Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A"

004611934

На правах рукописи

Булушова Наталья Владимировна

Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере 5-эндотоксииов СгуЗА и Сгу9А

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Москва 2010

004611934

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Научный руководитель:

кандидат химических наук Залунин Игорь Арсеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Вейко Владимир Петрович ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор химических наук, профессор, Руденская Галина Николаевна

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « » /¿¿РЛЗ/^Я^ 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан « » октября 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Насекомые - вредители запасов наносят существенный экономический ущерб. По данным Организации по продовольствию и сельскому хозяйству (ФАО) ООН, они ежегодно уничтожают не менее 5-10% мировых запасов зерновых культур. Из насекомых - вредителей запасов на территории нашей страны одним из наиболее опасных является большой мучной хрущак Tenebrio moütor .

В свою очередь, гусеницы пчелиной огневки Galleria mellonella наносят ощутимый вред пчеловодству. Так, потери воска, связанные с размножением этого насекомого, достигают по меньшей мере 20 % от его производства, а пораженность пчелиных семей составляет 10-28 % от их общего числа.

Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего, препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов, Cry-белков), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. Создание высокоэффективных биоинсектицидов данного класса для конкретных насекомых-вредителей, а также разработка путей предохранения от возникновения у них резистентности к этим препаратам требует знания процессов, происходящих при попадании эндотоксинов в организм насекомого-мишени. Таким образом, изучение различных стадий патологического эффекта 8-эндотоксииов (активации под действием кишечных протеиназ, связывания со специфическими токсинсвязывающими белками в мембранах кишечного эпителия, образования трансмембранных пор) является весьма актуальным.

Цели н задачи исследования. Целью работы было изучение взаимодействия энтомоцидных белков СгуЗА (5. thuringiensis ssp. tenebrionis) и Сгу9А (В. thuringiensis ssp. galleriae) с пищеварительной системой чувствительных к ним насекомых, личинок Т. molitor и гусениц G. mellonella, соответственно.

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучить первичные характеристики пищеварительных протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella и их участие в активации 5-эндотоксина Сгу9А;

- выделить из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. тоШог и гусениц & теИопеИа белки, специфически связывающие токсины, эффективные против этих насекомых (СгуЗА и Сгу9А, соответственно);

- изучить действие 8-эндотоксина СгуЗА на ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок большого мучного хрущака.

Научная новизна. В работе впервые:

- охарактеризован комплекс пищеварительных протеолитических ферментов гусениц С. те11опеИа\ получен препарат электрофоретически чистого трипсина из этого насекомого; доказана способность кишечных протеиназ б. теИопеИа эффективно активировать белок Сгу9А, токсичный против этого насекомого;

- методом аффинной хроматографии из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. тоШог выделены белки 66 и 58 кДа, специфически связывающие 8-эндотоксин СгуЗА, а из аналогичных мембранных препаратов гусениц б. теИопеИа - 67 кДа белок, специфически связывающий активированный токсин Сгу9А; произведена предварительная идентификация указанных белков;

- показано наличие в апикальных мембранах клеток кишечного эпителия личинок Т. тоШог ионных каналов и частично изучены их свойства; установлено, что 6-эндотоксин СгуЗА увеличивает проницаемость этих мембран, что связано либо с активацией собственных ионных каналов, либо с образованием новых, обладающих сходными свойствами.

Практическая ценность работы. Полученные данные о взаимодействии энтомоцидных токсинов СгуЗА и Сгу9А с элементами пищеварительной системы личинок Т. тоШог и гусениц С. теИопеИа создают базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного эффекта этих белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов нового поколения с существенно повышенной эффективностью против насекомых - вредителей запасов и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008) и IV Симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).

Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика»

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 36 рисунков и 7 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 235 источников, в том числе 6 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение комплекса пищеварительных протеина:» гусениц G. meUonclla (состав, свойства, ограниченный протеолиз 5-эндотоксина Сгу9А)

Анализ ферментного состава протеолнтнчсского комплекса средней кишки гусениц G. mellonella с помощью различных субстратов протенназ. Изучение протеолитической активности проводили на экстрактах передней (anterior midgud, AM) и задней (posterior midgud, РМ) частей средней кишки гусениц G. mellonella достигших III-IV стадии роста. Энзиматические активности выражали в единицах приходящихся на одно насекомое.

Суммарную протеолитическую активность изучали по способности экстрактов из AM и РМ G. mellonella гидролизовать белковый субстрат - азоказеин.

0,6 -0,5 0,4

о in

0,3 -

<

0,2 0,1 0

0

pH

Рисунок 1. Определение pH оптимума общей протеолитической активности экстракта из AM и РМ G. mellonella. В качестве субстрата использовали азаказеин. Требуемые значения pH создавали с помощью 30 мМ универсального буфера.

Эта активность была максимальной при рН 10,7 (рис. 1). Ниже рН 8,0 активность начинала быстро падать и к рН 6,0 доходила практически до нуля. Было показано, что рН содержимого средней кишки гусениц в. те11опе11а равен 8,5. При этом рН активность составляла 62 и 58% от максимальной (для АМ и РМ, соответственно).

Как видно из таблицы 1, при рН 8,5 суммарная протеолитическая активность экстракта из АМ составляет около 0,53 единицы, из РМ - 0,28 единицы. Таким образом, 65% протеолитической активности средней кишки в. теИопеНа сосредоточено в ее переднем отделе, 35% - в заднем отделе.

Содержание представителей различных классов протеиназ (сериновых, цистеиновых и металлопротеиназ) определяли с помощью специфических р-нитроанилидных субстратов. Максимальную активность мы наблюдали по гидролизу ВгЯрЫА, специфическому субстрату трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ. Однако, отсутствие увеличения (и даже уменьшение) интенсивности гидролиза данного субстрата при прибавлении 5мМ дитиотреитола (ДТТ) говорит об отсутствии активности цистеиновой протеиназы в кишечном экстракте данного насекомого при рН 8,5.

Таблица 1. Определение протеолитической активности экстрактов из АМ и РМ & теИопеНа с помощью различных субстратов протеолитических ферментов.

Субстрат Активность (единиц/насекомое)

рН 8,5 рН 10,7

АМ РМ АМ РМ

Азоказеин 0,528 0,275 0,851 0,481

Азоказеин5мМ,ггг 0,321 0,180

ВгЛрЫА 0,114 0,068 0,157 0,106

ВгКрИА5"" дтг* 0,089 0,054

РогААРрИА 0,011 0,005 0,014 0,006

СТрААЬрКА 0,018 0,015

йисААРГрИА 0,068 0,066

ОпрАЛЬК-Шг 0,016 0,015

гААРрЫА** 0,0018 0,00044

Инкубацию проводили в присутствии 5 мМ ДТТ Определение активности проводили при рН 8,0 ВгЯрЫА - бензоил-аргинин-ияра-нитроанилид; ОпрАА1,11-»Н2 - амид 2,4-динитрофенил-аланил-алапил-ленцнл-аргинина; РогААРрЫА - формил-аланил-аланил-фенилаланин-лара-нитроанилид; 01рААЬрЫА - пироглутамил-аланил-аланил-лейцин-иаря-нитроанилид;

ЗисААРРрКА - сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланин-гара-нитроанилид; 2-ААРрКА -бензилоксикарбонил-апанил-аланил-пролин-ларя-нитроанилид

Из трёх использованных нами субстратов химотрипсина, ForAAFpNA, GlpAALpNA и SucAAPFpNA, только в случае последнего отщепление р-нитроанилина протеиназами средней кишки G. mellonella происходит с относительно высокой скоростью, хотя и с меньшей, чем в случае BzRpNA. Это не удивительно, поскольку показано, что химотрипсины насекомых предпочитают более длинноцепочечные субстраты, чем химотрипсины млекопитающих.

Результаты, полученные при использовании в качестве субстрата DnpA;\LR-NH2 (таблица 1) дают возможность предположить наличие в кишечных экстрактах G. mellonella металлопротеиназы. Однако утверждать этого нельзя, поскольку аналогичный эффект может быть достигнут с помощью других протеиназ, например химотрипсина или эластазы. Активность по ZAAPpNA (таблица 1) (0,0018 ед./насекомое) предполагает наличие в средней кишке пчелиной огневки постпролиновой эндопептидазы.

Таким образом, протеолитическая активность кишечных экстрактов G. mellonella связана с наличием сериновых протеиназ, в основном, трипсина и химотрипсина.

Ингпбнторнын анализ кишечных протеиназ С. mellonella. Ингибиторный анализ (таблица 2) подтвердил сделанные выше выводы о ферментном составе протеолитического комплекса кишечных экстрактов G. mellonella. То, что основной вклад в его активность вносят сериновые протеиназы - трипсин и химотрипсин - доказывается сильным подавлением гидролиза азоказеина диизопропилфторфосфатом (DFP). Гидролиз специфичных субстратов подавлялся DFP полностью. Фенилметилсульфоиилфторид (PMSF) ингибировал гидролиз данных субстратов менее эффективно, а вот соевый ингибитор трипсина STI, как правило, был близок по эффективности ингибирования DFP.

Под действием тозил-Ь-лизин-хлорометилкетона (TLCK), специфического ингибитора трипсина, гидролиз азоказеина уменьшался примерно наполовину (58% остаточной активности в случае экстракта AM и 45% - РМ) (таблица 2). Следовательно, в ходе гидролиза белковых субстратов кишечным экстрактом этого насекомого роль трипсина и химотрипсина приблизительно одинакова. К сожалению, специфический ингибитор химотрипсинов млекопитающих тозил-Ь-фенилаланин-хлорометилкетон (ТРСК) не всегда ингибирует химотрипсины насекомых, поэтому подтвердить полученные данные при использовании этого ингибитора нам не удалось.

Ингибиторы цистеиновой протеиназы (Е-64 и иодацетамид) не влияли на гидролиз ни азоказеина, ни специфических субстратов. Это подтверждает, что указанные ферменты, либо вообще отсутствуют в кишечном соке, либо не вносят ощутимого вклада в его активность при pH 8,5.

Таблица 2. Ингибиторный анализ протеолитической активности экстракта АМ и РМ средней кишки гусениц й. теНопеИа по отношению к различным субстратам.

Ингибиторы Концентрация ингибитора, мМ азоказеин ВгЯрКА БогААРрКА ИрААЬрКА гч X Ъ с* ^ & а

АМ РМ АМ РМ АМ РМ АМ РМ АМ РМ

ОРР 1 17,5 9,5 1,4 0,0 0,9 0,0

3 0,18 0,0 29,5 28,0

РМЭР 5 43,5 34,1 25,0 13,6 33,3 9,9

ЭТ1 0,01 20,7 12,8 6,8 0,0 40,4 0,0

тьск 0,135 57,6 45,0 4,5 0,0 102 94,9 94,7 83,9

ТРСК 0,285 95,7 101 99,6 99,5 87,5 79,7 89,2 90,6

итт 5 60,8 65,6 75,9 75,4

Бензамидин 0,1 41,4 1,75

1 16,2 0,0

Е-64 0,001 103 107 90,0

0,01 101 102 121 98,3 92,9 106 93,1

Е-64+ОРР 10 34,7

Иодацетамид 0,1 102 101

1 97,2

ЭДТА 10 147 122 92,2

ЭГТА 10 141 106

о-фенантролин 2,5 106 90,0 51,8 59,1 66,7 65,3

о-фенантролин -ЮРР 0,0 22,9

В таблице представлены значения остаточной активности кишечного сока й. теЦопеИа в процентах от его исходной активности по указанному субстрату.

Из ингибиторов металлопротеиназ о-фенантролин лишь незначительно подавляет гидролиз азоказеина кишечными экстрактами, а ЭДТА и ЭГТА даже активируют его. Это говорит об отсутствии существенного вклада металлопротеиназы в гидролиз белков. В то же время, активность по гидролизу субстрата DnpAALR-NH2, используемого обычно для тестирования активности металлопротеиназ, на 70-72% подавлялась ДФФ и на 33-35% - о-фенантролином, что позволяет предположить, что эта активность обусловлена в значительной степени сериновыми химотрипсиноподобными протеиназами, а также и металлопротеиназами. Поскольку одновременное добавление в инкубационную среду DFP и о-фенантролина всё равно не привело к полному ингибированию гидролитической активности по DnpAALR-NH2, можно предположить наличие в средней кишке гусениц фермента, не относящегося ни к сериновым, ни к металлопротеиназам. Возможно, он относится к ферментам с неидентифицированным типом активности, описанным для некоторых членистоногих.

Изучение ферментного состава протеолитического комплекса экстракта средней кишки G. melloneUa методом зимографии. Для многих видов гусениц характерно продуцирование целого ряда изоформ пищеварительных ферментов. Существование множественных форм трипсина и химотрипсина связано с адаптацией насекомого к потреблению растительной пищи, содержащей различные ингибиторы протеиназ. Ферментный состав протеолитического комплекса средней кишки гусениц G. mellonella был изучен методом зимографии. Для этого белки кишечного экстракта разделили с помощью электрофореза в нативных условиях и определили их протеолитическую активность.

Для определения общей протеолитической активности в качестве субстрата был использован желатин, а триптическую и химотриптическую активности изучали с помощью специфичных р-нитроанилидных субстратов (BzRpNA, ForAAFpNA и GlpAALpNA).

На рисунке 2(а) можно видеть три компонента, мигрирующих к аноду при рН 7,4 (анионные формы (Gl-З)), и гидролизующих желатин. Среди белков, заряженных при рН 7,4 положительно (катионные формы) (рис. 26), имеется два медленно мигрирующих компонента, способных гидролизовать желатин (G4-5). Это говорит о наличие в экстракте средней кишки не менее пяти протеолитических ферментов.

Также здесь мы видим, что трипсиноподобные ферменты представлены в кишечном экстракте G. mellonella в виде трёх анионных (Т1-3) и двух катионных форм (Т4-5), химотрипсины представлены одной анионной формой (Cl) и одной катионной формой (С 2), плохо входящей в гель. Аналогичные результаты получены при изучении изоформ протеолитических ферментов РМ.

а

б

"" j

тз->

G5 С4

сг-р.

Т4-»>

+

Т2-*.

Т1-+- С1-+- С1->

+

желатин BzRpNA GlpAALpNA ForAAFpNA желатин BzRpNA GlpAALpNA

Рисунок 2. Использование метода зимографии для выявления компонентов протеолитического комплекса средней кишки гусениц G. mellonella, обладающих желатинолитической, триптической и химотриптической активностями. Белки кишечного экстракта из AM разделяли в: (а) анионной и (б) катионной электрофоретических системах. На электрофоретические гели накладывали гели, содержащие желатин, или нитроцеллюлозные фильтры, пропитанные одним из указанных на рисунке субстратов, и полученные сэндвичи инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Стрелками указано положение полос, в которых была обнаружена желатинолитическая (Gl-5), триптическая (Т1-5) и химотриптическая (С1-2) активности.

Изучение ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки G. mellonella методом ионообменной хроматографии. Экстракт средней кишки гусениц G. mellonella был хроматографирован при pH 7,4 на анионообменнике HiTrapQ. На рисунке 3 показано, что белки, обладающие триптической активностью, элюировались с колонки тремя пиками (Tri, Trll и ТгШ), тогда белки с химотриптической активностью -одним (Chi), частично совпадающим с третьим пиком триптической активности.

Выделение и характеристика фермента с триптической активностью из кишечного экстракта гусениц G. mellonella. Комбинацией ионообменной хроматографии на колонке MonoQ и аффинной хроматографии на колонке с бензамидин-сефарозой из кишечного экстракта гусениц был получен препарат трипсина Tr II. Использование метода зимографии показало, что препарат трипсина содержит один компонент, обладающий одновременно как желатинолитической активностью, так и способностью гидролизовать BzRpNA (рис. 4).

НаС1 [М] Д410 ■1,0Г 1,0

50 100

Объем злнзента, мл

150

Рисунок 3. Хроматография экстракта средней кишки гусениц С?. теНопеИа на анионообменнике ШТгарС). На рисунке изображены профили элюции белков (ОЕ280), а также триптической и ------- химотриптической активностей.

а

А280

0,125

ОЕ280

активность по BzRpNA

А410

0.5

кДа

130 -95 ' ~2 » 55 » 43 -34 * 26 т

1"

10

М 1

15

Объем элюента, мл

Рисунок 4. (а) Очистка трипсина из экстракта средней кишки гусениц <3. теИопеИа на бензамидин-сефарозе. (б) Анализ препарата очищенного трипсина методами электрофореза в денатурирующих условиях (Г) и зимографии (2,3). Препарат очищенного трипсина подвергали электрофорезу в нативных условиях в анионной электрофоретической системе. Для детекции энзиматической активности использовали в качестве субстрата желатин (2) или ВгЯрЫА (3). М - стандарты молекулярной массы.

Электрофорез в денатурирующих условиях выявил наличие одной полосы с молекулярной массой 28 кДа (рис. 4). Для данного белка была установлена следующая N-концевая последовательность аминокислот: Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Leu-Thr-Thr-Ile-Glu, полностью совпадающая с N-концевой последовательностью зрелого трипсина из гусеницы Plodia interpunctella. Кроме того, она имеет 70 - 90 % совпадения с N-концевыми последовательностями трипсинов из таких представителей семейства Lepidoptera, как Sesamia nonagrioides, Heliothis virescens, Helicoverpa armígera, а также из Aedes aegypti и некоторых видов Drosophila (все - Díptera).

Комбинацией ионообменной хроматографии на колонке MonoQ и гель-проникающей хроматографии на колонке Superdex 75 из кишечного экстракта гусениц был получен препарат химотрипсина. Электрофорез в денатурирующих условиях показал, что этот препарат содержит примеси других белков. Однако в нём полностью отсутствовала триптическая активность, что было очень важно для последующих исследований.

Протеолиз белков кристаллов В. thuringienses ssp. galleriae экстрактом средней кишки гусениц G. mellonella и некоторыми присутствующими в нём ферментами.

Энтомоцидные кристаллы В. thuringienses ssp. galleriae содержат вместе с высокотоксичным Сгу9А, другие Cry-белки, слабо токсичные для гусениц G. mellonella. Мы изучили ход протеолиза суммарного раствора Сгу-белков, составляющих кристалл ssp. galleriae, кишечным экстрактом этого насекомого и отдельными протеолитическими ферментами, выделенными из него.

На рисунке 5 видно, что в процессе часовой инкубации токсинов с кишечным экстрактом происходит постепенное уменьшение молекулярной массы исходных токсинов (130 кДа). Наименьшее количество кишечного сока, необходимое для начала протеолиза -0,05x10'3 единиц триптической активности на 1 мг белка токсинов. При соотношении 6,25x10° ед /мг кишечный экстракт гидролизует большую часть исходного белка до фрагментов с мол. весом 65 кДа. Следовательно, для активации летального количества токсина (6 мкг на насекомое, установлено ранее в нашей лаборатории) требуется 3,75x10"5 единиц триптической активности, что в 3000 раз меньше того количества, что присутствует в средней кишке одной гусеницы (табл. 1). Таким образом, активация протоксина Сгу9А не является скорость-лимитирующей стадией при действии этого белка на пчелиную огнёвку.

Препараты трипсина и химотрипсина, выделенные нами из кишечного экстракта данного насекомого, действуют похожим образом при аналогичных соотношениях фермент:белок. Из этого следует, что оба фермента принимают участие в ограниченном протеолизе Сгу-белков.

кДа

1"0

130

95 "2

55 т»

43 — 34 «•

26 «.

а

б

«II!

I шА Ш

-г -

>r, ч, V, o o

* ® (-1 F ir, с

« -ó ч© й '"-O

в У' W"

— <Ч лц О ^

о н

Рисунок 5. Ход ограниченного протеолиза белков кристаллов В. thuringiensis ssp. galleriae. 20 мкг раствора кристаллов инкубировали с экстрактом средней кишки гусениц G. mellonella (а, д), препаратами трипсина (б) и химотрипсина (в), выделенными из данного насекомого, а также коммерческим препаратом бычьего химотрипсина (г). Ход протеолиза детектировали с помощью окраски гелей раствором Кумасси R250 (а-г), или посредством вестерн-блоттинга с использованием специфической поликлональной антисыворотки к эндотоксину Сгу9А (д). Кишечный экстракт и препарат очищенного трипсина добавляли в количестве, указанном внизу рисунка х 10 \ в единицах триптической активности на мг белка S-эндотоксинов; препарат химотрипсина и препарат бычьего химотрипсина - в единицах химотриптической активности на мг энтомоцидных белков. В лунке «токсин» - исходный раствор кристаллов, в лунке «х/тр» -препарат химотрипсина. М- стандарты молекулярной массы. Стрелки указывают на фрагменты 46 и 49 кДа, полученные при гидролизе токсинов ssp. galleriae препаратом химотрипсина гусениц.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что бычий химотрипсин способен к более глубокому протеолизу белка Сгу9А до фрагмента 49 кДа. Выделенный нами из гусеницы химотрипсин также способен образовывать фрагменты с молекулярным весом 49 и 46 кДа, причем при меньшем соотношении единиц активности на 1 мг белка, нежели бычий химотрипсин.

Для подтверждения того, что кишечный экстракт пчелиной огнёвки в числе прочих гидролизует и 5-эндотоксин Сгу9А, мы применили метод вестерн-блоттинга с использованием специфической сыворотки на данный токсин. Полученные данные показывают (рис.5), что Сгу9А подвергается протеолизу с той же эффективностью, что и другие 8-эндотоксины ssp. galleriae.

2. Выделение токсинсвязывающих белков из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. molitor и гусениц G. mellonella.

Взаимодействие с токсинсвязывающим белком, экспонированным в апикальной мембране эпителиальных клеток средней кишки насекомого, является одним из основных этапов патологического действия Cry-белков. В настоящее время на роль рецепторов различных 6-эндотоксинов В. thuringiensis претендуют представители следующих классов мембранных белков: аминопептидазы N, кадгериноподобные белки, щелочные фосфатазы, а-амилазы, ADAM металлопротеиназа, А и В субъединицы V-АТФазы и ряд других. В данной работе для выделения из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. molitor и гусениц G. mellonella белков, способных специфически связывать токсины СгуЗ А и Сгу9А, соответственно, была использована аффинная хроматография.

Белковый состав апикальной мембраны клеток кишечного эпителия. В

качестве источника токсинсвязывающих белков были использованы препараты апикальных мембран кишечного эпителия, полученные в форме везикул BBMV (brush border membranes vesicles). Метод получения BBMV основан на осаждении ионами магния компонентов кишечного гомогената и дифференциальном центрифугировании. За степенью очистки BBMV следили по повышению удельной активности маркера апикальных мембран - лейцинаминопептидазы.

Препараты BBMV были получены из обоих отделов средней кишки Т. molitor (AM и РМ). В случае РМ апикальные мембраны были очищены в 22 раза. В случае AM оценить степень очистки не удалось, поскольку в этом отделе средней кишки данного насекомого активность лейцинаминопептидазы отсутствует.

В случае гусеницы G. mellonella, BBMV были выделены из полноразмерной средней кишки, причём была достигнута 18-кратная степень очистки апикальных мембран.

Для экстракции мембранных белков из BBMV, полученных из AM и РМ Т. molitor, были использованы буфера, содержащие различные детергенты: DS-Na, NONIDET Р40, CHAPS, н-окггилгликозид. Белковый состав полученных экстрактов очень близок. На электрофорезе можно видеть около двадцати полос с молекулярной массой от 20 до 200 кДа (рис. 6).

В дальнейших экспериментах был использован экстракт, полученный под действием н-октилгликозида.

Похожая, хотя и неидентичная картина получалась и при обработке буферами, содержащими вышеперечисленные детергенты, препаратов BBMV G. mellonella (данные не приводятся).

щ кДа Т 170 1 I30

95 72

L. 55 43

I 34 26

Рисунок 6. Белковый состав экстракта, полученного при обработке ВВМУ из РМ Т. то!Ног ОЭ-Ыа. На 10% ПААГ нанесены: 1-экстракт, М - стандарты молекулярной массы.

1 М

Выявление СгуЗА-связывающих белков в составе ВВМУ Т. тоШог.

Идентификацию токсинсвязывающих белков в полученных препаратах ВВМУ проводили посредством лиганд-бдатгинга. Экстракты ВВМУ из АМ и РМ личинок Т. тоШог были подвергнуты электрофорезу с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Инкубация полученных реплик с биотинилированным токсином СгуЗА показала наличие четырёх окрашивающихся полос с молекулярной массой 120, 95, 58 и 30 кДа (рис. 7).

