Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений"

На правах рукописи

Мирахорли Неда

ДИЗАЙН СИСТЕМ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.00Л5 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□03166130

Москва - 2008

003166130

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н И Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Элеонора Суреновна Пирузян ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, Александр Николаевич Игнатов

Центр «Биоинженерия» РАН

кандидат биологических наук, Владимир Григорьевич Богуш

ФГУП «ГосНИИгенетика»

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский Государственный Университет им МВ Ломоносова, кафедра генетики

Защита состоится " / 5 " О ^ 2008 г в 14ю часов на заседании Диссертационного совета Д 217 013 01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д 1

Автореферат разослан " Щ " О Ъ_2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

, Г.Г. Заиграева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертационной работы: В области биотехнологии растений основной задачей является создание трансгенных форм с заданными признаками и свойствами, а также конструирование растений для наработки целевых белковых продуктов

Успех в создании новых форм растений с заданными свойствами и в конструировании трансгенных растений зависит от эффективности экспрессии гетерологичных генов, направленной компартментализации генного продукта и его стабильности в растительной клетке В связи с этим крайне актуальным остается вопрос разработки и создания растительных векторных конструкций, позволяющих облегчить клонирование целевых генов и увеличить выход рекомбинантного белка

Как известно, уровень накопления рекомбинантного белка в растениях зависит от многих факторов, в том числе, от силы используемого промотора, от соответствия кодонового состава экспрессируемого гена кодоновому составу растения-хозяина, от места локализации белкового продукта и других факторов Очень часто экспрессионные системы, идеальные для экспрессии одного гена, оказываются совершенно непригодными для экспрессии другого Так, экспрессия гена под контролем сильного конститутивного промотора гена вируса мозаики цветной капусты приводит, с одной стороны, к наработке большого количества белка в растениях, с другой стороны, к экспрессии во всех тканях растения, что часто нежелательно для исследователей Кроме того, сильная экспрессия некоторых генов может приводить к гибели растения, так как синтезируемый белок в большом количестве может оказаться токсичным

В связи с этим, создание растительных векторных конструкций, в которых можно легко проводить замены регуляторных элементов и

использовать их для различных целей, является важной задачей современной биотехнологии

Достаточно сложной и многоэтапной работой является также тестирование наличия экспрессии исследуемого целевого гена в трансгенном растении Наиболее быстрым и удобным способом предварительной оценки работы созданной векторной конструкции в растениях является транзиентная экспрессия С помощью транзиентной экспрессии можно также легко нарабатывать белок в достаточно больших количествах, что часто используется для получения терапевтических белков Кроме того, при проведении дизайна и подбора наиболее оптимальной векторной конструкции этот метод позволяет быстро проверять эффективность работы различных регуляторных элементов

В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось создание универсального вектора для экспрессии целевых генов в растениях, позволяющего осуществлять дизайн систем экспрессии, и разработка метода количественной оценки транзиентной экспрессии данных генов

Для достижения поставленной цели работы, необходимо было решить следующие задачи

1 Сконструировать базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, в которых можно легко проводить модификационные замены основных регуляторных элементов с целью создания оптимальной векторной конструкции для экспрессии целевых генов

2 Разработать метод эффективной оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях

3 Оценить эффективность разработанного метода оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях в сравнении с результатами стабильной экспрессии этих генов в растениях на примере экспрессии гена репортерного белка лихеназы

4 Подобрать оптимальную векторную конструкцию на основе разработанных базовых векторов для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника в растениях

5 По активности репортерного белка лихеназы провести оценку транзиентной экспрессии гена дефензина в листьях салата Lactuca sativa

Научная новизна работы. Впервые для оценки эффективности транзиентной экспрессии гена дефензина использован ген термостабильной глюканазы (лихеназы) Clostridium thermocellum, ранее предложенный в качестве нового репортерного гена Создана новая векторная конструкция для трансформации растений, содержащая уникальные сайты рестрикции, позволяющие легко изменять регуляторные элементы вектора, с целью дизайна систем экспрессии для каждого конкретного случая

Апробация результатов работы Результаты работы были представлены на VI Съезде общества физиологов растений России и Международной конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, Республика Коми, 2007), на Международной научной конференции "От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям" ( Гомель, 2007), на Международной конференции «Nutrient Biofortification and Exclusion of Pollutants in Food Plants» (Израиль, 2007), а также на лабораторных и межинститутских семинарах Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы, 20 рисунков и графиков Список цитируемых литературных источников включает 152 наименований

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПО ГЛАВАМ ГЛАВА 1. Обзор литературы. В первой главе содержатся сведения о существующих системах экспрессии чужеродных генов в растениях Подробно рассмотрены наиболее оптимальные системы переноса чужеродных генов, их сравнительные характеристики и области применения Особое внимание уделено экспрессионным растительным векторам на основе Ti-плазмид и вирусов, как наиболее перспективным в настоящее время Во втором разделе представлены литературные данные о дефензинах растений Приведены структура, классификация, антимикробная и антигрибная активность растительных дефензинов, а также возможные области их применения В третьем разделе суммированы литературные данные об известных репортерных системах для и ¡учения различных аспектов регуляции экспрессии генов, с подробным анализом лихеназы Clostridium thermocellum, как нового транскрипционного и трансляционного репортера для прикладных и фундаментальных исследований

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

В работе использованы штаммы бактериальные штаммы Е coli XL 1-Blue ("Stratagene", США) recAl endAl gyrA96 thi-\ hsdR17 supE44 relAl lac [F' proAB lacfZAM15 TnlO(TetR)], BL21(DE3) ("Novagene", США) F" dem ompT hsdS(rB- mB-) gal л (DE3), Agrobacterium tumefaciens AGLO (recA bla pTiBo542AT, Mop+, CbR) [Lazo et al, 1991], GV3101 [Koncz С and Schell J, 1986] В качестве полноценной жидкой и твердой (1,5% агар) среды для выращивания клеток бактерий использовали LB-среду [Sambrook and Russell, 2001] В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые проводились согласно методическому руководству Sambrook et al (1989)

Растения. Использовали растения табака Nicotiana tabacum cv Samsun (2n), растения салата Lactuca sativa Контрольные и трансгенные растения табака

поддерживали как стерильную культуру на агаризованной МС среде при 23°С и 16-час освещении, 6000 лк (если не отмечено особо) Трансформацию растений табака проводили методом листовых дисков, как описано [Van Lysebettens et al, 1987]

Молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов растений табака проводили с использованием методов ПЦР и определения активности репортерного белка лихеназы Для проведения ПЦР-анализа использовали геномную ДНК, выделенную из листьев пробирочных растений, и специфические праймеры к /гсВМ2 и virE2 генам Методы определения активности лихеназы Количественное определение лихеназной активности в растительных белковых лизатах проводили по методу Miller et al (1960), модифицированному нами Антибиотики В работе использовались ампициллин (Ар) - 50-100 мг/л, тетрациклин (Тс) - 12,5-25 мг/л, канамицин (Km) - 50-100 мг/л, рифампицин (Rif)- 150 мг/л, цефотаксим (Cf) - 100 - 500 мг/л, гентамицин (Gm) - 12,5 мг/л

Агроинъекция Центрифугированием (5000 g, 5 мин) осаждали 1500 мкл ночной культуры Agrobacterium tumefaciens (штамм GV3101), ресуспендировали осадок в буфере, содержащем 10 мМ MES (рН 5,5) и 10 мМ MgCl2, до OD6oo 0,6 Листья растений Lactuca sativa инъецировали суспензией агробактерий при помощи шприца без иглы Результаты визуализировали на третьи сутки

Получение и очистка белковых препаратов. Листовую ткань растений (около 250 мг) растирали в жидком азоте, а затем экстрагировали белки в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0 (w v=l 1) в течение 30 минут на льду Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 12000 g в течение 20 минут Количество белка в препаратах определяли по методу [Bradford, 1976], используя Bio-Rad Dye реагент ("BioRad", USA) и БСА ("Sigma", USA) для построения калибровочной кривой

Визуализация результатов. Растительный материал, биотесты фотографировали, используя цифровую фотокамеру (Olympus C-1400XL, Япония)

Статистическая обработка данных Данные в таблицах и на рисунках представляют средние арифметические величины и стандартные ошибки, полученные при обработке результатов 5 независимых экспериментов, если не указано особо

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1 Конструирование базовых экспрессионных векторов для трансформации растений.

