Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофизиологические реакции трансгенных растений табака на инсерцию гетерологичного гена HMG1

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфофизиологические реакции трансгенных растений табака на инсерцию гетерологичного гена HMG1"

На правах рукописи

I ?

•Ж.,

ЕРМОШИН АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА НА ИНСЕРЦИЮ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ГЕНА /Ш<7/

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ИАР 2015

005561277

Пущино - 2015

005561277

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский федеральный уттерситет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» в Институте естественных наук и в Филиале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научные руководители:

Кандидат биологических наук, доцент Киселёва Ирина Сергеевна Кандидат биологических наук Алексеева Валерия Витальевна

Официальные оппоненты:

Чемерис Алексей Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, заместитель директора по научной работе Голденкова-Павлова Ирина Васильевна, доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, руководитель группы функциональной геном и ки

Ведущая оргапизацин: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет»

Защита диссертации состоится «20» мая 2015 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2. e-mail: dissovet_ifpb@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://www.ibbp.psn.ru/).

Автореферат разослан «16» марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/

Назарова Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Современная физиология и биохимия растений, используя

методы генной инженерии и биотехнологии, ставит и решает новые научные задачи фундаментального и прикладного характера, связанные с изучением роли отдельных генов в жизни растений, созданием форм с повышенной продуктивностью, улучшенным качеством, устойчивостью к болезням и фитофагам. Интерес к растениям обусловлен тем, что они играют в биосфере Земли и жизни человека важнейшую роль, формируя первичную биологическую продуктивность и урожай, используются как источник химического сырья, биологически активных веществ и конструкционных материалов. Клетки растений, в отличие от клеток животных, сохраняют в течение длительного времени свойство тотипотентности, легко вводятся в культуру, поэтому биотехнологические и генно-инженерные манипуляции с ними представляются достаточно простыми и удобными, не смотря на интенсивные споры о безопасности генной инженерии, её необходимости как инструмента экспериментальной биологии и практической деятельности.

Для растений характерен богатый вторичный метаболизм. Самый многочисленный класс вторичных метаболитов у них - изопреноиды. К классу изопреноидных соединений относятся многие растительные гормоны (фитогормоны) - абсцизовая кислота, гиббереллины, брассиностероиды, цитокинины. Молекулы, связанные с основным метаболизмом растений, такие как каротиноиды, фитол хлорофиллов, стерины мембран, убихиноны и пластохиноны также имеют изопреноидную природу. Соединения специфического обмена веществ - стероидные гликоалкалоиды, сесквитерпеновые фитоалексины и фитонциды, изопрен, компоненты эфирных масел и другие - тоже принадлежат классу изопреноидов.

В растениях существует два метаболических пути синтеза изопреноидов — ацетатно-мевалонатный, локализованный в цитоплазме клетки (МУА-путь), и 2-метил-В-эритритол-4-фосфатный (МЕР-путь), реализующийся в хлоропласте. До

3

сих пор достоверно не известно насколько данные пути могут взаимодействовать друг с другом, могут ли они обмениваться интермедиатами, способен ли один заменить другой. Для решения данной проблемы удобно применение генно-инженерных методов, позволяющих направленно ингибировать или усиливать экспрессию ключевых генов определённого метаболического пути. Изучение ацетатно-мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов представляет особый интерес в связи с тем, что через данный метаболический путь в растениях синтезируются цитокинины, брассиностероиды и стерины мембран, участвующие в регуляции роста и развития, а также в формировании неспецифической устойчивости растений к стрессорам различной природы. Кроме того, из мевалоновой кислоты образуются многие сесквитерпены, которые являются фитоалексинами и аттрактантами, а также, возможно, антиоксидантами. Ключевым этапом в синтезе изопреноидов в цитозоле является образование мевалоновой кислоты. Этот этап катализируется З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазой, кодируемой генами семейства hmg. Инсерция гена /гга^/, регулирующая синтез вторичных метаболитов изопреноидной природы, может быть интересна для получения трансгенных растений с полезными свойствами, такими как высокая устойчивость к абиотическим и биотическим факторам и/или большая продуктивность. Для последующего использования таких трансгенных растений необходимо изучение их физиологии.

Целью нашей работы было изучение роли гена hmgl в жизни растительного организма на примере трансгенных моделей.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести трансформацию ШсоИапа тЬасит конструкциями, несущими ген из АгаЫ(1орз1з ЛаНапа в прямой и обратной ориентациях относительно конститутивного промотора 3558 СаМУ.

2. Доказать трансгенную природу полученных линий, наличие в них экспрессии целевого гена, провести анализ наследования трансгенной вставки в первом семенном поколении.

