Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis"

Кириллова Нина Евгеньевна

Изучение структурно-функциональных особенностей 8-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis.

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О fi КВ2011

Москва-2010

004619204

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Научный руководитель:

кандидат химических наук Залунин Игорь Арсеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Азизбекян Рудольф Рубенович ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук Буздин Антон Александрович

Институт биоорганической химии

им. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им.

М.В. Ломоносова

Защита состоится 2011 года в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан

2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Т.Л. Воюшина

кандидат химических наук, доцент /у ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Bacillus thuringiensis (Bt) представляет собой широко распространенную в природе спорообразующую бактерию. Известны ее энтомопатогенные свойства, и промышленные препараты на основе (Bt) являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.

Основным действующим началом Bt, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является продуцируемые ею 5-эндотоксины (Cry и Cyt-белки). Они оказывают эффективное высокоспецифическое действие на различных насекомых, нематод, клещей -паразитов растений и животных и практически неактивны в отношении теплокровных организмов. Кроме инсектицидного действия 8-эндотоксины, вырабатываемые некоторыми подвидами Bt, проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов и фитопатогенным грибам.

Все это дает основание предположить, что Bt и её кристаллические 5-эндотоксины являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности ряда организмов, влияющих на экономическую деятельность человека. Создание и применение биоинсектицидов на основе 5-эндотоксинов позволяет обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, а также решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Встраивание генов этих белков в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми. В настоящее время так называемые ^/-растения занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных культур хлопка и кукурузы, которые выращивают на полях США.

В свою очередь, необходимость повышения эффективности действия указанных биоинсектицидов и уменьшения вероятности образования резистентных к ним форм насекомых делает необычайно актуальным детальное изучение механизма действия ö-эндотоксинов, в том числе взаимоотношения структуры и функции в их молекуле. Данное исследование посвящено решению этой проблемы на примере

/ i

эндотоксина Сгу9а, токсичного для гусениц пчелиной огнёвки {Gallería mellonella), являющейся паразитом пчелиных ульев.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение функциональной роли спиралей N-концевого домена эндотоксина Cry9a Bt. Для ее достижения были определены следующие задачи:

- получить эффективную систему для экспрессии рекомбинантного Сгу9А в клетках бацилл, изучить и охарактеризовать свойства полученного белка, сопоставить их со свойствами природного Сгу9А;

-создать генетическую систему для эффективного мутагенеза и получить серию точечных аминокислотных замен в белке Сгу9А в районе 5-и 6- a-спиралей, выделить полученные мутантные белки и изучить их биологическую активность на гусеницах G. mellonella;

- создать новые модели для тестирования антибактериального эффекта Сгу9А.

- изучить роль отдельных доменов молекулы Сгу9А и отдельных элементов их структуры в антибактериальном и фунгицидном эффектах этого белка, сравнить механизм действия Сгу9А на клетки насекомых и микроорганизмов.

Научная новизна. В работе впервые:

- на примере рекомбинантного 6-эндотоксика Сгу9А показано, что Сгу-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими б-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно;

- установлено что 5-эндотоксин Сгу9А, а так же его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью;

- создана генетическая система отбора форм токсина с измененной эффективностью антибактериального эффекта;

- при анализе полученных мутантов показано, что не только 5-я, но и 6-я а-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах G. mellonella;

- установлена корреляция между бактерицидной и инсектицидной активностями мутантных форм Сгу9А.

Практическая ценность работы. Полученные данные о структурно-функциональных особенностях 5-эндотоксина Сгу9А создают базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного и антибактериального эффекта этого и других Cry-белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов с существенно повышенной эффективностью против гусениц пчелиной огнёвки с уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм этого насекомого.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на II Съезде по защите растений, (Санкт-Петербург, 2005), III Российском Симпозиуме «Белки и Пептиды», (Пущино, 2007), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008) и на двух международных конференциях.

Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 1 декабря 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на /^¿страницах машинописного текста и содержит ¿L- рисунков и £ таблиц. Список цитируемой литературы содержит/?^ ¿источников, в том числе У^на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Введение.

Эндотоксины формируются в клетках бацилл во время споруляции, образуя в спорангиях этого микроорганизма кристаллоподобные включения, причём у большинства штаммов подобные включения формируются несколькими различными Cry-белками. В настоящее время известно более 100 Сгу-белков, которые различаются первичной структурой и спектром биологической активности, но имеют общие принципы организации вторичной и третичной структуры. Многие из них

имеют молекулярную массу 130-140 кДа и являются протоксинами, активирующимися в ходе протеолиза в кишечнике насекомых до истинных токсинов (65-70 кДа). Молекула истинного токсина состоит из трёх доменов: двух ß-структурных, ответственных за связывание со специфическим рецептором в апикальной мембране эпителиальных клеток кишечника чувствительных насекомых, и N-концевого, содержащего 7 а-спиралей и отвечающего за образование поры или ионного канала. Для ряда токсинов, например класса Cryl, показано, что в образовании поры участвуют 4-я и 5-я а-спирали.

Истинные токсины в большинстве случаев устойчивы к деградации. Эта устойчивость обеспечивается тем, что домены тесно связаны друг с другом многочисленными нековалентными взаимодействиями, петли, соединяющие домены и различные элементы структуры внутри доменов, как правило, хорошо защищены от контакта с протеолитическими ферментами. Вместе с тем, а-химотрипсин и субтилизин гидролизуют активированный токсин Сгу9А (70 кДа) до фрагментов с молекулярной массой 50 и 20 кДа. Гидролизуемая связь находится в петле, соединяющей 5-ю и 6-ю а-спирали. Таким образом, фрагмент (20 кДа), содержащий первые пять а-спиралей, в том числе а4 и а5, отщепляется от остальной части молекулы, но несмотря на это гидролизат сохраняет свою биологическую активность. Из этого следует, что либо у Сгу9А в образовании поры участвует другие спирали, например аб и а7, либо образовавшийся в результате протеолиза фрагмент 20 кДа остаётся в комплексе с остальной частью молекулы. Для изучения роли отдельных спиралей были использованы, как методы химии белка, так и генно-инженерные методы.

2. Использование хроматографических методов для разделения продуктов

ограниченного протеолиза ö-эндотоксина Сгу9А.

Была сделана попытка отделить фрагмент 20 кДа, содержащий пять а-спиралей, от фрагмента 50 кДа, содержащего 6-ю и 7-ю а-спирали совместно с доменами II и III, хроматографическими методами. Однако использование, как гель-проникающей (на колонке Superdex75), так и ионообменной (на колонках MonoS и MonoQ) хроматографий не увенчалось успехом. Все полученные в результате хроматографии фракции содержали оба фрагмента (50 и 20 кДа). По всей видимости, продукты протеолиза с молекулярной массой 50 и 20 кДа остаются связанными друг с другом нековалентными взаимодействиями. Для изучения роли отдельных а-

спиралей в энтомоцидном эффекте Сгу9А было решено использовать генно-инженерные подходы.

3. Разработка системы для экспрессия эндотоксина Сгу9А в клетках акристаллического штамма В! подвида киг5Гакй

Первой задачей нашей работы была разработка экспрессионной системы, для получения рекомбинантного белка Сгу9А в клетках бацилл. Ген сгу9А был клонирован ранее в нашей лаборатории. В качестве реципиента был использован акристаллический штамм подвида киЫакг Вг (4010). Плазмидные репликативные конструкции, несущие экспрессионные кассеты с геном сгу9А, были сконструированы на основе челночного вектора рВ5634, несущего ген устойчивости к тетрациклину и ориджин репликации рВС16. Было изучено несколько вариантов экспрессионных кассет (таблица 1).

Таблица 1.Экпрессионные конструкции.

Название плазмид Вектор Экспрессионная кассета, другие гены

Плазмиды, используемые для экспрессии Сгу9А в бациллах

рго28-Сгу9 pBSd634 сгу28А промотор, cry9A ORF

рго26-Сгу9 pBSd634 Сгу26А промотор, cry9A ORF

рго1С-Сгу9 pBSd634 с/у/С(Btl+BtH) промотор, cry9A ORF

proTet-Cry9 pBS634 tet промотор, cry9A ORF

Плазмиды, используемые в качестве отрицательного контроля

рО (pdBS634) pBluescriptKS+ tet и ориджин репликации из РВС16

pBS634 pBluescript KS+ cry 1С промотор, tet и ориджин репликации из РВС16

proO-Cry9 pBSd634 Нет промотора, cry9A ORF

Было показано, что разумная эффективность трансформации клеток Bt достижима лишь при условии использования плазмидной ДНК, выделенной из штамма E.coli JM110, дефектного по системам dam и dem метилирования. Дяя выбора трансформантов Bt клетки высевали на твердую среду BHIG (Brain Heart Infusion («DIFCO», США), содержащую 0,5% глицерин и 30 мг/л тетрациклина).

Использование данной среды оказалось существенным фактором для поддержания клонов, предназначенных для экспрессии гена 5-эндотоксина. При использовании других сред происходило преждевременное включение механизмов споруляции, и полученные клоны теряли способность к экспрессии изучаемого гена. Был сделан вывод, что семейство использованных плазмид обладало выраженной рекомбинационной и репликативной нестабильностью при споруляции бациллярных клонов (менее 1% клеток, прошедших споруляцию, содержали интактную экспрессионную конструкцию) Поэтому традиционный способ консервации экспрессионных клонов бацилл в виде спор был заменён на хранение вегетативных клеток В? в 20% растворе сахарозы при -70°С. Цикл экспрессии включал: (1) получение трансформантов (среда ВНЮ); (2) наращивание биомассы (среда ВНЮ); (3) экспрессия (стандартная споруляционная среда, содержащая гидролизат козеина, дрожжевой экстракт и неорганические соли). Эффективная экспрессия была получена при использовании, как жидких, так и агаризованных сред, однако экспрессия на поверхности агаризованных сред была более воспроизводимой.

Независимо от используемых промоторов: «вегетативного» (Тйг-рго) -наибольшая активность которого наблюдается на вегетативной стадии роста культуры, или споруляционных (Сгу26-рго, Сгу28-рго и Сгу1С-рго), в трансформированных клетках образовывался 5-эндотоксин Сгу9А, что было подтверждено с помощью БОБ-электрофореза. Вне зависимости от применённого промотора при экспрессии конструкций, содержащих ген Сгу9А, в клетках бацилл во время споруляции наблюдалось образование кристаллов. При культивировании штамма несущего контрольные конструкции (в одной отсутствовал промотор, во второй ген Сгу9А) при споруляции кристаллов не обнаружено. Лучшее кристалообразование наблюдалось в конструкции, где ген Сгу9А клонирован под Сгу1С-промотором (рго1С-Сгу9). Эта конструкцию была использована для дальнейших экспериментов.

3.1. Доказательства экспрессии и правильного фолдинга рекомбинантного Сгу9А в бациллярных клетках.

3.1.1. Электрофорез и иммунологические тесты.

Для контроля биосинтеза рекомбинантного Сгу9А использовали метод электрофореза в денатурирующих условиях. Как видно на рисунке 1, рекомбинантный белок Сгу9А присутствует в клеточных экстрактах из споро-

кристаллической смеси в двух формах: протоксина (130 кДа) и активированного токсина (70 кДа). Последний получается в результате протеолитической активации протоксина за счёт гидролиза С-концевой половины этого белка, которая может происходить под действием не только кишечных протеиназ насекомого, но и собственных протеолитических ферментов микроорганизма. После автолиза спорангиев трансформированного штамма споры и кристаллы были разделены в двухфазной системе ксилол-вода, а содержащиеся в них белки экстрагированы карбонатным буфером. Интересно, что рекомбинантный белок был обнаружен не только во фракции кристаллов, но и среди спор. Последнее, видимо, связано с тем, что, у некоторых штаммов Bt Cry-белки могут откладываться на внешнем слое «spore coat», одной из внешних оболочек спор.

Было показано, что во фракции кристаллов Сгу9А был представлен в основном в форме активированного токсина, а во фракции спор - в виде протоксина. По всей видимости, в споровой фракции эндогенные протеиназы отсутствуют или присутствуют в очень небольшом количестве. В этом случае эндотоксин, содержащийся в споровой фракции, должен остаться не повреждённым.

То, что полученный белок действительно является 5-эндотоксином Сгу9А было подтверждено иммунологическими тестами, с использованием специфической поликлональной антисыворотки к 5-эндотоксину Сгу9А. В экспериментах по двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (рисунок 2а), проводившейся в 1% агарозном геле, можно видеть полосу преципитации, полученную при взаимодействии экстракта белков из заспорулировавших клеток и специфической сыворотки на 5-эндотоксин Сгу9А. Эта полоса сливается, не образуя шпоры, с полосой, полученной при реакции нативного Сгу9А, с той же сывороткой. Это говорит как о присутствии рекомбинантного Сгу9А в экстракте, так и об иммунологической идентичности нативного и рекомбинантного вариантов токсина.

К таким же выводам приводят и результаты экспериментов по вестерн-блоттингу, в котором рекомбинантный белок (в виде как 130 кДа протоксина, так и 70 кДа активированного токсина) специфически реагирует с очищенной антисьгвороткой к нативному Сгу9А (рисунок 26).

Рисунок 1. Белковый состав экстрактов из акристаллического штамма III 4010, затрансформированного ргоО-Сгу9 (отрицательный контроль) и рго1С-Сгу9. (1) - споро-кристаллическая смесь; (2) — фракция спор; (3) — фракция кристаллов. В качестве положительного контроля использовали споро-кристаллическую смесь штамма В-1757 В/.

1 г г

Рисунок 2. Антигенные свойства рекомбинантного Сгу9А. (а). Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. (б). Вестерн-блот со специфической сывороткой к Сгу9А. (1) - активированный токсин Сгу9А; (2) - белковый экстракт, полученный из штамма В-1757 В/; (3) -рекомбинантный Сгу9А.

3.1.2. Ограниченный протеолиз.

Для доказательства правильного сворачивания рекомбинантного Сгу9А в трансформированных клетках бацилл был использован метод ограниченного протеолиза. Ранее было показано, что ход ограниченного протеолиза природного протоксина Сгу9А зависит от использованной протеиназы. Трипсин гидролизует протоксин до фрагмента с молекулярной массой 65 кДа, тогда как а-химотрипсин и субтилизин до суммы 50 и 20 кДа продуктов. На приведенной электрофореграмме видно, что рекомбинантный Сгу9А сохранил указанный тип протеолиза нативного токсина (рисунок 3), а значит и конформацию его молекулы.

Природный Р&конбинапный СгуЗД Сгу»А

1 I з к > г з

Рисунок 3. Электрофорез гидролизатов, полученных при ограниченном протеолизе нативного и рекомбинантного Сгу9А. (1) -токсины, инкубировались при 37С в течение 3 часов с буфером; (2) - с трипсином (весовое соотношение фермент: белок 1:100); (3) - с а-химотрипсином (соотношение фермент: белок 1:2). М - маркеры молекулярной массы (20, 24, 29,36, 45, 66 кДа).

3.1.3 Биологическая активность рекомбинантного Сгу9А.

Токсичность препаратов Сгу9А (споро-кристаллических смесей, рекомбинантного белка в виде щелочного экстракта из споро-кристаллической смеси

и хроматографически очищенного активированного нативного токсина) оценивали на гусеницах С те11опе11а второго возраста. Различные концентрации раствора рекомбинантного и нативного белков смешивали с 5 г корма и помещали в чашки Петри, в которые подсаживали по 10 гусениц. В качестве контроля использовали споры акристаллического штамма А/ 4010. Все эксперименты проводили при 28°С в трёх повторкостях. Изучение биологической активности споро-кристаллических смесей рекомбинантного Сгу9А и его природного аналога показало, что они почти одинаково эффективны по токсичности, проявляемой по отношению к гусеницам б теНопеЧа (таблица 2).

Таблица 2. Сравнение токсичности споро-кристаллических смесей природного и рекомбинантного токсина Сгу9А (концентрации выравнивали по СЮб5о)

№ Исследуемый препарат % гибели насекомых

1 Лизировавшая культура штамма В-1757 78

2 Лизировавшая кльтура штамма -трансформанта рго1С-Сгу9 73

3 Лизировавшая культура штамма 5/4010 (отрицательный контроль) 6

При сравнении активности белков, экстрагированных из споро-кристаллических смесей, были получены идентичные результаты (таблица 3). При этом, определение концентрации исследуемых белков проводили разными методами, так как экстракты рекомбинантного Сгу9А в отличие от нативного содержат примеси клеточных белков. В природном штамме В-1757 Сгу9А формирует кристаллические включения совместно с другими 5-эндотоксинами подвида galleriae, поэтому его выделение сопровождается хроматографической очисткой, во время которой Сгу9А не только отделяется от других токсинов, но и от клеточных белков. Концентрацию природного 5-эндотоксина Сгу9А определяли по методу Брэдфорд, а концентрацию рекомбинантного белка - методом иммунодиффузии. В последнем случае в 1% агарозный гель вносили специфические поликлональные антитела (0.1мл раствора антител на 15мл агарозы). Аликвоты экстрактов клеточных белков (Юмкл) помещали в лунки геля. Концентрацию белка оценивали по радиусу образованных кругов

преципитации. Для построения калибровочной кривой использовали стандартную серию разведений 5-эндотоксина Сгу9А.

Таблица 3. Сравнение токсичности активированных природного и рекомбинантного токсина Сгу9А.

№ Исследуемый препарат % гибели насекомых

1 Нативный Сгу9А (активированная форма); 40 мкг/мл 95

2 Рекомбинантный Сгу9А (активированная форма); 40 мкг/мл 80

3.2 Формирование кристаллов рекомбинантным 5-эндотоксином Сгу9А.

Вне зависимости от применённого промотора при экспрессии конструкций, содержащих ген сгу9А, в клетках бацилл во время споруляции наблюдалось образование кристаллов (рисунок 4), которое отсутствовало при культивировании штаммов, несущих контрольные конструкции (в одной отсутствовал промотор, во второй ген сгуЯА). С другой стороны, как видно из данных трансмиссионной и сканирующей микроскопии, полученные инклюзии своей формой и размерами несколько отличаются от нативньгх кристаллов штамма В-1757, построенных из смеси семи протоксинов. Из этого следует, что сокристагшизация 5-эндогоксинов влияет на структуру сформированных энтомоцидных кристаллов.

Таким образом, нами охарактеризована серия плазмид, содержащих ген сгу9А под разными промоторами, которые позволяют осуществить биосинтез соответствующего 8-эндотоксина в акристаллическом штамме В1 4010, значительно более эффективную, чем в Е.соИ. Нам удалось осуществить эффективную экспрессию рекомбинантного гена сгу9А, получить и выделить соответствующий белок и показать, что этот белок, не отличается по своим химическим, иммунологическим и биологическим свойствам от своего природного аналога и способен самостоятельно образовывать кристаллы.

йгтаи« тронсфармзнз штя«н Б-175? шт»«» трспсфориаи-

6

Рисунок 4. Электронная микроскопия кристаллов рекомбинантного Сгу9А. (а). Сканирующая микроскопия спор и кристаллов природного штамма В-1757 В( и штаммов трансформантов ргоО-Сгу9 и рго1С-Сгу9. (б). Трансмиссионная микроскопия споро-кристаллической смеси штамма трансформанта рго1С-Сгу9.

4. Получение точечных мутаций в области спиралей а5 и аб гена сгу9А.

4.1 Создание модифицированной версии гена сгу9\, содержащей уникальные сайты рестрикции, ограничивающие область, кодирующую спирали а5 и аб.

Для изучения роли спиралей а5 и аб в 5-эндотоксине Сгу9А, был использован метод сайт-направленного мутагенеза. Поскольку ген сгу9А имеет большие размеры, а район мутагенеза, ограниченный спиралями а5 и аб, относительно мал, была создана версия гена сгу9А (рисунок 5), содержащая молчащие мутации, которые вводят дополнительные сайты рестрикции ЕсоШ (праймер Сгу9А-£со111-11 cacggcgatatctatggaattc) и 5^/11 (Сгу9А-5§/П-Р tagacaaaatgcccagatcttattatt). Наличие

данных сайтов, ограничивающих участок, кодирующий спирали а5 и аб, позволяет манипулировать в ходе мутагенеза небольшим фрагментами, а не полноразмерным геном. В гене сгу9К присутствует природный сайт £coRI, который был удалён при помощи рестрикции с последующей застройкой концов и рециркуляризацией. При этом произошло удаление нескольких аминокислот, но поскольку эти делеции расположены в С-концевой части молекулы, которая подвергается деградации при последующей активации, они, по-видимому, не имеют особого значения. При создании модифицированной версии полноразмерного гена 5-эндотоксина использовались конструкции, несущие аналогичным образом модифицированные последовательности домена I гена сгу9А в стандартных векторах для клонирования в Е.соЧ pUK21, и pUC21. Эти плазмиды также использовалась как матрица ДНК в ходе сайт-направленного мутагенеза и для вставки фрагментов - продуктов ПЦР с целью секвенирования.

&няН1(М4г) t(13?6j

f<r<iev(1747)

feeswmB)

>ihn шв)

Лрз 1(33) крп1{27) л» к «f ü U)

Ncan 2S7J: Kpri t(295|

ХЬ* 1(5427) Нас 1(5433) Pst 1(54*3) Kiu i;544s; Sa/1(54491 Nda S4SSJ вгтн 1(54«г) fcoff Vt'547ß}

i\Ȋr I(S493) Sjf 11(5502}

|fgg.Wf-3754)j

Cry9A

jflg/XI)

[ffco Rlj

j Xho X

Рисунок 5. Модифицированная версия гена сгу9А.

4.2. Сайт-направленный мутагенез в области спиралей а5 и аб.

Ранее Аронсон и Кумар для 5-эндотоксина Сгу1АЬ, устойчивого к протеолизу в М-концевом домене, получили серию мутантов с точечными заменами в области

15

спиралей а4- а7, изучение которых показало, что именно а4 и а5, но не аб, важны для порообразования. В данной работе были проведены аналогичное исследование для 5-эндотоксина Сгу9А.

Полученные в результате мутагенеза фрагменты переносили в экспрессионную систему по сайтам рестрикции ЕсоШ и Bgl\l. В первую очередь перенесли фрагмент, содержащий мутацию К206Е, которая вводит дополнительный сайт рестрикции XIю[. Остальные фрагменты переносили по тем же сайтам в конструкцию, содержащую дополнительный сайт ХЬо1. По исчезновению этого сайта проверяли правильность вставки.

4.3. Выделение и изучение полученных мутантных белков.

В таблице 4 представлен перечень мутаций, введённых в области спиралей а5 и аб 8-эндотоксина Сгу9А.

Таблица 4. Мутантные варианты Сгу9А, полученные методом сайт-направленного мутагенеза, в области спиралей а5 и аб.

№ Мутация Спираль Ограниченный протеолиз Энтомоцидная активность

1 Р1928 а5 + +

2 А1970 а5 + -

3 Р199Ь а5 - +

4 Р200К а5 - +

5 Н2010 а5 + +

6 А208Т а5 - +

7 11206Е а5 + +

8 Р2228 аб - +

9 Р2230 аб - +

10 К229Е аб - -

11 Р222Р Р223Б аб аб - +

Рекомбинантные белки были экстрагированы из споро-кристаллических смесей и проанализированы. Их продукция и способность реагировать с антисывороткой к Сгу9А были доказаны с помощью электрофореза и экспериментов по иммунодиффузии.

4.4. Электрофорез и ограниченный протеолиз полученных мутантов.

Субтилизин и а-химотрипсин гидролизуют активированный токсин Сгу9А (70кДа) до фрагментов с молекулярной массой 50 и 20 кДа. Гидролизуемая связь находится в С-концевом районе петли, соединяющей 5-ю и 6-ю а-спирали. Скорее всего указанный район молекулы Сгу9А доступен действию протеиназ потому, что структура начального участка 6-й а-спирали расшатана из-за присутствия аминокислотного остатка, невыгодного для образования а-спирали (Рго-222), вслед за которым следует РИе-223, являющийся сайтом протеолиза.

Рисунок 6. Ограниченный протеолиз мутантных вариантов Сгу9А, полученных методой сайт-направленного мутагенеза.

Полученные мутантные белки различаются чувствительностью к протеолизу и составом продуктов протеолитаческой деградации (рисунок 6). У ряда мутантов отсутствует протеолиз в петле между 5-й и 6-й а-спиралью. Из данных электрофореза следует, что у них продукт протеолиза 50 кДа отсутствует. Это, вероятно, обусловлено конформационными изменениями, уменьшающими доступность фермента к сайту протеолиза. В частности, у мутантов P222S и F223D заменены остатки Pro и Phe, о роли которых в протеолизе говорилось выше, а у мутанта К229Е

рядом с местом протеолиза введена глутаминовая кислота, отрицательный заряд которой препятствует связыванию с а-химотрипсином. Можно предположить, что у этих мутантов протеолиз в первом домене заменён на протеолиз внутри второго домена.

4.5. Биологическая активность на гусеницах С теИопеНа.

Эксперименты по токсичности на гусеницах С. теИопеИа проводили по описанной выше методике. Результаты эксперимента приведены на рисунке 7.

Рисунок 7. Ингибирование питания гусениц С теИопеИа, происходящее под действием мутантов Сгу9А, полученных методом сайт-направленного мутагенеза. За 100% принято ингибирование питания гусениц под действием Сгу9А дикого типа.

Анализ мутантов показал, что мутация А1970 в 5-й а-спирали, как и в случае Сгу1 АЬ, приводит к существенному уменьшению токсичности. Из этого следует, что

5-я а-спираль участвует в токсическом эффекте Сгу9А. По всей видимости, отщепляющийся в ходе протеолиза Сгу9А фрагмент сохраняет свою функциональную активность в составе комплекса с остальной частью молекулы токсина. В тоже время, мутация H201D, в отличие от данных Аронсона для белка Cry 1 Ab, не приводила к изменению токсичности. Это говорит о некоторых различиях в роли остатков 5-й а-спирали у двух токсинов. Мутация К229Е в 6-й а-сиирали приводила к резкому уменьшению токсичности для G. mellonella. Таким образом, впервые установлено участие 6-й а-спирали в осуществлении токсического эффекта для одного из Сгу-белков (Сгу9А), токсичных для гусениц отряда Lepidoptera. До настоящего момента за осуществление токсического эффекта (образование поры или ионного канала) считались ответственными только 4-я и 5-я а-спирали.

Следует подчеркнуть, что изменение токсичности мутантных белков не связано со сменой схемы ограниченного протеолиза. Так, у слабо токсичного мутанта К229Е гидролиз в первом домене сохраняется, а у слабо токсичного мутанта К229Е -отсутствует.

5. Антибактериальный эффект Сгу9А.

Из литературных данных известно, что Ciy9A, как и многие другие Сгу-белки, обладают антибактериальным и антифунгальным эффектами. Это свойство можно использовать для повышения эффективности отбора мутантов с измененной токсичностью.

5.1 Система скрининга нетоксичных вариантов Сгу9А, основанная на его антибактериальной активности.

В ходе работы с клонами E.coli, несущими экспрессирующиеся фрагменты сгу9А, было отмечено значительное ингибированиие роста колоний. Наличие у белка Сгу9А антибактериальной активности позволило предположить, что наблюдаемый цитотоксический эффект прямо связан с мембранотропной активностью 5-эндотоксина. В свою очередь, это означало возможность создания системы прямого скрининга мутантных вариантов этого белка по изменению эффекта ингибирования роста колоний E.coli.

5.2.1. Конструкция для экспрессии в клетках E.coli.

Для проверки выдвинутого предположения были изучены две конструкции, несущие экспрессированные под lac промотором фрагменты рамки считывания модифицированного гена ô-эндотоксина трансляционно слитые с lacZ геном E.coli. Первая конструкция экспрессировала фрагмент сгу9А, соответствующий полноразмерному домену I, вторая - последовательности доменов I и II. Цветовая бело-синяя селекция на активность ß-галактозидазы на среде с X-Gal позволяла выявлять появление стоп кодонов внутри фрагмента. Оценка предположительной антибактериальной активности осуществлялась по размеру выросших колоний.

5.2.2. Изучение роли отдельных доменов в антибактериальной токсичности Сгу9А.

При использовании разработанной системы, прежде всего, было показано, что фрагмент гена сгу9А, кодирующий I домен истинного токсина, при экспрессии в клетках E.coli приводит к появлению ярко выраженной токсичности, проявляющиеся в крайне замедленном росте колоний и неспецифическом лизисе.

Осмотически Обмчнло cpta» стгбм л тированная среда

Рисунок 8. Роль отдельных доменов в антибактериальной токсичности Сгу9А. Подтверждение мембранотропного эффекта. (1) - отрицательный контроль р1Ж21; (2) -р1Ж21, содержащая фрагмент гена сгу9Л, кодирующего домен I; (3) - р1)К21, содержащая фрагмент гена сгу9А, кодирующего домен I и домен II.

Поскольку токсический эффект для E.coli снимался при добавлении в среду осмопротекторов (рисунок 8), можно предположить, что бактерицидное действие определяется формированием молекулами токсина в бактериальных клетках трансмембранных пор, что роднит этот эффект с токсичностью для насекомых. Но есть и существенное различие. Из литературы известно, что в случае токсичности для насекомых, имеющих рецепторы токсинов, связывание с которыми обеспечивается в значительной степени II доменом, последний увеличивает эффективность действия Cry-белков на эпителиальные клетки и их мембраны. Конструкции, содержащие I и II домен, а также полноразмерный ген обладали бактерицидным действием на E.coli, хотя и менее выраженным, чем в случае конструкции, содержащей только I домен. Полученные данные позволяют предположить, что у клеток кишечной палочки рецепторы Cry-белков отсутствуют.

5.23. Скрининг слаботоксичных вариантов Сгу9А, полученных методом «еггог-ргопе» ПЦР.

Методом «error-prone» ПЦР был получен ряд мутантов Сгу9А в области I домена, антибактериальная активность, которых была оценена по различию в цвете и размере соответствующих колоний. Точки произошедших мутаций установлены путём секвенирования ДНК. Список полученных мутантов представлен в Таблице 5.

Таблица 5. Мутанты Сгу9А, полученные методом «еггог-ргопе» ПЦР, по всей длине I домена.

№ Мутация Спираль Размер и цвет колонии

Mnl К24Е «2 Большая белая

W48R аЗ

нонсенс нонсенс

Мп2 I70N а1 Большая синяя

МпЗ E138G аЗ Большая синяя

Мп4 I70T а1 Большая синяя

S196G а5

Мп5 S6IP - Большая синяя

L252I аб

Мпб N185D а4-а5 Маленькая синяя

F223S аб

Мп7 нонсенс нонсенс Большая белая

Как и ожидалось, появление больших белых колоний (Mnl и Мп7) связано с нонсенс-мутациями. Четыре отобранных мутанта с резко уменьшенной антибактериальной активностью (Мп2-5) имели замены в al, a3, а5 и аб. Это показывает, что a-спирали I домена Cty9A имеют важное значение в осуществлении не только инсектицидного, но и антибактериального эффекта.

5.2.4. Токсичность, отобранных мутантов на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для доказательства того, что изменение в антибактериальной активности 5-эндотоксина специфически связано с нарушенной способностью к формированию трансмембранного канала, мы разработали систему экспресс-тестирования белка в экспериментах на дрожжевых протопластах. Схема эксперимента включала три стадии: (1) Приготовление протопластов дрожжей с помощью ферментативного разрушения клеточной стенки литиказой («Fermentas», Литва) в течение 2 часов в среде: 1.2М сорбит, ЮмМ TrisHCl рН 7.5. (2) Центрифугирование с последующим переносом в среду 0.6 М MgS04i ЮмМ TrisHCl рН 7.5. (3) Добавление тестируемого белка (в виде суспензии сонифицированной биомассы клеток E.coli продуцентов рекомбинантного токсина, или раствора очищенного 8-эндотоксина), 15 минутная инкубация и визуализация наличия/отсутствия интактных протопластов в препарате под микроскопом.

Была выявлена корреляция между эффективностью лизиса протопластов белком, продуцируемым рекомбинантными клонами, и ингибированием роста соответствующих клонов E.coli (рисунок 9). Лизис протопластов дрожжей эффективно осуществлялся, как диким типом Сгу9А, так и фрагментом, соответствующим N-концевому домену его молекулы, которые обладают бактерицидным эффектом. В тоже время мутанты Сгу9А с уменьшенной антибактериальной активностью не лизировали протопласты дрожжей.

Таким образом, было показано, что у Сгу9А спирали al-a3 влияют на антибактериальную активность и на способность токсина к образованию трансмембранных пор. Для ряда Cry-белков было показано, что 1-я a-спираль не нужна для порообразования, данные о роли 3-й a-спирали противоречивы. Поэтому было интересно соотнести антибактериальный эффект этого токсина с энтомоцидным. Поскольку экспрессия в E.coli низкая, нам пришлось перенести полученные фрагменты в конструкцию для экспрессии в бациллах, чтобы выделить

достаточное количество белка для экспериментов на гусеницах, а также проверить правильность фолдирования полученных мутантных вариантов.

МПЗ (E138G) Мл4(170Т/51Э6Т)

Колонии E.co/f на агаркзованной среде

Микроскопия поотопластов дрожжей

Wt МПЗ (E138GJ Mn4(I70T/S196T)

Рисунок 9. Изменение эффективности лизиса дрожжевых протопластов вариантами домена I 8-эндотоксина Сгу9А. В верхнем ряду приведены микроскопические фотографии препарата дрожжевых протопластов инкубированных с суспензией разрушенных ультразвуком клеток E.coli, эксперессировавших функциональный ген cry9A (wt) или отобранные мутантные варианты. Внизу колонии E.coli NM522, несущие соответствующие конструкции.

5.3. Сопоставление антибактериального эффекта с энтомоцидным.

Полученные мутантные белки были выделены и проанализированы. Их продукция и наличие антигенности были доказаны с помощью электрофореза, и экспериментов по иммунодиффузии (данные не приводятся). Приведенные на рисунке 10 данные по токсичности на гусеницах G. mellonella соответствуют результатам, полученным при изучении антибактериального эффекта. А именно: мутант Мпб (N185D/F223S), подавляющий рост клеток E.coli, ингибировал питание насекомых на уровне положительного контроля Сгу9А дикого типа, в то время, как

мутанты, образующие большие синие колонии, практически не отличались по токсичности от отрицательного контроля 4Б10 В1. Из этого следует, что спирали а1-аЗ также важны для инсектицидного действия Сгу9А, как и для его антибактериального эффекта.

100

#

*

х

г

S

с да С

к

я

»

о а,

s •

*

во

60

40

20

II

/ v / / / / / / / ^ /

Рисунок 10. Ингибирование питания гусениц G mellonella, происходящее под действием мутантов Сгу9А, полученных методом «еггог-ргопе» мутагенеза. За 100% принято | ингибирование питания гусениц под действием Сгу9А дикого типа. j

Таким образом, наши исследования позволили существенно обогатить представления о роли отдельных а-спиралей в инсектицидном и антибактериальном j эффектах Cry-белков. !

6. Выводы.

1. При анализе серии мутантов Сгу9А впервые показано, что не только пятая, но и шестая а-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах Galleria mellonella.

2. Установлено, что не только 5-эндотоксин Сгу9А, но и его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью и способностью лизировать протопласты дрожжей. Этот эффект связан с мембранотропной активностью указанных белков.

3. Создана система, позволяющая отбирать мутантные варианты 6-эндотоксина Сгу9А с уменьшенной бактерицидной активностью. Установлена корреляция между величинами бактерицидной и инсектицидной активности.

4. На примере рекомбинантного 8-эндотоксина Сгу9А впервые показано, что Cry-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими 5-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно.

7. Список публикаций по теме диссертации

1. Tatyana G Yudina, Andrei L. Brioukhanov, Igor A. Zalunin, Ludmila P. Revina, Andrei I. Shestakov, Nina E. Voyushina (Kirillova), Galina G Chestukhina, Alexander I. Netrusov. «Antimicrobial activity of different proteins and their fragments from Bacillus thuringiensis parasporal crystals against Clostridia and archaea». Anaerobe, 2007, V. 13, P.6-13.

2. Н.Е.Кириллова, Е.И.Левитин, Я.А.Войцеховская, Т.ГЛОдина, И.А.Залунин, Г.Г.Честухина, «Рекомбинантный Сгу9А способен образовывать кристаллы в спорулирующих клетках Bacillus thuringiensis», Биотехнология, 2010, №3, С.34-42.

3. Л.П. Ревина, Н.Е.Воюшина (Кириллова), Д.Л.Дунин, Л.И.Костина, М.А. Дронина, Л.И. Лютикова, Д.П. Жужиков, И.А. Залунин. «Изучение инсектицидной активности продуктов ограниченного протеолиза активированных дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis». Материалы Второго съезда по защите растений, Россия, Санкт-Петербург, 2005, T.II, С.110-112.

4. Igor A. Zalunin, Eugeniy I. Levitin, Nina E. Voyushina (Kirillova), Lyudmila P. Revina, Galina G Chestukhina «The ecological significance of the anti-microbial activity

of the Cry-proteins from Bacillus thuringiensis». Workshop - Environmental risk assessment of GM plunts, Italy, Matena, 2006.

5. Н.Е.Воюшина (Кириллова), Е.И.Левитин, Т.Г.Юдина, И.А.Залунин, Г.Г.Честухина. «Использование сайт-направленного мутагенеза для изучения взаимосвязи структуры и функции в молекуле эндотоксина Сгу9А». Материалы III Российского Симпозиума «Белки и Пептиды», Россия, Пущино, 2007, С.98

6. Eugene Lewitin, Nina Е. Voyushina (Kirillova), Igor A. Zalunin and Olga V. Tarusoval, Tatyana G Yudinal , Galina G Chestukhina «Selection for mutants of delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis with altered transmembrane channel formation via monitoring of their antibacterial performance», World-2007, II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology, Seville, Spain, P. 699.

7. Н.Е.Воюшина (Кириллова), Е.ИЛевитин, И.А.Залунин, Г.Г.Честухина «Эффективная система скрининга мутаций, нарушающих функцию формирования трансмембранного канала у энтомоцидных Cry-белков, на основе мониторинга токсичности при экспрессии в клетках Escherichia coli». «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Материалы Международной школы-конференции, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика, Россия, Москва-Пущино, 2008, С.31.

Подписано в печать:

22.12.2010

Заказ № 4754 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кириллова, Нина Евгеньевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Ведение

2.2. Молекулярная организация Сгу-белков

2.2. 1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура

2.2.2. Пространственная организация молекулы Сгу-белков

2.2.3. Междоменные контакты. Поведение истинных токсинов Cry-белков в ходе денатурации

2.2.4 Ограниченный протеолиз Cry- белков

2.3. Механизм действия Сгу-белков

2.3.1 .Специфичность инсектицидной активности

2.3.2. Общая схема патогенеза

2.3.3. Механизм порообразования

2.4. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Сгу-белков

2.4.1 .Роль домена I в образовании пор

2.4.2.Мутагенез спирального домена

2.5. Организация генома В. thuringiensis

2.5.1 .Положение cry-генов в геноме В. thuringiensis

2.5.2. Регуляция синтеза 5- эндотоксинов

2.5.3. Промоторы

2.5.4. Копийность плазмид, включающих cry гены

2.5.5. мРНК

2.6. Токсическое действие Cry- белков на другие объекты

2.6.1. Антимикробная активность белков параспоральных кристаллов В. thuringiensis.

2.6.2. Влияние биогенных аминов на микроорганизмы

2.6.3. Фунгицидное действие Сгу-белков

2.6.4. Действие на клетки теплокровных организмов

3. Материалы и методы

3.1. Используемые штаммы и среды

3.1.1. Выращивание штаммов Bt

3.1.2. Выращивание штаммов Escherichia coli

3.1.3. Выращивание анаэробных микроорганизмов

3.1.4. Выращивание Saccharomyces cerevisiae

3.2. Микроскопическое исследование культуры клеток бацилл

3.3. Получение активированного 8-эндотоксина Сгу9А

3.4. Электрофорез в денатурирующих условиях

3.5. Иммунодиффузия по Оухтерлони

3.6. Ограниченный протеолиз

3.7.Хроматографическое разделение продуктов протеолиза

3.7.1. Гельпроникающая хроматография

3.7.2. Ионнообменная хроматография

3.8. Трансформация клеток Bt методом электропарации

3.9. Очистка антисывороток на афинных сорбентах

3.9.1 Синтез аффинного сорбента.

3.9.2. Хроматография антисыворотки на аффинном сорбенте

3.10. Вестерн-блоттинг

3.11. Определение концентрации белка

3.12. Определение токсичности

3.13. Просвечивающая электронная микроскопия

3.14. Сканирующая электронная микроскопия

3.15. Конструирование плазмид для клонирования и экспрессии фрагментов гена Сгу9А в Е. coli

3.16. Введение аминокислотных замен в ген Сгу9А методом сайт-направленногомутагенеза.

3.17. Конструирование плазмид, для экспрессии в Bt полученных мутантных вариантов гена сгу9А.

3.18. Проведение экспериментов по изучению влияния БА на бактериоцидный эффект

3.18.1. Техника анаэробного культивирования

3.18.2. Определение биомассы

3.19. Мутагенез I домена Сгу9А методом «еггог-ргопе» ПЦР и анализ токсичности на уровне экспрессии в Е. coli.

3.20. Изучение фунгицидного эффекта мутантных вариантов

Сгу9А на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3.20.1. Приготовление протопластов дрожжей с помощью ферментативного разрушения клеточной стенки литиказой

3.20.2. Проведение экспериментов по изучению фунгицидного эффекта 80 4. Результаты и обсуждение

4.1. Введение. Постановка задачи исследования

4.2. Использование хроматографических методов для разделения продуктов ограниченного протеолиза 5-эндотоксина Сгу9А

4.3. Разработка системы для экспрессия эндотоксина Сгу9А в клетках акристаллического штамма Bt подвида kurstaki.

4.4. Доказательства экспрессии и правильного фолдинга рекомбинантного Сгу9А в бациллярных клетках

4.4.1. Электрофорез и иммунологические тесты

4.4.2. Ограниченный протеолиз

4.5. Биологическая активность рекомбинантного Сгу9А

4.6. Формирование кристаллов рекомбинантным 5-эндотоксином Сгу9А

4.7. Получение точечных мутаций в области спиралей а5 и аб гена сгуЯА

4.7.1. Создание модифицированной версии гена сгу9А, содержащей уникальные сайты рестрикции, ограничивающие область, кодирующую спирали а5 и аб.

4.7.2. Сайт-направленный мутагенез в области спиралей а5 и аб

4.8. Выделение и изучение полученных мутантных белков

4.9. Электрофорез и ограниченный протеолиз полученных мутантов

4.10. Биологическая активность полученных мутантных белков на гусеницах G. Mellonella

4.11. Антибактериальный эффект Cry9А

4.11.1. Изучение действия эндотоксина Сгу9А на анаэробные Микроорганизмы

4.11.2. Эффект биологических аминов: серотонина и дофамина, добавленных к питательной среде, на чувствительность

М. thermoacetica к антимикробной активности Сгу9А

4.12. Система скрининга нетоксичных вариантов Сгу9А, основанная на его антибактериальной активности

4.12.1. Конструкция для экспрессии в клетках Е. coli.

4.12.2. Изучение роли отдельных доменов в антибактериальной токсичности Сгу9А

4.12.3. Скрининг слаботоксичных вариантов Сгу9А, полученных методом «еггог-ргопе» ПЦР

4.12.4. Токсичность, отобранных мутантов на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae

4.13. Сопоставление антибактериального эффекта с энтомоцидным

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis"

Актуальность темы

Bacillus thuringiensis (Bf) представляет собой широко распространенную в природе спорообразующую бактерию. Известны ее энтомопатогенные свойства, и промышленные препараты на основе (Bf) являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.

Основным действующим началом Bt, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является продуцируемые ею 5-эндотоксины (Cry и Cyt-белки). Они оказывают эффективное высокоспецифическое действие на различных насекомых, нематод, клещей - паразитов растений и животных и практически неактивны в отношении теплокровных организмов. Кроме инсектицидного действия 8-эндотоксины, вырабатываемые некоторыми подвидами Bt, проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов и фитопатогенным грибам.

Все это дает основание предположить, что Bt и её кристаллические 5-эндотоксины являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности ряда организмов, влияющих на экономическую деятельность человека. Создание и применение биоинсектицидов на основе 8-эндотоксинов позволяет обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, а также решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Встраивание генов этих белков в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми. В настоящее время так называемые ßi-растения занимают основную долю в общем, объеме генетически модифицированных культур хлопка и кукурузы, которые выращивают на полях США.

В свою очередь, необходимость повышения эффективности действия указанных биоинсектицидов и уменьшения вероятности образования резистентных к ним форм насекомых делает необычайно актуальным детальное изучение механизма действия 5-эндотоксинов, в том числе взаимоотношения структуры и функции в их молекуле. Данное исследование посвящено решению этой проблемы на примере эндотоксина Cry 9 а, токсичного для гусениц пчелиной огнёвки {Gallería mellonellá), являющейся паразитом пчелиных ульев.

Цели и задачи работы

Данная работа посвящена изучению функциональной роли спиралей.N-концевого домена эндотоксина Cry9A Bt. В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Получение эффективной системы для экспрессии рекомбинантного Сгу9А в. клетках бацилл, изучение и характеристика свойств полученного белка, сопоставление его свойств со свойствами природного Сгу9А.

2. Конструирование генетической системы для эффективного мутагенеза-и получение серии точечных аминокислотных замен в белке Cry9А в районе 5-и 6- a-спиралей, выделение полученных мутантных белков и изучение их биологической активности на гусеницах G. mellonellá.

3. Создание новой модели для тестирования антибактериального эффекта Сгу9А.

4. Изучение роли отдельных доменов молекулы Сгу9А и отдельных элементов их структуры в антибактериальном и фунгицидном эффектах этого белка, сравнение механизма действия Сгу9А на клетки насекомых и микроорганизмов.

Научная новизна

В работе впервые на примере рекомбинантного S-эндотоксина Сгу9А показано, что Cry-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими S-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно. Получена серия мутантов в области 5-й и 6-й а-спиралей, анализ которых показал, что не только 5-я, но и 6-я а-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах G. mellonella. Установлено, что 5-эндотоксин Сгу9А, а так же его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью. Создана генетическая система отбора форм токсина с измененной эффективностью антибактериального эффекта. На основе полученных с её помощью мутантов Сгу9А установлена корреляция между бактерицидной и инсектицидной активностями.

Практическая значимость

Полученные данные о структурно-функциональных особенностях 5! эндотоксина Cry 9 А создают базу для дальнейших исследований механизма-энтомоцидного и антибактериального эффекта этого и других Cry-белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов с существенно повышенной эффективностью против гусениц пчелиной огнёвки и с уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм этого насекомого.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение.

Bacillus thuringiensis (Bt) - спорулирующая грамположительная аэробная бактерия, обладающая патогенностью для насекомых. Впервые данную бактерию из личинок тутового шелкопряда выделил японский бактериолог Ишивата и назвал ее Bacillus sotto [Schnepf 1998, Вершинина и Алимова, 2000]. Позднее было описано большое количество штаммов этой бактерии, каждый из которых характеризовался своим спектром восприимчивых насекомых [Berliner, 1915; Steinhaus, 1951]. Было установлено, что токсичностью для насекомых обладают включения, обнаруженные в бациллярной клетке, которые возникают одновременно со спорой, растут в ходе споруляции и по окончанию этого процесса лежат в противоположном от споры конце спорангия, вследствие чего они были названы "параспоральными включениями" (рисунок 1) [Наппау 1953]. Было предложено группировать все образующие подобные включения штаммы под названием Bacillus thuringiensis [Delapore and Beguin, 1955; Heimpel and Angus, 1960].

Рисунок 1. Электронная фотография заспорулировавшей клетки Bacillus thuringiensis. SP -спора; PB - кристалл эндотоксина [de Maagd, 2001]

Обнаруженные включения растворялись лишь при pH 12 и выше. [Наппау 1953], Под электронным микроскопом включения были очень похожи на кристаллы, что привело к появлению нового термина для этих частиц -"кристаллоподобные включения". После лизиса спорангиев кристаллы и высвобождаются во внешнюю среду и вместе со спорами могут заглатываться личинками насекомых.

После того как была доказана белковая природа веществ, образующих параспоральные включения [Hannay and Fitz-James, 1955],. [Fitz-James et al, 1958; Yong and Fitz-James, 1959], составляющие их белки стали называться "белками кристаллов", или б-эндотоксинами. В последующем было установлено, что 5-эндотоксины включают два семейства белков:Сгу- и Cyt-белки. В'данном обзоре речь пойдет о Cry-белках. В составе кристалла белки компактно уложены и неактивны, это предшественники активных белков (протоксины). При попадании в кишечник насекомого происходит растворение кристаллов и процессинг протоксинов протеолитическими: ферментами кишечного сока, в результате чего формируется« устойчивый к протеолизу «истинный токсин» - активная1 форма дельта-эндотоксина с молекулярной массойют 55-до 65кДа [CHestuckina1982; Zalunin 2004]). t

В1:, настоящее время-: известно; более 100 Cry-белков, продуцируемых, различными^ штаммами Bt и обладающих энтомоциднойг активностью. Flo величине мол. массы- они делятся на несколько групп. Самая многочисленная; состоит из Cry-белков с мол. массой 130-145 кДа, но описаны белки, имеющие мол массы- околов 70 кДа. , а также промежуточные значения- (80-901 кДа) [Crickmore, Full list of delta-rendotoxins] .

Данный обзор посвящен описанию молекулярно-биологических свойств и механизма действия Cry- белков, образующих кристаллы в спорулирующих клетках Bt.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кириллова, Нина Евгеньевна

5. Выводы.

1. При анализе серии мутантов Сгу9А впервые показано, что не только пятая, но и шестая a-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах Gallería mellonella.

2. Установлено, что не только 5-эндотоксин Сгу9А, но и его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью и способностью лизировать протопласты дрожжей. Этот эффект связан с мембранотропной активностью указанных белков.

3. Создана система, позволяющая отбирать мутантные варианты 5-эндотоксина Сгу9А с уменьшенной бактерицидной активностью. Установлена корреляция между величинами бактерицидной и инсектицидной активности.

4. На примере рекомбинантного 5-эндотоксина Сгу9А впервые показано, что Cry-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими 5-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириллова, Нина Евгеньевна, Москва

1. Галушка Ф.П., Азизбекян P.P. (1977) Изучение плазмид линий различных разновидностей Bacillus thuringiensis Berliner // Докл. Акад. наук СССР, Т. 236, С. 1233-1235.

2. Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В.(2002) Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis. И Микология и фитопатология, Т. 36. Вып. 1. С. 58-62.

3. Дебабов В.Г., Азизбекян P.P., Хлебалина О.И. и др. (1977) Выделение и предварительная характеристика экстрахромосомных элементов ДНК Bacillus thuringiensis. //Генетика, Т. 13, №3, С. 496-501.

4. Дьяков Ю.Т, (1998) Популяционная биология фитопатогенных грибов. М., Муравей, 384 с.

5. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Башрова СФ. (2001) Общая и молекулярная фитопатология: Учебное пособие, М.: Общество фитопатологов, 302 с.

6. Егоров Н.С., Юдина Т.Г., Баранов А.Ю. (1990). О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis.//Микробиология, Т.59. вып.З. С. 448 — 452.

7. Левина. Т.А. (2005) Особенности антибактериального действия 5 -эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений Дисс канд. биол. наук - Казань, 172 с.

8. Маликина К.Д., Шишов В.И., Чувелёв Д.И., Кудрин B.C., Олескин A.B. (2010) Регуляторная роль нейромедиаторных аминов в клетках Saccharomyces cerevisiae //Прикл. биохим. микробиол.,№ 6. С. 1 —6.

9. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Кировская Т.А.(1998б) Микробная эндокринология и биополитика // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. Биология, № 4. С. 3-10.

10. Хеймпел A.M. (1976) Безопасность энтомопатогенных микроорганизмов длячеловека и позвоночных животных. // Микроорганизмы в борьбе свредными насекомыми и клещами, М.: Колос, С. 373-390.

11. Цавкелова Е.А., Ботвинко И.Б., Кудрин B.C., Олескин A.B. (2000) Детекциянейромедиаторных аминов у микроорганизмов методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии // Докл. Росс. Акад. Наук, Т.372, С. 840—842.

12. Честухина Г.Г., Костина Л.И., Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха СП.,

13. Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. (1977) Белки кристаллов дельта-эндотоксина

14. В. thuringiensis //Биохимия, Т. 42, Вып. 9, С. 1660-1667.

15. Шкаликов В.А., Белошапкина О.О., Букреев Д.Д. и др. (2001) Защитарастений от болезней/Под ред. В.А. Шкаликова. М.: Колос, 248 с.

16. Юдина Т.Г., Егоров Н.С., Лория Ж.К., Выборных С.Н. (1988) Биологическаяактивность параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis Л Известия АН

17. СССР. Серия биологич., №3. С. 427 436.

18. Юдина Т.Г., Милько Е.С., Егоров Н.С. (1996а) Чувствительность диссоциантов Micrococcus luteus к действию эндотоксинов В. thuringiensis.// Микробиология, Т.65. №3. С. 365 369.

19. Юдина Т.Г., Егоров Н.С. (19966) Антимикробная активность белковых включений различных бактерий. // Доклады РАН, Т.349. №2. С. 283 287.

20. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. (1997) Предварительный отбор подвидов Bacillus thuringiensis, способных к синтезу уникальных эндотоксинов. // Сб. научн. трудов "Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов". Новосибирск. 1997. С. 59 64.

21. Юдина Т.Г., Брюханов A.JL, Нетрусов А.И. (2004) Чувствительность архей к антибиотическому действию белков параспоральных включений различных подвидов Bacillus thuringiensis.//Микробиология,. Том 73. №1. С. 25 30.

22. Юдина Т.Г.( 2006) Антимикробная активность и экологическая роль белковых включений бактерий представителей родов Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus. Дисс.докт. биол. Наук.- М, 81 с.

23. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1991) Cytotoxicity of a cloned Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CrylVB toxin to an Aedes aegypti cell line. // FEMS Microb. Lett., 83, P. 273-276.

24. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1992) Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo. // FEMS Microb. Lett., 94, P. 63-68.

25. Arnold S, Curtiss A, Dean DH, Alzate 0.(2001) The role of a proline-induced broken-helix motif in alpha-helix 2 of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. I I FEBS Letters, Feb 9;490(l-2), P. 70-4

26. Aronson, A.I., Wu, D., and Zhang, C. (1995). Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protoxin gene. // J. Bacteriol. 177, P 4059-4065.

27. Aronson, A.I., Geng, C., and Wu, L. (1999). Aggregation of Bacillus thuringiensis Cryl A toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. // Appl. Invironment. Microb., 65, P. 2503-2507.

28. Aronson, A.I. and Shai, Y. (2001) Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action.// FEMS Microbiol. Lett., 195, 1-8.

29. Auffray Y, Boutibonnes P.(1985) Prophage induction and filamentation in Bacillus thuringiensis caused by the genotoxic mycotoxin aflatoxin B1. // Mycopathologia, Sep;91(3), P. 159-63.

30. Barbehenn, R.V. (2003) Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species. // J. Chem. Ecol. 29, P. 683-702.

31. Baum JA, Coyle DM, Gilbert MP, Jany CS, Gawron-Burke C. (1990) Novel cloning vectors for Bacillus thuringiensis. II Appl Environ Microbiol., Nov;56(l 1), P. 3420-8.

32. Baum J.A., Malvar T. (1995) Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. II Mol Microbiol., 18(1), P.1-12.

33. Berliner E.(1915) Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenrouppe (Ephestia kuhniella Zell.) und ihen Erreger Bacillus thuringiensis, n. sp. // Z. Angew. Entomol.,V. 2 . P. 29-56.

34. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. (2005) Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. // J. Mol. Biol., 348, P. 363-382.

35. CaroII, J., and Ellar, D J. (1993). An analysis of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin action on insect-midgut-membrane permeability using a light-scattering assay. // Eur. J. Biochem. 214, P. 771-778.

36. Chen X.J., A. Curtiss, E. Alcantara, Dean D.H., (1995) Mutations in domain I of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin Cryl Ab reduce the irreversible binding of toxin to Manduca sexta brush border membrane vesicles. // J. Biol. Chem., 270, P. 64126419.

37. Chestukhina, G.G., Kostina, L.I., Mikhailova A.L., Tyurin, S.A., Klepikova F.S.,' and Stepanov, V.M. (1982) The main features of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin molecular structure. // Arch.Microbiol., 132, P. 159-162.

38. Chestukhina, G.G., Tyurin, S.A., Kostina, L.I., Osterman, A.L., Zalunin, I.A., Khodova, O.M., and Stepanov, V.M. (1990) Subdomain organization of Bacillus thuringiensis entomocidal protein's N-terminal domains. // J.Protein Chem., 9, P. 501-507

39. Choi, G.J. et al (2007) Antifungal activities of Bacillus thuringiensis isolates on barley and cucumber powdery mildews. //J. Microbiol. Biotechnol., 17(12), P. 20712075

40. Choma C.T., Surewicz W.K., Carey P.R., Pozsgay M., Raynor T., Kaplan H. (1990) Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillus thuringiensis structural implications. //Eur. J. Biochem., 189, P. 523-527.

41. Chungjatupornchai, W.P., Hoefte, H., Seurinck, J., Angsuthanasombat, C., and Vaeck, M. (1988) Common features of Bacillus thuringiensis toxins specific for Diptera and Lepidoptera. // Eur. J. Biochem., 173, P. 9-16.

42. Clarke M. B., Hughes D. T., Zhu C., Boedeker E. C., Sperandio V. (2006) The QseC sensor kinase: A bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.103, P.10420-10425.

43. Crickmore, N (2005) Using worms to better understand how Bacillus thuringiensiskills insects. Revew. I I Trends Microbiol., Aug; 13(8), P. 347-50.

44. Dai, S-M., and Gill, S.S. (1993) In vitro and in vivo proteolysis of the Bacillusthuringiensis subsp. israelensis Cry IVD protein by Culex quinquefasciatus larvalmidgut proteases. // Insect Biochem. Molec. Biol., 23(2), P. 273-283.

45. Debro L, Fitz-James PC, Aronson A. (1986) Two different parasporal inclusionsare produced by Bacillus thuringiensis subsp. finitimus. IIJ Bacteriol., Jan; 165(1), P.258.68.

46. Delapore B., Beguin S., (1955) Study of a strain of Bacillus, pathogenic for certain insects, identifiable with Bacillus thuringiensis Berliner. I I Ann Inst Pasteur (Paris), Dec;89(6), P. 632-43.

47. Derbyshire, D.J., Ellar, D.J., and Li, J. (2001) Crystalization of the Bacillus thuringiensis toxin Cry 1 Ac and its complex with the receptor ligand N-acetyl-D-galactosamine. //Acta Crystallog. sect. D, 57, P. 1938-1944.

48. English, L.H., Readdy, T.R., and Bastian, A.E. (1991). Delta-endotoxin phospholipid vesicles is catalysed by reconstituted midgut membrane. // Insect Biochem., 21, P. 177-184.

49. Felsenstein J. (1989) Mathematics vs. Evolution: Mathematical Evolutionary Theory. // Science, Nov 17;246(4932), P. 941-2.

50. Fitz-James, P.C., Toumanoff, C., and Yong, I.E. (1958) Localization of a toxicity for silkworm larvae in the parasporal inclusion of Bacillus cereus var. alesti. II Can. J. Microbiol., 4, P. 385-392

51. Flores H., X. Soberon, J. Sanchez, A. Bravo, (1997) Isolated domain II and III from the Bacillus thuringiensis CrylAb delta-endotoxin binds to lepidopteran midgut membranes. // FEBS letters, 414, P. 313-318

52. Fonstein M, Haselkorn R. (1995) Physical mapping of bacterial genomes. Review // J Bacteriol., Jun;177(12), P/ 3361-9.

53. Freestone P. P, Haigh R. D., Williams P. H., Lyte M. (1999) Stimulation of bacterial growth by heat-stable, norepinephrine-induced autoinducers // FEMS Microbiol. Lett., V.172,. P. 53-60.

54. Freestone P.P., Haigh R.D., Lyte M. (2007) Blockade of catecholamine-induced growth by adrenergic and dopaminergic receptor antagonists in Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica and Yersinia enterocolitica // BMC Microbiol., V.7, P.8.

55. Freestone P. P., Lyte M. (2008) Microbial endocrinology: Experimental design issues in the study of interkingdom signaling in infectious disease // Adv. Appl. Microbiol., V.64, P. 75-108.

56. Gonzales J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. (1981) Correlation between specific plasmids and delta-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. //Plasmid, 5, P. 351-365.

57. Gonzales J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. (1982) Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding delta toxin among strain of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereu. //Proc. Nat. Acad. Sci., 79, P. 6591-6595.

58. Grochulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, M. Cygler, (1995) Bacillus thuringiensis CrylAa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. // J. Mol. Biol., 254, P. 447-464.

59. Hannay C.L. (1953) Crystalline inclusions in aerobic sporeforming bacteria // Nature, V. 172,P. 1004

60. Hannay C.L., Fitz-James P. (1955) The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner II Can. J. Microbiol., V. 1, P. 694-710.

61. Heimpel A.M., Angus T.A. (1960) Bacterial insecticides II Bacteriol. Rev., V. 2, P. 266-288

62. Hodgman, T.C. & Ellar, D.J. (1990) Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis S-endotoxins determined by compilation analysis. // DNA Seq., 1,P. 97-106.

63. Hofmann, C., Liithy, P. (1986). Binding and activity of Bacillus thuringiensis deltaendotoxin to vertebrate cells. // Arch. Microbiol., 146, P. 7-11.

64. Hofmann C., P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska, (1988) Binding of the delta-endotoxinfrom Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of thecabbage butterfly (Pieris brassicae. II Eur. J. Biochem., 173, P. 85-91.

65. Hoefte, H. & Whiteley, H.R. (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillusthuringiensis. //Microbiol. Rev., 53, 242-255.

66. Jung, Y.C., Mizuki, E., Akao, T., Cote, J.C. (2007) Isolation and characterization of a novel Bacillus thuringiensis strain expressing a novel crystal protein with cytocidal activity against human cancer cells. // J. Appl. Microbiol. 103(1), P. 65-79

67. Jurat-Fuentes, J.L., Gould, F.L., and Adang, M.J. (2004). Altered glycosylation of63. and 68-kilodalton microvillar proteins in Heliothis virescens correlates withreduced Cryl toxin binding, decreased pore formation, and increased resistance to

68. Bacillus thuringiensis Cryl toxins. // Appl. Environ. Microbiol., 68, P. 5711-5717.

69. Kalman S, Kiehne KL, Libs JL, Yamamoto T. (1996) Cloning of a novel crylC-type gene. // Curr Microbiol., 32(4), P. 195-200 Kanintronkul, Y., Sramala, I., Katzenmeier, G., Panyim, S., and

70. Angsuthanasombat, C. (2003). Specific mutations within a4-a5 loop of the Bacillusthuringiensis Cry4B toxin reveal a crucial role for Asn-166 and Tyr-170. // Mol.

71. Biotechnol., 24, P. 11-20.

72. Kinney K.S., Austin C.E., Morton D.S., (1999) Sonnenfeld G. Catecholamine enhancement of Aeromonas hydrophila growth // Microbial Pathogenesis, V.25, P. 85-91.

73. Knowles, B.H., and Ellar, DJ. (1987). Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins with different insect specificity. Biochim. Biophys. Acta 924: 509-518.

74. Kolst0 AB. (1997) Dynamic bacterial genome organization. Review. // Mol Microbiol., Apr;24(2), P. 241-8.

75. Kruk Z. L., Pycock C. J. (1990) Neurotransmitters and Drugs. L., N.Y., Tokyo: Chapman & Hall.

76. De Maagd, R.A., Bravo, A., Crickmore, N. (2001) How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Review // Trends Genet., 17(4), P. 193-9.

77. Manasherob R, Zaritsky A, Metzler Y, Ben-Dov E, Itsko M, Fishov I. (2003) Compaction of the Escherichia coli nucleoid caused by CytlAa/ // Microbiology. Dec;149(Pt 12), P. 3553-64.

78. Macy JM, Snellen JE, Hungate RE. (1972) Use of syringe methods for anaerobiosis // Am J Clin Nutr., Dec;25(12), P. 1318-23

79. McNall, R.J., and Adang, M.J. (2003). Identification of novel Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac binding proteins in Manduca sexta midgut through proteomic analysis. // Insect Biochem. Mol. Biol., 33, P. 999-1010.

80. Nagamatsu, Y., Itai, Y., Hatanaka, G., Funatsu,G., Hayashi K. (1984) A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. II Agric. Biol. Chem., 48, P. 611-619.

81. Nicholls, C.N., Ahmad, W., and Ellar, D.J. (1989) Evidence for two different types of insecticidal P2 toxins with dual specificity in Bacillus thuringiensis subspecies. // J. Bacterriol., 171, P. 5141-5147.

82. Pang, A.S., Gringorten, J.L., Bai, C. (1999) Activation and fragmentation of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin by high concentrations of proteolytic enzymes. // Can. J. Microbiol., 45(10), P. 816-25.

83. Poncet S, Delecluse A, Klier A, Rapoport G. Evaluation of synergistic interactions between the CrylVA, CrylVB and CrylVD toxic components oiB.thuringiensis subsp.israelemis crystals // J. Invert. Pathol. 1995. - V.66. -P.131-135

84. Promdonkoy B, Ellar DJ (2005) Structure-function relationships of a membrane pore forming toxin revealed by reversion mutagenesis. // Mol Membr Biol.,22(4), P. 327-37

85. Salamitou S, Agaisse H, Bravo A, Lereclus D (1996) Genetic analysis of crylllA gene expression in Bacillus thuringiensis. II Microbiology, Aug; 142 ( Pt 8), P. 204955.

86. Sambrook, J., Fritsch, R.F., Maniatis, T.(1989) // Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition).

87. Sharpe, E.S., and Baker, F.L. (1979). Ultrastructure of the unusual crystal of the HD-1 isolate of Bacillus thuringiensis var. kurstaki. II J. Invertebr. Pathol. 34: 320322.

88. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R. & Dean, D.H. (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, P. 775-806.

89. Smedley DP, Armstrong G, Ellar DJ., (1997) Channel activity caused by a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin preparation depends on the method of activation. // Molecular Membrane Biology, Jan-Mar; 14(1), P. 13-8

90. Spurr H., Bailey J. (1983) Biological control of peanut leafspot // ZProc. Amer. Peanut. Res. and Educ.Soc., V. 15, P. 93.

91. Stahly D.P., Dingman D.W., Irgens R.L., Field C.C., Feiss M.G., Smith G.L. (1978a) Multiple extrachromosomal deoxyribonucleic acid molecules in Bacillus thuringiensis//FEMS Microbiol. Lett., V. 3, P. 139.

92. Stahly D.P., Dingman D.W., Bulla L.A., Aronson A.T.(19786) Possible origin and function of the parasporal crystals in Bacillus thuringiensis //Biochem. Biophys. Res. Communs., V. 84, P. 581-588.

93. Steinhaus E.A. (1951) Futher observations on Bacillus thuringiensis Berliner and other sporeforming bacteria // Hilgardia, V. 23, P. 1-21.

94. Tomimoto, K., Hayakawa, T., Hori, H. (2006) Pronase digestion of brush border membrane-bound CrylAa shows that almost the whole activated CrylAa molecule penetrates into the membrane. // Comp. Biochem. Physiol. Biochem. Mol. Biol., 144(4), P. 413-22.

95. Walters F.S., Slatin S.L., C.A. Kulesza, L.H. English, (1993) Ion channel activity of N-terminal fragments from CrylA(c) delta-endotoxin. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, P. 921-926.

96. Wolfsberger M.G., (1995) Permeability of Bacillus thuringiensis Cryl toxin channels. In J.M. Clark (ed.), Molecular action of insecticides on ion channels. American Chemical Society, Washington, D.C.

97. Wong HC, SchnepfHE, Whiteley HR (1983) Transcriptional and translational start sites for the Bacillus thuringiensis crystal protein gene.// Biol Chem, Feb 10;258(3), P. 1960-7.

98. Xia, L.Q., Zhao, X.M, Ding, X.Z, Wang, F.S, and Sun, Y.J. (2008): The theoretical 3D structure of Bacillus thuringiensis Ciy5Ba. // J.Mol. Model, 14(9), P. 843-848.

99. Xin-Min Z, Li-Qiu X, Xue-Zhi D, Fa-Xiang W (2009) The theoretical three-dimensional structure of Bacillus thuringiensis Cry5Aa and its biological implications. // Protein J, Feb;28(2), P. 104-10.

100. Yudina T.G, Konukhova A.V, Revina L.P, Kostina L.I, Zalunin LA, Chestukhina G.G. (2003) Antibacterial activity of Cry- and Cyt-proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. // Can. J. Microbiol, V.49, №1, P. 37 -44.

101. Zalunin, I.A., Revina, L.P., Kostina, L.I., and Chestukhina, G.G. (2004) Peculiarities of Cry proteins to be taken into account during their in vivo and in vitro study. // IOBC Wrps Bulletin, 27, P. 177-185.