Методами молекулярного клонирования были сконструированы два новых базовых экспрессионных вектора для трансформации растений, структура которых позволяет легко проводить клонирование целевых генов, а также проводить замены регуляторных элементов, контролирующих экспрессию целевого гена Корректность сборки полученных векторов была доказана рестрикционным анализом и секвенированием всей значимой части нуклеотидной последовательности

Конструкции новых экспрессионных векторов представлены на рисунке 1 Сконструированные базовые вектора содержат следующие элементы Pnos промотор - контролирует экспрессию гена селективного маркера, что позволяет проводить отбор первичных трансформантов растений в присутствии селективного агента, npt\I - ген, кодирующий неомицинтрансферазу II, которая обеспечивает устойчивость растений к селективному агенту канамицину, P35SCaMV - сильный конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, контролирует экспрессию целевого гена, LeB4 - лидерный сигнал гена LeB4 гороха Vicia faba, способный направлять продукт целевого гена в эндоплазматический ретикулум, KDEL — последовательность в 3'-концевой области целевого

гена, кодирующая аминокислоты С-концевой области белка, способные закреплять продукт целевого гена в эндоплазматическом ретикулуме и предотвращать его протеолитическое расщепление, /;сВМ2 -последовательность репортерного гена, которая кодирует термостабильную р-1,3-1,4-глюканазу (лихеназу) С1о$1пс1шт /ИегтосеИит, рА - области полиаденилирования, необходимые для посттранкрипционной модификации мРНК целевых генов Сконструированные вектора содержат уникальные сайты рестрикции, что позволяет легко проводить замену регуляторных элементов (промотор, последовательность лидерного сигнала, З'-концевые участки последовательностей) и целевых генов

Pnos npt\\ nos P35SCaMV LeB4 /;сВМ2 KDEL pA

/

PvuII BamHI

Salí HindIII

Xbal EcoRI

Pnos nplll nos P35SCaMV LeB4 hcBMl KDHL pA

PvuII BamHI Sali Hindill

Kpnl

Xbal

EcoRI

Рис. 1 Схема базовых эксирессиоиных векторов для трансформации растений. PvuII, BHI, Salí, HUI, Xbal, Kpnl, EcoRI - уникальные сайты рестрикции.

Таким образом, нами сконструированы базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, которые позволят легко проводить дизайн систем экспрессии гетерологичных генов, поскольку их структура дает возможность заменять регуляторные элементы и целевые гены, трансляционно слитые с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы, либо без такового слияния Сконструированные вектора предлагаются для изучения новых регуляторных элементов (промоторов, последовательностей лидерных пептидов), а также для изучения экспрессии целевых генов в растениях

3.2. Разработка количественного метода оценки уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках.

Нами был разработан метод количественной оценки транзиентной экспрессии с использованием агроинфильтрации для сравнительной оценки экспрессии целевых генов в растительных клетках с использованием различных регуляторных элементов, а также для оценки эффективности новых или известных растительных регуляторных элементов с использованием репортерных генов.

Для разработки данного метода мы использовали растительные вектора, в которых последовательность репортерного гена лихеназы находится под контролем различных регуляторных элементов, а также растительный вектор, описанный выше.

Схема области Т-ДНК использованных в работе экспресс ионных векторов представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Схема области Т-ДНК использованных растительных векторов р-ЫсВМ2-ЕТ(, р-Ь-1лсВМ2 и р-1лсВМ2.

Как видно из рисунка 2, во всех используемых экспрессионных векторах уровень транскрипции репортерного гена лихеназы контролируется сильным конститутивным промотором 358 РНК С'аМУ,

отличия векторов друг от друга заключаются в присутствии последовательностей лидерных сигналов и С-концевых сигнальных последовательностей Так, вектор p-LicBM2-ER содержит регуляторные элементы, обеспечивающие транспорт и удержание белкового продукта в эндоплазматическом ретикулуме В случае вектора p-L-LicBM2 использована последовательность, кодирующая лидерный пептид экстенсина моркови, который обеспечивает вынос белкового продукта в межклеточное пространство растительной клетки [Wong Е Y et al, 1992] Вектор p-LicBM2 не содержит последовательностей лидерных сигналов

Приступая к оценочным экспериментам с целью разработки метода количественной оценки транзиентной экспрессии с использованием агроинфильтрации, мы должны были последовательно ответить на следующий ряд вопросов

- действительно ли при измерении ферментативной активности продукта целевого гена в ряде последовательных экспериментов по агроинфильтрации одним и тем же штаммом агробактерий в пределах одного и того же растения, мы будем получать значения в пределах статистической ошибки нормально распределенной величины,

- можно ли получать значения в пределах статистической ошибки нормально распределенной величины в разных растениях (с использованием одного и того же штамма агробактерий) и объединять статистические выборки от разных растений,

- можно ли сравнивать влияние различных регуляторных элементов на экспрессию целевого гена в разных растениях, трансформарованных разными штаммами агробактерий, где целевой ген находится под контролем различных регуляторных элементов,

Для ответа на эти вопросы, мы провели агроинфильтрацию растений салата Lactuca sativa с использованием клеток трансформантов агробактерий LicBM2-ER, LicBM2 и L-LicBM2 Клетки агробактерий перед агроинфильтрацией растений выравнивали по оптической плотности

Рис. 3. Агробактериальная инъекция в листья салата Lactuca sativa.

Растительные белковые лизаты получали из листовой ткани области инфильтрации через 72 часа после проведения агроинфильтрации. Далее растительные белковые лизаты, предварительно выровненные по содержанию общего растворимого белка до 150 мкг/мкл, использовали для определения оптической плотности (OD при 540 им) как показателя уровня активности репортерного белка лихеназы. Для каждой независимой точки агроинфильтрации OD540 (уровень активности репортерного белка) определяли тремя повторными измерениями.

Используя критерий Пирсона о проверке нормальности распределений значений OD отдельно для каждой совокупности измерений, были рассчитаны тестовые статистики при инфильтрации каждым трансформантом агробактерий: LicBM2-ER, LicBM2 и L-LicBM2. Сравнение полученных тестовых величин с табличными значениями хи-квадрат распределения, которые оказались меньше экспериментальных, позволяют заключить, что экспериментальные данные подчиняются нормальному закону распределения.

Для ответа на вопрос, можно ли объединить результаты оценки уровня транзиентной экспрессии при агроинфильтрации, полученные на разных растениях, необходимо было провести попарное сравнение двух

дисперсий по критерию Фишера для каждой пары растений из общей выборки экспериментальных растений Этот критерий позволяет определить, принадлежат ли экспериментальные данные, полученные на исследуемых выборках, одной генеральной совокупности (и тогда эти данные можно объединять) или нет С этой целью были проанализированы данные, полученные при инфильтрации растений агробактериями LicBM2-ER Полученные результаты свидетельствуют о том, что значения уровней транзиентной экспрессии при агроинфильтрации, полученных на независимых выборках растений с использованием разработанного нами метода, могут быть объединены в одну генеральную совокупность данных

Для ответа на последний вопрос были использованы растения салата, трансформированные различными штаммами агробактерий, а именно, LicBM2-ER, LicBM2 и L-LicBM2

Применяя критерии Пирсона и Фишера к результатам определения уровня экспрессии лихеназы в растениях, трансформированных тремя различными векторными конструкциями, были показаны достоверные отличия выборок, соответствующих растениям линий LicBM2 и L-LicBM2 от выборки LicBM2-ER, в то время как выборки LicBM2 и L-LicBM2 между собой не различаются Отличие выборок позволяет заключить, что разработанный нами метод дает оценку влияния различных регуляторных элементов на экспрессию целевых генов

Для количественного подтверждения высказанного предположения было проведено сравнение результатов по относительному содержанию репортерного белка в листьях салата Lactuca sativa при агробактериалыгой инъекции векторными конструкциями p-LicBM2-ER, p-LicBM2 и p-L-LicBM2 (рис 4)

Wcp %, агроинфилырация

Рис. 4. Относительное содержание репортерного белка лихеназы в листьях салата Lactuca sativa при агробактериальной инъекции штаммами, несущими векторные конструкции с различными регуляторными элементами.

Как видно из рисунка 4, достоверные различия в относительном содержании репортерного белка лихеназы выявлены между LicBM2-ER и LicBM2, а также между LicBM2-ER и L-LicBM2, но не выявлены между LicBM2 и L-LicBM2.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что нами разработан оригинальный метод, основанный на агроинфильтрации, который позволяет дать предварительную количественную оценку уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках, что является важным для разработки оптимальной системы экспрессии гетерологичных генов.

3.3. Сравнение результатов транзиентной и стабильной экспрессии репортерного гена термостабильной лихеназы в растениях.

Целью данного раздела работы было выяснить, насколько точно можно оценить эффективность экспрессии гетерологичных генов под контролем изучаемых регуляторных элементов с использованием разработанного нами метода транзиентной экспрессии, а также выяснить, сравнимы ли результаты транзиентной экспрессии репортерного гена

лихсназы, полученные на растениях салата, с результатами стабильной экспрессии этого гена в растениях. Для ответа на эти вопросы методом агробактериальной трансформации листовых дисков с использованием векторных конструкций р-Ь1сВМ2-ЕК, р-1лсВМ2 и р-Е-1лсВМ2 (рис. 2.) были получены трансгенные растения табака сорта Самсун (2п), стабильно экспрессирующие ген лихсназы (рис.5). Трансгенность растений доказывалась путем проведения ПГДР с геномной ДНК растений табака на ген лихеназы и определением наличия ферментативной активности белка лихеназы у растений.

Рис. 5. Контрольное растение табака (К) и первичные трансформанты различных линий трансгенных растений табака ЫсВМ2-ЕК, ЬкВМ2 и Ь-ЫсВ1У12.

Для того, чтобы оценить эффективность стабильной экспрессии репортерного гена лихсназы, находящегося под контролем различных регуляторных элементов, был определен уровень накопления белкового продукта репортерного гена во всех линиях трансформированных растений табака. Полученные результаты представлены на рисунке 6. Результаты данного эксперимента свидетельствуют в пользу того, что векторная конструкция р-Ь1сВМ2-ЕК обеспечивает самый высокий уровень накопления гетерологичного белка по сравнению с другими векторными конструкциями, использованными в данном исследовании.

Wcp %, ¡n vitro 1

L-LÍCBM2 LÍCBM2-ER

I Wcp %, in vitro 1

Рис. 6. Относительное содержание репортерного белка лихеназы в листьях разных линий первичных трансформантов табака.

Следующий этап работы был направлен на сравнительный анализ результатов транзиентной экспрессии репортерного гена лихепазы, полученных на растениях салата (см. раздел 3.2), и результатов стабильной экспрессии этого гена, полученных на растениях табака. Результаты сравнительного анализа представлены на рисунке 7.

Рис. 7. Сравнение результатов по относительному содержанию репортерного белка лихеназы в листьях салата Lactuca sativa при транзиентной экспрессии репортерного гена, и в листьях разных линий первичных трансформантов табака при стабильной экспрессии этого гена.

Как видно из представленных данных, общая закономерность эффективности экспрессии репортерного гена под контролем исследованных регуляторных элементов как при транзиентной (в листьях салата), так и при стабильной экспрессии (трансформанты табака), в целом, сохраняется. Относительное содержание репортерного белка выше при использовании регуляторных элементов, обеспечивающих транспорт и локализацию белка в эндоплазматический ретикулум, как по данным агроинфильтрации, так и по результатам стабильной экспрессии репортерного белка.

Важно было также определить общую закономерность эффективности экспрессии репортерного гена при стабильной экспрессии в разных линиях трансформантов табака в зависимости от длительности культивирования в условиях in vitro (выращивание в колбах) и типа питания (гетеро- или автотрофное). С этой целью, нами было определено относительное содержание репортерного белка лихеназы во всех линиях трансформантов табака: у первичных трансформантов (in vitro 1), у растений после 2-х лет культивирования в колбах (in vitro 2) , а также в этих же трансформантах, выращенных в условиях теплицы (in vivo) (рис.

0,4

Wcp %. Wcp%, Wcp %, Wcp %

агроинф in vitro 1 in vitro 2 in vivo

□ LÍCBM2 0,006 0,08 0,005 0,05

О L-LÍCBM2 0,007 0.17 0,02 0,09

т LÍCBM2-ER 0,038 0,33 0,08 0,19

Рис. 8. Сравнение результатов по относительному содержанию репортерного белка лихеназы при транзиентной экспрессии репортерного гена в листьях салата Lactuca sativa н при стабильной экспрессии этого гена в листьях разных линий первичных трансформаптов табака в зависимости от длительности культивирования in vitro и типа питания растений (гетеротрофное и автотрофное).

Как видно из представленных данных, относительное содержание репортерного белка лихеназы во всех линиях трансформантов табака снижается как при длительном культивировании колбах, так и при переходе от гетеротрофного к автотрофному типу питания Однако, общая закономерность эффективности экспрессии репортерного гена лихеназы в трансформантах табака в зависимости от использованных регуляторных элементов сохраняется и не отличается от таковой, полученной при транзиентной экспрессии в листьях салата

Полученные результаты продемонстрировали, что разработанный и апробированный нами метод количественной оценки эффективности экспрессии, основанный на использовании агроинфильтрации листьев салата, позволяет с высокой достоверностью предсказать эффективность систем экспрессии гетерологичных генов при их стабильной экспрессии в растениях, а также достоверно оценить эффективность того или иного дизайна экспрессии гетерологичного гена при использовании различных регуляторных элементов

3.4. Дизайн систем экспрессии для целевого гена в растениях на модели модифицированного гена дефеизина подсолнечника.

В данном разделе работы было выяснено, может ли разработанный метод количественной оценки эффективности экспрессии использоваться для дизайна систем экспрессии целевых генов В качестве целевого гена был выбран ген 5с/2/яос/, который был сконструирован на основе последовательности гена .?б/2 подсолнечника [Сапа1 Ь е1 а1, 2000] Следует отметить, что ген «ей кодирует растительный дефензин, относящийся к третьей группе по классификации дефензинов Ранее в нашей Лаборатории в 5'-область последовательности гена .чсЛ. были введены триплеты, кодирующие 14 а о ОШБЗККСКТРЗКТ Такая модификация аминокислотной последовательности позволила нам сконструировать дефензин (502тос1), который, согласно данным сравнительного анализа,

относится к четвертой группе по классификации дефензинов, и может характеризоваться более широким спектром антимикробной активности, по сравнению с нативным дефенизином SD2, на основе которого он сконструирован [Сотченков Д.В. с соавт., 2005].

Для того чтобы оценить возможность эффективной экспрессии модифицированной последовательности гена sd2mod в модельных растениях салата Lactuca sativa (растения, выбранные нами для транзиентной экспрессии), был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена дефензина на соответствие частот использования кодонов этого гена и генов модельного растения с использованием ряда компьютерных программ и баз данных. Результаты сравнительного анализа частоты использования кодонов модифицированного гена дефензина в растениях салата Lactuca sativa представлены на рисунке 9.

L_

"""* i

Рис. 9. Сравнительный анализ частоты использования кодонов модифицированного гена дефензина sd2mod и растений салата Lactuca sativa.

Исходя из результатов анализа нуклеотидной последовательности модифицированного гена дефензина, можно сделать следующие заключения: а) модифицированный ген дефензина, практически, не содержит редких для растения Lactuca sativa кодонов (рис. 9); б) траискрипт модифицированного гена дефензина не содержит

- Pnos

последовательностей, которые могут быть узнаны растительными клетками как интроны.

Методами молекулярного клонирования были сконструированы экспрессионн ые вектора, в которых последовательность модифицированного гена дефензина имеет трансляционное слияние с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы, и находится под контролем различных регуляторных элементов - р358-яс!2тос1-ИсИМ2-ЕК и р358- 5с/2отос/-//'сВМ2. Экспрессионные вектора, несущие ген дефензина, были сконструированы на основе базовых векторов, описанных в разделе 3.1. Схема области Т-ДНК сконструированных экспрессионных векторов представлена на рисунке 10.

