Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разворачивание "расплавленной глобулы" как фазовый переход первого рода

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разворачивание "расплавленной глобулы" как фазовый переход первого рода"

, 1 Г5

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

УВЕРСКИй Владимир Николаевич

УДК 577.322

РАЗВОРАЧИВАНИЕ "РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ" КАК ФАЗОВЫЙ ПЕРЕХОД ПЕРВОГО РОДА

03.00.02 - Биофизика

Авторе 1юрят диссертации на сонскшшо учепой степени кандидата физико-матэматических наук

Москва - 1991

"/■¿.О

Работа выполнена в Института белка АН СССР

Научные руководители - доктор (Лизико-математических наук,

профассор О.Б.Птицын;

кандидат физико-математических каук, старший научный сотрудник Г.В.Семисотнов

Официальнао оппоненты - доктор физико-математических наук,

член-корреспондент АН СССР, профессор

A.. Р. Хохлов

доктор физико-математических 1! ук,

B. И.Иванов

Вэдувдя организация - Институт молекулярной

генетики АН СССР

¿0

Защита состоится ^СКйОрЛ 1991 г. в часов на

заседании Специализированного ученого совета К.063.91.10 при МФТИ по адресу: 141700, г.Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 9, Московский физико-технический институт.

С диссертацией мсхно ознакомиться в ОиОлпотекм Московского физико-технического института.

Авторефераг разослан 1991

Учений се1фетарь Совета -'

года.

кандидат физико-математических _'"'Т.1 /Б.Б.Киревв/

наук ^

карта ^

М-..:.' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА рльоти

Огдол _ !

Акт^альность_темил "Расплавленная глобула" - это термодинамически стабильное промежуточное состояние, обнарукешюе при мультипараметрическом исследовании денатурации глобулярных бел-нов. Известно, что белковал молекула, находящаяся в состоянии "расплавленной глобулы", обладает фнзико-хи\«чссккми свойствами, являющимися промежуточными между свойствам! полилоптадной цепи в натиыгай и полностью неупорядоченной (клубкосбразной) конфор-мзциях. Извостно такжо, что ронатурацил белковых молекул из клубкообрязного состояния часто проходит через формирование кинетического промежуточного состоишь, обладающего свойствами "расплавленной глобулы" (компактность, близкая к ьативной; наличие выраженной вторичной структуры; отсутсвно жесткой упаковки боковых групп). Этот факт свидетельствует в пользу того, что "расплавленная глобула" является универсальным интермедиатом на пуги сжооргага'защш белковых молекул. Получены также данные, свидетельствующие с том, что именно состояние "распллвленнной глобулы" является компетентшм к связыванию с оелкамл-шапэронами (типа белка СгоЕЬ), способствующими сборке олигомерных структур и транслокацки (секреции) белков через мембраны. Все изложенное выше обусловливает интерес к изучению структурных и термодинамических свойств этого IГромовуточного состояния глобулярных белков.

УЗЛЬ-Евботи. Извостно, что "расплавленная глобула" отделена от натишого состояния фазовым переходом первого рода. Но вопрос о природе перехода из такого промежуточного состояния в клубкообразное все еще оставался открытым. Цель данной работ состояла в получении ответа на этот встГрос.

Научнаяновнзнаи.ПЕзктотеская_знзчиыостьл 0 использованием мультипараметрического подхода в настоящей работе показало, что при равновесном разворачивании глобулярных белков (кербоангидрзз В из эритроцитов крови человека и коровы и р-лактамазы из 31ар/1у1осассии сштеил)сильными дснатурантами нэ обнаруживается накопления каких-лиЗс промежуточных состояний, отличающихся по своим свойствам от "расплазлешюй глобулы". В частности, при этом не аккумулируются ни компактные копформавди, лишенные вторичной структури, К! некомпактше промежуточные состоят^!,

- г -

обладающие выраженной вторичной структурой. Более того, были обнаружены такие экспериментальные условия, при которых удалось получить бимодальное распределение продуктов высоко эффективной хроматографии я области денатурационного перехода "расплавленная глобула" - клубок. - Эта данные позволили сделать вывод, что процесс равновесного разворачивания "расплавленной глобулы" являйся фазовым переходом первого роба и, таким образом, это промежуточное состояние можно считать стОелъыил терЛ'Эдина-лшческим состоянием.