3. У трансгенных и контрольных растений оценить накопление стеринов как продуктов метаболизации мевалоната (общее количество, синтез по включению ,4С02).

4. Изучить анатомо-морфологические (мезоструктура фототрофных тканей, размеры листа) и физиолого-биохимические (интенсивность фотосинтеза, содержание пигментов) характеристики листьев растений, особенности строения и состояния генеративной сферы.

5. Выявить устойчивость трансгенных и контрольных линий к биотическим и абиотическим стрессовым факторам (по ПОЛ, активности ферментов СОД и гваяколовой пероксидазы, накоплению пролина).

6. Определить степень микоризации трансгенных и нетрансгенных растений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инсерция гетерологичного гена hmgl и изменение его экспрессии вызывает морфогенетические эффекты у растений табака: регулирует формирование мужского и женского гаметофитов, листьев, их фотосинтетическую активность.

2. Ген hmgl вовлечен в формирование ответных реакций растений табака на действие стрессовых факторов абиотической (ионы меди, гербицид паракват) и биотической природы (инфекция Pseudomonas syringae и Erwinia carotovora).

3. Трансгенные растения табака с усиленной экспрессией гена hmgl имеют более высокую степень микоризации, чем контрольные растения и растения с подавленной экспрессией.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая

значимость работы заключается в уточнении роли гена hmgl в регуляции

морфогенетических и физиолого-биохимических процессов в растении.

Результаты исследования использованы в лекционных курсах «Биохимия

вторичного обмена», «Фитоиммунитет», «Генетика развития растений» для

5

студентов магистратуры, обучающихся по направлению «Биология» и при подготовке учебного пособия «Биохимия вторичного обмена».

Результаты могут представлять интерес для целей практической селекции при создании растений с повышенной продуктивностью и устойчивостью к комплексу стрессовых факторов.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение физиологии трансгенного растения табака, содержащего гетерологичный ген hmgl из арабидопсиса. Показано, что усиление его экспрессии приводит к увеличению размеров листа, изменению размеров внутренней ассимиляционной поверхности.

Впервые показано, что у трансгенных растений табака при подавленной экспрессии гена hmgl увеличивается доля абортивных семязачатков и стерильной пыльцы.

Получены приоритетные данные о вовлеченности гена hmgl в формирование устойчивости растений к ряду стрессовых факторов, таких как действие ионов меди, окислительный стресс, вызванный паракватом, инфицирование фитопатогенами, а также во взаимодействие растений с микоризообразующими грибами.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на I и II

Всероссийских с международным участием молодежных конференциях «Биология

будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2010, 2012), IX чтениях памяти

акад. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2011), съезде ОФР (Нижний Новгород, 2011),

Всероссийских симпозиумах «Физиология трансгенного растения ...» (Москва,

2010, 2012, 2014), международных молодежных конференциях «Ломоносов»

(Москва, 2010, 2012, 2014), международных конференциях «Eurobiotech» (Краков,

2010, 2011), ежегодных собраниях общества экспериментальных биологов (SEB

Annual meeting) (Зальцбург, 2012; Валенсия, 2013), Всероссийской конференции

«Физиология, биохимия и биотехнология растений: взгляд в будущее» (Томск,

2013), Международной конференции «Биология растений in vitro» (Казань, 2013),

Всероссийской молодежной школе «Биология растительной клетки» (Звенигород,

6

2014), Всероссийском конгрессе молодых биологов «Симбиоз-Россия - 2014» (Екатеринбург, 2014).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением результатов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 178 источников, из них131 на английском языке. Содержит 5 таблиц и 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В главе представлены литературные данные о гене HMG, его транскрипции, кодируемом им ферменте, регуляции активности фермента (Lawrence et al., 1995; Istvan, Deisenhofen 2000; Laule et al., 2003; Fresen et al., 2004). Охарактеризовано семейство генов HMG у растений (Choi et al., 1992; Enjuto et al., 1994; Denbow et al., 1996). Описаны пути биосинтеза изопреноидов и их роль в растении (Lichtenthaler et al., 1997; Rohmer, 1999; Племенков, 2001; Ершов, 2005), роль стеринов в регуляции роста и развития растений (Choe et al., 1999; Schrick et al., 2000; Diener et al., 2000; Peng et al., 2002; He et al., 2003). Представлены сведения о роли сесквитерпенов в микоризации растений (Akiyama et al., 2006; Sbrana, Giovannetti, 2005).

