Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль воды в термодинамике денатурации глобулярных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль воды в термодинамике денатурации глобулярных белков"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г О од

л ,. -..- На правах рукописи

1 '•< ¡-^а УДК 577.3

Хун Юанькай

РОЛЬ ВОДЫ В ТЕРМОДИНАМИКЕ ДЕНАТУРАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

03.00.02. -биофизика АВТОРЕФЕРАТ

диссертант* па сои^ание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва • 1998

Работ выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

док лор физико-математических наук, профессор В.И.Лобышев. Официальные оппоненты: доктор физико-математическ/ их наук,

Ю.М.П« грусевич кандид».т физико-матаматических наук, Н.Г.Есипова Ведущая организация: Инсти гут теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится "15"октября 1998 г. в "16-30" часов на ■заседании Дисссраадионтгого Совета N03 ОФТТ (К.053.77) в МГУ им.М.В.Лом;«посовано адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, аул."519".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослал "01" октября 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета N«3 ОФТТ(К.053.05.77) в МГУ

Общая характеристика работы

Актуальность теми

Как известно, белки являются участниками многих биологических процессов и выполняют разнообразные функции, обеспечивающие жизнедеятельности биологических систем. За последние год},; стало многое известно о структурной организации белковых молекул. Благодаря успехам рентге-поструктурного анализа мы имеем данные о координатах атомов полипептидной последовательности и молекул связанной воды для большого числа белков. Однако, и то время как пространственная структура белка может быть определена очень точно, конкретные физические механизмы, обеспечивающие температурную стабильность белков до копка не ясны. Многочисленные попытки расчетным путем установить закономерности стабилизации глобул известной структуры натпвного белка не привели к желаемой ясности, однако, они помогли осознать, что разрешить эту проблему нельзя б^ термодинамического исследования процесса структурной организации белка или обратного ему процесса денатурации под действием различных факторов, в том числе температуры. Изучение термодинамических характеристик тепловой денатурации белка дает информацию о внутримолекулярных взаимодействиях и о взаимодействиях биополимеров с водой, позволяет связать структуру белка, с его функционированием.

Среди обсуждаемых фактории, обеспечивающих стабильность нативных белковых глобул, наибольшие дискуссии вызывает связанная рода. Известно, что функционирование живых и даже модельных белковых систем невозможно в отсутствие воды. Это обусловлено тем, что вода играет важнейшую роль в организации и функционировании биополимеров. Все это определяет актуальность проблемы денатурации белков и необходимость выяснения конкретной роли воды в термостабильности биополимеров.

Самостоятельное значение имеют исследования, среди прочих глобулярных белков, поверхностного А-белка, образующего из мономерных субъеди-

ниц упорядоченную сеть на внешней оболочке мембран бактерий Леготопав 8а1тошас1а. Эти бактерии вызывают тяжелое заболевание у лососевых рыб, но не обладают вирулентностью в отсутствие оболочки поверхностного А -белка. Методами электронной микроскопии получены картины распределения А-белка на поверхности клетки. Он образует регулярные гексагональные или тетрагональные структуры, но принципы самосборки таких структур но обсуждаются из-за отсутствия термодинамических характеристик мономерного белка.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось установление закономерностей термодинамических параметров тепловой денатурации в ряду глобулярных белков с различной молекулярной массой и выявление вклада воды в исследуемые параметры.

Вклад в стабилизацию нативноя конформации белков взаимодействий типа биополимер - вода трудно отделить от вклада других внутримолекулярных взаимодействий. Эти затруднения можно решить методом изотопного замещения растворителя, т.е. заменой обычной воды на оксид дейтерия (£>2о). Ранее было обнаружено, что малые концентрации дейтерия (менее 1%) могут приводить к большим нелинейным эффектам в ряде биологических и модельных систем. Поскольку табличные значения физико-химических величин, в том числе термодинамических характеристик, в этой области концентраций отсутствуют, целесообразно провести исследование теплоемкости таких растворов. Это даст доио л п иге ль ну ю информацию для обсуждения механизмов обнаруженных нелинейных эффектов.