Обнаружение этого явления указывает, что белковая яолещла может натобшъел в трех фазовых состояниях - натнвнол, "расплавленной глсбулы" и полнеешь» развср1утол, подобном соответственно крюясилииескому, хиВкояу и газообразному состояниям обычных нызкомолеиулярныт вацеааб.

Агшробацая_работи. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме "Сворачивание и самосборка белков", Ньюкасл-иа-Тайне (Англия), 1990; на Международной школе-семинаро "Соврэмешшв проблемы физической химии макромолекул", Пущино (СССР), 1991; на УШ-ой Международной конференции молодух ученых по органической и биоорганической химии, Рига (Латвия), 1991.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Сщуктура_и_объеи_работу± Диссертационная работа изложена на М® страницах машинописного текста и содержат слздуши? разделы: Введение, Лшерсвиурсый сбзор (посвящои экспериментальным подходам к исследованию де- и ренатуроции глобулярных белков; свойствам термодинамически стабильных промежуточных состоять типа "расплавленной глобулы"; существующим модолям сворвчива.чия и влиянию изомеризации пролиповых остатков на скорость ронатурации глобулярных болков). катерюин и жотоОы (подробно рассмотрен, в частности, новый методический подход, позволяющий легко фиксировать накопление "расплавленной глсбулы" как гфи равновесном, так и при кинетическом исследовании до- и ренатура-ции белков - по изменению сродства гидрофобного флуоресцирующего зонда АНС к полипептидной цепи), Результат и сосуждзнш>, Выводы. Материал иллюстрирован (¿таблицами и 46 рисунками. Библиографический указатель включает 220 цитированных работ.

РЕаУЛЪТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1л _?№?МТ§Р?стики ._90р19юмя_ГР9Рплавле1той___ глобулы"

й^а^г^^-лактаиазыикарбад^

В качества объектов исследования были вибранн три 0>}лка. В двух из них, в карбоангидразе В корози-и Ь'.ш-теиз ^-лактамазн, ранее было обнаружено состоянии "расплавленная глобула". Что касается третьего белка, харбоангидразы В человека, гомологичной карбоангидразе В коровы, то имелись лишь предварительные дашше по несовпадению денатурациошшх перзходов, тестируемых по изменению эллиптичности в дальней и ближней У1> областях с унел1чнием концентрации гуанидингидрохлорида.

На Рис.1 - 2 в качестве примера приведены спектральные характеристики карбоангидразы В коровы в трех равновесных конформнциоиных состояниях: нативном, полностью развернутом и в состоянии "расплавленной глобулы". Спектры КД в области поглощения ароматических грут1 (Рис.1.А.) близки для обоих денатурированных состояния и сущоствешю отличаются от спектра нативного состояния белка, что указывает на отсутствие в них жесткого окружения ароматических групп.

191

развернутого Оолха (8.В м мочевины).

Рис.1. Саактрь: кругового дихроизма карбоангидразы В коровы: А - в области поглощения ароматических групп; В - в области поглощения пептидных свя-

г( ттс. •

бежа (0.1 М т-Р рН 7.5); (2) ■ белка, находящегося в состоянии "рзсплввлэшгоП глобули" (рН н.6);

в состоянии "р: глобули" (рН И

1И но к, ГМ Щ 840 1,1

(пт)

Вместе с том, оелок в состоянии "расплавленная глобула" сохраняет выраженную вторичную структуру,что видно из спектров КД в области поглощения пептидных связей (Рип.1В) и утрачивает ^э только при полном разворачивании болка.

Из спектров 1Н-НМР можно получать усредненную информацию о жесткости окружения определенного типа белковых групп. На Рис.2 представлены спектры 1Н-ЯМР карбзангидразн В коровы в нативнем состоянии (рН 7.6 - по показаниям рН метра раствора белка в Г.цО), полностью развернутом 8.8 М мочевиной и е состояииии

Рис.2. Спектри Н-ЯМР кар-боонгидразы В корови: (1) нативноо состояние (РН 7.5);

(3) - состояние "расплавленной глобулы" (ри 3.6); (?.) - клубкообразное состоять (8.8 M мочевины). Заштрихована ьысокополышя часть спектра. Сигналы, изменение которых при денатурации было проанализировано, указаны стрелками.