Глава 2. Объекты п методы исследования Объект исследования и генетическая конструкция. Работа выполнена на растениях табака сорта «Самсун». Трансгенные растения получены в ФИБХ РАН (Поройко и др., 2000) и автором с помощью метода агробактериальной трансформации листовых эксплантов по Дрейпер с соавт. (1991). Для трансформации использован штамм GV3101 (pMK90RK), несущий плазмиду pSS с геном hmgl из A. thaliana в прямой (смысловые или С-линии) и обратной

(антисмысловые или А-линии) ориентации относительно двойного вирусного промотора 35 SS CaMV.

Молекулярно-генетические методы. Плазмидную ДНК бактерий выделяли методом щелочного лизиса (Маниатис, 1984). Геномную ДНК растений выделяли по методу (Edwards et al., 1991) или с использованием детергента СТАВ. РНК выделяли с использованием реактива TRIZOL. ПЦР проводили в амплификаторе MJ MINI Bio-Rad (США) или «Терцик» (ДНК-технологии, Россия) с использованием реактивов производства «Евроген» (Россия) с праймерами к генам hmgl и nptll. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора «MMLV RT kit» (Евроген, Россия).

Физиолого-биохимические исследования. Липиды экстрагировали из сухого растительного материала по стандартной методике (Folch et al., 1957). Содержание стеринов определяли спектрофотометрически после омыления липидной фракции щелочью (Кандюк, 2002). О синтезе липидов судили по включению 14С после подкормки отдельных интактных листьев ИС02 (концентрация - 0,05%, удельная радиоактивность - 20 мКи/л С02, экспозиция -40 мин). Через 12 часов лист отделяли от растения, фиксировали в парах кипящего этанола, высушивали. Радиометрировали липидную фракцию и неомыляемый остаток.

Скорость фотосинтетического поглощения углекислого газа (нетто-фотосинтез) определяли радиоизотопным методом (Мокроносов, 1981), содержание хлорофиллов - спектрофотометрически (Гавриленко и др., 1975).

Устойчивость растений оценивали на листовых высечках после индукции абиотического стресса разными концентрациями сульфата меди (100 мкМ в течение 20 часов, 5 мМ в течение 9 часов) или параквата (1 мкМ, 20 часов на свету). Биотический стресс вызывали обработкой листьев культурой фитопатогена Pseudomonas syringae или Erwinia carotovora..

Уровень ПОЛ определяли спектрофотометрически по образованию цветного

продукта реакции малонового альдегида с тиобарбитуровой кислотой. (Uchiyama,

8

Mihara, 1978), содержание пролина - спектрофотометрически по (Bates et al., 1973; Калинкина, 1985), активность гваяколовой пероксидазы — по скорости окисления гваякола перекисью водорода (Chance, Maehly, 1955), супероксиддисмутазы — по ингибированию фотоокисления тетразолиевого нитросинего в присутствии метиошша (Beauchamp, Fridovich, 1971), содержание растворимого белка - по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Анатомо-морфологические методы. Мезоструктуру листа изучали методом световой микроскопии (Мокроносов, Борзенкова, 1978) с использованием программного обеспечения «SiamsMezoPlant», фертильность пыльцевых зерен -ацетокарминовым методом, а также по активности дегидрогеназ (реакция окисления трифенилтетразолия) и по прорастанию на 5%-ной агаризованной сахарозе (Паушева, 1988). Морфологию семязачатков изучали после мацерации и просветления завязей в 5%-ном КОН (5 суток).

Оценку развития микоризы у растений проводили по завершении фазы цветения. Корневые препараты обесцвечивали и мацерировали кипячением в 15%-ном КОН, окрашивали раствором анилинового синего в лактате, определяли частоту встречаемости микоризы, везикул и арбускул в поле зрения микроскопа (Селиванов, 1983).

Статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в 5-6 биологических и 2-3 аналитических повторностях. Каждый опыт закладывался не менее двух раз. Каждую трансгенную линию растений анализировали отдельно. На рисунках и в таблицах данные представлены в виде среднего и его ошибки. Достоверность отличий определена с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Получение трансгенных линий Nicotiana tabacum, определение

копийности вставки и экспрессии целевого гена. Получены новые трансгенные

линии растений табака с усиленной (линии С21-С28) и подавленной (линии А21-

А28) экспрессией гена hmgl, а также «трансгенный» контроль

9

(трансформированные вектором рББ без вставки линии рБ521 -23). Методом ПНР доказана трансгенная природа полученных линий. Методом ОТ-ПЦР показана экспрессия трансгенов. Полученные ранее в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН линии (А1, А2, А6, С1, С2, С4) сохраняли экспрессию трансгена. Для них определена копийность инсерции: одна за исключением линии А2 - две копии гена.

