Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль

Бычкова, Валентина Егоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль"

l-J

am U.4. J На правах рукописи

УДК 577.322

БЫЧКОВА ВАЛЕНТИНА ЕГОРОВНА

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОСТОЯНИЯ В СВОРАЧИВАНИИ БЕЛКОВ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Институте белка РАН

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

член Европейской Академии (Academia Europeaea), доктор физико-математических наук, профессор О.Б. Птнцын

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАН, доктор химических наук,

профессор В.А. Кабанов

доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Чиргадзе

доктор физико-математических наук,

профессор В.И. Иванов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии имени М.М.Шемякина и Ю.А.Овчииникова

Защита состоится "2$ " ФП-р^х^ 199С года в ■ Ачасов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.53 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119899 г. Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "Д^ " ^{{JlSpÁ 199^т-

Ученый секретарь Диссертационного совета | [(._^

доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева ^

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современное состояние физики белка, понимание основных закономерностей формирования белковой структуры и функции позволяют глубже понять поведение белков в клетке и перейти к применению накопленных знаний для решения проблем биологии, медицины и биотехнологии.

Проблема сворачивания белков имеет два аспекта: биохимический, связанный с биосинтезом белковой последовательности на рибосоме, и физический, отражающий сворачивание этой последовательности в нативную функционирующую трехмерную структуру. Один из центральных вопросов молекулярной биологии - как белковая молекула сворачивается в жесткую пространственную структуру - остается актуальным с момента расшифровки первой пространственной структуры белка с помощью рентгеноструктурного анализа. Актуальность этой проблемы сохраняется и до настоящего времени. Проблема правильного сворачивания отнюдь не является тривиальной, поскольку белку приходится решать, как выбрать правильный путь из астрономического числа возможных конформаций и не попасть в энергетическую ловушку (парадокс Левинталя, Levinthal, 1968). Как было показано Анфинсеном (Anfmsen, 1973), полностью развернутая гуанидин-гидрохлоридом рибонуклеаза А с разорванными S-S связями способна свернуться в активное состояние, будучи помещена в нативные условия. Это означает, что вся информация о сворачивании белка заключена в его аминокислотной последовательности, а это делает возможным изучать сворачивание белков прямыми физическими методами.

С другой стороны, накопившаяся информация о третичной структуре глобулярных белков свидетельствует о наличии сходных элементов в структурной организации белков. Все белки обладают определенными элементами вторичной структуры (а-спирали, (З-структура, так или иначе структурированные петли). Благодаря этому часть гидрофобных участков кластеризуется, образуя гидрофобное ядро молекулы, что, в свою очередь, приводит к определенному расположению элементов вторичной структуры относительно друг друга, т.е. к определенному ходу полипептидной цепи в пространстве, называемому "укладкой" или "топологией" цепи. Устойчивость к внешним воздействиям окружающей среды достигается плотной упаковкой боковых групп, что приводит к появлению жесткой третичной структуры, т.е. фиксированному положению большинства атомов белковой молекулы в пространстве. Эта третичная структура зависит от всех деталей аминокислотной последовательности и является специфичной для данного белка, в то время как топология, как оказалось, может быть сходной, и даже иногда идентичной, для разных белков (Richardson, 1977, 1981). Анализ этого сходства показал, что оно не является результатом эволюционной дивергенции или

функциональной конвергенции, а следует из общих законов молекулярной физики (Птицын, Финкельштейн, 1980; Финкельштейн, Птицын, 1987).

Кинетические и равновесные промежуточные состояния. Наличие нескольких уровней структурной организации белка должно приводить к промежуточным структурам на пути сворачивания белка из полностью развернутой цепи в его нативную третичную структуру. Еще в 1973 году О.Б.Нтицын предположил (Птицын, 1973), что сворачивание белка должно проходить по крайней мере через два кинетических интермедиата. Первый интермедиат имеет области вторичной структуры, флуктуирующие около их положения в нативной структуре, в то время как второй интермедиат имеет компактную структуру и нативоподобный ход полипептидной цепи, но в нем еще отсутствует плотная упаковка боковых групп. Оба этих интермедиата действительно были обнаружены на опыте (Dolgikh et al, 1981; Ptitsyn & Semisotnov, 1991).

С другой стороны, еще Тэнфордом было отмечено (Tanford, 1968), что белки более или менее полностью развернуты при высоких концентрациях сильных денатурантов, гуанидингидрохлорида (ГГХ) или мочевины, хотя даже в этих случаях наличие флуктуирующих структур не может быть исключено. При денатурации же белков другими агентами, такими как низкие рН, высокая температура, или высокие концентрации некоторых солей, их физико-химические свойства заметно отличались от таковых, наблюдаемых для высоких концентраций ГТХ, т.е. были промежуточными между свойствами нативных и развернутых белков. Более четко наличие равновесных промежуточных состояний было показано при изучении разворачивания бычьей карбоангидразы (Wong & Tanford, 1973), р-лактамазы (Robson & Pain, 1973), гормона роста (Holladay et al, 1974), коровьего (Kuwajima, et al, 1976) и человеческого (Nozaki et al, 1978) а-лактальбуминов, где изучалось разворачивание белков сильными денатуратами с помощью спектров кругового дихроизма (КД). Они показали, что спектры КД ароматических групп, связанные с наличием их асимметричного окружения, т.е. с жесткой третичной структурой белка, уменьшаются при более низких концентрациях ГГХ, чем спектры пептидных групп, связанные с наличием вторичной структуры в белке. Было сделано заключение, что ослабление плотной упаковки боковых групп в нативной структуре происходит как отдельный процесс, предшествующий разрушению вторичной структуры.

Кроме того, для бычьего гормона роста (Burger, 1966), бычьей карбоангидразы В (Wong & Hamlin, 1974) и а-лактальбуминов (Kuwajima et al, 1976, Nozaki et al, 1978), было показано, что их оптические свойства при кислых рН сходны со свойствами состояний, наблюдаемых при умеренных концентрациях ГГХ. Обнаружение подобных интермедиатов, особенно компактных, представляется очень важным для понимания проблемы структуры белков и их сворачивания.

Физиологическая роль промежуточных состояний. В последнее десятилетие появилось много экспериментальных данных, согласно которым ряд

клеточных процессов требуют не жесткого "нагивного" состояния белка, но некоторого "иенативного", достаточно гибкого состояния, способного адаптироваться к различным условиям в клетке или быть компетентным либо к транслокации через мембраны, либо олигомеризации, либо связыванию или передаче лигандов (см. обзор Bychkova and Ptitsyn, 1993). Некоторые условия в клетке, такие как низкие рН (4.5-5.0) в лизосомах или около отрицательно заряженных мембранных поверхностей, наличие мембран и цитоскелета являются умеренно-денатурирующими условиями для белков.

Это позволило нам (Bychkova et al., 1988) выдвинуть гипотезу, что основное промежуточное состояние - состояние расплавленной глобулы - может играть важную роль в физиологических процессах. В последующие годы основные положения этой гипотезы были подтверждены, и в обзоре (Bychkova & Ptitsyn, 1993) нами были суммированы первые доказательства существования и роли расплавленной глобулы in vivo.

Было показано, что это состояние, с одной стороны, сохраняет общую архитектуру белка, а с другой, допускает вращательную изомеризацию многих внутренних боковых цепей и петель. Оно имеет более гидрофобную поверхность за счет дополнительного экспонирования части гидрофобных боковых групп. Было показано, что это состояние участвует в транслокации белков через мембрану или внедрении токсинов и вирусов в мембраны; что оно обнаруживается сразу после биосинтеза белков и узнается шаперонами, основная роль которых сводится к экранированию связанных белков от различных побочных реакций, например, неспецифической агрегации; что оно реализуется при передаче гидрофобных лигандов или при связывании и взаимодействии рецепторов и их партнеров; что оно является также состоянием, компетентным к деградации; что мономеры многих олигомер-ных белков сохраняют это состояние перед олигомеризацией и т.д. Более подробную информацию можно найти в обзорах (Fischer & Schmid, 1990; Jaenicke, 1991; Freedman, 1992; Getting & Sambrook, 1992; Bychkova & Ptitsyn, 1993; Hendrick & Hartl,1995). Однако природа этих промежуточных состояний полностью не понята до настоящего времени.

Цель настоящей работы - изучение равновесных интермедиатов в сворачивании белков и их возможной роли в клетке.

Результаты первой части работы можно суммировать как участие в открытии и детальное описание свойств расплавленной глобулы, включая ее размеры, структуру ее гидрофобного ядра и ее переходов в нативное и развернутое состояния.

Обнаруженные свойства расплавленной глобулы позволили выдвинуть гипотезу о наличии этого состояния в живой клетке и о функциональной роли этого состояния. Экспериментальная проверка этой гипотезы была проведена на примере переноса гидрофобного лиганда ретинол-связывающего белка и влияния мембраны на состояние белков, функционирующих в ее поле (щггохром с).

Помимо этого в диссертацию включены также результаты работ по моделированию компактости белков и их доменного плавления с помощью полимеров и сополимеров.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Детальное исследование основного промежуточного (между нативным и полностью развернутым) состояния расплавленной глобулы, включая ее компактность, наличие плотного ядра и рыхлой оболочки, наличие фазовых переходов между нативным состоянием белка и состоянием расплавленной глобулы.

2. Моделирование компактности белков и их доменной организации с помощью гетеро- и гомо- полимеров.

3. Гипотеза о функциональной роли расплавленной глобулы в клетке и ее экспериментальное подтверждение.

4. Экспериментальное моделирование превращения белка в мембран-ном поле в расплавленную глобулу с помощью концертного действия умеренно низких рН и умеренно низкой диэлектрической проницаемости на примере цитохрома с и ретинол-связывающего белка.

5. Моделирование функции белка в поле мембраны на примере передачи ретинола (витамина А) ретинол-связывающим белком.

Научное значение и новизна работы определяются тем, что:

- обнаружено новое состояние белковой молекулы - расплавленная глобула - в соавторстве с О.Б.Птицыным, Д.А.Долгих, Р.И.Гильманшиным и Г.В .Семисотновым;

- показано, что это состояние расплавленной глобулы лишь ненамного менее компактно, чем нативное;

- обнаружено, что это состояние имеет ядро, значительно более плотно упакованное, чем оболочка, так как линейные размеры ядра возрастают только на 4% по сравнению с жесткой нативной структурой, что свидетельствует о неоднородном набухании расплавленной глобулы, состоящей из более или менее плотного ядра и сильно гидратированной оболочки;

- показано, что нативное состояние белка отделено от состояния расплавленной глобулы переходом, происходящим по принципу "все-или-ничего", т.е. внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого рода;

- проведено сравнение свойств белков со свойствами гомо- и гетеро-полимеров и обнаружено, что компактность белковых молекул связана с соотношением гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, а не со специфичностью эволюционно отобранных аминокислотных последовательностей, а доменное плавление больших белков является типичной характеристикой больших молекул;

выдвинута и экспериментально подтверждена гипотеза, что расплавленная глобула может иметь функциональное значение в клетке: в частности, она может возникать сразу после биосинтеза белковой цепи, при

проникновении белков в мембраны и перед деградацией белка и участвовать в других процессах в клетке;

- показано, что денатурирующее действие мембранных поверхностей на глобулярные белки зависит от концертного действия двух факторов -понижения диэлектрической проницаемости воды вблизи органической поверхности и локального понижения рН вблизи отрицательно заряженной поверхности; которое может быть смоделировано в водно-спиртовых смесях при умеренно низких рН, где это действие переводит нативный белок в состояние расплавленной глобулы;

- показано, что это концертное действие способно приводить к освобождению ретинола (витамина А) от его белкового носителя, ретинол-связывающего бежа, моделируя тем самым одну из важных функций белков - их роль в транспорте лигандов;

- выдвинута гипотеза о связи кинетического интермедиата в сворачивании белка - расплавленной глобулы - с некоторыми генетическими заболеваниями и, как следствие, необходимости нового подхода к конструированию лекарств против этих заболеваний.

Практическое значение предлагаемой работы заключается в том, что полученные данные об интермедиатах в сворачивании белка являются необходимой предпосылкой для конструирования искусственных белков с заданными свойствами или при модификации белков для биотехнологии, что уже осуществляется на практике. Эти результаты могут найти практическое применение также в пищевой, фармацевтической и парфюмерной промыш-ленностях, так как многие эмульсии получаются при умеренно кислых рН, когда можно ожидать перехода из нативного состояния белка в расплавленную глобулу, т.к. увеличение гидрофобной поверхности белков должно повышать их эмульгирующую способность. Способность белков переходить в состояние расплавленной глобулы при определенных условиях позволяет конструировать носители для перорального приема таких широко распространенных белковых лекарств как инсулин, интерферон и гормон роста. Эти носители позволяют перенести такие белки через сильно денатурирующие условия в желудке в стабилизированном состоянии расплавленной глобулы (Leone-Bay et al, 1995; Milstein et al, 1996, in press; носители сконструированы на фирме Emisphere Technologies, Inc, USA).

Данная работа представляет собой первое указание на функциональное значение состояния расплавленной глобулы, равновесного и кинетического интермедиата на пути сворачивания белка, в клетке. Высказанные гипотезы и их экспериментальная проверка открывают новое направление работ по изучению "ненативных" состояний белков, которые могут быть функциональными для данного белка в определенные периоды его жизни. Изучение условий, при которых эти негативные состояния возникают, могло бы помочь в исправлении дефектов в сворачивании белков от vivo, ответственных за изменение путей следования белков в клетке.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 13-ом симпозиуме ФЕБО (Дрезден, 1978); Международном симпозиуме IUPAC "Macromolecular Chemistry" (Ташкент, 1978); IV-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); V-ом Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980); 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); симпозиуме по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках стран СЭВ (Пущино, 1985); Международном семинаре "Small angle X-ray and neutron scattering" стран СЭВ (Пущино, 1985); VI-ом Всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополиме-ров в растворе (Тбилиси, 1985); Международной школе-семинаре "Modern Problems of Physical Chemistry of Macromolecules" (Пущино, 1991); 22-ом симпозиуме ФЕБО (Stockholm, Sweden, 1993); конференции IUBMB "Biochemistry of Cell Membrane (Bari, Italy, 1993); Международном семинаре "Molten Globule: its Physical Picture and Biological Meaning" (Tokyo, Japan, 1994); 23-om симпозиуме ФЕБО (Basel, Switzerland, 1995); Russian-Germany Summer School (Jena, Germany, 1995); the 2-nd international workshop "Principles of Protein Architecture" (Tokyo, Japan, 1995); научной конференции, посвященной 100-легию со дня рождения проф. Д.Н. Насонова (Санкт -Петербург 1995); симпозиуме "Advances in Gene Technology: Biomolecular Design, Form and Function" (Ft. Lauderdale, Florida, USA); Кейстоунском симпозиуме "Molecular and Cell Biology: Protein Folding, Modification and Transport in the Early Secretory Pathway"; а также доложены на совместном заседании Биофизического общества и кафедры биофизики Физического факультета Ленинградсого Университета (Ленинград, 1989); на научном семинаре кафедры проф. В.А. Кабанова (Москва, 1995) в Московском Университете; в Институте молекулярной биологии РАН (Москва, 1997); в Университетах Пармы, Падуи и Милана (Италия), в Уорикском Университете (Англия) и в Национальном институте рака (США).