7 '' 3 г 1 о рргг, Из Рис.2 видно, что спектр 1ПЯМГ натнгноП корбоапгидразы В типичен для обычных глобулярных белков и содержит иного сигналов но всем области химических сдвигов, не наблюдаемых в смеси аминокислот или в кдубкообразнпх конформациях белков. При переходе белка в состояние "расплавленная глобула" происходят существенные изминэшш в спектре 1Н-Ш\- значительно уволпчпваюя интенсивность рчда сигналов протонов боковых групп, о количество резонансных лш^'Л резко уменьшается. Это свидетельствует об уме-пьшепи:' ьелитлны хшятскпх. сдвигов сигналов протонов, что мок^т быть съчзако с умоиыкшием ьзпшолейсишя мокчу боковыми группами и с уквлгоэсиием га внутримолекулярной подвижности, т.е. с нарушенном 1-х здсткой уликомы. Следовательно, б состошшн "рас~

"расплавленная глобула" (рН 3.6).

плавленная глобула" (как и в клубкообрэзном состоянии) многие боковые группы белка, включая ароматические, утрачивают свое специфическое жесткое окружение.

Приведенные выше данные характерны для состояния "расплавленная глобула" и в других белках. С другой стороны, молекулы всех трех белков при переходе в состояние "расплавленной глобулы" остаются почти столь же компактными (глобулярными), как и в нэтивной конформации. К примеру, значения характеристической вязкости, отражающей размеры белковой молекулы, для карбоангкдрази В короЕЫ в нагишом состоянии (рН 7.5), состоянии "расплавленной глобулы" (рН 3.3) и полностью разЕерн"том СССТОЯ1ИИ (рН 7.5, 8.в М мочевгагы) равны соответственно - 4.1 см3/г; 4.2 см3/г; и 26.1 см3/г. Аналогочная картина наблюдается и при кспользовагага других физико-химических методов, чувствительных к компактности полгатеитпдпой цепи бежа.

2л_йенатп!Л1®от^ые перехода

. На Рис.3 приведет результаты исследования разворачивания карбоангидразы В коровы мочевиной в тяжелой воде

(DaO).

7 »

Urea concor,tranon (M)

Fi!c.3. Кзмене'иэ структурах характеристик карбоангидразы В коровы :гри равновесной денатурации мочевиной. В спектре 1H-fiMP: ( » ) - уменьшение площади .под высог.ополышми сигна-"лами; ( о ) - увеличений интенсивности сигналоп аро-матичосюя боковых групп; (-f ) - увеличение интенсивности сигналов алифатических боковых групп. В споктрах КД: С «я ) -[О]270; (а) - CGJ^ao- л

ТЫСТЭ ( 0 ) - 1/Р и гголож.э-1Ш0 масимума флуоресцэнтги-Ы D„0. 0.1 Н .7а- Р, pH 7.5.

измеренное по пз.мзнегаю птотошшх сигналов в сгскгру Ячл-

ка (см. Рис.2), слоктроп Kpyroscro дихроизма (см. Р/c.l) и сч'рд-

- б -

тной величины поляризации собственной флуоресценции (I/P). Видно, что изменения всех исследованных, параметров сгруппировались в виде двух усредненных кривых переходов (см. Рис.з),что подчеркивает двухстадийность разворачивания карбоангидразы В ксровы. Так, параметры, отражающие жесткость структуры белка (а именно, площадь под высокополышми сигналами в спектре 1Н-НМР, интенсивность ряда прстоиних сигналов алифатических боковых групп, амплитуда спектра кругового дихроизма в области поглощения ароматических боковых групп белка), начинают заметно меняться при меннчих концентрациях денатурата, чем параметры, отражающие наличие компактности (например, степень поляризации флуоресценции триптофановых остатков) и вторичной структуры (амплитуда спектра КД в области поглощении пептидных групп белка).

Также в две стадии протекает процесс равновесной денатурации S.aureus (Э-лактамазы мочевиной и Cu-HCl, карбоангидраз В ко-

Рис.4. Мультипараметрическое исследование разворачивания S.aureus р-лактамазы гуанидингидрохлоридом.