Содержание липидов и стеринов в тканях табака. В течение двух вегетационных сезонов наблюдали уменьшение содержания липидов в А-линиях трансгенных растений и увеличение в С-линиях относительно контроля (таблица 1).

Таблица 1. Содержание липофильных соединений в листьях табака

Год Линии Липиды, Неомыляемый остаток, Стерины,

мг/г сух. массы мг/г сух. массы мг/г сух. массы

к 113±5 54±3 5,4±0,1

о <ч А 102±4* 40±3 * 3,6±0,2 *

С 121±5 51±3 4.5±0,2

К 109±1 42±1 9,1 ±0,5

о А 101±2* 41±4 3,9±0,4 *

С П3±5 43±3 8,4±0,6

* - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Количество соединений неомыляемого остатка также меньше у А-линий, чем в контроле и С-линиях. Содержание стеринов у С-линий не отличалось от контроля, и было существенно меньше у А-линий в оба сезона.

Включение ,4С-фотоассимилятов в липофильные соединения листьев. У контрольных и трансгенных растений наблюдали включение ассимилированного в ходе фотосинтеза ИС в липиды и неомыляемый остаток: у С линий - на 5,1% и на 3,6% больше, чем в контроле, соответственно. При подавлении экспрессии гена Ъпщ1 (А-лииии) включение |4С в липиды относительно контроля падало на 3,9%, в компоненты неомыляемого остатка - на 7,3%. Наблюдаемые отличия были достоверны для р < 0,05. Включение 14С в липиды у растений трансгенного контроля не отличалось от нетрансгенного, что подтверждает связь наблюдаемых

отличий с работой гена hmgl. Таким образом показано, что уровень экспрессии гена hmgl влияет на накопление липофильных соединений в тканях листа.

Влияние экспрессии гетерологичного гена на морфологию

растений табака. Вставка дополнительной копии гена кто} вызывала увеличение размеров листьев трансгенных растений, а подавление его экспрессии - их уменьшение (рисунок 1). Эффекты инсерции трансгена в более

П/ШСТ СрйЗК^УО ж;у<3_Ш;:лкс-т

Рисунок ]. Размер листьев растений табака * - отличия от контроля достоверны при р<0,05 молодых листьях верхних ярусов, в сравнении с расположенными ниже,

проявлялись в большей степени у растений А-линий, чем у С-линий. В верхней

части побега у растений А-линий площадь листа составляла от 82,9 до 93,4% от

контроля, тогда как у С-линий - 130,5-171,6% от размера листа в контроле. В

средней части стебля лист А-линий достигал 49,8-87,6% от площади листьев в

контроле, С-линий - 106,8-126,9%

Структура мезофилла листа. Мы предположили, что изменение размеров

листа связано с изменением его анатомии. Выяснено, что все трансгенные линии,

независимо от типа генетической конструкции, имели меньшую (в среднем на

12%) толщину листа и большее число клеток мезофилла в единице площади и в

целом листе. Соответственно, все трансгенные линии имели достоверно большую

внутреннюю ассимиляционную поверхность. Растения А-линий отличались достоверно большей плотностью упаковки клеток в листе (таблица 2). Таблица 2. Расчетные показатели мезоструктуры листа

Вариант Индекс мембран клеток, ед. Доля мезофилла в объеме листа, %

Контроль 9±0,5 30±5

А 12±0,3 * 46±6 *

С 11±0,5 * 39±7,5

* - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05 Содержание пигментов в венчиках цветков табака. Ранее показано, что трансгенные линии табака с антисмысловой копией гена имели белую

окраску венчиков цветков (Поройко и др., 2000), тогда как контрольный табак имел цветки тёмно-розового цвета. Нами проведена количественная оценка содержания антоцианов в венчиках контрольных и трансгенных растений табака, как полученных ранее в ФИБХ РАН, так и созданных нами. Все линии, кроме трансформированных вектором без вставки, содержали меньше антоцианов. В цветках С-линий их количество недостоверно отличалось от контроля (снижение на 12-20%), в то время как венчики цветков А-линий имели достоверно меньше пигментов (на 67%) (рисунок 2).

Ш

= НЮ 1 11 1 3

К-

§ ;й> т

В ?? 40

|" ш ^ ш

I

рш

ш

Рисунок 2. Содержание антоцианов в венчиках цветков табака * - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Контроль Линия А1

Рисунок 3. Семена контрольного и трансгенного растения после просветления

а#т

щ

ЯШ

Рисунок 5. Прорастание пыльцы контрольных растений (А) и линии А1 трансгенного табака (Б) на среде с сахарозой

Рисунок 8. Влияние инфицирования Е. саго1о\ога на ткани листа табака (4 сутки после заражения). К - контроль, С1, А1 - линии трансгенного табака.