В задачу рабоаы входило:

- изучение теплоемкости смесей Н2О -ВгО в области малых концентраций дейтерия;

- исследование термодинамических характеристик тепловой денатурации глобулярных белков ( поверхностного А-белка, цитохрома, химотри-

псиногена) в Н2О, П2О, анализ изотопного эффектов;

- исследовапие тепловой денатурации белков в растворах с переменным изотопным составом;

- анализ днухцентровой модели изотопных эффектов в тепловой денатурации белков, выяснение роли воды в стабилизации нативного состояния белка.

- выяснение связи термодинамических характеристик тепловой денатурации глобулярных белков с их молекулярной массой, аминокислотным составом.

Научная новизна.

Методом микрокалориметрии впервые исследован поверхностный А - белок, образующий упорядоченную сеть на внешний поверхности бактерий Аеготопав за1тотас1а, получены термодинамические характеристики тепловой денатурации белка. Анализ термодинамических изотопных эффектов тяжелой воды в тепловой денатурации А-белка, цитохрома С, а- хи~ мотрипсиногена показал, что специфически связанная с биополимерами вода играет существенную роль в обеспечении стабильности их нативного состояния. Сравнение нелинейных экспериментальных зависимостей температуры денатурации белков от концентрации тяжелой воды в растворе с результатами модельных расчетов свидетельствует о предпочтительном связывании белком тяжелой веды и о наличии кооперативных эффектов при связывании воды.

Предложенный метод калибровки микрокалориметра позволил корректно измерить парциальную теплоемкость разбавленных растворов п:0 с содержанием дейтерия менее 1%. Показано, что теплоемкость таких растворов линейно связана с концентрацией дейтерия в воде. Полученный результат не допускает простого объяснения для наблюдаемых нелинейных биологических эффектов в живых и модельных системах в области очень малых концентраций дейтерия.

Практическая ценность.

Знание общих закономерностей изменения термостабильности белков и вклада растворителя - воды в измеряемые термодинамические параметры необходимо, т.к. увеличение термостабильности белков и ферментов диктуется рядом задач практической биотехнологии. Установленная роль воды должна учитываться в генно-инженерной технологии, направленной на стабилизацию белковых глобул. Найденные термодинамические характеристики поверхностного А-белка будут использоваться при создании физической модели взаимодействия белка с поверхностью клетки и образования на поверхности бактерий упорядоченных комплексов, обеспечивающих вирулентность Аеготопай Ба1тотасЗа и высокую толерантность к лекарственным препаратам. Полученные результаты будут способствовать также разработке методов борьбы с опасным заболеванием лососевых рыб, вызываемым бактериями А.за1тошас1а.

Предложенный метод калибровки микрокалориметра но известной зависимости теплоемкости растворов простых солей от их концентрации в растворе существенно расширяет возможности прибора в области больших тепловых эффектов, выявляет область нелинейности прибора ДАСМ-4 ц позволяет корректно измерять парциальную теплоемкость разбавленных растворов различных веществ, в том числе растворов ВгО с содержанием дейтерия менее 1%.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации докладывались на международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов 96" и "Ломоносов 97". Секция физики. ( Москва, МГУ, 1996, 1997). Основные результаты диссертации представлены в 4-х публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 94 страницах, содержит 30 рисунков, 6 таблиц, список литературы

из 31 наименования.

Содержание работы

Во введоиии обоснована актуальность темы, сформулированы пель и основные задачи работы.

В перрой главе представлен обзор литературных данных по теме диссертации. Изложены современные представлении о денатурации белков. Основное внимание уделено описанию элементарных механизмов изотопных эффектов состава воды. Подробно рассмотрена модель изотопного мф-фекта в среде с переменной концентрацией дейтерия, связывающая термодинамические параметры тепловой денатурации биополимеров с константами связывания воды.

В второй главе описана методика калибровки микрокалориметраДАСМ - 4 для измерения парциальной теплоемкости в растворах. Предложенный метод калибровки микрокалориметра по известной зависимости теплоемкости растворов простых солей от концентрации в растворе существенно расширяет возможности прибора в области больших тепловых эффектов, выявляет область нелинейности прибора ДАСМ - 4 и позволяет корректно измерять парциальную теплоемкость разбавленных растворов различных веществ. В связи с задачей интерпретации обнаруженных ранее эффектов активации живых организмов и модельных систем в растворах, содержащих малое количество дейтерия в водном растворе, измерена теплоемкость растворов £>2О с содержанием дейтерия менее 1%. Показано, что теплоемкость таких растворов линейно связана с концентрацией дейтерия в воде. Полученный результат не допускает простого объяснения для наблюдаемых нелинейных биологических эффектов в живых и модельных системах в области малых концентраций дейтерия.