ч

V4

nptll

35S CaMV

LeB4

LicBM2

KDEL

polyA

LB -

Pnos

LB

Pnos

У

7

nptll

35S CaMV

LeB4 MSd2mod-LicBM2

KDEL

polyA

RB

nptll

35S CaMV

sd2mod-T.irRlvr?

polyA

,RB

LicBM2 - polyA - RB

Рис. 10. Схема растительных экспрессионных векторов для агробактериальной инфильтрации. 3SS CaMV - сильный конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, LeB4 - лидер выноса белка в эндоплазматический ретикулум (ЭР), sdmod -ген дефензина, licRM2 - ген, кодирующий репортерный белок лихеназу, KDEL - последовательность аминокислот, обеспечивающая закрепление белка в ЭР, poly А - область полиаденилирования.

С использованием агробактерий, несущих полученные растительные вектора, была проведена агроинъекция в листья салата Lactuca sativa. Для

каждой независимой точки агроинфильтрации OD540 (как показатель уровня активности репортерного белка) определяли тремя повторными измерениями

Для того, чтобы выяснить, могут ли при переходе от репортерного к целевому гену количественные данные для каждой точки агроинфильтрации на одном либо разных растениях рассматриваться как независимый эксперимент, а также можно ли объединить результаты оценки транзиентной экспрессии гибридного гена при агроинфильтрации, полученных на независимых выборках растений, также как и ранее, с использованием критерия Пирсона и критерия Фишера применительно к настоящим условиям, были проделаны аналогичные расчеты и получены следующие результаты

- каждое полученное экспериментальное значение активности целевого гена при инфильтрации одним агробактериальным трансформантом, как на одном, так и на разных растениях, может рассматриваться как независимый результат

- значения уровней транзиентной экспрессии гибридного гена при агроинфильтрации, полученных на независимых выборках растений, могут быть объединены в одну генеральную совокупность данных

Для количественного подтверждения статистических результатов было проведено сравнение относительного уровня содержания гибридного белка в листьях салата Latinea sativa при агробактериальной инъекции различными векторными конструкциями (рис 12) Как видно из представленных на рисунке 12 данных, при транзиентной экспрессии достоверные различия в относительном содержании репортерного белка лихеназы выявлены как между SD2mod-LrcBM2-ER и SD2mod-LicBM2, так и между LicBM2-ER и SD2mod-LicBM2-ER, а также LicBM2 и SD2mod-LicBM2

Рис. 12. Сравнение результатов по относительному содержанию гибридного и репортерного белка лихеназы в листьях салата Lactuca sativa при агробактериальной инъекции различными векторными конструкциями.

Векторная конструкция p-SD2mod-LicBM2-ER обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный нами метод, основанный на агроинфильтрации, позволяет дать предварительную количественную оценку уровня транзиентной экспрессии целевых генов в растительных клетках.

I ,

I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растение - патоген, достигнут в последние 5-10 лет и, прежде всего, благодаря использованию генетических подходов к изучению этого процесса на модельных системах, таких как АгаЬгс/орзк Лакапа, и некоторых культурах, включая томаты и рис Как следует из анализа работ, представленного в главе I, несмотря на целый ряд исследований, посвященных растительным дефензинам, структурные детерминанты, обеспечивающие их антигрибную активность, и механизмы, которыми они осуществляют ингибирование роста патогенных грибов, остаются неизвестными Дальнейшие исследования механизмов действия дефензинов на патогены растений, так же как на патогены человека и животных, нуждаются в разработке простых и удобных тест-систем для изучения взаимодействия хозяин-патоген

В нашей работе были сконструированы базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, которые позволят легко проводить дизайн систем экспрессии гетерологичных генов, поскольку их структура дает возможность заменять регуляторные элементы и целевые гены, трансляционно слитые с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы, либо без такового слияния Сконструированные вектора предлагаются для изучения новых регуляторных элементов (промоторов, последовательностей лидерных пептидов), а также для изучения экспрессии целевых генов в растениях

С использованием созданных растительных векторов нами был разработан оригинальный метод, основанный на агроинфильтрации, который позволяет предварительно количественно оценить уровень транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках, что является важным для разработки оптимальной системы экспрессии гетерологичных генов С использованием данного метода была проведена

оценка эффективности экспрессии репортерного гена лихеназы при транзиентной экспрессии под контролем различных регуляторных элементов Было установлено, что общая закономерность эффективности экспрессии репортерного гена под контролем исследованных регуляторных элементов как при транзиентной (в листьях салата), гак и при стабильной экспрессии (трансформанты табака), в целом, сохраняется

Впервые было показано, что для сравнительной количественной оценки эффективности экспрессии различных регуляторных элементов (при использовании лихеназы как репортера) можно использовать как значения относительного содержания белкового продукта гетерологичного гена, так и средние значения оптической плотности СЮ54о, а также диапазон распределения ОО540 при условии использования растительных белковых лизатов, выровненных по количеству содержания суммарного растворимого белка

Разработанный и апробированный нами метод количественной оценки эффективности экспрессии, основанный на использовании агроинфильтрации листьев салата, был применен для оценки эффективности экспрессии целевого гена дефензина подсолнечника с целью выбора наиболее оптимальной системы экспрессии его в растениях Было установлено, что векторная конструкция р-8В2тос1-1лсВМ2-ЕИ обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка дефензина и локализацию его в эндоплазматическом ретикулуме

Полученные результаты позволяют предложить разработанную нами экспресс-систему в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем

выводы.

1 С помощью разработанной универсальной векторной конструкции для трансформации растений, позволяющей легко осуществлять замену регуляторных элементов, найдена наиболее оптимальная векторная система для экспрессии гена репортерного белка лихеназы

2 Разработан экспресс-метод, основанный на использовании агроинфильтрации листьев салата, для количественной оценки эффективности использования векторных конструкций Результаты оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях разработанным экспресс-методом сравнимы с данными, получаемыми при оценке уровня экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях

3 С применением экспресс-метода подобрана оптимальная векторная конструкция для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника 5с/2то£/ в растениях Векторная конструкция р-802тос1-Ь1сВМ2-Е11 обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка

4 Разработанная экспресс-система предлагается в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ:

1 Д В Сотченков, И В Голденкова, Н Мирахорли. Л В Волкова Модификация последовательности гена дефензина sd2 из подсолнечника и его экспрессия в бактериальных и дрожжевых клетках //Генетика, 2005, т 41, №11, с 1453-1461

2 Salehi Jouzam GR, N Mirakhorli. IV Goldenkova, E S Piruzian, 2006, Expression of modified сгуЗа and hybnd cry3aM-licBM2 genes m transgenic potatoes, Biotechnology, Agriculture and the Food Industry, Nova Science Publishers, Inc (New York) USA (ISBN 1-60021-040-6), pp 7-16

3 H Мирахорли. Д В Сотченков, P Маали, И А Абдеева, И В Голденкова-Павлова, Э С Пирузян Дизайн систем экспрессии для биотехнологии растений. Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Из-во «Логос», 2006, т 3 , с 609-613.

4 ИВ Голденкова-Павлова, И А Абдеева, Д В Сотченков, Н Мирахорли. Э С Пирузян Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям и перспективных для биотехнологии Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Из-во «Логос», 2006, т 3 , с 546-549

5 Исаенко Е В, Мирахорли Н . Абдеева И А , Картель Н А, Юрьева Н О , Голденкова-Павлова И В Новая система экспрессии сгу генов с целью создания биобезопасных растений, устойчивых к насекомым Материалы докладов VI Съезда общества физиологов растений России Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» 18-24 июня 2007, Сыктывкар, Республика Коми, Россия, с 247-248

6 ИВ Голденкова-Павлова, Н Мирахорли. А Р Маали, Е В Исаенко, Н А Картель, Н О Юрьева, И А Абдеева Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам // Цитология и генетика, 2007, № 3, с 44-49

7 ЕВ Исаенко, Н Мирахорли. И А Абдеева, И В Голденкова-Павлова, Н А Картель Конструирование систем экспрессии гена сгуЗаМ для создания трансгенных растений картофеля Материалы Международной научной конференции "От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям" (к 95-летию со дня рождения академика Н В Турбина), Гомель 2-5 октября 2007, с 155

8 Iauhema Isayenko, Neda Mirakhorli. Inna Abdeeva, Irma Goldenkova-Pavlova, Nikolai Kartel Transfer of the сгуЗАМ gene as a prospective method for insect pest management of crop plants Nutnent Biofortifícation and Exclusión of Pollutants ín Food Plants Ben-Gunon University of the Negev Jacob Blaustein Institutes for Desert Research Sede-Boqer Campus, Israel, October 23-25, 2007, p 123

Подписано в печать 11 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 151 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мирахорли Неда

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы экспрессии чужеродных генов в растениях.