Публикации. Основные результаты работы, представленной к защите, отражены в 47 публикациях, в том числе в 27 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах, включая три обзора с участием автора.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из семи глав (I. Введение, И. Содержание работы, III. Заключение, IV. Материалы и методы, V. Основные результаты и выводы, VI. Список публикаций по теме диссертации, и VII. Список цитированной литературы). Глава II подразделена на три части, первые две, содержащие шесть и пять разделов, соответственно, посвящены изучению белков in vitro и in vivo. Первая часть посвящена изучению равновесных промежуточных состояний, позволившего детально описать некоторые основные черты состояния расплавленной глобулы, открытого в лаборатории физики белка, возглавляемой О.Б. Птицыным. Во второй части изложены гипотеза о функциональной роли расплавленной глобулы и ее проявлении в клеточных процессах и предложены способы

моделирования некоторых черт структуры и функции белка в условиях, моделирующих окружение мембран. Третий раздел содержит возможные перспективы дальнейшего развития. Глава IV содержит описание объектов и методов исследования, изложенных в семи разделах. В диссертации нет традиционного обзора литературы в виде отдельной главы, но большинство разделов содержит описание известных результатов и данных, обсуждаемых по мере необходимости в тексте. Материал диссертации изложен на 207 страницах, включая 120 страниц машинописного текста, 34 рисунка, 8 таблиц и список литературы, состоящий из 318 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. ВВЕДЕНИЕ

Во введении формулируются направление и цели исследования.

II.1. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА in vitro

II. 1.1. ОТКРЫТИЕ НОВОГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО состояния

Для понимания процесса сворачивания белка необходимо изучение промежуточных состояний между натившлм (N) и полностью развернутым (U) состояниями. Наличие промежуточных состояний может тестироваться по несовпадению кривых перехода из N в U под действием денатурирующего агента, измеряемых различивши методами.

Наличие таких интермедиатов было обнаружено в ходе разворачивания нескольких белков. Более детально стадии разворачивания белковой структуры были изучены Куваджима с сотрудниками (Kuwajima et al, 1976) на примере коровьего а-лактальбумина (Ка-ЛА). Переходы, вызываемые гуанидин-гидрохлоридом (ГТХ) в этом белке и тестируемые по спектрам ближнего и дальнего кругового дихроизма (КД), происходят при разных концентрациях ГГХ, что указывает на наличие интермедиата, сходного с состоянием этого белка при низких рН. Куваджима пришел к заключению, что "наблюдаемый равновесный интермедиат сильно развернут, но содержит зачаточные спиральные структуры, диктуемые локальными взаимодействиями".

Как следует из вышеизложенного, интермедиаты в сворачивании белка наблюдались и раньше. Однако, когда мы начали их изучение, что из себя представляют эти интермедиаты, известно не было .

Для исследования были выбраны два белка, для которых наблюдалось несовпадение переходов по спектрам КД в дальней и ближней УФ областях: а-лактальбумины коровы и человека (Ча-ЛА). Равновесное промежуточное состояние как новое состояние белковой молекулы было открыто и детально охарактеризовано нами (Dolgifch et al, 1981, 1985). Это промежуточное состо-

яиие, названное поздпее расплавленной глобулой (MG) (Ohgushi & Wada, 1983), было детально исследовано для двух гомологичных а-сниральных белков с помощью различных, дополняющих друг друга и подтверждающих, методов (более 15), дающих информацию о различных свойствах белков.

Было показано, что эти белки в умеренно денатурирующих условиях (кислые pH, умеренные концентрации ГГХ, повышенная температура, удаление лигандов) приобретают некоторые общие свойства, позволившие описать эти денатурированные формы как "флуктуирующее состояние без уникальной пространственной структуры", но компактное и обладающее хорошо выраженной вторичной структурой (Dolgikh et al., 1981). Эта промежуточная форма обладает необычной комбинацией свойств, присущих как N, так и U формам, и представляет собой особое физическое состояние белковой молекулы. Так было открыто новое состояние белковых молекул - состояние расплавленной глобулы наряду с уже известными нативным и развернутым. Свойства этого состояния представлены в таблице 1.

П. 1.2. КОМПАКТНОСТЬ

Одним из наиболее важных свойств расплавленной глобулы является ее компактность. Отсутствие данных о компактности привели Куваджима к неверной модели (Kuwajima, 1977), по которой промежуточное состояние белков является развернутым и, следовательно, мало интересным. Поэтому мы детально исследовали компактность этого состояния с привлечением таких методов как квазиупругое рассеяние света (Gast et al, 1986) и макроскопическая диффузия с использованием поляризационного интерферометра (Бычкова и др., 1990) наряду с измерением характеристической вязкости (Dolgikh et al, 1981, 1985). С помощью равновесной седиментации было показано, что Ка-ЛА незначительно ассоциирует в N форме, тогда как человеческий белок дает небольшое увеличение молекулярного веса в кислой (А) форме (Гильманшин и др., 1982) . Для более точной оценки размеров Ча-ЛА нами были выбраны квазиупругое рассеяние света и макроскопическая диффузия, дающие возможность учесть ассоциацию. Оба метода позволяют измерить коэффициент поступательной диффузии, из которого можно вычислить гидродинамический радиус Стокса

Rs =kT/6<rr|oD,

где rio - вязкость растворителя, D - коэффициент диффузии при температуре Т, к - постоянная Больцмана. Метод динамического рассеяния света позволяет определить коэффициент диффузии макромолекул Dkc, возникающей за счет их теплового движения внутри измеряемого объема (Berne & Pécora, 1976; Chu, 1974). Метод макроскопической направленной диффузии (МНД), фиксирующий движение диффундирующих частиц вдоль градиента концентрации (химического потенциала), подробно изложен в монографиях (Цветков и др., 1964; Ellias, 1984) и чаще применяется к изучению полимеров и реже - белков. Этот метод имеет то преимущество, что при использовании

Таблица 1. Свойства равновесного состоянии расплавленной глобулы in vitro

Свойства

Доказательство

сходные с нативным состоянием

Компактность

Существование ядра

Содержание вторичной структуры

Разворачивание сильными денатурирующими агентами

Характеристическая вязкость [8, 9], диффузия [3, 10], седиментация [9, 54], малоугловое рентгеновское рассеяние [8, 9], малоугловое нейтронное рассеяние [167], рентгеновское рассеяние на средних углах [9], гель-хроматография [286]

Рентгеновское рассеяние под большими углами [11]

Спектры КД в дальней УФ области [51, 183] ИК спектры [9, 51]

Спектры КД в дальней УФ области [183] гель-хроматография [286, 287], спектры ЯМР [2], спектры флуоресценции трипто-фановых остатков [2]_

сходные с развернутым состоянием

Отсутствие энзимати- Обычные методы измерения активности

ческой активности ферментов

Отсутствие (или только Спектры ЯМР [9, 79], спектры КД в

следы) жесткой тре- ближней УФ области [183] тичной структуры

Подвижность алифати- Спектры ЯМР [2,59]

ческих боковых цепей__

промежуточные

Подвижность ароматических боковых цепей Крупномасштабные флуктуации Спектры ЯМР [2, 59] Дейтериевый (Н—D) обмен [8, 9, 79], чувствительность к протеолизу [214]

специфические

Доступные для растворителя неполярные кластеры Агрегация [8], связывание гидрофобных меток [247, 269], сродство к фосфо-липидам [178] или мембранам [191]

интерферометрической оптики в нем имеется возможность непрерывного контроля за процессом диффузии по интерферограммам, представляющим реальное распределение градиента концентраций с1с/сЬ: в диффузионной ячейке в различные моменты времени регистрации. Экспериментально определяют величину максимальной ординаты и площадь под диффузионной кривой, из которых вычисляют дисперсию ст2 = 2 ТУХ .Следует подчеркнуть, что начальный наклон этих зависимостей отражает диффузию молекул с

наибольшим коэффициентом диффузии, т.е. с наименьшими размерами. 11оэтому этот метод информативен далее тогда, когда в системе наблюдается небольшая (до 10-20%) димеризация, что особенно важно для оценки размеров белков в состоянии расплавленной глобулы.

Нами были измерены эффективные гидродинамические размеры Чсь ЛА в различных формах (Ы, А, температурно-денатурированной - Т и развернутой 6М ГГХ - и) с помощью квазиупругого рассеяния света. Комбинация данных по коэффициенту диффузии и интегральной интенсивности рассеяния света, измеряемой параллельно на том же самом приборе, позволяет учесть небольшую ассоциацию (димеризацию), когда она имеется.

На рис.1 приведены концентрационные зависимости коэффициента диффузии для N. А (рН 2,0) и бескальциевой форм Ча-ЛА, измеренные методом квазиупругого светорассеяния. После поправок на ассоциацию значения приведенных гидродинамических радиусов для N. А и Т форм а-лактальбу-мина, полученные с помощью квазиупругого рассеяния и макроскопической диффузии, практически совпали. Сравнение этих данных дано в таблице 2. из которой следует, что увеличение линейных размеров молекулы в расплавленной глобуле по сравнению с N состоянием, измеренных разными методами, составляет 14±2%, что даст увеличение в объеме молекулы в 1,5 раза. В то же время линейные размеры в и и N формах Ча-ЛА отличаются на -50% (см. табл. 2), что приводит к различию в объеме в 3,3 раза. Совокупность этих данных четко показывает, что белки в состоянии МО почти также компактны, как и в N. и сильно отличаются по размерам от развернутого состояния.

■

веденных к стандартным условиям, Ого,«I, молекул Ча-ЛА в нативной (■), кислой (+) и бескальциевой (•) формах при 20°С.

Рис.1. Концентрационная зависимость коэффициентов диффузии, при-

8 12

с (мг/мл)

Таблица 2. Коэффициенты диффузии а-лактальбуминов в различных состояниях

Белок

Состояние Условия Мкаж'/М D2oi(vxio7,cM2/ceK

R/RN

20мМ Трис-НС1 Djo.w КС; D2o,w МНД КС; МНД

а-лакталь- N рН7,5; 20°С 1,05 11,8+0,2 - 1,0

бумин MG рН2,0; 20°С 0,96 - 10,1 - 1,17

коровы и 6,4 M ПГХ - - 7,7 - 1,53

рН7,5; 20°С

а-лакталь- N рН7,5; 20°С 1,04 12,3±0,2 12,5 1,0 1,0

бумин MG(A) рН2,0; 20°С 1,16 10,8 11,1 1,14 1,13

человека MG (Т) без кальция 1,40 10,9 - 1,13 -

(0,01 M ЭДТА)

рН7,5; 50°С

и 6,0 M ГТХ ши - 8,6 8,3 1,43 1,51

6,4 M ГГХ

рН7,5; 20°С

1) Мкаж - мол.вес, измеренный по седиментации; M - мол.вес, рассчитанный из а.к. последовательности; 2) Коэф. диффузии, измеренные с помощью квазиупругого светорассеяния (КС) и макроскопической направленной диффузии (МНД); 3) Отношение гидродинамических радиусов к их значению в N состоянии;

а) Моделирование компактности. Возникает вопрос, определяется ли компактность белков их специфической, эволюционно отобранной аминокислотной последовательностью или физическими свойствами полипептидной цепи, составленной из гидрофобных и гидрофильных аминокислот? Чтобы ответить на этот вопрос, нами были изучены статистические сополимеры глутаминовой кислоты и лейцина (Anufrieva et al, 1975; Бычкова и др., 1980). Оказалось, что такие сополимеры, состоящие из гидрофобных и гидрофильных остатков, содержат фракции, способные приобретать в водной среде неагрегирующие компактные структуры. Получаемые при этом структуры по степени компактности близки к белковым глобулам. Удивительно, что содержание лейцина в этих глобуляризующихся фракциях составляет 17±2% независимо от исходного состава сополимеров, что примерно соответствует среднему содержанию массивных гидрофобных групп в небольших белках. Измерение поляризации флуоресценции показало, что изменение размеров молекул, происходит в области рН, где вторичная структура уже сформировалась, т.е. происходит компактизация уже существующих спиралей.

Таким образом, в этой работе впервые была смоделирована одна из основных черт глобулярных белков - их компактность. Поскольку модельная система содержала только гидрофобную (Leu) и гидрофильную (Glu) аминокислоты, то можно сделать вывод, что компактность полипептидных цепей

нс является следствием эволюционного отбора, а зависит от соотношения гидрофобных и гидрофильных остатков.

б) Сравнение размеров глобулярных белков и развернутых цепей. Обычно сравнивают размеры белка в данном растворителе с размерами в 6М ГГХ или 8М мочевины. Однако, размеры развернутой полимерной цепи, в том числе и белковой, могут зависеть от качества растворителя. Поэтому размеры полностью развернутой белковой молекулы в воде с высокой или низкой ионной силой могут значительно отличаться от их же размеров в 6М ГГХ. Это предположение было проверено, используя поведение апо-цитохро-ма с (который развернут даже в воде) в различных растворителях, включая 6М ГГХ и водные растворы с низкой и высокой (0,25 М ЫаС1) ионной силой (ОатазсЬип ^ а1., 1991). Радиусы инерции, определение с помощью квазиупругого светорассеяния и малоуглового рентгеновского рассеяния для этого белка, составляют 4,56нм и 3,83нм в растворах низкой и высокой ионной силы, соответственно, т.е. размеры развернутой цепи могут увеличиваться на 20% при переходе от высокой ионной силы к низкой. Размеры в 6М ГТХ являются промежуточными (4,09нм). Следует отметить, что водный раствор 0.25М №С1 при рН 2,0 является очень плохим растворителем для белковой цепи, и размеры в нем приближаются к невозмущешгым размерам в 9-точке для белковых молекул (оцененным как Кво=3,5 ± 0,4 нм). Этот факт следует иметь в виду при любых обсуждениях компактности белковых молекул.

И.1.3. НАЛИЧИЕ ЯДРА И ОБОЛОЧКИ

Увеличение размеров белка в состоянии расплавленной глобулы, полученное разными методами, естественно ставит вопрос об однородности набухания белковой молекулы. К тому лее состояние расплавленной глобулы характеризуется увеличением флуктуаций структуры белка. Это следует как из исчезновения (или очень резкого уменьшения) характерных для каждого белка спектров КД в ближней УФ области, так и спектров ЯМР ароматических и алифатических групп в высокопольной области, что предполагает усреднение во времени окружения ароматических и других групп (Во^кЬ е! а1., 1981, 1985; Ваши е1 а1, 1989). Оценить размеры этих флуктуаций можно, воспользовавшись методом рентгеновского рассеяния под большими углами. Этот метод позволяет получить информацию о мелкомасштабных особенностях белковой молекулы. В частности, все глобулярные белки имеют ярко выраженный максимум интенсивности рентгеновского рассеяния, соответствующий Брегговскому расстоянию

с! = 2п/Б = 4,5А,

и обусловленный главным образом большим числом ван-дер-Ваальсовых контактов между атомами в глобулярной структуре (Оегпа! й а1., 1986). Максимум слабо выражен для спиральных полипептидов и отсутствует в развернутой цепи. Нами было показано, что этот максимум сохраняется также и в состоянии расплавленной глобулы. На рис.2 представлены кривые

а 5 й

•

1 о' 10'

ъ о в о

о а 3 О

V 10° •о 10° • <3 • ° • ъ.

■ -1_ . 1 .. 1 Г 1 1 Р , 1 \ъ % •о '-Ч

г 4 б з 1а

Б (нм-'|

Рис.2, а) Кривые диффузного рентгеновского рассеяния для бескальциевой формы человеческого а-лактальбумина

(в присутствии 10 мМ ЭДТА), рН 7,5, при 10°С (о) и при 50°С (•); (4я/Я) ятв - абсолютное значение вектора рассеяния (Х.=0,154нм - длина волны; 29 - угол рассеяния. Кривые даны без поправки на коллимацию), б) Кривые диффузного рентгеновского рассеяния для нативной формы человеческого а-лактальбумина при рН 7,5 (о) и для кислой формы при рН 2,0 (•); в) Кривые диффузного рентгеновского рассеяния для полиглутаминовой кислоты при рН 7,0 (•) и рН 4,7 (о).

рентгеновского рассеяния под большими углами для N и Т форм Ча-ЛА (а). N и А форм (б) (РЛэуп с1 а1., 1986; ВатаБсЬлт « а1, 1986). На рис.бв для сравнения приведены кривые рассеяния для полиглутаминовой кислоты в спиральной и клубкообразной форме (Оатазскшп ег а1., 1986). Различие между белком в N состоянии и в состоянии х\Ю сводится к небольшому сдвигу максимума от 4,5А к 4,65А, что соответствует увеличению размеров ядра на 3-4% по сравнению с нативным белком. Это означает, что упаковка в состоянии расплавленной глобулы не отличается очень сильно от нативной структуры, и межатомные расстояния внутри белковой молекулы возрастают существенно меньше (3-4%) по сравнению с увеличением гидродинамического радиуса (14%). Эти данные указывают на то, что в состоянии МО внутри молекулы сохраняется ядро, объем которого изменяется намного меньше (-10%), чем общий гидродинамический объем молекулы (50%), что означает неоднородное набухание белковой молекулы в состоянии расплавленной глобулы (Ри1эуп е! а]., 1986). Набухание белковой молекулы предполагает, что вода может проникать внутрь молекулы. Измерение ультразвукового поглощения и сжимаемости и определение парциального удельного объема молекулы Ча-ЛА показывают (КЬагакоэ & ВусЬкоуа, 1997), что парциальный удельный объем белковой молекулы практически не меняется (0.3% ) при переходе из N состояния в состояние 1УЮ. В то же время ультразвуковое поглощение и сжимаемость претерпевают заметное изменение - их удельные значения в 2-3 раза выше, чем для нативного белка. Объяснить эти данные можно, предположив, что вода проникает внутрь белка при переходе из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы. Наша оценка показала, что во внешний слой молекулы а-лактальбумина проникает -270 молекул воды (КЪагакоБ & ВусЬкоуа 1997). Принимая во внимание существование ядра в состоянии расплавленной глобулы, можно считать, что молекула белка в этом состоянии действительно набухает неоднородно и имеет более плотно упакованное ядро и рыхлую внешнюю оболочку, достаточно лабильную, чтобы включить в себя более 250 молекул воды, находящихся в равновесии с окружающий водной средой.

ПЛ.4. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА

Спектры КД в области поглощения пептидных связей дают информацию о вторичной структуре в белках. На рис.3 представлены спектры КД гомологичных белков - Ка-ЛА и Ча-ЛА в N состоянии и в состоянии МЮ (рН 2,0). Из рис. следует, что интенсивности спектров КД в этих состояниях различаются. Чтобы выяснить, связано ли это различие с разным содержанием вторичной структуры, было сделано разложение спектров КД. Для КаЛА получено содержание а-егшралей и Р-структуры 31% и 18% соответственно, что близко к значениям 33% и 22%, найденным для нативного белка. Аналогичное содержание вторичной структуры для Ка-ЛА

получено из анализа ИК спектров (Эо^кЬ с1 а!., 1985). Сходный результат был получен и для карбоангидразы В (Долгих и др., 1983).

Сравнение спектров КД в дальней' УФ области в N состоянии и состоянии МО показывает, что спектры КД расплавленной глобулы достаточно интенсивны, что свидетельствует' о высоком содержании вторичной структуры в этом состоянии белка. Для Ча-ЛА спектр КД в состоянии МО более интенсивен по сравнению с нативным белком.

Аналогичная картина наблюдается для карбоангидразы В (Долгих и др., 1983) и ретинол-связывающего белка (Bychkova et al., 1992). Это увеличение эллиптичности не всегда означает изменение вторичной структуры, поскольку известно, что на спектры КД в пептидной области могут влиять и ароматические боковые группы, дающие основной вклад в спектр КД в ближней УФ области (Sears & Beychok, 1973; Dolgikh et al., 1985; Brazhnikov et al., 1985; Болотина,Лугаускас, 1985; Болотина, 1987; Manning, Woody, 1989).

Примером могут служить спектры КД в дальней УФ области ретинол-связывающего белка (рис.4), имеющего структуру цилиндра из восьми ß-цепей. В нативном состоянии спектры апо- и холо-формы белка имеют очень необычную для ß-белков форму (Bychkova et al., 1992). Однако, после перехода в состояние расплавленной глобулы, когда нарушается плотная упаковка боковых групп, в том числе и ароматических (см. рис.4б), эллиптичность на 224нм возрастает по абсолютной величине, а форма спектра становится похожей на форму спектра ß-белков в нативном состоянии. Такое изменение спектра КД для RBP в дальней УФ области свидетельствует об устранении влияния ароматических групп, что проявляется в резком уменьшении спектра ближнего КД, представленного на рис.4б.

Одновременное изучение поляризованной люминесценции остатков триптофана, вносящих основной вклад в спектры КД в ароматической обла-

Рис.З. Спектры КД в дальней УФ области для различных форм человеческого (кривые 1 и 2) и коровьего (кривые 3 и 4) а-лактапьбуминов в N (кривые 1 и 3) и А (кривые 2 и 4) формах.

200 220 240

А, нм

c ru, показывает, что времена релаксации движений остатков триптофана Ки-JIA в иативном состоянии и промежуточном при рН 2,0 составляют 19нс и 16нс, соответственно (Dolgikh et al., 1981, 1985). Для развернутой формы этого белка время релаксации составляет всего 8нс. Сопоставление этих величин указывает на достаточную ограниченность движения остатков триптофана в кислой форме белка по сравнению с их движением в развернутой форме. Это означает, что уменьшение интенсивности спектра КД в ближней УФ области не обусловлено отсутствием внутримолекулярных контактов вблизи ароматических групп, а является следствием усреднения окружения ароматических групп во времени и в пространстве, связанного с повышенной гибкостью молекулы бежа в состоянии расплавленной глобулы.

<а ч о

ч et О. u

250 270 290 510 330

Длина полны ( им ) Длина волны ( ни )

Рис.4, а) Спектры дальнего КД различных форм ЮЗР. Нейтральные формы при рН 7,4: апо-ЩЗР (—) и холо-КВР (- -). Денатурированные формы апо-ЯВР (при рН 2):

кислая форма (-.-.-) и развернутая 6М ГГХ (.....) форма; концентрация белка 0,5

мг/мл; температура 10°С; б) Спектры ближнего КД для различных форм КВР; обозначения те же, что и на рис.4а. Для холо-КВР значения эллиптичности [в]* умножены на 0,5.

11.1.5. ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ И ИХ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРИЧИНЫ

Температурные переходы в нативных глобулярных белках или их доменах являются высококооперативными процессами "все-или-ничего", т.е. представляют собой внутримолекулярные аналоги фазовых переходов первого рода (Anson, 1945; Privalov, 1979, 1982). Существуют по крайней мере три возможных объяснения кооперативности плавления белков:

1) плавление специфической третичной структуры; 2) кооперативное плавление вторичной структуры; 3) кооперативное разворачивание или набухание полипептидной цепи (переход "глобула-клубок").

Чтобы ответить на вопрос, чем определяется кооперативность плавления белков, нами было проведено детальное исследование температурного

плавления а-лактальбуминоп. Во-первых, была изучена температурная зависимость спектров КД в дальней и ближней УФ областях при различных концентрациях ГГХ для Ча-ЛА в Са-содержащей и бескальциепой формах (Вельяминов и Бычкова, 1984, неопубл. данные; Йквуп, 1995). На рис.5 и б представлены спектры дальнего и ближнего КД при низких и высоких температурах. Из рисунков следует, что спектры дальнего КД мало меняются в области температур и концентраций ГГХ, где резко уменьшаются спектры ближнего КД, что свидетельствует о разрушении плотной упаковки боковых групп белка при сохранении его вторичной структуры.

а) Фазовые переходы между N и МО и между МО и и. Проведенное микрокалориметрическое исследование поведения а-лактальбуминов показывает, что температурная денатурация Ка-ЛА и Ча-ЛА происходит по принципу "все-шш-ничего", т.е. изменение калориметрической энтальпии совпадает с изменением эффективной (Ван-Гоффовской) энтальпии.

Рис.5. Зависимость молярной эллиптичности [0]л.апо-формы Ча-ЛА от содержания ГГХ, указанного цифрами в молях около кривых; 0,02М ка-кодилата; 0,01М ЭДТА, рН 7,0; а) спектры КД в дальней УФ области при низких (0 ^ -10°С) и б) при высоких (60 -г 85°С) температурах.

Длина волны ( им )

е; о

ет я п. и

Рис.6. Зависимость молярной эллиптичности [0]х.апо-формы Ча-ЛА от содержания ГГХ (М): 0,0 (—);1,0 (-х-); 2,0 (-о-); 3,0 (-□-); 4,0 (-•-); 5,0 (-); 5,7 (—); 0,02М какодилата, 0,01М ЭДТА, рН 7,0; а) спектры КД в ближней УФ области при низких (0 г- -10°С) и б) при высоких (60 -т- 85°С) температурах.

На рис.7 представлена температурная зависимость удельной теплоемкости Ср для Ка-ЛА в различных формах (Dolgikh et al., 1985). Аналогичные данные получены и для человеческого белка (Pfeil et al., 1986). Пик теплопоглощения наблюдается для нативной и бсскальциевой форм, хотя удаление ионов Ca сильно дестабилизирует структуру белка, сни-жая температуру середины перехода иа 25°. Результаты, полученные из температурных зависимостей размеров, вторичной и третичной структур, четко показывают, что повышение температуры разрушает специфическую третичную структуру белка, но не приводит ни к разворачиванию белковой молекулы, ни к резкому падению вторичной структуры.

Температура (0 С )

Рис.7. Зависимость удельной теплоемкости Ср от температуры для Ка-ЛА в N (—) и бескальциевой (—) формах, 0,02 М Tris-HCl, pH 7,4,0,01М ЭДТА; для кислой формы, 0,05М KCl, рН2,0 (—); объем ячейки 0,5мл; скорость прогрева 1 К/мин.

Из рис.7 также следует, что промежуточное состояние Ka-JIA при кислых pH (равно как и промежуточное состояние при 2М ГГХ) не обнаруживает кооперативного поглощения тепла. Это же справедливо и для бескальциевой формы а-лактальбумина выше 40°С, которая переходит в компактное состояние, содержащее много вторичной структуры, но расплавленное с термодинамической точки зрения, поскольку реализуется после пика кооперативного поглощения тепла (Dolgikh et al., 1985). Однако, все эти промежуточные состояния а-лактальбуминов, полученные различивши способами, могут быть развернуты дополнительно высокими концентрациями ГГХ.

Прямым подходом к решению проблемы фазовости переходов является измерение тепловых эффектов в случае, когда оба перехода (из натив-ного состояния в промежуточное и из промежуточного в развернутое состояние, т.е. N=>MG и MG=>U) могут быть прослежены в одном и том же эксперименте. Для этого была использована изотермическая калометрия, позволя-ющяя измерять тепловые эффекты, связанные с переносом белка из одних условий в другие. Такое исследование было проведено для Ча-ЛА (Pfeil et al., 1986). Ha рис.8 представлены зависимости энтальпии денатурации от содержания ГГХ для нейтральной и кислой форм Ча-ЛА, которые показывают, что

при 2М ГГХ наблюдай гея промежуточное состояние, тестируемое по изменению оптических кривых, приведенных на рис.86. В этой же области при 40°С наблюдается изменение энтальпии, соответствующее области разрушения' специфического окружения ароматических 1-рупп (см. переход при 270нм на рис.8б). Для кислой формы Ча-ЛА, где уже отсутствует специфическое окружение ароматических групп, не наблюдается кооперативного перехода ниже 2М ГГХ (рис. 8а, кривая I). Разрушение же вторичной структуры в области от 2 до 5М ГГХ и разворачивание Ча-ЛЛ, тестируемое оптическими и гидродинамическими методами, не обнаруживает заметных тепловых эффектов. Это означает, что эти эффекты малы и компенсируются увеличением энтальпии при дополнительном связывании ГГХ в этом переходе.

Рис.8, а) Теплота переноса ДН Ча-ЛЛ в растворы ГГХ: кривая 1 - Л форма в 0,05М КС1, рН 2,0, 25°С; кривая 2 - нейтральная форма в 0,02М Тпб-НО, 0,001М СаС12, 25°С кривая 3 - нейтральная форма при 40"С. Ь) Относительное изменение молярных эллиптичностей Га Ча-ЛА в зависимости от концентрации ГГХ при 25°С; рН 7,5, при 270 нм (•) и 224 нм ( о ); рН 2,0 при 222 нм (□).

200

100 г

-" CGUHCI (rn°' '*'>

Свидетельство в пользу малых тепловых эффектов в области от 2 до 6М ГТХ получено в работах (Kuwajima, 1977; Ptitsyn, 1995), где проанализированы данные КД по титрованию Ка-ЛА гуанидинхлоридом. Эти оценки показывают, что трудно ожидать больших изменений эптальпии (или энтропии) для расплавленной глобулы как при высоких температурах, так и при высоких концентрациях сильных денатуратов.

Таким образом, впервые прямыми опытами было показано (Dolgikh et al., 1981; Pfeil et al., 1986), что причиной высокой кооперативное™ плавления глобулярных белков является разрушение специфической третичной структуры, сопровождающееся заметными изменениями в энтальпии и энтропии, которое наблюдается при переходе белка из N=>MG. Эти результаты показы-

вают, что состояние расплавленной глобулы отделено от нативного состояния фазовым переходом первого рода и что этот переход связан с разрушением специфических взаимодействий в третичной структуре белка, а не с разворачиванием белковой цепи или с разрушением ее вторичной структуры, что подтверждает теоретическое предсказание аналитической теории (Шахнович и Финкелынтейн, 1982; Finkelstein, Shakhnovich, 1989).

Изучение разворачивания карбоангидразы В ГГХ обнаружило наличие промежуточного состояния при 1,7М ГГХ, свойства которого сходны со свойствами расплавленной глобулы этого белка при pH 3,6 (Родионова и др., 1989). Там же было показано, что разворачивание этого интермедиата ГГХ, тестируемое различными методами, обнаруживает совпадение переходов, что дало первое серьезное основание предполагать наличие фазового перехода первого рода между MG и U, подтвержденное впоследствии в работах (Uversky et al., 1992; Ptitsyn & Uversky, 1994, Kreimer et al., 1994). Это означает, что расплавленная глобула представляет собой третье термодинамическое состояние белковой молекулы наряду с известными уже N и U состояниями (Ptitsyn & Uversky, 1994). Если при переходе из N в состояние MG кооперативно нарушается в основном специфическая плотная упаковка боковых групп, то при переходе из MG в U состояние происходит как кооперативное разрушение плотной упаковки еще сохранившейся части гидрофобного ядра, так и разрушение специфического пространственного расположения элементов вторичной структуры, т.е. грубой архитектуры белковой цепи (Ptitsyn, 1994, 1995).

Отсутствие кооперативное™ связывания ГГХ с развернутой белковой цепью было подтверждено при изотермическом титровании развернутой цепи апо-цитохрома с (Pfeil et al., 1991). Это означает, что кооперативное изменение свойств нативных белков под действием ГГХ целиком обусловлено свойствами белковой цепи.

б) Переходы в сополимерах заряженной и незаряженной аминокислот. В какой-то степени свойства полипептидной цепи белка могут быть апрокси-мированы свойствами гетерополимеров, в предельном случае сополимерами аминокислот с гидрофобными и гидрофильными боковыми группами. Как уже обсуждалось выше, фракция статистического сополимера глутаминовой кислоты с содержанием лейцина 17% дает компактную структуру, процесс формирования которой можно проследить, изучая одновременно поведение поляризации флуоресценции 1/Р и эффективного времени релаксации т, а также образование вторичной структуры (Anufrieva et al., 1975; Бычкова и др., 1980). При уменьшении степени ионизации боковых групп глутаминовой кислоты в молекулах этих фракций формируются спиральные участки, которые при дальнейшей деионизации конденсируются в компактные структуры, стабилизированные гидрофобными взаимодействиями.

При интерпретации сложной зависимости т от рП следует помнить, что внутримолекулярные релаксационные процессы всегда происходят на фоне вращения молекулы как целого, т.е. 1/т = 1/твн + 1/тц ,

где твн соответствует среднему времени внутримолекулярной релаксации и т„ означает время вращения молекулы как целого. Появление максимума на зависимости т от рН свидетельствует о наличии двух релаксационных процессов: уменьшение внутримолекулярной подвижности при одновременном уменьшении размеров молекулы сополимера (т.е. компактизации), при этом тц становится существенно меньше тШ1 , и эффективное время релаксации в компактном состоянии определяется, в основном, вращением молекулы как целого, то есть т ~ г„ . Так как компактизация происходит после завершения перехода клубок-спираль, то внутримолекулярная конденсация отражает взаимодействие уже предсуществующих спиральных участков.

Таким образом, из вышеизложенного следует вывод, что переходы в молекулах сополимеров не происходят по принципу "все-шш-ничего".

в*) Доменный характер плавления в белках и гамопалимерах.

До сих пор обсуждались конформационные переходы в небольших белках или белковых доменах. Денатурация же больших многодоменных белков температурой обычно не подчиняется правилу "все-или-ничего", так как их эффективная энтальпия составляет только часть энтальпии, измеренной калометрически. Эти "плавящиеся" домены могут либо совпадать со структурными, либо - нет.

Сходное поведение наблюдается и в гомополимерах, претерпевающих температурный переход клубок-глобула в водных растворах (Meewes et al, 1991; Ануфриева и др, 1991). Чтобы понять физическую природу различия в характере денатурации больших и малых белков, мы сравнили температурное плавление больших белков с переходами глобула-клубок в гомополимерах в зависимости от температуры. Тогда по отношению п = ДНкал/ДНэфф можно определить число "плавящихся" доменов или кооперативных единиц.

В качестве модели был выбран поли(Кт-изопроиилакриламид), имеющий пептидную связь в боковой цепи, для которого микрокалориметрически была исследована кооперативность перехода клубок-глобула (Tiktopulo et al., 1994, 1995). Было изучено температурное поведение фракций различных молекулярных весов от 11000 до 370000 и 7 млн, откуда следует, что независимо от молекулярного веса, переход совершается в одной и той же области температур. Калориметрическая энтальпия, рассчитанная на молекулу белка, растет с ростом молекулярного веса, тогда как эффективная, рассчитанная из значения Ср(Тш), не зависит от молекулярного веса и отражает плавление "кооперативной единицы". Совпадение ДНкал и ДНэфф наблюдается только для коротких полимерных цепей (-10000), а для более длинных - ДНэфф много меньше ДНкал. Это означает, что в гомополимерах наблюдается плавление квазинезависимых "доменов". Такое поведение

гомополимеров сходно с холодовой денатурацией белков, состоящих из нескольких "доменов" (Griko et al, 1989).

Полученные результаты дают основание предполагать, что "доменный" характер плавления больших белков не определяется специфической аминокислотной последовательностью, а скорее является типичной характеристикой больших молекул, зависящей от соотношения объема и поверхности системы.

11,1.6. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА - НЕ ИСКЛЮЧЕНИЕ, А СКОРЕЕ

ПРАВИЛО

В последние годы было обнаружено, что многие белки имеют термодинамически устойчивые промежуточные состояния, свойства которых обнаруживают все черты состояния расплавленной глобулы. Анализ этих экспериментальных данных был проведен нами в обзоре (Бычкова и Птицын, 1993). Оказалось, что кроме а-лактальбуминов и карбоангидразы, образующих в определенных условиях "классическую" расплавленную глобулу, это состояние к тому времени было обнаружено еще в 16 белках, для которых три основные характеристики расплавленной глобулы - компактность, наличие вторичной структуры и отсутствие жесткой третичной структуры -были установлены. Кроме того, имеющиеся неполные данные еще для 26 белков, позволяют предположить наличие у них этого состояния. Отсюда можно сделать следующие выводы:

1) Около 45 белков имеют свойства расплавленной глобулы. Это предполагает, что подобное состояние является не исключением, а скорее правилом для белков в мягких денатурирующих условиях.

2) Белки могут быть переведены в состояние расплавленной глобулы действием низких или высоких pH, высокой температурой, умеренными концентрациями ГГХ или мочевины, под влиянием литиевых и других солей, т.е. различными умеренно денатурирующими воздействиями.

3) Белки могут быть трансформированы в состояние расплавленной глобулы и без изменения окружения (т.е. почти при физиологических условиях) малыми изменениями в их химической структуре (Shortle & Meeker, 1989; Lim et al., 1992; Amir & Haas, 1988; Гильманшин и др., 1982; Kuwajima, 1989).

4) Среди белков, претерпевающих pH-зависимый переход в MG, имеется много белков, претерпевающих воздействие мембран (колицины, гормон роста, ретинол-связывающий белок, ингерфероны, дифтерийный токсин).

Возникает вопрос: может ли электростатическое поле мембран наводить сходные переходы в этих белках? Ответ на этот вопрос будет дан ниже (см. раздел И.2.2.), так как это является частью общего вопроса о возможной роли расплавленной глобулы в клетке.

11.2. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОЬУЛА in vivo

11.2.1. ГИПОТЕЗА О ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ РАСПЛАВЛЕННОЙ" ГЛОБУЛЫ И ЕЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ.

Свойства расплавленной глобулы (см. табл. I), делаться на 4 группы:

1) сходные, но не идентичные, со свойствами нативного белка;

2) сходные со свойствами развернутого белка;

3) промежуточные между свойствами нативного и развернутого состояний;

4) специфические, которые обычно отсутствуют (или сильно ослаблены ) в иативном или разверну том состояниях.

Основываясь на этих свойствах, можно предложить следующую модель, отражающую основные характеристики расплавленной глобулы:

это состояние белковой молекулы достаточно компактно и обладает выраженной вторичной структурой, сохраняет гидрофобное ядро, но лишено плотной упаковки боковых групп. Молекула белка становится более лабильной, в ней возрастают флуктуации структуры, особенно на периферии, позволяя воде проникнуть во внешний слой белка. В силу повышенной гибкости белковой молекулы, часть гидрофобных групп, ранее погруженных во внутрь белка, может быть экспонирована наружу. Появление дополнительной гидрофобной поверхности представляет специфическое свойство расплавленной глобулы и ответственно за его тенденцию к ассоциации. Увеличение гибкости белка создает предпосылки для большей доступности протеолизу.

Эти свойства расплавленной глобулы делают ее способной подстраиваться к большому разнообразию внешних условий, и поэтому компетентной для участия во многих процессах в клетке. Часть этих условий является денатурирующими, например, pH 4,5 внутри лизосом или локально низкое pH около мембран. Было показано, что для транслокации белка через мембрану требуется его денатурация ( Eilers & Schatz, 1986, 1988; Endo & Schatz, 1988; Vestweber & Schatz, 1988; Eilers et al, 1988). Предшественник ß-лактамазы, сразу после биосинтеза не достигший еще жесткой структуры, связывается с GroEL и может быть транслоцирован, но теряет эту способность после приобретения жесткой структуры (Bochkareva et al.,1988; Freedman , 1992). Денатурация белка облегчает его связывание с мембраной (например, дифтерийный токсин, Zhao & London, 1988).

Сочетание подвижности и наличия внутренней воды, способной соль-ватировать полярные группы, создают возможность равновесия следующего типа, проявляющегося в состоянии расплавленной глобулы:

-t-

экспонированные заряды

заэкранированные заряды

Таким образом, молекула белка в состоянии расплавленной глобулы приобретает способность аккомодироваться как к полярному, так и к неполярному окружению. Это может позволить белкам в этом состоянии взаимодей-ствоать с водно-липидными поверхностями гораздо легче, чем в нативном состоянии, что может объяснять повышенное сродство белка к мембранам при низких рН. Более того, состояние с менее полярной поверхностью может быть транслоцировано через мембрану со сравнительно небольшой свободной энергией активации. Эти наблюдения позволили нам высказать гипотезу, что состояние расплавленной глобулы может существовать в клетке и играть важную роль во многих физиологических процессах ( Bychkova et al., 1988). Это может проявляться в следующем:

1) шапероны связывают негативные белки;

2) вновь синтезированная белковая цепь может иметь ненативное состояние, стабилизированное связыванием с шаперонами; белки теплового шока связывают неактивные мономерные субъединицы олигомерных белков, предотвращая их агрегацию до образования ими четвертичной структуры.

3) в транслокации белков через мембрану (возможно, белки доставляются к мембранам в комплексе с шаперонами);

4) перед деградацией белков (в лизосомах кислые рН, а убиквитин-зависимая система деградации может требовать наличия или образования ненативного состояния).

И, вполне вероятно, что во всех этих случаях ненативное состояние белка представляет собой расплавленную глобулу. (Bychkova et al., 1988).

Экспериментальное подтверждение гипотезы. За 9 лет, прошедших с момента высказывания этой гипотезы, практически все ее предсказания были подтверждены экспериментально. Рассмотрим ряд работ, появившихся в литературе, где показано, что ненативное состояние белка, участвующее в том или ином процессе, представляет собой расплавленную глобулу, а затем остановимся на собственном экспериментальном вкладе в доказательство гипотезы о функциональной роли расплавленной глобулы.

Следует наломить некоторые характеристические времена - время биосинтеза небольшого белка или домена составляет ~10сек (Alberts et al, 1983,); время образования расплавленной глобулы - несколько секунд после биосинтеза (Semisotnov et al., 1987; Ptitsyn et al., 1990; Goldberg et al., 1990J; время образования жесткой третичной структуры может превышать 1000 сек (Colman et al, 1982; Gething et al, 1986). Эти факты предполагают, что белок может приобрести состояние MG сразу после биосинтеза и сохранять его долгое время, пока не трансформируется в N. Поскольку между MG и N существует большой потенциальный барьер, то клетка может иметь несколько причин сохранять белок в состоянии MG, предохраняя его от сворачивания не там и не тогда, когда надо, чтобы обеспечить правильной процесс сворачивания в нужное время в нужном месте (Ellis & Van der Vies, 1991).

Доказательство гипотезы".

Экспериментально было показано, что ишпероны:

- не взаимодействуют с N, но узнают вновь синтезированную цепь (Bochkareva et al, 1988); после биосинтеза 50% белков Е. coli остаются' связанными с шаперонами (Beckman et al, 1990; Viitanen et al, 1992);

- свойства белков дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и роданезы, связанных с шаперонами, сходны со свойствами MG этих белков в растворе (Martin et al, 1991, 1992)\ аналогичные результаты полученыдля Rubisco (Van der Vies et al, 1992); лактальбумин и циклофилин, связанные с GroEL, согласно ЯМР имеют дестабилизированную структуру и повышенный дейтерообмен, аналогично состоянию MG лактальбумина; при этом наличие развернутой конформации (U) исключается (Zahn et al, 1994; Robinson et al, 1995); при этом показано, что узнавание белков шаперонами неспецифично (Kassenbrock et al, 1988; Lakey et al, 1992; Lorimer, 1992);

Из этих данных можно заключить, что шаперон GroEL узнает интер-медиаты в сворачивании белка со свойствами, сходными с состоянием MG.

Для внедрения белков в (или транслокации через) мембрану показано,

что:

- состояние белков или их предшественников, компетентное к транспорту в митохондрию, не является нативным, т.к. оно доступно протеазам и не связывает лигандов; импорт частично развернутых предшественников происходит быстрее и эффективнее, чем нативных, что означает, что это состояние отделено высоким потенциальным барьером от нативного состояния (Eilers & Schatz, 1988; Glick & Schatz, 1991);

- поскольку кинетический интермедиат возникает через секунду после биосинтеза, это позволяет предположить, что состояние, компетентное к транслокации, может быть MG; (Randall & Hardy, 1986; Bochkareva et al, 1988; Ptitsyn & Semisotnov, 1991);

- предшественник ДГФР, связанный с мембраной, является компетентным к транспорту и сходен по свойствам с состоянием, полученным при разбавлении растворов белка в мочевине (Eilers et al, 1988);

внедрение порообразующих доменов колицинов и дифтерийного токсина в мембрану требует MG (Cavard et al., 1988; Parker et al., 1990; Van der Goot et al., 1991; Jiang et al., 1991; London, 1992);

- белки слияния (например, гемагглютенин вируса гриппа) переходят в MG перед слиянием с мембраной (Stegman et al, 1990; Tsurudome et al, 1992; Krumbiegel et al, 1994,);

Для процесса деградации показано следующее:

- долгоживущие белки деградаруются в лизосомах при рН 4,5 пулом гидролаз (Ciechanover, 1982; Reichsteiner et al, 1987); a короткоживущие белки проходят через убиквитин-АТФ-зависимую систему (Rechsteiner, 1987; Waxman et al, 1987; Varshavsky, 1992);

- трипсинолиз лактальбумина в MG идет быстрее, чем в нативном состоянии, но медленнее, чем в развернутом (Дюйсекина и Бычкова, неопубл.);

- белки, предназначешгые для деградации, подвергаются модификации: окисление, метилирование, фосфорилирование или убиквитинирование соответствующих групп (Hershko & Ciechanover, 1982, 1992; Stadtman, 1987; Rcchsteiner et al, 1987; Ashwad & Jonson, 1987>; окисление глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы ведет к дестабилизации ее структуры и делает ее компетентной к деградации (Friguet et al, 1994);

- состояние белка, компетентное к деградации, узнается шаперонами: для РНКазы А - hsp73 (Chiang et al, 1989); для несекретируемого аналога щелочной фосфатазы - Dna К (Sherman & Goldberg, 1992); для Ig тяжелых цепей - BiP (Bole et al, 1986); для клатрина - hsp73 (Chappell et al, 1986); шапероны hsp70 и Mdj lp комбинируются с протеазой PIM1 в митохондрии (Wagner et al, 1994);

Все вышеизложенные данные не оставляют сомнения, что состояние расплавленной глобулы действительно может иметь функциональное значение, что подтверждает высказанную нами гипотезу.

Теперь я переццу к изложению собственных экспериментальных результатов, подтверждающих гипотезу.

11.2.2. ДЕНАТУРИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ МЕМБРАН И ЕГО МОДЕЛИРОВАНИЕ или ПОЧЕМУ КЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ МОГУТ БЫТЬ В СОСТОЯНИИ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ?

Возникает естественный вопрос: как состояние расплавленной глобулы может возникнуть в клетке? Есть, по крайней мере, три возможности:

- это кинетические интермедиаты, фиксируемые шаперонами;

- это мутантные белки, которые не могут полностью свернуться при физиологических условиях;

- это денатурированные белки.

Что же может денатурировать нативные белки в клетке? В работах группы Шатца, упомянутых выше, предположено, что частичное разворачивание белка на поверхности мембраны не может не иметь физиологического значения. Они же показали, что частичное разворачивание белка обусловлено отрицательными зарядами на поверхности мембраны (Endo & Schatz, 1988; Eilers et al, 1989; Endo et al, 1989). В самом деле, еще в 1979 году было обнаружено (Eisenberg et al, 1979), что мембранная поверхность с сильным электростатическим потенциалом может притягивать протоны, приводя к локальному понижению рН по крайней мере на 2 единицы на расстоянии 5-15Â от поверхности мембраны в соответсвии с простой электростатической теорией. Напомним, что именно низкие рН дают возможность получить состояние расплавленной глобулы для многих белков (Ptitsyn, 1987, 1992; Бычкова и

Птицын, 1993). Поэтому создается впечатление, что мембрана не только нуждается в состоянии расплавленной глобулы для трпнелокацми белков, но и сама наводит переход в это состояние своей собственной отрицательно заряженной поверхностью. рН около мембраны митохондрий может понижаться также за счет выброса протонов, выделяемых дыхательной системой в межмембранное пространство, через поры внешней мембраны (Скулачсв, 1989).

Мною была высказана гипотеза (ВусЬкоул & РМвуп, 1993), что эффективная диэлектрическая проницаемость срсды около мемранной поверхности может также понижаться, тем самым усиливая электростатические взаимодействия и помогая локально низким рН трансформировать белки в состояние расплавленной глобулы. Простые расчеты показывают (Ландау и Лифшиц, 1982), что эффективная диэлектрическая проницаемость воды на границе раздела двух фаз (водной и органической) может быть вдвое меньше ее нормальной величины.

Каким образом можно смоделировать эти условия около мемраны, которые могут денатурировать изначально нативные белки?

Учитывая, что денатурирующее действие мембран обусловлено с одной стороны понижением локального рН, и предполагая, что с другой стороны оно в большей степени определяется влиянием гидрофобной части мембраны, проявляющемся в понижении диэлектрической проницаемости среды, мы предложили простую грубую модель, сочетающую локальное понижение рН и диэлектрической проницаемости (Bychkova et al., 1996; Ptitsyn et al., 1996): использовать смеси вода-спирт при умеренно низких рН, поскольку было показано (Wilkinson & Маует, 1986; Dufour et al, 1993; Uversky et al., 1997; Dujsekina et al., 1997, submitted), что денатурирующее действие спиртов определяется в основном понижением средней диэлектрической постоянной раствора, а не специфическими свойствами отдельных спиртов.

Моделирование. Для проверки гипотезы был выбран цитохром с, так как он является одним из белков межмембранного пространства митохондрии и функционирует около внутренней мембраны, перенося электроны от цитохром с-редуктазы к цитохром с-оксидазе, т. е. он может испытывать на себе воздействие поля мембраны, не будучи связан с ней непосредственно при физиологических условиях, Для изучения конформационных переходов в цигохроме с были использованны методы кругового дихроизма,

ницаемость воды, равная 81 при 20"С (или 74 при 37°С), и с: - диэлектрическая проницаемость внутри липидного слоя, равная 4.

флуоресценции, микрокалоримстрии и диффузии (ВусЬкоуа сЧ а], 1996). На рис. 10 представлены переходы в цигохроме с в зависимости от содержания метанола при рН 4 , тестируемые по спектрам КД в ближней и дальней УФ областях. Видно, что переход носит двухстадийный характер: уменьшение интенсивности спектра ближнего КД завершается к 40% метанола при практическом постоянстве спектра дальнего КД, а свыше 40% спирта наблюдается рост интенсивности спектра дальнего КД. На первой стадии происходит разрушение третичной структуры, на второй стадии - переход в состояние с более выраженной вторичной структурой, но без плотной упаковки боковых групп. Двухстадийность этого перехода потверждается изменением флуоресценции единственного Тгр59. Эти стадии хорошо разнесены, так что можно заключить, что при 40% спирта при рН 4 в 0,15 и 0,5 М ЫаС1 существует почти 100% промежуточного состояния. Оно обладает физическими свойствами, описанными ниже:

На рис. 11 приведен спектр дальнего КД для промежуточного состояния цитохрома с в водно-метанольной смеси, и для сравнения представлены спектры его нативного и развернутого состояний и состояния расплавленной-—

Концентрация метанола ¡£

Рис.10, а) Зависимость молярной эллиптичности [0]280 и [0]22О от концентрации метанола; рН 4,0 в 0,5М ЫаС1; 24°С. Тонкие линии представляют базовые линии, экстраполированные от малых и больших концентраций метанола, б) Те же данные представлены в относительных единицах,

доля денатурированных молекул.

Длина волны ( ни )

2ю гго гю гю г5о

о го «о

Концентрация метанола ( % % )

Рис. 11. Спектры дальнего КД цитохрома с в 40% и 72% МеОН (рН 4,0; 0,5М КаС1) по сравнению со спектрами в N (рН 4,0 ; 0,5М №С1), и (в 7МГТХ) и в Мй, полученной в водном растворе при кислых рН (рН 2,0; 0,5М N301). Т= 24°С.

глобулы, а также его спектр в растворе с высоким содержанием метанола (спектр ближнего КД сильно уменьшен при 40% метанола).

Гидродинамические размеры цитохрома с представлены в таблице 3. '

Промежуточное состояние при умеренных концентрациях метанола, обнаруженное нами, удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к состоянию расплавленной глобулы (см., например, Ptitsyn, 1992), а его структурные характеристики сходны с таковыми для расплавленной глобулы цитохрома с в водном растворе, описанной Огуши и Вада (Ohgushi & Wada, 1983). Таким образом, цитохром с может быть трансформирован из N состояния в MG в водно-метанольных смесях при умеренно низких pH, т.е. в мягких денатурирующих условиях сходных с теми, которые можно ожидать около мембранной поверхности. Как мы предполагаем, эта система позволяет смоделировать оба денатурирующих воздействия мембранной поверхности, локальное понижение pH и локальное уменьшите диэлектрической постоянной, предложенные соответственно Шатцем (Eilers & Schatz, 1988; Endo & Schatz, 1988) и нами (Bychkova & Ptitsyn, 1993). Эти результаты можно рассматривать как первое указание на то, что белки могут трансформироваться в состояние расплавленной глобулы в условиях, моделирующих окружение мембран.

Таблица 3. Молекулярные размеры цитохрома с в различных конформационных состояниях.

Состояние Условия Коэфф. диффузии D20.W-107 Радиус Стокса Rs(A) DN20,W/D20,W

Нативное pH 4; 0,15MNaCl 14,0+0,2 15 (1,00)

Расплавленная pH 2; 11,5 19 1,22

глобула 0,5MNaCl

Интермедиат в pH 4; >10,2 <21 <1,37

растворе вода- 0,I5MNaCl

метанол 40%

Развернутое pH 2; H2O-HCI 7,7 28 1,82

И.2.3. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА И ТРАНСПОРТ НЕПОЛЯРНЫХ ЛИГАНДОВ или МОДЕЛИРОВАНИЕ ФУНКЦИИ БЕЛКА ВБЛИЗИ МЕМБРАН.

Белки могут испытывать воздействие мембран не только при связывании с ними, но и при переносе различных лигандов к соответствующим клеткам. Существует специальный класс белков, переносящих неполярные

лигапды такие, как ретинол, жирные и желчные кислоты. Группа белкой, как ретинол-связывающий белок, р-лактоглобулин и билин-связывающий белок, принадлежит к структурному классу восьмичленных p-цилиндров с антипараллельной укладкой (3-структуриых участков. Наиболее изучен из них ретинол-связывающий белок плазмы крови (RBP), переносящий витамин А из клеток печени к соответствующим тканям. RBP используется только один раз и после передачи ретинола фильтруется почками из русла крови и деградирует. При этом ретинол может быть передан как рецептору на поверхности клетки, так и прямо на мембрану или липосому, причем скорость передачи липосомам сильно возрастает при понижении рН (Fex & Johannenson, 1987). Со структурной точки зрения ретинол плотно упакован внутри белковой молекулы и удерживается там ван-дер-Ваапьеовыми взаимодействиями с боковыми гидрофобными группами белка. Нами было предположено, что только ослабление жесткой структуры белка может привести к освобож-дешпо ретинола. Следить за этим процессом можно с помощью флуоресценции на 460нм или полосы 325нм в спектре ближнего КД, характерной для связанного ретинола. Мы показали, что ретинол может быть полностью удален из своего белка-носителя при кислых рН в водной среде (Bychkova et al, 1992). На рис.12 представлена зависимость выхода ретинола и денатурации RBP от рН в относительных единицах. Возникает вопрос: каковы структурные предпосылки этих переходов?

Как обсуждалось выше, около поверхности мембраны можно ожидать локального понижения рН. Изучение рН-зависимых конформационных переходов в RBP показало (Bychkova et al., 1992), что при низких рН ario-RBP (так же как и холо-RBP после освобождения ретинола) переходит из нативного состояния в компактное состояние, с ярко выраженной вторичной структурой и с увеличешюй гидрофобной поверхностью. Однако, оно утратило жесткую нативную структуру, как это следует из спектров ближнего КД и ЯMP в высо

ftifo

1.0

Рис. 12. Зависимость от рН выхода ретинола из RBP и денатурации ano-RBP, о.® Относительная доля молекул RBP, отдавших ретинол (fa, □) и денатуриро- о.б ванных молекул ano-RBP (fa, • ) отложена от значений рН. Выход ретинола и 0,4 денатурация RBP регистрировались с помощью спектров КД в ближней УФ-обла- вЛ сти (при 325 нм и 285 нм соответственно) Q

г з 4 5 6 7 в

копольной области и микрокалориметрических измерений. Спектры КД представлены на рис.4, а оценка компактности молекул RBP - в таблице 4. Свойства, наблюдаемые для RBP при рН 2,0, отвечают всем требованиям, пре-

рН

дъянляемым к состоянию расплавленной глобулы. Более того, рН-зависимая денатурация ГШР практически совпадает с зависимостью от рН выхода ретинола. Однако, как подчеркивалось выше, в клетке можно ожидать понижения рН около мембраны порядка 2-х единиц рН, а этого явно недостаточно для освобождения ретинола и денатурации 11ВР. Поэтому мы предположили, что в случае передачи гидрофобных лигандов только совместное ("концертное") действие заряженной поверхности мембраны и ее гидрофобной части (локально низкого рП и локального понижения диэлектрической проницаемости) может привести к желаемому результату. Исследова1ше денатурации

Таблица 4. Оценка компактности ГШР в различных состояниях.

Параметр Нативное Расплавленная Развернутое

(рН 7,5) глобула (рН 2,0) (7 М ГГХ)

Лгеа 4,4 9,7 24,5

^тпах 335нм 335-336нм 350нм

1/р 12,8 15,6 36,8

Ого^ 11,3 10'7см2/с 10,0 10"7см2/с -

19,0А 21,5А -

ЯВР и освобождения ретинола в зависимости от рН и содержания метанола показало, что, действительно, можно получить выход ретинола в мягких денатурирующих условиях (рН 3,5-5,0 и содержание метанола 20-40%, что равносильно понижению диэлектрической постоянной до 65-55). Свойства молекулы ГШР сразу после освобождения ретинола в различных условиях

Таблица 5. Деполяризация триптофановой флуоресцешдаи КВР в различных состояниях -

Состояние

Условия

1/Р

Нативное

Расплавленная глобула

Промежуточное, при совместном действии рН и метанола Развернутое

рН 7,5; 0,005М фосфата № 12,8

0% метанола

рН 2,0; 0,005М фосфата Ыа 15,6

0% метанола

рН 3,3-3,5; 0,005М фосфата Ыа 12,3-12,9 19 % метанола

рН 7,0; 6М ГГХ 36,8

обнаруживают удивительное сходство между собой и свойствами состояния расплавленной глобулы, полученного в водной среде при рН 2,0. Для примера на рис.13 сопоставлены спектры дальнего КД разных денатурированных состояний ЩЗР, уже не содержащих ретинол. Видно, что они сходны между собой и сильно отличаются от спектра нативного состояния, приведенного там же для сравнения (ВусЬкоуа, ¥гаЫгг\ е1 а1., 1995).

Данные по оценке компактности молекул ИВР в присутствии метанола приведены в табл. 5 , откуда следует, что молекулы ШЗР в промежуточном

Длина волны ( им ) На рис.14 представлены для сравнения переходы в 11ВР в относительных еди-

Рис.14. Переходы в ЮЗР (в относитель- о

пых единицах), наблюдаемые разными §

методами, в зависимости от содержания §

метанола при рН 3,5 и рН 8,5. 5

Обозначения: выход ретинола, тестируе- ^

мый по полосе 325нм спектра ближнего ~

КД: рН 3,5 - ■ ; рН 8,5 - • ; денатурация |

ЯВР, тестируемая по полосе 224нм 5

спектра дальнего КД: рН 3,5 - V; ° рН 8,5 - ; денатурация апо-КВР: на 280нм - 0 ; на 224нм - О.

% метанола

нпцах, наблюдаемые при разных рН в зависимости ог содержания метанола. Четко видно, что переходы сильно разнесены и что усиление денатурирующего действия понижения рН требует уже существенно меньшего вклада, второго денатурирующего агента (метанола). Полученные результаты позволили построить диаграмму состояний ШЗР в зависимости от рН и диэлектрической постоянной, представленной на рис.15.

142.8

о с;

о н

О)

Облость денатурированного состояния

•а

г\е9

е%о<)°

с>> ^

/ сГ /

л°

/О /

р /

/ Область

нативного состояния

47.3

51.7

56.2

60.6

65.1

69.5

74.0

89-

РН

Рис.15. Диаграмма состояний ШЗР в зависимости от рН и концентрации метанола (и диэлектрической проницаемости раствора с,фф, соответственно) при 37°С. Нативная область соответствует молекулам КВР, содержащим ретинол; денатурированная область - молекулам ШЗР, отдавшим ретинол и утратившим жесткую третичную структуру, но сохранившим вторичную структуру; область перехода соответствует условиям, где ретинол может быть освобожден из ШЗР за разумные времена (-1 часа). На границе области перехода и денатурированной области молекулы ШЗР находятся в состоянии, обозначенном кружком (о), сходном с состоянием расплавленной глобулы КВР при рН 2,0, обозначенного заштрихованным кружком.

Суммируя данные этой работы, можно сказать, что ретинол может быть освобожден из своего белка-носителя ШЗР "концертным" действием умеренно низких рН и умеренно низких значений диэлектрической проницаемости, т.е. при достаточно умеренных денатурирующих условиях. Это означает, что впервые удалось смоделировать функцию ШЗР - передачу ретинола - в простой искусственной системе (водно-органические смеси при умеренно низких рН). Показано также, что белок после выхода ретинола трансформируется в состояние, сходное с расплавленной глобулой.

Имея в виду структурное сходство белков семейства КВР и способ связывания ими лиганда, можно предположить, что механизм освобождения

ретинола из ШЗР может иметь общие черты с освобождением лигандов другими белками этого семейства.

Таким образом, предложенная нами гипотеза о роли расплавленной глобулы в транслокации белков через мембрану (или внедрении в мембрану) может быть распространена также на процесс передачи лигандов белками-переносчиками (такими как ШЗР) соответствующим клеткам-мишеням.

С нашей точки зрения, есть аналогия между внедрением токсинов и других белков в мембрану и направленной передачей ретинола и, возможно, других неполярных лигандов, погруженных глубоко внутрь структуры белка. В обоих случаях гидрофобная часть, которая должна быть освобождена, плотно упакована внутри структуры белка. Поэтому для выхода гидрофобной шпильки колицина А или молекулы ретинола из ШЗР нужно преодолеть высокий потенциальный барьер. Этот барьер резко уменьшается около мембранной поверхности при переходе белка из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы. С одной стороны, мембрана нуждается в "частично денатурированном" состоянии бежа (расплавленной глобуле), а с другой стороны, она сама может создать это "частично денатурированное" состояние из нативных белков своим собственным поверхностным потенциалом. Это позволяет заключить, что переход белка (или белкового домена) в состояние расплавленной глобулы под влиянием поля мембраны может быть обязательным как для внедрения белков в мембрану (или транслокации через), так и для направленной передачи неполярных лигандов их белками-носителями (ВусЫсоуа & РП1зуп, 1993).

П.З. ПЕРСПЕКТИВЫ

И.3.1. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА И БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

В последние годы появились новые данные о белок-белковых взаимодействиях, где вовлекается ненативное состояние белков. Это наблюдается в ряде процессов: белок-рецепторное узнавание, взаимодействие шаперонов с белками, окисление и восстановление цистеинов белковой дисульфидизоме-разой, белковые матрицы, удерживающие на себе ферменты (особенно фосфатазы и киназы) в неактивном состоянии; участие цитоскелета в регуляции концентрации бежов; транслокационный комплекс во внешней мембране митохондрий; олигомеризация белков.

Во всех этих процессах вовлекается ненативное состояние бежа, которое может возникать или существовать в присутствии другого белка. Эти факты позволяют предположить, что белки могут представлять собой специфическую микрофазу, способную оказывать денатурирующее действие на другие белки благодаря наличию зарядов на поверхности и достаточно низкой диэлектрической проницаемости внутри белковой молекулы.

Поэтому предложенный нами подход - исследовать белки в окружении, имитирующем мембранное поле (концертное действие умеренно низких рН и диэлектрической проницаемости), может быть полезен и при изучении белок-белковых взаимодействий. Косвенным указанием на полезность такого подхода может служить тот факт, что для диссоциации олигомерных структур необходимо менять рН, жмшуго силу раствора, добавлять детергенты, т.е. изменять "нативные" условия достаточно сильно. Вполне возможно, что, если включить органический растворитель как компонент буферной системы для диссоциации, то денатурирующие условия для белков будут более мягкими. Этот подход может быть полезен также при выделении белков из телец включения при биотехнологическом получении белков.

11.3,2. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА И НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ЗАБОЛЕВАНИЯ.

Еще одно возможное проявление расплавленной глобулы в клетке состоит в том, что она может быть вовлечена в механизм возникновения некоторых генетических заболеваний, вызываемых точечными мутациями в белках, которые приводят к изменению их локализации в клетке. Было показано, что эти мутантные белки задерживаются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и обнаруживаются в комплексе с шаперонами. Поскольку мутации не позволяют белку свернуться в нативную конформацию, белки оказываются связанными с шаперонами довольно длительное время. После этого они освобождаются АТФ-зависимым путем для деградации в ЭР, где существует "контроль качества" для секреторных и мембранных белков, препятствующий выходу неправильно свернутых или неправильно процессировашшх белков.

Примеров таких несколько. Один из них - болезнь муковисцидос (cistic fibrosis), большинство случаев которой связано с делецией одного Phe508 в последовательности трансмембранного регулятора проводимости (CFTR). Было показано (Yang et al, 1993) , что этот мутантный белок находится в комплексе с hsp 70 в ЭР вместо того, чтобы быть встроенным во внешнюю мембрану (Accili et al, 1992).

Сходный механизм наблюдается и для некоторых других заболеваний, включая, например, гиперхолестеринемию, вызываемую мутацией в рецепторе липопротеина низкой плотности, связывающего холестерин (Lehrman et al, 1987), и энфизему, связанную с мутацией в al-антитрипсине (Lomas et al, 1992; Sifer, 1995; Le et al, 1994). В случае антитрипсина показано, что Z тип мутантного белка (замена Glu342 на Lys) не может свернуться в правильную конформацию при 37°С и находится в состоянии кинетического компактного интермедиата, также связанного с шаперонами (Sifer, 1995; Le et al, 1994; Yu et al., 1995). В этом случае белок отсутствует в месте своего назначения - в плазме крови, оставаясь в эндоплазматическом ретикулуме.

Структурной основой описанного выше процесса являются убедительные данные in vitro, показывающие, что точечные мутации могут тормозить

последнюю стадию сворачивания белка и фиксировать белок в состоянии кинетического интермедиата при физиологических условиях. Такие данные были получены для тсмпсратурно-чувствительных мутантов эндорамнозидазы фага Р22 (Goldenberg & King, 1981; Smith & King, 1981); для термочувствительного мутанта G-белка вируса везикулярного стоматита (Machamer & Rose, 1988; Machamer et al., 1990). Довольно подробно изучены точечные мутации в неполярном ядре N-концевого домена ?. репрессора (Lim et al., 1992). Эти примеры четко показывают, что единственная мутация способна трансформировать нативный белок в состояние расплавленной глобулы.

Принимая во внимание вышесказашюе, мы предложили гипотезу, что неполное сворачивание белка, вызванное точечной мутацией и блокированное на стадии кинетической расплавленной глобулы или сходного интермедиата, ведет к изменению пути следования белка в клетке и тем самым провоцирует генетическое заболевание (Bychkova, Ptitsyn, 1995).

После того, как эта гипотеза была выдвинута, появились примеры, подтверждающие ее. Экспериментальные данные для супрессорного белка р53, связанного с различными формами канцерогенеза, показывают, что ряд мутаций ведет к инактивации его способности подавлять развитие опухоли. Существуют две структурные мутации, замещающие Argl75 и Vall43, которые не связаны напрямую с функцией белка (Cho et al, 1994; Sturzbecher et al, 1987). Показано, что одни и те же мутации ведут, с одной стороны, к денатурации белка, а с другой - к его делокализации в клетке, что соответствует нашей гипотезе. Другой пример - это супрессорный белок р16 (ингибитор цик-лин-О-зависимой киназы), также связанный с раковьми заболеваниями. Его структурные мутанты обнаруживают дефектное сворачивание (конформация мутантных белков сходна с расплавленной глобулой), что может является, по мнению авторов, общим механизмом инактивации р 16 (Zhang & Peng, 1996).

Тог факт, что мутантаые белки не могут свернуться в нативную структуру, обнаружен и при развитии различных форм амилоидозиса (amyloidosis). В этом участвуют такие белки, как легкие цепи иммуноглобулинов, трансти-ретин, аполипопротеин Al, лизоцим, инсулин и др, (Kelly, 1996). В развитии дегенеративных заболеваний большую роль играют прионные белки, способные из-за мутаций легко изменять свою структуру, содержащую как а-егшра-ли, так и (3-участки, на в основном ¡i-структуру, используя прионный агент как матрицу (см., например, обзор Prusiner, 1995; Chernoff et al, 1995; Safar et al, 1994).

Поэтому, если предложенная нами гипотеза верна, то из нее вытекает следствие, что при подходе к дизайну лекарств против такого рода генетических заболеваний следует принимать во внимание структурные принципы. Тогда изучение влияния лигандов или разнообразных кофакторов на сворачивание мутантных белков in vitro могло бы привести к новому рациональному конструированию лекарств, обеспечивающих правильное

сворачивание мутантных белков как одной из возможностей лечения генетических заболеваний наряду с другими лекарствами.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные экспериментальные результаты позволяют установить основные характеристики важнейшего интермедиата сворачивания белков. Это состояние:

- достаточно компактно, как это следует из определения гидродинамического радиуса белковой молекулы в различных состояниях методами квазиупругого светорассеяния и диффузии;

- имеет ярко выраженную вторичную структуру, сходную по содержанию вторичной структуры с нативным белком;

- лишено жесткой упаковки боковых групп, характерной для нативной молекулы белка, что следует из резкого уменьшения спектров кругового дихроизма в ближней УФ области, обусловленных жесткой упаковкой боковых групп в окружении ароматических групп, и отсутствия кооперативного поглощения тепла при нагревании.

- имеет гидрофобное ядро, что проявляется в наличии Брегговских расстояний, характерных для плотной упаковки атомов; изменение этих расстояний в ядре молекулы при переходе из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы сходно с изменением расстояний при переходе из кристалла в жидкость;

- более доступно протеолизу, чем нативное состояние, хотя скорость протеолиза существенно медленнее, чем в полностью развернутом состоянии, как это следует из сопоставления трипсинолиза в И, Мв и и состояниях.

- отделено от нативного состояния белка переходом первого рода (т.е. имеется высокий энергетический барьер между этими двумя состояниями) как это четко прослеживается с помощью калориметрических данных при разворачивании белка ГГХ в условиях, где есть возможность наблюдать оба перехода - из N в МО и из МО в и.

Такое уникальное свойство расплавленной глобулы, как сохранение общей архитектуры белковой молекулы при достаточной гибкости интерьера, может позволить белковой молекуле легко адаптироваться к различным внешним условиям. Это привело нас к гипотезе, что состояние расплавленной глобулы может быть функциональным для данного белка в определенные периоды его жизни в клетке. Это может проявляться, в частности, в следующих процессах:

1) состояние расплавленной глобулы может возникать сразу после биосинтеза во вновь синтезированной полипептидной цепи и стабилизироваться шаперонами (белками-помощниками) как обычный кинетический интермедиат в сворачивании белка;

2) белки теплового шока и другие стрессовые белки могут связывать белки в

состоянии расплавленной глобулы;

3) эти же белки могут участвовать в транслокации белков через мембра1гу, сохраняя белок в состоянии, компетентном к транспорту;

4) это состояние может реализоваться непосредственно перед деградацией белка, который должен быть удален из клетки;

5) мономерные субъединицы олигомерных белков перед олигомеризацией могут находиться в состоянии расплавленной глобулы и связываться шаперо-нами, предохраняющими их от агрегации до образования четвертичной структуры;

Эта гипотеза нашла свое полное экспериментальное подтверждение и получила широкое признание.

Анализ условий в клетке привёл к заключению, что наличие кислых рН в некоторых органеллах, присутствие отрицательно заряженных мембран и развитого цитоскелета, большая концентрация белков могут создавать умеренно-денатурирующие условия в клетке. Основываясь на этих данных, была выдвинута гипотеза о денатурирующем воздействии мембран на белки, проявляющемся в концертном действии умеренно низких рН и умеренно низкой диэлектрической проницаемости на белки, находящиеся в поле действия мембраны, и предложена простая модель для ее экспериментальной проверки. Эта модель - исследование белков в водно-спиртовых смесях, так как было показано, что денатурирующее действие спиртов на белки определяется исключительно их низкой диэлектрической постоянной.

Предложенная гипотеза была экспериментально проверена на двух белках - цитохроме с и ретинол-связывающем белке (НВР), для которых были изучены конформационные переходы в водно-метанольных смесях при умеренно низких рН. Полученные результаты четко показывают, что в этих денатурирующих условиях цитохром с совершает переход в состояние, сходное по свойствам с состоянием расплавленной глобулы этого белка в водной среде. Для ретинол-связывающего белка удалось смоделировать и его функцию - передачу ретинола (витамина А) - в умеренно денатурирующих условиях. При этом одновременно с выходом ретинола сам белок совершает конформационный переход в состояние, сходное с состоянием расплавленной глобулы этого белка в водной среде при низких рН.

Результаты, полученные для цитохрома с и ЫВР, показывают, что белок может быть переведен в состояние расплавленной глобулы при комбинированном действии умерено низких рН (рН -4-5) и умеренного понижения диэлектрической проницаемости (до 60-55), т.е. в условиях, которые можно ожидать около отрицательно заряженной мембранной поверхности в клетке.

Такое умеренно-денатурирующее воздействие на белок может обусловливать освобождение гидрофобных лигандов из их белков-носителей, переводя эти белки в состояние, компетентное к этому процессу.

Возможно, аналогичный подход может быть полезен и при изучении

белок-белковых взаимодействий, особенно в практическом случае биотехнологического получения белков - поиске условий для выделения белков из телец включения и их последующей ренатурации.

Появление все возрастающего числа примеров, что генетические заболевания человека связаны с точечными мутацими в определенных белках, и данных in vitro об изменениях в структуре белка, вызываемых точечными заменами, позволили предложить гипотезу о связи генетических заболеваний с нарушениями процесса сворачивагам белка. Точечные замены в аминокислотной последовательности белка ведут к блокированию процесса сворачивания белковой молекулы на последней стадии - стадии кинетической расплавленной глобулы. Это приводит к изменению нормального пути следования белка к месту его назначения в клетке и провоцирует, тем самым, возникновение генетического заболевания. В пользу этой гипотезы говорят данные, полученные для раковых заболеваний, вызываемых мутациями в двух супрессорных белках - р53 и р16. Следствием этой гипотезы является необходимость учитывать структурные особенности мутантных белков при конструировашга соответствующих лекарств против этих заболеваний.

Суммируя все вышеизложенные результаты, можно сказать, что наличие функциональной роли денатурированных белков в клетке (в состоянии расплавленной глобулы) открывает новое направление исследований и позволяет объяснить многие казавпгаеся до этого странными результаты при исследовании состояния белков во многих клеточных процессах.

О научно-практической значимости работы. Полученные данные об интермедиатах в сворачивании белка вносят вклад в фундаментальные знания о принципах структурной организации белковых молекул и позволяют понять их связь с поведением белков в клетке.

Полученная информация может быть использована при конструировании искусственных белков с заданными свойствами (см., например, Dolgikh et al., 1996) и при целенаправленной модификации белков для биотехнологии. Она может быть с успехом применена и к выделению белков, полученных биотехнологическим способом. Она может найти практическое применение и в пшцевой, фармацевтической и парфюмерной промышлен-ностях, так как многие эмульсии получаются при умеренно кислых рН, когда можно ожидать трансформации белка из нативного состояния в промежуточное. Увеличение гидрофобной поверхности белков в промежуточных состояниях должно повышать их эмульгирующую способность.

Способность белков переходить в состояние расплавленой глобулы при определенных условиях позволяет конструировать носители для пероралыюго приема таких широко распространенных белковых лекарств как инсулин, интерферон и гормон роста. Эти носители позволяют перенести эти белки через низкое рН в желудке в сильно стабилизированном состоянии расплавленной глобулы и освободить их в тонком кишечнике для усвоения клетками эпителия (Leone-Bay et al., 1995; Milstein et al., 1996, in press; работа

проведена на фирме Emispherc Technologies, Inc., USA).