Влияние экспрессии гена на всхожесть семян. Растения с

антисмысловой ориентацией гена имели меньшую всхожесть семян (8-26%) в сравнении с контролем и растениями с усиленной экспрессией (таблица 3). Семена растений А-линий имели низкую выполненность (рисунок 3).

Таблица 3. Всхожесть семян растений табака (%)

Линия Время сбора семян Среднее

2003 г июль 2009 февраль 2010 сентябрь 2010 июль 2012

Контроль 92±4 80+5 84+4 94+4 89+5 88+3

А 79±2* 50+5* 77+1* 73+5* 64+5* 69±5*

С 80±6* 85±5 88+4 82+2* 83+4 84+1

* - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Контроль Линия А1

Рисунок 3. Семена контрольного и трансгенного растения после просветления Влияние гена hmgl на мужскую генеративную сферу растений. В работах Сузуки с соавторами подавление ацетатно-мевалонатного метаболического пути приводило к повышенной стерильности пыльцевых зерен (Suzuki et al., 2009). Мы получили аналогичные данные. Использование двух методик оценки фертильности пыльцы показало, что пыльца растений со смысловой копией гена hmgl имела такой же уровень фертильности, как и контрольных, в то время как пыльцевые зерна антисмысловых растений обладали достоверно меньшим уровнем фертильности (рисунок 4). При определении фертильности пыльцы по активности дыхательных дегидрогеназ обнаружено, что у антисмысловых растений она значительно меньше, чем при использовании

ацетокарминовой методики. Это может говорить о том, что стерилизация пыльцевых зерен у этих растений происходит на поздних этапах развития мужского гаметофита.

Рисунок 4. Доля фертильной пыльцы в цветках растений табака * - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

При проращивании пыльцы А-линий на 5%-ном растворе сахарозы обнаружены лишь единичные проросшие пыльцевые зерна, а пыльцевые трубки обладали пониженной скоростью роста (рисунок 5).

Рисунок 5. Прорастание пыльцы контрольных растений (А) и линии Al трансгенного табака (Б) на среде с сахарозой Влияние иисерции гена hmgl на формирование женской генеративной сферы у растений табака. Показано, что ген HMG1 экспрессируется в зародышевых мешках, рыльце и столбике пестика (Enjuto et al., 1995). Мы обнаружили, что все трансгенные линии имели высокую частоту патологии в

семязачатках, проявляющуюся в изменении формы семязачатка, неправильной

14

ориентации микропиле относительно фуникулюса, неполном развороте семязачатка или его отсутствии, гипертрофии или недоразвитости интегументов. В смысловых линиях растений такие патологии встречались реже, чем в линиях с антисмысловой копией гена \vngl (рисунок 6).

т 1

§ 40 | л ЗЙ

111 шш V

т ¡11 Ш ¡¡¡я

1111 1111 1Щ;!;

ШШШ-. ¡111 :

Е.г г.г , —

йЬ

К ¡3$$ А С

Рисунок 6. Доля аномальных семяпочек * - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05 Таким образом, подавление экспрессии гена hmgl приводило к нарушениям генеративной сферы растений табака, а именно к повышению доли патологических семязачатков и увеличению стерильности пыльцевых зерен.

Устойчивость к абиотическим стрессовым факторам. Проведены несколько серий опытов по выявлению роли гена hmgl в реакции растений на стрессовые факторы: 20-часовое воздействие 100 мкМ ионов меди, 9-часовое действие 5 мМ ионов меди и 20-часовое действие 1мкМ параквата. Показано, что растения с повышенной экспрессией гена hmgl более устойчивы к указанным стрессовым факторам. Ниже представлены результаты опыта по влиянию 5 мМ сульфата меди на листовые высечки табака. Содержание продуктов ПОЛ при действии стрессора у А-линий возрастало в 3,1-4,7 раза, в контроле и С-линии - в 3,8 раза (рисунок 7 А). Содержание растворимого белка у А-линий снижалось на 30-57%, в контроле - на 19%, у С-линии существенно не менялось - не более 2% (рисунок 7 Б). При стрессе активность гваяколовой пероксидазы значительно возрастала во всех вариантах опыта, но не в равной степени. В контроле

наблюдали рост активности фермента в 3,4 раза, в А-линиях в 2,7-5,0 раз, а в С-линии - в 2,4 раза (рисунок 7 В). Таким образом, в контроле и в антисмысловых линиях происходило значительное увеличение активности гваяколовой пероксидазы, что может свидетельствовать о большем количестве образующихся в клетках АФК. В смысловой линии активность фермента повышалась в меньшей степени, что, возможно, связано с большим содержанием у них антиоксидантов изопреноидной природы. Интенсивность фотосинтеза при стрессе снижалась во всех вариантах опыта: у контрольных растений она составила 19% от исходного уровня, у А-линий 16%, а у растений С-линии - 31% (рисунок 7 Г). Полученные данные подтверждают, что трансгенные растения А-линий являются менее устойчивыми, а растения С-линии - более устойчивыми к действию высоких концентраций ионов меди.

45; -К® -

л»

300

4.

¡е. и Ш} 11Ш

¡1 I 2Ш I £ Уй * Щг

В

'Л-

т к №

г

Рисунок 7. Влияние ионов меди (5 мМ, 9 ч.) на некоторые маркеры стресса у растений табака:

А - уровень ПОЛ; Б - содержание растворимого белка; В - активность гваяколовой пероксидазы; Г - нетго-ассимиляция ССЬ. За 100 % принят уровень показателей на воде. * -Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Устойчивость к фитопатогенам. Как известно, некоторые сесквитерпены являются фитоалексинами (Плотникова и др., 2007), поэтому мы предположили, что растения с усиленным ацетатно-мевалонатным биосинтетическим путём могут быть более устойчивы к ряду фитопатогенов.

Оценивали устойчивость полученных трансгенных растений к фитопатогену широкого круга хозяев Pseudomonas syringae. Линии с антисмысловой копией гена hmgl в сравнении с контролем не показали достоверных отличий в устойчивости к патогенам. Возможно, это связано с недостаточно сильным ингибированием ацетатно-мевалонатного биосинтетического пути у растений при использовании стратегии антисмысловых РНК.

У смысловых линий содержание продуктов ПОЛ при стрессе не возрастало, тогда как в контроле их количество увеличилось более, чем на 70%. Это свидетельствует о том, что трансгенные С-линии не испытывают значительного стресса в отличие от контрольных. Под действием Р. syringae в контроле происходил незначительный рост уровня свободного пролина, при этом в смысловых линиях наблюдали его увеличение более чем в 3 раза.

Таким образом, показана специфичность реакций растений с разными формами гена hmgl на биотический стресс и повышение устойчивости трансгенных линий со смысловой копией гена к фитопатогену Р. syringae.

Кроме того, обнаружено повышение устойчивости листовых эксплантов трансгенных С-линий к патогену Е. carotovora (рисунок 8).

' » Ш

ä ' V

Рисунок 8. Влияние инфицирования Е. carotovora на ткани листа табака (4 сутки после заражения). К - контроль, С1, АI - линии трансгенного табака.

Влияние гена на степень микоризации трансгенных растений. У

растений С-линий встречаемость микоризы в целом была больше в 4 раза, частота встречаемости арбускул - в 2, а везикул - в 4.9 раза по сравнению с контролем (рисунок 9). Частота встречаемости микоризы и везикул в А-линиях достоверно не отличалась от контроля, при этом встречаемость арбускул была почти в 4 раза меньше в сравнении с контролем (рис. 9). Это может быть обусловлено снижением синтеза мевалоновой кислоты - ключевого предшественника изопреноидов. Возможно, изменение мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов у этих трансгенных линий табака приводило к увеличению продуктов или предшественников метилэритритолфосфатного пути синтеза изопреноидов, по которому, вероятно, образуются стриголактоны.

А

18 1в л Н

ё. ® & «

11111111 Лнмшрагттй

С

Рисунок 9. Встречаемость микоризы у растений табака (А) и отдельно арбускул и везикул (Б) * - Отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Заключение

Диссертационное исследование посвящено изучению роли экспрессии гена кт%1 в жизнедеятельности растений табака. Проведена агробактериальная трансформация растений генетическими конструкциями с геном \\mgl в прямой и обратной ориентациях относительно промотора. Методом ПЦР подтверждена вставка целевого и маркерного генов в 7 новых линиях табака с геном Ьщ1 в прямой ориентации и в 8 линиях с геном в обратной ориентации. Получено 3

18

линии растений, трансформированных «пустым вектором» - трансгенный контроль. У отобранных линий методом ОТ-ПЦР доказана экспрессия встроенных генов.

Роль гена в жизнедеятельности растения оценивали по анатомо-морфологическнм и физиолого-биохимическим характеристикам. Сформулирована гипотеза о том, что ген 1\т%1, кодирующий ОМГ-КоА редуктазу, катализирующую реакцию образования мевалоната, вовлечен в регуляцию широкого спектра процессов, происходящих в целом растении, поскольку мевалоиат является предшественником изопреноидных соединений, включая фитогормоны, стерины, соединения вторичного обмена. Логично предположить, что изменение экспрессии гена Нпщ1 должно привести к изменению содержания мевалоновой кислоты и, как следствие, цитозольных изопреноидов, например, стеринов. Это предположение нашло подтверждение в нашей работе - у трансгенных линий содержание стеринов и липидов отличалось в сравнении с контрольными растениями. Стерины являются предшественниками брассиностероидов, поэтому, возможно, у трансгенных растений произошло изменение содержания этих фитогормонов. Известно, что недостаток брассиностероидов приводит к формированию карликового фенотипа растений. Эти гормоны участвуют в развитии пыльцы. В наших исследованиях показано, что растения с антисмысловой копией гена \migl имели меньшую степень фертильности пыльцы и меньшие размеры листьев, что косвенно может подтверждать гипотезу о более низком содержании брассиностероидов у растений с подавленной экспрессией гена Ипщ1.

Обнаружено, что растения с дополнительной копией гена в большей

степени толерантны к абиотическим стрессорам, чем контрольные линии, а растения, в которых была подавлена экспрессия данного гена, менее устойчивы к неблагоприятным факторам. Мы предполагаем, что изменение устойчивости трансгенных растений могло быть обусловлено изменением уровня цитозольных

изопреноидов, участвующих, в том числе, в стрессовых реакциях растений.

19

Показано, что устойчивость к биотическим стрессорам у трансгенных растений с усиленной экспрессией гена также выше, чем у нетрансгенных растений и растений с подавленной экспрессией гена. Возможное объяснение этого факта состоит в том, что при инфицировании фитопатогенами растения накапливают сесквитерпеновые фитоалексины и гликоалкалоиды, которые являются производными стеринов.

Усиление микоризации трансгенных растений табака с дополнительной копией гена в прямой ориентации также может быть объяснено накоплением таких производных изопреноидов, как стриголактоны, которые, как известно, являются факторами аттракции гифов микоризообразующих грибов.

Таким образом, в нашем исследовании показано участие гена й/иgl в процессах роста и развития растений, формировании устойчивости к стрессорам абиотической и биотической природы, а также установлении взаимоотношений с микоризообразующими грибами. Модификация начальных этапов биосинтетических путей (образование мевалоната), вероятно, вызывает заметные изменения в накоплении таких конечных продуктов как стернны, липиды, фитогормоны и другие и, следовательно, может приводить к множественным эффектам на уровне целого растения.

Выводы

1. Получено 15 новых линий трансгенных растений табака, экспрессирующих ген hmgl из А. ЛаНапа в прямой и обратной ориентациях относительно промотора 3588 СаМУ. Показано, что изменение экспрессии гена вызывало уменьшение (у антисмысловых линий) или увеличение (у смысловых линий) включения 14С-фотоассимилятов в липофильные соединения листа, что приводило, соответственно, к снижению или росту содержания липидов и стеринов.

2. Подавление экспрессии гена hmgl приводило к уменьшению площади

листьев (до 83%), усиление - к её росту (до 171%) в сравнении с контролем.

Плотность мезофилла листа трансгенных растений была выше, чем контрольных:

20

у смысловых линий - за счет увеличения объёма клеток губчатой ткани, у антисмысловых - за счёт большего числа клеток в единице поверхности листа.

3. У антисмысловых линий растений по сравнению с другими выявлены особенности генеративной сферы: снижение всхожести семян (на 26%), уменьшение доли фертилыюй пыльцы (на 25-32%), наличие множественных аномалий в морфологии семязачатков.

4. Показано влияние гена hmgl на толерантность растений табака к действию абиотических и биотических стрессоров (ионы меди, паракват, патогены Р. syringae и Е. carotovora). Линии с усиленной экспрессией гена проявляли большую устойчивость, а с подавленной — меньшую, что выражалось в уменьшении содержания белка и интенсивности фотосинтеза, повышении уровня ПОЛ, изменении активности ферментов антиоксидантной защиты.

5. Впервые обнаружено, что у трансгенных линий с дополнительной копией гена hmgl возрастала степень микоризации растений: частота встречаемости арбускул и везикул в корнях была в 2 и 5 раз выше, соответственно, по сравнению с контролем.

Публикации по теме диссертации В журналах из перечня ВАК:

1. Ермошин A.A., Синенко О.С., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Буданцсв А.Ю., Бурьянов Я.И. Влияние гетерологичного гена hmgl на мезоструктуру листа и устойчивость трансгенных растений табака к Pseudomonas syringae II Вестник Томского гос. университета. Сер. Биология. 2011. № 2 (14). С. 46-55.