1.1 Л. Экспрессионные растительные вектора на основе Ti-плазмид.

1 > I

1.1.2.Экспрессионные вектора, полученные на основе растительных патогенов.

1.1.3. Альтернативные системы экспрессии растений.

1.1.4. Пространственная и временная регуляция экспрессии генов в растениях.

1.2. Дефензины растений.

1.2.1. Структура и классификация растительных дефензинов.

1.2.2. Антимикробная и антигрибная активность дефензинов растений.

1.2.3. Возможности применения растительных дефензинов.

1.3. Репортерные системы для изучения различных аспектов регуляции экспрессии». . генов.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Конструирование базовых экспрессионных векторов для трансформации растений.683.2. Разработка количественного метода оценки уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках.

3.3. Сравнение результатов транзиентной и стабильной экспрессии репортерного гена термостабильной лихеназы в растениях.

3.4. Дизайн систем экспрессии для целевого гена в растениях на модели модифицированного гена дефензина подсолнечника.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений"

В области биотехнологии растений основной задачей является создание трансгенных форм с заданными признаками и свойствами, а также конструирование растений для наработки целевых белковых продуктов.

Успех в создании новых форм растений с заданными свойствами и в> конструировании трансгенных растеиий зависит от эффективности экспрессии перенесенных генов, направленной компартментализации генного продукта и его стабильности в растительной клетке. В связи с этим крайне актуальным остается вопрос разработки и создания растительных векторных конструкций, позволяющих облегчить клонирование целевых генов и увеличить выход рекомбинантного белка.

Как известно, уровень накопления рекомбинантного белка в растениях зависит от многих факторов, в том числе, от силы используемого промотора, от соответствия кодонового состава экспрессируемого гена кодоновому составу растения-хозяина, от места локализации белкового продукта и других факторов. Очень часто экспрессиоиные системы,идеальные для экспрессии одного гена,оказываются совершенно непригодными для экспрессии другого. Так, экспрессия гена под контролем сильного конститутивного промотора гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты приводит, с одной стороны, к наработке большого количества белка в растениях, а, с другой стороны, к повсеместной экспрессии во всех тканях растения, что часто нежелательно для исследователей. Кроме того, сильная экспрессия некоторых генов может приводить к гибели растения, так как синтезируемый белок в большом количестве может оказаться токсичным.

В связи с этим, создание растительных векторных конструкций, в которых можно легко проводить замены регуляторных элементов и использовать их для различных целей, является важной задачей современной биотехнологии.

Достаточно сложной и многоэтапной работой является также тестирование наличия экспрессии исследуемого целевого гена в трансгенном растении. Наиболее быстрым и удобным способом предварительной оценки работы созданной векторной конструкции в растениях является транзиентная экспрессия. С помощью транзиентной экспрессии можно также легко нарабатывать белок в достаточно больших количествах, что часто используется для получения терапевтических белков. Кроме того, при проведении дизайна и подбора наиболее оптимальной векторной конструкции этот метод позволяет быстро проверять эффективность работы различных регуляторных элементов.

В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось создание универсального вектора для экспрессии целевых генов в растениях, позволяющего осуществлять дизайн систем экспрессии, и разработка метода количественной оценки транзиентной экспрессии данных генов.

Для достижения поставленной цели работы, необходимо было решить следующие задачи:

1. Сконструировать базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, в которых можно легко проводить модификационные замены основных регуляторных элементов с целью создания оптимальной векторной конструкции для экспрессии целевых генов.

2. Разработать метод эффективной оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях.

3. Оценить эффективность разработанного метода оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях в сравнении с результатами стабильной экспрессии этих генов в растениях на примере экспрессии гена репортерного белка лихеназы.

4. Изучить экспрессию модифицированного гена дефензина подсолнечника в растениях: подобрать оптимальную векторную конструкцию на основе разработанных базовых векторов для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника в растениях;

- по активности репортерного белка лихеназы провести оценку транзиентной экспрессии гена дефензина в листьях салата Lactuca sativa.

Научная новизна работы.

Впервые для оценки эффективности транзиентной экспрессии гена дефензина использован ген термостабильной глюканазы (лихеназы) Clostridium thermocellum, ранее предложенный в качестве нового репортерного гена. Создана новая векторная конструкция для трансформации растений, содержащая уникальные сайты рестрикции, позволяющие легко изменять регуляторные элементы вектора, с целью дизайна систем экспрессии для каждого конкретного случая.

Апробация результатов работы.

Результаты работы были представлены на VI Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, Республика Коми, 2007); на Международной научной конференции "От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям" ( Гомель, 2007); на Международной конференции «Nutrient Biofortification and Exclusion of Pollutants in Food Plants» (Израиль, 2007); а также на лабораторных и межинститутских семинарах .

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы, 20 рисунков и графиков. Список цитируемых литературных источников включает 152 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мирахорли Неда

выводы

1. С помощью разработанной универсальной векторной конструкции для трансформации растений, позволяющей легко осуществлять замену регуляторных элементов, найдена наиболее оптимальная векторная система для экспрессии гена репортерного белка лихеназы.

2. Впервые разработан экспресс-метод для оценки эффективности использования векторных конструкций. Результаты оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях разработанным экспресс-методом сравнимы с данными, получаемыми при оценке уровня экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях.

3. С применением экспресс-метода подобрана оптимальная векторная конструкция для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника Sd2mod в растениях. Векторная конструкция p-SD2mod-LicBM2-ER обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка.

4. Разработанная экспресс-система предлагается в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растение - патоген, достигнут в последние 5-10 лет и, прежде всего, благодаря использованию генетических подходов к изучению этого процесса на модельных системах, таких как Arabidopsis thaliana, и некоторых других культурах, включая томаты и рис. Как следует из анализа работ, представленного в главе I, несмотря на целый ряд исследований, посвященных растительным дефензинам, структурные детерминанты, обеспечивающие их антигрибную активность, и механизмы, которыми они осуществляют ингибировапие роста патогенных грибов, остаются неизвестными. Дальнейшие исследования механизмов действия дефензинов на патогены растений, так же как на патогены человека и животных, нуждаются в разработке простых и удобных тест-систем для изучения взаимодействия хозяин-патоген.

В нашей работе были сконструированы базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, которые позволят легко проводить дизайн систем экспрессии гетерологичных генов, поскольку их структура дает возможность заменять регулягорные элементы и целевые гены, трансляционно слитые с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы, либо без такового слияния. Сконструированные вектора можно использовать для изучения новых регуляторных элементов (промоторов, последовательностей лидерных пептидов), а также для изучения экспрессии целевых генов в растениях.

С использованием созданных растительных векторов нами был разработан оригинальный метод, основанный на агроинфильтрации, который позволяет предварительно количественно оценить уровень транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках, что является важным для разработки оптимальной системы экспрессии гетерологичных генов. С использованием данного метода была проведена оценка эффективности экспрессии репортерного гена лихеназы при транзиентной экспрессии под контролем различных регуляторных элементов. Причем, было установлено, что общая закономерность эффективности экспрессии репортерного гена под контролем исследованных регуляторных элементов как при транзиентной (в листьях салата), так и при стабильной экспрессии (трапсформанты табака), в целом, сохраняется.

Впервые было показано, что для сравнительной количественной оценки эффективности экспрессии различных регуляторных элементов (при использовании лихеназы как репортера) можно использовать как значения относительного содержания белкового продукта гетерологичного гена, так и средние значения оптической плотности OD540, а также диапазон распределения OD540 при условии использования растительных белковых лизатов, выровненных по количеству содержания суммарного растворимого белка.

Разработанный и апробированный нами метод количественной оценки эффективности экспрессии, основанный на использовании агроинфильтрации листьев салата, был применен для оценки эффективности экспрессии целевого гена дефензипа подсолнечника с целью выбора наиболее оптимальной системы экспрессии его в растениях. Было установлено, что векторная конструкция р-SD2mod-LicBM2-ER обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка дефензипа и локализацию его в эндоплазматическом ретикулуме.

Полученные результаты позволяют предложить разработанную нами экспресс-систему в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мирахорли Неда, Москва

1. Абдеев P.M., Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2001) Изучение свойств термостабильной целлюлазы CelE Clostridium thermocellum с целью экспрессии в растениях // Биохимия, , т.66, вып.7, с. 991-998.

2. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Лаптев Д.А., Метт В.Л., Пирузян Э.С. (1990) Клонирование и некоторые свойства гена licB, кодирующего новую эндоклюкапазу Clostridium thermocellum Ф7 // Биотехнология, №4, 18-19.

3. Голденкова И.В. Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов (2002) //Успехи современной биологии, т. 122, № 6, с. 515-526.

4. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство.- Москва: Мир, 1991 .-408с.

5. Р.А. Комахин, И.А. Абдеева, Г.Р. Салехи Джузани, И.В. Голденкова, А.А. Жученко. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер. // Генетика. 2005. Т. 41, №1. с. 31-40.

6. Кучук Н.В. (2007) Трансгенный, транпластинчатый и трапзиентный подходы для экспрессии чужеродных генов в растениях // Цитология и генетика, №3,, с. 50-54.

7. Ю.Матвеева Н.А., Шаховский A.M., Кучук Н.В. (2005) Генетическая трансформация хлоропластной ДНК S.rickii// Цитология и генетика, т.39, №5, с.3-8

8. Монзави-Карбасси Б., Голденкова И.В., Кобец Н.С., Мусийчук К.А., Волкова JI.B., Пирузян Э.С. (1997) Гетерологическая экспрессия гена lie В Clostridium thermocellum в протопластах тбака // Генетика, т.33,№7, 899-905.

9. НЦовська 1.О., Шаховський A.M., Череп М.Н., Городенська М.М., Кучук М.В. (2006) Отримання цибридних транспластомних рослин Brassica napus з хлоропластами Lesquerella fendleri II Цитология и генетика, v.40, №4.с.3-11.

10. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985) Клонирование и экспрессия структурного гена эндонуклеазы целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum Ф7 в клетках E.coli К12 // ДоклАН СССР, т.281,№4, 963-965.

11. Пирузян Э.С., Могугов М.А., Великодворская Г.А., Пушкарская Т.А. Изучение целлюлолитических (eel) генов Clostridium thermocellum Ф7 и кодируемых ими белков // Генетика, 1988, №2, 204-209.

12. Д.В. Сотченков, И.В. Голденкова, II. Мирахоли, Л.В. Волкова. Модификация последовательности гена дефензина SD2 из подсолнечника и его экспрессия в бактериальных и дрожжевых.// Генетика, 2005. Т. 41. № 11. с. 1453-1461.

13. Alting-Mees M.A., Short J.M. (1989) pBluescript II: gene mapping vectors //Nucleic Acids Res., 17(22):9494

14. Ait N, Greuzet—N— Gattaneo J.(1979) Characterization and purification of thermostable beta-glucosidase from Clostridium thermocellum.// Biochem Biophys Res Commun., v.113, p. 399-402.

15. Alam J., Cook J.L. (1990) Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription//Analyt.Biochem.,v.l88, p.245

16. Apel K., Bohlmann H. & Reinmann-Philipp U. (1990) Leaf tionins: A novel class of putative defence factors // Physiol.Plant, v.80, p.315-321.

17. Baum T.j., Hiatt A., Parrott W.A., Pralt L.H., Hussey R.S. (1996) Expression in tobacco of a functional monoclonal antibody specific to stylet secretions of the root-knot nematode. //Mol. Plant-Microbe Int., 9, p. 382-387.

18. Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. // Nucleic Acids Res., 12(22), p. 8711-21.

19. Bradford M. M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding// Anal. Biochem.- V.72.- P.248-254.

20. Brauenr-Osborne H., Brann M.R. (1996) Functional partial agonism at cloned human muscarinic acetylcholine receptors //Eur. J. Pharmacol., v.295, p.93.

21. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M., Thevissen K., De Samblanx G.W., Osborn R.W. (1997) Antimicrobal peptides from plants. // Crit. Rev. Plant Sci., v.16, p. 297-323.

22. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A.& Osborn R.W. (1995) Plant defensins: Novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. //Physiol.Plant., v.108, p. 1353-1358.

23. Bronstein I., Fortin J., Stanley P.E., Stewart G.S.A.B., Kricka L.J. (1994) Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays //Anal. Biochem., V. 219(2), P. 169-181.

24. Burton D.R., (2002) Antibodies, viruses and vaccines. //Nat. Rev. Immunol., 2, p. 706-713.

25. Caldwell J.E., Abildgaard F., Dzakula Z., Ming D., Hellekant G., Markley J.L. (1998) Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein. //Nat. Struct. Biol., v.5, p. 427-431.

26. Саттие В. P. A., Francois I. Е. J. A., De Bolle М. F. С. et al. Transgenic expression in Arabidopsis of a polyprotein construct leading to production of two different antimicrobial proteins // Plant Physiology. 2002. V.128. P.1346-1358.

27. Canal L., Urdangarin M. C., Norero N. S., Broekaert W. F. A defensin gene expressed in sunflower inflorescence // Plant Physiol. Biochem., 2000. V.38. N.3. P.253-258.

28. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression //Science, v.263, №1548, p.802-805.

29. Charlet M., Chernysh S., Philippe H., Hertu C„ Hoffmann J.A., Bulet P. (1996) Innate immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the the blood of a mollusk, Mytilus edulis. IIJ. Biol. Chem., v.274, p. 21808-21813.

30. Chen C.-C., Wu P.-H., Huang C.-T., Cheng K.-J. (2004) A Pichia pastoris fermentation strategy for enchancing the heterologous expression of a Escherichia coli phytase. //Enz. Microb. Technol., 35, p. 315-320.

31. Colilla R.J., Rocher A., Mendez E. (1990) gamma-Purothionins : amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. //FEBS Lett., v.270, p. 191-194.

32. Cornet В., Bonmatin J.M., Hertu C., Hoffmann J.A., Ptak M., Vovelle F. (1995) Refined three-dimensional solution structure of insect defensin. //A. Structure, v.3, p. 435-448.

33. Craig F.F., Simmonds A.C., Watmore D., McCapra F., White M.R.H. (1991) Membrane-permeable luciferin esters for assay~of firefly luciferase in live intact cells // Biochem.J., v.276, p.637-641.

34. Cutt J.R., Harpster M.H., Dixon D.C., Carr J.P., Dunsmuir P., Klessig D.F. Disease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis- related PR-lb gene // Virology.- 1989.-V.173.- P.89- 97.

35. Doran P.M. (2000) Foreign protein production in plant tissue culture. //Curr. Opin.' Biotech., 11,p. 199-204.

36. Fischer R., Vaquero-Martin C., Sack M. et al. (1999b) Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants // Biotechnol. Appl. Biochem., 30, p. 113-114.

37. Flenbok B. (1991) The etanol utilization regulon of Aspergillus nidulans: the alcA-alcR system as tool for the expression of recombinant proteins. // J. Biotechnol., v.17, p. 177-180.

38. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M., et al., (2000) Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide.//Nat Biotechnol., 18, p. 1307-1310.

39. Gatz C. (1996) Chemically inducible promoters in transgenic plants. //Curr. Opin. Biotechnol., v.7, p. 168-172.

40. Gatz С. (1997) Chemical control of gene expression. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.48, p. 89-108.

41. Gatz C. and Lenk I. (1998) Promoters that respond to chemical inducers. // Trend Plant Sci., v.3, p. 352-358.

42. Gatz C., Frohberg C., Wendenburg R. (1992) Stringent repression and homogeneous derepression by tetracycline of modified CaMV 35S promoter in intact transgenic plants. // Plant J., v.2, p. 397-404.

43. George S.E., Bungay P.J., Naylor L.H. (1998) Functional analysis of the D2L dopamine receptor expressed in a cAMP-responsive luciferase reporter cell line//Biochem. Pharmacol., v.56, p.25-30.

44. Gleba Y., Marillonnet S., Klimyuk V. (2004) Engineering vector expression system in plants: the «full virus» and the «deconstructed virus» strategies // Curr. Opin. Plant Biol., v.7, p. 182-188.

45. Gorman C. DNA cloning II-A Practical Approach/ Ed.Glover D.M., 1985,p. 143

46. Gossen M. and Bujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., v.89, p. 5547-5551.

47. Gura T. (2001) Innate immunity. Engineering protection for plants. // Science, v. 291(5511), p. 2070.

48. Harder J., Siebert R., Zhang Y., Matthiesen P., Christophers E., Schlegelberger В., Schroder J.M. (1997) Mapping of the gene encoding human P-defensin-2 (DEFB2) to chromosome region 8p22-p23.1. //Genomics, v.46, p. 472-475.

49. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.//Proc. Natl.Acad.Sci.USA,, v.91, p. 12501

50. HeIIens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R. et al. (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation //Plant Mol. Biol., № 42(6), p.819-832.

51. Hiatt A., Caffertey R., Bowdish K. (1989) Production of antibodies in transgenic plants. //Nature, 342, p. 76-78.

52. Hitchcock C.A. (1991) Cytochrome Р-450-dependent 14 alpha-sterol demethylase of Candida albicans and its interaction with azole antifungals //Biochem. Soc. Trans., 19, p. 782-787.

53. Hoekema A., Roelvink PW, Hooykaas PJ, Schilperoort RA. (1984) Delivery of T-DNA from the Agrobacterium tumefaciens chromosome into plant cells. //EMBO J., 3(11), p. 2485-2490.

54. Hou B.K., Zhou Y.H., Wan L.H., et al. (2003) Chloroplast transformation in oilseed rape. //Transgenic Res., 12, p. 111-114.

55. Hristova K., Selsted M.E., White S.H. (1996) Interactions of monomeri rabbit neutrophil defensins with bilayers: comparison with dimeric human defensin HNP-2. // Biochemistry, v.35, p. 11888-11894.

56. Jefferson RA, Kavanagh ТА, Bevan MW. (1987) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J., v.6, № 13, p.3901-3907.

57. Jia H.P., Schutte B.C., Schudy A., Linzmeier R., Guthmiller J.M., Johnson G.K., Tack B.F., Mitros J.P., Rosenthal A., Ganz Т., Mc Cray P.B. (2001) Discovery of new human (3-defensin using a genomics-based approach. //Gene, v.263, p. 211218.

58. Joyeux A., Balaguer P., Germain P., Boussioux A.M., Pons M., Nicolas J.C. (1997) Engineered cell lines as a tool for monitoring biological activity of hormone analogs. // Anal. Biochem.,v.249 (2), p. 119-130.

59. К. Ко, H. Koprowski. (2005) Plant biopharming of monoclonal antibodies// Virus Research, №111, p. 93-100.

60. К. Ко, Wei X., Crooks P.A., Koprowski H. (2004) Elimination of alkaloids from plant-derived human monoclonal antibody. //J. Immunol. Methods, 286, p. 79-85.

61. Kapila J.,R. de Rycke, M. van Montagum and g. Angenon. (1997) An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves // Plant Sci., v.122, p. 101-108.

62. Kawaoka A., Kawamoto Т., Ohta H. et al. Wound-induced expression of horseradish peroxidase // Plant Cell Rep.-1994.-V.13.-P.149-154.

63. Khoudi H., Laberge S., Ferullo, Bazin R., Darveau A., Castonguay Y., Allard G., Lemieux R., Vezina L.P. (1999) Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. //Biotechnol. Bioeng., 64, p. 373-381.

64. Koncz C. and Schell J., (1986) The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector //Mol. Gen. Genet., v.204, p. 383-396.

65. Kononowicz A.K., Nelson D.E., Singh N.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Regulation of the osmotin gene promoter // Plant Cell.- 1992.- V.4.- P.513-524.

66. Kuchuk N., Sytnik K., Vasilenko M., Shakhovsky A., Komarnitsky I., Kushnir S., Gleba Yu. (2006) Genetic transformation of plastids of different Solanaceae species using tobacco cells as organelle hosts// Theor.Appl.Genet., v. 113, № 3, p.519-527

67. Lanberty M., Caille A., Landon C., Tassin-Moindrot S., Hertu C., Bulet P., Vovelle F. (2001)Solution structures of the antifungal heliomicin and a selected variant with both antibacterial and antifungal activites. //Biochemistry, v.40, p. 11995-12003.

68. Landon C., Pajon A., Vovelle F., Sodano P. (2000) The active site of drosomycin, a small insect antifugal protein, delineated by comparison with the modeled structure of Rs-AFP2, a plant antifungal protein. // J. Pept. Res., v.56, p. 231-238.

69. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. (1991) A DNA Transformation-competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology (NY).,)9 (10): 963-967.

70. Lessard P.A. et al. (2002) Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. // Metab. Eng., v.4, p. 67-79.

71. Lorenz W.W., Cormier M.J., O'Kane D.J., Hua D., Escher A.A., Szalay A.A. (1996) Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells // J. Biolumin. Chemilumin., v.l 1, p.31-37.

72. Lu S., Shi R., Tsao C.C., Yi X., Li L., Chiang V.L. RNA Silencing in Plants by the Expression of siRNA Duplexes// Nucleic Acids Res. 2004 V.32(21). P. 171.

73. M. Padidam. (2003) Chemically regulated gene expression in plants // Current Opinion in Plant Biology, №6, p. 169-177.

74. M. Venter. (2007) Synthetic promoters: genetic control through cis engineering // Trends in Plant Science, v.12, № 3,

75. Ma J.K., Hikmat B.Y., Wycoff K., Vine N.D., Chargelegue D., Yu L., Hein M.B., Lehner T. (1998) Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. //Nat. Med., 4, p. 601-606.

76. Manen-D., Pougeon M., Damay P., Geiselmann J. (1997) A sensitive reporter gene system using bacterial luciferase based on a series of plasmid cloning vectors compatible with derivatives of pBR322 // Gene, v. 186, p. 197-200.

77. Marillonnet S. et al.(2004) In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium // Proc.

78. Natl. Acad. Sci US A,.v. 101, p. 6852-6857.

79. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. (2005) Systemic Agrobacterium tumefacient -mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants //Nature biotechnology, v. 23, p. 718-723.

80. Hamilton DA, Roy M, Rueda J, Sindhu RK, Sanford J, Mascarenhas JP. (1992) Dissection of a pollen-specific promoter from maize by transient transformation assays //Plant J., v.18 (2), p.211-218.

81. Matsunaga Т. and Rahman A. (1998) What brought the adaptive immune system to veterbrates?-The jaw hypothesis and the seahorse. //Immunol. Rev., v. 166, p. 177-186.

82. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Yu.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. //Nature Biotech., v. 17, p.969-973.

83. Misteli Т., Spector D.L. (1997) Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology // Nat.Biotechnol., v. 15, p.961-964.

84. Pazzagli M., Devine J.H., Peterson D.O., Baldwin Т.О. (1992) Use of bacterial and firefly luciferases as reporter genes in DEAE-dextran-mediated transfection of mammalian cells // Anal. Biochem., v. 204 (2), p. 315-323.

85. Picard C. (1994) Regulation of protein function through expression of chimeric proteins. // Curr. Top.Biotech., v.5, p. 511-515.

86. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V.(1998) The use of a thermostable beta-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants // Mol. Gen.Genet, v. 257, p. 561-567

87. E.S. Piruzian, I.V. Goldenkova-Pavlova, R.M. Abdeev, R.A. Komakhin, S.A. Brouskin, I.A. Abdeeva. (2006) Transgenic plants expressing bacterial genes as a model system for plant functional genomics. // Current Genomics, V.7, p. 3342.

88. Porta C. and Lomonossoff G.P. (2002) Viruses as vectors for expression of foreign sequences in plants //Biotechnol. Genet. Eng. Rev., v. 19, p. 245-291.

89. Potrycus I., Mutelstein-Sheid O., Suatter C., Spangenberg G. (1991) Gene transfer to plants. EMBO advanced cources. Zurich: Swiss Federal Institute of Technology, -125p.

90. Prats E., Galindo J.C., Bazzalo M.E., Leon A., Macias F.A., Rubiales D., Jorrfn J.V. (2007) Antifungal activity of a new phenolic compound from capitulum of a head rot-resistant sunflower genotype. // J Chem Ecol., 33(12), p. 2245-53

91. Rigden J.E., Dry I.B., Mullineaux P.M., Rezaian M.A. (1993) Mutagenesis of the virion-sense open reading frames of tomato leaf curl geminivirus.// Virology, 193(2), p.1001-1005.

92. R. Boehm. (2007) Bioproduction of therapeutic proteins in the 21 st century and the role of plants and plant cells as production platforms// Ann.N.Y. Acad.Sci. 1102, p.121-134.

93. Tyagi AK, Khurana JP. (2003) Plant molecular biology and biotechnology research in the post-recombinant DNA era.// Adv Biochem Eng Biotechnol., 84, P. 91-121.

94. R.M. Twyman, E.Stoger, S. Schillberg, P. Christou, R. Fischer. (2003) Molecular farming in plants: host systems and expression technology// Trends in Biotechnology, vol. 21, № 12, p. 570-578.

95. Reed R. and Hurt E. (2002) A conserved mRNA export machinery coupled to pre-mRNA splicing //Cell, v. 108, p. 523-531.

96. Salter M.G., Paine J.A., Riddell K.V., Jepson I., Greenland A.J., Caddick M.X., Tomsett A.B. (1998) Characterization of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants. // Plant J., v.16, p. 127-132.

97. Samach A., Onouchi H., Gold S.E., Ditta G.S., Schwarz-Sommer Z., Yanofsky M.F., Coupland G. (2000) Distinct roles of constans target genes in reproductive development of Arabidopsis // Science, v.288, p. 1613-1616.

98. Sambrook J. and Russell D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.-Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition 2001.-999 p.

99. Sandhu J. S. • Osadjan M. D. • Krasnyanski S. F. Domier L. L. • Korban S. S., -Buetow D. E. Enhanced expression of the human respiratory syncytial virus-F gene in apple leaf protoplasts Plant Cell Reports (1999) 18: 394-397.

100. Sawai M.V., Jia H.P., Liu L., Aseyev V., Wiencek J.M., McCray P.B., Ganz Т., Kearney W.R., Tack B.F. (2001) The NMR structure of human defensin-2 reveals a novel alpha-helical segment. //Biochemistry, v.40, p. 381038.16.

101. Schillberg S. et al. (2002) Antibody molecular farming in plants and plant cells. // Phytochem. Rev., v.l, p.45-54.

102. Schinmyo A., Garsia-Martinez D.V., Demain A.L. (1979) Classification and biological distribution of histamine receptor sub-types // J.Appl.Biocem., v.l, p. 202-209.

103. Segura A., Moreno M., Molina A., Garcia-Olmedo F. (1998) Novel defensin subfamily spinach (Spinacia oleracea). //FEBS Lett., v.435, p. 159-162.

104. Serge Remy, Els Thiry, Bert Coemans, Saskia Windelinckx, Rony Swennen, and Laszlo Sagi. Improved T-DNA vector for tagging plant promoters via high-throughput luciferase screening. //BioTechniques. Vol. 38, No. 5 (2005) 763-770.

105. Sergeyenko T.V., Los D.A. (2000) Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. FEMS Microbiol. Lett. 193: 2113-216.

106. Spaink H.P. (1994) The molecular basis of the host specificity of the Rhizobium bacteria. // Antonie Van Leeuwenhoek., 65(2), p. 81-98.

107. Sytnik K., Komarnytsky I., Gleba Y., Kuchuk N. (2005) Transfer of transformed chloroplasts from Nicotiana tabacum to the Lycium barbarum plants// Cell Biol.Int., v.29, p.71-75.

108. Taylor C.B. (1997) Plant Vegetative Development: From Seed and Embryo to Shoot and Root //Plant cell, v.9 (7), p.981-988.

109. Taylor С. B. (1997) Promoter fusion analysis: an insufficient measures of gene expression// Plant Cell.- V.9.- P.273-275.

110. Giddings G. (2001) Transgenic plants as protein factories// Current Opinion in Biotechnology V.12.- P.450-454.

111. Thevissen K., Kathelijne K.A. Ferket, Isabelle E.J.A. Francois, Bruno P.A. Cammue. (2003) Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components. //Peptides, 24, p. 1705-1712.

112. Templeton M.D., Rikkerink E.A.H. & Beever R.E.(1994) Small, cystein-rich proteins and recognition in fungal-plants interactions // Mol.Plant-Microbe Interact., v.7, p.320-325.

113. Thomma В., Cammue B. and Thevissen K. (2003) Mode of action of plant defensins suggests therapeutic potential // Curr. Drug Targets-Infectious Disorders, v.3, p. 1-8.

114. Thomma B.P.H.J., Cammue B.P.A., Thevissen K. (2002) Plant defensins. // Planta, v.216, p. 193-202.

115. Topfer, R., V. Matzeit, et al. (1987). A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions.// Nucleic Acids Res 15(14): 5890.

116. Van Lijsebettens M. and Valvekens D. (1987). Tobacco Leaf Disk Infection with Agrobacterium tumefaciens EMBO Practical Course on Plant Molecular Biology. Montagu M. V. Gent., Belgium: 15-18.

117. Vasilenko M., Ovcharenko O., Kuchuk N., Gleba Yu.(2006) Production of cybrids in Brassiacaceae species// Molecular Biology, Plant Cell Cultire Protocols. Totowa, NJ:Humana Press Inc., v.318, p.221-234.

118. Verch Т., Yusibov. V., Koprowski H. (1998) Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. //J. Immunol. Metods, 220, p. 69-75.

119. Walsh T.J., Viviani M.A., Arathoon E., Chiou C., Ghannoum M., Groll A.H., Odds F.C. (2000) New targets and delivery systems for antifungal therapy // Med. Mycol, 38, p. 335-347.

120. Welsh S., Kay S.A. (1997) Reporter gene expression for monitoring gene transfer //Curr.Opin.Biotechnol., v.8,p.617-622.

121. Wong E.Y., Hironaka C.M., Fishholf D.A. (1992) Arabidopsis thaliana small subunit leader and transit peptide enhance the expression of Bacillus thuringiensis protein in transgenic plants. Plant Mol. Biol., 20: 81-93.

122. Wood Т. M. and Bhat К. M. (1988) Methods for measuring cellulase activities// Meth Enzymol.- V.160.- P.87-112.

123. Yang Y.S., Mitta G., Chavanieu A., Calas В., Sanchez J.F., Roch P., Aumelas A. (2000) Solution structure and activity of the synthetic four-disulfide bond Mediterranean mussel defensin (MGD-1). //Biochemistry, v.39, p. 1443614447.

124. Yoshida K. and Shinmoy A. (2000) Transgene expression systems in plant, a nature bioreactor. //J. Biosci. Bioeng., v.90, p. 353-362.

125. Yano A., Maeda F., Takekoshi M. (2004) Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis В virus surface antigen. //J. Med. Virol., 73, p. 208-215.

126. Zeidler В., Gatz c., Hartmann E., Hughes J. (1995) Tetracycline regulated reporter gene expression in the moss Physcomitrella patens //Plant Mol. Biol., v.30, p. 199-205.

127. Zhong Huang and Hugh S. Mason. (2004) Conformational analysis of hepatitis В surface antigen fusions in an Agrobacterium-mediated^ transient expression system. // Plant Biotechnology Journal, 2 , pp. 241-249.

128. Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своему научному руководителю, профессору, доктору биологических наук Пирузян ЭлеонореN

129. Суреновне за поддержку, внимание и неоценимую помощь в ходе выполнения научной работы.