Данная работа представляет собой первое указание на функциональное значение расплавленной глобулы - равновесного и кинетического интер-медиата на пути сворачивания белков в клетке. Высказанные гипотезы и их экспериментальная проверка открывают новое направление работ по изучению "ненативных" состояний белков, которые могут быть функциональными для данного белка в определенные периоды его жизни (см., например, Uversky et al., 1995). Изучение условий, при которых эти ненативные состояния возникают, должно помочь в исправлении дефектов в сворачивании белков, ответственных за изменение путей следования белков в клетке и связанных с генетическими заболеваниями.

Результаты, изложенные в предлагаемой диссертационной работе, могут быть использованы в работе ряда учреждений, где исследуются свойства белков и молекулярные механизмы их функционирования, таких как: Кафедры биофизики биологического и физического факультетов МГУ, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Институт биофизики клетки РАН, Институт химической физики РАН, Институт биоорганической химии РАН, Институт молекулярной биологии РАН, Институт цитологии РАН, и другие.

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В этой главе описано получение белков, которые выделялись в лаборатории, и методы, использованные для изучения их физико-химических свойств.

V. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

А. Исследования расплавленной глобулы.

1) Показано, что размеры молекул белка в состоянии расплавленной глобулы только на 14±2% превышает эту величину для нативного состояния, что соответствует увеличению объема на 50+8%. Это означает, что состояние расплавленной глобулы значительно более компактно, чем развернутое состояние, но менее компактно, чем нативное.

2) Показано, что белковая молекула в состоянии расплавленной глобулы имеет более плотно упакованное "ядро" и значительно более рыхлую оболочку. Этот вывод подтверждается также нашими данными по удельному парциальному объему и ультразвуковой сжимаемости.

3) Показано, что нативное состояние отделено от состояния расплавленной глобулы внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого рода.

4) Изучение полимерных моделей показало, что:

- физической основой компактности белков является не эволюционно отобранная аминокислотная последовательность, а определенное соотношение гидрофобных и гидрофильных остатков в белковой цепи;

- доменный характер плавления больших белков не определяется специфичностью аминокислотной последовательности, а скорее является типичной характеристикой больших молекул, зависящей от соотношения объема и поверхности системы.

Б. Исследования функг\ионалъной роли расплавленной глобулы.

1) Высказана гипотеза о функциональной роли расплавленной глобулы, которая получила экспериментальное подтверждение и широкое признание.

2) Предложено и экспериментально обосновано объяснение денатурирующего действия мембрашюго поля на структуру белка (главным образом путем понижения диэлектрической проницаемости среды). Доказательство гипотезы проведено путем изучения поведения цитохрома с и ретинол-связывающего белка;

а) показано, что при концертном действии умеренно низких рН и диэлектрической проницаемости среды цитохром с совершает конформационный переход из нативного остояния в состояниие расплавленной глобулы;

б) показано, что ретинол может быть удален из своего белка-носителя в мягких денатурирующих условиях, сходных с теми, которые можно ожидать около мембраны. Таким образом, смоделирована функция белка в поле мембраны - освобождение ретинола из ретинол-связывающего белка.

3) Предложена гипотеза о связи кинетического интермедиата в. сворачивании белка (расплавленной глобулы) с генетическими болезнями. Из этой гипотезы вытекает необходимость нового подхода к созданшо действенных лекарств против этих заболеваний, направленных на обеспечение правильности сворачивания белка в клетке

1. Бычкова В.Е., Семисотнов Г.В., Птицын О.Б., Гудкова О.В., Митин Ю.В., Ануфриева Е.В. Компактная структура статистических сополимеров из гидрофобного и гидрофильного аминокислотных остатков. // Молекулярная биология. 1980. T.14.N0.2. С.278-286.

2. Родионова H.A., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами. // Молекулярная биология. 1989. Т.23. No.3. С.683-692.

VI. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в отечественных журналах:

3. Бычкова В.Е., Бартошевич С.Ф., Кленин С.И. Сравнительное исследование коэффициентов диффузии а-лактальбуминов и лизоцима с помощью поляризационного интерферометра. // Биофизика. 1990. Т.35. No.2. С.242-248.

4. Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Состояние расплавленной глобулы белковой молекулы становится скорее правилом, чем исключением. // Биофизика. 1993. Т.38. No.l. С.58-66.

5. Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты. // Цитология. 1995. Т.37. No.12. С.1238-1250.

6. Бычкова В.Е. О функциональной роли ненативных белков. // Сб. "Успехи

биологической химии". 1997. Т.37. С.49-99.

Статьи в международных журналах.

7. Anufrieva E.V., Bychkova V.E., Krakovyak M.G., Pautov V.D., Ptitsyn O.B. A synthetic polypeptide with a compact structutre and its self-organization. FEBS Lett. 1975. Vol. 55. P.46-49.

8. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., BychkovaV.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. a-lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? FEBS Lett. 1981. Vol.136. P.311-315.

9. Dolgikh D.A., Abaturov L.V.,Bolotina I.A., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Bushuev V.N., Gilmanshin R.I., Lebedev Yu.O., Semisotnov G.V., Tiktopulo E.I., Ptitsyn O.B. Compact state of a protein molecule with pronounced small-scale mobility: bovine a-lactalbumin. Eur. Biophys. J. 1985. Vol.13. P.109-121.

10. Gast K., Zirwer D., Welfle H., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Quasielastic light scattering from human a-lactalbumin: comparison of molecular dimensions in native and "molten globule" states. Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol.8. P.231-236.

11. Damasehun G., Gernat Ch., Damaschun H., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Comparison of intramolecular packing of a protein in native and "molten globule" states. Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol.8. P.226-230.

12. Pfeil W., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Physical nature of the phase transition in globular proteins: calorimetric study of human a-lactalbumin. FEBS Lett. 1986. Vol.198. P.287-291.

13. Ptitsyn O.B., Damaschun G., Gernat Ch., Damaschun H., Bychkova V.E. Comparison of intramolecular packings in human a-lactalbumin in native and "molten globule" states. Studia biophysica. 1986. Vol.112. P.207-211.

14. Gernat Ch., Damaschun G., Rrober R., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Large-angle diffuse X-ray scattering from a homopolypeptide and some proteins. Studia biophysica. 1986. Vol.112. P.213-219.

15. Bychkova V.E., Pain R., Ptitsyn O.B. The "molten globule" state is involved in the translocation of proteins across membranes? FEBS Lett. 1988. Vol.238. P.231-234.

16. Pfeil W., Welfle K., Bychkova V.E. Guanidine hydrochloride titration of the unfolded apo-cytochrome с studied by calorimetry. Studia biophysica. 1991. Vol.140. P.5-12.

17. Damashun G., Damaschun H., Gast K., Zirwer D., Bychkova V.E. Solvent

dependence of dimensions of unfolded protein chains. Int. J. Biol. Macromol. 1991. Vol.l3.P.217-221.

18. Gast K., Damashun G., Damaschun H., Misselwitz R., Zirwer, D., Bychkova,-V.E. Compactness of protein molecules in native and denatured states as revealed Ъу laser light sctattering and X-ray scattering. In: Laser Light Scattering, eds. S.Harding & D.B.Sattelle, Royal Soc.Chem. Cambridge, UK, 1991. P.209-224.

19. Bychkova V.E., Berni R., Rossi G.L., Kutyshenko V.P., Ptitsyn O.B. Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pll. Biochemistry. 1992. Vol.31. P. 7566-7571.

20. Ptitsyn O.B., Zanotti G., Denesyuk A.I., Bychkova V.E. Mechanism of pH-induced release of retinol from retinol-binding protein. FEBS Lett. 1993. Vol.317. P.181-184.

21. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The molten globule in vitro and in vivo. Chemtracts-Biochem. Mol. Biol. 1993. Vol.4. P.133-163.

22. Tiktopulo E.I., Bychkova V.E., Ricka J., Ptitsyn O.B. Cooperativity of coil-globule transition in homopolymer: microcalorimetric study of poly-(N-isopropylacryl-amide). Macromolecules. 1994. Vol.27, P.2879-2882.

23. Bychkova V.E., Ptitsyn, O.B. Folding intermediates are involved in genetic diseases? FEBS Lett. 1995. Vol.359. P.6-8.

24. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Uversky V.N. Kinetic and equilibrium folding intermediates. Phil. Trans. Royal Soc. 1995. London, Ser. B, Vol.348. P.35-41.

25. Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Lushchik V.B., Klenin S.I., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. "Domain" coil-globule transition in homopolymers. Macromolecules. 1995. Vol.28. P.7519-7520.

26. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome ,c under conditions simulating those near the membrane surface. Biochemistry. 1996. Vol.35. P.6058-6063.

27. Kharakoz D.P., Bychkova V.E. Molten globule of human a-lactalbumin: hydration, density and compressibility of the interior. Biochemistry. 1997. Vol.36. P. 1882-1890.

Тезисы отечественных конференций:

28. Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Синтетический гидрофобно-гидрофильный полипептид с компактной структурой. // Материалы Симпозиума по химии и биохимии белков и пептидов. Ташкент. 1975. С.41-42 .

29. Бычкова В.Е., Семисотнов Г.В., Ануфриева Е.В., Птицын О.Б. Компактное состояние полипептидных цепей со случайным чередованием полярных й иеполярных остатков. // Тезисы V Всесоюзного симозиума по химии и физике белков и пептидов. Баку. 1980. С.50.

30. Гильманшин Р.И., Бычкова В.Е., Веньяминов С.Ю., Семисотнов Г.В., Тиктопуло Е.И., Птицын О.Б. Человеческий а-лактальбумин: различные компактные формы без уникальной пространственной структуры. // Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. Москва. 1982. С.19.

31. Дамашун Г., Гернат К., Дамашун X., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Срав-

нение внутримолекулярной упаковки белка в нативном состоянии и состоянии расплавленной глобулы. // Тезисы докладов Симпозиума по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках. Пущино. 1985. С.57.

32. Гаст К., Цирвер Д., Вельфле X., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Квазиупругое светорассеяние человеческим а-лактальбумином: сравнение размеров в нативном состоянии и состоянии расплавленной глобулы. // Тезисы докладов Симпо-зиума по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках. Пущино. 1985. С.58.

33. Пфайль В., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Калориметрическое исследование различных стадий разворачивания человеческого а-лактальбумина. // Тезисы докладов Симпозиума по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках. Пущино. 1985. С.61.

Тезисы международных конференций:

34. Bychkova V.E., Anufrieva E.V., Gudkov А.Т., Krakovyak M.G., Mitin Yu.V., Pautov V.D., Ptitsyn O.B. Synthetic polypeptide with a compact structure and its selforganization // Soviet-French symposium on the physical chemistry of proteins and peptides, abstracts. Pushchino. 1975. P.48.

35. Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Ptitsyn O.B., Anufrieva E.V., Gudkova O.V., Mitin Yu.V. Synthetic polypeptides with compact structure // XII FEBS meetings, abstracts. Dresden. 1978. P.2243.

36. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Mitin Yu.V., Gudkova O.V. Compact structure of random hydrophobic-hydrophilic copolypeptides // Internationa! symposium on macromolecular chemistry, abstracts. Tashkent. 1978. P.186.

37. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dolgikh D.A., Semisotnov G.V., Uversky V.N. Molten globule and protein folding // Modern problems of physical chemistry of macromolecules. International school-seminar. Pushchino. 1991. Abstracts. P.57-58.

38. Bychkova V.E., Damaschun G., Damaschun H., Gast K., Zirwer D., Ptitsyn O.B. Solvent dependence of dimensions of unfolded protein chain // Modern problems of physical chemistry of macromolecules. International school-seminar. Pushchino. 1991. Abstracts. P.88.

39. Bychkova V.E., Berni R., Rossi G.-L., Ptitsyn O.B. The native-molten globule state transition in retinol-binding protein at low pH and its possible role in retinol release to target cells //XXII FEBS meeting, abstracts. Sweden. 1993. P.99.

40. Ptitsyn O.B., Zanotti G., Denesyuk A.I., Bychkova V.E. Possible mechanism of pH-induced release of retinol from retinol-binding protein and its relation to the insertion of proteins into membranes // Biochemistry of cell membrane. П IUBMB conference, abstracts. Bari, Italy. 1993.P.I47.

41. Bychkova V.E., Fantuzzi, A., Rossi G.-L., Dujsekina A.E., Ptitsyn O.B. Denaturation of retinol-binding protein and release of retinol Н XXIII FEBS meeting, abstracts. Basel, Switzerland. 1995. P.171.

42. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The molten globule state under physiological conditions: principles of modeling and first results // ХХП1 FEBS meeting, abstracts. Basel, Switzerland. 1995. P.171.

43. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Some genetic diseases are related to folding intermediates. // Principles of protein architecture. II Workshop, abstracts. Tokyo. 1995. P.81.

44. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. An equilibrium intermediate of cytochrome c under conditions simulating those near negatively chargcd membrane surfaces // Principles of protein architecture. II Workshop, abstracts. Tokyo. 1995. P.80.

45. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B, Folding intermediates and genetic diseases // Advances in gene technology: biomolecular design, form and function. Miami nature biotechnology winter symposium. Abstracts. Ft.Lauderdale, Florida, USA. 1997. P.23.

46. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Rossi G.-L., Fantuzzi A., Uversky V.N., Tiktopulo E.I., Klenin S.I. Modeling of the molten globule state of proteins near membranes // Advances in gene technology: biomolecular design, form and function. Miami nature biotechnology winter symposium. Abstracts. Ft.Lauderdale, Florida, USA. 1997. P.32.

47. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome c under conditions vpch may mimic those occuring near membrane surfaces // Protein folding, modification and transport in the early secretory pathway. Keystone symposia on molecular and cellular biology. Abstracts. New Mexico, USA. 1997. P. 18.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Бычкова, Валентина Егоровна, Пущино

БЫЧКОВА ВАЛЕНТИНА ЕГОРОВНА

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОСТОЯНИЯ В СВОРАЧИВАНИИ БЕЛКОВ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Пущино - 1997

Памяти Моей первой учительницы Эмилии Вениаминовны ФРИСМАН

посвящается

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

I. ВВЕДЕНИЕ ...................................... ...1

1.1. Проблема сворачивания белков ..................1

1.2. Кинетические и равновесные промежуточные состояния .....................................2

1.3. Физиологическая роль промежуточных состояний ..5

II.1. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА in vitro ..................8

II.1.1. Открытие нового промежуточного состояния ...8 II. 1.2. Компактность ..............................10

а) моделирование компактности ................19

б) сравнение размеров глобулярных белков и развернутых цепей .........................22

II.1.3., Наличие ядра и оболочки ...................24

II. 1.4. Вторичная структура .......................2 9

11.1.5. Фазовые переходыи их физические причины ...34 а) фазовые переходы N MG и MG U ..... 42

в) переходы в сополимерах заряженной и незаряженной аминокислот ..................50

г) "доменный" характер плавления в белках и гомополимерах .............................55

11.1.6. Расплавленная глобула - не исключение,

а правило .................................58

II. 2. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА in vivo ..................63

11.2.1. Гипотеза о функциональной роли расплавленной глобулы и ее экспериментальное подтверждение ......................:.................63

11.2.2. Денатурирующее действие мембран или почему

белки могут быть в состоянии расплавленной глобулы в клетке? ............................81

11.2.3. Расплавленная глобула и транспорт неполярных лигандов или моделирование функции белка вблизи мембран ...............................93

II.3. ПЕРСПЕКТИВЫ ...................................109

11.3.1. Расплавленная глобула и белок-белковые взаиимодействия .............................111

11.3.2. Расплавленная глобула и некоторые генетические заболевания ....................115

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .....................................123

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . . . ..........................13 0

IV. 1. Материалы ..................................130

IV 2. Методы определения размеров молекул ........135

IV.2.1. Характеристическая вязкость ...........135

IV.2.2. Квазиупругое светорассеяние ...........13 6

IV.2.3. Макроскопическая диффузия .............13 8

IV.2.4. Рассеяние рентгеновских лучей

под малыми углами ..........................14 0

IV.2.5. Поляризация флуоресценции .............140

IV.2.6. Седиментация ..........................143

IV.3. Определение плотной упаковки ...............143

IV.3.1. Рассеяние рентгеновских лучей

под большими углами .........................143

IV.4. Методы тестирования третичной структуры ....145

IV.4.1. Спектры кругового дихроизма

в ближней УФ области ........................145

IV. 4.2, Спектры флуоресценции .................146

IV. 4.3. Спектры ХН-ЯМР.........................147

IV.5. Методы тестирования вторичной структуры.....148

IV.5.1. Спектры кругового дихроизма

в дальней УФ области.........................148

IV. 5 . 2 . Инфракрасные спектры...................149

IV. 5 . 3 . Дисперсия оптического вращения.........150

IV.6. Методы определения тепловых эффектов........151

IV. б . 1. Потенциометрическое титрование.........151

IV. 6 . 2 . Сканирующая калориметрия...............152

IV. 6.3. Изотермическая калориметрия............155

IV.7. Определение гидратации и сжимаемости

молекул.....................................156

V. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ....................158

VI. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..........160

VII. ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА ..........................168

ТАБЛИЦЫ И РИСУНКИ:

Таблица 1 .............................................

Таблица 2 ............................................18

Таблица 3 ............................................23

Таблица 4 ............................................59

Таблица 5 ..............................................

Таблица б ............................................89

Таблица 7 ..............................................

Таблица 8 ...........................................104

Рис. 1 .................................................

Рис. 2 ...............................................16

Рис. 3 ...............................................16

Рис. 4 ...............................................17

Рис. 5 ...............................................21

Рис. б ...............................................26

Рис. 7 ...............................................28

Рис. 8 ...............................................30

Рис. 9 ...............................................33

Рис. 10 а, б .........................................36

Рис. 10 в, г .........................................37

Рис. 11 а, б .........................................38

Рис. 11 в, г .........................................39

Рис. 12 ..............................................40

Рис. 13 ..............................................41

Рис. 14 ..............................................43

Рис. 15 . ..............................................46

Рис. 16 ..............................................51

Рис. 17 ..............................................57

Рис. 18 ..............................................71

Рис. 19 ..............................................83

Рис. 20 .............................................. 86

Рис. 21 ..............................................8 8

Рис. 22 ..............................................90

Рис. 23 .................;............................90

Рис. 24 .............................................. 95

Рис. 25 ..............................................95

Рис. 2 6 ..............................................98

Рис. 27 ..............................................98

Рис. 28 .............................................102

Рис. 29 .............................................103

Рис. 30 .............................................105

Рис. 31 .............................................106

Рис. 32 .............................................107

Рис. 33 .............................................110

Рис. 34 .............................................120

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Проблема сворачивания белков имеет два аспекта: биохимический, связанный с биосинтезом белковой последовательности на рибосоме, и физический, отражающий сворачивание этой последовательности в нативную функционирующую трехмерную структуру. Один из центральных вопросов физики белка, как белковая молекула сворачивается в жесткую пространственную структуру, остается актуальным с момента расшифровки первой пространственной структуры белка с помощью рентгеноструктурного анализа. Актуальность этой проблемы сохраняется до настоящего времени. Проблема правильного сворачивания отнюдь не является тривиальной, поскольку белку приходится решать, как выбрать правильный путь из астрономического числа возможных конформаций и не попасть в энергетическую ловушку (парадокс Левинталя, Levinthal, 1968). Как было показано Анфинсеном (Ап:£1пзеп, 1973), полностью развернутая гуанидингидрохлоридом рибонуклеаза А с разорванными Б-Б связями способна свернуться в активное состояние, будучи помещена в нативные условия. Это означает, что вся информация о сворачивании белковой молекулы заключена в ее первичной последовательности, а это делает возможным изучать сворачивание белков прямыми физическими методами.

С другой стороны, накопившаяся информация о третичной структуре глобулярных белков свидетельствует о наличии сходных элементов в структурной организации белков.

Все белки обладают определенными элементами вторичной структуры (а-спирали, (3-структура, так или иначе структурированные петли и неупорядоченные участки). Благодаря этому, часть гидрофобных участков кластеризуется, образуя гидрофобное ядро молекулы, что, в свою очередь, приводит к определенному расположению элементов вторичной структуры относительно друг друга, т.е. к определенному ходу полипептидной цепи в пространстве, называемому "укладкой" или "топологией" цепи (tertiary fold). Устойчивость к внешним воздействиям окружающей среды достигается плотной упаковкой боковых групп аминокислотных остатков, что приводит к появлению жесткой третичной структуры, т.е. фиксированному положению большинства атомов белковой молекулы в пространстве. Эта третичная структура зависит от всех деталей аминокислотной последовательности и является специфичной для данного белка, в то время как топология, как оказалось, может быть сходной, и даже иногда идентичной, для разных белков (Richardson, 1977, 1981). Анализ этого сходства показал, что оно не является результатом эволюционной дивергенции или функциональной конвергенции, а следует из общих законов молекулярной физики (Ptitsyn & Finkelstein, 1980; Finkelstein &

Ptitsyn, 1987) .

1.2. Кинетические и равновесные промежуточные состояния. Наличие трех уровней структурной организации белка должно приводить к промежуточным структурам на пути

сворачивания белка из полностью развернутой цепи в его нативную третичную структуру. Как было предположено О.Б.Птицыным еще в 1973 году (Птицын, 1973), сворачивание белка должно проходить по крайней мере через два кинетических интермедиата. Первый интермедиат имеет области вторичной структуры, флуктуирующие около их положения в нативной структуре, в то время как второй интермедиат имеет компактную структуру и нативоподобный ход полипептидной цепи, но в нем еще отсутствует плотная упаковка боковых групп. Оба этих интермедиата позднее были обнаружены на опыте (Dolgikh et al., 1981; Ptitsyn &

Semisotnov, 1991).

С другой стороны, еще Тэнфордом в 1968 году было отмечено (Tanford, 1968), что белки более или менее полностью развернуты при высоких концентрациях сильных дена-турантов, гуанидингидрохлорида (ГГХ) или мочевины, хотя даже в этих случаях наличие флуктуирующих структур не может быть исключено. При денатурации же белков другими агентами, такими как низкие рН, высокая температура, или высокие концентрации некоторых солей, их физико-химические свойства заметно отличались от таковых, наблюдаемых для высоких концентраций ГГХ, т.е. были промежуточными-между свойствами нативных и развернутых белков. Более четко наличие равновесных промежуточных состояний было показано при изучении разворачивания бычьей карбоангид-разы (Wong & Tanford, 1973) , р-лактамазы (Robson & Pain, 1973), гормона роста (Holladay et al, 1974), коровьего

(Kuwajima, et al, 1976) и человеческого (Nozaka et al, 1978) сс-лактальбуминов, когда изучалось разворачивание белков сильными денатурантами с помощью спектров круго-' вого дихроизма (КД) . Они показали, что спектры КД ароматических групп, связанные с наличием их асимметричного окружения, т.е. с жесткой третичной структурой белка, уменьшаются при более низких концентрациях ГГХ, чем спектры пептидных групп, связанные с наличием вторичной структуры в белке. Было сделано заключение, что ослабление плотной упаковки боковых групп в нативной структуре происходит как отдельный процесс,

предшествующий разрушению вторичной структуры. Эти интермедиаты отличаются от нативного состояния отсутствием жесткого окружения ароматических боковых групп, а от полностью развернутого состояния - наличием вторичной структуры.

Кроме того, для бычьего гормона роста (Burger, 1966), бычьей карбоангидразы В (Wong & Hamlin, 1974) и а-лактальбуминов (Kuwajima et al, 1976, Nozaka et al, 1978),

было показано, что их оптические свойства при кислых рН сходны со свойствами состояний, наблюдаемых при умеренных концентрациях ГГХ. Авторы пришли к заключению, что равновесный интермедиат представляет собой "свернутое состояние с локальной спиральной структурой, диктуемой локальными взаимодействиями". Однако, в случае рН-зависимой денатурации карбоангидразы (Wong & Hamlin, 1974) было отмечено, что наблюдаемое промежуточное состояние при

кислых рН было достаточно компактно, хотя наблюдаемый переход был необратим. Обнаружение подобных интермедиа-тов, особенно компактных, представляется очень важным для понимания структуры белков и их сворачивания.

1.3. Физиологическая роль промежуточных состояний. В последнее десятилетие появилось много экспериментальных данных, согласно которым ряд клеточных процессов в клетке требует не жесткого "нативного" состояния белка, но некоторого "ненативного", достаточно гибкого состояния, способного адаптироваться к различным условиям в клетке или быть компетентным либо к транслокации через мембраны, либо олигомеризации, либо связыванию или передаче лигандов (см. обзор Bychkova & Р-Ьл^эуп, 1993) . Это состояние, с одной стороны, сохраняет общую архитектуру белка, с другой, - допускает вращательную изомеризацию многих внутренних боковых цепей и петель. Оно имеет более гидрофобную поверхность за счет дополнительного экспонирования части гидрофобных боковых групп.

Некоторые условия в клетке, такие как низкие рН ■ (4.5-5.0) в лизосомах или около отрицательно заряженных *■;

5 '

мембранных поверхностей, наличие мембран и цитоскелета, Л являются умеренно-денатурирующими условиями для белков.

Это позволило нам (ВусЬкоуа et а1, 1988) выдвинуть . гипотезу, что основное промежуточное состояние -состояние расплавленной глобулы - может играть важную роль в физиологических процессах. В последующие годы

основные положения этой гипотезы были подтверждены, и в обзоре (Bychkova & Ptitsyn, 1993) нами были суммированы первые доказательства существования и роли расплавленной глобулы in vivo.

Действительно, было показано, что это состояние:

- участвует в транслокации белков через мембрану или

внедрении токсинов и вирусов в мембраны;

обнаруживается сразу после биосинтеза белков и

узнается шаперонами, основная роль которых сводится к экранированию связанных белков от различных побочных реакций, например, неспецифической агрегации;

- реализуется при передаче гидрофобных лигандов или при

связывании и взаимодействии рецепторов и их партнеров;

- является также состоянием, компетентным к деградации;

мономеры многих олигомерных белков сохраняют это

состояние перед олигомеризацией и т.д.

Более подробную информацию можно найти в обзорах

(Fischer & Schmid, 1990; Jaenicke, 1991, Freedman, 1992;

■ 1

Gething & Sambrook, 1992; ' Bychkova & Ptitsyn, 1993;

Hendrick & Hartl,1995; Бычкова, 1997). Однако природа этих промежуточных состояний полностью не понята до настоящего времени.

Цель настоящей работы - изучение равновесных интер-

медиатов в сворачивании белков и их возможной физиологической роли в клетке. Результаты можно суммировать как участие в открытие и детальное описание свойств расплав-

ленной глобулы, включая ее размеры, структуру ее гидрофобного ядра и ее переходов в нативное и развернутое состояния. Обнаруженные специфические свойства расплавленной глобулы позволили выдвинуть гипотезу о наличии этого состояния в живой клетке и о функциональной роли состояния расплавленной глобулы. Экспериментальная проверка этой гипотезы была проведена на примере переноса гидрофобного лиганда ретинол-связывающим белком и влияния мембраны на состояние белков, функционирующих в ее поле (цитохром с). Выдвинута также гипотеза о связи между промежуточными состояниями в сворачивании белка и' генетическими болезнями человека, которая нашла свое подтверждение в ряде экспериментов.

Помимо этого в диссертацию включены также результаты работ по моделированию компактизации белков и их доменного плавления с помощью полимеров и сополимеров.

Основные результаты настоящей диссертационной работы отражены в 4 7 публикациях, в том числе в 2 7 статьях в отечественных и международных журналах [1-47].

II.1. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА in vitro

11.1.1.' ОТКРЫТИЕ НОВОГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОСТОЯНИЯ

Для понимания процесса сворачивания белка необходимо

изучение промежуточных состояний между нативным и '-

, £

полностью развернутым состояниями. Наличие промежуточных1 состояний может тестироваться по несовпадению кривых перехода из нативного в развернутое состояние под действием денатурирующего агента, измеряемых различными методами.

Еще Тэнфорд в 1968 году (Тап:£огс1, 1968) отметил, что более или менее развернутое состояние белковой молекулы наблюдается только в высоких концентрациях гуанидингидро-хлорида (ГГХ) или мочевины, и то не всегда. Денатурация же другими агентами, как кислые или щелочные рН, высокая температура, высокие концентрации некоторых солей, приводит лишь к частичному разворачиванию. Это свидетельствует о том, что в этих условиях могут существовать некие промежуточные состояния между нативным и полностью развернутым белком.

Наличие интермедиатов было обнаружено в ходе разворачивания нескольких белков, указанных выше.

Более детально эти стадии разворачивания белковой структуры были изучены Куваджимой с сотрудниками (Кгша^та et а1, 197 6) на примере коровьего а-лактальбумина. Переходы, вызываемые ГГХ в этом белке и тестируемые по спектрам ближнего и дальнего КД, происходят при разных концентрациях ГГХ и указывают на

наличие интермедиата, сходного с состоянием этого белка при низких рН. Куваджима пришел к заключению, что "наблюдаемый равновесный интермедиат сильно развернут, но содержит зачаточные спиральные структуры, диктуемые локальными взаимодействиями"

Как видно из вышеизложенного, наличие интермедиатов в сворачивании белка наблюдалось, но когда мы начали их изучение, что из себя представляют эти интермедиаты, известно не было.

Равновесное промежуточное состояние как новое состояние белковой молекулы было открыто и детально охарактеризовано нами (Бо1д1кЬ. et а1, 1981, 1985) . Для исследования были выбраны два белка, для которых наблюдалось несовпадение переходов по спектрам кругового дихроизма в дальней и ближней УФ областях: а-лактальбумины коровы и человека. Это промежуточное состояние, названное позднее расплавленной глобулой (СЛдизМ & ЭДас1а, 1983) , было детально исследовано для двух гомологичных а-спиральных белков с помощью различных, дополняющих друг друга и подтверждающих, методов (число которых превышает 15), дающих информацию о различных свойствах белков.

Было показано, что эти белки в умеренно денатурирую- • щих условиях (кислые рН, умеренные концентрации гуанидин-гидрохлорида, повышенная температура, удаление лигандов) приобретают некоторые общие с

Информация о работе

Бычкова, Валентина Егоровна
доктора физико-математических наук
Пущино, 1997
ВАК 03.00.02

Диссертация

Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Бычкова, Валентина Егоровна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Промежуточные состояния в сворачивании белков и их функциональная роль
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика