Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии генов термостабильных ферментов бета-гликозидазы и бета-1,3 глюканазы из Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии генов термостабильных ферментов бета-гликозидазы и бета-1,3 глюканазы из Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

т

ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР -

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рыкописи

ГАДЙГ Равиндра Нагаппа

" ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ /3-ГЛИКОЗИДАЗН и /3-1,3 ГЛЮКАНАЗВ ИЗ Clostridium thermocellum В КЛЕТКАХ Escherichia coli."

03.00.15 Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИОСКВЙ—1391

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики АН СССР

Научный руководитель: -доктор биологических наук, профессор З.С. Пирузян.

Оффициальные оппоненты: -доктор биологических наук, профессор Н.Д. Поповская.

-кандидат биологических наук, |ТПГ- Тенкнг ■ I

Ведущая организация: -Кафедра генетики.

Биологический факультет МГ9.

Завита состоится " 21 " января 1992 г. в " 14 " час. на заседании специализированного ученого совета Д098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из главных задач молекулярной генетики растений является изучение механизмов активации генов стрессового ответа высших растений. Непосредственно в процессе такого изучения возникает проблема адекватного моделирования стрессового ответа растений. Наряду с различными химическими активаторами стрессового ответа большой интерес представляет нетрадиционный способ активации генов стрессового ответа, заключающийся в индукции экспрессии в растениях бактериальных генов, родственных стрессс-генам растений. К числу таких генов относятся гены, кодирующие £-1.4 гликозидазу и 0-1,3 глвканазу. Показано, что в растениях при стресс-ответе в результате атаки патогена ( вирусного, грибного или растительного) происходит значительное увеличение экспрессии генов, кодирующих ферменты с ферментативной активностью гликозидаз и глюканаз. В соответствии с этим большой интерес представляет работа по получению трансгенных растений с эффективно экспрессирующимися генами генами Г1-г.пикозидаз и И-глвконаз гетерологичной природы.

В качестве объектов для переноса в растения большой интерес представляют гены (3-1,4 гликозидазы и Р- 1,3 глюканазы из термофильной бактерии С 1оэ1г1 (11иш МегюсеПиш. Существенной особенностью этих двух бактериальных генов является высокая термостабильность соответствующих ферментов, что позволяет легко отличить их активность от активности нетермостабильных гликозидаз и глюканаз в трансгенных растениях.

Цель и конкретные задачи исследования. В свзи с вышесказанным представляется актуальной работа по получению трансгенных растений с экспрессируищимися генами р-гликозидазы и р-глюканазы. Задача настоящей диссертационной работы

заключалась в модификации выбранных генов bgl и eel, конструированию векторных плазмид для экспрессии гликозидазы и глюканазы в Е.col i а также в сравнительном анализе характеристик ферментов, синтезируемых в E.coll и растении N.tabacum.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получены экспрессионные векторные плазмиды с модифицированными копиями генов (3 -гликозидазы и fi-глюканазы ранее клонированных из thermocellum. Проведено изучение экспрессии клонированных генов в клетках E.coli. где в случае ¡i-гликозидазы синтезировался полноразмерный белок а в случае ß-глюканазы - гибридный белок LacZ'-'Cel. Получены характеристики термостабильностей бактериальных ферментов и проведено сравнение аналогичных параметров с глюканазаыи и гликозидазами N.tabacum.

Полученные рекомбинантные плазмиды могут быть непосредственно использованы в дальнейшей работе по получению трансгенных растений. Полученные результаты по экспрессии гетерологичных генов bgl и eel, а такяе полученные в работе делеционные варианты N-концевой части гена eel могут быть использованы для изучения синтеза и функционирования белков целлолитического комплекса thermocellua.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Результаты исследования докладывались на 15 -ом ежегодном симпозиуме ЕМВО (FRG, 1989), на Международном симпозиуме по биотехнологии растений (Женева, 1991) и на Юбилейном симпозиуме Индийского общества генетиков (Индия,1991).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литератдры, включающего цитируемых работ. Работа изложена на страницах машинописного текста и содеряит рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛН И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы и плазмиды. Штаммы Е.coli TGI (Sanbrook et al., 1989), плазмидные векторы pUC18. pUC19 (Yanish-Perron etal., 1985), pTZ18R и pTZ19R (Mead et al., 1986) и фаговые векторы M13tgl30, M13tgl3i (Saibrook et al., 1989).

Трансформацию клеток E.coli проводили по методу Мандела и Хига (Saibrook et al.. 1989).

Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом (Birnboin & Doly, 1979). Рестрикционные эндонуклеазы и другие ферменты были получены от ВНИИПЭ (г. Вильнюс, Литва), НПЦ "Биопол" (г. Москва, Россия), Boehringer Hannheim (FRG), ftmershau (UK), Pharmacia-LKB (USA) как коммерческие препараты и использовались в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в агарозных гелях в IX трис-ацетатном буфере. Концентрация агарозы составляла 0.72, V/. и 27. в зависимости от размера разделяемых фрагментов (Sambrook et al., 1989).

Определение первичной нуклеотидной последовательности поводили по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) по протоколу фирмы Boehringer Mannheim (FRG).

Измерение ферментативной активности Р-гликозидазы проводили по методу, описанному в работе (Schwarz et al.,1985). В качестве субстрата был использован р-нитрофенил гликозид (PNPG). Ферментативная активность эндо р -глвканазы измерялась в соответствии с методикой, представленной в работе (Miller et al.,1960). При измерении применялся субстрат лихенан, являющийся полиглвканом со смешанными ,1-1,4 иГ>-1,3 связями.

Содержание работы.

I. Экпрессия гена р-гликозидазы, клонированного из

C.thermocellum в клетках E.coli.

Первым этапом в процессе получена трансгенных растений является клонирование гетерологичного гена в составе экспрессионного вектора и изучение его экспрессии в клетках Е.col i. Для этого было проведено конструирование рекомбинантной плазмиды с эффективно экспрессирупцимся геном /з-гликозидазы, ранее изолированным из термофильной бактерии Clostridium thermocelluii.

1.1. Конструирование векторной системы для экспрессии й-гликозидазы.

Ген, кодирующий фермент /i- 1,4 гликозидазы был ранее изолирован из геномного банка Clostridium thermocel lum, клонирован в составе плазмиды pUC19 СрВ44) СUelikodvorskava et al.,1986), после чего была определена полная нуклеотидная последовательность клонированного гена. Как представлено на рис.1, кодирующая часть гена, а такие промотороподобный участок располовены внутри фрагмента Smal-Saul11й размером около 2.5 тнп.

В соответствии с опубликованными данными (Érabnitz & Staudenbauer, 1988) экспрессия гибридных белков с изменненными N-концевыми и С-концевыми участками приводила к значительной потере ферментативной активности синтезируемого фермента. Поэтому при конструровании экспрессионной плазмиды было решено использовать полноразмерную копии кодирующей части. Для этого фрагмент Smal-SauIIIA плазмиды рВ14 был лигирован с плазмидой pTZi9R (Mead et al.) расщепленной по Smal сайту. Полученная лигированная смесь была использована для трансформации бактерий Е.coli TG1, и клетки содержащие рекомбинантную плазмиду были отобраны с помощью цветового теста.

1.2. Тестирование энзиматической активности ^-гликозидазы, синтезируемой в E.coli.

Отобранные безцветные колонии были тестированы с помощью

АНЕ5РАНЕ5С Н АЕРЭ Е5

РВЦ--1 " ' 'Г I 1 I | ИГ »

рВЯ322 Ар*

-)_КЬ

0-5 10 1-5 2'° 25

С.

Рис. 1 Й. Физическая карта гена в-глвжазидазы СЬгП.

Б. Схема клонирования гена Ьд1 в составе плазмиды рТг19Я. Обозначения: й. АуаП: С, С1а1: Е. ЕсоШ: Е5, ЕсоМ: Н. Н1пОШ; Р. РгИ; 5. 5аиЗЙ: Ба. Бва!.

теста Fe-esculin (Cuskey et al.. 1980). Истинные трансформанты, содержащие плазмиду pTZ i Э—Ь г 1 были обнаружены по потемнению клеточной колонии в результате расщепления эскулина до зскулитина, обладающего характерным темным тоном. Наличие искомой рекомбинантной плазмиды было также подтверждено с помощью рестрикционного картирования.

1.3. Изучение экспрессии гетерологичной 3-гликозидазы в клетках E.coli.

Полученные трансформанты были использованы для определения активности синтезируемого фермента, а также для изучения его термостабильности.

Фермент р-1,4 гликозидаза катализирует гидролиз химической связи в поли 1,4 -p-D-гликозидах, и для определения его Ферментативной активности могут быть использованы следующие субстраты: алкил-р>-D-гликозид (например метил- р-D-гликозид), арил- (i -D-гликозид (например р-Нитрофенил гликозид, PNPG), а также гликозиды, содержащие только гликозидные остатки ( например целлобиоза).

Синтезиремый в E.coli TGI[pTZ19-bgl] фермент обнаружил

о о

максимальную активность при 60-70 С при рН 5.6 (см. рис. 2). Еденица активности (catal) измерялась в РНР(mol)/s/mg. В клетках TG1 и TGl[pTZ19R] активность (J-гликозидазы отсутствовала (Таб.1).

Рис. 2 График зависимости ферментативной активности ,4 гликозидазы от температуры инкубации, при которой определялась активность.

Таблица 1. Тестирование активности ß -гликозидазы, синтезируемой в E.coli.

! Штамм ! 1 1 TG1 ! TGl[pTZ19R] ! TQiipTZi9-bei] : 1 <

! Активность! ■ 1 0 ! 0 : + ' 1 1

1.4. Сравнительный анализ термостабильностей и-гликозидазы, синтезируемой в E.coli и (1- гликозидаз N.tabacum.

Для определения термостабильности исследуемого фермента экстракт бактериальных клеток TGI[pTZ19-bgl1 преинкубировали при 60° С в течении различных промежутков времени и определяли Ферментативную активность с помощью субстрата PNPG. На рис.3 представлена гистограмма изменения относительной активности в зависимости от интервала преинкубации. Как видно из представленных данных около 50% активности от исходного уровня сохраняется после приинкубации в течении 90 мин. По аналогичной методике-было проведено измерение термостабильности ферментов, обладающих аналогичной активностью в растении N.tabacum (на том же рис.2 представлена в виде графика). Как видно из

100

19' 7.0' 30' АО' 50' iO' ?0' gO' 9 О'

Время преинкубации

Рис. 3 Гистограмма ферментативной активности /з-гликозидазы, синтезируемой в E.coli в зависимости от времени преинкубации С60 С); график изменения активности ß -гликозидаз N.tabacum в зависимости от времени преинкубации (60° С).

представленных данных около 50У. активности от исходного уровня сохраняется после приинкубации в течении 90 мин. По аналогичной методике было проведено измерение термостабильности ферментов, обладающих аналогичной активностью в растении N.tabacua (на том хе рис.2 представлена в виде графика). Как видно из

о

представленных результатов в процессе преинкубации при 60 С уже через 15 мин. фермент(ы) теряют более 60'/. своей активности. В то se время бактериальный фермент после аналогичной преинкубации в течении 15 мин. теряет не более 10Z своей активности. Такое различие, по-видимому, сможет послужить основой для тестирования активности бактериального фермента, синтезируемого в трансгенных растениях с эффективно экспрессируемым геномр-гликозидазы.

II. Экспрессия ß-1,3 эндоглюканазы из Clostridiua thermoce11 un в клетках E.coli.

Ii.l. Модификация фрагмента ДНК, включающего ген /3-1,3 глюканазы.

Используемая в работе копия гена, кодирующего фермент /1-1,3 эндоглюканазу (cel. другое название фермента ламинариназа ЕС 3.2.1.39) , была ранее клонирована из бактерии Clostridium theraocel1ид (ZverlovS Uelikodvorskaya, 1990). Минимизация размера клонированного фрагмента и последующая его интеграция в вектор для экспрессии в E.coli была проведена в соответствии со следующей стратегией.

Il.l.fi. Физическое картирование гена /1-глюканазы.

С использованием рестриктаз EcoRU, ВавШ, Hindi 11» Pstl, Mlul, SaulIIfl и BspRI была построена точная карта фрагмента, содержащего клонированный ген в составе плазмиды pCU402 (см. рис. 4 ). Полученные данные были использованы при определении первичной нуклеотидной последовательности клонированного гена. Б процессе картирования было обнаружено, что ген полностью (включая промоторный участок) локализован внутри Saul lift фрагмента размером 1.2 тпн. Этот SaulIIfl фрагмент был клонирован

OS

1-0

_j5 ТПН

pCU 402-

pUC18-Cel.

S M p M

4=y=L

Ж P

a_L

N

_L

д зоа.а. л 50 а .а. д loo а.а.

В

£5 HS S

I И I

€5

*

I \ \ v

Н \ I I

Ар'

Mlul Bal3l Клено ФЛинкер BamHl A urn j.

-*BL Д2

->BL 35

-f BL 33

Рис. 4 ft. Физическая карта гена р-эндоглюканазы (eel).

Б. Делеционные варианты гена cel. Обозначения: В, BaiHI; Е5, EcoRU; Н, HinDIII: И, Hlul: Р. PstI; S, Sau3fl.

в сайт BamHI плазмидн pUC18, и ферментативная активность fi-гликозидазы бала тестирована в клетках ТЕПрИС18-сеП.

Для дальнейвего использования копии клонированного гена в работах по генной инженерии растений и для достижения максимальной экспрессии этого гена в бактериях были проведены работы по получению гибридных белков с геном cel.

11.1.Б. Получение делеций в N-концевой области гена cel.

Для получения делеций в N-концевой области гена eel

плазмида pUCi8-се 1 была линеаризована с помощью рестриктазы Mlul и обработана экзонуклеазой Ва131 с различным временем инкубации. Затем обработанная плазмида была лигирована с линкерами BamHI и использована для трансформации клеток Т61 (см. рис. 4 ). Отобранные клоны ftp были картированы, и фрагменты BaaHI-Pstl размером 600-900 тпн С варианты BL33, 35, 42, 19) были клонированы в соответствующие сайты фагового вектора Mi3tgl31. Методом Сэнгера (Sanger et al., 19?7) были определены нуклеотидные последовательности в области интеграции линкера в структуру гена eel (рис.5).

11.2. Конструирование вектора для экспрессии гибридного гена lacZ '-'cel.

Для последующего конструирования экспрессионного вектора был отобран делеционный вариант BL42 гена cel. Как видно из данных представленных на рис.4й, в отобранном варианте были делетированы 31 а.к. в N-концевой части полипептида. По предварительном данным (Зверлов, ИНГ) в полученном таким образом фрагменте гена eel отсутствовал участок ДНК, кодирующий лидерный пептид (23-26 а.к.), который в клетках C.thprcocel1иш обеспечивал эффективную секрецию синтезируемого полипептида. Однако, полученный делеционный варинт мог детерминировать синтез фермента с измененной ферментативной активностью и термостабильностью.

Для тестирования и определения активности модифицированного

линкер BauHI

eel

3 Ч'

BL42 GflftGCTT'GGGflTCC'CG T 'fiTG GTfl'flAT flCG CCT TTT GTT GCfi... M13tgl31

Последовательность Ual Ual flsn Thr Pro Phe Ual flla...

а.а. остатков

Рис.5 Частичная нуклеотидная последовательность рекомбинантного фага M13tgl31-BL42.

гена eel два фрагмента Hindi 11—Pstl и BamHI-PstI из M13tgl31-BL42 были клонированы в плазмиды pUC19 и pl)C18 по сайтам Hindi II, Pstl и BamHI, Pstl соответственно (рис.6). В результате клонирования были получены гибридные гены, кодирующие два различных гибридных полипептида. В первом случае (HindlII-Pstl) lac-промотор контроллировал синтез гибридного белка LacZ'-'Cel (рис.бБ), который включал 8 а.к. LacZ (полилинкер М13 и pUC), 3 а.к. образовавшихся за счет интеграции линкера ВавН! и пептид Cel, начинающийся с 32 а.к. Во втором случае под lac-промотором синтезировался гибридный белок LacZ'-'Cel', включающий в себя 13 а.к. LacZ, 3 а.к. синтезируемых за счет полилинкера, но в отличие от предидущего варианта делегированный пептид 'Cel' синтезировался со сдвигом рамки, что дол»но привести к терминации трансляции уме на 3-ем триплете (ТАЙ) делетированного фрагмента ДНК. В этом случае образующийся гибридный белок не доляен был обладать ß -глюканазной активностью. Выбранная стратегия клонирования позволяла также проверить корректность полученной ранее нуклеотидной последовательности гена cel.

II.3. Определение активности модифицированного фермента ß-1,3 глюканазы.

При тестировании активности -глюканазы был использован метод (Miller et al., 1960), в качестве субстрата применялся лихенан, представляющий собой полиглюкан со смешанными ß-1,3 и Р-1,4 связями. Применение такого типа субстрата было возможно благодаря ранее полученным данным об отсутствии ферментативной активности ß-1,3 глюканазы по отношению к полиглюкану со связями типа (3-1,4.

Результаты тестирования, в отличие от ожидаемых, обнаружили синтез активного фермента как в штамме TGl[pUC-42\Hl так и в штамме ТЫ[р1С-42\В]. По-видимому, это связано с возможным наличием внутреннего сайта инициации трансляции (GUE в полокении 32). Это предположение косвенно подтверждается и теы

ft.

LacZ'-'Cel'

f-HetThr Met lie Thr flsn Ser Ser Ser Ual Pro Gly flsp Pro Ual Trp Stop ATG ЙСС ATG ATT flCG AAT TCG fl£C TCG GTA CCC GGG GAT CCC GTG TGG TflA ATA

GTG GTA fiflT

Plac

'Се 1 f-Met Ual Asn

32 33 34

Б.

LacZ'-'Cel

f-MetThr Het lie Thr Pro Ser Leu Gly Ser Pro Ual Ual Asn ...

ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GGA ТСС CCT GTG STA AAT...

Plac 32 33 34

Рис. 6 Наклеотидные и аминокислотные последовательности транслируемой области гибридных генов lacZ'-'cel' (A:pUC-42\B) и lacZ'-'cel (B:pUC-42\H). Цифрами обозначены номера аминокислотных остатков полноразмерного Cel.

Фактом, что удельная активность фермента в случае варианта pUC-42\Н Сем. таб.2) в 2 раза выше чем в случае pUC-42\B. Результаты по измерению активности ß -глюканазы в различных штаммах E.coli суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Измерение активностей ß -глюканазы, интезируемых в клетках E.coli Т61 и N.tabacun.

Штамм : nCl/402 I pUC-42\H 1 pUC-42\B ,' N.tabacun QojJ. ТЫ ! ! ! !

Активность ( МКМОЛЬ/^МГ) 16.2 1 1 31.7 I 18.э t 1 12.2

11.4. Сравнение термостабильности бактериальной глюканазы, синтезируемой в E.coli с термостабильностью аналогичного фермента(ов) N.tabacuia.

Термостабильность фермента в обоих случаях измерялась как изменение удельной активности фермента в зависимости от времени

о

преинкубации клеточного экстракта при 70 С. Результаты измерений представлены на рис. 7. Как видно из сравнения данных для клеточных экстрактов TEUpCU4021 и TGi [ pUC-42\H 3. гибридный белок LacZ'-'Cel с модифицированной частью Са1 незначительно изменил свов термостабильность по сравнению с исходным Cel.

Сравнение термостабильностей бактериального белка и ферментов из растения N.tahacua обнаружило картину аналогичную ситуации с гликозидазами. Как видно из рис. 7 относительная активность бактериального LacZ'-'Cel незначительно изменяется

0' io' %o' 30' 40' 50' 6c'

бремз преинкубации

Рис. 7 Графики изменения ферментативной активности (1-глкжаназы С Се 1) в зависимости от времени преинкубации при 70° С: в клетках Е_ Uli TGI IpCU402 J-I, [pUC-42\B J-11. IpUC-42\H]—11 и в клетках растения N.tabacua -IU.

о

после преинкубации клеточных экстрактов при 70 С, так после 60-ти минутной преинкубации бактериальный белок сохраняет более 60% своей активности. В процесе аналогичной преинкубации клеточных экстрактов N.tabacum за 60 мин. ферменты, определяющие ß -глюканазную ативность теряют более 90% своей активности (рис. ?).

ВЫВОДЫ.

1. Получена конструкция векторной плазмиды для экспрессии, и изучена экспрессия ß-гликозидазы (bgl) из Clostridium thermocel1иш в клетках E.coli.

2. Проведена модификация гена (J-1,3 глвканазы (eel) из

С.thermocel1иш и получены конструкции векторной экспрессионной плазмиды для изучения экспрессии в Е.col i.

3. Проведено тестирование экспрессии (^-глвканазы в клетках Е.со 1 i.

4. Проведен сравнительный анализ термостабильностей глшканазы и глюкозидазы, синтезированных в клетках E.coli с терыостабильностью аналогичных ферментов N.tabacua.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. R.N. Gadag, U.L. Mett, E.S. Piruzian. Transgenic tobacco plants carrying bacterial ß- glucosidase gene. Proceedings of 15 EMBO ñnnual Syaposiua on Molecular Coamunication in higher plants. Sept., 19B9 Heidelberg, Germany, p.105.

2. R.N. Gadag, U.L. Mett. E.S. Piruzian. Transfer of bacterial ß-glucosidase gene in tobacco plants. Proceedings of

International Symposium on Plant Biotechnology and its contribution to plant development. Multiplication and improvement., Apr., 1991, Geneva.

3. E.S. Piruzian, R.N. Gadag, V.L. Mett. Study of transfer of bacterialy3-glucosidase gene from Clostridium thermocellum in to tobacco plants. Proceedings of Golden Jubilee Symposium of Indian Society of genetics and plant breeding. Feb., 1991, New Dehli, India, p.897.

Зак.$£9 Xr.ii.jCO И* 1Щг. Отдел оперативной полиграфии к множительной техники МГИЮ МВД СССР пр-кт Веркадского-76