Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках

Салехи Джузани Голам Реза

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках"

На правах рукописи

Салехи Джузани Голам Реза

Сравнительный анализ экспрессии дативного и модифицированного генов сгуЗш ВасШт &ипп§геп$18 в прокариотических и эукариотических клетках

03.00.1S - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Элеонора Суреновна Пирузян ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Прозоров кандидат биологических наук Александр Александрович Соловьев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП "ГосНИИгенетика").

Защита состоится " " 2005г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д002.49.01. при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Автореферат разослан "__"_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.II. Полухина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертационной работы: Открытие в начале XX века инсектицидного действия токсинов Bacillus thuringiensis (Bt) имело важные последствия в вопросе защиты растений от насекомых-вредителей. В последующие десятилетия дня защиты растений от насекомых применялись, и по настоящее время применяются, биологические препараты, основой которых являются эти микроорганизмы и/или их метаболиты. Действующие агенты биопрепаратов являются компонентами природных биоценозов, что объясняет их относительную безопасность для окружающей среды, человека, животных, птиц, рыб и полезной энтомофауны. Следующим знаменательным событием, предопределившим ход событий в защите от насекомых, было создание растений, которые сами продуцировали данные токсины (Cry-белки). В настоящее время получены трансгенные растения кукурузы, картофеля, хлопка, риса, экспрессирующие cry-гены. Экспрессия нативных «у-генов Bacillus в растениях, даже при переносе делеционных вариантов нативных генов, которые кодируют только токсическую часть белка, малоэффективна. Причина низкого уровня экспрессии этих генов в эукариотических системах обусловлена рядом факторов. Во-первых, относительное содержание А+Т в ДНК Bacillus значительно выше, чем таковое в эу кар йотах, и в растениях в частности. Высокое содержание А+Т характерно для сайтов сплайсинга, полиаденилирования (polyA), сигналов деградации мРНК, и сайтов терминации транскрипции. Во-вторых, частоты использования кодонов в генах, которые кодируют токсины Bacillus, значительно отличаются от таковых для эукариот (дрожжей, растений). При замене нуклеотидов в последовательностях Bacillus синонимичными кодонами растений экспрессия модифицированных генов в растениях значительно увеличивается

В настоящее время для идентификации трансгенов используется целый арсенал молекулярно-биологических методов: Нозерн- или Вестерн-блот гибридизация, визуализация РНК или белка in situ, определение ферментативной активности белкового продукта (если таковая имеется), и ряд других. Однако эти методы исследований в большинстве случаев требуют больших затрат времени, реагентов, а также специального оборудования, и исследователи для изучения структурно-функциональных характеристик интересующих их последовательностей часто используют стратегию репортерных систем. Используя репортерные системы, можно определять как уровень экспрессии исследуемых генов (транскрипционные репортеры), так и локализацию их продуктов (трансляционные репортеры). Такие исследования проводятся с использованием гибридных последовательностей, которые состоят из последовательности интересующего исследователя гена, слитого в рамке считывания с последовательностью репортерного гена. Это значительно облегчает проведение исследований, поскольку зачастую проще определить продукт репортерного гена, нежели продукт исследуемого гена. Ранее в нашей лаборатории была разработана репортерная система на основе термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum (Piruzian et al, 1985, 1998, 2000, 2002) Свойства лихеназы

соответствуют многим требованиям, предъявляемым к репортерным белкам. Лихеназа -термостабильный белок с температурным оптимумом 70°С, имеет небольшой размер (28 кДа), высокую удельную активность. Эти свойства позволяют тестировать ее активность простыми, и чувствительными методами. Помимо этого, лихеназа сохраняет свои основные свойства -активность и термостабильность - при значительных достройках в N- и С-концевых областях белка, что позволяет ее использовать как трансляционный репортер.

В настоящее время проблемы биобезопасности трансгенных растений, в том числе экспрессирующих cry гены, являются актуальными, Cry белки изучаются достаточно долго, и не являются токсичными для млекопитающих, птиц, амфибий, рептилий, и очень специфично влияют на определенные группы насекомых и беспозвоночных вредителей. В то же время, наиболее острым остается вопрос неконтролируемого переноса генетической информации от трансгенов в окружающую среду, в дикорастущие растения, в том числе сорные. Несмотря на многочисленные исследования, этот вопрос пока не до конца разработан. В связи с этим разработка новых подходов, позволяющих производить такие исследования быстро, точно и с минимальными затратами является актуальной.

Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЪ& в клетках про- и эукариот. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Клонирование нативного гена сгуЗа, определение его нуклеотидной последовательности и анализ последовательности ауЗг гена.

2. Модификация последовательности гена cryla. с помощью компьютерных программ для эффективной экспрессии в клетках эукариотах (дрожжи и растения).

3. Химический синтез и клонирование фрагментов модифицированного гена с последующей проверкой корректности сборки последовательности модифицированного генасгуЗаМ секвенированием.

4. Конструирование бактериальных и дрожжевых экспрессионных векторов, в которых нативный и синтетический гены слиты с новым универсальным репортерным геном /г'сВМ2, кодирующим термостабильную лихеназу.

5. Сравнительное изучение экспрессии нативного, модифицированного и гибридных генов в клетках Е. coli и дрожжей.

6. Проведение биотестов на личинках первого возраста колорадского жука (Leptinotarsa disemlineata) с использованием белковых экстрактов, полученных из дрожжевых траисформантов.

7. Конструирование растительных экспрессионных векторов, в которых <т>'ЗаМ и гибридный сгуЪйЫ-ИсВШ. гены находятся под контролем светоиндуцибильного промотора малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana и последовательности лидерного пептида гена РБФК гороха.

8. Получение и молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЗеМ и ауЪ&Ы-ИсЪЫ2 гены.

9. Проведение биотестов первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЪъМ и со'ЗаМ-/гсВМ2 гены, с использованием личинок колорадского жука.

Научная новизна работы Впервые термостабильную лихеназу (LicBM2) успешно использовали в качестве трансляционного репортера для проведения сравнительных исследований экспрессии нативного и синтетического белков С^За в клетках про- и эукариот. Показано, что термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Для эффективной экспрессии в клетках эукариот ген сгуЪг (сгуЗаМ) был модифицирован и проведен его синтез и клонирование с использованием новой стратегии. Показано, что модификация последовательности сгуЗа гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот (дрожжи, растения) с сохранением биологической активности белкового продукта. Впервые для экспрессии модифицированного cryЗаМ и гибридного ау2зМ-1кВМ2 генов в растениях картофеля был использован светоиндуцибильный промотор малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana, который обуславливает преимущественную экспрессию контролируемого им гена только в зеленых тканях растения (листьях) - органах-мишенях для личинок колорадского жука.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на XYII European Association for Research on Plant Breeding Conference on "Genetic Variation for Plant Breeding" (Tulln, Austria, 2004); International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (10BC) Conference on "Breeding for plant resistance to insects, mites and pathogens" (Bialowieza, Poland, 2004); 9th Iranian Students Seminar in Europe (Birmingham, UK,

2002); 2"' International Seminar presentation on "Innovational scientific- technical projects of Biotechnology" (Pushino, Russia, 2003); 3th Iran- Russia International Conference on " Agriculture and natural resources" (Moscow, Russia, 2002); 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE) (Manchester, United Kingdom, 2004); 4th International Iran and Russia Conference on " Agriculture and Natural recourses" (Sharekord, Iran, 2004); 3th international scientific conference on "Biotechnology in plant and animal production, and veterinary" (Moscow, Russia, 2004); International scientific conference on "Molecular genetics, Genomics and Biotechnology" (Minsk, Belarus, 2004); 11ш International Congress on "Molecular Plant-Microbe Interactions" (Saint-Petersburg, Russia,

2003); Международной конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции" (Almata, Kazakhstan, 2003); III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке, Современное состояние и перспективы развитая" (Москва, Россия, 2004); Международной конференции "Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология" (Minsk, Belarus, 2004); II Конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. H.H.

Вавилова "Актуальные проблемы генетики" (Москва, Россия, 2003); Конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России (Москва, Россия, 2003); на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 38 рисунков, Список цитируемых литературных источников включает 207 наименований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПО ГЛАВАМ ГЛАВА 1. Обзор литературы. Приводятся литературные данные об общих характеристиках бактерии Bacillus thuringiensis (Bt). В первом разделе приводится: описание видов токсинов, образующиеся в i3t, классификация штаммов и cry генов Bt, а также частные вопросы генетики и молекулярной биологии Bt. Во втором разделе рассматриваются транскрипционные, постгранскрипционные и посттрансляционные механизмы экспрессии cry генов (преимущественно, с/уЗа), приводится описание процесса кристаллизации инсектицидных белков, в сравнительном аспекте приводятся данные о структуре токсинов Bt. В третьем разделе описаны механизмы действия Cry токсинов. В четвертом разделе суммированы современные литературные данные об использовании Cry белков для контроля численности вредителей и защиты растения, разработке новых биопестицидов, основанных на Bt, экспрессии cry генов в растениях, устойчивости насекомых к токсинам Bt, управлении устойчивостью насекомых к Bt токсинам. В пятом разделе суммированы литературные данные о структуре, механизме действия, трехмерной структуре, топологии активных центров лихеназы Clostridium thermocellum, и сведения об использовании этого фермента в качестве нового транскрипционного и трансляционного репортера в прикладных и фундаментальных исследованиях.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

В работе использованы штаммы: Е. coli XLl-Blue ("Stratagene"): F'::TnlOta, proA+B+, lacIQ, D (lacZ)M15/recAl, end AI, gyrA96, thi, hsdR17, (rk-mk+ ), supE44, relAl, lac; и BL21(DE3) ("Novagene", USA): F, ompT, hsdSa (гй-,тв-), gal, dem (DE3); Asrobacterium tumefaciens AGLO (recA:bla pT®o542AT, Mop+, CbR), Saccharomvces cerevisiae YPH 857 (Mata, ade 2-101, lys 2-81, ura 3-52, trp 1-63, leu 2-1, his 3-200). В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые проводились согласно методическому руководству Sambrook et al. (1989). Синтез и конструирование модифицированного гена егуЗа. Комплементарные фрагменты длиной 50-55 звеньев были синтезированы фосфоамидитным

методом и очищены электрофорезом в ПААГ. После лишрования комплементарных фрагментов проводили достраивание ДНК-полимеразой и конструирование четырех двухцепочечных фрагментов длинной около 500 п.н. Далее осуществляли конструирование последовательности модифицированного гена сгуЗаМ за счет последовательного клонирования четырех полученных фрагментов в промежуточный плазмидный вектор.

Растения. Использовали растения картофеля Solanum tuberosum сорта Десница и Юбилей Жукова. Агробактериальнуго трансформацию растений картофеля проводили по разработанному нами методу из микроклубней. Отбор трансформантов и дальнейшее их поддержание проводили на среде MC с добавлением 50-100 мкг/мл канамицинсульфата. Молекулярио-биологический анализ первичных трансформантов растений проводили с использованием методов ПЦР, а также количественных и качественных методов определения активности лихеназы.

Методы определения активности лихеназы. Количественное определение лихеназной активности в бактериальных, дрожжевых и растительных белковых лизатах проводили по методу Miller et al. (1960), модифицированному нами. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров за 1 мин. Зимограммм получали разделением белков в 10% или в 8-16% ДСН-ПААГ, содержащем субстрат лихенан, с последующим окрашиванием гелей 0,5% раствором Конго красного (Sigma) и отмыванием в IM NaCl. Активность лихеназы в дрожжевых и бактериальных колониях методом чашечного теста проводили согласно Teacher & Wood (] 982).

Белковые лизаты для определения активности лихеназы получали разрушением клеток в 50мМ трис-HCI, pH 8,0 ультразвуком, с последующим центрифугированием при 12000g в течение 30 минут для получения осветленных препаратов.

Инсектицидную активность рекомбинантных белков в дрожжевых экстрактах и кристаллах Bt var tenebrionis тестировали на личинках первого возраста колорадского жука (Leptinotarsa disemlineata). Анализ растений картофеля на устойчивость по отношению к личинкам первого возраста колорадского жука проводили in vitro.