кД-| кДа

170

120-t- 130

95 9?

72

58 ч- 55

43

34

30^- 26

1 2 3 4 M

Рисунок 7. Визуализация токсинсвязывающих белков из BBMV, полученных для AM (2) и РМ (1,3,4) Т. molitor с помощью лиганд-блоттинга. Нитроцеллюлозные реплики подвергали следующей обработке: (1,2) инкубировали с биотинилированным СгуЗА и окрашивали с помощью биотин-стрептавидиновой системы; (3) окрашивали также, но без предварительной инкубации с токсином; (4) окрашивали Понсо S. (М) - стандарты молекулярной массы, Стрелками обозначены визуализированные полосы с указанием молекулярной массы соответствующих белков.

Полоса 30 кДа окрашивается и при инкубации с одним конъюгатом и, видимо, соответствует неидентифицированному мембранному белку, содержащему биотин. Полоса, соответствующая белку 120 кДа, являлась мажорной при окрашивании нитроцеллюлозных фильтров с помощью Понсо S, так что мы не наблюдали

относительного усиления её окрашивания при лиганд-блоттинге. А вот интенсивность окрашивания полос 95 и 58 кДа в случае лиганд-блоттинга резко возрастает по сравнению с картиной, наблюдаемой при окраске на белок, что делает соответствующие компоненты кандидатами на роль токсинсвязывающих белков из BBMV Т. molitor. Результаты лиганд-блоттинга для BBMV, полученных из AM и РМ, похожи, в силу чего, дальнейшие эксперименты проводили с препаратами, полученными из РМ.

К сожалению, эксперименты по лиганд-блоттингу имеют тот недостаток, что мембранные белки претерпевают денатурацию в ходе взаимодействия с буфером для образцов, содержащим DS-Na. Поэтому данные лиганд-блоттинга требуют проверки в системе, в которой с токсинами взаимодействуют нативные мембранные белки. В нашей лаборатории был разработан метод выделения нативных специфических токсинсвязывающих белков посредством аффинной хроматографии, который и был использован в работе.

Выделение токсинсвязывающих белков из BBMV кишечного эпителия Т. molitor и G. mellonella. Для выделения токсинсвязывающих белков из апикальной мембраны кишечного эпителия гусеницы G. mellonella был синтезирован аффинный сорбент на основе активированного токсина Сгу9А: Сгу9Аб5кда- аминогексилагароза. В ходе хроматографии на данном сорбенте экстракта белков, полученного при действии на BBMV G. mellonella неионного детергента «-октилгликозида, 0,1 М N-ацетилгалактозамин элюировал с колонки белок с мол. массой 67 кДа, связывающий биотинилированный Сгу9А65кДа в условиях лиганд-блоттинга (рис. 8а).

б

кДа Г О 150

95

2 ~<Г кДа - 66 кДа

55 — 58 кДа

45

¡N11 2 3

Рисунок 8. Электрофоретичесюш анализ фракций, полученных в ходе аффинной хроматографии (а) белков BBMV G. mellonella на сорбенте Сгу9Аб5кдв-аминогексилагароза: 1- белок, элюированный с сорбента 0,1 М N-ацетилгалактозамином, М - стандарты молекулярного веса, (б) белков BBMV Т. molitor на сорбенте СгуЗА-МкДа-аминогексилагароза: 2- белки не связавшиеся с сорбентом, 3 -белки, элюированные с сорбента 1 М NaCl. Гели проявляли методом лиганд-блоттинга, используя в качестве лиганда соответствующие биотинилированные токсины.

К сожалению, СгуЗА обладает плохой растворимостью при рН ниже 10,0, что затрудняет его применение для синтеза аффинных сорбентов. Использование для этой цели 49 кДа продукта ограниченного протеолиза СгуЗА, обладающего существенно большей растворимостью, было более перспективным, но требовало доказательства наличия у этого фрагмента биологической активности по отношению к личинкам Т. тоШог.

С этой целью был получен химотриптический гидролизат 5-эндотоксина СгуЗА, содержавший фрагменты 65; 59; 55,5 и 49 кДа, причём последний был преобладающим (рис. 9). В ходе хроматографии этого гидролизата на анионообменнике МопоС? были получены четыре фракции (рис. 9).

Фракция 1 содержала химотрипсин, тогда как во фракциях 2-4 с колонки элюировали продукты гидролиза СгуЗА, причём в пике 2 компоненты гидролизата присутствовали в приблизительно одинаковых количествах, тогда как во фракциях 3 и 4 фрагмент с молекулярной массой 49 кДа содержал лишь небольшую примесь других фрагментов (рис. 9).

а б

А280 МаС1.[М]

кДа

25 50 12 3 4

Объем элюента. мл

Рисунок 9. (а) Анионообменная хроматография химотриптического гидролизата 5-эндотоксина СгуЗА на колонке МопоС), уравновешенной 50 мМ карбонатным буфером, рН 9,4. Элюцию осуществляли градиентом концентрации №С1 (0-1М) в том же буфере, (б) Электрофорез фракций, полученных в ходе анионообмепной хроматографии химотриптического гидролизата СгуЗА. (исх) - исходный гидролизат; (1,2,3,4) - фракции, соответствующие полученньм при хроматографии.

Изучение биологической активности показало, что гибель личинок Т. тоШог от продуктов протеолиза СгуЗА, элюировавшихся с колонки в составе фракций 2 и 4, практически не отличается от их гибели от кристаллов взр. гепеЬгютй, как на 15-е, так и

на 21-е сутки (таблица 3). Величины ЛВ50, т.е. время, за которое гибнет 50% насекомых, для обеих фракций также статистически не отличаются от соответствующего показателя для кристаллов.

Таблица 3. Смертность личинок Т. то!Ног при действии кристаллов В. ¡Ииг^епзи Бэр. геиейп'оии и продуктов протеолиза 5-эндотоксина СгуЗА

Препарат Белок Смертность (%, М±Д) J1B50 (сутки,

(мг/г корма) 15 сут. 21 сут. мин-макс)

Кристаллы В. 1Ъигт£1ет1$ яхр. гепеЪгютв 0,3 47±13 80±23 14-16

Фракции, полученные в ходе хроматографии химотриптического гидролизата СгуЗА: фракция 1 1,4 0 0

фракция 2 0,3 59 ±2 9 89 ±1 15-17

фракция 4 0,3 53 ±4 87 ± 13 15-17

Из полученных данных следует, что 49 кДа фрагмент СгуЗА (СгуЗА49кДа) не отличается от исходного 8-эндотоксина по токсичности для личинок Т. molitor, что делает правомерным его использование для выделения СгуЗА-связывающих белков.

При хроматографии на колонке СгуЗА^кДз-аминогексилагароза экстрактов, полученных при обработке BBMV из РМ Т. molitor н-октилгликозидом, большая часть мембранных белков не связывалась с сорбентом и выходила в проскоке. В тоже время 1 М NaCl элюировал белки с мол. массой 66 и 58 кДа, способные реагировать с биотинилированными токсинами СгуЗА и СгуЗА49кда в условиях лиганд-блоттинга (рис. 8).

Поскольку связывание с аффинным сорбентом происходит в условиях, близких к нативным, то можно сделать вывод, что выделенные нами белки способны связываться с токсинами не только в денатурированном (условия лиганд-блоттинга), но и в нативном состоянии.

Взаимодействие выделенных из BBMV Т. molitor и G. mellonella белков с токсинами В. thuringiensis, обладающими различной специфичностью энтомоцидного эффекта. Изучение специфичности связывания является важным этапом в доказательстве участия данного токсинсвязывающего белка в исполнении рецепторной функции in vivo. В условиях лиганд-блоттинга белки, элюируемые 1М NaCI с СгуЗА49кДа-аминогексилагарозы, одинаково реагируют с биотинилированными 8-эндотоксином СгуЗА, и его 49кДа фрагментом, взятыми в концентрации 4 мкг/мл. В тоже время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными токсинами Cryl 1А (обладающим

16

москитоцидной активностью) и Сгу9А65кда (действующим на гусениц), используемыми в концентрации 8 мкг/мл (рис. 10). Эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 66 кДа и 58 кДа белками из Т. тоНгог при взаимодействии с эндотоксином СгуЗА.

