and ¡--Phenylalanine, and with L-Phenyalanineamide"; J. Phys. Chem., 1994, 98, 10282-10288.

35.Rekharsky, M.V.; Egorov, A.M.; "Enzymes. Determination in Industrial Products"; Encyclopedia of Analytical Science (Editor-in-Chief: Professor Alan Townshend) vol. 2, pp. 1212-1216. Academic Press; London, f 995.

36.Tewari, Y.B.; Schantz, M.M.; Pandey, P.C.; Rekharsky, M.V.; Goldberg, R.N.; "Thermodynamics of the Hydrolysis of N-Acetyl-L-phenylalanine Ethyl Ester in Water and in Organic Solvents", J. Phys. Chem. 1995, 99, 1594-1601.

37.Rekharsky, M.V.; Goldberg, R.N.; Schwarz, F.P.; Tewari, Y.B.; Ross, P.D.; Yamashoji, Y.; Inoue, Y.; Thermodynamic and Nuclear Magnetic Resonance Study of the Interactions of a- and (3-cyclodextrin with Model Substances: Phenethylamine, Ephedrines, and Related Substances. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8830-8840.

38.Tewari, Y.B.; Schantz, M.M.; Rekharsky, M.V.; Goldberg, R.N.; "Thermodynamics of the hydrolysis of 3,4,5-trihydroxybenzoic acid propyl ester (n-propylgallate) (o 3,4,5-trihydroxybenzoic acid (gallic acid) and propan-l-ol in aqueous media and in toluene," J. Chem. Thermodyn., 1996, 28, 171-185.

39. Ross, P.D.; Rekharsky, M.V.; Thermodynamics of Hydrogen Bond and Hydrophobic Interactions in Cyclodextrin Complexes; Biophys. J. 1996, 71, 2144-2154

40.Rekharsky, M.V.; Mayhew, M.P.; Goldberg, R.N.; Ross, P.D.; Yamashoji, Y.; Inoue, Y.; A Thermodynamic and Nuclear Magnetic Resonance Study of the Reactions of a- and p-cyclodextrin with Acids, Aliphatic Amines, and Cyclic Alcohols. J.Phys.Chem. 1997, 101, 87-100

Книги

1. PexapcKirii, M. В.; Егоров, A. M.; "Термодинамика биотехнологичееких процессом"; Издательство Московского государствешгого университета, "Москва (1992) стр. 1-301.