(A) - Изменошо профилей элюции iTl/J;

(B) - Изменение структурных характеристик белка: первая кривая описывает изменение ело дующих параметров: (о) - уменьшение эллиптичности поглощения на 27о им; ( + ) -уменьшение энзиматичеокой активности. Вторая кривая -уменьшения эллиптичности поглощения на '¿20 нм - ( *> ); уменьшение объема элшии ь профилях t'1'I.C - (ы).

рош и человека гуапидин-г.лоридом. Б качестве примера на Рис.4 приведены результата исследования равновесного разворачизания 6-лактамазн гуаниднк-гкдрохлоридом. Рис.4Л представляет происходящее при этом изменение профилей эллции РГЬС, отражающих изменение компактности белковой молекулы. Видно, что денатурация данного белка приводи1 к плавному изменению ооьема элюции единственного пика по мере увеличения концентрации денатуранта (соответствующие ззючс-чпя объемов з зависимости от концентрации гуаниднк-хлорнда приведены на рис.ЛЬ). (Этот факт указывает на то, что в денатурационном переходе "расплавленная глобула" ■клубок скорость обмена между состояниями чрезвычайно велика.) Из Рис.4А видно, что как и в предыдущем случае, первая стадия разворачивания белковой молекулы характеризуется резким (в интервале от 0.3 до 0.8 М Си-НСХ) уменьшен..ем амплитуды спектра КД в области поглощения ароматических групп и исчезновением энзиматической активности, отражающие уменыиенеие жесткости структуры белка, другими словами, переход молекулы в состояние "расплавленной глобулы". Вместе с тем, заметное увеличение размеров белковой молекулы (уменьаоние компактности), тестируемое по изменению объема'элюции Р?ЬС) и уменьшение содержание вторичной структуры, происходят при существенно больших концентрациях денатуранта.

Образовашге промежуточного состояния "расплавлншач глобула" приводит к большей эксггонирсвашюсти гидр^юбного ядра мо«. .'кулы на растворитель и легко тестирует«- связыванием гидрофобного флуоресцирующего зонда АНС (1-аншшно-нафталене-8-сульфоната). На Рис.Ь представлено изменение сродства АНС к молекуле белка при разворачивании карбоангидраз В и р-лактамазы гуанищш-гидрохлоркдом (Рис.ГзВ) или изменением рК раствора (Рис.5А). Ьлагодаря сильному сродству АНС к компактному, но без жестко;! упаковки боковых групп, промежуточному состоянию Сзлк;1 (т.е. с доступным раствори гелю гидрофобным ядром), интенсивность флуоресценции ЛИС увеличиваемся по мере увеличения относительней концентрации такого промежуточного состояния при росте концинтрации денатуранта (или изменения р!1 раствора). а затем по мере перехода этого состояния в клубкоебразное уменьшается. Это позволяет достаточно легко определить область концентрации денатуранта (значения. р1 Г), при которых накапливается

рН в^-НО. сопсчоЕгаПоп (М)

Рис.5. Изменение интенсивности флуоресценции на Я=480 им: 250 свободного ЛНС ( о ) и в присутствии БКАВ ( © ), Ч1САВ (ф) и р-лактамазы из Б.сшгеиз при уменьшении рН (Л) и увеличении концентрации гуенидин-хлорида (В) (ез ).

промежуточное состоят» типа "расплавленная глобула".

При мультипарнметрическом исследовании разворачивания "чистого" промежуточного состояния, которое в карбоангидрззо В коровы реализуется прл рН 3.6, в качестве денатуранта с ла использована мочевина. Оказалось, что в этом случае изменштя тают параметров, как величина характеристической вязкости, обратная величина поляризации флуоресценции триптофановых остатков, положение максимума спектра их флуоресценции и амплитуда спектров кругового дихроизма в пептидной области.

( I-

Г*

Л - ■

Л

О 1

1 дао

Рис.6. изнш'вниэ структурных параметров пои равновесном разворачивании состояния "расплавленной глобулы" (гН 3.6, ЬКАВ) мочевиной. (л) - умекы;;еш'.е эллиптичности пог.вдеши: на 220 км; ( о ) - увеличите .чарчкте-ркстическсй вязкости л (о ) -величина 1/Р; (в ) - уменьшение отношения /I.,в спектре

3^.-0 зоь г

флуоресценции Селка.

-ийо с:.г-с&п;га(1с*1

происходят одновременно, т.е. наблюдается только одна стадия изменения эти структурных параметров (Рис.6.).

Следовательно, при равновесном разворачивании таких глобулярных белков, как карбоангидразы В из эритроцитов человека и коровы и р-лактамазы из Staphylococcu3 аигеия сильными денату-рантами изменения большого количества исследуемых структурных параметров описываются только двумя денатурацношшми процессами: 1 ) переходом из наганного состояния в состоят!') "расплавленной глобула" и 2) переходом из состояния "расплаолеыгай ^лобулы" п клубкообразное. Иными словами, при равновесной разворачивании этих глобулярных белков не обнаруживается накопления кьких-либо проиехуточш^х состояния (иеяду иативним и полностью развер1гугим состсягаяии), которые отличались бы по своим свойствам or состояния "расплавленной глобулы". Очевидно, что этот факт является перзим указанием на то, что переход из состояния "расплавленной глобулы" в клубкообразное мокет быть переходом "все-или-ничего", т.о. фазовым переходом первого рода.

Зл_йеН2Т2231йоннуи_переходы_при ja3Bopa4Mbijmj_Kap6caijra^yasu и_(3-льктаыпзн из_ Ç.fM^Ç'^ профилей_эхлцл_1_УР1,С белков„в_областн_перехода " р а с пл в ш; е ! п i а яг л о(5 у jj îj " _ - ^ клу бок.

4to0i получит!, более прямую информации о наличии только двух конформацконных состояний белка в области порохода из состояния "расплавленной глобулы" в клубкообразное ш непользовали метод высокоэффективной колоночной хроматограф:™ (PPLC), который, в принципе, позволяет разделить компактные и развер-нутио молекулы, о ели скорость обмена мйж.чу этими конформоциоп-HUîîn состояниями достаточно низка по сравнении со скоростью хрчоматогрэфического процесса, ь'олое того. к^алтазся в пади'ша ф:!р:.<енныр коло*юч!ые носителя обладает вмссксЯ лчуячоскоЯ а iresofjii'iocKOit устсй'гл>'ссть»;, что позволяв? ycaesuîo игмо."Ьзоьауь PPLC для исследования щхщоосов до- и реяа-i уршри глэбуляршх белков как сильными денатуралтаки, так и экстремаль;:!.'^,! ьнэче1г:1я:л1 pli среди.

Клквтнчвскго хрсматогряфические иезлодовошш прэцэосэ

разворачивания (сворзчивания) белкой при комнатной температуре показании, что скорость обмена между состоянием "расплавленной глобулы" и клубком велика пс сравнению со скоростью хроматографического процесса. С целью замедления скорости этого обмена температура била понижена до 4°С. Оказалось, что только при использовании Си-Н01 в качестве денатуранта при нейтралышх значениях рН процессы обмона замедляются достаточно сильно для того, чтобы возможные состояния, возиикакчдие при равновесной денатурации, OЫJШ разделены с помощью хроматографии.

Естественно, что с целью получения информации о процессе денатурации при этих условиях было проведено мультипараметои-часкоо исследованиэ процесса равновесной денатурации кэрбоангид-

Рис/1. йаменеюю структурных характеристик карбоангидраои В коровы при равновесном разворачивании белка гуаиид.ш-тид-рох.торпдом при 4°С:

(Л) - ( о ) - уменьшение онзчматической активности белка; ( » ) - умоньшение эллиптичности поглощения на 270 1м; (15) - ( « ) - изменение интенсивности флуоресценции Л110; (С) - спектры К.Ц в блыскей УФ области; (Р) - схюктрт КД в дальний УФ области.

J

разы в коровы и р-лактамазы из з.аигешз гуа:идшьпуфохлорвдом в нейтральных рН при 4°С.