В свою очередь, 67 кДа белок, элюированный с колонки Сгу9А(,5кДа-аминогексилагароза 0,1 М Ы-ацетилгалактозамином, не проявлялся при обработке нитроцеллюлозных реплик биотинилированными токсинами СгуЗА, СгуЗА49Кда и Сгу11А, не эффективными против гусениц & те11опе11а, а также биотинилированным БСА (данные не приводятся), что говорит о специфичности его связывания с Сгу9А(,5кда.

ббкДа

58кДа «

1 2 3

Рисунок 10. Изучение связывания белками, элюированными с СгуЗА4е)кдл-аминогексилагарозы, 5-эндотоксинов В. Аипп&ет'я различной специфичности. Нитроцеллюлозные реплики, содержащие 66 и 58 кДа белки, инкубировали со следующими биотинилированными токсинами: 1- СгуЗА, 2 - Сгу9Аб5кДа, 3- Сгу11А.

Обработка нитроцеллюлозных реплик, содержащих белки, элюированные с аффинного сорбента, СгуЗА49кда-аминогексилагароза, смесью биотинилированного токсина СгуЗА и 20-кратного избытка его небиотинилированного варианта (гомологическая конкуренция) не приводила к визуализации соответствующих полос. Из этого следует, что связывание указанных белков с СгуЗА не является следствием биотинилирования последнего. Зато присутствие 20-кратного избытка небиотинилированных Сгу11А и Сту9Аб5кда. (гетерологическая конкуренция) не отражалось на способности биотинилированного СгуЗА окрашивать полосы 66 и 58 кДа, что лишний раз свидетельствует о специфичности связывания. Полученные данные суммированы в таблице 4. Аналогичные результаты были получены при использовании в экспериментах по гомологической и гетерологической конкуренции биотинилированного СгуЗА49кДа.

Таблица 4. Специфичность взаимодействия белков, полученных в ходе аффинной хроматографии, с различными Сгу-токсинами в экспериментах по лиганд-блотгингу.

Элюированные белки Токсины Окрашивание полос

биотинилированный токсин (2,5 мкг/мл) небиотинилированный токсин (50 мкг/мл)

66 и 58 кДа белки из BBMV Т. molitor Cry ЗА.,9 есть

СгуЗА49 СгуЗА49 нет

СгуЗА49 Сгу9А65 есть

СгуЗА49 CryllA есть

Сгу9А65 нет

CryllA - нет

67 кДа белок из BBMV G. mellonella Сгу9А65 _ есть

СгуЗА _ нет

CryllA - нет

Идентификация токсинсвязывающих белков BBMV Т. molitor н G. mellonella.

Материал, содержащийся в полосе, соответствующей 67 кДа белку из BBMV G. mellonella, был проанализирован автоматическим методом Эдмана и установлена следующая последовательность остатков аминокислот: Leu-Asn-Leu-Asn-Gln-Asn-Leu. В ресурсе "Proteins" в NCBI последовательности белков G. mellonella отсутствуют. Использование ресурса первичных структур белков Lepidoptera позволило обнаружить 71% совпадения при сравнении указанной последовательности с последовательностью аминокислот аминопептидазы N4 Plutella xylostella (accession number AAS75552) на отрезке между остатками 98 - 104. Более того, среди банка расшифрованных последовательностей белков Lepidoptera отсутствуют другие кандидаты на роль ортологов изучаемого белка. Аминопептидазы являются одним из наиболее распространенных классов рецепторов Cry-токсинов. К сожалению, по величине мол. массы выделенный нами белок меньше аминопептидазы N4 P. xylostella (106,6 кДа,) и других аминопептидаз чешуекрылых (100-170 кДа). Остаётся предположить, что нами был выделен продукт ограниченного протеолиза аминопептидазы N G. mellonella.

Исходя из данных масс-спекгрометрии, 58 кДа-белок был идентифицирован нами как а-амилаза Т. molitor (Р56634). Имеются сообщения о том, что некоторые белки, относящиеся к семейству а-амилаз, служат рецепторами ряда токсинов В. thuringiensis. Эти белки связаны с мембраной посредством GPI-якоря, в то время как описанная а-амилаза Т. molitor является растворимым белком и не имеет потенциального сайта GPI-модификации.

Однако 58кДа белок выделен нами из BBMV насекомого. Можно предположить, что он является неописанной до настоящего времени мембранной формой а-амилазы Т. molitor. С другой стороны, нельзя исключить, что растворимая а-амилаза Т. molitor может образовывать комплекс с мембранными белками кишечного эпителия.

Масс-спектрометрическое исследование показало, что 66 кДа белок из BBMV Т. molitor обладает сходством с А-субъединицей V-АТФазы из малого мучного хрущака Tribolium castaneum. Факт, что субъединица V-АТФазы демонстрирует специфическое сродство к Сгу-белку не является неожиданностью, поскольку ранее похожие результаты были получены при идентификации Сгу1Ас-связывающих белков из BBMV Heliothys virescens.

Таким образом, в ходе проведенных исследований нам удалось идентифицировать токсинсвязывающие белки из кишечного эпителия гусениц G. mellonella и личинок Т. molitor. Однако, требуются дополнительные исследования для доказательства того, что эти белки действительно выполняют роль рецепторов активированного токсина Сгу9А и 8-эндотоксина СгуЗА в организме указанных насекомых in vivo.

3. Изучение действия 5-эндотокснна СгуЗА на ионную проницаемость апикальной мембраны эпителиальных клеток средней кишки личинок Т. molitor

Следующая стадия токсического эффекта Сгу-белков заключается в том, что конформационные изменения в молекулах токсина, вызванные его взаимодействием с рецептором, приводят к образованию им пор или ионных каналов в апикальной мембране эпителиальных клеток чувствительного насекомого.

До настоящего времени большинство исследований мембранотропного эффекта Сгу-белков проводилось на препаратах мембран кишечного происхождения из гусениц-фитофагов, которые существенно отличаются от личинок многих других насекомых по физиологическим и биохимическим особенностям пищеварительной системы. Вместе с тем аналогичные исследования для личинок жуков практически не проводились.

Для доказательства способности Сгу-белков образовывать в апикальных мембранах чувствительных насекомых поры или ионные каналы применяются несколько модельных систем, одной из которых является использование потенциал-чувствительных красителей. Эти красители способны проникать внутрь мембраны, причем их проникающая способность зависит от трансмембранного потенциала. Краситель, связанный с мембраной, существенно отличается по своим оптическим свойствам от свободного красителя. Обычно с этой целью применяется краситель Dis-C3-(5). В данной работе

впервые использованы другие потенциал-чувствительные красители, сафранин О и оксонол VI, а также акридиновый оранжевый, чья поглощающая способность зависит не от трансмембранного потенциала, а от градиента концентраций ионов водорода.

В настоящее время в литературе существуют довольно противоречивые данные о наличии собственных ионных каналов в апикальных мембранах эпителиальных клеток средней кишки насекомых, поэтому первая серия экспериментов была направлена на изучение собственной проводимости препарата апикальных мембран Т. то1Иог.

Помещение ВВМУ, нагруженных в ходе выделения ионами магния, в бессолевую буферную среду приводило к возникновению трансмембранного потенциала со знаком «-» на внутренней стороне мембраны, что детектировалось с помощью потенциал чувствительного красителя сафранина О, который менял свои оптические свойства (рис. 11 а). Очевидно, это связано с выходом ионов магния через собственные ионные каналы по градиенту концентраций. Действительно, добавление во внешнюю среду 20 мМ СаС12 или липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТРР+) приводило к подавлению трансмембрашгого потенциала (рис. 11 а). Тот факт, что блокаторы кальциевых каналов, такие как верапамил и соли лантана, кобальта и никеля, имели аналогичный эффект, позволяет предположить, что собственные ионные каналы ВВМУ Т. тоШог родственны кальциевым каналам клеточных мембран млекопитающих.

о 6

Рисунок 11. Спонтанная генерация в BBMV мембранного потенциала («минус» внутри везикул) (а) и кислотного сдвига pH (АрН) внутри везикул (б) при их инкубации в бессолевой буферной среде и чувствительность этих процессов к сантимолярным концентрациям сульфата магния и калия, хлорида кальция, ТРР+ и к блокаторам Са2+-каналов клеточных мембран. BBMV, нагруженные ионами магния в ходе выделения, суспендировали, в буферной среде (pH 8,6), содержащей сафранин О (о) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 20 мМ MgS04, K2S04 и СаС12, 0,6 мМ ТРРС1, 100 мкМ LaClj, CaCh, NiCh и вврапатша (Ver.), 2 мкМ FCCP и 4 мкМ валиномицина.

Добавление везикул в среду с высокой концентрацией соли, приводило к возникновению на мембране потенциала со знаком «+» внутри везикул, что детектировалось с помощью другого красителя - оксонола VI (рис. 12).

Д*5во-в1о = о,оз 2 мин

Рисунок 12. Генерация диффузионного потенциала К+ в ВВХ^, запускаемая добавлением к ним сантимолярных концентраций сульфата калия и действие на этот процесс 5-эндотоксина СгуЗА.

Интересный эффект был обнаружен при использовании акридинового оранжевого (рис.116). Помещение нагруженных ионами магния ВВМУ в бессолевую среду сопровождалось также снижением рН внутри везикул. По всей видимости, наблюдаемый сдвиг рН, вызван транспортом протонов внутрь везикул, в ответ на выход ионов наружу. Об этом свидетельствует существенное ускорение процесса закисления среды внутри везикул в присутствии протонофора РССР, а также быстрое обращение его после добавления к везикулам М§304, К2504, валиномицина и вышеуказанных блокаторов Са-каналов.

Таким образом, мы показали, что в апикальной мембране кишечного эпителия Т. тоШог имеются собственные ионные каналы, проницаемые для таких катионов как калий, кальций и магний и слабопроницаемые для анионов.

Вторая серия экспериментов была направлена на изучение проницаемости везикулярных мембран под действием 5-эндотоксина СгуЗА. Как видно из рисунка 12, добавление СгуЗА приводит к увеличению проницаемости мембран для ионов калия, причем это увеличение зависит от концентрации токсина, потому что последовательное добавление новых порций этого белка усиливает эффект.

В свою очередь, если нагруженные ионами магния везикулы поместить в бессолевую среду, добавление токсина вызывает увеличение поляризации мембраны со знаком «-» внутри везикул (сафранин О), которое снимается добавлением в среду сульфата магния (рис. 13а). Интересно, что и в этом случае происходит компенсационное изменение транспорта протонов и закисление среды внутри везикул, как и в случае собственных каналов (рис. 136).

ВВМУ

Рисунок 13. Гиперполяризация ВВМУ (а) и стимуляция кислотного сдвига рН внутри везикул (б) в бессолевой буферной среде (рН 8,6), запускаемые добавлением к везикулярной суспензии 8-эндотоксина СгуЗА. ВВМУ, нагруженные М§2+, суспендировали в буферной среде (рН 8,6), содержащей сафранин О (а) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 40 нМ СгуЗА, 20 мМ 1^504 и 2 мкМ РССР.

Подводя итог, можно заключить, что СгуЗА увеличивает проницаемость мембраны ВВМУ Т. тоШог для ионов щелочных и щелочноземельных металлов в заметно большей степени, чем для соответствующих анионов (противоионов) за счет образования новых (или активации собственных) ионных каналов.

выводы

1. Впервые охарактеризован комплекс протеолитических ферментов средней кишки гусениц Gallería mellonella, осуществляющий высокоэффективный ограниченный протеолиз токсичного для этого насекомого белка Сгу9А. Показано, что преобладающими протеиназами кишечного экстракта являются сериновые протеиназы. Выявлено наличие 5 форм трипсина и 2 форм химотрипсина.

2. Выделена и частично охарактеризована одна из форм трипсина. Показано, что в протеолизе 8-эндотоксина Сгу9А принимают участие как трипсин, так и химотрипсин.

3. С помощью аффинной хроматографии из BBMV Gallería mellonella выделен белок, специфически связывающий активированный 8-эндотоксин Сгу9А, относящийся к классу аминопептидаз. Аналогичным образом из BBMV Tenebrio moliíor выделены СгуЗА-связывающие белки - а-амилаза и А-субъединица вакуолярной АТФ-азы.

4. Показано, что апикальные мембраны эпителиальных клеток личинки мучного хрущака имеют собственные ионные каналы, проницаемые для ионов К+, Mg2+ и Са2+, но не проницаемые для крупных анионов. 8-Эндотоксин СгуЗА увеличивает проницаемость данных мембран за счет образования новых (или активации собственных) ионных каналов.

Список публикаций по теме диссертации

1. Жужиков Д.П., Залунин И.А., Лютикова Л.И., Булушова Н.В., Ревина Л.П., Честухина Г.Г. (2010) Сравнительное изучение действия эндотоксина СгуЗА и его растворимого 49 кДа фрагмента на личинок жуков-чернотелок (Coleóptera: Tenebrionidae). Биотехнология, 3, 43-49.

2. Андреев И.М., Булушова Н.В., Залунин И.А., Честухина Г.Г. (2009) Действие энтомоцидных белков из бактерии Bacillus thuringiensis на ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor. Биохимия, 74(10), 1346-1355.

3. Булушова Н.В, Андреев И.М., Залунин И.А.,. Честухина Г.Г. Увеличение ионной проницаемости апикальной мембраны кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor под действием 5-эндотоксина СгуЗА, продуцируемого ssp. tenebrionis Bacillus thuringiensis. Материалы симпозиума, IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань 2009, с. 334.

4. Goptar, . I. A.,. Filippova, I.Yu., Lysogorskaya, E.N.,Oksenoit, E.S., Vinokurov, K.S., Zhuzhikov, D.P., Bulushova, N.V., Zalunin, I.A., Dunaevsky, Y.E.,. Belozersky, M.A., Oppert, B. and Elpidina, E.N (2008) Localization of post-proline cleaving peptidases in Tenebrio molitor larval midgut. BIOCHIMIE, 90, 508-514.

5. Булушова H.B., Залунин И.А. Выделение токсинсвязывающего белка из кишечного эпителия личинок мучного хрущака Tenebrio molitor. Материалы конференции, Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2008, с. 109.

Подписано в печать:

13.10.2010

Заказ № 4268 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Булушова, Наталья Владимировна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Организация Cry-белков

2.1.1. Физико-химические свойства Cry-белков

2.1.2. Сравнение первичной структуры Cry-бел ков

2.1.3. Пространственная организация молекулы Cry-белков

2.1.4. Механизм действия Cry-белков

2.2. Пищеварительные эндопептидазы насекомых

2.2.1. Общая характеристика ферментов

2.2.2. Связь между набором кишечных протеиназ и рН. Компартментализация средней кишки

2.2.3. Множественные формы кишечных протеиназ насекомых

2.2.4. Изменение спектра кишечных протеиназ в ходе развития насекомого

2.2.5. Индуцибельный характер синтеза протеолитических ферментов насекомых

2.2.6. Эволюция кишечных протеиназ

2.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков

2.3.1. Ход ограниченного протеолиза Cry-белков определяется особенностями их пространственной структуры

2.3.2. Особенности действия пищеварительных протеиназ насекомых на 8-эндотоксины ВТ

2.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых

2.4.1. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых

2.4.2. Кадгериноподобный рецептор Сгу-белков

2.4.3. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков

2.4.4. Элементы структуры Сгу-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором

2.4.5. Доказательство участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo<.

2.4:6: Токсинсвязывающие свойства аминопептидазы N

2.4.7. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N.

2.4.8. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Сгу-белков.

2.4.9. Щелочная фосфатаза

2.4.10. ADAM металлопротеиназа

2.4.11. Альфа-амилаза

2.4.12. Так что же является рецептором 8-эндотоксинов ВТ в организме чувствительных насекомых?

2.4.13. Механизм бивалентного взаимодействия токсина с апикальной мембраной клеточного эпителия

2.4.14. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков

2.4.15. Альтернативные представления о механизме действия токсинов

2.5. Изучение способности токсинов ВТ образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах

2.5.1. Участие а-спиралей домена I в образовании пор

2.5.2. Изучение взаимодействия с мембранами синтетических пептидов, соответствующих а-спиралям N-концевого домена

2.5.3. Мутагенез спирального домена

2.5.4. Свойства пор, образуемых активированными токсинами ВТ в искусственных фосфолипидных мембранах и мембранах чувствительных клеток

Электрическая проводимость пор

Размер пор

Ионная селективность

2.5.5. Олигомсризация Cry-белков и ее связь с порообразованием

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Получение кишечного экстракта гусениц G. mellonella

3.3. Определение общей протеолитической активности

3.4. Определениетриптической активности!

3.5. Определение активности химотрипсина1 . 74'

3.6. Определение активности пролинэндопептидазы

3.7. Определение активности металлопротеиназ

3.8. Изучение влияния рН на протеолитическую активность экстракта средней кишки <7. те11опе11а

3.9. Изучение влияния ингибиторов на протеолитическую активность кишечного экстракта гусениц (т. теПопеПа

3.10. Определение постэлектрофоретической активности методом зимографии

3.11. Электрофорез в денатурирующих условиях

3.12. Выделение трипсина из кишечного экстракта & теПопеПа

3.13. Определение Ы-копцевой аминокислотной последовательности

3.14. Выделение химотрипсина из кишечного экстракта О. теПопеПа.

3.15. Выделение 8-эндотоксинов

3.16. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков

3.17. Вестерн-блотгинг

3.18. Определение концентрации белка

3.19. Биотинилирование белков

3.20. Получение препаратов везикул апикальных мембран (ВВМУ) кишечного эпителия личинок Т.тоШог и гусениц & теПопеПа.

3.21. Определение активности лейцинаминопептидазы

3.22. Определение активности щелочной фосфатазы

3.23. Изучение белкового состава апикальной мембраны клеток кишечного эпителия.

3.24. Синтез аффинных сорбентов СгуЗА^кДа- и Сгу9А65кда-аминогексилагарозы

3.25. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Т. тоШог

3.26. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков С.те11опе11а.

3.27. Лиганд-блотгинг

3.28. Изучение связывания белков, элюированных с аффинных сорбентов

Cry ЗА^кДа- и Cry 9А б5кда-аминогексилагароза с токсинами ВТ. • различной специфичности

3.29. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции.

3.30. Масс-спектрометрическое исследование

3.31. Регистрация изменений мембранного потенциала и трансмембранного градиента рН на везикулярной мембране

3.32. Определение токсичности СгуЗА и продуктов его протеолиза для насекомых

4. Результаты и обсуждение

4.1. Изучение комплекса протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella (состав, свойства, ограниченный протеолиз 5-эндотоксина Сгу9А B.thuringiensis)

4.1.1. Изучение суммарной протеолитической активности экстрактов, полученных из различных отделов средней кишки гусениц

G. mellonella

4.1.2. Анализ ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки G. mellonella с помощью специфических субстратов протеиназ

4.1.3. Ингибиторный анализ протеиназ средней кишки G. mellonella

4.1.4. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом зимографии

4.1.5. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом ионообменной хроматографии

4.1.6. Выделение и характеристика фермента с триптической активностью из кишечного экстракта G. mellonella

4.1.7. Получение препарата частично очищенного химотрипсина из экстракта средней KmniaiG. mellonella

4.1.8. Протеолиз белков кристаллов подвида galleriae ВТ кишечным экстрактом гусениц G. mellonella и некоторыми присутствующими в нем ферментами.

Список сокращений

ALP щелочная фосфотаза

AM передний отдел средней кишки

AME экстракт переднего отдела средней кишки

APN нейтральная аминопептидаза

ВВМ мембрана щеточной каемки

BBMV везикулы мембраны щеточной каемки

BSA бычий сывороточный альбумин

ВТ Bacillus thuringiensis

ВТР бис-Tris-nponaH; 1,3-бме-Гп5-(гидроксиметил)метиламинопропан

BzRpNA бензоил-аргинин-ияря-нитроанилид

CR кадгериноподобные повторы

СгуЗАдсвда 49кДа фрагмент токсина СгуЗА

DnpAALR-NH2 амид 2,4-динитрофенил-аланил-аланил-лейцил-аргинина

DTT дитиотреитол

DS-Na, SDS додецилсульфат натрия dsRNA двухцепочечная РНК

Е - 64 транс-эпоксисукцинил-Ь-лейциламидо-(4-гуанидино)бутан

ЕС эктодомен

FCCP карбонилцианид-и-трифторметоксифенилгидразон

ForAAFpNA формил-аланил-аланил-фенилаланин-иора-нитроанилид

FPLC высоко эффективная жидкостная хроматография

GlpAALpNA пироглутамил-аланил-аланил-лейцин-лсря-нитроанилид

HEPES тУ-2-гидроксиэтилпиперазин-//-2-этансульфоновая кислота

MES 2-[//-морфолино]этансульфоновая кислота

ММ средний отдел средней кишки

MPED ассоциированный с мембранной внутриклеточный домен

Mr молекулярная масса р! изоэлектрическая точка

PBS фосфатная буферная система

РМ задний отдел средней кишки

PME экстракт заднего отдела средней кишки

PC фосфатидилхолин

SBTI соевый ингибитор трипсина

SKTI, STI соевый ингибитор трипсина Куница

SucAAPFpNA сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланин-«£7/?а-нитроанилид

TBR токсин связывающий район

ТМ трансмембранный пептид

TLCK тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон

ТРСК тозил-Ь-фенилаланин-хлорметилкетон

ТРРС1 хлорид тетрафенилфосфония

Z-AAPpNA бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролин-иора-нитроанилид

АТФ аденозинтрифосфат

БСА бычий сывороточный альбумин кДНК комплементарная ДНК

ДМФА диметилформамид

ДФФ диизопропилфторфосфат дтт дитиотреитол

ЛВ50 летальное время

ОФ о/?гао-фенантролин

ПААГ полиакриламидный гель

РСА рентгено-структурный анализ

РНК рибонуклииновая кислота

ТФУ трифторуксусная кислота

ТХУ трихлоруксуная кислота

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ЭГТА соль этиленгликольтетрауксусной кислоты

ЭДТА соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

В работе использованы стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозночения аминокислот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A"

Актуальность проблемы;

Насекомые - вредители» запасов? - распространены; повсеместно и наносят большой вред; зерну и зернопродуктам. По данным Организации по продовольствию шсельскому хозяйству (ФЛО) ООН, они-ежегодно уничтожают не менее 5-10% мировых запасов зерновых культур. Вредители снижают всхожесть семян, загрязняют зерно и зернопродукты, уменьшают их массу (вес); ухудшают пищевые и хлебопекарные качества;, являются? переносчиками различных инфекций: Поврежденное зерно* намного быстрее поражается, плесневыми грибами; которые, прорастая; портят его, выделяя приэтом вредные и канцерогенные вещества; Из насекомых-вредителей на территории нашей страны наиболее опасны: мучной и обыкновенный волосатый клещи, амбарный и рисовый долгоносик, большой; и малый мучные хрущаки, мельничная и мучная* огнёвки.

Bs свою- очередь,, гусеницы большой; вощинной- моли Galleria mellonella наносят ощутимый вред пчеловодству. Так, потери: воска; связанные с. размножением огнёвки, достигают^, по меньшей мере, 20 % от его производства, а пораженность пчелиных семей составляет 10-28 % от их общего числа.

Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно,, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего,- препараты; полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных, подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (5-эндотоксинов, Сгу-белков), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. Создание высокоэффективных биоинсектицидов этого класса; для конкретных насекомых-вредителей, а также разработка путей предохранения от возникновения у них резистентности к препарату требует знания процессов; происходящих при попадании 8-эндотоксинов в организм насекомого-мишени. Вследствие этого, изучение различных стадий патологического эффекта (активации 8-эндотоксинов под действием кишечных протеиназ, связывания со специфическими рецепторами-в мембранах кишечного эпителия, образования трансмембранных пор) является весьмаактуальным.

Цели и задачи исследования.

Целыо работы было изучение взаимодействия энтомоцидных белков СгуЗА (В. thuringiensis ssp. tenebrionis). и Gry9A (В. thuringiensis ssp. galleriae)¡ с пищеварительной системой чувствительных к hhm¡ насекомых, личинок большого мучного хрущака Tenebrio molitor и гусениц пчелиной огнёвки Gallería mellonella, соответственно.

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучить первичные характеристики пищеварительной системы гусениц Gallería mellonella и ее участие в активации токсина Сгу9А;

- выделить, специфические рецепторы, ответственные за« связывание токсинов СгуЗА и Сгу9А с кишечным эпителием личинок Tenebrio molitor и. гусениц Gallería mellonella, соответственно;

- изучить действие токсина СгуЗА на. ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок мучного хрущака.

Научная новизна.

В работе впервые:

- изучен комплекс пищеварительных протеолитических ферментов гусениц Gallería mellonella, получен препарат электрофоретически чистого трипсина из этого насекомого; доказана способность кишечных протеиназ G. mellonella эффективно активировать белок Сгу9А, токсичный против этого насекомого;

- методом аффинной хроматографии из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor выделены белки 66 и 58 кДа, специфически связывающие 6-эндотоксин СгуЗА, а из аналогичных мембранных препаратов гусениц Gallería mellonella - 67 кДа белок, специфически связывающий активированный токсин Сгу9А; произведена предварительная идентификация указанных белков;

- показано наличие в препарате BBMV Tenebrio molitor собственных ионных каналов и частично изучены их свойства; установлено, что под действием

Cry-белков в BBMV личинок Т. molitor открываются дополнительные поры или каналы, обладающие значительно большей проницаемостью для катионов щелочных и щелочноземельных металлов, чем для соответствующих анионов.

Практическая ценность работы.

Полученные данные о взаимодействии энтомоцидных токсинов СгуЗА и Сгу9А с элементами пищеварительной системы личинок Tenebrio molitor и гусениц Gallería mellonella создает базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного эффекта этих белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов нового поколения с существенно повышенной эффективностью против насекомых - вредителей запасов и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Булушова, Наталья Владимировна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые охарактеризован комплекс протеолитических ферментов средней кишки гусениц Gallería mellonella, осуществляющий высокоэффективный ограниченный протеолиз токсичного для этого насекомого белка Сгу9А. Показано, что преобладающими протеиназами кишечного экстракта являются сериновые протеиназы. Выявлено наличие 5 форм трипсина и 2 форм химотрипсина.

2. Выделена и частично охарактеризована одна из форм трипсина. Показано, что в протеолизе 8-эндотоксина Сгу9А принимают участие как трипсин, так и химотрипсин.

3. С помощью аффинной хроматографии из BBMV Gallería mellonella выделен белок, специфически связывающий токсин Сгу9А, относящийся к классу аминопептидаз. Аналогичным образом из BBMV Tenebrio molitor выделены СгуЗА-связывающие белки - а-амилаза и А-субъединица вакуолярной АТФ-азы.

4. Показано, что апикальные мембраны эпителиальных клеток личинки мучного хрущака имеют собственные ионные каналы, проницаемые для ионов К+, Mg и Са2+, но не проницаемые для крупных анионов. 6-Эндотоксин СгуЗА увеличивает проницаемость данных мембран за счет образования новых (или активации собственных) ионных каналов.

BBMV I

Рисунок 35. Гиперполяризация BBMV (а) и стимуляция кислотного сдвига рН внутри везикул (б) в бессолевой буферной среде (рН 8,6), запускаемые добавлением к

2+ везикулярной суспензии 5-эндотоксина СгуЗА. BBMV, нагруженные Mg , суспендировали в буферной среде (рН 8,6), содержащей сафранин О (а) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 40 нМ СгуЗА, 20 мМ MgS04 и 2 мкМ FCCP.

Согласно полученным результатам через поры или каналы, образуемые токсином СгуЗА, способны проходить ионы калия, магния и кальция. Подобная особенность ионных каналов, индуцируемых Сгу-белками, выявлена и в везикулах апикальных мембран кишечника чешуекрылых, для которых продемонстрирована их проницаемость для ионов щелочных и щелочноземельных металлов [Uemura et al, 1992]. Кроме того, образование каналов, проницаемых для ионов кальция, характерно также для токсического эффекта Cry 1С и Cry 1 Ас на культуры клеток насекомых Sf9 и СП, соответственно [Monette et al, 1997, Potvin et al, 1998]. Нами не обнаружено какого-либо действия СгуЗА на поляризацию везикулярной мембраны в присутствии в инкубационной среде хлорида калия. Это обстоятельство может объясняться тем, что по селективности по отношению к К+

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Булушова, Наталья Владимировна, Москва

1. Akerman K.E.O. and' Wikstrom, K.F. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Letters, 68, 191-197.

2. Apell, H.-J. and Bersch, B. (1987) Oxonol VI as an optical indicator for membrane potentials in lipid vesicles. Biochim: Biophys. Acta, 903(3), 480-94.

3. Alcantara, E.P., Alzate, O., Lee, M.K., Gurtiss, A., and Dean, D.H. (2001) Role of a-helix seven of Bacillus thuringiensis CrylAb 5-endotoxin in membrane insertion, structural stability and ion channel activity. Biochemistry, 40,2540-2547. —-—~~"

4. Alzate, O., You, T., Claybon, M., Osorio, C., Curtiss, A. and Dean, D.H. (2006) Effects of Disulfide Bridges in Domain I of Bacillus thuringiensis CrylAa delta-Endotoxin on Ton-Channel Formation in Biological Membranes. Biochemistry, 45(45),

5. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1991) Cytotoxicity of a cloned Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CrylVB toxin to an Aedes aegypti cell line. FEMS Microb. Lett., 83,273-276.

6. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1992) Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo. FEMS Microb. Lett., 94, 63-68.

7. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1993) Effects on toxicity of eliminating a cleavage site in a predicted interhelical loop in Bacillus thuringiensis CrylVB 8-endotoxin. FEMS Microb. Lett., Ill, 255-262.

8. Angus, T.A. (1954) A bacterial toxin paralysing silkworm larvae. Nature, 173,

9. Arenas, I., Bravo, A., Soberon, M., and Gomez, I. (2010) Role of alkaline phosphatase from Manduca sexta in the mechanism of action of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin. J. Biol. Chem., 285(17): 12497-12503.13597-605.545.546.

10. Aronson, A.I., Wu,- D:, and Zhang, C. (1995) Mutagenesis of specificity and" toxicity regions of- Bacillus thuringiensis protoxin gene. J. Bacteriol., 177, 4059-4065.

11. Aronson, A.I., Geng, C., and Wu, L. (1999) Aggregation of Bacillus thuringiensis CrylA'toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. Appl. Invironment. Microb., 65, 2503-2507.

12. Aronson, A.I. and Shai, Y. (2001) Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiol. Lett., 195, 18.

13. Azuma, M., Harvey, W.R., and Wieczorek, H. (1995) Stoichiometry of K+/H+ antiport helps to explain extracellular pH 11 in a model'epithelium. FEBS Letters, 361, 153-156.

14. Bah, A., Frankenhuyzen, K. van, Brousseau, R., and Masson, L. (2004) The Bacillus thuringiensis CrylA toxin: effects of trypsin and chymotrypsin site mutations on toxicity and stability. J. Invertebrate Pathol., 85, 120-127.

15. Barbehenn, R.V. (2003) Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species. J. Chem. Ecol., 29, 683-702.

16. Barrows, B.D., Griffitts, J.S., and Aroian; R.V. (2007) Resistance is non-futile: resistance to Cry5B in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Invertebr. Pathol., 95(3), 198-200.

17. Belfiore, C.J., Vadlamudi, R.K., Osman, Y.A., and Bulla, L.A., Jr. (1994) A specific binding protein from Tenebrio molitor for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Biochem Biophys Res Commun., 200(1), 359-364.

18. Blankemeyer, J.T. Demonstration of a pump-mediated efflux in the epithelial potassium active transport system of insect midgut (1978) Biophys. J., 23,313-318.

19. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method'for the quantitation* of microgram* quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. AnalytBiochem., 72, 248-254.

20. Broehan, G., Kemper, M., Driemeier, D:, Vogelpohl, I., and Merzendorfer, H. (2008) Cloning and expression analysis of midgut chymotrypsin-like proteinases in the tobacco hornworm. J. Insect. Physiol., 54(8), 1243-1252.

21. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. (2005) Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. J. Mol. Biol., 348, 363-382.

22. Candas, M., Francis,. B.R., Griko, N.B., Midboe, E.G., and Bulla, L.A. (2002) Proteolytic cleavage of the developmentally important cadherin BT-Rj in the midgut epithelium of Manduca sexta. Biochermistry, 41:13717-13724.

23. Candas, M., Loseva, O., Oppert, B., Kosaraju, P., and Bulla, L.A. Jr. (2003) Insect resistance to Bacillus thuringiensis. Alterations in the indianmeal moth larval gut proteome. Mol. Cell Proteomics, 2(1), 19-28.I