Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры"

На правах рукописи

СТЕПАНЕНКО Ольга Викторовна

ФОЛДИНГЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ПЕРИПЛАЗМЫ БАКТЕРИЙ РОЛЬ ЛИГАНДОВ В СТАБИЛИЗАЦИИ ИХ СТРУКТУРЫ

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003171125

Работ выполнена п Пнспнл te цтолоши РАН

Научные руководи!ели. доктор физико-математических наук, проф

Константин Коистшинович 1УРОВЫЮВ.

Институт циттагии РАИ

доктор ополот ичсскич наук Ирина Михаиловна КУЗНЕЦОВА, Институт цитоюгии РАН

Официальные ошюнегны: аомор био iui ичесьих наук, проф

Владимир Иосифович ВОРОЬЬЬВ, Институт щто югии P4II

доктор oiiotoi ическич наук, проф Дмтрий Иваноинч ЛГВИЦКИЙ. Институт биохимии им А Н Баха РАН

Ведущая организация. Петербургским инстнтуг ядерно» физики

им Ь ¡1. Консшиннова РАН

Защита состой гея "20" июня 2(Ю8 года в 13 ч на заседании Дисоср мцшжноя о cohciд

Д 002 230 01 при Итлшую ииюдш ии РАН по адресу. 194064, Санкз-Петербург, 1 и-

хорецкий пр , д 4

e-mail cellbiotnmi! cyHpb ru

сайг u\vv\ cytspb ibsi ru

С днссершшеи можно ознакомиться в бибчжиеке Иненнуи шно им и и РАН Автореферат разослан "/3" мая 2008 i ода

Ученым секретарь Диссергациогаю! о совсы, »

кап шдаг биодог ических наук (fAQW*^

Г В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Процессы разворачивания-сворачивания белков, i - устойчивость к действию химических деиатурантов и нагреванию, структура и механизмы образования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интенсивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира Актуальность этих исследований обусловлена как нх значимостью для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в денатурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины [1-6] и биотехнологии [3, 7-8] Специфическая ассоциация, приводящая к образованию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых "кон-формационных болезней"), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркин-сона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативиых рекомбинантных белков

К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга-рефолдинга небольших мономерных белков Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени В связи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежащих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотаксиса и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий В настоящей работе объектами исследования стали глутамин-связывающий белок и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и Сахаров Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурах, [9]) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больных, [10]) Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков

Цель и задачи исследования Цель работы состояла в изучении процессов сворачива-

ния-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛЭ-глкжоза-связывающего белка В задачи работы входило

1 Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛ)-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl),

2 Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоы-связывагощего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний,

3 Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывакмцего белка под действием Сс1пНС1 обратимой,

4 Исследование роли лигандов - глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и О-глкжозы и иона кальция, в случае О-галактоза/О-глкжоза-связывающего белка — в стабилизации структуры этих белков к денатурирующему действию 0(1пНС1 и нагревания

Основные положения, выносимые на защиту

1 Связывание лиганда стабилизирует структуру лигакд-связывающих белков и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний

2 Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и О-галактозаЯ)-глкжоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается разворачивание О-галактоза/В-глкжоза-связывающего белка осуществляется по принципу "все или ничего", при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния Одно из этих состояний является состоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией молекул глутамин-связывающего белка

3 Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд-связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначительно

Научная новизна исследований Результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глкжоза-связывающего белка, получены впервые Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка под действием й(1пНС1 Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию ОёпНС! и нагреванию, но и делает процесс денатурации более кооперативным Впервые охарактеризована стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса

Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно Сделано заключение о том, что собственная флуоресценция О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в качестве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для неинвазивного определения содержания сахара в крови больных диабетом Тем не менее, существенные изменения пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток -донора и акцептора энергии возбуждения

На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света Предложен метод учета этого эффекта

Теоретическое и практическое значение работы Новые данные о процессах сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактозаЮ-глюкоза-связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубокого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их структуры к действию различных химических денатурантов и нагреванию Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков

Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое значение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара

Существенной методической разработкой является установление того факта, что г слад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и информационных изменений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофановых остатков, на составляющие

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ

Апробация работы Основные положения работы были представлены на 8-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), III Съезде биофи-

зиков России (Воронеж, 2004), итальянской конференции по биохимии (Италия, Витербо, 2004), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломо-носов-2007" (Москва, 2007), 12-й Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобиньи, Франция, 2007) и 4-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, 2008)

Публикации По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 2 статьи в сборниках, а также тезисы 7 докладов на всероссийских и международных конференциях и съездах

Финансовая поддержка работы Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 06-04-48231), 1NTAS (грант 012347), Программы РАН "Молекулярная и клеточная биология", Программы "Ведущие научные школы РФ" (11Ш-9396 2006 4, НШ-1961 2008 4), администрации Санкт-Петербурга (грант 02/2 6/15-03/39) и Фонда содействия отечественной науке по программе "Лучшие аспиранты РАН" Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях"

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 11 таблиц и 30 рисунков Библиография включает 179 наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы Препараты глутамин-связывающего белка (GlnBP) из Escherichia coli и D-галактоза/О-глкжоза-связывающего белка (GGBP) из Escherichia coli предоставлены проф Д'Ауриа (Институт биохимии белка, Неаполь, Италия) Белки GlnBP и GGBP из Escherichia cok были получены и очищены согласно известным методикам [9, 11] Эксперименты выполнены при концентрации растворов белков 0 1-03 мг/мл Для образования комплекса белок - лиганд в раствор белка добавляли Glc и Gin в концентрации 103- 102М

Препараты D-глюкозы и L-глутамина (Sigma, США), гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) и 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС) (Serva, США) использовали без дополнительной очистки При отщеплении иона кальция использовали раствор 1 мМ ЭДТА фирмы Fluka (Швейцария) Во всех экспериментах с GGBP использовали 10 мМ TrisHCl буфер (pH 7 4), при работе с GlnBP - 10 мМ TrisHCl буфер (pH 8 5)

Анализ пространственной структуры белка. Свойства микроокружения и локализацию триптофановых и тирозиновых остатков в GGBP и GlnBP и в их комплексах с лиганда-ми анализировали с использованием данных о пространственной структуре белков, содержащейся в PDB [12] GGBP (файл 2FW0ent, [13]), GGBP/Glc (файл 2GBPent, [14]), GlnBP (1GGG ent, [15]) и GlnBP/Gln (1WDN ent, [16]) Микроокружение триптофановых и тирози-

новых остатков определяли как совокупность атомов, расположенных на расстоянии менее го от геометрического центра индолыюго или фенольного кольца, /а принято равным 7 А [7] Выявляли атомы микроокружения, ближайшие к каждому атому индолыюго или фенольного кольца и расстояние между ними Плотность упаковки атомов в микроокружении определяли как число атомов, входящих в микроокружение, или как отношение объема, занимаемого атомами микроокружения, к общему объему сферы с радиусом 7 А Объем, занимаемый атомами, определяли на основании известных Ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов, причем учитывали лишь ту часть объема, которая входит в сферу радиуса 7 А Реальный объем, занимаемый атомами, несколько меньше, так как атомы участвуют в образовании химических связей Тем не менее, для целей данного анализа это не имеет существенного значения Эффективность безызлучателыюго переноса энергии рассчитывали согласно Ферстеру [17-21]

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметриче-скнх установок собственного изготовления [22] Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длинами волн 280 и 297 им Для характеристики положения спектров флуоресценции использовался параметр А = /320//3М (/320 и 1м - интенсивности флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, соответственно, см [23]) Спектры флуоресценции и параметр А корректировали на спектральную чувствительность установки Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белков от концентрации С<1!1НС1 измеряли после инкубации белка в растворах в(1пНС1 соответствующей концентрации при 4 °С в течении 24 ч Концентрацию СМпНС1 определяли рефрактометрически [24] с помощью рефрактометра Аббе (ЛОМО, Россия) Все флуоресцентные измерения были выполнены с использованием микрокювет (101 016-(}8 5x5 мм, НеНта, Германия) Термодинамические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [25]

Вклад тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка рассчитывали с помощью выражения

А). Туг = (/А / 1Ш )2М - (/д //,„ )2„

Анизотропию флуоресценции [26-27] определяли, используя соотношение

г=(/; -с/;, щ' +2вг„)

где /,' и - вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом, в - коэффициент, характеризующий различие чувствительности приемной системы установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету (в -1" 11Ц)

Интенсивность флуоресценции гидрофобного зонда АНС регистрировали при А.ео1б — 365 нм и Хри = нм

Равновесные и кинетические зависимости интенсивности флуоресценции анализировали с помощью метода, основанного на параметрическом представлении двух независимых экстенсивных характеристик системы В качестве параметра выступала концентрация денатурирующего агента или время, прошедшее после смешения раствора белка и GdnHCl Этот подход был впервые предложен в работах [28-29] и использовался в нашей лаборатории для изучения процессов сворачивания-разворачивания и доказательства существования промежуточных состояний для ряда белков [30-34], в том числе при изучении данных кинетических экспериментов, когда в качестве параметра выступает время после перевода белка в раствор денатуранта соответствующей концентрации[35-37] В последние годы этот метод широко используется исследователями других лабораторий [38-39]

Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции. Измерение кривых затухания флуоресценции проводили на импульсной спектрофлуориметрической установке Института цитологии РАН [22] Кривые затухания флуоресценции анализировали в мультиэкспо-ненциальном приближении Расчет проводили по методу наименьших квадратов с использованием алгоритма минимизации Маркуардта [40] В качестве эталона использовали растворы />-терфенила в этиловом спирте или водный раствор iV-ацетилтриптофанамида [41]

Круговой дихроизм Измерение спектров КД проводили на спектрополяриметре J-810 (Jasco, Япония) Концентрация белка составляла 0 3 мг/мл Для измерения спектров КД в дальней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 мм, измерение проводили в области 250 - 190 нм с шагом 0 1 нм Для измерения спектров КД в ближней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, измерения проводили в области 340 - 250 нм с шагом 0 1 нм Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3-5 раз и полученные данные усредняли Спектры КД белков построены с учетом КД соответствующего буферного раствора

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глутамин-связывающий белок (GlnBP) и О-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia coli относятся к обширной группе лиганд-связывающих белков, содержащихся в периплазме бактерий Основная функция этих белков заключается в связывании различных биологически-активных молекул (Сахаров, аминокислот, пептидов и т д ) и неорганических ионов для их транспорта в клетку Хотя белки этой группы существенно различаются по размеру и аминокислотной последовательности, все они имеют сходную пространственную структуру два глобулярных домена связаны шарнирной областью, образованной двумя или тремя пептидными сегментами, в щели между доменами расположен лиганд-связывающий центр Связывание субстрата приводит к большим структурным изменениям в молекуле белка(рис 1)

Рис. 1. Пространственная структура GGBP (а) и комплекса GGBP/Glc (£), GlnBP (<?) и комплекса GlnBP/Gln (г).

Показана локализация триптофановых (красные) и тирозиновых (синие) остатков. Молекула связанного лиганда, D-глюкозы в случае GGBP/Glc (б) и Gin в случае GlnBP/Gln (г), изображена в зеленом цвете. На панелях а и б в структуре GGBP и GGBP/Glc изображен атом Ca2 (желтый) и аминокислотный остаток Phe 16 (фиолетовый), участвующий в связывании D-глкжозы. На панелях в и г в структуре GlnBP и GlnBP/Gln показан аминокислотный остаток Lys 166 (фиолетовый), входящий в состав микроокружения Тгр 220 этого белка. Для построения изображений использовали графические программы VMD [42] и Raster 3D [43]. Рисунок создан на основании данных банка белковых структур [12]. файлы 2FW0.ent [13], 2GBP.ent [14], lGGG.ent [15], и IWDN.ent [16].

i I

Спектральные свойства GGBP и GlnBP и их комплексов с лнгандами

Спектр триптофановой флуоресценции GlnBP в нативном состоянии представляет широкую бесструктурную полосу с максимумом при длине волны 332 нм При связывании Gin максимум флуоресценции сдвигается в коротковолновую область лишь на 1-2 нм Сравнительный анализ микроокружения триптофановых остатков GlnBP и его комплекса с Gin позволил объяснить этот эффект тем, что хотя связывание L-глутамина вызывает закрытие щели и существенные структурные изменения с образованием так называемой "закрытой" формы, микроокружение Тгр 32 и Тгр 220 изменяется незначительно (Kuznetsova et al, 2005, Степаненко и др, 2005)'

Хотя GlnBP содержит 10 тирозиновых остатков, их вклад в суммарную флуоресценцию нативного GlnBP незначителен Анализ микроокружения тирозиновых остатков показал, что возможны две причины низкого квантового выхода тирозиновых остатков GlnBP Во-первых, существуют условия для эффективного переноса энергии от большинства тирозиновых остатков к двум триптофановым остаткам белка Тгр 32 и/или Тгр 220 непосредственно или через другие тирозиновые остатки Во-вторых, большинство тирозиновых остатков может быть затушено не только за счет переноса энергии возбуждения на триптофановые остатки, но также близлежащими тушащими группами или переносом энергии на тирозиновые остатки, которые затушены Для того чтобы проверить существование эффективного переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым остаткам, была измерена зависимость интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм (триптофановая флуоресценция) от концентрации GdnHCl при двух длинах волн возбуждения 280 и 297 нм (рис 2, г) За единицу принята интенсивность флуоресценции нативного белка при длине волны возбуждающего света, равной 297 нм Величина интенсивности флуоресценции развернутого белка при длине волны возбуждения 280 нм была принята равной величине интенсивности флуоресценции развернутого белка длине волны возбуждения 297 нм Следует отмстить, что приравнивание этих величин оправдано, так как разворачивание белка приводит к потере условий для переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым остаткам и нивелирует все особенности микроокружения отдельных триптофановых и тирозиновых остатков

Можно было ожидать, что для нативного белка получим (/гво//297)зб5> 1» если при возбуждении светом с длиной волны 280 нм энергия возбужденных триптофановых остатков определяется поглощением самих триптофановых остатков и переносом энергии от тирозиновых остатков (Туг -> Тгр) Это отношение может быть равным единице, если нет переноса энергии от тирозиновых к триптофановым остаткам Однако экспериментально было обна-

' Здесь и далее в круглых скобках приводятся ссылки на работы представленные в списке публикаций по теме диссертации

ружсно, что (/28о//29?)зб5<1 Такое соотношение может иметь место только в случае изменения спектра поглощения при разворачивании белка, что может вызывать уменьшение величины (1жЛ29т)}ы, если для коэффициента молярной экстинкции е справедливо соотношение (Е2«»/е297)/<<(е281)/Е297);/ Изменение формы спектра поглощения при разворачивании белка должно быть значительным для того, чтобы превзойти эффект, обусловленный уменьшением эффективности переноса энергии Туг -> Тгр, который, напротив, приводит к превышению /280 над /297

В работе Акселссна с сотрудниками [44] было показано, что спектр поглощения 0!пВР в нативном состоянии имеет необычную форму, а именно, характеризуется наличием небольшого плеча при 293 нм Это плечо в длинноволновой области спектра поглощения С1пВР было надежно зарегистрировано и в наших экспериментах (рис 2, а) Согласно нашим данным, оно обусловлено большим вкладом в поглощение на длинноволновом краю спектра поглощения ИпВР Тгр 220 по сравнению с Тгр 32 Этот вывод сделан на основании характера зависимости параметра А от длины волны возбуждения (рис 2, б) и анализа микроокружения трипто-фановых остатков белка Как бьио показано выше, тирозиновые остатки дают незначительный вклад в спектр флуоресценции нативного С!пВР Вследствие этого зависимость параметра А от длины волны возбуждения может определяться только изменением относительного вклада Тгр 32 и Тгр 220 в суммарную флуоресценцию белка Характер этой зависимости свидетельствует о том, что вклад триптофанового остатка с более длинноволновым спектром флуоресценции возрастает с увеличением длины волны возбуждающего света На рис 2, в представлены спектры флуоресценции нативного 01пВР при длинах волн возбуждения 297 и 280 нм (которые построены с учетом определенного нами соотношения (ЫоН29т)ж ~ 0 93, см рис 2, г), а также разностный спектр Ь^О-) ~

Длина волны (нм) 260 280 300 320 360 400

1 2 ОёпНС1 (М)

Рис 2 Спектральные характеристики С1пВР в Спектр поглощения С1пВР в нативном состоянии б Зависимость величины параметра Л С1пВР в нативном состоянии от длины волны возбуждения в Спектры флуоресценции 01лВР при длине волны возбуждения 297 (кривая /) и 280 нм (кривая 2) Кривая 3 - Л/Й1П11(>.) = /297(А.) -/з8<Д) <" Изменение интенсивности триптофановой флуоресценции (\?ет = 365 нм) при возбуждении светом с длинами волн 297 и 280 нм С!пВР в процессе разворачивания белка под действием Ос[пНС!

= W - Л» W = (AeTrp220) - Д/280 (Туг -> Trp220) - Д/280(Туг -> ТФ32) Величина А2екр(Х) представляет ту часть флуоресценции Тгр 220, которая определяется превышением поглощения этого остатка на длинноволновом краю спектра поглощения Д/297(ДеТгр220) Величины Д/280(Туг-»Тгр220) и Д/28о(Туг-»Тгр32) представляют собой части флуоресценции Тгр 220 и Тгр 32, которые определяются их переходом в возбужденное состояние при переносе энергии от тирозиновых остатков при длине волны возбуждения 280 нм

Спектр флуоресценции триптофановых остатков более чувствителен к их микроокружению, чем спектр поглощения Различия спектров поглощения отдельных триптофановых остатков невелики и обычно не принимаются в расчет при анализе флуоресцентных данных GInBP - необычный белок, в котором один из двух триптофановых остатков, несомненно, имеет более высокое значение коэффициента молярной экстинкции по сравнению с другим триптофановым остатком в длинноволновой области спектра Анализ экспериментальных данных и характеристик микроокружения двух триптофановых остатков GInBP позволил нам сделать вывод о том, что Тгр 220 является тем остатком, который вносит больший вклад во флуоресценцию белка при возбуждении на длинноволновом краю спектра поглощения Пока неясно, как часто такое различие в спектрах поглощения отдельных триптофановых остатков встречается в белках Таким образом, результаты этой работы свидетельствуют о том, что спектры триптофановой флуоресценции при возбуждении светом с длинами волн 280 нм и 297 нм могут различаться Этот факт следует учитывать при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка при возбуждении светом с длиной волны 280 нм Кроме того, этот эффект, очевидно, может являться причиной различий в длинноволновой области спектров флуоресценции некоторых белков (приведенных к интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм), измеренных при длинах волн возбуждения 280 нм и 297 нм В этом случае для представления таких спектров в сопоставимых единицах необходимо учитывать величину соотношения (¡авНтЪм Для определения этого соотношения наряду со спектрами флуоресценции нативного белка необходимо измерять спектры флуоресценции полностью развернутого белка при длинах волн возбуждения 280 нм и 297 нм (Kuznetsova et al, 2005, Степаненко и др, 2005, Степаненко и др, 2007) Существование различий в спектрах поглощения (возбуждения) и спектрах флуоресценции триптофановых остатков может быть полезным при разработке подхода для разложения многокомпонентного белкового спектра флуоресценции на составляющие

Спектр флуоресценции GGBP в нативном состоянии представляет собой широкую бесструктурную полосу и имеет максимум при длинах волн 344 - 346 нм При связывании ли-ганда максимум спектра флуоресценции GGBP сдвигается в коротковолновую область на 4 -

5 нм В состав белка входят 5 Тгр и 7 Туг остатков Особого внимания заслуживает Trp 183 С-концсвого домена, ориентированный внутрь щели, соединяющей два домена белка и служащей для связывания лиганда Этот остаток и остаток N-концсвого домена Phe 16 непосредственно участвуют в связывании сахара в щели между двумя доменами GGBP, формируя ароматический карман из индольного и фенолышго колец, между которыми помещается молекула сахара [14] Именно этот остаток характеризуется наибольшими различиями в составе микроокружения в GGBP и в комплексе GGBP/Glc Микроокружснис Тгр 183 GGBP характеризуется высокой полярностью, поскольку насчитывает много гстсроатомов полярных остатков, 5 атомов кислорода связанной воды и всего 1 группу нсполярного остатка (Ala 155) В состав микроокружения Тгр 183 GGBP/Glc по сравнению с микроокружением этого остатка в GGBP дополнительно входят полярные группы ОН Туг 10 и OD1 Asp 14, принадлежащие N-концсвому домену, и группа ОЕ1 Glu 149 Но, в то же время, микроокружснис этого остатка в комплексе GGBP/Glc по сравнению с GGBP содержит на 2 атома кислорода связанной воды меньше В комплексе GGBP/Glc все атомы углерода и кислорода глюкозы входят в состав микроокружения Тгр 183 Плотность микроокружения Тгр 183 в комплексе GGBP/Glc выше, чем в GGBP (0 84 и 0 81, соответственно) По-видимому, небольшой коротковолновый сдвиг спектра флуоресценции GGBP/Glc связан с увеличением плотности микроокружения Тгр 183 (Стспанснко и др , 2007)

Процессы сворачивания и разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCL Характер равновесных зависимостей различных флуоресцентных характеристик - интенсивности флуоресценции, параметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции, и анизотропии флуоресценции (рис 3 и 4) - свидетельствует об одностадийном разворачивании GGBP и комплекса GGBP/Glc Линейный вид параметрических зависимостей для GGBP и комплекса GGBP/Glc, построенных на основании зависимостей интенсивности флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, также говорит о том, что процесс разворачивания GGBP и комплекса GGBP/Glc происходит по принципу "все или ничего" (рис 4) Спектры КД в дальней УФ-области, измеренные для GGBP и комплекса GGBP/Glc, совпадают Это свидетельствует о том, что связывание молекулы D-глюкозы не влияет на вторичную структуру белка Характер зависимости эллиптичности при 222 нм от концентрации GdnHCl для GGBP и комплекса GGBP/Glc свидетельствует о наличии только одного перехода в процессе денатурации в области 0 3 - 1 5 M GdnHCl и 0 8 - 1 9 M GdnHCl, соответственно (рис 3) Таким образом, характер изменения спектров КД в дальней УФ-области спектра белка и комплекса с D-глюкозой под действием дснатуранта также свидетельствует об одностадийности процесса разворачивания GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl

0 12 3 4 GdnHCI (M)

(31234 [GdnHCI) M C*/

08 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 20 22 24

Рис 3 Конформационные переходы СвВР в отсутствие (кривые 1, кружочки) и в присутствии И-Ос (кривые 2, треугольники) под действием СапНС)

Открытые символы - разворачивание, закрашенные - сворачивание а - изменение параметра А - /з2сД}е>5> Ктб -297 нм, б - изменение анизотропии флуоресценции, Х^б = 297 нм = 365 нм в - изменение эллиптичности при 222 нм (град см2 дмоль')

Рис 4 Параметрические зависимости между интенсив-ностями флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, характеризующие процесс разворачивания ОбВР (открытые кружки) и ОСВР/С1с (открытые треугольники) под действием 0<ЗлНС1 Параметр - концентрация ОёпНС1 Темные кружки отвечают процессу ренатурации ОвВР Вставка а и б -изменение /320 и в зависимости от концентрации Ос1лНС1 соответственно А,* = 297 нм

Рис 5 Доля молекул бОВР (верхняя панель) и С0ВР/01с (нижняя панель) в нативном (открытые символы) и развернутом (закрашенные символы) состояниях в зависимости от концентрации ОдпНС1 Данные рассчитаны из величины триптофановой флуоресценции при регистрации на 320 (кружки), 350 (квадраты), 365 (треугольники) нм и эллиптичности при 222 нм (ромбы)

[GdnHCI], М

Рис 6 Влияние EDTA на третичную структуру GGBP (панель а) и комплекса GGBP/Glc (панель б) Кривые 1 2, 3 и 4 были измерены для растворов, содержащих 0 0, 0005, 0 01 и 0 75 мМ EDTA, соответственно Вставки Спектры триптофановой флуоресценции GGBP (/) и GGBP/Glc (//) в нативном состоянии (кривые черного цвета) и в присутствии EDTA разной концентрации 0 005 (зеленый цвет), 0 01 (синий цвет) и 0 75 мМ (красный цвет) ХВ(лб = 297 нм

Время, мин ч

Зависимости изменения доли молекул в нативном и развернутом состояниях от концентрации GdnHCl, построенные на основании изменения интенсивности флуоресценции при трех различных длинах волн регистрации и изменения КД при 222 нм, хорошо совпадают как для свободного GGBP, так и для его комплекса с D-глюкозой (рис 5) Это свидетельствует об одновременном разрушении третичной и вторичной структуры белка и его комплекса с лигандом Как белок, так и комплекс разворачиваются кооперативно Середина перехода от нативного к развернутому белку для GGBP и его комплекса с D-глюкозой составляет 0 5 и 1 2 M GdnHCl, соответственно Таким образом, присоединение лиганда стабилизирует структуру белка Об этом же свидетельствуют сопоставление величин свободных энергий Гиббса для белка и комплекса - эти величины различаются приблизительно в два раза (Стс-паненко и др , 2007)

Ренатурация GGBP Все равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик, таких как интенсивность флуоресценции, параметр А и анизотропия флуоресценции, и КД в дальней УФ-области от концентрации GdnHCl (рис 3 и 4), полученные при рс-натурации GGBP из полностью развернутого состояния (в присутствии 3 M GdnHCl), совпадают с соответствующими кривыми, характеризующими процесс разворачивания белка Это говорит об обратимости процесса денатурации GGBP под действием GdnHCl (Степаненко и др, 2007)

Отщепление иона кальция Молекула GGBP содержит один ион кальция, локализованный в петле С-концсвого домена (остатки 134 - 142) и образующий координационную связь с атомами кислорода каждого второго остатка этой петли и остатка Glu 205 (рис 1) Структура кальций-связывающсго сайта напоминает структуру мотива "EF-руки", распространенного во внутриклеточных кальций-связывающих белках [13-14]

Все проведенные эксперименты показали стабилизирующую роль иона кальция в структуре GGBP Отщепление иона кальция приводит к изменению третичной структуры молекулы GGBP, о чем свидетельствует изменение флуоресцентных свойств GGBP с отщепленным кальцием по сравнению с GGBP Кинетические зависимости интенсивности флуоресценции, зарегистрированные при исследовании процесса отщепления иона Са2+ от GGBP с помощью ЭДТА, характеризуются увеличением интенсивности триптофановой флуоресценции на 35 % (рис 6, а) Равновесные значения интенсивности флуоресценции GGBP с удаленным ионом Са2+, устанавливающиеся за время от 2 до 7 мин после смешения растворов белка и хелатирующего агента, оказались больше соответствующего значения для нативного белка (рис 6, а и вставка I) В то же время присутствие молекулы связанного сахара Glc делает белок более устойчивым к перестройкам структуры GGBP-Ca/Glc, вызванным удалением иона Са2+ Отщепление иона Са2+ в значительно меньшей степени влияет на тре-

тичную структуру комплекса GGBP/Glc, о чем свидетельствует меньшая амплитуда увеличения интенсивности триптофановой флуоресценции GGBP/Glc после добавления ЭДТА и достижение равновесных значений регистрируемой характеристики за время меньше 2 мин (рис 6, б) При этом равновесные значения интенсивности флуоресценции GGBP/Glc с удаленным ионом Са2+ (GGBP-Ca/Glc) совпадают со значением, характерным для комплекса GGBP/Glc (рис 6, б и вставка II) Эксперименты по кинетике денатурации GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc химическим дснатурантом GdnHCI позволили показать, что GGBP-Ca менее устойчив к денатурирующему действию GdnHCI по сравнению с GGBP, в то же время наличие в структуре белка молекулы связанной D-глюкозы повышает устойчивость GGBP-Ca/Glc к денатурирующему действию GdnHCI (Stepanenko et al, 2008)

Процессы сворачивания и разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/GIn Разворачивание GlnBP и ClnBP/Gln под действием GdnHCL Равновесные зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции, параметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции, анизотропии флуоресценции, величины эллиптичности при длине волны 222 нм, интенсивности флуоресценции АНС и вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию для GlnBP и GlnBP/GIn от концентрации GdnHCI свидетельствуют о сложном процессе разворачивания как GlnBP, так и комплекса белка с лигандом под действием GdnHCI (рис 7)

Характер зависимостей интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм, параметра А и КД в дальней УФ-области спектра GlnBP от концентрации GdnHCI (рис 7, вставка 1 к панели а, б и г), свидетельствует о существовании, по крайней мере, двух переходов при разворачивании белка под действием GdnHCI Первый переход лежит в области концентраций 0 2 - 0 7 М GdnHCI, а второй - в области 1 4 - 2 1 М GdnHCI В противоположность GlnBP, зависимости соответствующих характеристик GlnBP/GIn под действием GdnHCI имеют простой сигмоидальный вид, что соответствует модели перехода "все или ничего" Зависимость интенсивности триптофановой флуоресценции GlnBP от концентрации GdnHCI, измеренная при длине волны 365 нм, характеризуется выраженным увеличением интенсивности флуоресценции в области концентраций GdnHCI 01 - 1 1 М, что говорит о более сложном процессе разворачивания GlnBP под действием GdnHCI В то же время, зависимости анизотропии флуоресценции GlnBP и GlnBP/GIn от концентрации GdnHCI совпадают на всем промежутке концентраций дснатуранта от 0 0 до 3 0 М, при этом величина анизотропии флуоресценции остается постоянной вплоть до 1 3 М GdnHCI (рис 7, в) Постоянство величины анизотропии в области от 0 0 до 1 3 М GdnHCI свидетельствует о том, что белок в этой области концентраций дснатуранта сохраняет глобулярную структуру и достаточно жесткое микроокружение триптофановых остатков, которое

/,65, отн ед GdnHCl, М GdnHCI, М

Рис 7 Конформационные переходы GlnBP (кривые 1, синий цвет) и его комплекса с Gin (кривые 2 красный цвет) под действием GdnHCl Закрашенные кружки отвечают процессу ренатурации GlnBP а - параметрические зависимости между 132о и /к,5 параметр - концентрация GdnHCl Показаны флуоресцентные характеристики соответствующие нативному (N) промежуточным состояниям (1| и Ь) и полностью развернутому (U) состояниям Числа на кривых - концентрации GdnHCl Вставки / и // - изменение интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 и 365 нм, соответственно, =297 нм, Ь - изменение параметра А = hwHm /.Н(Г1,-, =297 нм, в - изменение анизотропии флуоресценции, Л^.,.-, = 297 нм, ^рет = 365 нм г ~ изменение интенсивности флуоресценции АНС, = 365 нм, /Jpa = 480 нм д - изменение эллиптичности при 222 нм

ограничивает внутримолекулярную подвижность индольных колец

Параметрическое представление результатов измерений равновесных зависимостей интенсивности флуоресценции /320 и /зм от концентрации 0(1пНС1 и кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции /320 и Ьа после перевода белка в раствор в(1пНС1 соответствующей концентрации свидетельствует о существовании двух промежуточных состояний (1, и 1г) на пути перехода С1пВР из нативного в развернутое состояние (рис 7, а)

Переход N -> 1| происходит в области концентраций Сс1пНС1 от00до06-07М для С1пВР Этот переход сопровождается уменьшением интенсивности флуоресценции и величины параметра А, увеличением вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также увеличением интенсивности флуоресценции АНС (рис 7, г) Неизменность величины анизотропии флуоресценции вплоть до 1 3 М 0(1пНС1 предполагает, что в этой области концентраций С(1пНС1 белок сохраняет глобулярную и довольно жесткую структуру, несмотря на существенное уменьшение сигнала КД в дальней УФ-области Возможно, сохранение высокого значения анизотропии флуоресценции белка обусловлено ассоциацией денатурированных частично-свернутых молекул белка, возникающих в результате перехода N -» ¡1 Существенное увеличение флуоресценции АНС в области перехода N -> Ь, можно связать с возникновением состояния типа "расплавленной глобулы" Возникновение гидрофобных кластеров на поверхности макромолекулы 01пВР при переходе в состояние типа расплавленной глобулы может являться предпосылкой ассоциации макромолекул

Переход —» 1г хорошо проявляется в равновесной зависимости интенсивности флуоресценции, изморенной при длине волны регистрации 365 нм (рис 7, а, вставка II), и в параметрических зависимостях (рис 7, а) Более того, для СНпВР существование !г видно из сравнения равновесных зависимостей анизотропии флуоресценции г и интенсивности флуоресценции АНС Увеличение интенсивности флуоресценции АНС соответствует переходу N 1| Интенсивность флуоресценции АНС начинает уменьшаться до начала разворачивания белка, которое проявляется в уменьшении анизотропии флуоресценции Разумно предположить, что существует дополнительный переход (Ь —> Ь), приводящий к уменьшению интенсивности флуоресценции АНС, который предшествует полному разворачиванию белка (Ь—> и) Переход I] Ь происходит в области 0 75-1 1 М Ос1пНС1 В то же время, ни зависимость интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм, ни зависимость параметра А от концентрации С(1пНС1 не дают никаких свидетельств существования перехода в этой области концентраций вс!пНС1 Согласно данным КД в дальней УФ-области, вторичная структура белка также не изменяется в этой области концентраций Сс1пНС1 (рис 7, д)

Переход Ь и происходит в области 1 3-2 4 М Ос1пНС1 В результате этого перехода разрушается компактная глобулярная структура Прежде всего, это видно по значительному длинноволновому сдвигу спектра флуоресценции, т с по уменьшению параметра А (рис 7, б), что предполагает увеличение полярности микроокружения триптофановых остатков Уменьшение анизотропии флуоресценции в этой области концентраций Ос1пНС1 (рис 7, в) говорит об увеличении подвижности триптофановых остатков и их микроокружения Об увеличении подвижности микроокружения триптофановых остатков при этих концентрациях 0(1пНС1 свидетельствует также изменение спектра КД в ближней УФ-области спектра Существенное уменьшение эллиптичности при 222 нм (рис 7, д) свидетельствует о разрушении вторичной структуры белка в результате данного перехода Интересно, что уменьшение интенсивности флуоресценции АНС начинается при концентрациях 0(1пНС1, которые существенно меньше, чем тс, при которых начинается переход Ь —> I) Это косвенно подтверждает существование состояния Ь Это также означает, что при переходе в состояние Ь белок теряет способность связывать АНС

Так как ИпВР - двухдоменный белок, то мы не можем не учитывать возможности последовательного разворачивания доменов В то же время переход N —>11 нельзя объяснить разворачиванием малого домена (который не имеет триптофановых остатков), так как он сопровождается существенными изменениями флуоресцентных характеристик С помощью РТЖ была показана более низкая тсрмочувствитсльность а-спиралей белка по сравнению с Д-листами [45] Возможно, а-спирали 01пВР также менее устойчивы к денатурирующему

действию GdnHCl В этом отношении существенно отмстить, что тепловая денатурация (в противоположность разворачиванию под действием GdnHCl) никогда не приводит к полному разворачиванию белка Таким образом, мы можем предположить, что в нашем случае, переход N —> Ii сопровождается разворачиванием а-спиралсй, тогда как переход Ii —> I2 связан с разрушением Р-листов (Staiano et al, 2005, Стспанснко и др, 2005, Туровсров и др, 2007)

Ренатурация GlnBP Несмотря на сложный характер разворачивания GInBP под действием GdnHCl, его денатурация полностью обратима (рис 7) Все флуоресцентные характеристики GlnBP, такие как параметр А, интенсивность триптофановой флуоресценции и анизотропия флуоресценции, измеренные для растворов белка, содержащих 1 38, 0 71, 0 50 и 0 43 М GdnHCl, не зависят от того, были ли эти растворы получены в процессе денатурации или рснатурации из 3 0 М GdnHCl Об обратимости процесса разворачивания белка под действием GdnHCl свидетельствует также вид параметрических зависимостей процесса рснатурации GlnBP из 3 02 М GdnHCl, при построении которых параметром выступала концентрация дснатуранта (рис 7, а)

Кинетические кривые процесса рснатурации GlnBP из полностью развернутого состояния (в присутствии 3 02 М GdnHCl), как и равновесные эксперименты, свидетельствуют о том, что, хотя процесс разворачивания GlnBP является сложным, денатурация GlnBP обратима Параметрическое представление кинетических зависимостей интенсивностей флуоресценции, измеренных при рснатурации белка, показывает, что ренатурация белка, очевидно, проходит через образование тех же промежуточных состояний, что и при денатурации белка (Staiano et al, 2005, Стспанснко и др, 2005)

Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигаидом Все экспериментальные данные говорят о том, что структура комплекса GlnBP/Gln более устойчива к денатурирующему действию GdnHCl по сравнению с GlnBP В самом деле, для GlnBP/Gln перс-ход N ^^ Ii происходит при более высокой концентрации GdnHCl (рис 7) Это означает, что процессы N Ii, Ii -—1 I2 и I2 -—- U происходят в более узкой области концентраций GdnHCl В результате связывания Gin разворачивание белка становится более кооперативным и белок выдерживает большие концентрации GdnHCl Это создает видимость того, что процесс денатурации GlnBP/Gln происходит с образованием только одного промежуточного состояния Тем не менее, характер параметрических зависимостей между /320 и /зб5 (рис 7, а) однозначно показывает, что процесс разворачивания GlnBP/Gln, так же как и GlnBP, является трехстадийным

Таким образом, разворачивание GlnBP под действием GdnHCl является трехстадийным и обратимым Связывание лиганда (Gin) приводит к тому, что структура белка становится более устойчивой к денатурирующему действию GdnHCl Это, в свою очередь, приводит к

кооперативному разворачиванию структуры по достижении соответствующей концентрации денатуранта (Степаненко и др, 2005, Staiano et al, 2005) Возрастание интенсивности флуоресценции АНС при разворачивании GlnBP под действием GdnHCl (переход N •<—'- 1|), по-видимому, связано с образованием ассоциатов макромолекулы белка после их перехода в состояние типа расплавленной глобулы (Síaiano et al, 2005, Степаненко и др, 2005)

Сравнение характера процессов разворачивания-сворачивания GGBP с GlnBP Оба белка, GlnBP и GGBP, относятся к одному семейству лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий и имеют сходную третичную структуру, несмотря на различие аминокислотной последовательности и молекулярной массы (25 кДа для GlnBP и 33 кДа для GGBP) Величины свободной энергии для этих белков близки по значению Комплексообразованис GlnBP с глутамином и GGBP с D-глюкозой делает белки более тсрмостабильными Установлено, что температурная денатурация как GlnBP и GGBP, так и их комплексов со своими ли-гандами является необратимой Характер разворачивания GGBP и GlnBP под действием GdnHCl существенно различается Как было показано, GlnBP и GlnBP в комплексе с глутамином разворачивается по трехстадийному механизму Совокупность данных, полученных методом собственной флуоресценции белков, флуоресценции АНС, данных КД в дальней УФ-области, а также использование параметрического представления флуоресцентных данных позволили предложить следующую схему для разворачивания как GlnBP, так и GlnBP/Gln под действием GdnHCl

N I, I2 s=í U где N - нативное состояние, U - развернутое состояние, 11 и Ь - промежуточные состояния, возникающие на пути перехода из нативного в развернутое состояние В присутствии глута-мина структура GlnBP становится более тсрмостабильной и более устойчивой к денатурирующему действию GdnHCl Несмотря на сложный характер процесса разворачивания GlnBP, он полностью обратим

В то же время разворачивание как GGBP, так и его комплекса GGBP/GIc является одностадийным процессом Более кооперативный характер денатурации GGBP по сравнению с GlnBP, возможно, вызван присутствием иона Са2+ в структуре GGBP Макромолекула GGBP сохраняет нативное состояние, пока ион Са2+ не отщепляется под действием GdnHCl или нагревания Таким образом, разворачивание GGBP начинается при более высокой концентрации GdnHCl (температуре) по сравнению с GlnBP, и переход осуществляется более кооперативно Разрушение GGBP/GIc начинается при еще более высокой концентрации GdnHCl (температуре) после удаления второго лиганда - молекулы сахара (Степаненко и др , 2005, Kuznetsova et al, 2005, Staiano et al, 2005, Степаненко и др, 2007)

ВЫВОДЫ

1 Связывание лиганда стабилизирует структуру глутамин-связывающего белка и 0-галактозаУЭ-шокоза-связывающего белка и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний

2 Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается

• разворачивание глутамин-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является трехстадийным, т е проходит с образованием двух промежуточных состояний 1| и Ь

• процесс разворачивания О-галактозаЛЗ-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является одностадийным

3 Разворачивание глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является обратимым, а тепловая денатурация необратима

4 Существенное увеличение интенсивности флуоресценции гидрофобного красителя 1-анилинонафталин-8-сульфоната при переходе в первое промежуточное состояние Ь, возникающее при разворачивании глутамин-связывающего белка, связано с образованием состояния типа "расплавленной глобулы" Возникновение гидрофобных кластеров на поверхности макромолекулы глутамин-связывающего белка при переходе в это состояние сопровождается ассоциацией макромолекул

5 Несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и О-галактоза/Р-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигаидов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Kuznetsova I М , Stepanenko Olga V , Turoverov К К , Staiano М , Scognamiglio V , Rossi М , D'Auria S (2005) Fluorescence properties of glutamine-bmdmg protein from Escherichia coli and its complex with glutarmne J Proteome Res 4 (2) 417-23

2 Staiano M , Scognamiglio V , Rossi M , D'Auna S , Stepanenko Olga V., Kuznetsova 1 M , Turoverov К К (2005) Unfolding and refolding of the glutamme-binding protein from Es-chenchia coli and its complex with glutarmne induced by guamdme hydrochloride BiochenuUry 44(15)5625-33

3 Степаненко Ольга В , Кузнецова И М, Туроверов К К , Скогнамиглио В , Стаяно М , Д'Ауриа С (2005) Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином Цитология 47(11) 988-1006

4 Туроверов К К , Поварова О И , Степаненко Ольга В , Кузнецова И М (2007) Термодинамически стабильные, компактные состояния белков образование нативной структуры в процессе фолдинга, аморфных агрегатов, амилоидных и амилоидо-подобных фибриллярных структур при его нарушении В сб "Бресчеровские чтения Молекуяярная генетика, биофизика и медицина сегодня" Ред В А Ланцов СПб ПИЯФ РАН, 78-87

5 Степаненко Ольга В , Кузнецова И М , Туроверов К К , Скогнамиглио В , Стаяно М , Д'Ауриа С (2007) Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдомен-ных лиганд-связывающих белков Вестник молодых ученых Выпуск IV М СП "Мысль" 42-52

6 Степаненко Ольга В., Кузнецова И М , Стаяно М , Д'Ариа С (2004) Анализ микроокружений триптофановых и тирозиновых остатков и спектральные свойства GlnBP 8-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 34

7 Степаненко Ольга В, Кузнецова И М , Туроверов К К , Скогнамиглио В , Стаяно М , Д'Ариа С (2004) Сравнительное изучение структуры и стабильности глутаминсвязывающего белка и его комплекса с глутамином III Съезд биофизиков России, Воронеж, 105

8 Рагтасшо А , Scognamiglio V , Staiano М , Varnalc А , Rossi М , D'Auna S , Kuznetsova IM , Stepanenko Olga V , Turoverov К К (2004) Glutamme-binding protein from E coli location of tryptophan and tyrosine residues, characteristics of their microenvironments, and their contribution to the bulk fluorescence of the protem The Italian Journal of Biochemistry V 53, suppl 1, 104

9 Степаненко Ольга В , Кузнецова И М , Туроверов К К , Скогнамиглио В , Стаяно М , Д'Ауриа С (2007) Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдомен-ных лиганд-связывающих белков XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", Москва, т 1,76

10 Stepanenko Olga V , Kuznetsova I M , Turoverov К К , Scognamiglio V, Staiano M , Rossi M, D'Auria S (2007) Peculiarities of folding processes of ligand binding protein D-galactose/D-glucose-binding protein and glutamme-binding protem XIIth European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Bobigny, France, 190

11 Степаненко Ольга В (2007) Фолдинг и стабильность двухдоменных лиганд-связывающих белков - чувствительных элементов социально значимых биосенсоров Двенадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 42

12 Stepanenko Olga V, Kuznetsova IM , Turoverov К К, Scognamiglio V , Staiano M , D'Auna S (2008) The role of calcium ion in the structure of D-galactose/D-glucose-binding protein 4lh Saint-Petersburg young scientists conference Abstract book, Saint-Petersburg, 73

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Harper J D , Lansbury P T Jr 1997 Ann Rev Biochem 66 385-407 2 Carrel 1 R \V , Gooptu В 1998 Curr Opin Struct Biol 8 799-809 3 Fmk A L 1998 Fold Des 3 9-23 4. Uversky V N et al, 1999a Medical Science Monitor 5 1001 - 1012 5. Uversky V N et al, 1999b Medical Science Monitor 5 1238 -1254 6 Selkoe D J 2003 Nature 426 900- 904 7 Wetzel R 1994 Trends Biotechnol 12 193 - 198 8 Speed M A et al, 1996 Nat Btotechnol 14 1283 -1287 9 Dattelbaum J D , Lakowicz J R 2001 Anal Biochem 291 89-95 10. Staiano M et al, 2004 Biotechnology Progress 20(5) 1572 - 1577 11 Tolosa L etal,1999 Anal Biochem 267 114-120 12 Berman H M , et al, 2000 Nucleic Acids Research 28 (1) 235 -242 13 Borrok MJ et al, 2007 Prot Sci 16(6) 1032-1041 14 Vyas N К et a!, 1988 Science 242 1290-1295 15. Hsiao С-D et al, 1996 J Mol Biol 262 225-242 16 Sun Y et al, 1998 J Mol Biol 278 219-229 17 Turoverov К К et al, 1985 Biophys Chem 23 79-89 18 Forster Th 1960 Rad Res Suppl 2 326-339 19 Dale R E , Eismger J 1974 Biopolymers 13 1573-1605 20. Eismger J et al, 1969 Biochemistry 8 3908-3915 21. Steinberg I Z 1971 Ann Rev Biochem 40 83114 22 Туроверов К К и др, 1998 Цитология 40 (8/9) 806-817 23 Turoverov К К, Kuznetsova 1 М 2003 J Fluorescence 13 41- 57 24 Расе С N 1986 Methods Enzymol 131 266-280 25 Noltmg В 1999 Protein Folding Kinetics Biophysical Methods Berlm-Haidelberg Springer-Verlag, 191 p 26 Jablonski A 1957 Acta Phys Polon 16 471-479 27. Лакович Дж 1986 Основы флуоресцентной спектроскопии М Мир стр 136-139 28 Бурштейн Э А 1976 Люминесценция белковых хромофоров Сер Бнофиз, Т 7, ВИНИТИ, Москва 29 Ка-планас РИ и др, 1975 Мол Биол 9 795 - 804 30 Bushmanna N A et al, 2001 Chem Bio Chem 2 813-821 31 Kuznetsova I M , Stepanenko Olga V et al, 2002a Biochem Biophys Acta 1596 138 - 155 32 Kuznetsova I M et al, 2004 J Proteome Res 3 485-494 33 Stepanenko Olga V et al, 2004 Biochemistry 43 5296 - 5303 34 Кузнецова И M , Стена-ненко Ольга В и др , 2005 Цитология 47 (11) 1007-1016 35. Kuznetsova I М , Stepanenko Olga V et al, 2002b Biochemistry 41 13127 - 13132 36 Turoverov KK, Kuznetsova 1M 2003 J Fluorescence 13 41-57 37 Поварова О И и др, 2005 Цитология 47 935-977 38. Altschuler G М et al, 2005 J Mol Biol 353(2) 385- 396 39. Das P et al 2005 102(41) 14569 - 14574 40 Marquardt D W 1963 J Soc Indust Apl Math 11 431-441 41 Zuker M et al, 1985 Rev Sci [nstrum 56 14-22 42. Humphrey W et al, 1996 J Molec Graphics 14 33- 38 43 Merritt E A , Bacon D J 1977 Methods enzymol 277 505-524 44 Axelsen P H etal,1991 Biophys J 60 650-659 45 D'Auria S et al, 2005 Proteins 58 80 - 87

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 16 05 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2989Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степаненко, Ольга Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цель и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о фолдинге белков.

1.1.1. Сворачивание белков в клетке.

1.1.2. Модель энергетической воронки. Роль внутри- и межмолекулярных взаимодействий в фолдинге и нарушении фолдинга белков.

1.2. Периплазматические лиганд-связывающие белки.

1.2.1. И-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli.

1.2.1.1. Структура GGBP и его комплекса с О-глюкозойЛЗ-галактозой.

1.2.1.2. Спектральные свойства GGBP и GGBP/Glc.

1.2.1.3. Тепловая денатурация GGBP. Роль лигандов — D-глюкозы и иона кальция — в стабилизации структуры белка.

1.2.2. Глутамин связывающий белок из Escherichia coli.

1.2.2.1. Структура GlnBP в свободном состоянии и в комплексе с Gin.

1.2.2.2. Спектральные свойства GlnBP и GlnBP/Gln.

1.2.2.3. Изучение структуры и стабильности GlnBP и комплекса GlnBP/Gln при тепловой денатурации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых и тирозиновых остатков.

2.2.2. Фпуорещентные измерения.

2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции.

2.2.4. Круговой дихроизм.

2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.

2.2.6. Измерение кинетических кривых разворачивания-сворачивания белков.

2.2.7. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.

2.2.8. Расчет констант скоростей процессов сворачивания-разворачивания.

2.2.9. Расчет термодинамических параметров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Процессы сворачивания-разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc.

3.1.1. Анализ микроокружения триптофановых и тирозиновых остатков GGBP в отсутствие и в присутствии лиганда.

3.1.2. Триптофановая флуоресценция GGBP и его комплекса с D-глюкозой в нашивном и полностью развернутом состоянии.

3.1.3. Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl.

3.1.4. Ренатурация GGBP.

3.1.5. Тепловая денатурация GGBP и GGBP/Glc.

3.1.6. Отщепление иона кальция.

3.2. Процессы сворачивания-разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/Gln.

3.2.1. Триптофановая флуоресценция GlnBP и его комплекса с Gin в нашивном и полностью развернутом состояниях.

3.2.2. Характеристика микроокружения триптофановых остатков GlnBP.

3.2.3. Флуоресцентные свойства и характеристика микроокружения триптофановых остатков комплекса GlnBP/Gln.

3.2.4. Тирозиновая флуоресценция GlnBP.

3.2.5. Зависимость триптофановой флуоресценции GlnBP от длины волны возбуждения. 3.2.5. Разворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием GdnHCl. Равновесные зависимости.

3.2.6. Кинетика разворачивания GlnBP под действием GdnHCl.

3.2.7. Параметрическое представление процессов разворачивания GlnBP.

3.2.8. Ренатурация GlnBP.

3.2.9. Тепловая денатурация GlnBP и комплекса GlnBP/Gln. Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом.

3.3. Сравнение характера процессов разворачивания-сворачивания GGBP с GlnBP.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры"

Процессы разворачивания-сворачиваиия белков, их устойчивость к действию химических денатураптов и нагреванию, структура и механизмы образования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интенсивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира. Актуальность этих исследований обусловлена как их значимостью для решения фундаментальной проблемы фолдипга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в денатурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink,. 1998; Uversky et al., 1999a; Uversky et al., 1999b; Selkoe, 2003) и биотехнологии (Wetzel, 1994; Speed et al., 1996; Fink, 1998). Специфическая ассоциация, приводящая к образованию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых "конформационных болезней"), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативных рекомбинантных белков.

К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга-рефолдинга небольших мономерных белков. Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени. В связи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежащих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотаксиса и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий. В настоящей работе объектами исследования стали глутамин-связывающий белок и D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli. Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и Сахаров. Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурах; Dattelbaum, Lakowicz, 2001) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больных; Staiano et al., 2004). Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка. В задачи работы входило:

1. Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Б-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl);

2. Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний;

3. Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Е)-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl обратимой;

4. Исследование роли лигандов - глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и D-глюкозы и иона кальция, в случае О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка - в стабилизации структуры этих белков к денатурирующему действию GdnHCl и нагревания.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Связывание лиганда стабилизирует структуру лиганд-связывающих белков и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.

2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галакгозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу "все или ничего", при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих состояний является состоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией молекул глутамин-связывающего белка.

3. Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд-связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначительно.

Научная новизна исследований

Результаты исследования процессов разворачивания—сворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, получены впервые. Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl. Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию GdnHCl и нагреванию, по и делает процесс денатурации более кооперативным. Впервые охарактеризована стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса.

Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и Б-галактозаЯ)-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно. Сделано заключение о том, что собственная флуоресценция D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в качестве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для пеинвазивного определения содержания сахара в крови больных диабетом. Тем не менее, существенные изменения пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток - донора и акцептора энергии возбуждения.

На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Предложен метод учета этого эффекта.

Теоретическое и практическое значение работы

Новые данные о процессах сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и Б-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубокого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их структуры к действию различных химических денатурантов и нагреванию. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков.

Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/Э-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое значение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара.

Существенной методической разработкой является установление того факта, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и конформационных изменений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофановых остатков, на составляющие.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Степаненко, Ольга Викторовна

выводы

1. Связывание лиганда стабилизирует структуру глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.

2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается:

• разворачивание глутамин-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является трехстадийным, т.е. проходит с образованием двух промежуточных состояний Ii и 12.

• процесс разворачивания О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является одностадийным.

3. Разворачивание глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является обратимым, а тепловая денатурация необратима.

4. Существенное увеличение интенсивности флуоресценции красителя 1-анилинонафталин-8-сульфоната при переходе в первое промежуточное состояние 1Ь возникающее при разворачивании глутамин-связывающего белка, связано с образованием состояния типа "расплавленной глобулы". Возникновение гидрофобных кластеров на поверхности макромолекулы глутамин-связывающего белка при переходе в это состояние сопровождается ассоциацией макромолекул.

5. Несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и О-галактоза/О-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степаненко, Ольга Викторовна, Санкт-Петербург

1. Бурштейн Э. А. (1976). Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.

2. Бычкова В. А. и Птицын О.Б. (1995). Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты. Цитология. 37: 1238 — 1250.

3. Гильманшии Р.И., Долгих Д.А., Птицын О.Б., Финкелынтейн А.В. и Шахнович Е.И. (1982). Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель. Биофизика. 27: 1005 1015.

4. Грузина В.Д. (2003). Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия. 48(10): 32-39.

5. Гусев Н.Б. (2004). Нейродегенеративные болезни и проблема правильного сворачивания белка. СОЖ. 8(2): 15-23.

6. Капланас Р.И., Буколова Т.Г., Бурштейн Э.А. (1975). Флуоресценция Р-лактоглобулина в различных физико-химических условиях. Мол. Биол. 9: 795 -804.

7. Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К. (2005). Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков. Цитология. 47(11): 943 952.

8. Кузнецова И.М., Степаненко Ольга В., Туроверов К.К., Хуанг Ч., Ванг Ч.-Ч. (2005) Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология. 47 (11): 1007 1016.

9. Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (1983). Поляризация собственной флуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков. Мол. биол. 17 (4): 741 754.

10. Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (1998). Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения иособенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40 (8/9): 747 762.

11. Лакович Дж. (1986). Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136 139.

12. Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (2005). Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания — разворачивания. Цитология. 47: 935 — 977.

13. Полинг Л., Полинг П. (1978). Химия. М.: Мир. стр. 683.

14. Птицын О.Б. (1973). Стадийный механизм организации белковых молекул. Докл. Акад. Наук СССР. 210: 1213 1215.

15. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогиамиглио В., Стаяно М., Д'Ауриа С. (2005). Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47(11): 988 1006.

16. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д'Ауриа С. (2007). Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдоменных лигапд-связывающих белков. Вестник молодых ученых. Выпуск IV. М.: СП "Мысль". 42-52.

17. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. (1998). Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40 (8/9): 806-817.

18. Туроверов К.К., Кузнецова И.М. (1998). Собственная УФ-флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 40 (8/9): 735 -746.

19. Финкельштейн, А.В. (1976). Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. I. Разрешение конформации дипептидов. Мол. Биология. 10 (3): 507 513.

20. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. (2005). Физика белка. М.: КДУ. 456 с.

21. Эфтинк М.Р. (1998). Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия. 63 (3): 327 337.

22. Akiyama S., Takahashi S., Ishimori К. and Morishima I. (2000). Stepwise formation of a-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7: 514 — 520.

23. Altschuler G.M., Klug D.R., Willison K.R. (2005). Unfolding energetics of G-a-actine: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J.Mol.Biol. 353(2): 385-396.

24. Ames G. F.-L. and Lecar H. (1992). ATP-dependent bacterial transporters and cystic fibrosis: analogy between channels and transporters. FASEB J. 6: 2660-2666.

25. Anfinsen C.B. (1973). Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181:223 -230.

26. Anraku Y. (1968). Transport of sugars and amino acids in bacteria. I. Purification and specificity of the galactose and leucine-binding proteins. JBC 243 (11): 3116 -3122.

27. Arai M., Inobe Т., Maki K., Ikura Т., Kihara H., Amemiya Y., and Kuwajima K. (2003). Denaturation and reassembly of chaperonin GroEL studied by solution X-ray scattering, Protein Sci. 12: 672 680.

28. Bader M.V. and Bardwell J.C.A. (2002). Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv. Protein. Chem. 59: 283 301.

29. Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999a). Is protein folding hierarchic? I. Local structure and peptide folding. Trends Biochem. Sci. 24(1): 26-33.

30. Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999b). Is protein folding hierarchic? II. Folding intermediates and transition states. Trends Biochem. Sci. 24(2): 77-83.

31. Beel B.D. and Hazelbauer G.L. (2001). Signaling substitutions in the periplasmic domain of chemoreceptor Trg induce or reduce helical sliding in the transmembrane domain. Molecular Microbiology. 40(4): 824 834.

32. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissing H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. (2000). The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235-242.

33. Bilsel O., Matthews C.R. (2000). Barriers in protein folding reactions. Adv. Protein Chem. 53: 153 -207.

34. Bjorkman A.J. and Mowbray S.L. (1998). Multiple open forms of ribose-binding protein trace the path of its conformational change. JMB. 279(3): 651 64.

35. Borrok M.J., Kiessling L.L. and Forest K.T. (2007). Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures. Prot.Sci. 16(6): 1032- 1041.

36. Bushmarina N. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Turoverov К. K., Uversky V. N. (2001). Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analysis. Chem.Bio.Chem. 2: 813 — 821.

37. Bychkova V.E. and Ptitsyn O.B. (1993). The molten globule in vitro and in vivo. Chemtracts Biochemistry and Molecular Biology. 4: 133 — 163.

38. Careaga C.L., Sutherland J., Sabeti J. and Falke J. (1995). Large amplitude twisting motions of an interdomain hinge: a disulfide trapping study of the galactose-glucose binding protein. Biochemistry. 34: 3048 3055.

39. Carrell R.W., Gooptu B. (1998). Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799 - 809.

40. Carrio M., Gonzalez-Montalban N., Vera A., Villaverde A., Ventura S. (2005). Amyloid-like properties of bacterial inclusion bodies. J.Mol.Biol. 347: 1025 1037.

41. Chen Y., Barklcy M. D. (1998). Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry 37: 9976-9982.

42. Chen X., Schauder S., Potter N., Van Dorsselaer A., Pelczer I., Basslcr B.L., and Hughson F.M. (2002). Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 415: 545 549.

43. Chen J., Walter S., Horwich A.L. and Smith D.L. (2001). Folding of malate dehydrogenase inside the GroEL-GroES cavity. Nature Struct. Biol. 8: 721 728.47