В третьей главе описаны материалы и методы исследования. В работе были использованы глобулярные белки: поверхностный А-белок, а -химотрипсиноген, и гем-содержадций белок цитохром С. Поверхностный А

- белок, полученный из клеточной стенки бактерий Аеготопав 8а1тошас1а, окружает внешнюю поверхность бактериальной клетки, образуя непрерывную структуру гексагональной симметрии. Его функция до конца не известно, но известно, что его присутствие связано с инфицирующей способностью бактерий. А-белок является глобулярным белком с молекулярной массой 49 кД, содержит значительное ( до 30% ) количество гидрофобных аминокислот, что отличает его от других глобулярных белков. Изучение термодинамических характеристик тепловой денатурации белка дает информацию о внутримолекулярных взаимодействиях и взаимодействии с водой, позволяет связать структуру белка с принципами его самосборки на поверхности клетки. Исследованы также а-химотрипсиноген, полученный из поджелудочной железы позвоночных, и гем-содержахций белок: цитохром С, полученный из сердечных мышц позвоночных.

Описан метод сканирующей микрокалориметрии для регистрации малых тепловых эффектов, сопровождающих процесс денатурации белка при его нагревании, а также способы нахождения энтальпии, энтропии, температуры денатурации и парциальной теплоемкости. На рис.1 представлена типичная калориметрическая запись раствора белка и базовой линии с калибровочной тепловой меткой. Энтальпия денатурации определяется величиной площади под кривой теплопоглощения, нормированной на площадь под калибровочной меткой. Метод нахождения денатурационного скачка ДСр и температуры денатурации ясен из рисунка.

В четвертой главе описаны результаты калориметрических исследований глобулярных белков в обычной и тяжелой воде и проведен их анализ. Проведено систематическое исследование термодинамических характеристик процесса тепловой денатурации трех глобулярных белков. Обнаружено заметное повышение температуры денатурации А-Ьелка, цитохрома С, а-химотрипсиногена в о -¡о по сравнению с температурой денатурации этих белков в Л2О. Температура денатурации, как видно из рис.2 - 4, зависит от рН среды. В качестве оси абсцисс мы использовали величину измеренного

дСр(кЖ.то1)

161412-ю 8 6 420

30

40

50

60

70

"Т/С)

Рис.1. Типичная калориметрическая запись раствора белка и базовой линии с калибровочной тепловой меткой.

значения рН в Н2О и Д2О ■ Выбор такой координаты обеспечивает эквивалентность электростатического состояния белков в двух растворителях и позволяет пренебречь изотопным эффектом в диссоциации функциональных групп белка. Дальнейший анализ проводили в области рН, где зависимость температуры денатурации от рН раствора отсутсвует. Измеренные и рассчитанные величины термодинамических параметров тепловой денатурации белков представлены в таб.1.

Из приведенных данных видно, что как температура денатурации белков так и энтальпия денатурационного перехода белков ь й¡О выше, чем в Я2О. Полагая, что изотопный эффект, наблюдаемый в термодинамиче-

ских характеристиках перехода белка из нативного в денатурированное состояние, полностью определяется изменением свойств связанной воды при замене обычной воды на DjO можно найти количество молекул воды, существенных для стабилизации нативной молекулы белка.

Во льду молекулы воды связаны с соседями посредством 4- х водородных связей. При плавлении льда наблюдается значительный рост теплоемкости, что отражает появление дополнительных степеней свободы. Аналогично, специфически связанные с нативным белком молекулы воды приобретав ют дополнительные степени свободы при денатурации белка. Поэтому, для оценки количества специфически связанной с белком воды, существенной для его нативной структуры, необходимо сравнить величины изотопных эффектов в теплотах плавления льда и денатурации белка. Величина изотопного эффекта, наблюдаемого при измерении теплоты плавления льда составляет:

бАнлед = AHDi0 - Ани& ЯЗ.ЗкДЖ.

Теперь разделим разность теплот плавления белка в обычной и тяжелой воде на разность теплот плавления обычного и тяжелого льда:

SAH

n = —-

¡АНлед

Получим, что денатурационный переход в молекуле данного белка сопровождается плавлением около N молекул воды. Такая оценка дает следующее количество специфически связанной воды: с А-белком - 45, с а-химотрипсиногеном - 9, с дитохромом С - 12 молекул или соответственно 0.017; 0.006 и 0.017 г.воды/г.белка. Полученные цифры не следует сравнивать с числами гидратации, поскольку они характеризуют не саму гидратацию, а ее изменения.

Участие воды в процессе тепловой денатурации белков можно также проиллюстрировать на компенсационной зависимости Д S = f(AH), изображенной на рис.5. По мнению Ламри, зависимости такого типа характерны

Таблица 1. Характеристика термодинамических величин тепловой денатурации белков

белок А- аг-химотри- цитох- рибопук- лизо-

белок псиноген ром С леаза цим

М.М.(кД) 49 25 12.5 13.4 17.5

Т<1Н,0(°С) 38.6 61.8 . 78.4 61.3 74.2

рНарр 7.3 3.8 5.3 4.5 4.7

42.2 64.6 80.9 64.5 77.4

Д т(°с) 3.6 2.8 2.5 3.2 3.2

1000 735 450 614 630

(МЛ \rnol> ±13 ±3 ±1

&НП2о 1150 765 490 635 630

(Щ ±6 ±4 ±2

¿д я 150 30 40 21 0

(Щ \rnnl! ± 14 ± 5 ± 2

ДСр(н20) 44.1 14.3 7.3 5.1 8.1

( " ) V Ктп о! 1 ± 3.0 ±1.0 ±1.0

ДСр(К20) 46.8 15.5 8.7 - -

/ и \ \K-moV ±5.0 ±1.0 ±2.0

для белковых реакций и говорят об участии воды в этих процессах. Действительно, термодинамические величины, принадлежащие плавлению белков и плавлению льда лежат на одной примой. Из рисунка наглядно видно, что расстояние между точками для одного белка в НуО и £>гО на этой прямой пропорционально количеству молекул воды, вовлеченных в процесс денатурации.

Если верна точка зрения о воде, как причине изотопного эффекта в теплоустойчивости белков, то в отсутствие фракционирования (предпочтительного связывания), температура денатурации белка в смесях Н2О —О^О должна увеличиваться линейно с ростом концентрации дейтерия. Ожидаемое преимущественное связывание тяжелой воды, очевидно, должно привести к более быстрому увеличению температуры денатурации в области малых концентраций тяжелой воды.

43 42 41 40 39 38 37 36 35

ТЧ(вС)

8

66

64

62

60

58

ТсК°С)

—|РНарр 10

фН.

1.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

Рис.2. Зависимость температуры Рис.3. Зависимость температуры денатурации Т от рНизм. при денатурации Т от р#изм. при

термоденатурации растворов термоденатурации растворов

А-белка в буфере: 1 -н20 2 -п20

а-химотрипсиногепа в буфере:

1 - н2о 2-П20

81 80 79 78 77 76 75

71

та(°с)

дЗ(э.е)

т

400

5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

1 1 ■ 1—■—1 ■ |—■—|—■—1 5 400 600 800 1000 1200 1400

ДН(Ы/Мо|)

Рис:4. Зависимость температуры Рис.5. Связь энтропии и энтальпии

денатурации Т от рНизм. при процессов денатурации белков:

термоденатурации растворов 1.А-белок, 2. а-химотрипсиноген,

ци-гохрома С в буфере: 3. цитохром С и 4. лед.

1 - н20 1-ого 1 — 4: н20 1'-4':П20

Действительно, соответсвующие экспериментальные зависимости характеризуются выпуклой формой, а в случае А-белка эта зависимость имеет слабовыраженную Б-образную форму. Как было сказано ранее, выпуклые кривые зависимости температуры денатурации от концентрации дейтерия в воде можно описать математической моделью, содержащий 2 центра гидратации. Рассмотренная модель, однако, была несимметричной и не учитывала возможности разной последовательности заполнения центра связывания протонами и дейтронами. Учет такой возможности приводит к следующей схеме:

р +н ( *г , рн + Я (*т , plli t zh2

р + я ( *i , рн + d phd ju zhd

р + d [ *з ) pd + Я phd f h ; zhd

р + d ( h , pjd + d ( ь> , pd2 ( ) zd2

где Р - концентрация негидратированных центров белка, PL2 - концентрация гидратированных центров (L=H, D) Zhi - концентрация гидратированных центров денатурированного белка.

H, D - концентрация ОН и 0D групп в воде

кз, ку, кд, к\\, ki2 - обратные константы связывания (константы диссоциации)

— у/к2 * - константы равновесия процесса денатурации, включающие экспериментально определяемые энтальпию и температуру денатурации белка в н^о и d20. Для такой системы получаем решение в виде квадратного уравнения:

Х2[(1 - к2) + в(1 - kt) - ф(1 - *,)]-

'■где,

. .... ■ ^ 7 к} ■ к 7 к 7

а = -, =--1--

кз ■ кд ¿3 - Ац Л12

Как и предполагалось, решение для этой схемы совпадает с предыдущим, различаясь лишь небольшой поправкой в виде второго слагаемого в коэффициенте ф.

На рис.6 - 8. представлены результаты эксперимента и расчетов при надлежащем выборе параметров а яр. Видно, что экспериментальные результаты хорошо описываются предложенной моделью. Величины параметров для ряда исследованных белков и известных из литературы приведены ниже:

Таблица 2. Параметры а и р для различных белков.

белок а р

А - белок 13 10.5

а-химотрипсиноген 9 7

цитохром С 9.5 7.6

рибонуклеаза 20 16

лизоцим 28 22

Видно, что во всех случаях а, р »1, следовательно константа связывания СЮ групп больше константы связывания ОН групп. Полученные оценочные значения констант соответствуют квантово-механической природе изотопных эффектов дейтерия и не превосходят их теоретического предела для ОН групп. Различие величин а ж /3 свидетельствует о проявлении коонера-тивных эффектов при связывании. Поскольку из эксперимента невозможно найти значения всех констант (¡¿, находить наилучшее приближение для а ж р с высокой точностью нецелесообразно, т.к. построение точной физической модели связывания воды белком с учетом всех степеней свободы весьма проблематично, а сравнение с экспериментом неоднозначно.

Отметим также, что в модели рассматриваются специфически связанные белком молекулы воды, с изменяющимся числом степеней свободы при

Рис.6 Зависимость температуры денатурации а-химотрипсиногена от объемной доли £>20 в растворе при значениях параметров: а = 9 ¡3=7

Рис.7 Зависимость температуры денатурации цитохрома С от объемной доли Э^О в растворе при значениях параметров: а = 9.5 /3 = 7.6

Рис.8 Зависимость температуры денатурации А-белкаот объемной доли Б^О в растворе при значениях параметров: а = 13 /3 = 10.5

денатуранионном переходе и поэтому существенных для стабилизации нативного биополимера. Большинство связанных молекул воды, образующих с белком лишь одну водородную связь, не меняю своих характеристик при денатурации и не являются существенными для термодинамических свойств нативного белка.

Используя полученные экспериментально термодинамические величины, можно найти зависимость свободной энергии Гиббса от температуры:

Аа(т) = .ДЯ(Г) - Г • Д5(Т)

= дя(г<0 • - аср • - г)

+д ср-т -1п — v Г

Сооиетствуюгцая зависимость для А-белка приведена на рис.9. При температуре, равной температуре денатурации величина ДС? =0. О понижением температуры термодинамическая устойчивость белка растет и достигаг ет максимума при температуре около 20°С . Для всех трех белков температура, соответствующая максимальной устойчивости нативного биополимера, выше в Л 2О, как и температура денатурации. При комнатной температуре А-белок более стабилен в Б^О, что может иметь значение в решении практических задач. В других белках наблюдается уменьшение устойчивости ъ Б2О при комнатной температуре. Характер температурной зависимости свободной энергии Гиббса указывает на возможность наблюдения холодовой денатурации в Б2О при отрицательных температурах близких к О "С.

Рассмотрим аминокислотный состав белков и проанализируем возможную связь между содержанием гидрофобных аминокислот и скачком теплоемкости Аср белка при денатурации. За меру гидрофобности белка примем суммарный по всем аминокислотам индекс гидрофобности по Тэнфорду. На рис.10 представлена связь между индексом гидрофобности ряда глобулярных белков и скачком теплоемкости. Полученная зависимость линейна,

дС(ки/то|)

30 40 50 20 40 ■ ДСр(Ы/К.то1)

Рис.9 Температурная зависимость Рис.10 Связь индекса гидро-

свободной энергии Гиббса денатурации А-белка в растворе: 1 -н20 2 -т)го

50ДСр(ки/К.то1)

40-

фобности Н1 белков: рибонук-леазы, лизоцима, миоглобина и А-белка со скачком теплоемкости при денатурации

30-

20-

10-

J МУУ(кЭ) 10 20 30 40 50 Рис.11 Зависимость денатурациоппого скачка теплоемкости от молекулярного веса белков: ингибитор трипсина, рибонуклеаза, лизоцим, миогло-бин, лизоцим, ^-трипсин, а- химотрипсин, цитохром С, а-химотрипсиноген, А-белок.

что позволяет заключить, что скачок теплоемкости связан с выходам на поверхность определенной доли гидрофобных аминокислот, не зависящей от деталей строения белка.

Известно, что величина денатурадионного скачка теплоемкости ДСр зависит от молекулярного веса М белка и может быть выражена многочленом:

А Ср = ао + * М + аг* М2 +

где, а0=0.7, «1=0.11, «2=0.02, а1=-0.1340_3,

Соответствующая зависимость для множества исследованных глобулярных белков, включая А-белок представлена на рис.11. Видно, что А-белок, обладающий большим количеством гидрофобных аминокислотных остатков принадлежит семейству других глобулярных белков и обладает идентичными характеристиками денатурационных переходов, связанных, пови-димому, с соотношением объем - поверхность.

Основные результаты и выводы.

1. Впервые измерены термодинамические характеристики тепловой денатурации поверхностного клеточного А-белка из Аеготопаз за1тошас1а.

2. Теплоемкость разбавленных растворов в20 в области менее 1% линейно зависит от концентрации дейтерия и не может быть объяснить причиной наблюдаемые нелинейные биологические эффекты.

3. Для А-белка, цитохрома С, а-химотрипсиногена показано увеличение температуры денатурации в растворах Б20 по сравнению с растворами Н20 при одинаковом заряде макромолекул.

4. Существенную роль в стабилизации нативного состояния исследованных белков играет специфически связанная с биополимерами вода.

5. Сравнение нелинейных экспериментальных зависимостей температуры денатурации белков от концентрации тяжелой воды в растворе с результатами модельных рассчетов свидетельствует о предпочтительном связыванием белком тяжелой воды и о наличии кооперативных эффектов при заполнении двух центров.

Основные результаты работы изложены в следующих

публикациях:

1. Хун Юанькай. Термодинамика денатурации поверхностного клеточного белка. // Международная конференция студентов и апирантов по физическим наукам " Ломоносова 96". Секция физики. Сборник тезисов. Физический факультет МГУ, 1996, с. 192.

2. Хун Юанькай. Использование сканирующего микрокалориметра для определения парциальной теплоемкости раствора. // Международная конференция студентов и апирантов по физическим наукам "Ломоносова 97". Секция физики. Сборник тезисов. Физический факультет МГУ, 1997, с. 170.

3. Хун Юанькай, Лобышев В.И. Измерение теплоемкости смесей #20 — D2O с помощью сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4.// Биофизика, 1998, т.43, вып.2, с.365.

4. Хун Юанькай, Лобышев В.И., С.Эль Карадаги. Исследование клеточного поверхностного А-белка из Aeromonas salmonicida методом сканирующего микрокалориметрии.// Биофозика, 1998 (в печати).

Отпечатано в фото множительной мастерской Геологического факультета МГУ тир. 100 j-j л&ч