Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum"

005058531

На правах рукописи

Дворцов Игорь Александрович

Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы ЬісІбА Сіояігісііит іігегтосеїіит

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

1 6 МАЙ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2013

005058531

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Лунина Наталия Александровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

кафедры органической химии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова.

доктор химических наук, Козлов Сергей Александрович

ведущий научный сотрудник лаборатории

нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Института биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "20" мая 2013 года в "15" часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на интернет-сайте ВАК РФ: http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Ферментативная деградация нерастворимых полисахаридов - одна из наиболее важных реакций на земле. Гликозил-гидролазная атака таких полисахаридов относительно неэффективна, так как ее цель - гликозидные связи - часто недоступна для активного сайта соответствующего фермента. Многие гликозил-гидролазы, разрушающие нерастворимые субстраты, состоят из нескольких модулей - функционально и пространственно обособленных глобулярных доменов. Такие гликозил-гидролазы включают в себя каталитический модуль в сочетании с одним или более некаталитическими, в основном, углевод-связывающими модулями (сокращенно СВМ). В виду центральной роли, которую СВМ играют в ферментативном гидролизе структурных и резервных полисахаридов, лиганд-специфичность, проявленная этими модулями, и механизм, посредством которого они узнают свою цель, привлекают пристальное внимание исследователей с момента их открытия, около 30 лет назад. Сотни СВМ на данный момент идентифицированы экспериментально, несколько тысяч СВМ могут быть идентифицированы на основании анализа аминокислотных последовательностей. Аналогично каталитическим модулям гликозил-гидролаз, СВМ распределены но семействам исходя из гомологии их аминокислотных последовательностей. Сформировано более 60 семейств СВМ, и эти СВМ демонстрирует значительное различие в субстратной специфичности. Были охарактеризованы СВМ, связывающие кристаллическую и аморфную целлюлозу, хитин, глюканы с различными Р-связями, ксилан, галактан и крахмал. Изучение свойств разных СВМ важно как для понимания фундаментальных механизмов гидролиза сложнейших природных полисахаридов, так и для биотехнологии. Особый интерес для биотехнологического использования имеют СВМ из термофильных гликозилгидролаз, сохраняющие свою стабильность при температурах 70-90 °С.

В последние годы отмечен большой рост числа публикаций, посвященных прикладному использованию СВМ. Можно выделить следующие свойства СВМ, позволяющие использовать их как универсальный инструмент в молекулярной биотехнологии: автономность в составе исходных гликозил-гидролаз и сохранение.свойств после отделения от остальной молекулы, а также в составе химерных белков, способность к специфическому связыванию с полисахаридами - дешевыми и экологически безопасными носителями.

Основным направлением в исследованиях, посвященных практическому использованию СВМ, является разработка способов иммобилизации на полисахаридах гибридных

белков на основе промышленно значимых ферментов и СВМ. Основными достоинствами метода является дешевизна и нетоксичность природного сорбента, специфичность взаимодействия и высокий выход активного белка при иммобилизации, а также одностадийность очистки и иммобилизация целевого белка. Существенна также возможность использования СВМ в иммунохимии для очистки или детектирования интересующих химических соединений с помощью антител с СВМ. Гибридный белок из СВМ и антитела, специфичного в отнощении определенных биологических соединений, иммобилизованный на субстрате, может быть использован для высокоэффективной очистки этих соединений.

Работа поддержана грантами РФФИ: 03-04-48610-а «Изучение структуры и свойств новых мультимодульных гликозилгидролаз; исследование субстрат связывающих модулей и их использование в генной инженерии и биотехнологии»; 06-04-48351-а «Структура и функции бактериальных мультимодульных ферментов, гидролизующих растительные субстраты; изучение и использование изолированных модулей»; 09-04-00204-а «Поиск и исследование новых гликозид гидролаз; изучение свойств вспомогательных модулей мультимодульнх ферментов». Цели и задачи исследования

Целью работы являлось изучение свойств некаталитических модулей, входящих в состав ламинариназы LiclöA (номер по классификации ферментов КФ 3.2.1.6) из термофильного микроорганизма Clostridium thermocellum. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить делеционные производные, содержащие помимо каталитического модуля прилегающие к нему субстрат-связывающие модули и изучить влияние, которое они оказывают на свойства каталитического модуля.

2. Получить изолированный N-концевой модуль ламинариназы LiclöA и исследовать его свойства.

3. Получить изолированные С-концевые СВМ, а также тандем этих модулей, изучить их субстрат-связывающие свойства, а также их взаимодействие друг с другом.

Научная новизна

В представленной работе охарактеризован неизвестный ранее СВМ с широкой субстратной специфичностью, обладающий сродством к нерастворимым полисахаридам. Найдены гомологи к этому белку и сформировано новое 54-е семейство СВМ, зарегистрированное на сайте, посвященном углевод-активным ферментам (CAZY). СВМ54 расположен в N-концевой области LiclöA, ранее представлявшим собой участок с неизвестными функциями.

СВМ54 содержит не менее двух сайтов связывания, один из которых локализован на Т>1-конце СВМ54, является кальций-независимым и специализируется на связывании глюкозидов; второй расположен на С-конце, кальций-зависимый, с более широкой субстратной специфичностью, связывает помимо глюкозидов, глюкозаминозиды (хитин и хитозан) и пентозиды. Показано, что расположенные тандемом на С-конце 1лс16А СВМ, относящиеся к 4 семейству, способны связывать кристаллическую целлюлозу, что является нетипичным для этого семейства. Наибольшее сродство С-концевые модули проявляют к Р-глюкану клеточной стенки дрожжей, ксилану, бактериальной кристаллической целлюлозе и пустулану - тем субстратам, которые не гидролизуются каталитическим модулем 1лс16А. В то же время отсутствует сродство к лихенану и ламинарину - субстратам, на которых ламинариназа Ыс16А имеет наивысшую активность. Обнаружен синергизм при связывании тандема С-концевых модулей с авицелом, (3-глюканом и пустуланом. Константа связывания тандема превышает константы связывания отдельных модулей на этих субстратах в 100-1000 раз. Обнаруженный в данной работе синергизм свидетельствует о биологической целесообразности наличия у многих гидролаз прокариот повторов двух и более СВМ. Практическая значимость работы

Определены свойства перспективных для биотехнологии СВМ 4-го и 54-го семейств. Изучены их субстратная специфичность и константы связывания. Полученные в работе данные позволяют использовать эти СВМ в биотехнологии для иммобилизации и очистки широкого спектра биологических соединений, включая ферменты, а также в иммунологии и медицине для создания нового поколения высокоочищенных поливакцин и поливалентных лекарственных средств. Для СВМ 54 показана широкая субстратная специфичность в отношении ряда нерастворимых полисахаридов, в том числе способность связываться с хитином и хитозаном. Хитозан давно используется в качестве лекарственного препарата, на его основе с использованием СВМ54 возможно создание поливалентных лекарств и вакцин. Апробация работы

Результаты работы были представлены следующих конференциях: IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), Международная Научная Конференция «Фундаментальные и прикладные достижения в биологии», (Донецк, 2009), V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экпериментальной части (1 глава), 3-х глав, в которых приведены результаты и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 155 источников. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, включает 35 рисунков и 12 таблиц.

Основные результаты работы

1. Изучение функций вспомогательных модулей ламинариназы LiclöA из Clostridium thermocelliim, прилегающих к каталитическому модулю.

На рисунке 1 представлена схематическая структура мультимодульной ламинариназы Licl6A из Clostridium thermocelliim. Изучаемый нами термофильный фермент состоит из 9-ти отдельных модулей, соединенных гибкими линкерами: лидерного пептида (LP), трёх SLH-модулей, гомологичных белкам S-слоя клеточной стенки бактерий, X -модуля с неизвестными функциями, GH16 - каталитического модуля 16 семейства гликозилгидролаз и четырёх С-концевых СВМ из семейства 4.

147 кДз

гибкие линкеры

СВМ4 2 СВМ4 3 СВМ4_4

СВМ54 (ранее X модуль)

Рис. 1. Схематическая структура ламинариназы LiclöA Clostridium thermocellum. Расшифровка обозначений в тексте.

Для изучения свойств отдельных модулей были получены делеционные производные ламинариназы LiclöA (рис. 2), LicA-full - полноразмерный LiclöA без лидерного пептида, LicA-xcat - тандем Х-модуля и каталитического модулей, LicA-cat -изолированный каталитический модуль, LicA-catcbd - тандем каталитического модуля и СВМ4-1.

С целью выяснения роли вспомогательных модулей LiclöA в каталитическом процессе, исследована активность делеционных производных LiclöA на лихенане, ламинарине -растворимых субстратах, на которых полноразмерный LiclöA демонстрирует наибольшую активность, а также на ряде нерастворимых субстратов - ß-глюкане клеточной стенки дрожжей, пахимане и пустулане (табл. 1). Активности делеционных производных на растворимых субстратах практически неизменны, в то время как

константы Михаэлиса ниже для тех конструкций, которые содержат Х-модуль - ЬісА-М1 и ЬісА-хсаІ, то есть в присутствии Х-модуля повышается сродство к субстрату. Активность белков на нерастворимых субстратах незначительна.

.200 400

«0

мт

1200 1400

шшш

2V,

X modufc

Сш'

СВМ4...1 СВМ4_2 СВМ4_3 СВМ4_<

LicA-fuil

LicA - xcüi LicA-cat

LicA-catciK!

З CBMX

Рис. 2. Структура делеционных производных ЬісІбА. Показаны сконструированные белки относительно структуры ІдсІбА. Расшифровка обозначений в тексте.

Таблица 1. Активности делеционных производных на ряде субстратов.

LicA-full LicA-xcat LicA-cat LicA-catcbd

Лихенан, А 964 888 983 1020

смешанные (3-1,3-1,4-связи К.,,, 0.45 0.98 1.41 1.54

Ламинарии, (3-1,3-, редко |3-1,6-связи А 61 91 111 103

Km 2.11 1.69 3.83 3.56

(3-глюкан клеточной А ND 0.33 0.53 18.3

стенки дрожжей, Р-1,3-связи

Пахиман, А 0.43 0.23 0.32 12.5

(3-1,3-связи

Пустулан, (3-1,6-связи А ND 0.12 0.17 5.5

А - активность (U/pmol), К.т - константа Михаэлиса (mg/ml). ND - активность в этом

случае не обнаружена. Ошибка измерений не превышала 10% от указанной величины.

Температурные и рН оптимумы для ЫсА-ШП и ЬюА-хса! не различались и составляли 70°С и рН 6.0. Температурный оптимум у ЫсА-са1 и ЫсА-са1сЬё, конструкций не содержащих Х-модуля, несколько ниже и составляет 60° С, оптимум рН 6.5. Время полуинактивации для ЬюА-1чл11, 1лсА-хса1, ЫсА-са1 и 1_лсА-са1:сЬс1 при 70° С составляет 40, 30, 20 и 20 минут, соответственно. Из полученных результатов видно, что делеционные производные ЫсА, не содержащие X модуля, обладают меньшим сродством к лихенану и ламинарину и более низкой термостабильностью и

температурным оптимумом. Т.о. X модуль стабилизирует ЬюА и влияет на активность фермента.

Изучено влияние различных добавок на активность конструкций на лихенане. 1.5-2-кратное увеличение активности обнаружено в присутствии 2% глицерина и 2 шМ [5-меркаптоэтанола. Ионы кальция и БОБ увеличивали активность конструкций, содержащих модуль X ( 1лсА-Ш1 и ЬюА-хсаЦ в 1.5 раза. Остальные добавки не оказали существенного влияния на активность.

Temperature (*С)

Рис. 3. Кривые плавления делеционных производных Licl6A. а - без кальция, b - в присутствии 10 мМ кальция. Поглощение измерялось при 280 нм. Производные коэффициента поглощения были нормализованы относительно своих максимальных значений.

Как видно из полученных результатов, повышение стабильности и сродства к растворимым субстратам ЬісА обусловлено наличием в его структуре Х-модуля. С целью выяснения вопроса, функционирует ли Х-модуль как самостоятельная единица или образует комплекс с каталитическим, стабильность белка и влияние добавок исследовали методом иУ спектроскопии.

На рисунке 3 приведены кривые плавления делеционных производных - ЬісА-хсаІ, ІлсА-саі и ІлсА-саІсЬсі.

При плавлении изолированного ЬісА-саІ получили один узкий пик с точкой плавления при 83°С, т.е. каталитический модуль представляет собой компактный глобулярный белок.

Плавление LicA-catebd, конструкции, содержащей два независимых модуля, соединённых гибким линкером, дала два пика с точками плавления при 83°С и 69°С, а также низкотемпературный пик с точкой плавления при 40°С. Последний, по-видимому, отражает некоторые взаимодействия между модулями при температурах ниже температурного оптимума - 70°С. Кривая плавления LicA-xcat также имеет 3 пика: при 40°С - низкотемпературный, при 80°С, связанный с плавлением каталитического модуля, и при 65°С, который обусловлен плавлением модуля X. Исходя из картины плавления, модуль X плавится как отдельный компактный белок.

Мы изучали плавление рекомбинантных белков в присутствии кальция - как добавки, оказавшей наибольшее влияние на активность делеционных производных. При плавлении LicA-xcat при добавлении 10 мМ СаСЬ было обнаружено только два пика с небольшим смещением относительно варианта без кальция к 68"С и 78°С соответственно. Низкотемпературный пик исчезал (рис. ЗЬ). Кальций не оказал заметного влияния на плавление LicA-cat и LicA-catcbd, кроме незначительного изменения температур пиков в случае LicA-catcbd - пики сместились от 38°С, 69°С и 83°С к 40°С, 72°С и 81°С соответственно.

Таким образом, модули X и СВМ4-1 плавятся как отдельные домены и, по-видимому, имеют независимый ог каталитического модуля фолдинг. Также было исследовано влияние прилегающих модулей на взаимодействие каталитического модуля с субстратами. При неденатурирующем электрофорезе в присутствии растворимых полисахаридов лихенана, ламинарина и карбоксиметилцеллюлозы (CMC) конструкции LicA-cat, LicA-xcat и LicA-catcbd не показали существенных отличий от картины, которая наблюдалась в отсутствии этих субстратов. Связывание с нерастворимыми субстратами было наиболее выражено у конструкции, в которую включён Х-модуль (LicA-xcat).

Наличие выраженных углевод-связывающих свойств у LicA-xcat при отсутствии таковых у LicA-cat возможно объяснить только тем, что Х-модуль представляет собой углевод-связывающий модуль (СВМХ).

2. Изучение свойств модуля X (СВМХ).

На следующем этапе, мы получили очищенный рекомбинантный белок, представляющий собой изолированный модуль X. Способность связываться с полисахаридами модуля X исследовали двумя способами: по ретардации в нативном ПААГ в присутствии соответвующих растворимых субстратов (аффинный гель-ЭФ), и

по измерению концентрации белка в осадке после инкубации с нерастворимым субстратом.

Эксперименты по ретардации модуля X в присутствии растворимых полисахаридов лихенана, ламинарина и CMC не показали его сродства к этим субстратам. На рисунке 4 представлены результаты по изучению связывания модуля X с нерастворимыми субстратами. После 3-х часовой инкубации с субстратами при 4°С при перемешивании, на денатурирующий полиакриламидный гель наносили исходный раствор белка, супернатант и белок, снятый с субстратного осадка. Как видно из рисунка 4, модуль X связывался с рядом субстратов, продемонстрировав наивысшее сродство к Р-глюкану клеточной стенки дрожжей, ксилану и хитину.

Ксилан

Хитин

Пустулан

Авицел

25.2 Юз 17.2 kDa-

(5-глкжан

I F Е Хитозан

25.2 ГОа 17.2 kDa

I

В

В

Рис.4. Связывание СВМХ с нерастворимыми субстратами. I - дорожка с исходным (initial) белком до связывания с субстратом, F - дорожка с несвязавшимся (free) белком, оставшимся в супернатанте после связывания, В - дорожка со связавшимся (bound) белком, элюированным с предварительно промытого субстрата путём кипячения в денатурирующем буфере. Стрелками указаны молекулярные массы белковых зон.

В таблице 2 приведены константы связывания и субстратные емкости СВМХ для ряда субстратов, в присутствии и в отсутствии кальция, поскольку при изучении делеционных производных ЫсА было обнаружено влияние кальция на углевод-связывающие свойства.

Таблица 2. Константы связывания (К) и субстратные емкости (N0) изолированного СВМХ.

С кальцием_Без кальция

К[М"1] N0 Гцто!^" ] К ГМ"1]

Ксилан, р-1,4-связи 34±1 (5±1)104 14±1 (ЗД±0.5) 104

Хитин, [М,4-связи 48±1 (3.3±0.7) 105 10±0.3 (1±0.1) 103

Пустулан, (3-1,6-связи 16±0.6 (3.4±1) 103 12±0.5 (2.1±0.5) 103

Авицел, (3-1,4-связи 40±2 (8.5±1.6) 103 16±0.6 (3.4±1) 103

Р-глюкан клеточной

стенки дрожжей, 18±0.5 (0.5±0.05) 105 18±0.3 (1.4±0.2) 10і

Р-1,3-связи

Хитозан, р-1,4-связи 20±0.б (6.6±0.5) 104 24±1 21±5

ВСС, р-1,4-связи 16±0.6 (2.8±0.6) 103 14±0.6 (3±0.6) 103

(ВСС - бактериальная кристаллическая целлюлоза)

Кальций в 5 тМ концентрации значительно увеличивал сродство к хитину и хитозану. По-видимому, СВМХ содержит Са-связывающие сайты. Наличие углевод-связывающих свойств у СВМХ и отсутствие гомологии к уже известным СВМ позволило нам определить его как представителя нового семейства СВМ, после регистрации в базе данных САХХ этому семейству был присвоен номер 54.

Эксперименты по связыванию СВМХ (СВМ54) показали, что белок, снимаемый в процессе элюции с субстратов, специфически гидролизуется (рис. 5).

25кДа 17кДа

Рис. 5. Гидролиз СВМХ в процессе связывания с субстратом. I -дорожка с нанесенным белком, р -дорожка с белком, оставшимся в супернатанте, В - дорожка с белком, снятым с субстрата.

[ Р В

Фракция, снятая с субстрата, содержит две белковых зоны, с молекулярной массой 25 кОа и 17 кОа. Тяжелая зона соответствует полноразмерному СВМ54. Чтобы проверить предположение о том, что легкий белок представляет собой фрагмент СВМ54, от которого отщеплен участок полипептида, и определить точку протеолиза, была определена аминокислотная последовательность И-конца фрагмента с массой 17 кДа. Определены первые 10 Ы-концевых аминокислот - ЗШРЩТКШ. Точка протеолиза локализована на последовательности СВМХ (рис. 6).

200

400

600

L Sl.ll

СВМ54

CAT

—FVNGGGSDSíHFiNTKíNRVWNKTGV—

Рис. 6. Сайт гидролиза СВМ54. Стрелкой указана точка гидролиза аминокислотной последовательности, определенная М-концевым секвенированием. Последовательность подчеркнута.

Теоретически вычисленная молекулярная масса деградированного белка, найденная по аминокислотной последовательности, 17 кДа, совпала с молекулярной массой, определенной экспериментально по электрофорезу.

В нашей лаборатории ранее было обнаружен феномен специфического гидролиза полноразмерного белка L¡cl6A, причём было доказано его существование как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Аминокислотный сиквенс укороченной формы полноразмерной ламинариназы полностью совпадает с приведённым здесь сиквенсом для СВМ54. Поэтому существование специфического сайта протеолиза внутри СВМ54 доказано и in vivo, в клетках Clostridium thermocellum. Мы сконструировали и получили изолированный рекомбинантный белок, соответствующий индивидуальной С-концевой части СВМ54 (СВМ54С) (рис. 7) и исследовали его углевод-связывающие свойства, а также влияние кальция на его субстрат-связывающие свойства.

......

38Ш свмы свмс

Ы-концевая часть ис16А

| | СВМ54

I 1 СВМ54С

Рис. 7. Структура СВМ54 Ью16А и полученных рекомбинантных белков.

Из данных, приведённых в таблице 3, следует, что константы связывания СВМ54С с ксиланом, хитином, нерастворимым (3-глюканом дрожжевой стенки и кристаллической бактериальной целлюлозой имеют тот же порядок величин, что и у СВМ54, однако, в отличие от него, СВМ54С не связывается с пустуланом, авицелом и хитозаном. Ионы кальция восстанавливают способность СВМ54С связываться с тремя последними субстратами.

Таблица 3. Константы связывания К и субстратные емкости N0 для СВМ54 и СВМ54С с рядом полисахаридов._

Без кальция С кальцием

N0 [мкМ г"1] К [М1] N0 [мкМ г"'] К [М"1]

СВМ54 СВМ54С СВМ54 СВМ54С СВМ54 СВМ54С СВМ54С

М54

Ксилан, 14 12 3.1 х 104 4.4x104 34 21 >х104 3.7x10"

Р-1,4-связи 1.4x103

Р-глюкан 18 20 1.7x105 18 27 >х 104 1.2x105

дрожжевой

стенки,

Р-1,3-связи

ВСС, 14 24 3x103 1.5х105 16 26 1.6x105

Р-1,4-связи хЮ3

Хитин, 10 14 1х103 2.7х103 48 35 2.4x105

Р-1,4-связи х105

Пустулан, 12 N0 2.1х103 N0 16 12 2.5x103

Р-1,6-связи х103

Авицел, 16 N0 3.4x103 N0 40 36 1.1 х 104

Р-1,4-связи хЮ3

Хитозан, 24 N0 N0 N0 20 23 5.3x104

Р-1,4-связи хЮ4

Ошибка определения не превышала 10% от указанных величин. Концентрация ионов

кальция составляла 5мМ. ВСС - бактериальная кристаллическая целлюлоза. N0 -связывание не обнаружено.

Константы связывания СВМ54С и СВМ54 с аморфными субстратами ниже, чем с кристаллическими. Из кристаллических субстратов константы выше для более плотно упакованных. Абсолютные значения констант связывания для всех использованных субстратов относительно невелики. Из данных по связыванию можно предполагать наличие по меньшей мере двух сайтов связывания у СВМ54, один из которых должен быть кальций-зависимым (рис. 8).

Вероятно, N-концевая часть СВМ54 содержит Са2+-независимый сайт, а связывание с сайтами, расположенными в С-концевой части возможно в присутствии ионов Са2+. С помощью Blast NCBI был найден ряд гомологов СВМ54, предполагаемых членов нового 54 семейства СВМ и было построено выравнивание аминокислотных последовательностей найденных гомологов (рис. 9).

Гены с наибольшей степенью гомологии с СВМ54 кодируют бактериальные протеины, также содержащие N-концевые SLH модули. Некоторые из них, также как и в случае Licl6A, содержат каталитические модули GH 16 семейства. Процент максимальной гомологии с СВМХ достигает 65. Каждый гомолог содержит две подпоследовательности, гомологичные N- и С-концевым участкам СВМ54, разделенные вставкой различной длины (рис. 10). Граница раздела этих областей у СВМ54С находится вблизи сайта специфического протеолиза. Между собой гомологи различаются длиной негомологичной вставки.

Хитин

,, О

Хитозаи

/.Я 54

г ВМС

1свм\ гиме

Сайты связывания глюкозаминов

ВСС

Авицел

р-глюкан

Пустулам

А

Сайты связывания глюкоз

Ксилан

СВМ\ свмс Сайт связывания пентоз

О

в л.

і®

і щи Са -зависимый сайт

I Са2 -независимый сайт

Рис. 8. Локализация углевод-связывающих сайтов СВМ54. СВМЫ и СВМС обозначают М-концевую и С-концевую части модуля, разделенные сайтом гидролиза. Показаны сайты связывания полисахаридов, построенных на основе мономера - глюкозамина, ксилозы и глюкозы.

Таким образом, показано, что часть последовательности Ыс16А с ранее неизвестными функциями содержит углевод-связывающий модуль нового 54 семейства, отделенный от других модулей линкерными последовательностями. СВМ54 состоит из двух элементов. При связывании происходит гидролиз СВМ54 по сайту, разделяющему эти элементы. В нативных условиях фрагменты связаны между собой. Оба компонента, СВМЫ и СВМС, содержат сайты связывания углеводных лигандов.

Сайт, расположенный на М-концевой части СВМ54, не зависит от присутствия ионов кальция и специализирован на связывании глюкозидов. С-концевой сайт — Са2+-

Cth 192 IKIL|KIXPSL{|f|KGDgKNEE----VAGIALINTBG-VX rJKDTVJ NGjMl «Q3.QNGD'/I ЛЗ

ep2 210 AS I Iii! IAVEVValwGVeKLGR----VAGHWISAMGNTGL$$|fTVXIGilLgXPAGVG||G|ll FL|f||

geo 202 SI,gy|\?PTD"_gDE.a.GTBGPTAGV^TIFGKVIVAÄPG-VTL®»WIEGHLTLTEAVGSG®AFFirai

рЬЗ 228 ESGGlVpAALNI^AGTSGPEftGTFTVAGlLVVDVPG-VTLRHLaVKGiiLTIGEKSVGSGBAFLffiB

dre 203 QQATAAF^KTVFga.I?GTWGPATGRETIHG|i/TISVaD-VT:,ÜIITTISGI>I I.T AEGVGSGBv'KI.i®

рм 203 aVbLSGMIGDLVMPGKHD МЩ----VEGgiJ 1КЗТ0-УТ\ФЕТАУУб|1ЛЛ.А|:Я1ж|йТь|б

pbl 229 yVLLiRLAGElIfä?GS§DGVK----SDSGLLIÄSAD-TILܧAEVKGS\'LITAGVGBGEyTLBG

csa 199 VKLLSSIGAVIVTfeGVWQNIK----KEGFVLINSQD-VELSAVXKGKVglKgSVGKGTVTLTS

pb2 207 VVLLSRLÄGEVgvKAßTWKDQK----LAG|Gl,yNbDG-VTieSAIGG|l2bTAGIGEGO!rT-,ra>l

bca 185 VTIlJnI FNAMWNTSGEWTG-----DVDGSAVISADN-VTLpMHITg|lIVA|GVG*GHV'E1D«

cc2 196 VAX IHK X VKGYSIICAGtBoD-----NVTGTV1 IKVPD-VTl|gVWITe|lI IaIgvGEGDVTLDS

cph 193 ITMllsiVIRYggjDGTgSK-----SVTGTAVINTGN-ITLIKMQINGllLIlAEyVGSGDVTlßtl

ccl 190 LIMliKCVGQXÄb§SGTIKT-----NAAG|»MFISVGA-VTLRGISISGBHIGEGVGDGVVT^B3

epl 188 ITMVSKVSEKirmrGEiJiVEG----YVDSSVVXbTCTS-VTI,STTIRG|il|jlNiGIGÄGiVTL|G

cth vJvj-GTV#v|jGGGS|Sl|gl|TKX»KVVVlifeG----V*|XVTSGNTSV-|sVW|SGAKL| 307

ep2 v(v|-GTV§f|gGXX---i:JSUTKIETLIVsfcD----TTIKGNFKSEVEVÄDIRTAÄNl| 323

geo V#/K-GTTTTQGGGANSVH§SDSVLVRV-SVßltC"-GTV'fvVVVGESAIQHVVVHSPVKLp 323

pb3 ViWS-GST|l|GGGVNSVBLTOSELGTV-VXH^D-GKvivVVSGTIVVEOKOVKSNAS^ 349

dre Vi^/S-GKTIIKGGGAHSVTXiEBCSLPNI-TVSKE—G-V|VVASGNTTv|v\?RL(SGATLV 322

pb4 VTVT-GKTVIKGGGSHSVVfKAKLKDV-LIgPG-GA\^VFSNGTTA|QVLl|HPi;Drf 320

pbl LSAjf-GTliWvHGGGSHSVBIJiNAKVGKV-V"^RKSG-GP\#.'VLEGSSKVGEMSLiTGAV\A 34 6

osa VSliNGKI№FGGGSisvil|gjT:^^ 318

pb2 TE4m-GTigiSGGGVTid:81JW1'HypAI-IV«KE-GPv|viVDG-SEVGTMDL|SDTVLi 323

bca VTV^-GRLLVfGGGAfsIVlKGDSKITQVIXiJjöE-GKv|vÄVEDGAQVSVVW|EGSDDV 302

со2 УГ'К-GNTVVSGGGEHSIHITGSSNISNIK:Bltt:M-NKL|lVII,DGNTV|EIEIA.KGEEII 313

cph ygIS-GQLIVBGGGKHSIBIIGSTKVANII4'SKEKAPVSLKFSSSYESSSVTVINGELYL 311

ccl vilA-GRI^-RGGCPNGVI-JW3QXGGNiavUsA-GNVYXRVVGSTTl|QAYX.|SGCTl| 307

epl VTyL-GTV|l|GGGDlplVL^X-CKMAEMVVDK;D-GNVflTGDAKrKITMXXF'|sAGTVA 305

Рис. 9. Выравнивание консервативной области СВМ54. Обозначения (белок, организм, Genbank номер): cth, LicA С. thermocellum , САС27412; ер2, Epulopiscium sp., ZP _02692123; geo, Geobacillus sp., Y412MC10, ZP _03036254; pb3, Paenibacillus sp. JDR-2, ZP _02846396; dre, Desulfotomaculum reducens MI-1, YP001113692; pb4, Paenibacillus sp. JDR-2, ZP _02849476; pbl, Paenibacillus sp. CCRC17245, ABJ15796; csa, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903, YP_001181313; pb2, Paenibacillus sp. JDR-2, ZP _02847034; bca, Bacteroides capillosus ATCC 29799, ZP_02036105; cc2, Clostridium celhdolyticum H10, ZP_01575502; cph, Clostridium phytofermentans ISDg, YP 00158884; ccl, Clostridium cellulolyticum H10, ZP_01576976; epl, Epulopiscium sp., ZP 02693375. Черным цветом выделены ароматические остатки, серым - полярные, предположительно участвующие в связывании субстратов.

nSLH homN I homC

3SLH CBMN CBMC N-концевая часть LicI6A

Рис. 10. Структура гомологов СВМ54. пБЬН - тандемы ЭЬН модулей, ЬошИ - гомологи Ы-концевой части СВМ54 - СВМЫ, ЬошС - гомологи С-концевой части СВМ54 -СВМС, а также I - негомологичная последовательность.

зависимый, без выраженной специфичности к определенному типу субстрата, связывает, помимо полимеров на основе глюкозы, пентозы и глюкозамины. Широкая субстратная специфичность в сочетании с низкими константами связывания может свидетельствовать о том, что полисахариды клеточной стенки растений не являются истинными субстратами СВМ54. Возможно, его роль состоит в связывании с протеогликанами клеточных оболочек бактерий. Зависимость констант связывания от присутствия кальция может свидетельствовать о существовании тонкой регуляции связывания фрагментов СВМ54 между собой и с клеточными структурами. Такая регуляция может обеспечить челночный механизм доставки LiclöA с клеточной стенки клостридии к субстрату.

3. Изучение свойств С-концевых СВМ LiclöA

Ранее показано, что мультимодульная ламинариназа LiclöA из Clostridium thermocellum содержит 8 вспомогательных модулей помимо каталитического (рис. 1). В С-концевой области LiclöA расположен тандем из четырех гомологичных СВМ, относящихся к семейству СВМ4 углевод-связывающих модулей и обозначенных как СВМ4_1, СВМ4_2, СВМ4_3, СВМ44. Удаление этих модулей не приводило к изменению активности фермента. С целью изучения данного участка LiclöA получены индивидуальные рекомбинантные СВМ и повтор СВМ4-(1-4) из четырех модулей (Рис. 11).

GH16

ШжШШШШМ СВМ4_1

: V 2 I

CBMS14

Рис. 11. Структура С-концевой области LiclöA и полученных рекомбинантных белков. С-концевые СВМ4_х и CBMsl-4 - тандем СВМ.

Соответствующие белки экспрессировали в клетках Е. соИ с использованием рекомбинантных плазмид рС>Е, содержащих последовательности СВМ с добавленными His6-tag, что позволило провести одноступенчатую очистку белков с помощью аффинной хроматографии. Полученные белки гомогенны по данным ЭФ в

денатурирующих условиях и имели следующие молекулярные массы: СВМ4_1 (17.7 кДа), СВМ4 2 (17.7 кДа), СВМ4_3 (16.7 кДа) и СВМ4-(1-4) - 67.6 кДа, что соответствовало рассчитанным значениям по аминокислотной последовательности. В случае СВМ4_4 при ЭФ-ПААГ в денатурирующих условиях обнаружили ряд белковых зон, соответствующих мономеру (13.7 кДа), димеру и мультимерам СВМ4_4. Молекулярная масса нативного белка определена нами с помощью гель-проникающей хроматографии (рис. 12). В нативных условиях мономер не обнаружен, в основном, белок представлен в виде димера.

Субстрат-связывающие свойства С-концевых СВМ4 1лс16А

Ни один из полученных нами рекомбинантных белков не обладал сродством к растворимым субстратам - лихенану и ламинарину, полисахаридам, содержащим р-1,3-связи и являющимися основными субстратами для Ыс16А. Не обнаружено связывания концевых СВМ с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и растворимым ксиланом. Результаты связывания СВМ4_1, СВМ4_2, СВМ4_3 и тандема СВМэМ с нерастворимыми субстратами представлены в таблице 4. В связи с гетерогенностью препарата СВМ4_4, его связывание с субстратами изучали только качественно. Сродство к субстратам проявлял только димер СВМ4_4. Димер связывался с авицелом, хитозаном, ксиланом, и слабо с пустуланом. С бактериальной кристаллической целлюлозой (ВСС), хитином, р-глюканом клеточной стенки дрожжей связывания обнаружено не было.

Все конструкции за исключением СВМ4_4 обладали сродством к ВСС, что нетипично для семейства СВМ4. Все белки обладают сродством к ксилану, хитину, р-глюкану клеточной стенки дрожжей и аморфной целлюлозе, а СВМ4_3 и СВМ4_4 к хитозану . Полученные результаты свидетельствуют о широкой субстратной специфичности СВМ 4, расположенных на С-конце Ыс16А. Сродство к авицелу и пустулану обнаружили у СВМ4_3 и СВМ4_4 . Тандем СВМэМ обладал наиболее высоким сродством к р-глюкану клеточной стенки дрожжей, авицелу и пустулану. Константы связывания СВМз1-4 на этих субстратах примерно в 100 раз выше, чем у отдельных модулей, что свидетельствует о синергизме между СВМ в единой полипептидной цепи в процессе адсорбции на перечисленных полисахаридах. На ксилане, ВСС, хитине порядки констант связывания тандема совпадают с таковыми для отдельных модулей. Сродство тандема к хитозану не обнаружено. Вероятно, это связано со взаимодействием ковалентно связанных СВМ, в процессе которого происходит перекрывание сайта связывания хитозана. У всех

полисахаридов субстратная емкость тандема СВМ ниже, чем у индивидуальных белков, что, скорее всего, обусловлено большей длиной тандема и конкуренцией за места посадки на субстрате. Повышение сродства к субстратам у тандема СВМ по сравнению с индивидуальными модулями показывает эволюционную целесообразность мультипликации СВМ. Такая мульти- или чаще дупликация СВМ, относящихся к одному семейству, обнаружена у многих мультимодульных гликозил-гидролаз. Их синергизм приводит к значительному повышению сродства к субстрату.

Рис. 12. Гель-проникающая хроматография нативного рекомбинантного СВМ44. Кривая поглощения СВМ4_4 при гель-фильтрации в нативных условиях. Внедренный график - калибровка; с ее помощью были оценены массы белков, соответствующих пикам. 13.7 кДа - теоретическая масса СВМ4_4.

Анализ представителей семейства СВМ4

СВМ 4 семейства вместе с модулями 9, 17, 28 и других семейств входят в суперсемейство СВМ, обладающих общей ЗО-укладкой типа (3-сандвич. Помимо этого, семейства 4 и 9 принято объединять в семейство СВМ49 ввиду того, что они

принадлежат к одному кластеру суперсемейства. Модули 9 семейства специализируются на связывании ксилана и обнаружены в составе исключительно ксиланаз, в то время как модули семейства 4 обладают более широкой субстратной специфичностью и шире распространены.

Таблица 4. Константы связывания и субстратные емкости С-концевых СВМ4 LicA Clostridium thermocellum, __

Ксилан, ВСС, Авицел, ß-глюкан дрожжей, р-1,3-связи Пусту лан, Хитин, Хитозан,

ß- 1,4-связи ß-1,4-связи ß-l,4-cвязи ß-l,6-cвязи ß-l,4-cвязи ß-l,4-cвязи

СВМ4 1 к No І.ЗхЮ6 15 3.4x10s 14 - 2.ІХІ06 18 - 3.8х104 18 -

СВМ4 2 К No 2x106 12 7.3х104 15 _ 3.5x10s 13 - 3.4x10" 14 -

К 3.8ХІ06 4.9хЮ5 2.2х103 3.2x10s 2.4x10s 4.5x10" 1.8х103

СВМ4 _3

No 21 19 19 13 17 15 7

К 8.3ХІ06 7.9x10s 5-ЗхІО6 5.1 х 107 3.7ХІ07 2.8х104 _

CBMsl-4

No 12 11 17 11 12 14 -

К - константа связывания, М"1. N0 - субстратная емкость, рмоль г"1. Погрешность измерения составила не более 10%.

Несколько СВМ 4 семейства изучены и для них получены 3 D-структуры. Все они относятся к типу ß-jelly-roll. Дендрограмма модулей семейства 4 представлена на рисунке 13. Ее отличает веерообразная структура. Кластеры подсемейств выражены слабо. Можно предположить наличие не менее 3^4 подсемейств. Уровень гомологии между любыми двумя модулями не ниже 30%. По-видимому, эти 30% аминокислотных остатков обеспечивают существование общей 3 D-укладки ß-сандвича. СВМ 4-семейства — белки размером примерно 150 аминокислотных остатков, в основном входят в состав бактериальных гликозил-гидролаз. Связываются с ксиланом, Р-1,3-глюканом, ß-1,3-1,4- • глюканом, р-1,6-глюканом, аморфной, но не кристаллической целлюлозой. В целом специализация модулей семейства 4 - связывание растворимых субстратов. Способность связывать нерастворимые полисахариды - авицел, ксилан, хитин, ß-глюкан клеточной стенки дрожжей - обнаружена у СВМ ламинариназ Thermotoga maritima и Thermotoga neapolitana и нами у модулей ламинариназы Licl6A. Также нами обнаружено, что, по крайней мере, три модуля из четырех - СВМ4_1, СВМ4_2, СВМ4_3 связываются с кристаллической целлюлозой - ВСС, что является необычным для

модулей семейства 4. На дендрограмме модули с изученной структурой вместе с модулями из микроорганизмов рода Thermotoga лежат в одном кластере. В этом же кластере локализован СВМ4_4. Можно предположить наличие у него схожих субстрат-связывающих свойств. СВМ4_2 и СВМ4_3 расположены в одном кластере, но результаты связывания не показывают у них схожих свойств, а остальные модули LiclöA - в других кластерах. Субстрат-связывающие свойства СВМ4_2 сходны со свойствами СВМ4_1, однако эти модули расположены в разных кластерах. Веерообразная структура дерева СВМ4 и нечеткость деления на кластеры свидетельствует о том, что в данном случае природа разными способами использует структурную пластичность ß-сандвич-укладки для связывания с разнообразными субстратами, не останавливаясь на каком-то единственном варианте. Также, распределенность СВМ4_п по всей дендрограмме может свидетельсвовать о том, что способность связываться с кристаллической поверхностью распространена среди углеводсвязывающих модулей семейства 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в данной работе показано, что пять вспомогательных модулей ламинариназы LiclöA, расположенные на N и С-концах фермента, являются углевод-связывающими. Эти модули имеют сродство к нерастворимым полисахаридам, не являющимися субстратом для фермента. Обнаруженный и исследованный нами СВМ54 обладает широкой специфичностью к полисахаридам, в том числе, к хитину и хитозану. Хитозан давно нашел применение в медицине и косметике, поэтому СВМ54 может быть использован для создания поливалентных биотехнологических препаратов. Поскольку тандем С-концевых СВМ4 показал синергизм в отношении авицела, нерастворимого ß-глюкана клеточной стенки дрожжей и пустулана, то, вероятно, роль тандема СВМ4 LiclöA- доставка фермента к лихенану и ламинарину, в природе локализованным в комплексе именно с этими углеводами. Известно, что в естественных условиях микроорганизм Clostridium thermocelliim утилизирует полисахариды из остатков клеток растений и лишайников. Лихенан является компонентом клеточной стенки водорослей, ламинарин - ее резервным полисахаридом, ксилан, пустулан, ß-глюкан, хитин - компонентами клеточной стенки растений, грибов и водорослей. Таким образом,

наличие синергизма между СВМ фермента, вероятно, способствует тесному связыванию с полисахаридами, которые сопутствуют лихенану и ламинарину, и обеспечивает их оптимальный гидролиз.

Схема челночной доставки ЬісІбА с поверхности клетки клостридии к этим субстратам показана на рисунке 14.

Рис. 13. Дендрограмма СВМ 4 семейства. Отмечены С-концевые СВМ ламинариназы Ыс16А -СВМ4_п, модули ламинариназы ЬашА Thermotoga пеаро1Напа, а также модули, для которых получены ЗО-структуры, обозначенные с помощью ГО базы РБВ.

Челночная система доставки

Са-зэаисимое взаимодействие''

Рис. 14. Челночная система доставки ламинариназы Ыс16А к природным субстратам. В виде кружков показаны каталитические модули 1лс16А, ромбами - СВМ54, прямоугольниками - С-концевые СВМ 4 семейства.

Ыс16А после экспрессии транспортируется из клетки и закрепляется на в-слое с помощью модулей и СВМ54. Неизвестно, происходит ли гидролиз СВМ54 в этот момент или при отделении фермента от стенки, но в любом случае взаимодействие между компонентами СВМ54 сильное и обеспечивает необходимую силу связывания фермента со стенкой. При некоторых условиях фермент может сниматься с поверхности стенки и дрейфовать к полисахаридным субстратам. На стенке может оставаться якорь из БЬН и СВМИ-компоненты СВМ54. К этому якорю фермент может снова прикрепляться, обеспечивая челночность этой системы утилизации полисахаридов. На субстратах - клеточной стенке водорослей и грибов ламинариназа может прочно закрепляться с помощью С-концевого тандема СВМ, и гидролизовать лихенаны и ламинарины.

Выводы

1. Показано, что N-концевая область Licl6A с неизвестными функциями, не имеющая гомологов среди известных модулей гликозил-гидролаз, содержит субстрат-связывающий модуль, который стал первым представителем вновь образованного 54 семейства СВМ. Найдены гомологи этого модуля, также включенные в семейство СВМ54.

2. Обнаружено, что СВМ54 содержит не менее 2 сайтов связывания, один из которых вероятно локализован на N-конце СВМ54 и является кальций-независимым, второй расположен на С-конце, кальций-зависимый, с более широкой субстратной специфичностью, связывает помимо глюкозидов, глюкозаминозиды (хитин и хитозан) и пентозиды (ксилан).

3. Показано, что С-концевые модули Licl6A способны связывать кристаллическую целлюлозу, что является нетипичным для модулей 4 семейства.

4. Наибольшее сродство С-концевые модули проявляют к р-глюкану клеточной стенки дрожжей, ксилану, бактериальной кристаллической целлюлозе и пустулану - тем субстратам, которые не гидролизуются каталитическим модулем Licl6A. При этом отсутствует сродство к лихенану и ламинарину - основным субстратам фермента.

5. Обнаружен синергизм при связывании тандема С-концевых модулей с авицелом, Р-глюканом и пустуланом. Константа связывания тандема превышает константы связывания отдельных модулей на этих субстратах в 100-1 ООО раз.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях: Статьи:

1. Dvortsov I.A., LuninaN.A., Chekanovskaya L.A., Schwarz W.H., Zverlov V.V., Velikodvorskaya G.A. Carbohydrate-binding properties of a separately folding protein module from p-l,3-glucanase Licl6A of Clostridium thermocellum. //Microbiology. 2009. V. 155, P. 2442-2449.

2. Дворцов И.А., Лунина H.A., Зверлов В.В., Великодворская Г.А. Субстрат-связывающие свойства модуля СВМ54 ламинариназы Licl6A из Clostridium thermocellum. // Молекулярная биология. 2010. Т. 44. № 4. С. 671-676.

3. Дворцов И.А., Лунина Н.А., Зверлов В.В., Великодворская Г.А. Свойства четырёх С-концевых углевод-связывающих модулей (СВМ4) ламинариназы Licl6A Clostridium thermocellum. // Молекулярная биология. 2012. Т. 46. №6. С. 915-921.

Материалы конференций:

1. Характеристика нового субстрат-связывающего модуля термостабильной ламинариназы Licl6A Clostridium thermocellum, Дворцов И.А., Лунина H.A., Чекановская JI.A., Зверлов В.В., Великодворская Г.А., IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.

2. Анализ модулей мультимодульной ламинариназы LiclöA, продуцируемой термофильной бактерией Clostridium thermocellum, Дворцов И.А., Лунина H.A., Великодворская Г.А., Международная Научная Конференция «Фундаментальные и прикладные достижения в билогии», Донецк, 2009.

3. Дворцов И.А., Лунина H.A., Великодворская Г.А. Субстрат-связывающие свойства С-концевых модулей ламинариназы LiclöA Clostridium thermocellum. V Российский симпозиум. Белки и пептиды. Петрозаводск, 2011.

Дворцов Игорь Александрович Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Licl6A Clostridium thermocellum Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 15.04.2013. Заказ № 78 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Дворцов, Игорь Александрович, Москва

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи 04201357062

ДВОРЦОВ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы 1лс16А С1о$1псИит ШегтосеНит

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Лунина Наталия Александровна

Москва - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СВМ - углевод-связывающие модули (carbohydrate binding modules) СВМХ - изолированный модуль с ранее неизвестными функциями WGA - Wheat Germ Agglutinin из Triticum vulgaris BCC - бактериальная кристаллическая целлюлоза

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.......................................................................................................5

1. Обзор литературы.......................................................................................6

1.1 Распространенность СВМ..............................................................................7

1.2 Функции СВМ............................................................................................8

1.3 Пространственная структура СВМ.................................................................11

1.4 Взаимосвязь структуры и функции СВМ.........................................................19

1.5 Молекулярный механизм связывания СВМ......................................................24

1.6 Множественные взаимодействия СВМ............................................................32

1.7 Синергизм СВМ.......................................................................................36

1.8 Применения СВМ в биотехнологии................................................................39

1.9 Clostridium thermocellum, продуцент термостабильных ферментов - перспективный объект для изучения различных СВМ..................................................................43

2. Экспериментальная часть...........................................................................46

2.1 Материалы и методы................................................................................46

2.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.............................................................46

2.1.2 Химические реагенты и ферменты...............................................................47

2.1.3 Бактериальные среды и условия культивирования...........................................47

2.1.4 Выделение и анализ плазмидной ДНК..........................................................47

2.1.5 Выделение хромосомной ДНК Clostridium thermocellum....................................48

2.1.6 Введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки и экспрессия белков..............48

2.1.7 Приготовление клеточных экстрактов и очистка белков....................................48

2.1.8 Измерение концентрации белков, белковый электрофорез и определение молярного веса белков...................................................................................................49

2.1.9 Исследование плавления белков.................................................................49

2.1.10 Полисахаридные субстраты.....................................................................49

2.1.11 Определение ферментативной активности ламинариназы при гидролизе.............50

2.1.12 Определение биохимических свойств ламинариназы и ее делеционных производных.................................................................................................50

2.1.13 Связывание с растворимыми полисахаридами...............................................51

2.1.14 Связывание с нерастворимыми полисахаридами............................................51

2.1.15 Гель-проникающая хроматография............................................................52

2.1.16 Анализ белковой последовательности.........................................................52

2.1.17 Компьютерный анализ белковых последовательностей....................................53

2.2 Результаты и обсуждение...........................................................................53

2.2.1. Изучение функций вспомогательных модулей, прилегающих к каталитическому...53

2.2.1.1 Получение делеционных производных Ыс16А.............................................53

2.2.1.2 Биохимические свойства делеционных производных.....................................54

2.2.1.3 Плавление делеционных производных........................................................59

2.2.1.4 Влияние прилегающих модулей на углевод-связывающие свойства каталитического модуля....................................................................................63

2.2.2 Изучение свойств СВМХ..........................................................................65

2.2.2.1 Получение и экспрессия изолированного СВМХ..........................................65

2.2.2.2 Углевод-связывающие свойства СВМХ (СВМ54)..........................................65

2.2.2.3 Спонтанный гидролиз СВМ54..................................................................67

2.2.2.4 Получение и экспрессия С-концевой части СВМ54 - СВМ54С.........................71

2.2.2.5 Углевод-связывающие свойства СВМ54С...................................................72

2.2.2.6 Структура сайтов СВМ54........................................................................73

2.2.2.7 Анализ гомологов СВМ54.......................................................................75

2.2.2.8 Функции СВМ54 в 1лс16А.......................................................................83

2.2.3 Изучение свойств С-концевых СВМ 1лс16А...................................................84

2.2.3.1 Получение и экспрессия С-концевых СВМ Ыс16А........................................84

2.2.3.2 Углевод-связывающие свойства С-концевых СВМ Licl6A

85

2.2.3.3 Свойства СВМ4 4

87

2.2.3.4 Анализ представителей 4 семейства СВМ

89

2.2.4 Роль углевод-связывающих модулей Licl6A

92

Заключение

94

Выводы

98

Список использованной литературы

99

Введение

Многие углевод-активные ферменты являются мультимодульными белками, состоящими из каталитических и вспомогательных модулей. К вспомогательным модулям относятся в первую очередь углевод-связывающие модули (carbohydrate binding modules, СВМ). В настоящее время исследовано большое число СВМ, еще больше найдено по степени схожести аминокислотной последовательности. По гомологии аминокислотных последовательностей все СВМ разделены на семейства, которых в настоящий момент насчитывается больше 60. СВМ состоят из 30 - 200 аминокислотных остатков и чаще всего представляют собой модули с независимым фолдингом в мультимодульных ферментах. Существуют также СВМ - структурные компоненты мультиферментных комплексов, таких как целлюлосома и несколько СВМ - отдельных белков. СВМ проявляют сродство к широкому спектру углеводных субстратов, компонентов клеточной стенки микроорганизмов и растений, а также резервных углеводов клеток. СВМ связывают кристаллические и аморфные полисахариды, а также олигосахариды. Для ряда СВМ получены пространственные структуры, часть из них разрешена в комплексе с углеводными лигандами. На основе этих структур изучается механизм распознавания полисахаридов СВМ, выделены факторы, влияющие на связывание. Углевод-связывающие свойства СВМ и их функционирование в мультимодульных ферментах в

виде модуля с дискретной укладкой делает СВМ чрезвычайно перспективными в области биотехнологического применения. СВМ используются для очистки белков, а также для экспрессии белков, т.к. наличие СВМ во фьюжн-конструкциях с целевым белком увеличивает выход белка и улучшает его растворимость. Углеводные носители являются дешевыми и легкими в использовании материалами. СВМ применяются для иммобилизации на таких носителях целевых ферментов и целых клеток. Также известно использование СВМ для анализа структуры клеточной стенки.

Цель данной работы - изучение свойств некаталитических модулей ламинариназы Licl6A из термофильной анаэробной бактерии Clostridium thermocellum и их влияния на свойства каталитического модуля фермента. Исследуемый фермент содержит 8 некаталитических модулей, функции некоторых были неизвестны.

1. Обзор литературы

Первые свидетельства о существовании СВМ появились в 50-ых годах XX века. Исследования по энзиматической деградации целлюлозы приводили к выводу, что процесс деградации включает в себя действие неизвестного негидролитического компонента. Используя протеолитическую доступность междоменных линкеров, из целлюлаз были выделены первые СВМ [1,2,3,4]. Первоначально СВМ были классифицированы как целлюлозо-связывающие домены, поскольку именно они были обнаружены первыми. Впоследствии было найдено гораздо больше модулей, связывающих и другие углеводные субстраты, отличные от целлюлозы, что привело к необходимости переклассифицировать найденные СВМ. СВМ - это модули с непрерывными аминокислотными последовательностями внутри углевод-активных ферментов, обладающие независимой пространственной укладкой, и проявляющие углевод-связывающую активность [5,6,7].

В настоящее время известно большое количество СВМ, которые объединены в более чем 60 семейств по принципу гомологии их аминокислотных последовательностей. СВМ найдены в составе ферментов практически всех царств микроорганизмов - архей, бактерий, эукариот, а также вирусов. Классификация СВМ доступна в базе данных углевод-активных ферментов CAZY [8].

1.1 Распространенность СВМ

К СВМ относят модули, встречающиеся в составе углевод-активных ферментов -гликозил-гидролаз, трансфераз, лиаз, эстераз.

В трансферазах - ферментах, формирующих гликозидные связи, СВМ представлены в виде трехкратного повтора модулей величиной 150 аминокислотных остатков. Модули этого типа были впервые обнаружены в углевод-связывающих белках растений и животных - лектинах, таких как рицин и агглютинин из Ricinus communis, где они связывают остатки галактозы. Эти СВМ демонстрируют ось псевдосимметрии третьего порядка в согласии со своим трехкратным повтором. Помимо галактозы, такие СВМ связывают маннозу, ксилан, N-ацетил-галактозамин [9,10,11].

Лиазы деполимеризуют цепи полисахаридов, содержащих уроновые кислоты (напр. пектин), по механизму, отличному от гидролиза связей гликозил-гидролазами. За счет независимой укладки, свойства СВМ в составе лиаз не определяются свойствами каталитического модуля; и эти СВМ способны осуществлять углевод-связывающие функции, также как СВМ в составе гликозил-гидролаз [12,13]. То же самое можно сказать о роли СВМ в составе карбоксил-эстераз - ферментов, деполимеризующих гемицеллюлозу, катализируя де-0 или де-Ы-ацетилирование сахаридов, таких как пектин-метилэфиры или ацетилированный ксилан [14,15]. Также к СВМ относят домены скаффолдинов - белковых комплексов, состоящих из взаимодействующих когезиновых и докерных доменов. Скаффолдины являются

структурными компонентами целлюлосомы - мультиферментного комплекса, состоящего из гликозил-гидролаз, углевод-лиаз, карбоксил-эстераз. Такие комплексы продуцируются многими бактериями. СВМ в составе целлюлосомы выполняют функцию докерных доменов - белков, сцепляющих между собой скаффолдины. Показано, что наличие СВМ в составе скаффолдина драматически влияет на гидролитическую способность этого комплекса [16-20].

Было обнаружено, что СВМ входит в состав цитохрома [21].

Экспанзины - белки, играющие роль в росте клеточной стенки растений, являются гомологами СВМ и обладают углевод-связывающими свойствами [22]. Обнаружено несколько СВМ, не входящих в состав других белков. Например, СВМ семейства 43, белок пыльцы оливы Ole 10 (10 kDa) связывается с (3-1,3-глюканами и представляет собой отдельный полипептид [23].

В настоящее время принято различать СВМ и лектины. Лектины - углевод-связывающие белки растений и животных, характеризуются связыванием с моно- и олигосахаридами, имеют, как правило, несколько углевод-связывающих центров, обычно представлены отдельными белками [24,25]. Однако среди СВМ есть целый класс таких, которые связываются с олигосахаридами, а несколько семейств СВМ, например, 13, 14 и 18, были первоначально идентифицированы как лектины. Модули 13 семейства обладают схожей с лектинами третичной структурой, среди модулей 18 семейства есть лектино-подобные модули, входящие в состав хитиназ. Но, несмотря на эти сходства, СВМ отличаются от лектинов по типу лиганда и способу взаимодействия с ним. В случае СВМ, это субстраты с высокой степенью полимеризации и ненасыщенностью водородных связей, 2 связи/100А , в случае лектинов - олигосахара и почти полная насыщенность водородных связей -

3.5/100А2 [26,27]. Также к СВМ не относят белки системы транспорта Сахаров. 1.2 Функции СВМ

Принято выделять несколько функций СВМ, которые они осуществляют в качестве модулей гликозил-гидролаз [28].

Связывание с субстратом. Повышение скорости реакции за счет увеличения концентрации фермента возле субстрата. В этом случае удаление СВМ из фермента приводит к значительному падению активности фермента на нерастворимых субстратах. Активность на растворимых субстратах остается без изменений [29]. Таргетинг. Природные углеводные субстраты, такие как клеточная стенка и резервные полисахариды, являются сложно устроенными комплексными соединениями. Материал стенок варьирует между видами, и различается в зависимости от типа клетки и стадии развития [30]. СВМ, которые связываются с поверхностью кристаллических полисахаридов, могут входить в состав различных гликозил-гидролаз. С другой стороны, СВМ, связывающиеся с отдельной полисахаридной цепью, должны быть специфичны к тем полисахаридам, которые являются субстратами каталитического модуля гидролазы. Например, целлюлаза, ксиланаза и маннаназа содержат СВМ второго типа, которые связываются с целлюлозой, ксиланом и маннаном, соответственно. Тем самым СВМ будет сближать фермент с целевым субстратом, находя его в сложной макромолекулярной структуре клеточной стенки. Кроме того, таргетинг может осуществлять более тонкую функцию, чем простой поиск нужного субстрата среди полисахаридов клеточной стенки. Например, СВМ семейства 9 ксиланазы 10А Thermotoga maritima имеет выраженную специфичность для редуцирующих концов нерастворимых ксилана и целлюлозы. Для связывания СВМ 9 нужен прямой доступ к С1- С2-гидроксил-группам пиранозы. У природных субстратов концентрация редуцирующих концов мала из-за высокой степени полимеризации и разветвления полисахаридов. Таким образом, можно предположить таргетинг фермента к областям с повреждениями клеточной стенки [31,32]. Показано, что фьюжн-белки, содержащие СВМ семейств 1 и 3 с одним и тем же каталитическим модулем, демонстрировали разную способность деградировать кристаллическую

целлюлозу, что предполагает, что некаталитические модули распознают разные участки одного и того же полисахарида [33].

Некаталитическая деградация субстрата. Некоторые СВМ оказывались способны разрыхлять кристаллическую структуру субстрата. Впервые это было обнаружено для Ы-концевого СВМ 2 целлюлазы Се16А Се11и1отопа$Ат1 [34]. Эксперименты показали увеличение концентрации редуцирующих концов после инкубации субстрата с этим СВМ. Происходит разрыв водородных связей между полисахаридными цепями целлюлозы в микрофибриллах (рис. 1). Аналогичный эффект был получен для еще одного СВМ из семейства 20, специфичного к крахмалу [35,36]. Наличие 2 сайтов связывания в этом СВМ существенно для разрушения структуры амилозы. Полисахаридная цепь, связываясь в обоих сайтах, достаточно сильно изгибается, что приводит к разрыву водородных связей с другими цепями субстрата.

Рис 1. Некаталитическая деградация целлюлозы. А - волокно хлопка в 6000-кратном увеличении. В - в 2000-кратном увеличении. С - волокна хлопка после 6-часовой инкубации в присутствии СВМ в 6000-кратном увеличении. D - после 10-часовой инкубации в 2000-кратном увеличении.

Модуляция акгивности фермента. СВМ могут менять активность прилегающих к ним каталитических модулей. Например, СВМ семейства 3 эндоцеллюлазы Е4 Thermonospora fusca способен взаимодействовать с каталитическим модулем GH9, меняя тип его

активности [37]. Было показано, что этот каталитический модуль обладает как экзо- так и эндо-глюканазной активностью на целлюлозе. После того как каталитический модуль делает разрез полисахаридной цепи, СВМЗс связывается с каталитическим модулем, и вследствие этого взаимодействия, меняется конформация аминокислотных остатков активного центра каталитического модуля, в результате чего он процессивно отщепляет целлотетрозу с нередуцирующего конца. Кроме того, за счет взаимодействия СВМЗс и каталитического модуля фермент приобретает активность на новых субстратах [37]. Аналогичные результаты были получены для СВМ 22 бета-1,3-1,4-ксиланазы Xynl OB Clostridium stercorarium [38]. В отличие от бета-глюкана овса, на котором активности отдельного каталитического модуля и его фьюжн-белка с СВМ22 сравнимы, на ксилане ячменя отдельный каталитический модуль не имеет активности. Стабилизация фермента. Показано увеличение стабильности фьюжн-белков, содержащих различные каталитические модули и СВМ. Присутствие СВМ в составе белка увеличивает время полуинактивации, повышает температурный оптимум, делает белок более устойчивым к протеолизу. В настоящее время предполагаются два механизма, объясняющие этот эффект. Во-первых, СВМ, взаимодействуя с каталитическим модулем, уменьшает число сайтов, восприимчивых к атаке протеаз, стабилизирует третичную структуру всего белка. Во-вторых, наличие в структуре белка крупной глобулярной молекулы улучшает растворимость белка, что уменьшаем склонность к агрегации и увеличивает количество правильно уложенного белка [39-42].

1.3 Пространственная структура СВМ

В настоящее время известны ЗЭ-структуры для ряда СВМ различных семейств. Они были получены с использованием методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии. Для некоторых СВМ структуры определены в комплексе с лигандами -олигосахаридами (таблица 1).

Таблица 1. ЗО-структуры СВМ различных семейств. Указаны РБВ коды для разрешенных структур. Структур