Статистическая обработка данных. Данные в таблицах и на рисунках представляют средние арифметические величины и стандартные ошибки, полученные при обработке результатов 5 независимых экспериментов, если не указано особо.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена сгуЪл и структуры его белковой молекулы

Первоначально, используя базу данных NCBI, был клонирован укороченный (нативный) ген сгуЗа Bt var. tenebrionis (1810 п.н) с делецией в 5'-коицевой области длиной 144

п.п. Известно, что эти нуклеотиды кодируют 48 а.о., которые отщепляются с N-концевой области полноразмерного белка (73 кДа), что приводит к формированию белка с молекулярной массой 65 кДа. Следует отметить, что такая модификация увеличивает токсичность белкового продукта Далее, был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена ауЪг с использованием компьютерных программ и баз данных: GENSCAN (поиск интронов, поли А сигналов); Codon Usage Database; Countcodon program; для выравнивания (alignment) ДНК и аминокислотных последовательностей применяли программы Blastn и Blastp Проведенный анализ показал, что нативный ауУа ген содержит более 50% кодонов, которые редко используются эукариотическими системами (дрожки, растения). G+C состав в этом гене составляет 37%. Помимо этого, было выявлено 24 потенциальные области полиаденилирования и 12 сигналов деградации мРНК (табл. 1), поэтому для эффективной экспрессии в клетках эукариот необходимо было модифицировать нуклеотидную последовательность этого гена.

Таблица 1. Сравнительный анализ последовательностей генов сгуЪл и сгуЗаМ Гены

Отличие в последовательности нуклеотидов (от нативного гена), %

Оглнчис кодонового состава (от нативного гена), %

G+C состав7(%)

Потенциальные сайты полиаденилирования, шт Сайты дефадации мРНК (АТТТА). шт.

3.2. Модификация последовательности гена сгуЗя для эффективной экспрессии в эукариотах и химический синтез модифицированного гена (сг^ЗаМ)

Используя свойство вырожденности генетического кода и Codon Usage Database, мы модифицировали кодоновый состав с/уЗа в соответствии с частотой использования синонимичных кодонов в растениях картофеля. А именно, заменили редко использующиеся в растениях сочетания динуклеотидов (CG и ТА) в позициях «2» и «3» кодонов. Нуклеотид G, в позиции «3» кодонов, кодирующих треонин, пролин, аланин и серии, практически не использующийся в растениях, был заменен на синонимичные для данных кодонов нуклеотиды. Кроме того, были изменены и потенциальные сайты сплайсинга и терминации транскрипции. Проведенная модификация позволила увеличить содержание G+C до 49% (табл. I). Нуклеотидная последовательность гена была проанализирована на наличие сайтов рестрикции. Это позволило разбить ген на четыре фрагмента, без изменения его белковой последовательности. Фрагменты модифицированного гена были синтезированы (Evrogen, Россия) и обозначены нами соответственно, как Fl, F2, F3 и F4. Для получения синтетического гена осуществляли последовательное клонирование фрагментов в плазмиду pGEM-Teasy. Модифицированный ген был обозначен нами сгуЗаМ (Рис. 1).

егуЗ а _ ciy3 аМ _

350/1812(20%) - __ 320/597(54%)

*37 .............49"..........

24 0

12.....~Т

Ndel Xbal

457 44 - ......... < .. .....- ~

BamHI Bsu36l Xhol

Рис.1. Схема последовательности модифицированного гена сгуЗаМ, состоящего из четырех синтетических фрагментом

3.3. Конструирование прокариотических и эукариотических экспрессионных векторов

Ген сгуЪа кодирует белок, ме обладающий ферментативной активностью, за счет которой можно определить как уровень его экспрессии (количественно), так и молекулярную массу белкового продукта. Для сравнительного исследования эффективности экспрессии нативного и модифицированного сгуЗа генов в клетках про- и эукариот в качестве трансляционного репортера была использована термостабильная лихеназа. Методами молекулярного клонирования были сконструированы гибридные гены cry3a.-licBM2 и сгуЗаМ-//сВМ2. Нативный ауЗа, модифицированный с/уЗаМ и гибридные гены были клонированы в экслрессионные вектора для 'фансформации клеток E.coli: pET32-cry3a, pET32-cry3aM, рЕТ32-со'За-/;сВМ2 и рЕТ32-стуЗаМ-//сВМ2; и дрожжей: pGal-cA>>3a-//cBM2 и pGal-o>,3aM-//cBM2 (рис. 2).

Рис. 2. Схема бактериальных (pET32-cr>'3a-//cBM2 и рЕТ32-£туЗаМ-йсВМ2) и дрожжевых (pG ЛI .-сгуЗй-ИсВ М 2 и pGAL-£xj>3aM-IicBM2) экспрессионных векторов. Т7-бактериальныи промотор Т7-ДНК-пол имеразы, Gal - индуцибельный дрожжевой галактозный промотор, poIyA - сигнал полиаденилирования, //сВМ2 - ген лихеназы

3.4. Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов с/уЗа в клетках Е.соИ и дрожжей

Для того, чтобы провести сравнительные исследования экспрессии нативного и синтетического генов ауЗа в прокариотических и эукариотических клетках были получены бактериальные (штамм Е.соИ В121) трансформанты, несущие плазмиды рЕТ32-с/^За, рЕТ32-

со-'ЗаМ, рЕТ32-/;сВМ2, рЕТ32-сг>За-//сВМ2 и рЕТ32-с/уЗаМ-//сВМ2, а гакже дрожжевые фансформанты, несущие плазмиды рСАЬ-с/тЗа-//сВМ21 рО А 1.-сг>>3аМ-//сВ М2 и рСАЫ/сВМ2.

Первоначально, бактериальные и дрожжевые трансформанты были проанализированы методом чашечного теста (рис. 3). Активность репортерного белка лихсназы обнаружена только у трансформантов, несущих плазмиды, которые содержали последовательность гена //сВМ2 или гибридных генов сгуЗа-ИсВМ2 и стуЗаМ-//сВМ2 (рис. 3).

Для того, чтобы показать, что в бактериальных и дрожжевых трансформантах происходит образование белковых продуктов, белковые экс-факты всех трансформантов были проанализированы методом ПААГ электрофореза (рис. 4А и 5А). Как видно из представленных результатов, в бактериальных трансформантах происходит образование белковых продуктов СгуЗа и СгуЗаМ с молекулярными массами - около 77 кДа, гибридных СгуЗа-УсВМ2 и СгуЗаМ-ЫсВМ2 - около 105 кДа, лихеназы (УсВМ2) - 42 кДа, что соответствует теоретически рассчитанным молекулярным массам белковых продуктов при использовании плазмид системы экспрессии рЕТ32 (рис. 4А). Следует подчеркнуть, что при экспрессии с плазмид системы рЕТ32 молекулярная масса синтезируемого белка увеличивается примерно на 14 кДа. Это обусловлено присутствием в плазмидах последовательностей, которые кодируют пептиды, используемые либо для очистки, либо для идентификации рекомбинантного белка. Поэтому, при использовании дрожжевой системы экспрессии истинная молекулярная масса белковых продуктов СгуЗа и СгуЗаМ составила 63 кДа, СгуЗа-ЫсВМ2 и СгуЗаМ-ЫсВМ2 - 91 кДа, ЫсВМ2 - 28 кДа (рис. 5А), что соответствует теоретически рассчитанным молекулярным массам данных белков, согласно данным аминокислотных последовательностей нативного, модифицированного и гибридных белков.

Методом зимограмм было показано, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет свои свойства, а именно термостабильность и активность, и по активности лихеназы можно судить о молекулярной массе гибридных белков (рис. 46 и 56).

Рис. 3. Чашечный тест бактериальных трансформантов. экспрсссирующих ген //сВМ2 (I), гибридный стуЗа-//сВМ2 (2), гибридный с/уЗаМ- //сВМ2 (3), и отрицательный контроль (4).

Рис. 4. Электрофореграмма (А) п шмограмма (Б) бактериальных белковых экстрактов. М - маркер молекулярных масс; К - рЕТ32(а); I - LicBM2 (лихеназа); 2 - кристаллический СгуЗа, полученный из Bt var. tenebrionis; 3 - СгуЗа (нативный); 4 - СгуЗаМ (модифицированный); 5 - Cry3a-LicBM2; 6 - €ry3aM-LicBM2. Стрелочками указаны соответствующие белковые продукты (А) и просветленные полосы активности лихеназы (Б).

При анализе зимограмм выявлены полосы активности лихеназы только у бактериальных и дрожжевых трансформантов, несущих плазмиды, которые содержали последовательности licQMl гена или гибридных генов сгуЗа-//сВМ2 и стуЗаМ-//сВМ2 (рис. 4Б и 5Б). Как видно из результатов зимограммы, в бактериальных и дрожжевых трансформантах происходит образование белковых продуктов с молекулярными массами, которые соответствуют теоретически рассчитанным (рис. 4Б и 5Б).

118 85

50 33 26

I > , Ii* ** >'

ЩШШШШт

■пшНвШ

ШШШШ

■шар

.91

; д -

Рис. 5. Электрофореграмма (А) и зимограмма (Б) белковых экстрактов, полученных из клеток дрожжей. М - маркер молекулярных масс; 1, 6 - СгуЗаМ-ИдсВМ2; 2, 5 - СгуЗа-ЬкВМ2; 3, 7 - ЫсВМ2; 4, 8 - рСа1.

Не выявлено эндогенных активностей лихеназы в экспериментах по качественному (чашечные тесты, зимограммы) и количественному определению активное™ лихеназы в бактериальных и дрожжевых трансформантах, содержащих контрольные плазмиды, а также в штаммах бактерий и дрожжей дикого типа.

Для того чтобы показать, что использование лихеназы, как трансляционного репортера, альтернативно применению других молекулярно-биологических методов идентификации рекомбинантных белков, бактериальные и дрожжевые белковые экстракты были проанализированы методом Вестерн-блот гибридизации (рис. 6). Как видно из представленных результатов, молекулярные массы гибридных белков, определенные как с помощью Вестерн-блот гибридизации, так и методом зимограмм, совпадают (рис. 4Б, 5Ь, 6). Таким образом, при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортера, метод зимограмм может использоваться вместо Вестерн-блот гибридизации, как более простой и менее дорогостоящий подход, не требующий получения антител.

1 Л2 . 3 4 5 6

105

91 '"V .. . .

75 t .

Рис. 6. Вестерн-блот гибридизация с использованием белковых экстрактов дрожжевых и бактериальных трансформантов. I, 2, 3 - СгуЗа, Cry3a-LicBM2, Cry3aM-LicBÍVI2, выделенных из клеток E.coli; 4 и 5 - Cry3aM-LicBM2 и Cry3a-LicBM2, выделенных из клеток дрожжей; 6 - кристаллический СгуЗа

Далее, были проведены сравнительные исследования по экспрессии гибридных генов и стуЗаМ-/гсВМ2 в клетках прокариот и эукариот. Об уровне экспрессии гибридных генов судили на основании данных количественного определения активности лихеназы, входящей в состав гибридных белков (рис. 7). Видно, что в клетках E.coli уровни экспрессии гибридных генов сгуЗа-/гсВМ2 и сгуЗаМ-/гсВМ2 сравнимы, и составляют 5% от таковых для репортерного гена /УсВМ2 (рис. 7А). Возможно, это объясняется тем, что как нативный сгуЗа, так и синтетический сгуЗаМ гены содержат в своей последовательности относительно редко использующиеся в клетках E.coli кодоны (данные в автореферате не приводятся). В клетках низших эукариот 5. cerevisiae уровень экспрессии гибридного стуЗаМ-/;сВМ2 гена, в состав которого входит последовательность модифицированного гена, значительно выше, чем уровень экспрессии гибридного сгуЗа-ИсВМ2 гена, в состав которого входит последовательность нативного гена (рис. 7Б). Так, уровень экспрессии гибридного гена cry3ä-licBM2, рассчитанный по активности лихеназы, составляет 5%, а уровень экспрессии гибридного cry3'áM-licBM2 гена, с оптимизированным для экспрессии в эукариотах кодоновым

составом, составляет 50%, относительно уровня экспрессии репортерного гена licbMl (рис. 7.Б). Полученные результаты позволяют заключить, что проведенная модификация последовательности сгуУл гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках модельных эукариот-дрожжах.

120

100

Ё (SO

Р 40

о1----Ь—-1---ЕГЭ-1----а------1___I—■ I к'-!

I 2 Я 12 3

Рис. 7. Уровень экспрессии гибридных генов сгуЗя-ПсЗМ2 и сгуЗаМ-//сВМ2, рассчитанный по активности термостабильной лихеназы. а - в клетках Е.соИ, б - в клетках дрожжей. 1 -ГлсВМ2 (лихеназа); 2 - СгуЗа-1ЛсВМ2; 3 - СгуЗа-М-исВМ2

3.5. Биотесты белковых экстрактов дрожжевых трансформантов Cry3a-LicBM2 и СгуЗаМ-LicBM2 на личинках колорадского жука

Для того, чтобы проверить сохрашет ли биологическую активность СгуЗаМ белок в составе гибридного белка Cry3aM-LicBM2, были проведены сравнительные исследования по эффективности инсекцитидного действия гибридных Cry3a-LicBM2 и Cry3aM-LicBM2 белков на личинки (первого возраста) колорадского жука с использованием биотестов in vitro на молодых листьях растений картофеля. Для этого, листья картофеля с двух сторон обрабатывали дрожжевыми белковыми экстрактами, содержащими равные концентрации суммарного белка, и помещали в чашки Петри. Далее на каждый лист размещали по 5 личинок и частоту их гибели определяли через 5 дней. Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 8 и в табл.2. Следует подчеркнуть, что среднесмертельная концентрация (LC50) дрожжевых экстрактов, содержащих Cry3aM-LicBM2 белок, сравнима с положительным контролем (кристаллический СгуЗа белок), но оказалась в 8-10 раз меньше, чем у дрожжевых экстрактов, содержащих Cry3a-LicBM2 белок. Это свидетельствует в пользу представленных выше результатов о более эффективной экспрессии гибридного белка Cry3aM-LicBM2 в клетках дрожжей по сравнению с белком Cry3a-LicBM2. Помимо этого полученные результаты продемонстрировали, что в составе гибридных Cry3aM-LicBM2 и Cry3a-LicBM2 белков СгуЗаМ и СгуЗа белки сохраняют свою биологическую активность - инсекцитидное действие на личинки колорадского жука (табл.2 и рис. 8), а лихеназа сохраняет основные свойства трансляционного репортерного белка - термостабильность и активность (рис.4Б и 5Б).

Рис. 8. Эффективность инсекцитидного действия дрожжевых экстрактов, содержащих ЫсВМ2 (отрицательный контроль) (слева) и СгуЗаМ-1ЛсВМ2 (справа), на личинки колорадского жука

Таблица 2. Среднесмертельная концентрация (1X50) белковых экстрактов, полученных из дрожжевых трансформантов

, Дрожжевые -• - * ЬС50 суммарного белка '1

трансформанты (}щ/гашх)

УсВМ2+ 1Р СгуЗа (К?) " ~ ~ 3,8± 0,3 ~

_ СгуЗз-УсВМ2 ' " ___- „ '___

СтуЗаМ-йсВШ " "" 41+0,4"""......

Примечание: Среднесмертсльную концентрацию (1X50$) определяли Пробит-анализом. 1Р СгуЗа - Кристаллический инсектицидный белок СгуЗа, полученный из бактерий В/ подвид (епеЬпотн, К и К+ - отрицательный и положительный контроли.

3.6. Конструирование растительных экснрессионимх векторов и трансформация растений картофеля

Результаты эффективной экспрессии модифицированного cryЗаМ и гибридного сууЗаМ-/гсВМ2 генов в клетках низших эукариот дрожжей, а также результаты по сохранению биологической активности СгуЗаМ белка в составе гибридного Cry3a-LicBM2 белка, позволили предположить, что эти гены будут эффективно экспрессироваться и в растениях картофеля с сохранением биологической активности белковых продуктов. Для проверки этого предположения, были сконструированы экспрессионные вектора для трансформации растений, обозначенные pC29-leader-cry3aM-licBM2 и pC29-leader-cry3zM. В этих вето pax модифицированный слуЗаМ и гибридный с/уЗаМ-/г'сВМ2 гены, слитые в рамке считывания с последовательностью лидерного пептида гена малой субъединицы РБФК/О (rbcS) гороха, находятся под контролем светоиндуцибельного промотора гена малой субъединицы РБФК/О ОrbcS) Arabidobsis lhaliana (рис.9). Выбор в качестве регуляторного элемента светоиндуцибельного промотора (rbcS) обусловлен тем, что этот промотор обеспечивает преимущественную экспрессию контролируемого им гена в зеленых тканях растения - листьях - органах-мишенях для личинок колорадского жука. Использование лидерного пептида (leader) обосновано тем, что он способен транспортировать белок в хлоропласт (компартмент

растительной клетки с невысоким уровнем протеолитической активности), что, в свою очередь, обеспечит поддержание достаточного количества гетерологичного белкового продукта для защиты растений от личинок колорадского жука.

. R8£S Л m>3aM 4'ilif- и -— .jsfrslsii.?..,:

RiiiS ьмгъ**я, л .... ¿vv/rt-" j crvSaM

Рис. 9. Схема растительных экспрессиониых векторов. А - pC29-leader-ci)>3M и Б - рС29-leader-оуЪ»М-//сВМ2, RBCS - промотор гена малой субъединнцы РБФК/О, Leader -последовательность лидерного пептида гена rbcs гороха

В качестве растительного материала были использованы сорта картофеля Юбилей Жукова (код 39) и Десница (код 47). В результате трансформации растений картофеля было отобрано 17 и 9 независимых первичных трансформанта линии Cry3aM-LicBM2 и СгуЗаМ, соответственно. Отбор первичных трансформантов проводили на селективной среде МС, содержащей канамицин. В таблице 3 представлены результаты получения первичных трансформантов растений картофеля, несущих гибридные гены leader-cry3aM-licBM2 и leader-сгуЪ аМ,

Таблица 3. Эффективность трансформации гибридными генами leader-cry3&M-licBM2 (генотип 46) и leader-оуЗаМ (генотип 49).

Индукционная среда ' О ГК • 0,___ПС 0 ' ГК_____ О

Генотни растения 1 46 .46 ' 49' : -49 46 46 49

сорт , __ . _ ' ^ЮЖ ЮЖ ЛОЖ ЮЖ Дес Дес_ '

™Кол-во эксплаТп'ов .........."* " ~ 123~ 209~~" И8~Т84"''~63Г 144 '

Кол-во полученных регенератов 46 104 _9 50 17 ___6_____18

Кол-во регенерантов, устойчивых к ^ 5 6 3 i 4 2 5 ; канамишну

Кол-во первичных трансформантов (по 3 5 -, - 4 2

j шстивносш LicB)___________^_'__________ '__________

7^рл-ао"рУгснсрантоГш 1 исходный эксплзнт Г 37% ." 50% 8% 721% 26% , 4% _ 22% ДоляКм~устойчт^ на 1 ' \1%~6% ?33% - 2% 24% - 33%" 28%

регенерант ,

Доля первичныхТ^ансформ&нтов,отобранных; 7% 5% -24% 33%

по активности лихеназы, на 1 регенерат i ,

Доля первичных трансформантов, . ! 7% 5%, 0% 0% 24% 33%' 0%

отобранных, по результатам ПЦР-анализа на 1;

регенерант

Примечание: 0 - стандартная среда для регенерации растений картофеля, ГК - среда для регенерации растений картофеля с добавлением гибберелииа, ЮЖ и Д-обозначение сортов картофел» Юбилей Жукова и Десница, соответственно.

Первичные трансформанты растений, укоренившиеся на среде с канамицином, были использованы для дальнейших экспериментов.

3.7. Молекулярио-биологический анализ трансгенных растений картофеля

Первоначально, регенеранты линии Cry3aM-LicBM2, устойчивые к канамицину, проанализированы методом качественного определения активности лихеназы. В таблице 3 представлены результаты селекции этих регенератов на каиамицине с последующим отбором первичных трансформантон по активности лихеназы. Проведенные эксперименты позволили отобрать трансформанты растений картофеля линии Cry3aM-LicBM2, которые экспрессируют перенесенный гибридный ген. Далее, первичные трансформанты растений картофеля, отобранных на селективном агенте, были проанализированы методом ПЦР, При анализе первичных трансформантов линии Cry3aM-LicBM2 использовали специфические праймеры к последовательностям лидерною пептидаи второго фрагмента гена сгуЪгМ (последовательность лидерного пептида - 200 п.н., последовательность первого и второго фрагментов гена с^ЗаМ -800 п.н.). После проведения ПЦР с этими праймерами образуется фрагмент размером около 1000 п.н., что соответствует размеру этих последовательностей (рис. 10А). При анализе первичных трансформантов линии Cry3aM-LicBM2 также использовали праймеры на 5'-концевую область второго фрагмента сгуЗаМ гена и 3'-концевую область гена //еВМ2. После проведения ПЦР происходит образование фрагмента размером 2050 п.н., что соответствует размеру перенесенного гибридного гена с/уЗаМ-//сВМ2 без первого фрагмента. Следует отметить, что у всех первичных трансформантов линии Cry3aM-LicBM2, отобранных на селективной среде с канамицином, а затем по активности лихеназы, выявлены ПЦР-фрагменты соответствующего размера. У первичных трансформантов линии СгуЗаМ, отобранных только на селективной среде, а также у первичных трансформантов линии СгуЗаМ-LicBM2, у которых после отбора на селективной среде активность лихеназы не обнаружена, ожидаемые ПЦР-фрагменты не выявлены (данные не приводятся). Высокий процент первичных трансформантов, отобранных на каиамицине, по сравнению с таковым при дополнительном отборе по активности лихеназы может быть обусловлен: во-первых, сомаклональной вариабельностью растений в процессе регенерации; во-вторых, присутствием в сосудистой системе растений агробактерий, экспрессирующих ген селективного маркера, поскольку его экспрессия контролируется агробактериальным промотором, который осуществляет транскрипцию как в клетках прокариот, так и в растительных клетках. Следует подчеркнуть, что экспрессия гибридного гена с/>'ЗаМ-//сВМ2, в состав которого входит последовательность репортерного гена лихеназы контролируется промотором (rbes A. thaliana), который функционирует только в растительных клетках.

Полученные результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о том, что термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, и эффективность трансформации (доля трансформантов на один регенерант), рассчитанная по экспрессии регюртерного белка лихеназы, является более объективной величиной, чем таковая, рассчитанная по экспрессии селективного агента - канамицина.

1234.5 6789

А В

Рис. 10. А. Анализ геномной ДНК контрольного растения (дорожка 7) и первичных трансформантов растений линии СгуЗаМ-1лсВМ2 (дорожки 1-6) методом ПЦР (праймеры к 5-концевой области последовательности лидерного пептида и 3-концевой области второго фрагмента модифицированного гена сгуЗаМ). Дорожка 8 - положительный контроль. Б. Анализ геномной ДНК контрольного растения (дорожка 8) и первичных трансформантов растений линии СгуЗаМ-ЫсВМ2 (дорожки 1-7) методом ПЦР (праймеры к 5-концевой области последовательности второго фрагмента модифицированного гена сгуЗаМ и 3-концевой области последовательности гена А'сВМ2). Дорожка 9 -положительный контроль. М - маркер молекулярных масс. Цифрами обозначены размеры фрагментов.

Для доказательства того, что в растениях картофеля эффективно синтезируются рекомбинантные белки, первоначально, белковые экстракта первичных трансформантов линии СгуЗаМ-ЫсВШ были проанализированы методом зимограмм (рис. 11). Анализ белковых экстрактов выявил полосы активности лихеназы у всех первичных трансформантов этой линии с молекулярной массой около 95 кДа, что соответствует теоретически рассчитанной молекулярной массе белкового продукта, который должен образовываться в результате экспрессии гибридных генов в растениях (рис. 11).

Известно, что уровень продукции гетерологичных белков в трансгенных растениях варьирует в широких пределах и составляет от 0,001% до 15% от суммарного растворимого белка. Для того, чтобы определить уровень накопления белковых продуктов в первичных трансформантах растений картофеля линии СгуЗаМ-УсВМ2, мы провели количественное определение активности лихеназы, которая входит в состав гибридных белков СгуЗаМ-1лсВМ2, в белковых экстрактах из контрольных растений и первичных трансформантов (табл. 4). Для сравнения уровня накопления рекомбинантных белков в растениях были использованы бактериальные белковые экстракты с известной концентрацией термостабилыюй лихеназы.

Рис. 11. Зимограмма белковых экстрактов, полученных из контрольных растений (дорожка 2) и первичных трансформантов растений (дорожки 1,3- 7), экспрессирующих гибридные белки с7>'ЗаМ-//сВМ2. К+ - белковые экстракты из Е. coli, экспрессирующих ген сгуЗаМ-//сВМ2. М - маркеры молекулярных масс.

Таблица 4. Уровни накопления рекомбинантных белков в первичных трансформантах картофеля и результаты биотсстов

Первичный Активность Уровень Бштёст

трансформант лихеназы накопления (%

(Ед./мг рекомбинантных смертельности)

суммарного белков (% от

белка) суммарного белка)

IOB-S-L(l) 0,44 + 0,05 0,03 37

"' ЮБ-З-ЩГ.........." "I,ITFO;2"O...... ~.......~о;о?г~ ~.....................

IOB-S-L(3) 0,90+0,19 0,06 55

K)ß:S-t(4)~......" " W±"Ö",ГО..............0,06.............."бТ

IOB-S-L(5) 0.44 + 0.05 0.03

"Д-$-Ц1) "" ""0,610,10 "" .......0,04 "' Ж "

ЮБ-Э-Цб) 1,10 + 0,14- 0,07

IOB-S-L(7)'...... Г20~± 0Г20 "0709 .....------

Д-Б-Ш) 0,34 + 0,07 0,02

" д-з-цз) ..... i;25± o;25 ......o;i ~ ........—st.....

Д-!5-Ц4) 0,5 ±0,07 0,03

S-S-L(5) _ ' 1,08 + 0,1Й" ' 0,08 " " "

Д-5-Ц6)" " "0,60 +о; 10.....0.04......."

ЮБ-8-Ц8) 0,73 + 0,10 0,05

*• Линии, у которых не проводили биотест.

Примечание: ЮБ и Д: обозначение сортов картофеля Юбилей Жукова и Десница, соответственно. 8-Ь: (с/уЗаМ-Л'сВМ2)

У большинства первичных трансформантов растений линии СгуЗаМ-УсВМ2 уровень накопления рекомбинантных белков составил около от 0,05% до 0,1% общего количества растворимых белков. Полученные нами результаты показывают, что светоиндуцибельный промотор гена гЬсБ обеспечивает высокий уровень экспрессии перенесенных генов в растениях.

Для того чтобы определить, насколько стабильны гетерологичные белки в первичных трансформантах были проведены следующие эксперименты. Первичные трансфоманты линии

СгуЗаМ-УсВМ2 в возрасте 1 месяца выдерживали в темноте в течение 7 суток. Далее растения переносили на свет (4000-6000 люкс). Ферментативную активность лихеназы, входящей в состав гибридных белков, измеряли в белковых экстрактах из листьев трансгенных растений в конце светового и темнового периодов, а также через 6, 12 и 24 и 48 часов после перенесения растений на свет (рис. 12). Полученные результаты свидетельствуют о том, что гетерологичный СгуЗаМ-исВМ2 белок характеризуется высоким уровнем стабильности в первичных трансформантах растениях. Это заключение основано на том, уровень СгуЗаМ-1_лсВМ2 в условиях отсутствия индуктора промотора гЬсб (свет) в течение 168 часов (7 суток) составляет около 40% от уровня этого белка при выращивании растений в стандартных условиях (16 часов - свет, 8 часов - темнота). Уровень активности фермента у растений, перенесенных на свет, увеличивался и достигал первоначального уровня через 24 ч после переноса растений из темноты на свет (рис. 12).

Рис. 12. Кинетический анализ действия света (в качестве индуктора) на экспрессию гибридного гена сг>>ЗаМ-//сВМ2 в первичных трансформантах растений. Активность лихеназы измеряли в конце светового периода (КСП); в конце темпового периода (КТ11); через 6,12, 24 и 48 часов после индукции светом. Л - Независимые первичные трансформанты растений.

3. 8. Результаты биотеста первичных трансформантов растений картофеля на личинках колорадского жука

Анализ первичных трансформантов картофеля линии СгуЗаМ-УсВМ2 на устойчивость по отношению к личинкам первого возраста колорадского жука проводили с использованием молодых листьев в чашках Петри в стандартных условиях. В качестве контролей использовали листья контрольных растений картофеля с двух сторон обработанных раствором кристаллического СгуЗа белка в концентрации 1 мкг/мм2 (положительный контроль) либо буфером для растворения кристаллического СгуЗа белка (отрицательный контроль). Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 4. Первичные трапсформанты показали от 35% до 81% эффективности (токсичности) (табл. 4), контрольные растения, обработанные буферным раствором, не проявляли токсичности, а контрольные растения, обработанные раствором кристаллического белка, проявляли 100% токсичности. Следует подчеркнуть, что выявлена положительная корреляция между процентом смертности личинок и

Л1 Л2 ЛЗ Л4 Л5

уровнем накопления гибридных белков в первичных трансформантах (табл. 4). Таким образом, было показано, что гибридный белок Cry3aM-LicBM2, который нарабатывается в первичных трансформантах картофеля, эффективно экспрессируется и обеспечивает достаточно высокий уровень защиты растений против личинок колорадского жука.

Заключение

Таким образом, представленные результаты исследования позволяют заключить следующее: нуклеотидная последовательность, а также кодоновый состав генов значительно влияет на их экспрессию в разных организмах, поскольку проведенная нами модификация последовательности сгуЗа гена значительно увеличила уровень его экспрессии в клетках эукариот- дрожжей и картофеля.

Продемонстрировано, что в составе гибридных Cry3aM-LicBM2 и Cry3a~LicBM2 белков СгуЗаМ и СгуЗа белки сохраняют свою биологическую активность - инсекцитидное действие на личинки колорадского жука, а лихеназа сохраняет основные свойства трансляционного репортерного белка - термостабильность и активность. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования ее в качестве трансляционного репортера при изучении экспрессии генов, кодирующих продукты с высокой молекулярной массой. Метод зиммограм - метод качественного определения активности лихеназы - может использоваться как альтернативный методу Вестерн-блот гибридизации, при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортера, поскольку молекулярные массы гибридных белков, определенные методом Вестерн-блот гибридизации, соответствует молекулярным массам этих белков на зимограммах. Показано, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает проведение отбора и анализа экспрессии рекомбинантных белков в трансгенных организмах, что является важным при проведении поисковых исследований. В результате работы сконструированы экспериментальные модели первичных трансформантов картофеля, экспрессирующие гибридный ген c/y3aM-/icBM2. Молекулярно-биологический анализ и бнотесты экспериментальных моделей позволяют предложить новую систему экспрессию cry генов в растениях. Эта система основана на экспрессии гибридных генов, в состав которых входит последовательность репортерного гена лихеназы, и использовании в качестве регуляторного элемента светоиндуцибельный промотор, который обеспечивает преимущественную экспрессии контролируемых генов только в зеленых тканях растения (листьях) - органах-мишенях для насекомых-вредителей. Основываясь на свойствах репортерного белка лихеназы, входящего в состав гибридных белков представляется возможным использовать эту репортерную систему для мониторинга трансгенов в агроценозах, поскольку эта система является достаточно простой и точной, и не требует больших материальных и временных затрат.

Выводы

1. Анализ последовательности нативного гена стуЗа с использованием компьютерных программ позволил сделать заключение, что для эффективной экспрессии в эукариотах необходимо модифицировать нуклеотидную последовательность и кодоновый состав этого гена, поскольку:

- он содержит более 50% кодонов, которые редко используются эукариотическими системами (дрожжи, растения),

- в его составе выявлено 24 потенциальные области полиаденилирования и 12 сигналов деградации мРНК;

- его С+С состав составляет 37%, что значительно ниже, чем у эукариот.

2. Модификация последовательности о>'За гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот (дрожжи, растения) с сохранением биологической активности белкового продукта.

3. Впервые нативный, синтетический и гибридные гены сгуЗа экспрессированы в клетках дрожжей ЯассЬ.аготусе$ сегеУ1я1ае и показано что дрожжи могут использоваться в качестве модельного организма для проверки и предсказания уровня экспрессии генов в высших эукариотах.

4. Показано, что в составе гибридных СгуЗаМ-УсВМ2 и СгуЗа-1лсВМ2 белков СгуЗаМ и СгуЗа белки сохраняют свою биологическую активность - инсекцитидное действие на личинки колорадского жука, а лихеназа сохраняет свои основные свойства репортерного белка - термостабильность и активность.

5. Лихеназа (1лсВМ2) может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов и определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Метод зимограмм (метод качественного определения активности термостабильной лихеназы) позволяет точно определять молекулярные массЫ гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Этот метод предлагается вместо Вестерн-блот гибридизации при использовании лихеназы в качестве репортерного белка.

6. На основании молекулярно-биологического анализа и результатов биотестов первичных трансформантов растений картофеля предлагается новая система экспрессии СгуЗа белков в растениях, основанная на использовании гибридных сгуЗа генов, в состав которых входит лихеназа, и светоиндуцибельного промотора гена гЬсБ, который обеспечивает высокий уровень экспрессии модифицированного и гибридного генов в трансгенных растениях.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ:

1- Г.Р. Салехи Джузани. Р.А. Ко махин, Э.С Пирузян, Сравнительный анализ экспрессии

нативного и модифицированного генов cry За В. thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках, Генетика, 2005, Т. 41, № 1, С. 171-177

2- P.M. Абдеев, К.А. Мусийчук, И.В. Голденкова, Д.В. Сотченков, Г.Р. Салехи Джузани. А.К.

Алявина, Н.В. Загоскина, Э.С Пирузян, Изменение морфологии и фитогормонального статуса у трансгенных растений табака в результате экспрессии бактериальной термостабильной целлюлазы, Физиология Растений, 2004,Т. 51, № 5, С. 714-720.

3- Р.А. Комахин, И.А. Абдеева, Г.Р. Салехи Джузани. И.В. Голденкова, А.А. Жученко,

Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер, Генетика, 2005,То. 41, № 1,С. 40-47

4- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I.V, Piruzian E.S, Full modification of the coding sequence for

enhancing potato expression of insect control protein cryia gene, Proceeding book of XVII European Association for Research on Plant Breeding conference on " Genetic Variation for Plant Breeding", Tulln, Austria, 2004, P. 239-245.

5- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I.V, Piruzian E.S, Full modification of the coding sequence for

enhancing potato expression of insect control protein СгуЗа gene and prediction of its expression in plants using yeast transformation, Proc. of International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (IOBC) conference on "Breeding for plant resistance to insects, mites and pathogens, Poland, 2004, P. 16.

6- Салехи Джузани Г.Р, К.Мусийчук. Модификация последовательности гена 6-эндотоксина

Bt var. tenebrionis для эффективной экспрессии в двудольных растениях, Сборник материалов II конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики», Россия,2003,С. 112.

7- Piruzian E.S, Goldenkova I.V, Musiychuk К.А, Abdeev R.M & Salehi Jozani G.R. Analysis of

plant physiological processes by expression of bacterial genes, XIth International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions: New bridges between past and future, Saint-Petersburg, Russia, 2003, P..53.

8- Высоцкая M.B, Ралдугина Г.Н, Вальдерама Ромеро, А.С, Гайворонская JI.M, Салехи

Джузани Г.Р, Получение трансгенных растений рапса, несущих бактериальный ген [}-глюканазы, Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений, Компания Спутник, 2003, С. 107-114,

9- Salehi Jozani G.R, Sotchenkov D.V, Sazonova I.A., Goldenkova I.V, The comparative analysis of

the expression of wild and synthetic Bacillus thuringiensis genes сгуЪг. in prokaryotic cells, International Seminar - presentation " Innovational scientific- technical projects of Biotechnology, November 24-25, Pushino, Russia, 2003, P. 183-184.

10- Салехи Джузани Г.Р, Голденкова И.В. Создание синтетического гена cry За Bt и его

экспрессии в прокариотических клетках, сборник материалов конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России, Москва, 2003, С.148-149.

11- Salehi Jozani G.R Prosperity or failure for Bt Crops? Proceeding of Crop and Plant Sciences 9Ul

Iranian Students Seminar in Europe, Birmingham, UK, 2002, P. 8.

12- Salehi Jozani G.R and K. Musichuk, Modification of the coding sequence enhances plant

expression of insect control protein сгуЪъ gene, proceeding of Зш Iran-Russia International conference on " Agriculture and natural resources", 2002, Moscow, Russia, P. 58.

13- G. R. Salehi Jouzani, I.V. Goldenkova and E. S. Piruzian, Development of new strategies to

prevent Colorado potato beetle resistance to Cry toxins of B. thuringiensis expressing in transgenic plants, Proceeding book of 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE), Manchester - United Kingdom, 2004, P. 31.

14- Салехи Джузани Г.Р., Абдеев P.M., Голденкова И.В., Пирузян Э.С. Модификация гена

сгуЗг из В. thuringiensis увеличивает его экспрессию в клетках эукариот, Сборник

материалов Международной конференции "клеточные ядра и пластиды растений: Биохимия и биотехнология", Минск, Беларуси, 2004, С. 209-214.

15- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I V, Piruzian E.S, A novel strategy for modeling, synthesis and

plant expression prediction of the Bacillus thuringiensis cry genes. Abstract book of the 4th Internationa] Iran and Russia Conference on "Agriculture and Natural Recourses, Sharekord, Iran, 2004, P. 38.

16- Салехи Джузани Г.Р., Голденкова И.В., Пирузян Э.С. Полная модификация нативного гена

сгуЗа Bacillus thuringiensis увеличивает его экспрессию в дрожжевых клетках, сборник тезисов III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: Современное состояние и перспективы развития», 2004, Москва, Россия. С. 408.

17- Голам Реза Салехи, Мусийчук К.А, Анализ экспрессии гена 8-эндотоксина Bacillus

thuringiensis var. tenebrionis для эффективной экспрессии в двудольных растениях, Сборник материалов международной конференции современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции, Almati, Kazakhstan, 2003, С. 93-94.

18- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I.V, Piruzian E.S, A novel strategy for modeling, synthesis and

plant expression prediction of the Bacillus thuringiensis cry genes. Full paper Proceeding of the 4th International Iran and Russia Conference on "Agriculture and Natural Recourses, Section 1, Sharekord, Iran, 2004, P: 339-348,.

19- Marzban R. & Gh. R. Salehi Jouzani, Distribution of Bacillus thuringiensis in the agricultural

soils of Iran, Proceeding of the 16ш Iranian Plant Protection Congress, Volume 1: Pests, Tabriz, Iran, 2004, P. 70.

20- Salehi Jozani G.R., Hosseinzadeh A.H., Abdmishani S. RAPDs markers as a useful tool for

determination of genetic diversity in commercial potato cultivars {Solanum tuberusom). Proceeding of 3th International Scientific Conference on "Biotechnology in Plant and Animal Production, and Veterinary", Moscow, Russia, 2004, P. 7-10.

21- Салехи Джузани Г.Р., Голденкова И.В., Пирузян Э.С. Новая стратегия для моделирования,

синтеза и предсказания экспрессии cry генов Bacillus thuringiensis в растениях. Сборник статей третьей Международной Конференции "Biotechnology in Plant and Animal Production, and Veterinary", Москва, Россия, 2004, С. 67-70.

22- Salehi Jozani G.R., Hosseinzadeh A.H., Abdmishani S. Genetic diversity analysis of commercial

potato cultivars (Solanum tuberusom) in Iran using RAPD-PCR technique. Proceeding of International Scientific Conference on "Molecular Genetics, Genomics and Biotechnology", Minsk, Belarus, 2004, P. 317-319.

23- Салехи Джузани Г.Р.. Голденкова И.В., Пирузян Э.С, Уровень экспрессии cry генов

Bacillus thuringiensis в дрожжах определяет эффективность экспрессии этих генов в растениях. Сборник тезисов Международной Научной Конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология", Минск, Беларусь, 2004, С. 343-345.

24- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I.V, Piruzian E.S, Full modification of the coding sequence for

enhancing potato expression of insect control protein Ciy3a gene and prediction of its expression in plants using yeast transformation, Bulletin of International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (IOBC/wprs) (in press).

25- Марзбан P., Салехи Джузани Г.Р., Распределение штаммов Bacillus thuringiensis в

сельскохозяйственных почвах Ирана, Сборник материалов третьего Московского международного конгресса « Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, 2005, С. 274.

26- Salehi Jozani G.R, Goldenkova I.V, Piruzian E.S, Expression of modified сгуЗаМ and сгуЗаМ-

licBMl hybrid genes of Bacillus thuringiensis in transgenic potatoes, Proceeding of 3th Moscow International congress " Biotechnology: State of the art and prospects of developement", Moscow, Russia, 2005, P. 292.

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своему научному руководителю, профессору, доктору биологических наук Пирузян Элеоноре Суреновне за всемерную поддержку, внимание и бесценную помощь в ходе выполнения научной работы. Автор искренне благодарен д.б.н. Голденковой Ирине Васильевне, к.б.н. Мусийчуку Константину Анатольевичу и к.б.н. Абдееву Рустаму Муратовичу за неоценимую помощь в работе и дискуссии, в ходе которых рождались интересные идеи, и за участие в обсуждении полученных результатов; к.б.н. Наталье Олеговне Юрьевой за помощь в получении трансгенных растений картофеля; Всем сотрудникам, аспирантам, стажерам и студентам лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН к.б.н. Ларисе Васильевне Волковой, Роману Комахину, Денису Сотченкову, Инне Сазоновой, Сергею Брускину, Наталье Ковальской, Оксане Кобзарь, Мише Голденкову, а также всем моим добрым друзьям и коллегам Камалу Гасеми, Резе Маали, Мохамаду Мохамадабади, Джалалу Ростамзадех, Неде Мирахори огромное спасибо за поддержку, помощь и дружеское отношение. Моя огромная благодарность моим родителям Манучехр Салехи и Махин Бахадори за поддержку, и жене Фатемех Джабери за любовь, поддержку, доброту, понимание и терпение.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.03.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л.1,5. Тираж 110 экз. Заказ 117. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские торы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

¡trt

II И) Русски!! фон.

2006-4

3448

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салехи Джузани Голам Реза

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Bacillus thuringiensis (Bt) и 5-эндотоксины.

1.1. Общая характеристика бактерий Bt.

1.2. Виды токсинов, образующихся в бактериях Bt.

Классификация штаммов и cry-генов Bt.

1.4. Частные вопросы генетики и молекулярной биологии Bt.

2. Экспрессия сту-генов и синтез протоксинов.

2.1. Транскрипционные механизмы.

2.2. Посттранскрипционные механизмы.

2.3. Посттрансляционные механизмы.

2.4. Кристаллизация инсектицидных белков.

2.5. Структура ifr-токсинов.

2.6. Структурные сходства среди токсинов.

2.7. Функционально- структурная интерпретация Я*-токсинов

3. Механизм действия Cry-токсинов.

3.1. Общая характеристика.

3.2. Роль петель домена II.

3.3. Роль домена III в закреплении рецептора.

3.4. Интеграция в мембрану.

3.5. Образование ионных каналов.

3.6. Получение мутантов для повышения токсичности.

4. Использование Bt- генов в биотехнологии и генной нженерии.

4.1. Использование Cry-белков для контроля численности вредителей и защиты растения.

4.2. Разработка новых биопестицидов, основанных на Bt.

4.3. Экспрессия c/j-генов Bt в растениях.

4.4. Устойчивость насекомых к ^-токсинам.

4.5. Управление устойчивостью насекомых к ^-токсинам.

5. Новые репортерные системы на основе лихеназы Clostridium thermocellum.

Глава II. Материалы и методы.

Глава III. Результаты и обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках"

Открытие в начале XX века инсектицидного действия токсинов Bacillus thuringiensis (Bt) имело важные последствия в вопросе защиты растений от насекомых-вредителей. В последующие десятилетия для защиты растений от насекомых применялись, и по настоящее время применяются, биологические препараты, основой которых являются эти микроорганизмы и/или их метаболиты. Действующие агенты биопрепаратов являются компонентами природных биоценозов, что объясняет их относительную безопасность для окружающей среды, человека, животных, птиц, рыб и полезной энтомофауны. Следующим знаменательным событием, предопределившим ход событий в защите от насекомых, было создание растений, которые сами продуцировали данные токсины (Cry-белки). В настоящее время получены трансгенные растения кукурузы, картофеля, хлопка, риса, экспрессирующие сгу-гены. Экспрессия нативных cry-генов Bacillus в растениях, даже при переносе делеционных вариантов нативных генов, которые кодируют только токсическую часть белка, малоэффективна. Причина низкого уровня экспрессии этих генов в эукариотических системах обусловлена рядом факторов. Во-первых, относительное содержание А+Т в "ДНК Bacillus значительно выше, чем таковое в эукариотах, и в растениях в частности. Высокое содержание А+Т характерно для сайтов сплайсинга, полиаденилирования (polyA), сигналов деградации мРНК, и сайтов терминации транскрипции. Во-вторых, частоты использования кодонов в генах, которые кодируют токсины Bacillus, значительно отличаются от таковых для эукариот (дрожжей, растений). При замене . нуклеотидов в последовательностях Bacillus синонимичными кодонами растений экспрессия -модифицированных генов в растениях значительно увеличивается.

Ранее в нашей лаборатории была разработана репортерная система на основе термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum (Piruzian et al, 1985, 1998, 2000, 2002). Свойства лихеназы соответствуют многим требованиям, предъявляемым к репортерным белкам. Лихеназа - термостабильный белок с температурным оптимумом 70°С, имеет небольшой размер (28 кДа), высокую удельную активность. Эти свойства позволяют тестировать ее активность простыми, и чувствительными методами. Помимо этого, лихеназа сохраняет свои основные свойства - активность и термостабильность - при значительных достройках в N- и С-концевых областях белка, что позволяет ее использовать как трансляционный репортер.

В настоящее время проблемы биобезопасности трансгенных растений, в том числе экспрессирующих cry гены, являются актуальными. Cry белки изучаются достаточно долго, и не являются токсичными для млекопитающих, птиц, амфибий, рептилий, и очень специфично влияют на определенные группы насекомых и беспозвоночных вредителей. В то же время, наиболее острым остается вопрос неконтролируемого переноса генетической информации от трансгенов в окружающую среду, в дикорастущие растения, в том числе сорные. Несмотря на многочисленные исследования, этот вопрос пока не до конца разработан. В связи с этим разработка новых подходов, позволяющих производить такие исследования быстро, точно и с минимальными затратами является актуальной.

Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЪа. в клетках про- и эукариот. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Клонирование нативного гена сгуЪа, определение его нуклеотидной последовательности и анализ последовательности сгуЪа. гена.

2. Модификация последовательности гена сгуЪа. с помощью компьютерных программ для эффективной экспрессии в клетках эукариотах (дрожжи и растения).

3. Химический синтез и клонирование фрагментов модифицированного гена с последующей проверкой корректности сборки последовательности модифицированного гена стуЗаМ секвенированием.

4. Конструирование бактериальных и дрожжевых экспрессионных векторов, в которых нативный и синтетический гены слиты с новым универсальным репортерным геном licBMl, кодирующим термостабильную лихеназу.

6. Проведение биотестов на личинках первого возраста колорадского жука (Leptinotarsa disemlineata) с использованием белковых экстрактов, полученных из дрожжевых трансформантов.

7. Конструирование растительных экспрессионных векторов, в которых сгуЪаМ и гибридный с/уЗаМ-//сВМ2 гены находятся под контролем светоиндуцибильного промотора малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana и последовательности лидерного пептида гена РБФК гороха.

8. Получение и молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих стуЪаМ и с/>ваМ-/гсВМ2 гены.

9. Проведение биотестов первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЪаМ и стуЗаМ-ИсВМ2 гены, с использованием личинок колорадского жука.

Научная новизна работы. Впервые термостабильную лихеназу (LicBM2) успешно использовали в качестве трансляционного репортерного для проведения сравнительных исследований экспрессии нативного и синтетического белков СтуЗа в клетках про- и эукариот. Показано, что термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Для эффективной экспрессии в клетках эукариот ген сгуЪъ. (сгуЗаМ) был модифицирован, и проведены его синтез и клонирование с использованием новой стратегии. Показано, что модификация последовательности сгуЪа гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот (дрожжи, растения) с сохранением биологической активности белкового продукта. Впервые для экспрессии модифицированного оуЗаМ и гибридного сгуЪ аМ-//сВМ2 генов в растениях картофеля был использован светоиндуцибильный промотор малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana, который обусловливает преимущественную экспрессию контролируемого им гена только в зеленых тканях растения (листьях) - органах-мишенях для личинок колорадского жука. Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на XVII European Association for Research on Plant Breeding Conference on "Genetic Variation for Plant Breeding" (Tulln, Austria, 2004); International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (IOBC) Conference on "Breeding for plant resistance to insects, mites and pathogens" (Bialowieza, Poland, 2004); 9th Iranian Students Seminar in Europe (Birmingham, UK, 2002); 2th International Seminar presentation on "Innovational scientific- technical projects of Biotechnology" (Pushino, Russia, 2003); 3th Iran- Russia International Conference on " Agriculture and natural resources" (Moscow, Russia, 2002); 12th Iranian Researchers

Conference in Europe (IRCE) (Manchester, United Kingdom, 2004); 4th International Iran and Russia Conference on " Agriculture and Natural recourses" (Sharekord, Iran, 2004); 3th international scientific conference on "Biotechnology in plant and animal production, and veterinary" (Moscow, Russia, 2004); International scientific conference on "Molecular genetics, Genomics and Biotechnology" (Minsk, Belarus, 2004); 11th International Congress on "Molecular Plant-Microbe Interactions" (Saint-Petersburg, Russia, 2003); Международной конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции" (Almata, Kazakhstan, 2003); III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке, Современное состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2004); Международной конференции "Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология" (Minsk, Belarus, 2004); II Конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики" (Москва, Россия, 2003); Конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России (Москва, Россия, 2003); на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Салехи Джузани Голам Реза

Выводы

1. Анализ последовательности нативного гена сгуЪг. с использованием компьютерных программ позволил сделать заключение, что для эффективной экспрессии в эукариотах необходимо модифицировать нуклеотидную последовательность и кодоновый состав этого гена, поскольку: он содержит более 50% кодонов, которые редко используются эукариотическими системами (дрожжи, растения), в его составе выявлено 24 потенциальные области полиаденилирования и 12 сигналов деградации мРНК; его G+C содержание составляет 37%, что значительно ниже, чем у эукариот.

2. Модификация последовательности сгуЪъ. гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот (дрожжи, растения) с сохранением биологической активности белкового продукта.

3. Впервые нативный, синтетический и гибридные гены сгуЪа экспрессированы в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и показано что дрожжи могут использоваться в качестве модельного организма для проверки и предсказания уровня экспрессии генов в высших эукариотах.

4. Показано, что в составе гибридных Cry3aM-LicBM2 и Cry3a-LicBM2 белков СгуЗаМ и СгуЗа белки сохраняют свою биологическую активность -инсектицидное действие на личинки колорадского жука, а лихеназа сохраняет свои основные свойства репортерного белка - термостабильность и активность.

5. Лихеназа (LicBM2) может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов и определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Метод зимограмм (метод качественного определения активности термостабильной лихеназы) позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Этот метод предлагается вместо Вестерн-блот гибридизации при использовании лихеназы в качестве репортерного белка.

6. На основании молекулярно-биологического анализа и результатов биотестов первичных трансформантов растений картофеля предлагается новая система экспрессии СгуЗа белков в растениях, основанная на использовании гибридных сгуЗа. генов, в состав которых входит лихеназа, и светоиндуцибельного промотора гена rbcS, который обеспечивает высокий уровень экспрессии модифицированного и гибридного генов в трансгенных растениях.

Заключение

Таким образом, представленные результаты исследования позволяют заключить следующее: нуклеотидная последовательность, а также кодоновый состав генов значительно влияет на их экспрессию в разных организмах, поскольку проведенная нами модификация последовательности сгуЪа. гена значительно увеличила уровень его экспрессии в клетках эукариот - дрожжей и картофеля.

Продемонстрировано, что в составе гибридных Cry3aM-LicBM2 и СгуЗа-LicBM2 белков СгуЗаМ и СгуЗа белки сохраняют свою биологическую активность - инсектицидное действие на личинки колорадского жука, а лихеназа сохраняет основные свойства трансляционного репортерного белка термостабильность и активность. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования ее в качестве трансляционного репортера при изучении экспрессии генов, кодирующих продукты с высокой молекулярной массой. Метод зиммограм - метод качественного определения активности лихеназы - может использоваться как альтернативный методу Вестерн-блот гибридизации, при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортера, поскольку молекулярные массы гибридных белков, определенные методом Вестерн-блот гибридизации, соответствует молекулярным массам этих белков на зимограммах. Показано, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает проведение отбора и анализа экспрессии рекомбинантных белков в трансгенных организмах, что является важным при проведении поисковых исследований.

В результате работы сконструированы экспериментальные модели первичных трансформантов картофеля, экспрессирующие гибридный ген стуЗаМ-/г'сВМ2. Молекулярно-биологический анализ и биотесты экспериментальных моделей позволяют предложить новую систему экспрессию cry генов в растениях. Эта система основана на экспрессии гибридных генов, в состав которых входит последовательность репортерного гена лихеназы, и использовании в качестве регуляторного элемента светоиндуцибельного промотора, который обеспечивает преимущественную экспрессии контролируемых генов только в зеленых тканях растения (листьях) — органах-мишенях для насекомых-вредителей. Основываясь на свойствах репортерного белка лихеназы, входящего в состав гибридных белков, представляется возможным использовать эту репортерную систему для мониторинга трансгенов в агроценозах, поскольку эта система является достаточно простой и точной, и не требует больших материальных и временных затрат.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салехи Джузани Голам Реза, Москва

1. Евстратова В.В., Калиев А.Б., Андрианов В.М., и Пирузян Э.С. (1988), Использование векторных плазмид Agrobacterium для переноса в растения генов делта-эндотоксина из Bacillus thuringiensis. Вестник с. х. наук, № 384, с.71-77.

2. Гулина И.В., Шульга О.А., Миронов М.В., и др. (1994), Экспрессия частично модифицированного гена делта-эндотоксина из В. t var. tenebrionis в трансгенных растениях картофеля, Молекулярная биология, Т.28, № 5, С.1166-1175.

3. Мусийчук К.А., Голденкова И.В., Абдеев P.M., Кобец Н.С., Пирузян Э.С., (2000), Получение и свойства делеционных вариантов лихеназы Clostridium thermocellum и создание на их основе бифункциональных гибридных белков. Биохимия, том 65, № 12, с. 1659-1665.

4. Adams, L. F., Mathewes S., Ohara P., Petersen A., and Guertler H., (1994), Elucidation of the mechanism of СгуЗА overproduction in a mutagenized strain of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis. Mol. Microbiol., V. 14, P. 381-389.

5. Agaisse H., and Lereclus D., (1994), Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis cryiz. toxin gene is not dependent on a sporulation specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant. J. Bacterid., V. 176, P. 4734-4741.

6. Agaisse H., and Lereclus D., (1995), How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein? J. Bacteriol., V. 177, P. 6027-6032.

7. Agaisse H., and Lereclus D., (1996), STAB-SD: a Shine-Dalgarno sequence in the 59 untranslated region is a determinant of mRNA stability. Mol. Microb., V. 20, P. 633-643.

8. Agaisse H., and Lereclus D., (1994), Structural and functional analysis of the promoter region involved in full expression of the сгуЗа toxin gene of B.t. Mol. Microbiol., V.13, P. 97-107.

9. Alliote Т., Zhu L.H., Van Montagu M., Inze D., (1988), Plant expression vectors with the origin of replication of the wild type plasmid Sa, Plasmid, V. 19, P. 251-254.

10. Alstad D. N., and Andow D. A., (1995), Managing the evolution of insect resistance to transgenic plants. Science., V. 268, P. 1894-1896.

11. Aronson A. I., Wu D., and Zhang C., (1995), Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protoxin gene. J. Bacterid., V.177, P. 4059—4065.

12. Aronson A., (2002), Sporulation and delta-endotoxin synthesis by Bacillus thuringiensis. Cell.Mol. Life Sci., V. 59, P. 417-425.

13. Baum, J. A., (1994), Tn5401, a new class II transposable element from Bacillus thuringiensis. J. Bacterid., V. 176, P. 2835-2845.

14. Beard. С. E, Ranasinghe C., and Akhurst R.J., (2001), Screening for novel cry genes by hybridization. Letters in Applied Microbiology, V. 33, P. 241-245.

15. Bietlot H.P.L., Vishmuthala J., CareyP.R., (1990), Characterization of the cysteine residues and disulfide linkage in the protein crystal of B.t. Biochem.J., V. 267, P. 309-315.

16. Bradford M. M., (1976), A rapid sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., V. 72, P. 248-254.

17. Bravo A., (1997), Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin family proteins and their functional domains. J. Bacterid., V. 179, P. 2793-2801.

18. Bravo A., Agaisse H., Salamitou S., and Lereclus D., (1996), Analysis of crylAo. expression in sigE and sigK mutants of B.t. Mol. Gen. Genet., V. 250, P. 734—741.

19. Bravo A., Jansens S., and Peferoen M., (1992), Immunocytochemical localization of B.t insecticidal crystal proteins in intoxicated insects. J. Invertebr. Pathol., V. 60, P. 237-246.

20. Brown К. L., (1993), Transcriptional regulation of the Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni crystal protein gene operon. J. Bacterid., V. 175, P. 7951-7957.

21. Brown K. L., and Whiteley H. R., (1990), Isolation of the second B.t RNA polymerase that transcribes from a crystal protein gene promoter. J. Bacteriol., V. 172, P. 6682-6688.

22. Burges H. D., and Hurst J. A., (1977), Ecology of Bacillus thuringiensis in storage moths. J. Invertebr. Pathol., V. 30, P. 131-139.

23. Butko P., Huang F., Pusztai-Carey M., and Surewicz W. К. K., (1997), Interaction of the delta-endotoxin CytA from B.t var. israelensis with lipid membranes. Biochemistry, V. 36, P. 12862-12868.

24. Candas M., Loseva O., Oppert В., Kosaraju P., and Lee A, (2002), Insect Resistance to B.t Alterations in the Indian Moth Larval Gut Proteome, Research, V. 4, P.234-238.

25. Cao J., Zhao J.Z., Tang J. D., Shelton A. M., Earle E. D., (2002), Broccoli plants with pyramided crylAcand cry\CBi genes control diamondback moths resistant to CrylA and Cry 1С proteins, Theor. Appl. Genet., V. 105, P. 258-264.

26. Carlson C. R., T. Johansen, M., M. Lecadet, and A. Kolst. 1996. Genomic organization of the entomopathogenic bacterium B.t subsp. berliner 1715. Microbiology 142:1625-1634.

27. Carroll J., and Ellar D. J., (1997), Analysis of the large aqueous pores produced by a Bacillus thuringiensis protein insecticide in Manduca sexta midgut-brush-border-membrane vesicles. Eur. J. Biochem., V. 245, P. 797-804.

28. Chaufaux J., Muller-Cohn J., Buisson C., Sanchis V., Lereclus D., and Pastuer N., (1997), Inheritance of resistance to the Bacillus thuringiensis CrylC toxin in Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). J. Econ. Entomol., V. 90, P. 873-878.

29. Cheng Bai, Brady A. Vick, Shu-Xia Yi., (2002), Characterization of a New B.t Isolate Highly Active Against Cochylis hospes, Current Microbiology, V. 44, P. 280-285.

30. Chestukhina G. G., Kostina L. I., Mikhailova A. L., Tyurin S. A., Klepikova F. S., and Stepanov V. M., (1982), The main features of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin molecular structure. Arch. Microbiol., V. 132, P. 159-162.

31. Choma С. Т., and Kaplan H., (1990), Folding and unfolding of the protoxin from B.t.: evidence that the toxic moiety is present in an active conformation, Biochemistry, V. 29, P.10971-10977.

32. Choma С. Т., Surewicz W. К., Carey P. R., Pozsgay M., and Kaplan H., (1990), Secondary structure of the entomocidal toxin from B.t subsp. kurstaki HD-73. J. Protein Chem., V. 9, P. 87-94.

33. Conner Anthony J., Travis R. Glare and Jan-Peter Nap, (2003), The release of genetically modified crops into the environment, Part II. Overview of ecological risk assessment. The Plant Journal, V. 33, P. 19-46.

34. Crawford D. N., and Harvey W. R., (1988), Barium and calcium block Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki delta-endotoxins inhibition of potassium current across isolated midgut of larval Manduca sexta. J. Exp. Biol., V. 137, P. 277-286.

35. Crickmore N., Zeigler D. R., Feitelson J., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., and Dean D. H., (1998), Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 807-813.

36. Delecluse A., Rosso M., and Ragni A., (1995), Cloning and expression of a novel toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan encoding a highly mosquitocidal protein. Appl. Environ. Microbiol., V. 61, P. 4230-4235.

37. Denolf P., Hendrickx K., Van Damme J., Degheele D., and Van Rie J., (1997), Cloning and characterization of Manduca sexta and Plutella xylostella midgut aminopeptidase N enzymes related to B.t toxin-binding proteins. Eur. J. Bioch., V. 248, P. 748-761.

38. Dervyn E., Poncet S., Klier A., and Rapoport G., (1995), Transcriptional regulation of the crylVD gene operon from B.t subsp. israelensis. J. Bacteriol., V. 177, P. 2283-2291.

39. De Souza M. Т., Lecadet M. M., and Lereclus D., (1993), Full expression of the сгуЗа toxin gene of Bacillus thuringiensis requires a distant upstream DNA sequence affecting transcription. J. Bacteriol., V. 175, P. 2952-2960.

40. Erirington J., (1993), Bacillus subtilis sporulation, regulation of gene expression and control of morphogenesis. Microbiol. Rev., V. 57, P. 311-315.

41. Estrella H., (1999), Transgenic plants for tropical regions: Some considerations about their development and their transfer to the small farmer, PNAS, V. 96, P. 5978-5981.

42. Estruch J. J., Carozzi N. В., Desai N., Duck N. В., and Koziel M. G., (1997), Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nat. Biotechnol., V. 15, P. 137-141.

43. Federici B.A., Luthy P. and Ibarra J.E., (1990), Parasporal body of B.t israelensis .structure, protein composition and toxicity. In bacterial Control of Mosquitoes and Black flies., P.l6-44.

44. Fedoroff N. V., and Cohen Joel E., (1999), Plants and population: Is there time?, PNAS, V. 96, P. 5903-5907

45. Feitelson J. S., (1993), The Bacillus thuringiensis family tree, In L. Kim (ed.), Advanced engineered pesticides. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., P. 63-71.

46. Ferre J., Escriche В., Bel Y., and Van Rie J., (1995), Biochemistry and genetics of insect resistance to B.t insecticidal crystal proteins. FEMS Microbiol. Lett., V. 132, P. 1-7.

47. Flores H., Soberon X., Sanchez J., and Bravo A., (1997), Isolated domain II and III from the B.t CrylAb delta-endotoxin binds to lepidopteran midgut membranes. FEBS Lett., V. 414, P. 313-318.