2. Ермошин A.A., Малёва М.Г., Чукина Н.В., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Роль модифицированной экспрессии гена hmgl в устойчивости трансгенных растений табака к действию ионов меди // Известия Тульского гос. университета. Сер. Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 237-245.

3. Ермошин A.A., Кондратков П.В., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б. Развитие

арбускулярной микоризы у трансгенных растений табака с измененным

21

синтезом изопреноидов и растений с гиперпродукцией ауксинов // Вестник Нижегородского университета. 2013. №1-1. С. 146-150.

В прочих изданиях:

1. Алексеева В.В., Ермошин A.A., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Влияние уровня мевалоновой кислоты на физиолого-биохимические параметры трансгенных растений семейства Solanaceae // Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований: Сб. ст. I Всерос. науч.-практ. конф. М.: НИИ РРР, 2009. С. 19-22.

2. Ермошин A.A., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Трансгенные растения табака - модель для изучения физиологических эффектов изменения уровня мевалоновой кислоты // Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования: материалы III Всерос. конф. Нижний Тагил: НТГСПА, 2010. С. 313-314.

3. Ермошин A.A., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б. Изменения в генеративной сфере табака, вызванные экспрессией гетерологичного гена hmgl // Биология будущего - традиции и инновации: материалы Всерос. (с междунар. участ.) конф. молодых ученых. Екатеринбург: АМБ, 2010. С. 49-51.

4. Ермошин A.A., Малева М.Г., Чукина Н.В., Алексеева В.В., Киселева И.С., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Реакции трансгенных растений табака с геном hmgl на биотический и абиотический стрессы // Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений: Сб. ст. Всерос. симп. с междунар. участием. Саратов: Саратовский источник, 2010. С. 30-32.

5. Ermoshin A.A., Alekseeva V.V., Rukavtsova Е.В., Maleva M.G., Kiselyova I.S., Buryanov Ya.I. Tolerance to oxidative stress in transgenic tobacco plants with expression of heterologous hmgl gene // Acta Biochimica PoIónica. 2010. V. 57. Sup. 3. P. 13.

6. Ермошин A.A., Синенко O.C., Алексеева B.B., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Влияние экспрессии гена hmgl на физиолого-биохимические характеристики

трансгенных растений // Труды Томского университета. 2010. Т. 275. С. 346-348.

22

7. Ермошип А.А., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Воздействие гетерологичного гена hmgl на генеративную сферу трансгенных линий табака // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всерос. (с междунар. участием) конгр. Воронеж: ВГУ, 2011. Т. 1.С. 200-202.

8. Ермошин А.А., Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Киселёва И.С., Бурьянов Я.И. Экспрессия гетерологичного гена hmgl влияет на физиолого-биохимические характеристики и устойчивость к патогенам трансгенных растений // Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий: материалы VII съезда ОФР. Нижний Новгород: ННГУ, 2011. С. 39-40.

9. Ermoshin А.А., Alekseeva V.V., Rukavtsova Е.В., Zimnitskaya S.A., Kiselyova I.S., Buryanov Ya.I. Suppression of isoprenoid synthesis affects the generative function of transgenic plants // Acta Biochimica Polonica. 2011. V. 58. Sup. 4. P. 89.

10. Алексеева B.B., Ермошип A.A., Рукавцова Е.Б., Синенко О.С., Бурьянов Я.И. Модификация синтеза изопреноидов для повышения стресстолерантности у трансгенных растений табака // Биология - наука 21 века: материалы Междунар. конф. М.: РЭУ, 2012. С. 24-26.

11. Ермошин А.А. Развитие женского гаметофита у трансгенных растений с экспрессией гетерологичного гена hmgl // Биология будущего - традиции и новации: материалы 2 Всерос. конф. Екатеринбург: УрФУ, 2012. С. 199-202.

12. Ермошип А.А., Борцова С.А., Санаева Ю.В. Влияние инсерции гена hmgl на рост трансгенных растений табака // Современная микробиология и биотехнология глазами молодых исследователей: материалы Всерос. конф. Томск: ТГУ, 2014. С. 1720.

13. Ермошин А.А., Санаева Ю.В., Борцова С.А., Киселёва И.С. Ген hmgl влияет на накопление липидов в листьях растений табака // Трансгенные растения: технология создания, биологические свойства, применение: материалы V Всерос. симпозиума, Москва: ИФР РАН, 2014. С. 94-97.

Подписано к печати 03.03.2015г. Брошюра А5. Печать на ризографе, бумага офсетная, Тираж 110 шт. Заказ № 75 ООО «Копи Мастер» 620014 г. Екатеринбург, Шейнкмана, д.57 тел/факс 379-50-28, e-mail: copymaster@list.ru