В качестве примера на Рис.7 приведены суммированные результата, полученные при исследовании равновесного разворачи-взния карбознгидразы В коровы. Видно что при 4°С процесс денатурации белка качественно похок на наблюдаемый при комнатной температуре (см., например. Рис. 3 - 4). К а первой стадии разворачивания, заканчивающейся к 1.5 М Си-ЛС! (см.Рис.УА), происходит изменение физико-химических параметров, отражающих разрушение жесткой третичной структуры бедовой молеку.гси -исчезновение энзимэтической активности и уменьшение амплитуды спектров кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области. Из Рис.70 видно, что спектр КД в ароматической области при 1.5 М Си-НС] ведома близок к спектру полностью раззернугого белка. В тоже время, пептидная область спектра КД в аналогичных условиях весьма близка к спектру ьативного белка (cm.Piic.7D). Иными слезами, белок переходит в промежуточное состояния, обладающее выраженной вторичной структурой, но утерявшее жесткую упаковку Соковых групп. Это промежуточное состояние обладает высоким сродством к гидрофобному флуоресцирующему зонду АНС (см.Рис.7В), а также имеет спектр 'н-ЯМР, характерный для белковой молекулы в состоянии "расплавленной глобулы".

Аналогичные результаты были получены и для р-лактамязн из З.аигеиз. Имеющиеся экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что при равновесои разворачивании этих белков Си-КС1 при 41}С не наблюдаются вроиеяуточ'ше териодинакически стабильнее состояния, которые отличались Си по своим свойствам от состояния "расплавленной глобулы". .

Как у:хе отмечалось выше, при дашшх экспериментальны.': условиях обмен между состояниями в переходе "расплавленная глобула" - клубок достаточно замедленен для того, чтоби использовать РРЬС. Профили глюции, получоште при исследовании разворачивания карбоангидразы В гуониднн-тилрохлорпдом в этих условиях приведены на Рис.вА.

Видно, что процесс перехода из нативного состояния в состояние "расплавленной глобулы" не сопровождается заметным изменением размеров молекулы (объема элпцил в области от О Ч до 1.2 М Си-НС!), в то время, иск при дальнейшем увеличении

концентрации гуамадъч-гидрохлорвда наблвдается бимодалъность профилей элхшга (см. Гис.8.А.). Причем, полол.е:ше второго пика, отвечающего Солее компактному состоянию, практически совпадает с положением гаша нзтивного белка и не меняется на всем протяжении дензтурациопного перехода. Ьместе с тем, положение первого пика меняется очень сильно. Это сгэдетельствует о том, что в переходе "расплавленная глооула" - клубок существуют две медленно обмею'.е.'щ;;::еся популяции молекул белка. Первую составляют белковые молекулы, чей объем элюции, а, значит, и гидродинамические размеры, весьма близок к соответствующим

Рис. 8. Исследование разворачивания карбоангидразн В коровы гуа-нидин-гидрохлоридом при 4°0:

А - Изменение профилей элюции í'PLC 1фи увелпчешш концентрации депатуранта в растворе

В - Изменение структурных характеристик белка: (а ) - уменьшение эизиматической активности боша; ( о ) - уменьшение эллиптичности поглощения на 270 >ш; (о ) - увеличение относительной площади под пиком, соответствую1!!™ менее компактному состоянию (по данным FPLC) при росте концентрации денатуранта.

Во врезке приведени споктрц 1(Д в дальней УФ области.

величинам, хярактеризупцим нативноо состояние. В то же время во вторую группу входят существенно менее компактные молекулы, объем элюшш которых сильно зависит от концентращш делятурактя.

Аналох'ичгшй результат был получен такке для разворачипания р-лактамазн гуашщин-гидрохлоридом при 4°0. Видно, что и в этом

случае можно выделить такую область концентраций гуанидин-гидрохлоридэ, где полностью отсутствует нативное состояние (см. Рис.ЭВ). Как видно из профнлэй эллюции (см. Рис.ЭА) в этих условиях (т.е. в области денатурации, где отсутствуют нативные молекулы) также наблщвется бимодальное распределение продуктов хроматографии. И в этом случае объем элюции второго пика слабо меняется во всей области существования, тогда как первый да движется о^о.мь сильно.

Рис. 9. Исследование разворачивания р-лактамазы из З.сшгьпз гуанидин-хлоридом при 4'С:

А - Изменение профилей элыции Х'РЬС при увеличении концентрации денатурента п растворе;

О - Изм'.:ш?;г-!е структурных характеристик белка: (л) - уменьшение зчзпматичиской активности белка; ( о ) - умепыпэнке эллшг-ти нюсти яоглсарлтя на 270 нм; ( я ) - уменьшение эллиптичности поглощении на им.

Таким образои,' совокупность гл>чгл-«ся гкснврянепталыых данных по «сследо&егппа парохода "'рлеплашютшл глобула" - клубов (¡1алач,:г> только о;:,но! о доил-урппмотокч'о порзходз, тестируемого

|>:!'>личи!г:;1 о] |)у1стур:!цгл ц'|{>гл!.! грмли и о.пмодгш.поэ рпепродялогаю продукты) ¿рикэтограрш в этом поре ходе) надчу еикс воюю укагикает нп то, что, по »-ра^чсЛ 1'.>фо, г> рекоторих условиях ;|'.-р'!Хсд "р.чси.ч'-1л!ои'>э.ч глобул.г' -- к.чуУок п глобул><рш»х дт.'/г.^тсд ¡гааоы."! пнрело.гсч горного рода.

- и

выводы

1) Показено, что при равновесном разворачивании глобулярных селксы сильными денатурантами накапливается единственное термодинамически стабильное промежуточное состояние - "расплавленная глобула".

2> При понижении температуры эта картина не изменяется, однако, процессы обмена между кокфермационнши состояниями (нативннм, "расплавленной глобулой" и клубком) очень ыиьно галыдмутси.

3) Показано, что переход "расплавлеюьая глобула" - клубок, по крайней мере, в некоторых условиях является фазовым переходом первого рода. Иными словами, состо.тчие "расплавленной глобулы" отделено переходами типа "все-илн-ничего" как от нативного, так и от кдубкообразного состояний, т.е. оно является особым, в том числе и с точки зрения термодинамики, состоянием. Из э¡ого следует, что бе.исовая молекула жохет находиться в трех фазовых состояниях: налсиЗном, состоянии, "расплавленной елобулы" и полностью неупорядоченном, подобным соответственно крисжшичеснолу, хиймомц и газообразному состояниям обычных низкомолекулчрних веществ.

Материалы диссертации опубликованы в слздупцих роботах:

1. Родионова Н.А., Семчсогнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными дензтурантами. - Молещлярная биология, 1939, 23, вып.3, C.683-G92.

2. Uversky V.N., Gutin A.M. Sokolovsky 1.7. & SereiBotnov G.V. The nature of slow processes in tha kinetics of carbonio anhydrase В refolding. - 5th Conference of Young Scient ist-ч of Socialist Ccmtrlcb on Bloorganic Chsmlatry (Pushchino, USSR), Reports Thesises, 1988, p.86-87.

3. Semiaotnov G.V., Uvarslcy V.N., Sokolovsky I.Y., Gutin A.M., Razgulyaev 0.1., Rodionova N.A. Two 8lo*r stages in refolding of bovine carbonio anhyirase В are due to proline isomerization. - J.tiol.Dlol., 1990, 213, p.561-568.

4. Semiaotnov G.Y., Rodionova N.A., Razgulyaev 0.1., Uveroky V.N., Gripasj /..Ph., Gilmanshir. R.I. Study of tha molten globule intermediate state by a hydrophobic fluore-oent. -Blopolynera, 1991. 31, p. 119-129.,

5. Uvernky V.N. Cementing the folding oomunity. - Report in: The Biochemist, 1991, 13, p.9.p.9.

6. Uversky V.N., Pain R.H., Rodionova N.A., Semieotnov G.V. & Ptitsyn O.B. Unfold^g of globular proteins as two first order phase transitions. - eth Conference of Young Sclent 1st.1 on Organic ami Bloorganic Chemistry (Riga", Latvia), Reports Thesises, 1991, p.234-23!j.

7. Uversky V.H. .Rodionova N.A., Semteotnov G.V. Pain R.H. & Ptitnyn O.B. Experimental evidence for all-ore-none nature of molten globule - ooil transition in globular proteins. -Interratlonal School-Seminar "Hodern Problems of Physical Cfwmtsiry of Kacromolecules (ruehohino, USSR), Abstracts, 1991, p.170.

8. Ptitsyn O.B., Byohkova V.E., Dolgikh D.A, Sercisotnov G.V. & Uveraky V.N. Molten globule and protein folding. International School-Seminar "Modern Problems of Physical Chnrrdsiry of Uacrcmoleculea (Pushchino, USSR), Abstracts, 1991, P.S7-53.

/V/ФПУ S^sz- 'S/^s