Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры гена лихеназы CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM Ф7 и характеристика продукта данного гена

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры гена лихеназы CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM Ф7 и характеристика продукта данного гена"

РГО ОД Я

' ; НЛУЧиО,*ИССЛЕДОНАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 577.29:577.112.083.3

ЗВЕРЛОВ Владимир Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ГЕНА ДИХЕНАЗЫ CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM Ф7 И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТА ДАННОГО ГЕНА

03.00.03 — молекулярная биология

Авторефер а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1993

Работа выполнена в Лаборатории нолекулярцой генетики анаэробов Института молекулярной генетики РАН

Шучниз руководитель: , Кандидат медицинских наук Г. А, Всликодворская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. В. Нашсо кандидат биологических наук С. В. Костров

Ведущая организация: Химический Факультет ИГУ ин. И. В. Ломоносова

Зашита диссертации состоится т1Я." 1994 г.

в часов на заседании Специализированного Ученого совета

Д 098.12.01 ш>и Научно-исследовательском институте генетики н селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545. Москва. 1 -й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией ножно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики, и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 1993 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЯЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гены.

В связи с ген. что огромное количество растительной биомассы накапливается в виде полимерных Сахаров с большим нолекуляркым весок. ♦ерменты деполинеризгапие полисахариды представляли и представляют значительный интерес для биотехнологии.

Лихеназы или 1. 3-1. Ч-бета-О-гижан-Ч-гяюкан-гндролазы (X. ф. 3.2.1.73) это пирокий класс глюкангидролаз спеяи*нчески расшеплямаих i, 4-бета-0-гяхжозндные связи о бета-гяюкаяах со снешаиныкя I. 3-1.4-бста-0-связяни. Природными субстратами для этих Ферментов являются бета-глсклны клеточных стенок эндоспермы злаков (до 1С* от сххого веса зерца) или лихенав пол/чаемый из водорослей. Cetraria lslandlca.

Наиболее интенсивно лихеназы используются в пивной пронызленности в качестве добавки к Ферментам солода. Проблемы возникающие при пивоварении, а именно: уменьшение выхода, снихение скорости разделения сусла и Фильтрации пива, а такте образование зелатинопсдобкых осадков при хранении пива. в основной связаны с неполной деградацией бета-глгжанов овса. Образующиеся в процессе прорастания зерен ячиеня бета-глюканазы разрушают глюканы клеточных стенок зкдосперны и тен самым позволяют альФз-амилазам осахаривать крахнал. Однако часть солодорых бета-глюканаз, з связи с их недостаточной терностабильностью. необратимо инактивируется в процессе сушки зерен, а оставшиеяся Ферменты быстро разрушаются при заваривании солода. Поэтому во время приготовления солода часто добавляют препараты тегнестабильных I, 3-5, 4-бета-глюканаз грибного или бактериального проксхохдемгия. Слабим нестон подобных препаратов является их недостаточная стабильность при температурах применяемых п пивопарении (до 70°С). Ко нпогих лабораториях ведется лктивныи поиск термостабилышх лихеназ для протащенного использования.

Известно, что одна из наиболее sopomo изуяешшх апаэробкык терноФнльиих бактерий, С. Июгтэсс] лип, помимо педлюлдз к ксяяаназ продуцирует Ферменты обладающие лакинариназиой и лихеиазной активностями. Этот микроорганизм. такяе как и другие термофильные бактерии-иеллюлолктики обладает рядом недостатков, которые препятствует их непосредственному использованию в качестве источника различных Ферментов. Поэтому клонирование и экспрессия соответствующих генов в мезоФильных бактериях, в настоящий иоиент. самый распространенный сносов получения и изучения теркостабильных Ферментов. Клонирован и секвенирован ряд генов с. Ihermocel lum. кодирующих эндо-1,4-гдюкацазы is ксиланазный ген. Почти все эти Ферменты входят в состав нультиФерментного комплекса, названного цеялюлосоной.

Цель и задачи работы.

Цель данной работ« заключалась в изучении структуры гена термостабильной лихеназы С. thermoceiiura и определении основных свойств продукта данного гена.

В ходе работы решались следующие задачи:

1) клонирование гена лихеназы С. thermocellum в клетках Е. coll;

2) определение нуклеотидной последовательности гена.

3) создание продуцента терностабильной дкзеназы на основе мезофидышх микроорганизмов;

изучение свойств Фермента;

Научная новизна и практическая значимость работа.

Нз клонотеки С. thermocelluia ФТ отобран клон продуцируюсэй теркостабильную бета-глгжаназу и локализован фрагмент ДНК С. thermocellum о пределяиаии синтез данного Фермента. Получеш реконбкнатные плазмиды, обеспечивающие эффективную экспрессы гена высоко-термостабильноя лихеназы Clostridia therioocel lum i клетка2 E. coll и В. subtllls ( продуктивность 30000 и lOOOCi ед/л среды, соответственно). Терностабкльная бета-глюканаза и: реконбглантвого штамма Е. "coli TGt (PCU4Q2) очинена д

■омогенности и определены ее осношше биохимические сойства. На основании данных вискоэннетрического теста, анализа убстратной специфичности и основных продуктов гидролиза лихена-:а и лаиияарина бета-глюканаза С. thermoceliura охарактеризована, :ак лнхеназа (ЕС 3.2.1.73). На настояний нонепт данный Фермент репосходит все известные препарата, применяющиеся в пивовлрен-ой промышленности но термостабильности и удельной активности.

Определена нуклеотидная последовательность гена лихеназы С. heraocel 1ши Ка основа аналнза иухлеотидной последовательности епа определена структура лихеназы С. thernoceinui.

Впервые показана целлюлосонпая локализация лихеназы. аличие бета-1. 3-1.4-глюкаиолитическои Ферментативной активности неллюлосоме С. thermocel lum означает, что эта органолла частвует не только в гидролизе целлюлозы, но а п деградации ругнх полисахаридов.

Структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора итературы. экспериментальной части. гислючаюшей описание атериалов и методов, изложение и обсуждение экспериментальных езультатов. заключения, выводов и списка литературы (104 нтературных источника ). Работа содержит <99 страниц ашинописного текста, включает 19 рисунков и 8 таблиц.

Апробация диссертации.

Результаты исследований докладывались на Нехдународпон инпозиуне FEBS (Будапешт. 1990); на Всесоюзной конференции Ловые направления биотехнологии" (Путлино, 1990),- па V энФереннии РФ "Новые направления биотехнологии* (Пэтшшо, 1992). также на секинарах Лаборатории колекулярной генетики анаэробов »статута молекулярной генетики РАН.

НЛТЕРЖЛУШ И МЕТОДЫ

Бактериальные «гганмы и плазмкды. В работе использовали штаммы: Clostridium therraocelliun Ф7, из коллекции микроорганизмов ИЬ'ФН РАН; Е. coll TGI <SUPE. hSdD5. thl, DUac-proAB ), F' [ tr<JD3C, proAB'i lacl4. lacZDHiSl); Bacillus subtllls AJ73 <апу4, т>г512. аргТЗ) (ВНИМгенетика).

В качества некто ров для клеток Е. çoli использовались плазниды: рвкзгг. PUC19. PTZ19R и pTil 58 и плазмид« рсвг;;, способная реплицироваться в клетках В, subtills и Е. coll и несущая гены резистентности к ампициллину и эритромицину. Бактериальные среды и условия культивирования. Для внраыиваккя клеток В. subt ills и Е. coll использовали среду LB (Haniatls et al.. 1982). Клетки штакна С. tlicrmocel luai Ф7 вырашииалк в анаэробных условиях при температуре 65 С на комплексной минеральной среде (Члзильскзя и др., 1986). В качестве источника углерода использовали яеллобиозу или Фильтровального б/нагу. Выделение и анализ ДНК. Выделение плазмндной днк из клеток Е. coll и другие стандартные процедуры проводили по оошеприятым методикам (Haniatls et al.. 1982). Выделение плазмидной ДНК из клеток В. subtil is проводили методом Бирнбойма-Доли. трансформацию В. subtil Is осуществляли по стандартам методикам (Харди, 1966). Хромосомную ДНК С. thenoocelluo выделяли, как описано в работе Пирузян и др. (1965)

Определение Ферментативной активности лихеназы. Активность лихеназы определяли при 70° С в Tpiic-Hci буфере рН 8. 3, содержащем в качестве субстратов О, 5 * раствор СНС; ксклана,' бета-глгжанов овса; лнхенава или дамннарива с использованием динитросалишмсвого реагента (Hlller et al., I960). При определении активности иа хроногенных субстратах (pHPC; pHPPLac; PKPG; pHPGal иди рКРХу1) реакдию останавливали добавлением НагС03 до О. 33 H и измеряли активность Фотометрическим методом при длине водны 400 нн. За единицу активности принимали образование 1 икмоля продукта реакции за 1 минуту на 1 нг белка.

Определение активности лихеназы на чашках -проводили с использованием красителя Конго-красный (Teather » Wood. 1982) с лихенанои в качестве субстрата.

Вискозииетрическое измерение активности проводили на вискозиметре Оствальда. В качестве субстрата использовали гх раствор дихенана. Относительную вязкость вычисляли по Формуле 1/п(отп)-to/t-to (где to-текучесть буфера, а t-текучесть пробы, измерянные в сек).

Изнерение концентрации белков. Содержание белка в клеточных экстрактах определяли по методу Бредфорда (Bredford. 1976). Тонкослойная хонатограФия. Хроматографию продуктов гидролиза лихенана и данинарина проводили в системе растворителя адетонитрил : вода = 80 : 20 с использованием силикогелевых пластинок для тонкослойной хроматографии ("Неге"). После проведения хронатографии пластинку обрабатывали растворок (1 г о-нафтола, 100 мл метанола и 20 нл HjSO^ ) и понепали в териостат на 95°С на 5 мин.

Электрофорез и изоэлектрофокусирование. электрофорез проводили в 10* ПААГ. содерхаяен 0. 1* SDS согласно Laemmll (1970). ИзоэлектроФокусирование проводили в полиакриламидных пластинах. рН 3.5-9.5 (LKB, кат. нонер 1804-101) на приборе Hultlphor II (LKB. Pharmacia) согласно инструкциям Фирмы. Для локализации зон обладающих бета-глюканазной активностью использовали нетод агарозных реплик.

Очистка лихеназы. Подробное описание процедуры очистки лихеназы С. theraocellum приведено в статье Zverlov et al. (1993) Получение препарата целлюлосокы. Супернатант культуры с. ther-nioce llura концентрировали и обессоливали на нембране Amlcon ХН-300. Гель-Фильтрацию раствора целлюлосокы проводили на колонке Superóse 6В (1 X 30 сн). В результате били отобраны две фракции проявляющие активность на Авицеле: высокомолекулярная Фракция содержащая нативные целлюлосомы (выходит в свободной обьене . колонки) и Фракция с более низким нолекулярнын весон, представляюяая собой частично деградировавшие целлюлосоны.

Приготовление антисыворотки и вестерн блоттинг. О. 25 иг частично очищенной лихеназы (после стадии гель-Фильтрации) смешивали с полным адыэвантом Фрейнда и полученным раствором инмупизкровали белого кролика. Повторную инъекцию проводили через 12 дней. Через неделе после повторной инъекции у кролика была взята кровь для приготовления аитисыворотки. После центрифугирования (15000 е; 15 нин) сыворотка была очишена на колонке для очистки IgG.

Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлознло мембрану и инмунохимическую обработку нембраны выполняли по протоколу описанному в каталоге Фирмы amersham "Иммунологические реагента". Определение нуклеотидной последовательности. Определение нуклеотшшой последовательности проводили по нетоду Сеыгера (Seneer et al., 197Т).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование гена лихеназы С. thermocellum в клетках Е.

coll и свойства продукта ванного гена.

Клонирование гена терностабильной лихеназы С. thermocellum.

Для создания клонотеки частично обработанную эндонуклеазой Sau3A хроносонную ДНК С. thermocellum дигировали с линеаризованной по Валш сайту и обработанной шелочной ФосФатазой ДНК вектора PBR322. Более 95 z клонов получешшх в результате трансформации этой лигазной смесью клеток Е. coll TGI содержали рекомбинантные плазмиды со вставками ДНК С. thermocellum от 2 до 9 т. п. н.. Скрининг проводили непосредствекно на чашках с использованием в качестве субстратов бета-глюканов овса и лихенана.

Клон отобранный нами для дальнейшей работы обладал наибольшей активностью на данных субстратах. Выделенная из него реконбинантная плазмида PCU401 содержала фрагмент ДНК С. thermocellum размером 1.9 т. п. н. (рис. 1).

Hlfntlt ÎM.Q!

ecotïj

ECCF HliBI E

йр<в>

Bfii Я-U

eccttu

BftMH Ш11

Рисунок i. Физические карта плазнид pctMOl, рсиюг и рСШОЗ. Заштрихованной полосой обозпачен Фрагмент ДНК С. tberraocel1ия. Тонкой линией обозначены ДНК векторов PUC19 и РВЕЗгг. HlndlII сайты использованные для конструирования плазнид рсиюг и рСШОЗ обозначены стрелками.

Далее нами были получены плазниды рсичог и РСОТОЗ, которые представляли собой линиаризованный по сайту HlndlII вектор PUC19 и HlndlII фрагнент плазниды pCU'101, содержащий часть вставки ДНК С. thermocellun (рис. 1). Новые плазниды отличались лишь ориентацией вставки относительно lac промотора вектора рис19.

В связи с тем, что Ферментативная активность на лихенане, определяемая при 70°С. в клеточных экстрактах клонов с плазмидами PCU401, рсичог и РСОЧОЗ была практически одинаковой (39 Ед. /иг обшего белка) нами было сделано предположение, что клонировашшй фрагмент содержит область выполнявшую Функции промотора в клетках E. coll.

Очистка рекомбинантной бета-гдгжаназы С. thermocellum из клеток Е, coli.

данные по очистке рекомбинантной бета-глюканазы с. thermocellum из клеток Е. coll приведены в Таблице 1. На конечной стадии очистки, после проведения анион-обиенпой хроматографии фермент был очишен в 416 раз и представлял собой после проведения SDS-ПААГЕ одну белковую полосу с молекулярным весом около 30000. По данным гель-Фильтрации молекулярный вес Фермента приблизительно 32000, что свидетельствует о том, что данный Фермент существует в растворе в нативных условиях в виде мономера. Удельная активность очишенной бета-глюканазы при 70°С на лихенане в качестве субстрата составляет около 12000 Ед. /мг белка, чгго значительно превосходит значения удельных активностей других известных бета-глюканаз, находящихся в пределах от 1000 Ед. /иг (R subtllls) до 7500 Ед./мг (В. llchenoformis).

Таблица 1. Этапы очистки рекомбинантной бета-глюканазы С. игегтосеИиш из клеток Е. сои (рси40£).

суннарный суммарная Удельная

бедок активность активность Выход Степень Этап <нг) (Ед.) (Ед./иг) (X) очистки

Клеточный 48В. б 14170 29

экстракт

Прогрев при 70°С 97.7 14170 145

фракционирование 45.8 21250 464

сульФатон аммония

ГеЛЬ-ФИЛЬТРЭДИЯ 18.6 17760 955

(Toyoperi hv-60)

Ион-обненная ХРО- 0.74 8930 12068

натограФия

(Hono-Q)

100

100

150 (10О)

125 (84)

63 (42)

1

5 16

33

416

В скобках приведены величины выхода Фермента по активности, из расчета юо ч. - максимальная суммарная активность, (численные данные приведены с точностью до 10 '/■)

При определении бета-глюканазной активности в неочищенном экстракте клеток Е, coll (PCU402) непосредственно в палг были

обнаружены две зоны активности соответствумше белкги с нолекулярныки весами около 30000 и 36000. Ни предположили, что бедок с неньяеЯ кассой образуется в результате отпепления нефункционального участка или домена не влиззжего на активность ♦ернеата.

отн. активн. щ___

100

80 / X

60 / \ 40 'у/ \

20 /

01 ' ■-.-.-——

20 40 60 80 в температура (°С)

Рис. 2 графики зависимости активности бета-глюканазы С. ^егвосе! 1ип от величины рН

(A), температуры (Б) и кривые стабильности Фернента при различных температурах

(B). Зависимости снимались А- при 70°С; Б- при РН 3. 5; В- при обозначенных тенпе-ратурах и рН 8. 5.

Физико-химические свойства реконбинантной бета-глюканазы с. гьегтосепит.

Нами были определены зависимость активности Фермента от температуры, от величины рН и подучены данные по тениературной стабильности глюканазы (рис. 2). Оптинум Ферментативной активности наблюдался при температуре 70°С и РН 8.5. В отсутствие субстрата Фермент сохранял свою активность в течении

отн. айтивн. (Г) 100

30

60

40

20

0

3 4 5 6 7 8 9 1011

рн

отн. активы. (Г) 1 100

80

60

40

20

О

70°С

0 1 2 4 5

» вреня (час. )

нескольких часов при то°с и 50х активное™ после 4 часовой инкубации при 75°с.

Б Таблице 2. приведены данные со влиянию некоторых веаеств на стабильность Фернента. Инкубацию проводили при 70° С в отсутствии субстрата. Видно, что Фермент достаточно устойчив к воздействию различных химических агентов, лучше всего стабилизируется Тритоном Х-100 и плохо переносит коны 2аг* .

Константа Нихаэлкса была определена из графика зависимости скорости реакции (VI от концентрации субстрата (з) в координатах 1/у н 1/2 (метод Даинуивера - Берка) при изкенении концентрации лихенана от 5 до ?.о мг/кл к составила 2, 5+/-0, 3 нг/мл.

При измерении изоэяектрической точки и в случае грубого клеточного экстракта, и очинённого белка проявлялись две зоны обладающих активностью па дкхенаке в области рН 4.9 и 5, 3.

Таблица 2. Влияние различных вешеств на стабильность рекомбинантной бета-глюкгиазы С. Шегтосепиа

Вешестао Концентрация Относительная активность (>:>

- - - 100

ЭДТА 5 ни 120

Н8С12 г ни но

сас12 г мн 110

гпс12 10 НИ 50

ШС12 10 им 100

сизо4 1 ни во

этанол 10 У. 110

г-меркаптоэтанол г нн 100

тритон х-100 0, 1 V. 200

тритон х-юо 0. 5 г. 300

ЭОБ 10 нН 90

100 МН 70

Измерения активности производили после получасовой инкубации при 70°с. в качестве субстрата использовали лихенан. « - в присутствии субстрата (численные значения величины относительной активности приведены с точностью до 10 )

Определение субстратной специфичности и типа действия рекомбинантной бета-глюканазы С. ШегюосеПили анализ конечных продуктов реакции.

Из данных по активности реконбинантпой бета-глюканазы С. гЬегшосеНшп на различных субстратах (Таблица 3.) можно

заключить, что фернепт действует только па полимерные субстраты содерхаике смешанные 1,3-1,4-бета или 1, 3-бета связи. При этом «а ланинарине (1,3-бета связи) активность глюканэзи на порядок ниже. Активности па таком субстрате, как КШ (1.4-бета связи) не было обнаружено даже при длительной (24 часа) инкубации реакционной снеси.

Таблица 3.

Субстратная специфичность рекомбинантной бета-глюканазы С. Июгюосепиш.

субстрат

Удельная активность (Ед./кг1 белка)

субстрат

удельная активность (Ед. /мг белка)

Лихенан

Бета-глюкани

овса

ланинагнн

ксилан

АВИИО«'

12000 15000

140 О О

кпп

пнф-лак пнФ-цел пнф-ГЗЛ

ш1ф-ксил

пнф-ГЛ»

О- отсутствие активности после дзенадпети часового инкубирования в стандартных услопиях.

(численные дашшо приведены с точность» до ю XI

100хб1/п

г

дй-Б.

Рис. 3. Изменение вязкости раствора лкхенана в зависимости от . концентрации образуюяихся редуцирующих Сахаров под действием различных ферментов . 1 - СШЗ; 2 - Е£2; 3 - бета-глюканаза С. гъегпюсеПшп.

Для определения неханизна действия бета-гдюканазы с. (ЬегаосеШш мы исследовали зависимость - изменения вязкости раствора лихенана от концентрации образующихся восстанавливающих Сахаров в процессе гидролиза (рис. 3). Поскольку вязкость раствора полинера экспоненциально зависит от степени полимеризации, гидролиз внутренних связей долхен привести к значительно более сильному снижению вязкости, чек гидролиз того же количества концевых связей, это означает, что угол наклона кривой зависимости специфической вязкости от концентрации редуцирующих Сахаров, определяемых по глюкознону эквиваленту, для эндоглюканаз должен быть слнественно больше. чем в случае эхзоглюканаз.

В качестве контролен мы взяли два белка, ранее полученных и охарактеризованных в нашей лаборатории : целлобиог-идролазу (СШЗ) - фермент обладавший экзо-фгкклией и эндоглюканазу (Ейг). Из рис. 3 видно, что наш фермент типичная зндоглюканаза.

Для более детального изучения механизма действия бетг-глюканазы С. гьегоосеПш) были проведены исследования конечных продуктов, образующихся в процессе гидролиза лихенана и лаиинарина методом тонкослойной хронатографии. На рис. 4 показана динамика накопления конечных продуктов. Видно, что при гидролизе и лихенана, и ламинарина в начальный момент времени образуются преимущественно высокомолекулярные олигосахара, что характерно для реакции эндо-типа. Основным продуктом реакции на лихенане является целлобиозилтриоза, а на ланинариве ламинаринбиоза.

На основании анализа субстратной специфичности, основных продуктов гидролиза лихенана и ламинарина и данных вискозинетрического теста бета-глюканаза С. ЦЬегтосеПиш является лихеназой или эндо-1.3-1.4-бета-В-глюкан-4-глюкангидролазой, т.е. Фернентом расщеплявшей только 1.4-бета связи соседствующие с 1.3-бета связями в бета-глюканах со смешанными связями.

.. -G -2G

„.■»» /Г'", .»*■"*%

¡-G

j-2G

^pst-—iaasa—;" "4-i

- ^ <31 ^

с=о слг» ¿ХЗ еде,

123456 1234

А Б

Рисунок 4. Тонкослойная хронатография продуктов гидролиза лихе-мапа и ланинарина бета-гяюканазой С. и>егшосе11ша. А - гидролиз лихенана: 1-0 нин; г-3 кет; з-Ю мин; 4-25 ниш 5-50 кип; 6-50 ник; Б - гидролиз ланинарина: 1- О кип; г- 10 нин; 3- 30 нин; 490 нин. Справа показано положение глюкозы (О и дедлобкозн (26).

2. Создание продуцента терностабидьной дихеназы С. theraocellum на основе вгганиа В. subtil is AJ73.

Клонирование гена, дихеназы С. thenaocelluii в В. subtil is. Для перексонирования гена лихеназы С. tbermocellum из Е. coll в клетки В. subtllis кы использовали вектор РСВ22 (Сорокин и Хазак. 1990), способный к репликации в метках a subtllis н Е. coll и несганй гены резнстентпостя к ампициллину и

эритромицину.

BamHl фрагмент плазниды pClHOS, содержащий вставку ДНК С. tbermocel lum, был встроен со ВапШ сайту в вектор РСВ22. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coll TGI. Клоны обладагжше лихеназной активностью отбирали на чашках по ик способности гидролизовать лихенан (тест с использованием красителя Коного крас>шй). Рестрикционный анализ показал, что все эти клонк содержат реконбинантные плазниды, отличающиеся друг от друга ориентацией ВапШ фрагмента. Соответственно плазниды были названы PBL01 и PBL02 (рис. 5). После трансформации этими плазмидами клеток В. subtllis оказалось, что клетки негуюте плазниды со вставкой или в той, или в другой ориенташш обладают одинаковой активностью на лихенане при 70°С. Это свидетельствует об экспрессии гена лихеназы с. thermocellus в клетках В. subtil is с собственного промотора.

Заштрихованной полосой обозначен фрагмент ДНК С. thermocelluia. Тонкой линией обозначены ДНК векторов PUC19 и РВЕ322. BamHI сайты использованные для конструирования плазнид pBLOl и PBL02 обозначены стрелками.

Свойства лихеназы С. tbermocellum из культуральной жидкости штанма В. subtllis AJ73 (pBLOl).

для сравнения свойств реконбинантной лихеназы С. thermocellum из штанма В. subtllls AJ73 (PBLOl) и из экстракта Е. coll (PCU402) нами был выделен гомогенный препарат этого

ЕСОВ«8*«1

eccru вяин1

ECORU

важк ЕССЯУ J

Рисунок 5.

Физические карты плазнид pBLOl и pBLOE.

Фернента из культуральной жидкости a subtil is (pBLOl).

Удельная активность полученного препарата с больной точность» совпала с удельной активностью рекокбинантной лихеназы выделенной из Е. coll и составила 11700 Ед/нг белка. Все остальные биохимические характеристики н константы Ферментов тоже ссппадаяк. Есключенне составил только молекулярный вес Ферментов. Для лихеназы из В. subtil 1з AJ73 (PEL01) - 33 кДа, а кз Е. coll (PCU402) - 36 кДа. Это, по-видинону. связано с откреплением о первом случае лидерного пептида.

вгеня (час. )

Динамика накопления лихеназы С. №егпюсе11иш в клетках и культуральной жидкости В. зиьипз (РВ1.01). На рис. б представлены данные по накоплению реконбннантной лихеназы в клетках и культуральяой жидкости пгганна К АЛЗ (рвьои в зависимости от времени культивирования. Видно, что основное количество образуюшегося Фермента накапливается в культуральной жидкости. Наксинальное увеличение количества лихеназы (по активности) происходит на поздней логарифмической стадии' роста. Если предположить, что удельная активность Фермента не изменяется при прохождении белка через клеточную мембрану, то около 80 х лихеназы обнаруживается в культуральной жидкости.

- Продуктивность полученного нами штамна . составила

приблизительно i00000 Ед/д среды (измерение активности проводили при 70е С с не пользованием лкхенана в качестве субстрата).

3. Определение кгклеотндной последовательности гена лихеназы с. then&ocellum Ф7 и цедлюдосокная локализация продукта этого гена.

Определение нгклеотидной последовательности гена лихеназы С. tbermocellun *Т.

Нукдеотидная последовательность фрагмента плаз.чнды PCU402 была определена методом Сенгера по двум цепяк. Первичная структура гена и Фланкирующих его участков приведена на рис. 7. Ны обнаружили одну открытую рамку считывания, первый стартовый кодон которой ка рис. 7 находится в положении +1. Перед этан АТС колонок на расстоянии в п. н. расположен потенциальный участок связывания с рибосомой (GGAGG) со свободной энергией спаривания с последовательности» Жайн-Дальгарно G=-66.5 кДх. Кодирующая последовательность заканчивается анбер стоп колонок в позиции +963. Таким образон продукт гена лихеназы в Б. coli(PCU402) представляет собой бедок. состояний из 320 аминокислот, с молекулярной массой 36190 Да. что полностью соответствует данным ПЛАТЕ.

Как и у других генов С. therroocellum 5' некодируюшая область гена лихеназы сильно обогащена А-Т остатками. Так на участке от -230 до -1 позиции GC содержание составляет 26. 9*. по сравнению с 41.2* внутри кодирусвей области.

На 5' некодируюием участке были обнаружены канонические проноторные последовательности -ю (ТАТААТ) в позиции -160 и предшествующая ей -35(TTGACA). Эти два промоторных элемента разделены нежду собой расстоянием в 17 нуклеотидов. что является оптимальным для промоторов Е. coll и Clostridium spp. и, поэтону. являются эффективным сайтом инициации, транскрипции, распознаваемым основными РНЕ полинеразани Е. coll и С. thermocellum. 16

-191

agttgacaatc

180 -160 -140

■ TGMGTTTATAGGATATMTTAAATCGAATTMCGCGTGTTAGTGGCTTAAAATACAGGG 120 -loo -ao

TTTGACGTTrATATATAlTrCTrrGAATTGTTACAGGAGC'ITTGCTGAACrrerrA/a^T.'T -60 -10 -го s.u. -i

TACCGCCGCTAAAGTATAAAAATATATnTATTTATATTATlXrACGGGAGGTATTlTTT

1 20 40 60

ATGAAAAACAGGCTMTTl'CATTATTAATGGCTTCCTrrcCTTTl^GTTrTGTCGGTAA'rr i HKHRV15!, LMASLLLVLSYI ПО лидерн. пепт. юс 120

GTTGCTCCTTTTTACAAAGCGGAAGCCGCAACTGTGGTAAATACGCCTTTTGTTGCAGTG 21 VAPFYKAIEAATVVNTPFVAV 140 1 160 180

TTTTCGAACTTTGACTCCAGTCAGTGGGAAAMGCGGAITCGGCGAACGGTTCGGTGTTC 41 FSHFDSSQUEKADWAHCSVK 200 220 240

AACTGTGTTrcGMGCCTrCACAGGTGACATTrrcGAACGGTAJW\ATGATTTTGACCCTT 61 HCVWKP SQVTFS HGKH I LTL 260 280 300

GACAGGGAATATGGCGGTTCATATCCGTATAAAAGCGGTGAATATCGTACAAAATCATTT 81 DREYGGSYPYKSGEYRTKSF 320 340 360

rrCGGATACGGTTAlTATGAAGTAAGAAl'GAAAGCTGCCAAAAACGTAGGAATTGTTTCA 101 F С У G У Y E V U M К А А К ¡I V G I V f> 3C0 катлл. Д0НС11 '100 420

TCTTTCTTCAC'ITATACAGGACCTTCGGACAACAATCCATGGGACGAAATCGATATCGAG 121 S F F T Y X G P S D H H 1' U D E 1 I) I E '140 460 430

TTnTAGGAAAGGACACAACTAAAGTTOAGTTCAACTGGTACAAAAATGCAGTCGGTGGA 141 F L G К I) T T К V U F H V Y К 11 G V G G 500 520 510

AACGAGTATTTGCACAATClTGGATTCGATGClTGCCAGGATTTTGATACATATGíjAlTr 161 H E Y L H N L G F D A S 0 1) F И T Y G F 560 bñO 600

GAATGGAGGCCGGATrATATAGACTrCTATG'lTGACGGCAAAAAAGTrTATCGTGGAACC 181 E V R P D Y I D F Y V D G К К V Y К G Т 620 Ь'10 660

AGGAACATACCTGTTACTCCCGGCAAAATTATGATGMTTTGTGGCCAGGAATAGGAGTG 201 RNIPVTPGKIMMNLWPGIGV 680 700 720

GATGAATGGTTGGGACGTTACGACGGAAGAACTCCTTTGCAGGCGGACrrACGAATATGTA 221DEVLGRYDGRTPLQAEYEYV 710 760 780

AAATACTATCCTAACGGTGTrCCGCAAGATMTCCTACTCCTACTCCTACGATrCGTCCT 241 KYYPNGVPQDH1PT PTl'T I A P 80Ö T его FrO-Thr-ßokc 840

TCTACTCCGACTAACCCTAATTTACCTCTTAAGGGAGACGTAAACGGCGACliGTCATGTT 261 ST PTiHPNLPLKGDVNGDGHV ' 860 S80 900

MCTCATCAGACTATTCATTATTTAAAAGATATTTGCTCAGGGTTA'ITGATAGATTCCCT 281 N S S D Y S L F К R Y I. I. R V I D R F P KOHC. ПОВТОР. 920 940 960

GTTGGAGATGCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAG 301VGDPQDGCGKHDKVVDSGSK 996 TAGCGA 321 •

Рисунок 7. нуклоотиднля последовательное гена лихенлзн с. thor-mocellura и анинокислотная последовательность его продукта. U.-предположительный сайт связывании риьосиии; подчеркнуты -10 и -35 проноторние области; | -гмиины структурных участкоп лихеназы.

При анализе последовательности гена лихепазы было обнаружено, что нами клонирована не полная копия данного гена и после сайта эндонуклеазы Sau3A в позиции 910 начинается последовательность ДНК вектора PBR322 кодяруювая 18 дополнительных аминокислот.

Структура лихеназы С. thenuocellum.

Как показано на рис. 7, на полученной нами аминокислотной последовательности лихеназы можно выделить несколько дискретных участков: Н-коидевой сигнальный пептид, каталитическую область, участок обогащенный Pro и Thr остатками и С-кондевой домен.

Последовательность первых 27 аминокислот представляет собой типичный сигнальный пептид секреторного белка. Положительно заряженный конец, следующий за ним, гидрофобный участок и сайт растепления сигнальной пептидазой. Сравнение структур различных лидерных последовательностей, в тон числе, зндо-глюкапазы CelZ С. stercorarium (Jaurus et al., 1966) и эндо-глюканазы С. acetobutyllcum (Zappe et al.. 1986) позволило нан локализовать место отщепления сигнального пептида в позиции А1а27.

Нежду 252 и 264 аминокислотными остатками расположен так называемый Рго-ТЬг-бокс, т. е. последовательность сильно обогашенная пролинон и гидроксиаминокислотами, которая, как считают, выполняет роль подвижной связки между каталитическим и некаталитическим доменами и обнаружена г ряда пеллюлаз и ксиланаз (Knovies et al., 1967). Этот неждоненный участок, по видимому, значительно непее зашииен от воздействия протеаз. особенно в гетерологичных хозяевах.

С-концевой домен реконбинантной лихеназы состоит из 56 аминокислот, причем 1в последних транслируются с последовательности вектора РВЕ322. Это связано в нашем случае с процедурой клонирования гена лихеназы. Этот домен содержит высоко - консервативный участок из 25 аминокислот (от 272 до 29б а. а.), который составляет первую половину консервативного повтора обнаруженного во многих целлюлолитических Ферментах С.

thermocollum mazlevood et ai.. 1993) и не влияюпего на Ферментативную активность.

Сравнение аннпокнслотной последовательности лихеназы с. thermocellum с другини эндо-глюканазамн. При сравнении аминокислотных последовательностея нами била обнаружена значительная гомология между клталитическин доменок лихеназы с, thermoceliuja (позидии а. к. 28-251) и разлнчныни бациллярными лихеназами.

Организм процент идентичности

В. зиъииз - 53. 5 У.

а amrlollquefaclens - 51.6 х а тасегапз - 58.4 г.

а lichenoformis - 54.1 л

Н1А16-Н) « - 58, 3 Z

• - (Гибридный белок - лихеназа а тасегапз. 16 я-кондевых а. к. каталитического домена которой замешены на 16 а. к. а aa/loliTaefaciena (Olsen et al.. 1991)).

процент идентичности при сравнении последовательностея вычисляли как отношение количества идентичных аминокислотных остатков к обшему количеству а. к Ножно отнетигь абсолютное совпадение первичных структур обоих белков в районах аминокислот формирующих активные центры Фегнентов и сайт связывания иона Ca . при таком высоком проценте гомологии нежду белками ножно утверждать о большой сходстве их третичных структур и нехапизма действия, такин образом, как и в случае бациллярной лихеназы из штанна Н(Мб-Н) (Keitel et al., 1993). каталитический домен лихеназы с. thermocellum состоит из двух бета слоев, образующих компактную сендвич-подобную структуру, в свою очередь, каждый слой сформирован семью антипараллельными бета-тяжами. изгиб бета-слоев и некоторых петель образуют с одной стороны Фермента канал, одна стенка которого состоит в основной из кислотных основания, а другая обогашена ароматическими составляющими, в канал активного центра понешаются два глюкозных пеллобиозшшых.

остатка.

как у понималось ранее (г. г. 3. г. ). с-конпевой домен лихеназы с. thermocel1иш содержит консервативный прямой повтор из £5 а. к., характерный почти для всех иедлюлолитических Ферментов, входяпих в состав деллюлосомы с. tbermocelium (рис. ö) (Besinn, 1990). с поношью дедетаенного анализа было показано, что этот повтор не влияет на энзинатическую активность. Наиболее вероятно, что этот домен каким-то образо^ взаимодействует с карбоксигидратнои цепью гликопротеинооого кора деллюлосокы. Обе части повтора содержат последовательности похожие на Са2+-связывавшие донены (рис. 8). Не исключено, что ионы Ca2* могут структурировать этот участок полипептидной цепи и/или влиять на взаимодействие Фернента и деллюлосонного кора.

■<#■** Я Л I KU««* III««« к

l1cb .. FLKGDVKGDGHVHSSDYSLFTRYLLRVIDRFPYGD-QS-

CelA . . WYGDVHGDGHVUSTDbTHLKKYLLISVTHIKRE-----

CelH . . VTYGDVHGDGRVKSSDVAI.LKRYLLGLVENINKE-----

CelD . . VLYGDVNDDGKVHSTDLTbLKRYVLKAVATLFSSKAEK-CelE . . ILYGPVNGDGKIHSTDCTHLKKYILKGIEEFPSPSGII-CelH . . IKHGÜ1 yHKDHAVHSTDLI.HLKRYILKSLELGTSEHEEKF XYnZ . . TGLGDLNGDGN1 NSTDLQALKRHLL.G ISPL-TGEALLR-

i*i# «1 II III IIIIII l

—vadvh r dgri dstdl.thlkr ylir аipsl

--aadvhrdgaihssdhtilkryliksiphlpy --aadvnvsgtvnstdlaihkryvlrsisklpyk --nadvkrdgridssdvtilsrylirvieklpi --aa dvh/ldlki nstdlvlhkkyllr5i dkftae. . . kkaadi.hrdkkvdstdlt ilkryllkai sei pi ---advnrsgkvdstdysvlkryilriitefpgq. . .

Рисунок О. Сравнение аминокислотных последовательностег консервативных повторов лихеназы. пяти целлюлаз и ксиланазы С. гьегтосе11ит. подчеркнуты последовательности са2+ связывают« участков; «•«»»» - высоко консервативные участки.

целлюлосокная локализация лихеназы С. «шгтосеПшп.

При определении локализации лихеназы С. шегтосепшп 1 деллюлосоме. были использованы поликлоналыме антител; 20

l1cu

CelA celB celD CeiE сеш xynz

полученные против рекомбкнантпого Фернснта, выделенного из Е. сон (рсичог), после ;:ГЗ-ПАЛГЕ цсдлг.лосошмх препаратов и клеточного экстракта С. '.hers>ocel iura был пиполчен перенос белков на нитроцеллюлоэную нс.чбрану и проведено иинуыохимическое окраяинание полученной реплики. Как видно на рис. 9 на обеих дорохках с целлюлосомшни препаратами шисутствует сильно окрааенная полоса, соответствующая «слку с молекулярной массой около 35C0Q. ста величина совпадает с молекулярной массой неукороченной лихенззн С. thermoce) inn; без сигнального пептида, которая, по данный сиквснса гена 1KB (Schimm na et а!.. 19921. равна jsОЫ. п качестве положительного контроля ми использовали частично очииенныл клеточный экстракт к. сои Tfil (рсичог). Основная uosoca на контрольном пгепарате распологаетсп на уровне 29-30 кДа. и соответствует лихен-азе без С-копиевого домена. Остальные окрааешше полосы объясняются недостаточной очисткой препарата рекомбинаитноя лшенази от белков • Е. сои. использованного для получения поликлональных антител.

Таким образом, нами показано, что лихеназа С. thermocel1иш входит в состав пеллюлосомного комплекса.

2 3 U

97 -

Рисунок 9. вестерн блот с исполь-

зованием яоликлонаяьных антител,

полученных против лнхеназы С.

tbenDOceilun.

66 -45 - •

1 - клеточный экстракт Е. coll

(rcuw);

4 - клеточный экстракт с. therco-

2 и 3 - деллюлосошше препараты;

сепшз.

После описания деллюлосомной локализации ксилапазы Хуп2 (Сгерше! е1 а].. 1988). это первый результат доказывающий Факт вхождения неделлюлолитической 1.3-1.4- бета-глюканазы в этот сложный нультифернентный кокплскс. наличие бета-1.3-1.4-глюкаполитическои и ксиланолнткческой Ферментативной активности в пеллюлосоме с. 1ьегпюсе11ша означает, что эта органелла участвует не только в гидролизе целлюлозы, но и в деградации других полисахаридов.

ВЫВОДЫ

1. из клонотеки с. tiiermoceiium Ф7 отобран клон продуцирующий термостабильную бета-глюканазу, сконструированы рекомбинантные плазниды PCU402 и рсиюз несущие фрагнент ДНК с. thermocellum определяющий синтез данного Фермента.

2. на основе итамна е. coll К12 получен продуцент терностабильной бета-глюканазы С. theraocellum. выход фермента составляет зоооо ед/л среды (здесь и далее по тексту при определении активности в качестве субстрата использовали лихенан).

3. терностабильная бета-глюканаза из рекомбинантного штамма Е. coll TGI (PCU402) очишена до гомогенности и определены ее основные биохимические характеристики: тенпературный оптимум -то°С; оптинун рн - 8. 5; pi - 5. 3: кн - 2. 5 нг/нл; удельная активность - 12000 ед/мг; молекулярная насса - з&ооо.

4. На основании данных вискозинетрического теста, анализа субстратной специфичности и основных продуктов гидролиза лихенана и ламинарина бета-глюканаза с. thermocellum охарактеризована как эндо-1.3-1.4-бета-д-глюкан-4-глюкан-гидголаза (ЕС 3,2.1.73) или лихеназа.

5. Создан продуцент терностабильноя лихеназы с, thermocelium на основе штанна a subtil is AJ73. показапо. что во синтезирующейся лихеназы выходит в культурэльную жидкость, при этом происходит отшепление лидерного пептида, продуктивность полученного пгганна - íooooo ед/л среды.

6. Определена нуклеотидная последовательность гена лихеназы с. therraocel lum. открытая райка считывания кодирует белок состоящий из зго аминокислот, обшей кассой 36190 да.

7. на основе анализа нуклеотидной последовательности гена определена структура лихеназы с. therraocellum. данный Фернент состоит из Н-конпевого сигнального пептида (1-27 а. к), каталитического донена (£8-251 а. к.), нехдоненного участка обогащенного Pro. ТЬг и Ser (252-26% а. к. ) и С-конпевого некаталитического донена (255-320 а.к.).

8. Обнаружена значительная гомология каталитического домена лихеназы с. thermocellum с известными бациллярными лихеназани. идентичность аминокислотных последовательностей колеблется от 52 до 58 x.

9. Впервые показала целлюлосонная локализация лихеназы -Фермента расшепляюоего только полиглюканы со смешаяныни 1.3- и 1.4-бета связяни. Наличие бета-1.3-1.4-гдюканолнтнческои Фернентативной активности в деллюлосоме С. thermoceiiiua означает, что эта оргаиелла участвует не только в гидролизе целлюлозы, но и в деградации других полисахаридов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. великодворская Г, А.. Царейюшз Я. К.. Зпердов В. В.. Лаптев Д. А., Нетт В. Л. "Реконбинаитная плазнидная ДНЕ PCU401, кодиругстая 1. з- (1. з: 1.4) -бетта-Д-глхжан-з-гдсканог-идролазы. способ ее конструирования к штанн бактерий Е. со И продуцент 1. 3- (1. 3:1.4) -бегга-д-глисан-з-глюканогидродазы. * а/С Н 1656868 от гв, 07. 89

г. Г. А. ведккольорскдя. в. в. Звердол , д. А. Лаптев, в. л. нетт. 3. С. Пнрузян. "Клонирование и некоторые свойства гена Uh 1, кодирующего новую эндоглгжаназу С. theriaocel lum «7.* -БИОТеХНОДОГИЯ. 1990. Н4. cm 19-19.

3. д. А. Лаптем, в. в. зверлов. в. л. нетт. э. с. пирузиц •характери-эачия новой эндоглюканази Clostridium thensoceilum -перспективного антигрибкового агента для зэииты растений." тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии". Пушимо. 1990, стр. 43.

4. звердов В. В.. Маркин П.П. 'Экспрессия гена термостабильноя ланннагннази с. ihermoceilum о клетках a subtilis." -Тезисы V конференции РФ "Новые направления биотехнологии". пушило. 1992. стр vie.

5. zverlov V. Y.. vel lhodvorsKaJa G. A. "Clonins of thermostable laruinarmaae eene of Clostridium thernsocellum. " Abstracts of £0th nee tine of the febs. Budapest. Hungary. 1990, p. 347.

6. V. V. Zverlov. G. A. VellKodvorsKara "Cloning the Clostridium thcrmocel 1шо thensiostable laminarmase aene in Escherichia coll,- the properties of enzrae thus produced. * - Biotechnol. Lett., 1990. V. 1г. К 11. Р. 811-816.

7. zverlov V. v.. Laptev V. A.. TishKov v. I. , ve 1 lKodvorsKara G. A. •nucleotide Sequence of the Clostridium thermocellua Laminarmase Gene." - Blochera. ВЮрьуз. Ses. CoimRin. ■ 1991. V. 181, P. 507-512.

8. V. V. Zverlov. K. F. Fuchs, v. H. schvarz. G. A. veiiKodvorsKaya "Purification and cellulosoroal Localisation of Ciostridiua thermocellum mixed unKaee beta-«lucatiase LicB (l. 3-1.4-beta-D-fllucanase). " - Biotechnol. Lett.. 1993. tin press).