48. Francis, B. R., and Bulla L. A. Jr., (1997), Further characterization of Bt-Rl, the cadherin-like receptor for CrylAb toxin in tobacco hornworm (Manduca sexta) midguts. Insect Biochem. Mol. Biol., V. 27, P. 541-550.

49. Ge A. Z., Fister R. M., and Dean D. H., (1990), Hyper expression of a B.t delta-endotoxin encoding gene in Escherichia coli: properties of the product. Gene, V. 93, P. 49-54.

50. Gilbert H. F., (1997), Protein disulfide isomerase and assisted protein folding, J. Biol. Chem., V. 272, P. 29399-29402.

51. Gould F., (1998), Sustainability of transgenic insecticidal cultivars: integrating pest genetics and ecology. Annu. Rev. Entomol., V. 43, P. 701-726.

52. Harry A., Kleter Gijs A., Noteborn Hub P. J. M., and Kok Esther J., (2001), Assessment of the food safety issues related to genetically modified foods. The Plant Journal, V. 27(6), P. 503-528.

53. Helgason E., Okstad 0. A., Caugant D.A., ( 2000), Bacillus anthrasis, B. cereus and Bt — one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol., V. 66:2627-2630.

54. Himeno M., and Ihara H., (1995), Mode of action of delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis var. aizawai and molecular action of insecticides on ion channels. American Chemical Society, P. 129-135.

55. Hodgman Т. C., and Ellar D. J., (1990), Models for the structure and function of the B.t delta-endotoxins determined by compilational analysis, DNA Seq., V. 1, P. 97-106.

56. Hofte H., and Whiteley H. R., (1989), Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Rev., V. 53, P. 242-255.

57. Ho San Kim, Saitoh H., Yamashita S., Акао Т., Park Y. S., Maeda M., Tanaka R., Mizuki E., (2003), Cloning and Characterization of Two Novel Crystal Protein Genes from a Bacillus thuringiensis serovar Dakota. Current Microbiology, V. 46, P. 33-38.

58. Ho San Kim, and Ming Shun Li. 2001. Molecular Cloning of a New Crystal Protein Gene cryl Afl of B.t from Korean Sericultural Farms, Curr. Microbiol., V. 43, P. 408-413

59. Ihara H., Kuroda E., Wadano A., and Himeno M., (1993), Specific toxicity of delta-endotoxins from B. t to Bombyx mori. Biosci. Biotechnol. Biochem., V. 57, P. 200-204.

60. Ives A. R., and Andow D. A., (2002), Evolution of resistance to Bt crops: directional selection in structured environments, Ecology Letters, V. 5, P. 792-801.

61. Johnson D. E., and McGaughey W. H., (1996), Contribution of Bacillus thuringiensis spores to toxicity of purified Cry proteins towards Indianmeal moth larvae. Curr. Microbiol., V. 33, P. 54-59.

62. Keeton T. P., and Bulla L. A., (1997), Ligand specificity and affinity of BT-R1 , the Bacillus thuringiensis Cryl A toxin receptor from Manduca sexta, expressed in mammalian and insect cell cultures. Appl. Environ. Microbiol., V. 63, P. 3419-3425.

63. Laemmli U. K., (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, P. 680-685.

64. Lecadet M. M., and Frachon E., (1994), Presented at the XXVIIth Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Montpellier, France.

65. Lee M. K., Aguda R. M., Cohen M. В., Gould F. L., and Dean D. H., (1997), Determination of binding of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin receptors to rice stem borer midguts. Appl. Environ. Microbiol., V. 63, P.1453-1459.

66. Lee M. K., Curtiss A., Alcantara E., and Dean D. H., (1996), Synergistic effect of the B.t toxins CrylAa and CrylAc on the gypsy moth, Lymantria dispar. Appl. Envir. Microbiol., V. 62, P. 583-586.

67. Leonard C., Chen Y., and Mahillon J., (1997), Diversity and different distribution of IS231, IS232 and IS240 among B. cereus, B. thuringiensis and B. mycoides. Microbiology, V. 143, P. 2537-2547.

68. Lereclus D., Agaisse H., Gominet M., and Chaufaux J., (1995), Overproduction of encapsulated insecticidal crystal proteins in a B. thuringiensis spOA mutant. Bio/Technology, V. 13, P. 67-71.

69. Lereclus D., Vallade M., Chaufaux J., Arantes O., and Rambaud S., (1992), Expansion of the insecticidal host range of Bacillus thuringiensis by in vivo genetic recombination. Bio/Technology, V. 10, P. 418-421.

70. Leroy Т., Herry A.M., Royer M., Altosaar I., Frutos R., Duris D., Philippe R., (2000), Genetically modified coffee plants expressing the Bacillus thuringiensis cry 1 Ac gene for resistance to leaf miner, Plant Cell Report, V. 19, P. 382-389.

71. Li M. S., Je Y.H., Lee I.H., Chang J.H., Roh J.Y., Kim H.S., Oh H.W., Boo K.S., (2002), Isolation and characterization of a strain of Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki containing a new delta-endotoxin gene, Current Microbiology, V. 45, P. 299-302.

72. Li J., Koni P. A., and Ellar D. J., (1996), Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from B.t sp. kyushuensis and implica-tions for membrane pore formation. J. Mol. Biol., V. 257, P. 129-152.

73. Liu Y. В., and Tabashnik В. E., (1997), Experimental evidence that refuges delay insect adaptation to Bacillus thuringiensis. Proq. R. Soc. Lond. Ser., V. 264, P. 605-610.

74. Liu Y. В., and Tabashnik В. E., (1997), Inheritance of resistance to the B. thuringiensis toxin CrylC in the diamondback moth. Appl. Environ. Microbiol., V. 63, P. 2218-2223.

75. Liu Y. В., Tabashnik В. E., and Pusztai-Carey M., (1996), Field-evolved resistance to B.t toxin CrylC in diamondback moth (Plutellidae). J. Econ. Entomol., V. 89, P. 798-804.

76. Loevgren A., Cathrine R. Carlson, Daiwu Kang, Katarina Eskils, Anne-Brit Kolsto, (2002), Physical mapping of the Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and alesti Chromosomes. Current Microbiology, V. 44, P. 81-87.

77. Luo K., Lu Y. J., and Adang M. J., (1996), A 106 kDa form of aminopeptidase is a receptor for Bacillus thuringiensis CrylC delta-endotoxin in the brush border membrane of Manduca sexta. Insect Biochem. Mol. Biol., V. 26, P. 783-791.

78. Mallet J., and Porter P., (1992), Preventing insect adaptation to insect-resistant crops: are seed mixtures or refugia the best strategy? Proc. R. Soc. ond. Ser., V. 250, P. 165-169.

79. Malvar Т., and Baum J. A., (1994), Tn5401 disruption of the spoOF gene, identified by direct chromosomal sequencing, results in СгуЗА overproduction in B.t. J. Bacterid., V. 176, P. 4750-4753.

80. Malvar Т., Gawron-Burke C., and Baum J. A., (1994), Overexpression of Bacillus thuringiensis HknA, a histidine protein kinase homolog, bypasses early Spo 2 mutations that result in СгуЗА overproduction. J. Bacterid., V. 176, P. 4742-4749.

81. Martinez C., and Caballero P., (2002), Contents of cry genes and insecticidal toxicity of B.t strains from terrestrial and aquatic habitats, J. Appl. Microbiol., V. 92, P. 745-752.

82. Masson L., Mazza A., Brousseau R., and Tabashnik В., (1995), Kinetics of Bacillus thuringiensis toxin binding with brush border membrane vesicles from susceptible and resistant larvae of Plutella xylostella. J. Biol. Chem., V. 270, P. 11887-11896.

83. McGaughey W. H., (1985), Evaluation of B.t for controlling Indianmeal moths (Pyralidae) in farm grain bins and elevator silos. J. Econ. Entomol., V. 78, P. 1089-1094.

84. McGaughey W. H., and Johnson D. E., (1994), Influence of crystal protein composition of Bacillus thuringiensis strains on cross-resistance in Indian-meal moths (Lepidoptera: Pyralidae). J. Econ. Entomol., V. 87, P. 535-540.

85. Meadows M. P., (1993), Bacillus thuringiensis in the environment: ecology and risk assessment, In P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, and S. Higgs (ed.), B.t an environmental biopesticide: theory and practice. Wiley, New York, P. 193-220.

86. Menou G., Mahillon J., Lecadet M. M., and Lereclus D., (1990), Structural and genetic organization of IS232, a new insertion sequence of Bacillus thuringiensis. J. Bacterid., V. 172, P. 6689-6696.

87. Metz T. D., Roush R. Т., Tang J. D., Shelton A. M., and Earle E. D., (1995), Transgenic broccoli expressing a Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein: implications for pest management strategies. Mol. Breed., V. 1, P. 309-317.

88. Nagamatsu Y., Itai Y., Hatanaka C., and Hayashi K., (1984), A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of B.t Agric. Biol. Chem., V. 48, P. 611-619.

89. Naimov N., Dukiandjiev S., and De Maagd Ruud A., (2003), A hybrid Bacillus thuringiensis delta-endotoxin gives resistance against a coleopteran and a lepidopteran pest in transgenic potato, Plant Biotechnology Journal., V. 1, P. 51-57.

90. Nayak P., Basu D., Das S.,. Basu A, Ghosh D., Ramakrishnan N. A., Ghosh M., and Sen S. K., (1997), Transgenic elite indica rice plants expressing CrylAc delta-endotoxin of B.t are resistant against yellow stem borer. PNAS, V. 94, P. 2111- 2116.

91. Nierlich D. P., and Murakawa G. J., (1996), The decay of bacterial messenger RNA. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., V. 52, P. 153-216.

92. Novillo C., Castan P., and Ortego F., (1997), Characterization and distribution of chymotrypsin-like and other digestive proteases in Colorado potato beetle larvae. Arch. Insect. Biochem. Physiol., V. 36, P. 181-201.

93. Oppert В., Kramer K. J., Beeman R. W., and Mc-gaughey W. H., (1997), Proteinase-mediated insect resistance to B.t toxins. J. Biol. Chem., V. 272, P. 23473-23476.

94. Park Hyun-Woo, Baoxue Ge, Leahs Bauer, and Federisi Brian A., (1998), Optimization of СгуЗА Yields in B.t by Use of Sporulation-Dependent Promoters in Combination with the STAB-SD mRNA Sequence, V. 64(10), P. 3932-3938.

95. Parker M. W., Postma J. P. M., Pattus F., Tucker A. D., and Tsernoglou D., (1992), Refined structure of pore-forming domain of colicin A at 2.4 E resolution. J. Mol. Biol., V. 224, P. 639-657.

96. Peferoen M., (1997), Progress and prospects for field use of Bt genes in crops. Trends Biotechnol., V. 15, P. 173-177.

97. Perez C. J., and Shelton A. M., (1997), Resistance of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) to B.t Berliner in Central America. J. Econ. Entomol., V. 90, P. 87-93.

98. Perlak F. J., Fuchs R. L., Dean D. A., McPherson S. L., and Fischhoff D. A., (1991), Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. PNAS, V. 88, P. 3324-3328.

99. Piruzian E. S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V., (1998), The use of a thermoactive -glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants. Mol. Gen. Genet., V. 257, P. 561-567

100. Poncet S., Delercluse A., Anello G., Klier A., and Rapoport G., (1994), Transfer and expression of the cryIVВ and cryIVD genes of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in Bacillus sphaericus 2297. FEMS Microbiol. Lett., V.l 17, P. 91-96.

101. Poncet S., Dervyn E., Klier A., and Rapoport G., (1997), SpoOA represses transcription of the cry toxin genes in B.t. Microbiology, V. 143, P. 2743-2751.

102. Pray Carl E. , Jikun Huang, Ruifa Hu and Scott Rozelle, (2002), Five years of Bt cotton in China the benefits continue. The Plant Journal, V. 31(4), P. 423-430.

103. Ragni A., Thierry I., and Delercluse A., (1996), Characterization of six highly mosquitocidal B. thuringiensis strains that do not belong to the H-14 serotype. Curr. Microbiol., V. 32, P. 48-54.

104. Rajamohan F., Alzate O., Cotrill J. A., Curtiss A., and Dean D. H., (1996), Protein engineering of B.t delta-endotoxin: mutations at domain II of CrylAb enhance receptor affinity and toxicity towards gypsy moth larvae. PNAS, V. 93, P. 14338-14343.

105. Rajamohan F., Lee M. K., and Dean D. H., (1998), Bacillus thuringiensis insecticidal proteins: molecular mode of action. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Academic Press, New York, V. 60, P. 335-339.

106. Rezsohazy R., Mahillon J., and Delcour J., (1993), IS231V and W from B.t subsp. israelensis, two distant members of the IS231 family of insertion sequences. Plasmid, V. 30, P. 141-149.

107. Richard S. V. and Playford C. L., (2001), Abundance of Helicoverpa (Lepidoptera: Noctuidae) pupae under cotton and other crops in central Queensland: Implications for resistance management, Australian J. Entomol., V. 40, P. 264-269.

108. Robertson J. L., Preisler H. K., Hickle L. A., and Gelernter W. D., (1995), Natural variation: a complicating factor in bioassays with chemical and microbial pesticides. J. Econ. Entomol., V. 88, P. 1-10.

109. Rosso M. L., and Delercluse A., (1997), Distribution of the insertion element IS240 among Bacillus thuringiensis strains. Curr. Microbiol., V. 34, P. 348-353.

110. Roush R. Т., (1996), Can we slow adaptation by pests to insect transgenic crops?, In G. J. Persley (ed.), Biotechnology and integrated pest management. CAB International, UK. P. 242-263.

111. Salamitou S., Agaisse H., Bravo A., and Lereclus D., (1996), Genetic analysis of сгуЗА gene expression in Bacillus thuringiensis. Microbiology, V. 142, P. 2049-2055.

112. Sambrook J., Fritch E.F. and Maniatis Т., (1989), Molecular cloning- A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

113. Sayyed A. H., Hugo C., and Denis J., (2003), Could Bt transgenic crops have nutritionally favorable effects on resistant insects?, Ecology Letters, V. 6, P. 167-169.

114. Shelton A. M., and Mark K. S., (2001), The monarch butterfly controversy: scientific interpretations of a phenomenon. Plant Journal, V. 27(6), P. 483-488.

115. Schnepf E., Crickmore N., Vanrie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D. R., and Dean D. H., (1998), Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiology and Molecular Biology Reviews, V. 62(3), P. 775-806.

116. Schuler Т. H., Van Emden H. F., (2000), Degradation of the CrylAb protein within transgenic Bacillus thuringiensis corn tissue in the field, Agricultural and furest Entomology, V. 2, P. 3-28.

117. Schwartz J. L., Lu Y. J., Sohnlein P., Brousseau R., Laprade R., Masson L., and Adang M. J., (1997), Ion channels formed in planar lipid bilayers by B.t toxins in the presence of Manduca sexta midgut receptors. FEBS Lett., V. 412, P. 270-276.

118. Schwartz J. L., Garneau L., Masson L., and Brousseau R., (1991), Early response of cultured Iepidopteran cells to exposure to delta-endotoxin from B.t: involvement of calcium and anionic channels. Biochim. Biophys. Acta., V. 1065, P. 250-260.

119. Sekar V., (1988), The insecticidal crystal protein gene is expressed in vegetative cells of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis. Curr. Microbiol., V. 17, P. 347- 349.

120. Sekar V., Held В., Tippett J., Amirhusin В., Robert P., Wang K., and Wilson H. M., (1997), Biochemical and molecular characterization of the insecticidal fragment of CryV. Appl. Environ. Microbiol., V. 63, P. 2798-2801.

121. Shelton A. M., Roush R. Т., Tang J. D., Perez C. J., and Earle E. D., (1995), Presented at the XXVIIIth Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Cornell University.

122. Shimizu Т., and Morikawa К., (1996), The b-prism: a new folding motif. Trends Biochem. Sci., V. 21, P. 3-6.

123. Sims S. R., and Holden L. R., (1996), Insect bioassay for determining soil degradation of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki CrylA(b) protein in corn tissue. Environ. Entomol., V. 25, P. 659-664.

124. Sims S. R., and Ream J. E., (1997), Soil inactivation of the Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Cry2A insecticidal protein within transgenic cotton tissue: laboratory microcosm and field studies. J. Agric. Food Chem., V. 45, P. 1502-1505.

125. Slatin S. L., Abrams С. K., and English L., (1990), Delta-endotoxins form cation selective channels in planar lipid bilayers. Biochem. Biophys. Res Commun., V. 169, P. 765-772.

126. Smith G. P., and Ellar D. J., (1994), Mutagenesis of two surface exposed loops of the B.t CrylC endotoxin affects insecticidal specificity. Biochem. J., V. 302, P. 611-616.

127. Soltes-Rak E., Kushner D. J., Williams D. D., and Coleman J. R., (1993), Effect of promoter modification on mosquitocidal cry4B gene expression in Synechococcus sp. strain 7942. Appl. Environ. Microbiol., V. 59, P. 2404-2410.

128. Stephens J. M., (1952), Disease in codling moth larvae produced by several strains of Bacillus cereus. Can. J. Zool., V. 30, P. 30-40.

129. Stewart C. N., Raymer P. L., and Ramachandran S., (1997), Increased fitness of transgenic insecticidal rapeseed under insect selection pressure. Mol. Ecol., V. 6, P. 773779.

130. Stock C. A., McLoughlin T. J., Klein J. A., and Adang M. J., (1990), Expression of a. B.t crystal protein gene in Pseudomonas cepacia. Can. J. Microbiol., V. 36, P. 879-884.

131. Tabashnik В. E., Patin A. L., Dennehy T. J., Yong-Biao Liu, Yves Carriere, Sims M. A., and Larry A., (2000), Frequency of resistance to Bacillus thuringiensis in field populations of pink bollworm, PNAS, V. 97(24), P. 12980-12987.

132. Tabashnik В. E., (1992), Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol., V. 58, P. 3343-3346.

133. Tabashnik В. E., (1994), Evolution of resistance to B. thuringiensis. Annu. Rev. Entomol., V. 39, P. 47-79.

134. Tang J. D., Gilboa S., Roush R. Т., and Shelton A. M., (1997), Inheritance, stability, and lack-of-fitness costs of field-selected resistance to B.t in diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) from Florida. J. Econ. Entomol., V. 90, P. 732-741.

135. Те Giffel M. C., Beumer R. R., Klijn N. Wagendoф A., and Rombouts F. M., (1997), Discrimination between Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNA. FEMS Microbiol. Lett., V. 146, P. 4751.

136. TeatherR., and Wood P., (1982), Appl.Environm.Microbiol., V. 43, P. 777-780.

137. Thomas W. E., and Ellar D. J., (1983), Mechanism of action of Bacillus thuringiensis var. israelensis insecticidal delta-endotoxin. FEBS Lett., V. 154, P. 362-368.

138. Trisyono A., and Whalon M. E., (1997), Fitness costs of resistance to B.t in Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). J. Econ. Entomol., V. 90, P. 267-271.

139. Vadlamudi R. K., Ji Т. H., and Bulla L. A., (1993), A specific binding protein from Manduca sexta for the insecticidal toxin of B.t subsp. berliner. J. Biol. Chem., V. 268, P. 12334-12340.

140. Valaitis A. P., Mazza A., Brousseau R., and Masson L., (1997), Interaction analyses of Bacillus thuringiensis Cryl A toxins with two aminopeptidases from gypsy moth midgut brush border membranes. Insect Biochem. Mol. Biol., V. 27, P. 529-539.

141. Van Aarssen R., Soetaert P., Stam M., Dockx J., Gossele V., Seurinck J., Reynaerts A., and Cornelissen M., (1995), c/jlA(b) transcript formation in tobacco is inefficient. Plant Mol. Biol., V. 28, P. 513-524.

142. Van Rie J., McGaughey W. H., Johnson D. E., and Van Mellaert H., (1990), Mechanism of insect resistance to the microbial insecticide B. t. Science, V. 247, P. 72-74.

143. Von Tersch M. A., Slatin S. L., Kulesza C. A., and English L. H., (1994), Membrane-permeabilizing activities of Bacillus thuringiensis coleopteran-active toxin Cry3B2 and Cry3B2 domain I peptide. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 3711-3717.

144. Whalon M. E., Miller D. L., Hollingworth R. M., Grafius E. J., and Miller J. R., (1993), Selection of a Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) strain resistant to Bacillus thuringiensis. J. Econ. Entomol., V. 86, P. 226-233.

145. Wie I. S., and De Vos P., (2003), Properties of Bacillus thuringiensis isolated from bank voles. Journal of Applied Microbiology, V. 94, P. 60-64.

146. Williams S., Friedrich L., Dincher S., Carozzi N., Kessmann H., Ward E., and Ryals J., (1992), Chemical regulation of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin expression in transgenic plants. Bio/Technology, V. 10, P. 540-543.

147. Wolfersberger M. G., (1990), The toxicity of two Bacillus thuringiensis delta-endotoxins to gypsy moth larvae is inversely related to the affinity of bindingsites on midgut brush border membranes for the toxins. Experientia, V. 46, P. 475—477.

148. Wong H. C., Schnepf H. E., and Whiteley H. R., (1983), Transcriptional and translational start sites for the Bacillus thuringiensis crystal protein gene. J. Biol. Chem., V. 258, P. 1960-1967.

149. Wood, T.M., and Bhat K.M., (1988), Methods for measuring cellulose activities. Methods Enzymology, V. 160, P. 87-112.

150. Wraight C. L., Zangerl A. R., Carroll M. J., and Berenbaum M. R., (2001), Absence of toxicity of Bacillus thuringiensis pollen to black swallowtails under field conditions, Appl. Environ. Microbiol., V. 85, P. 1601-1610

151. Wu G., Cui H., Ye G., Xia Y., Sardana R., Cheng X., Li Y., Altosaar I., Shu Q., (2002), Inheritance and expression of the cryl Abgene in B.t transgenic rice, Theor. Appl. Genet., V. 104, P. 727-734.

152. Wu D., and Aronson A. I., (1992), Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis delta-endotoxin involved in toxicity and specificity. J. Biol. Chem., V. 267, P. 2311-2317.

153. Wu S. J., and Dean D. H., (1996), Functional significance of loops in the receptor binding domain of B.t СгуЗА delta-endotoxin. J. Mol. Biol., V. 255, P. 628-640.

154. Yaoi К., Kadotani Т., Kuwana H., Shinkawa A., Takahashi Т., Iwahana H., and Isato R., (1997), Aminopeptidase N from Bombyx mori as a candidate for the receptor of Bacillus thuringiensis CrylAa toxin. Eur. J. Biochem., V. 246, P. 652-657.

155. Yi S., Pang A. S. D., and Van Frankenhuyzen K., (1996), Immunocytochemical localization of Bacillus thuringiensis Cryl toxins in the midguts of three forest insects and Bombyx mori. Can. J. Microbiol., V. 42, P. 634-641.

156. Yong W. K., and Kim D. S., (2001), Herbicide-resistant genetically-modified crop: its risks with an emphasis on gene flow. Weed Biology and Management, V. 1, P. 42-52.

157. Yool A. J., (1994), Block of the inactivating potassium channel by clofilium and hydroxylamine depends on the sequence of the pore region. Mol. Pharmacol. V. 46, P. 970-976.

158. Yoshisue H., Шага К., and Komano Т., (1995), Expression of the genes for crystal proteins in B.t: cryAA, not сгуАЪ, is transcribed by RNA polymerase containing Sigma H and that containing Sigma E. FEMS Microbiol. Lett., V. 127, P. 65- 72.

159. Yu C. G., Mullins M. A., Warren G. W., Koziel M. G., and Estruch J. J., (1997), The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelial cells of susceptible insects. Appl. Environ. Microbiol., V. 63, P. 532-536.

160. Zhan H., Choe S., Huynh P. D., Finkelstein A., Eisenberg D., and Collier R. J., (1994), Dynamic transitions of the transmembrane domain of diphtheria toxin: disulfide trapping and fluorescence proximity studies. Biochemistry, V. 33, P. 11254-11263.

161. Zhang J., Schairer H. U., Schnetter W., Lereclus D., and Agaisse H., (1999), Bacillus popilliae crylSAa. operon is transcribed by Sigma E and Sigma К forms of RNA polymerase from a single initiation site. Nucleic Acid., V. 12, P. 562-570.

162. Zhu Y. C., Oppert В., Kramer K. J., McGaughey W. H., (2000), cDNA sequence, mRNA expression and genomic DNA of tripsinogen from the Indianmeal moth, Plodia Interpunctella, Insect molecular Biology, V. 9(1), P. 19—26.

163. Zques R. I., Moreno Fierros L., Neri-Baza L. Dela Riva N, G. A., Lopez Revilla R., (1999), Bacillus thuringiensis CrylAc Protoxin is a Potent Systemic and Mucosal Adjuvant, Scand. J. Immunol., V. 49, P. 578-584.

164. Zusheng L., and Piggot P. J., (2001), Development of a two-part transcription probe to determine the completeness of temporal and spatial compartmentalization of gene expression during bacterial development. PNAS., V. 98 (22), P. 12538-12543.

Информация о работе

Салехи Джузани Голам Реза
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы