Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений

Кулуев, Булат Разяпович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений"

На правах рукописи

КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РАЗМЕРОВ ОРГАНОВ У РАСТЕНИЙ

03.01.03 - молекулярная биология

28 ОКТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уфа - 2015 00556Д097

005564097

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный консультант

Официальные оппоненты

Константинов Юрий Михайлович доктор биологических наук, профессор

Голденкова-Павлова

Ирина Васильевна

доктор биологических наук, доцент

Веселов Дмитрий Станиславович доктор биологических наук

Ведущая организация

Чемерис Алексей Викторович доктор биологических наук, профессор

Заведующий лабораторией генетической инженерии растений ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

Руководитель группы функциональной геномики ФГБУН Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Заместитель директора по научной работе ФГБУН Уфимского института биологии Российской академии наук ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится 16 декабря 2015 г. часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН и в Научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71).

С авторефератом - на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан " " октября 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 002.133.01 доктор биологических наук, доцент

Гульназ Фаритовна Корытина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем науки о растениях является интенсификация растениеводства с целью увеличения продуктивности растений для удовлетворения растущих продовольственных потребностей, что невозможно без знаний молекулярных механизмов роста растений, особенно учитывая постоянно изменяющиеся условия произрастания, в которых находятся растения в связи с их прикрепленностью к месту обитания. Одним из наиболее важных ростовых параметров являются размеры органов, которые регулируются множеством внутренних и внешних факторов как биотической, так и абиотической природы. В целом размеры органов растений находятся под контролем двух основных механизмов, а именно регуляции клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой, пролиферативной фазы развития любого органа клетки митотически делятся, и увеличивается их количество. Затем клетки начинают постепенно увеличиваться в размерах за счет растяжения и дифференцируются. В рамках этих двух основных механизмов, конечные размеры органов зависят от ряда отдельных генетически регулируемых процессов, например, исходного числа стволовых клеток в апикальных меристемах; количества клеток, рекрутированных в зачатки органов, а также скорости и продолжительности их деления; роста клеток растяжением; деления меристемоидных клеток в растущих органах; уровня полиплоидизации и некоторых других (Gonzalez et al., 2012). Главными регуляторами поддержания стволовых клеток в центре апикальной меристемы побега и перехода клеток к стадии дифференциации являются пептид CLAVATA3 и транскрипционный фактор WUSCHEL (Dodsworth, 2009). Клеточная пролиферация в зачатках надземных органов контролируется транскрипционным фактором A INTEGUMENT A (Mizukami, Fischer, 2000). Из литературных данных следует, что системы регуляции клеточного деления и роста клеток растяжением взаимосвязаны между собой (Mizukami, Fischer, 2000; Feng et al., 2011), причем важная роль при координации этих процессов может принадлежать белкам с OSR-доменом (Qin et al., 2014), в то же время молекулярные механизмы таких взаимодействий остаются во многом неизученными. Молодые органы растут в основном за счет увеличения размеров клеток, причем важную роль при росте клеток растяжением выполняют неферментативные белки экспансины (Шарова, 2007) и ксилоглюканэндотрансгликозилазы/гидролазы, а также относящиеся к этой же группе ферментов так называемые эндоксилоглюкантрансферазы (Miedes et al., 2011).

Рост растений контролируется большим количеством генов, поэтому может быть изучен на должном уровне лишь при помощи большого количества современных методов физико-химической биологии и средств биоинформатики. Однако для полноценного биоинформационного анализа и компьютерного моделирования так называемого «виртуального растения» (Holtorf et al., 2002), на данном этапе развития науки совершенно не хватает данных об особенностях

взаимодействия сигнальных молекул, систем трансдукции внутриклеточного сигнала, транскрипционных факторов и белков, обеспечивающих клеточное деление и растяжение при регуляции роста и развития растений. К настоящему времени секвенированы геномы большого количества растений, но на фоне этих блестящих достижений ясно обозначился разрыв между формальными знаниями первичной структуры геномов и отсутствием какой-либо информации о функциях большинства генов. Данная работа направлена, в том числе, на преодоление этого барьера и соответствует идеологии постгеномных исследований в растительной биологии.

Большинство исследований по функциональной геномике растений ведутся на модельном растении Arabidopsis thaliana, которое не представляет хозяйственной ценности. В связи с этим, является актуальным проведение аналогичных исследований на других видах растений, которые представляют интерес для сельского или лесного хозяйств. Одним из таких модельных растений является табак, который характеризуется простотой обращения в культуре in vitro и поэтому может быть использован для получения большого количества линий трансгенных растений с увеличенной или сниженной экспрессией исследуемых генов. Из древесных растений к модельным растениям можно отнести осину, которая относительно легко трансформируется агробактериями и не требовательна к составу среды для регенерации. Более того, геном одного из видов тополей Populus trichocarpa был полностью секвенирован и поэтому осина может быть успешно использована для исследований в области функциональной геномики древесных растений. Важной для России сельскохозяйственной культурой, для которой разработаны относительно легковоспроизводимые методы генетической трансформации, является рапс. Генетическая близость этой культуры с модельным объектом A. thaliana позволяет использовать гены последнего для создания трансгенных растений рапса с хозяйственно-ценными признаками.

Одним из перспективных способов увеличения продуктивности сельскохозяйственных культур являются генно-инженерные манипуляции, направленные на изменение уровня экспрессии генов, участвующих в регуляции роста и развития растений. Путем изменения уровня экспрессии различных генов могут быть получены генно-модифицированные растения с увеличенными и уменьшенными размерами органов. Такие растения могут быть востребованы в сельском и лесном хозяйствах, а также в декоративном растениеводстве. Однако при проведении работ по получению трансгенных растений, исследователи постоянно сталкиваются с различными проблемами, одной из наиболее острых при этом, является компенсаторный механизм, направленный на поддержание скорости роста и размеров органов, близких к физиологической норме (Mizukami, Fischer, 2000; Ни et al., 2003). Один из возможных путей решения данной проблемы лежит в выяснении регуляторных связей между биомолекулами при координации роста и развития растений и использовании полученных знаний при генетической модификации

культурных растений. Другой не менее важной проблемой в генной инженерии растений является низкий уровень экспрессии целевого гена, который довольно часто обуславливается косупрессией генов и проявляется в виде так называемого «молчания» трансгена. Для создания трансгенных растений с конститутивной экспрессией целевых генов в основном применяется 358 промотор, активности которого часто оказывается недостаточно (М^Лага й а1„ 1996). В связи с этим поиск или создание более сильных, чем 358 промотор, растительных промоторов, а также создание генно-инженерных конструкций таких промоторов в сочетании с генами-регуляторами роста растений являются весьма актуальными и, в конечном счете, могут привести к получению трансгенных растений с увеличенными размерами органов. В то же время после агробактериальной трансформации трансгенные побеги с высоким уровнем экспрессии целевых генов, возможно, не выживают или даже не образуются из-за негативного влияния белковых продуктов трансгенов на начальных стадиях развития растения. Одним из путей решения данной проблемы может стать использование при создании трансгенных растений тканеспецифичных или индуцибельных промоторов вместо конститутивных.

Цель исследования: выяснение молекулярных механизмов регуляции транскрипции и взаимодействия генов А1ЫТЕО11МЕЫТА, ОЗИ, экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз, а также создание трансгенных растений с измененными размерами органов.

Задачи исследования:

1. Клонировать конститутивные промоторы каулимовирусов и создать на их основе генно-инженерные конструкции, пригодные для получения трансгенных растений. Создать гибридные формы промоторов каулимовирусов и отобрать варианты с наибольшей активностью.

2. Провести биоинформационный анализ и определить содержание транскриптов генов-кандидатов, участвующих в регуляции клеточного деления и роста клеток растяжением в различных органах растений в ответ на экзогенную обработку фитогормонами и действие стрессовых факторов.

3. Клонировать гены СЬАУАТАЗ, АШТЕОиМЕЫТА, 057?, экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз из различных растительных объектов и создать на их основе трансгенные растения табака с конститутивной и пониженной экспрессией целевых генов. Получить трансгенные растения табака со специфичной и индуцибельной экспрессией генов 057?.

4. Провести морфофизиологический и молекулярный анализ созданных трансгенных растений и определить вклад каждого из исследуемых генов в регуляцию размеров органов.

5. На основе данных, полученных при исследовании генов СЬАУАТАЗ, АШТЕОиМЕИТА, 057?, экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз, определить молекулярные механизмы взаимодействия клеточного деления и роста клеток

растяжением в процессе роста листьев табака.

6. Установить молекулярные основы компенсаторного механизма, характерного для трансгенных растений с уменьшенным количеством клеток в органах и направленного на поддержание размеров органов близких к норме.

7. Отобрать эффективные генно-инженерные конструкции, способствующие наиболее существенному увеличению размеров органов табака и на их основе создать трансгенные растения рапса.

8. Определить эффективные генно-инженерные конструкции, способствующие наиболее существенному уменьшению размеров органов.

Научная новизна. Клонированы и исследованы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики. Методами ДНК шаффлинга и рекомбинантных ДНК получены гибридные формы промоторов вируса мозаики георгина, вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики в различных комбинациях. Установлено, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем классический 35S промотор. Впервые клонированы гены тополя черного PnARGOS-LIKE, PnANTLl, PnANTL2, PnEXPAl, РпЕХРАЗ, а также гены табака NtANTL, NtEXPAl, NtEXPAS и NtEXGT. Впервые получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией генов CLAVATA3, PnARGOS-LIKE, PnANTLl, PnANTL2, PnEXPAl, РпЕХРАЗ, NtANTL, NtEXPAl, NtEXPAS и NtEXGT. Получены трансгенные растения табака с пониженным уровнем экспрессии генов NtANTL, NtEXPA4 и ARGOS, а также трансгенные растения табака со цветокспецифичной и индуцибельной экспрессией 05Л-генов. Показано, что сверхэкспрессия гена CLAVATA3 в трансгенных растениях табака способствует уменьшению числа недифференцированных клеток, рекрутированных в зачатки органов, что приводит к увеличению размеров отдельных клеток в листьях и стеблях и способствует более быстрому старению клеток, при этом в молодых листьях по сравнению с контролем компенсаторно увеличивается концентрация цитокининов и содержание мРНК экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз. Получены данные, свидетельствующие об участии транскрипционных факторов семейства АР2 не только в регуляции клеточного деления, но и роста клеток растяжением. Впервые показано, что экспрессия транскрипционного фактора A INTEGUMENT А может регулироваться не только ауксинами, но также цитокининами и брассиностероидами. Конститутивная экспрессия гомологов гена AINTEGUMENTA, а также 05Л-генов способствует повышению уровня содержания мРНК ряда экспансинов табака, что отражается в увеличении размеров отдельных клеток в органах растений. Индуцибельная экспрессия гена AtARGOS в цветках, главным образом, способствует увеличению содержания мРНК гена NtANTL, в то время как экспрессия гена AtARL приводит к накоплению транскриптов гена NtEXPAl. Сверхэкспрессия генов NtEXPA5 и РпЕХРАЗ способствует, в первую очередь, увеличению размеров стебля, а трансгены

ШЕХРА1, А1ЕХРА10 и РпЕХРА1 оказывают большее влияние на рост листьев. Гены экспансинов МЕХРА!, ШЕХРА4 и Ы1ЕХРА5 являются листоспецифичными, а ген ШЕХРАб специфичным для недифференцированных клеток. Экспансиям №ЕХРА1 и №ЕХРА6 необходимы на стадии инициации клеточного растяжения в верхних молодых листьях, а в нижних листьях их экспрессия полностью прекращается и экзогенными фитогормонами не индуцируется. Экспансины №ЕХРА4 и №ЕХРА5 необходимы на всех стадиях клеточного растяжения, причем они остаются доступными для стимуляции экспрессии экзогенными фитогормонами, по крайней мере, до 8-го от верхушки побега листа.

Практическая значимость. Генно-инженерные конструкции на основе бинарных векторов с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии различных целевых генов. Знания о взаимодействии генов-регуляторов роста между собой и с фитогормонами будут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-ценных растений с увеличенными и уменьшенными размерами органов. Клонированные нами гены в сочетании с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для увеличения размеров листьев, стебля, цветков, плодов и семян у хозяйственно-ценных растений. В рамках проведенной работы были определены некоторые молекулярные механизмы взаимодействия процессов клеточного деления и роста клеток растяжением. Эти знания в совокупности с многочисленными литературными данными в будущем позволят более эффективно разрабатывать методы управления процессами роста растений и станут одним из первых шагов по конструированию так называемых «вирту&чьных растений» (НоНогГ е1 а1., 2002) с заранее заданными свойствами. Полученные нами трансгенные растения табака, рапса и осины могут быть использованы для создания коммерческих сортов и пород, которые будут иметь спрос в сельском и лесном хозяйствах.

Результаты исследования могут быть использованы в генной инженерии, биотехнологии, селекции растений, а также при разработке перечня рекомендаций для сельского хозяйства, включающего технологию использования регуляторов роста и основы инновационной методики возделывания различных культур, направленную на повышение их продуктивности и стрессоустойчивости.

Разработанные и модифицированные в ходе работы методы и подходы используются на практических и лабораторных занятиях по предметам «Основы биотехнологии», «Основы генной инженерии» и «Методы молекулярной биологии» при обучении студентов Башкирского государственного университета. Полученные теоретические сведения используются при чтении курсов лекций по предметам «Молекулярная биология растений» в Башкирском государственном университете и «Молекулярная вирусология» в Башкирском государственном медицинском университете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем классический 35Б промотор и при совместном использовании с генами, участвующими в регуляции роста, способствует более существенному влиянию последних на размеры органов в трансгенных растениях.

2. Компенсаторный рост клеток растяжением при уменьшении их количества в растущих органах контролируется цитокининами через стимуляцию экспрессии экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз.

3. Транскрипционный фактор АШТЕСиМЕОТА контролирует размеры органов, влияя не только на клеточное деление, но и на рост клеток растяжением, причем его экспрессия регулируется не только ауксинами, а также цитокининами и

брассиностероидами.

4. Экспрессия 057?-гена ЛКСОЗ-ЫКЕ тополя контролируется ауксинами, а его белковый продукт участвует в регуляции роста клеток растяжением и конечных размеров органов.

5. Сигналы от фитогормонов к генам экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз частично идут через продукты 05/?-гсноп, где происходит трансдукция сигнала и его передача к транскрипционному фактору АШТЕОиМЕЫТА.

6. Гены РпАЫТЫ, АсАКООЯ-иКЕ, РпАЯвОЗ-ЫКЕ, ШЕХРА1, ШЕХРА5, РпЕХРА 1 и РпЕХРАЗ участвуют в регуляции размеров органов через стимуляцию роста клеток растяжением.

7. Гены ШШЬ, ВпаХ.АЫТ.Ъ, РпАМП и А/АЯООЗ контролируют размеры органов не только через влияние на клеточные деления, а также за счет стимуляции роста клеток растяжением.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2006); Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); школе-семинаре молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007); 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008); Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем», посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы (Уфа, 2009); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); I Всероссийской Интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010); 15-й Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); УИ-м Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений -

фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); Третьем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); И Всероссийской школе-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Урапьского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011); VI Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2011); IV Всероссийском симпозиуме «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, биобезопасность» (Москва, 2012); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012); Всероссийской научной конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013); X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны программой «У.М.Н.И.К.» (2008-2010 гг.), грантом Республики Башкортостан молодым ученым и молодежным научным коллективам (2009 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» направления 1.3.1. (2009-2011 гг.) и грантом РФФИ мол-а (2011-2012 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, в том числе в журналах из Перечня ВАК РФ - 20. В международной базе данных GenBank депонированы 4 нуклеотидные последовательности.

Структура и объем диссертанни. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 486 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 141 рисунками. Список литературы содержит 428 источников, из них 386 зарубежных.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.б.н. проф. Чемерису A.B. и сотрудникам лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. A.B. Князеву и Ю.М. Никонорову.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований в данной работе служили, во-первых, промоторы двух представителей каулимовирусов: вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики. Растения георгина (Dahlia pinnata), инфицированные вирусом мозаики георгина, были найдены в Уфе и Нуримановском районе Республики Башкортостан. Листья растений, инфицированные вирусом кольцевой гравировки гвоздики, были получены из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г. Брауншвейг, Германия). В качестве целевых были

выбраны гены CLAVATA3, OSR, AINTEGUMENTA, а также гены, кодирующие экспансины и эндоксилоглюкантрансферазу NtEXGT. Для клонирования целевых генов использовались растения Arabidopsis thaliana L. экотип Columbia 0 (гены CLAVATA3, AtARGOS, AtARL, AtEXPAlO), Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SRI (гены NtANTL, NtEXPAl, NtEXPAS, NtEXGT), Brassica napus L. сорта Hanna (ген BnaX.ANT.b), выращенные в условиях искусственного освещения. Для клонирования генов тополя черного PnARGOS-LIKE, PnANTLl, PnANTL2, PnEXPAl и РпЕХРАЗ использовались листья растущих в условиях города Populus nigra L.

В работе использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной растительной ДНК проводили методом фенольно-хлороформной экстракции (Graham, 1978) или методом солевой экстракции (Aljanabi, Martinez, 1997). Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в плазмидных векторах, расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). ПЦР проводили на ДНК-термоциклерах Терцик МС-2 (ДНК-Технология, Россия), Т1 с модулем Combi (Biometra, Германия) с использованием ДНК-полимераз Hi-Fi (Кара biosystems, США), Pfu (Биоскрин, Россия), Q5, LongAmp (NEB, США), Taq (Биоскрин; Хеликон; Силекс; Россия), LR (Силекс, Россия) и других. Праймеры были подобраны при помощи программы PrimerSelect (DNAStar, США) и были синтезированы в ООО "Биоскрин" (Уфа) или в ЗАО "Синтол" (Москва). Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных генов растений и промоторов каулимовирусов проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems" (США). Промоторы каулимовирусов в одноцепочечной форме были получены с помощью ДНК полимеразы фага phi 29. ДНК шаффлинг проводили по (Stemmer, 1994b) с модификациями (Zhao, Arnold, 1997) и (Kikuchi et al., 2000). Электрокомпетентные клетки Agrobacterium tamefaciens готовили по методу Lin (1995). Электропорацию компетентных клеток проводили при помощи электропоратора фирмы "Bio-Rad" модели Micropulser. Протопласты табака трансформировали методом опосредованного полиэтиленгликолем (ПЭГ 4000) эндоцитоза плазмидной ДНК, затем проводили анализ транзиентной экспрессии репортерных генов GUS и GFP. Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с модификациями (Зверева, Романов, 2000). Трансгенные растения табака N. tabacum сорта Petit Havana линии SRI получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков, высеченных из листьев трехмесячных растений (Horsch et al., 1985). Трансгенные растения рапса получали методом погружения цветков (floral dip) (Clough, Bent, 1998). Трансгенные растения осины получали при помощи

Argobaclerium rhizogenes с использованием игольчатых кристаллов карбида кремния. Растения трансгенных линий табака проращивали на селективной среде MC в течение 20-ти дней, затем акклиматизировали их к условиям почвы и культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом "Тетта vita" в условиях световой комнаты при температуре 25-27°С с освещенностью около 140 ммоль на кв. м в сек и фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота). В качестве контрольных использовали нетрансгенные растения табака сорта Petit Havana линии SRI, выращенные на среде MC без добавления антибиотиков и акклиматизированные к условиям почвы. Также для контроля использовали трансгенные растения, содержащие Т-ДНК бинарных векторов pCambia 1301 и pCambia 2301 без целевого гена. Морфологический анализ проводили на растениях второго поколения (Ti), размер выборки для каждой линии составлял 5 растений.

Для экзогенной обработки фитогормонами растения дикого типа проращивали до стадии 12-ти листьев, при этом для лучшей смачиваемости в раствор для опрыскивания добавляли сильвет до 0,1%. Нумерацию листьев осуществляли, начиная от верхушки побега, то есть лист №1 в побеге был наиболее молодым. Тотальную РНК из листьев и цветков исследуемых растений выделяли с тризолом и использовали ее для построения первой цепи кДНК. Количественное определение содержания мРНК (после конверсии в кДНК) целевых генов проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I на термоциклере Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, Австралия). Расчеты производились по методу (Livak,

Schmittgen, 2001), используя в качестве стандартов мРНК тубулина или фактора элонгации EF-la в случае с табаком и мРНК актина в случае с осиной и рапсом. Количественную оценку свободных форм фитогормонов в одних и тех листьях проводили методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител против зеатин рибозида, ИУК и АБК и антикроличьих антител, меченых пероксидазой (Shakirova et al., 2004). Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Для оценки морфометрических различий между выборками контрольной и опытной групп растений, а также разницы в уровнях транскрипции между разными частями растения или в ответ на внешнее воздействие использовали U-критерий Манна - Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Новые промоторы каулнмовнрусов и конструирование их гибридных форм методами ДНК шаффлинга и рекомбинантых ДНК

Для исследования молекулярных механизмов регуляции размеров органов у растений, нами планировалось создание большого количества трансгенных растений с измененным уровнем экспрессии различных целевых генов. При создании

трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена. В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al., 1985), при этом существует необходимость увеличения его активности (Mitsuhara et al., 1996). Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особый интерес создание гибридных форм промоторов методом ДНК шаффлинга (Stemmer, 1994; Remans et al., 2005). Из большого разнообразия каулимовирусов для проведения дальнейшего анализа и отбора промоторов для ДНК шаффлинга с 35S промотором, нами были взяты вирус кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ) и вирус мозаики георгина (ВМГ), поскольку эти вирусы оказались филогенетически близки к ВМЦК, а их промоторы были неисследованными. Далее нами были амплифицированы промоторные участки ВМГ размером 442 пн и ВКГГ размерами 501 и 370 пн, которые были клонированы в векторе pKRX. Промоторы ВМЦК (510 пн), ВКГГ (501 пн) и ВМГ (442 пн) вырезали из вектора pKRX и после этапа самолигирования (<оакольцовывание») проводили наработку одноцепочечньтх последовательностей при помощи ДНК-полимеразы фага phi29. Одноцепочечные формы промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ были использованы в качестве исходного материала при проведении ДНК шаффлинга. Для удобства промоторы в одноцепочечной форме были обозначены нами в соответствии с названием вируса и праймера, с которого данную цепь ДНК нарабатывали (форвард - F, реверс - R): 35SF, 35SR, BKrrF, ВКГГО, BMrF, BMrR. Для проведения ДНК шаффлинга, использовали все 6 комбинаций разных цепей ДНК этих промоторов: 35SF+BKrrR (смесь 1), BKrrF+35SR (смесь 2), 35SF+BMrR (смесь 3), BMrF+35SR (смесь 4), BKrrF+BMrR (смесь 5), BMrF+BKrrR (смесь 6).

В соответствии с данными по гомологии промоторов каулимовирусов, были смешаны разные цепи ДНК промоторов ВМЦК и ВКГГ, обработаны ДНКазой I, при этом были получены фрагменты ДНК размерами около 50 - 300 пн. Далее был проведен первый раунд амплификации без добавления праймеров, при котором происходит постепенное увеличение размеров восстанавливаемых фрагментов и образование их пула. Затем был проведен 2-й раунд амплификации с использованием специально подобранных праймеров, фланкирующих исходные промоторы. В результате при смешивании плюс-цепи промотора ВМЦК с минус-цепью промотора ВКГГ (1 смесь) и двух раундов ПЦР, получили ампликон размером больше 500 пн. Благодаря тому, что при втором раунде ПЦР использовали форвард праймер промотора ВМЦК и реверс праймер промотора ВКГГ, в качестве конечных продуктов реакции нарабатывались лишь гибридные молекулы ДНК. При смешивании плюс-цепи промотора ВКГГ и минус-цепи промотора ВМЦК (смесь 2) получили однородный ампликон размером около 500 пн. Полученные ампликоны были

клонированы в векторе pKRX, далее был проведен ПЦР-анализ полученных клонов, при этом были получены ампликоны различного размера, все они были приблизительно равны или больше по размеру, чем промоторы ВМЦК и ВКГГ. В целом в ходе работы было получено 30 клонов, промоторы которых были секвенированы и оказались гибридными, при этом были использованы все возможные комбинации промоторов каулимовирусов (смеси 1 - 6). Конструкции вектора pCambia 1304 с промоторами ВКГГ (501 и 370 пн) и ВМГ (442 пн) были использованы для трансформации протопластов табака и анализа транзиентной экспрессии репортерных генов GUS и GFP в растительных клетках. С помощью данного метода было показано, что клонированные нами промоторные последовательности ВМГ и ВКГГ являются достаточными для проявления транзиентной экспрессии генов GUS и GFP в растительных клетках (рис. ! а-г).

Рис. 1. Анализ активности промоторов ВМГ и ВКГГ в протопластах, каллусах и трансгенных растениях табака: а, в - транзиентная экспрессия генов GFP и GUS под контролем промотора ВМГ в протопластах табака; б, г - транзиентная экспрессия генов GFP и GUS под контролем промотора ВКГГ размером 501 пн в протопластах табака; д - активность промотора ВМГ в каллусах табака; е, ж - активность промотора ВМГ в листьях и корнях трансгенных растений табака.

Генно-инженерные конструкции, использованные при трансформации протопластов, были применены также для получения трансгенных растений табака. Было показано, что анализируемые промоторы проявляют свою активность в листьях, стебле и корнях табака (рис. le, ж). В ходе работы пять вариантов гибридных промоторов каулимовирусов также были получены, используя методы рекомбинантных ДНК. Методом ДНК шаффлинга нами были получены гибридные формы промоторов каулимовирусов гвоздики и георгина, как между собой, так и с 35S промотором в различных комбинациях, 6 из которых были отобраны для проведения дальнейших анализов. Из гибридных конструкций между промоторами каулимовирусов цветной капусты и гвоздики было отобрано три варианта: 4', 71 и 141; между промоторами каулимовирусов цветной капусты и георгина - 2 варианта: 94 и II4; между промоторами каулимовирусов гвоздики и георгина - 1 вариант: 19б (во

всех вариантах цифра означает номер клона полученного при генно-инженерных манипуляциях, а надстрочный индекс означает номер смеси промоторов, см. стр. 12). После проведения агробактериальной трансформации листовых дисков табака, трансгенные растения отбирали для проведения качественного гистохимического анализа активности репортерного гена GUS. По результатам проведенных анализов было показано, что для полученных нами гибридных и модифицированных форм промоторов каулимовирусов, как и для 35S промотора характерны конститутивность и отсутствие тканеспецифичности. По 6 растений с каждого варианта использовали для выяснения и сравнения активности промоторов флюориметрическим методом. Количественный анализ показал активность для 35S промотора в среднем 26,2±2,8 нмоль 4Ми/(мин мг белка), а для промотора ВМГ в среднем 45,1±10,2 нмоль 4MU/(mhh мг белка). Из рис. 2 видно, что наиболее "сильным" из полученных нами гибридных и модифицированных форм промоторов каулимовирусов является промотор размером 739 пн, а наиболее "слабыми" оказались гибридные промоторы размером 429 и 726 пн. В целом, наибольшая активность в трансгенных растениях табака была характерна для немодифицированного промотора ВМГ, который оказался в среднем в 1,7 раза "сильнее" 35 S промотора. При дальнейшей работе промотор ВМГ планировалось использовать для создания трансгенных растений с измененными размерами органов, тогда как для части фундаментальных исследований планировалось применять и классический 35S промотор.

Рис. 2. Активность природных и гибридных промоторов каулимовирусов по сравнению с 35S промотором в трансгенных растениях табака. 35S ВМЦК, 442 ВМГ, 501 ВКГГ, 371 ВКГГ - природные формы промоторов каулимовирусов. 4, 7, 14 ВМЦК/ВКГГ - гибридные промоторы, полученные методом ДНК шаффлинга из смеси 1 (ВМЦК+ВКГГ). 9, 11 ВМГ/ВМЦК - гибридные промоторы, полученные методом ДНК шаффлинга из смеси 4 (ВМГ+ВМЦК). 19 ВМГ/ВКГГ - гибридный промотор, полученный методом ДНК шаффлинга из смеси 6 (ВМГ+ВКГГ). 429, 514, 700, 726, 739 - гибридные промоторы каулимовирусов, полученные методами рекомбинантных ДНК.

Роль генов, контролирующих клеточную пролиферацию в апикальной

меристеме побега и зачатках органов, в регуляции размеров листьев, стебля н цветков

Для создания трансгенных растений с уменьшенным числом стволовых клеток в апикальной меристеме побега нами была проведена трансформация табака генно-инженерной конструкцией, содержащей ген CL.4VAT.43 А. ЛаИапа (а УЗ) под контролем 358 промотора. В результате проведенной работы были получены 12 линий трансгенных растений, из которых три типичные линии под номерами 14, 18 и 20 были использованы для морфологического и молекулярного анализов. При выращивании на почве поколения Т/ трансгенных 35Б::СЕУЗ растений табака, для всех трех линий были выявлены три различных фенотипа (независимо от линии). Они нами были обозначены как фенотип 1, фенотип 2 и фенотип 3 (рис. За). Листья у растений фенотипа 1 были бледные и искривленные (рис. Зд). Проводящая система листьев у этих растений была недоразвитой, размеры клеток нижнего и верхнего эпидермиса листьев увеличены в 5 раз по сравнению с контролем (рис. Зж). Для всех трех фенотипов был характерен высокий уровень содержания транскриптов гена СХКЗ, что могло способствовать проявлению фенотипов 1 и 2. В то же время трансгенные растения с фенотипом 3, несмотря на относительно высокий уровень экспрессии гена СЬ УЗ, по ростовым параметрам приближались к контрольным растениям, видимо за счет функционирования компенсаторных механизмов. С целью раскрытия возможных молекулярных основ этого компенсаторного механизма, при наших дальнейших исследованиях были использованы в основном трансгенные растения табака относящиеся к фенотипу 3. Линейные размеры и площадь листьев у опытных трансгенных растений фенотипа 3 и контрольных растений в период цветения достоверно не различались. В то же время у части анализируемых растений, в отличие от контроля, наблюдались измененные цветки (рис. 36, в, г), что выражалось в асимметричности венчика, в наличии больших разрывов в венчике и чашечке, слиянии тычинок с лепестками и их недоразвитии. Несмотря на одинаковые размеры листьев у исследуемых растений, размеры клеток у опытных растений всегда были заметно больше, чем у контрольных форм. У опытных растений линии №14 размеры клеток по сравнению с контрольной группой были увеличены в среднем на 38%. Еще более значительным оказалось увеличение размеров клеток эпидермиса листьев у растений линий №18 и составило в среднем 64% по сравнению с контролем. Выявленные различия в размерах клеток эпидермиса сохранялись и при измерении площади клеток мезофилла листьев (рис. Зк, л). Продольный срез верхушки побега трансгенных растений фенотипа 3 показал уменьшение объёма апикальной меристемы у трансгенных растений и в целом, уменьшение количества клеток в

верхушке побега и зачатках листьев (рис. Зз, и). Но при этом клетки оказались увеличены в размерах, поэтому в целом размеры самих растений относящихся к фенотипу 3 достоверно не отличались от контроля.

Рис. 3. Трансгенные растения табака поколения Г/, сверхэкспрессирующие

ген СЬУЗ А. ЛаИапа: а -трехмесячные трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией гена СЬУЗ, относящиеся к трем разным фенотипам; б - цветки контрольных растений; в, г - цветки трансгенных растений линии №18; д -сравнение листьев

контрольного (слева) и трансгенного (справа)

растения

фенотипа

нижнего

листьев

растений;

нижнего

листьев

растений

линии

е - клетки эпидермиса контрольных ж - клетки эпидермиса трансгенных линии №18, фенотипа 1; з — продольный срез верхушки побега контрольного растения; и -г продольный срез верхушки побега трансгенного

растения линии №18, фенотипа 3; к - поперечный срез листа контрольного растения; л - поперечный срез листа трансгенного растения линии №18, фенотипа 3.

Фенотип 1

Было обнаружено, что трансгенные растения всех трех линий фенотипа 3 отличаются более высоким содержанием цитокининов в сравнении с контрольными растениями линии №5 (рис. 4). Например, если концентрация цитокининов в листьях №5 контрольных растений в среднем составляла 7 нг/г сырой массы, то в опытных растениях их содержание в среднем составляло около 32 нг/г сырой массы. При этом

по содержанию ИУК и АБК контрольные и опытные растения достоверно не различались (рис. 4).

« S зо 3 «

s *

II »

s- 5

п "

<31 10

§ g с Я

о L 100

Контроль 35S:;CLY3

Контроль 35S::CLV3

Контроль 3SS::CLV3

Рис. 4. Сравнительный анализ содержания фитогормонов в листе №5 двухмесячных контрольных (содержащих Т-ДНК вектора pCambia 1301 без целевого гена) и трансгенных по гену CLV3 растений табака (35S::CLV3). Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (п=5; * - р < 0,01 ).

В трансгенных растениях табака наблюдалось уменьшение содержания транскриптов гена транскрипционного фактора NtANTL, как в верхушке побега (в 1,4 раза), так и в листьях №¡3 (в 2,7 раза) (рис. 5а, г), что соотносится с данными о снижении количества клеток в листьях опытных растений. В то же время в верхушках побега опытных растений наблюдалось повышение уровня содержания транскриптов гена экспансина NŒXPA4 (рис. 56), что возможно, является отражением функционирования компенсаторных механизмов, направленных на поддержание размеров органов в пределах нормы в условиях уменьшения количества клеток, приходящихся на один орган. В то же время в молодых листьях №3 опытных растений наблюдается небольшое снижение уровня экспрессии гена N1EXPA4 (рис. 5д), что можно связать с более ранним старением органов у опытных растений по сравнению с контролем. Уровень содержания транскриптов гена эндоксилоглюкантрансферазы NtEXGT в анализируемых растениях менялся в меньшей степени, однако, как и в случае с геном NŒXPA4, в верхушках побега наблюдалось увеличение его уровня экспрессии (рис. 5в), а в листьях №3, наоборот его снижение (рис. 5е). Чтобы подтвердить наши предположения о более быстром старении клеток в органах у 35S::CLV3 растений по сравнению с контролем, нами был проведен анализ содержания в них 18S рРНК. Было показано, что если в верхушках побега опытных растений наблюдается лишь незначительное снижение содержания 18S рРНК, то уже в листе №3 его уровень экспрессии снижается в 4,8 раза по сравнению с контролем.

№4А71

шхатп

_г_

Контроль J5S.Cl.Y3

шлта

Контроль Ш::С/.1'3

ШХРА4

,Д

I е

Контроль ЗХг.СШ

МЕХвТ

I па

Контроль ЗЖ:С№ Контроль ЗК-аУЗ Контроль ЗЗЯгСШ

Рис. 5. Анализ содержания транскриптов генов ШАИП, МЕХРА4 и МЕХвТ в трансгенных растениях табака, сверхэкспрессирующих ген С1К5, по сравнению с контрольными растениями, содержащими Т-ДНК бинарного вектора рСатЫа 1301: а, б, в - верхушки побега; г, д, е - молодые листья №3. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (п=5; * - р < 0,05).

Учитывая значительное повышение содержания цитокининов в трансгенных растениях 358::СЬУЗ (рис. 4), мы предположили, что именно этот фитогормон может участвовать в регуляции компенсаторного увеличения размеров клеток путем стимуляции экспрессии белков, обеспечивающих рост клеток растяжением. Так как в трансгенных растениях увеличивалось содержание транскриптов генов МсЕХСТ и ЪНЕХРА4, то, в первую очередь, можно предполагать, что именно эти гены могут оказаться мишенями цитокининов. Для проверки данной гипотезы мы провели экзогенную обработку растений табака дикого типа БАП, ИУК, НУК, 24-эпибрассинолидом (ЭБ) и гибберелловой кислотой (ГКЗ). Далее провели количественную ОТ-ПЦР в листьях №4. Было показано, что под влиянием цитокининов в растениях табака дикого типа наиболее существенное повышение уровня экспрессии по сравнению с контролем было характерно именно для генов ШЕХРА4 и №ЕХОТ.

Исходя из литературных данных (Бос^оПЬ, 2009; 8аЫо\У81а, 2011) следует, что при сверхэкспрессии гена СЬУЗ блокируется цитокининовый сигнал, поэтому необходимо было убедиться, что при экзогенной обработке трансгенных 35Б::СЬУЗ растений табака цитокининами уровень содержания транскриптов генов экспансинов действительно может повышаться. Оказалось, что при экзогенной обработке трансгенных растений БАП уровень экспрессии гена МЕХРА4 повышается как в листьях №2, так и в листьях №3. Это означает, что цитокининовый сигнал, по

"Г:™ еГ° ^ направлена на стиМуляцию роста „

раегяжением в листьях тпансгенныу пч-.гтю клеток

исходя „3 полученных „ Г РаСТС'",Й' Не блокируется. В целом,

полученных нами данных, можно пепяти „,.„

компенсаторный рост клеток в трансген ых 2 -СЬуГ ° ^ "Т°

преимущественно ниток„„„иами,ТоТор Г1Го1Г

белков, обеспечивающих клеточное ра™ие ? ' ^^

Меристематические клетки центральной зоны АМП постепенно пеп зонам, где ф0рмируются зачатки органов> кот : Г «

интенсивных клеточных делений (Оос^оПН 2009 ГГпо 7 СЧеТ

: г-:ж—

органах табака уповень тг,^ проанализированных

аиака уровень содержания транскриптов гена шдгг; я ниже, того уровня котопмй ™ ШЫТЬ был существенно

о—л, ~

„„<,„, л,12„ ™шь ■

экспрессии ге„, 6ыл " '

;=:?——"

что в этих ж Г УР0Ве"Ь КЛеТ0ЧНЫХ делений' ОД»ак°. отметим

(в,аСкт; °Бр:г ~переходят к ~——«

транскриптов гена №АЫТ1. П0КаЗШЮ' ™ В «ветках содержание

1сЛ1:: ~ — В СЛеД-— ^ плодолистики > тычинки >

—был од:~ ;:г;™овень экстои -Данных следовало, что экспрессия ге а ™ °бРа3°М' "

женского гамегофита, как ппеТо ассоциирована не только с развитием

интенсивно ^Г Г ^ ^^ * '"б)' а С —ми,

»—г=

Федполагать, что в регуляции экспрессии гена ШАШ!

ауксины, но и цитокинины „ брассиностероиды. шТт^ ^лТ ^ Т°ЛЬК°

исследования по анализу уровня транскрипции гена ШМП Т^Г^Г экзогенной обработке фитогормонами. Было показано, что в этих мстьях содёржание

транскриптов исследуемого гена резко снижается и не увеличивается даже при действии экзогенных фитогормонов.

É &

а 4

£ „<

Пп

■ J </ jF <? ¥

Рис. 6. Количественный анализ содержания транскриптов гена NtANTL в различных органах табака и под влиянием экзогенной обработки фитогормонами. Апекс -верхушка побега с листом №1.

Косвенным признаком того, что мишенями транскрипционного фактора NtANTL являются гены циклина MCYCD3.1 и циклин-зависимой протеинкиназы NtCDKBl-1, может служить обнаружение корреляции между уровнями их экспрессии при экзогенной обработке фитогормонами. Поэтому следующим этапом наших исследований стало определение уровня содержания транскриптов генов NtCYCD3;l и NtCDKBl-1 в верхушке побега и листе №2 под влиянием цитокининов, ауксинов, брассиностероидов и гиббереллинов и сравнение полученных данных с профилем экспрессии гена NtANTL. В верхушке побега положительная корреляция с уровнем содержания транскриптов гена NtANTL была показана для обоих генов при использовании БАП. Во втором листе транскрипция гена NtCYCD3;l положительно коррелировала с содержанием мРНК гена NtANTL при обработке БАП, ПУК и ЭБ. Таким образом, по полученным нами данным можно предположить, что, по крайней мере, при нормальных условиях произрастания, между генами NtCYCD3;l, NtCDKBl-1 и NtANTL существуют взаимосвязи, и они могут быть отнесены к коэкспрессирующимся генам. Коэкспрессия генов NtCYCD3;l, NtCDKBl-1 и NtANTL нами была обнаружена также при переходе клеток листьев в недифференцированное состояние в каллусе. Именно в каллусе наблюдался высокий уровень транскрипции как гена NtANTL, так и генов NtCYCD3;l и NtCDKBl-1, по сравнению с листом №5, причем гены NtANTL и NtCDKBl-1 вовсе не экспрессировались в этом листе. Далее представлял большой интерес выяснение связей между двумя OStf-генами ARGOS и ARL с геном NtANTL на примере табака, однако у этого растения гомологи OSR-генов пока не секвенированы. Поэтому для выяснения особенностей регуляции экспрессии

™ооГ: ———е

транскрипционной сисггемъ! XVE Был"" "" Цельной

гена AtARGOS в цветах содеркаш!е м1^НК^ена' ™д^циРовании экспрессии

раз, в то же время продукт ге„а AtARL не о "^шается в среднем в 5

транскрипции гена ШАЫП. Т г заметного влияния на уровень

™ 0Le„Г ™Г в Г РЗЗОМ' "а ПРИМСРе ТабаКЭ "ЗМИ бЫЛ° —'

находятся в системе клеточной сигнализации выше относительно транскрипционного фактора ANT e4™

растений по " 7 ГГГ™ " ^ ^ ^ " статистически достоверным уве ^ ПеРВЬЮ -Ревизовались

контролем (рис 722 " ^^ ™ с

например, У^Т^^Ъ^Г"* ^ ""' листьев контрольные и ol РаЗМбраМ КЛ6ТОК ^'^рмиса

Размерам л„ГеВ ис Г "" Р£ШШЧШШСЬ " -пени, чем по

•фапсг сн ш7тТо Lb ва1 вл Р0Я™ее "" ^Hb,e °буС" ™

—_—- - ~ ~ ;г:г/а рост

количества клеток, приходящихся на одиГорган так и уГ' ""

отдельных клеток. Для снижения vnnnH Увеличение размеров

14 линий трансгенных Г Ге ЭКСПРеССИИ NUNTL ,,ами бь.ли созданы

250 пн, каГ сГ Гвс Т ЭКСПРеССТОИ* -левого гена размером

, как в смысловой так и в антисмысловой ориентация* rw,,.

отличались снижением уров„я экспрессии ^J^TZ^ZI листьев по сравнению с ко.гтпп«, и * уменьшением размеров

—ев было хара j ; ГГГз ^ Г СУЩеСТВеШЮе УМе"Ь™е

Уменьшалась на 23»/„ а пГшГ ^ э™« ™ в Сред„ем

ач-n Hd ZJ/о, а площадь листьев на 39% Спнг 71 п„.

уменьшалась у линий 3 9 10 и 14 „„ Достоверно

™ Р,« с ;u ~ zi™у

— ^ —:г:::

стволовых клеток в центральной зоне апикальной меристемы побега, а из-за уменьшения количества меристематически компетентных клеток в зачатках листьев

(Mizukami, Fischer 2000).

Также нами были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген ANT рапса (BnaX.ANT.b) под контролем 35S промотора и промотора ВМГ. Трансгенные растения характеризовались увеличением длины листьев, размеров цветка, высоты стебля и массы семян, причем степень увеличения была больше в случае использования в качестве регулятора транскрипции промотора ВМГ. Конститутивная экспрессия гена BnaX.ANT.b рапса способствовала пролонгации роста листьев табака, при этом размеры клеток эпидермиса листьев оставались неизменными. Продукт гена BnaX.ANT.b рапса в листьях табака в основном оказывал влияние на клеточное деление, а не на рост клеток растяжением.

Из деревьев полностью секвенирован геном лишь тополя P. trichocarpa, однако, гены ANT-факторов этого растения на момент начала наших исследований, оставались не изученными. В связи с этим, нами был проведен поиск ЛЛТ-подобных генов в геноме тополя и два наиболее близких к AtANT гена, которые были обозначены нами как PnANTLl и PnANTL2. были амплифицированы и клонированы из тотальной ДНК тополя черного (P. nigra). Были получены трансгенные растения табака, конститутивно экспрессирующие гены PnANTLl и PnANTL2. Трансгенные по генам PnANTLl и PnANTLl растения табака по длине листьев через 30 дней после акклиматизации к условиям почвы превосходили контрольные растения в среднем на 20%. Через 45 дней после пересадки в почву было зафиксировано увеличение длины листьев по сравнению с контролем для вариантов с целевым геном PnANTLl на 58% и с геном PnANTL2 на 29% в среднем. В период цветения длина листьев у всех трансгенных растений была больше, чем у контрольных, причем в случае с геном PnANTLl в среднем на 21%, а с геном PnANTL2 на 17%. Трансгенные по гену PnANTLl растения характеризовались существенным увеличением размеров клеток эпидермиса листьев по сравнению с контролем. Было показано, что размеры клеток у опытных растений увеличивались в гораздо большей степени, чем размеры отдельных листьев. Размеры клеток эпидермиса листьев у трансгенных по гену PnANTL2 растений табака также были увеличены, но в меньшей степени, чем у трансгенных по гену PnANTLl. В среднем разница по площади клеток у трансгенных по гену PnANTL2 и контрольных растений составила 18%. В трансгенных по генам PnANTLl и PnANTL2 растениях табака наблюдалось повышение уровня содержания транскриптов гена экспансина NtEXPA4. Эти данные говорят о существовании взаимосвязей между ANT и генами экспансинов, более того, возможно последние являются мишенями данного транскрипционного фактора

Рис. 7. Сравнительный анализ трансгенных растений табака с конститутивной и пониженной экспрессией гена NtANTL. SRI - контрольные растения табака дикого типа. 1301 - контрольные трансгенные растения табака, содержащие Т-ДНК бинарного вектора pCambia 1301 без целевого гена. 35S::NtANTL - трансгенные растения с конститутивной экспрессией исследуемого гена. NtANTLi - трансгенные растения с пониженной экспрессией исследуемого гена.

С целью создания трансгенных растений с уменьшенными размерами органов, нами были клонированы в антисмысловой ориентации по два консервативных участка предполагаемых ортологов гена ANT из A. thaliana, рапса (BnaX.ANT.b), табака (NtANTL) и тополя (PnANTL2). При помощи полученных генно-инженерных конструкций были созданы 38 линий трансгенных растений табака, экспрессирующих антисмысловую РНК первого или второго участка гена ANT. 26 из 38 линий трансгенных растений табака характеризовались достоверным уменьшением

размеров листьев, стеблей и цветков, при этом их форма и симметрия не изменялась. Также трансгенные растения прекращали свой рост раньше контрольных, зацветали позже и отличались уменьшением количества цветков. Было показано, что основной причиной уменьшения органов у трансгенных растений явилось сокращение количества клеток, приходящихся на один орган, при этом размеры отдельных клеток оставались неизменными или иногда компенсаторно увеличивались. Однако следует отметить, что степень уменьшения размеров органов при этом была меньшей, чем при создании трансгенных растений, экспрессирующих участок гена NtANTL

одновременно в смысловой и антисмысловой ориентации (см. стр. 21).

***

Сверхэкспрессия гена CLV3 способствует переходу стволовых клеток организующего центра АМП на стадию интенсивной пролиферации, перемещению их в другие участки центральной зоны АМП, и их последующей дифференцировке. Из-за уменьшения количества стволовых клеток в центральной зоне АМП, уменьшается число меристематически компетентных клеток в периферической зоне АМП, а затем и в зонах верхушки побега, где формируются зачатки органов. Так как клетки в 35S::CLV3 растениях раньше переходят на стадию дифференцировки, они делятся меньшее количество раз, гораздо быстрее теряют меристематическую компетентность и в итоге каждый орган образуется из меньшего количества клеток. На первый взгляд, уменьшение количества клеток могло бы способствовать существенному уменьшению размеров органов, однако, в растениях функционирует компенсаторный механизм, направленный на поддержание размеров органов в пределах нормы. Функционирование этого компенсаторного механизма направлено на увеличение размеров клеток, из которых состоит растущий орган. Известно, что цитокинины, наряду с другими фитогормонами участвуют в регуляции роста клеток растяжением (Роньжина, 2003; Bhargava et al., 2013). Несмотря на то, что при сверхэкспрессии гена CLV3 цитокининовый сигнал, направленный на поддержание стволовых клеток в недифференцированном состоянии, блокируется, эта группа фитогормонов остается способной влиять на экспрессию белков, обеспечивающих рост клеток растяжением, по крайней мере, в растущих листьях. Из наших данных следует, что при сверхэкспрессии гена CLV3, цитокинины повышают уровень экспрессии генов экспансина NtEXPA4 и эндоксилоглюкантрансферазы NtEXGT, тем самым, способствуя увеличению размеров отдельных клеток.

Меристематические клетки после перемещения в зачатки органов интенсивно делятся и начинают постепенно дифференцироваться. Меристематическая компетентность клеток зачатка органов поддерживается определенное время за счет регулирующего влияния транскрипционного фактора ANT. Данный транскрипционный фактор получил такое название из-за того, что у мутантных по его гену растений в семязачатках отсутствовали интегументы. Однако ANT-фактор контролирует не только развитие женского гаметофита, а связан с ростом всех

надземных органов и их зачатков, которые характеризуются высоким уровнем клеточных делений. Экспрессия транскрипционного фактора ANT контролируется цитокининами, ауксинами и брассиностероидами. В зависимости от возраста органа, экспрессия ANT-фактора может регулироваться фитогормонами по-разному. Уже в листьях, расположенных ниже 3-го от верхушки побега, уровень экспрессии ANT-фактора невозможно повысить даже путем экзогенной обработки фитогормонами, что может свидетельствовать в пользу вовлеченности в данном случае эпигенетических механизмов регуляции экспрессии. Сигналы от фитогормонов к исследуемому транскрипционному фактору поступают через OSR-белки, которые гомологичны белку ARGOS. В свою очередь, транскрипционный фактор ANT контролирует клеточные деления в зачатках органов совместно с циклинами и циклин-зависимыми протеинкиназами. В то же время, ANT-фактор может регулировать и рост клеток растяжением через влияние на уровень экспрессии экспансинов. Таким образом, ANT - это один из ключевых транскрипционных факторов, связанных с регуляцией размеров органов в целом, так как он контролирует не только клеточные деления, но и рост клеток растяжением.

Роль 05Д-генов в регуляции размеров органов растений

Важную роль в координации процессов клеточного деления и растяжения, выполняют белки с OSR-доменом (Feng et al., 2011). У A. thaliana обнаружены и изучены четыре гена, кодирующие белки данной группы, а именно AtARGOS, AtARL, OSR1 и OSR2 (Ни et al., 2003; Ни et al., 2006; Feng et al., 2011; Qin et al., 2014), которые в целом можно называть OSR-reuami. Нами были впервые получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией генов AtARGOS и AtARL A. thaliana. Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров листьев, стебля и цветков, причем в случае с первым геном за счет стимуляции как клеточного деления, так и роста клеток растяжением, а в случае со вторым геном только за счет увеличения размеров клеток. Степень увеличения размеров органов по сравнению с контролем составляла в среднем в случае листьев и стебля около 25% и в случае цветков 5%. Мы предположили, что столь незначительное увеличение размеров органов у опытных растений может быть связано не только с компенсаторным уменьшением количества клеток в органе или косупрессией трансгенов, но и с низким уровнем экспрессии целевых генов. Одним из путей решения данной проблемы может стать использование при создании трансгенных растений специфичных или индуцибельных промоторов вместо конститутивных. Исходя из этих соображений, нами были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гены AtARGOS и AtARL A. thaliana под контролем цветокспецифичного промотора хальконсинтазы Petunia hybrída L., а также эстрадиол-индуцибелыюй системы XVE. Часть трансгенных растений со цветокспецифичной экспрессией целевых генов характеризовалась увеличением

размеров цветков, в случае с геном AtARGOS за счет увеличения количества и размеров клеток, а в случае с геном AtARL за счет стимулирования роста клеток растяжением. В цветках трансгенных растений табака был выявлен повышенный по сравнению с контролем уровень экспрессии генов экспансинов NtEXPAl, NtEXPA4, эндоксилоглюкантрансферазы NtEXGT и гена NtANTL (рис. 8). Обобщая данные по всем линиям опытных растений, было показано, что трансгенные по гену AtARGOS растения табака характеризовались увеличением уровня транскрипции гена NtEXPAl в среднем в 2 раза (рис. 8а), гена МЕХРА4 в 1,4 раза (рис. 86), гена NtEXGT в 1,3 раза (рис. 8в), гена NtANTL в 85 раз по сравнению с контролем (рис. 8г). Цветокспецифичная экспрессия гена AtARL способствовала еще большему увеличению содержания мРНК генов, участвующих в регуляции роста клеток растяжением: гена NtEXPAl в 2,6 раза (рис. 8а), гена МЕХРА4 в 2,2 раза (рис. 86), гена NtEXGT в 1,7 раза (рис. 8в) по сравнению с контролем. В трансгенных растениях табака, со цветокспецифичной экспрессией гена AtARL, наблюдалось повышение уровня транскрипции гена NtANTL в 53 раза по сравнению с контролем (рис. 8г). Столь существенное увеличение уровня транскрипции гена NtANTL может говорить об усилении сигнала в промежутке между OSR-белками и транскрипционным фактором ANT.

(а).

(В)

I ««га/ (б)г*Л N,Exr"

ill iUll

'I-^--SRI AHO ARL

SR] ARG ARL (r)

I KlEXGT AMOTl,

¡■■111 It

- SRI ARO ARL SRI ARO ARL

Рис 8 Результаты количественного анализа содержания транскриптов генов NtEXPAl (а) NtEXPA4 (б) NtEXGT (в) и NtANTL (г) в цветках всех линий трансгенных растений, экспрессирующих гены AtARGOS и AtARL под контролем промотора chsA. SRI - контрольные растения табака дикого типа. ARG - трансгенные по гену AtARGOS растения табака ARL - трансгенные по гену AtARL растения табака.

При индуцибельной экспрессии генов AtARGOS и AtARL для нескольких линий трансгенных растений было показано увеличение размеров листьев, стебля и цветков по сравнению с контролем. В данном случае экспрессия гена AtARGOS также оказывала влияние на количество и размеры клеток, а ген AtARL влиял в основном на рост клеток растяжением. Индуцибельная экспрессия гена AtARGOS в цветках, главным образом, способствовала увеличению содержания мРНК гена NtANTL, в то

время как экспрессия гена А1АШ приводила к активации транскрипции генов ШЕХРА1 и ШЕХОТ (рис. 9). Было показано, что индуцибельная экспрессия гена А1АКООЗ в цветках способствует увеличению содержания мРНК гена МЕХРАI в 1,5 раза (рис. 9а), гена АНАИТЬ в 6 раз (рис. 9г). При этом уровень транскрипции гена МЕХРА4 уменьшался в 2 раза (рис. 96), а содержание транскриптов гена МОТГ немного повышалось (рис. 9в). Индуцибельная экспрессия гена А1АЯЬ приводила к увеличению содержания транскриптов гена МЕХРА! в 2,5 раза (рис. 9а) и гена МЕХвТ в 1,4 раза (рис. 9в). Уровень транскрипции генов МЕХРА4 (рис. 96) и МЛ (рис. 9г) при этом, по сравнению с контролем, практически не менялся.

(б)'" Г Ы1ЕХГА4

- ч I ШЕЛ/711 . . р ^

IПI п I

лиа7 АК07 АК1.3 ЛИЛ

м , * 3 к 3

| мел'сг вем

1Ьжп1

Л 407 АИ07 ЛК1.3 АШ 1

к э к э

¡Г

5 * н

' I

II",

(Г) К Э к э чшп.

!!*

! * 11 1 0 л-1

гп 1-1 ЩН

Рис. 9. Результаты количественного анализа уровня транскрипции генов ШЕХРАI (а) МЕХРА4 (б), МЕХвТ (в) и МАШЬ (г) в цветках трансгенных растений," экспрессирующих гены А1АК(К^ и А1АЯ1 под контролем системы ХУЕ. К -контрольные растения, обработанные 5 мкМ раствором ДМСО. Э - опытные растения, обработанные 5 мкМ раствором эстрадиола, содержащего 5 мкМ ДМСО.

Ценные сведения о возможных функциях тех или иных растительных генов могут быть получены также путем уменьшения уровня экспрессии гена-мишени. Исходя из этого, целью следующей нашей работы являлось клонирование короткого консервативного участка генаЛ/Л/?С05 в антисмысловой ориентации и получение на основе этой генно-инженерной конструкции трансгенных растений табака Кроме получения знаний фундаментального характера результаты проведенного нами исследования могли иметь также прикладное значение. В ходе работы были отобраны 5 линий трансгенных растений табака, экспрессирующих консервативный участок гена АГАЯООБ в антисмысловой ориентации, из которых достоверным уменьшением размеров органов характеризовались лишь две линии под номерами 3 и 12, остальные линии трансгенных растений существенно не отличались от контроля. Длина листьев у линий 3 и 12 была меньше, чем у контроля в среднем на 13%, а площадь листьев на 16%. По длине цветка некоторые опытные растения характеризовались статистически достоверным уменьшением: на 6% у линии 3, на 2% у линии 9, на 4% у линий 12 и 14,

а у линии 17 длина цветков не отличалась от контроля. Трансгенные растения линий 3 и 12 отличались небольшим уменьшением размеров клеток эпидермиса листьев на 26 и 14% соответственно. В связи с чем, можно предположить, что уменьшение размеров листьев у этих растений обуславливалось, в первую очередь, именно уменьшением размеров клеток. Исходя из того, что в трансгенных растениях, экспрессирующих фрагмент гена AtARGOS в антисмысловой ориентации уменьшались размеры клеток, можно предположить, что в них изменяется уровень экспрессии генов некоторых экспансинов. Для подтверждения данного предположения, нами была проведена полуколичественная ОТ-ПЦР генов NtEXPAl и ШЕХРА4 в молодых растущих листьях табака (листья №3). Уровень транскрипции генов NtEXPAl и NtEXPA4 оказался довольно высоким именно в верхушках побегов, молодых цветках и листьях, что говорит об участии данных экспансинов в процессе роста органов (рис. 10, 1, 2). В то же время, в молодых листьях №3 трансгенных растений линий 3 и 12 наблюдалось заметное уменьшение содержания транскриптов генов NtEXPAl и ШЕХРА4 (рис. 10, 3, 5). Отметим, что именно для этих растений было показано уменьшение размеров органов. А в листьях трансгенных растений линии 9, у которых размеры органов не уменьшались, уровень содержания транскриптов генов NtEXPAl и ШЕХРА4 оставался в пределах нормы (рис. 10, 4). Полученные данные свидетельствуют о том, что сигналы от фитогормонов к экспансинам поступают, в том числе, через белки с OSR-доменом.

Рис. 10. Электрофореграммы результатов полуколичественной ОТ-ПЦР в листьях №3 трансгенных растений, экспрессирующих фрагмент гена AtARGOS в антисмысловой ориентации: 1 - контрольные трансгенные растения табака, содержащие Т-ДНК бинарного вектора pCambia 1301 без целевого гена; 2 - контрольные растения табака дикого типа; 3 - опытные растения табака линии 3; 4 - опытные растения табака линии 9; 5 -опытные растения табака линии 12.

Так как гены белков с OSR-доменом могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенной продуктивностью, актуальным является вопрос поиска и изучения гомологов этих генов в геномах древесных растений. Из деревьев полностью секвенирован геном тополя P. trichocarpa, в то же время в умеренной зоне России наибольшее распространение имеет P. nigra. В связи с этим, основной целью дальнейшей работы являлся поиск гомологов гена ARGOS тополя и изучение его роли при регуляции роста органов. В рамках данной работы нами был впервые клонирован гомолог геш ARGOS P. nigra, который был зарегистрирован в GenBank под номером JQ955606.1 и получил название PnARGOS-LIKE. Для получения трансгенных

NtEXPAl

деревьев eo сверхэкспрессией гена РпАRGOS-LIKE была выбрана осина (.Populus trémula L.), так как из различных видов тополей именно это растение характеризуется наибольшей легкостью обращения в культуре in vitro. Так как в качестве модельного объекта в данном исследовании использовалась осина, для анализа профиля экспрессии гена ARGOS-LIKE тополя была использована культура in vitro этого дерева, а анализируемый ген получил название PtrARGOS-LIKE (от Р. trémula). Наиболее высокий уровень содержания мРНК гена PtrARGOS-LIKE нами был обнаружен в каллусе, а также в верхушках побегов, содержащих зачатки листьев и два наиболее молодых листочка (рис. 11а). Как в верхушках побега, так и в молодых листьях содержание транскриптов гена PtrARGOS-LIKE повышалось при экзогенной обработке НУК (рис. 116, в). Уровень транскрипции гена PtrARGOS-LIKE в верхушках побегов немного повышался под влиянием 6-бензиламинопурина (рис. 11 б), а в молодых листьях на уровень экспрессии исследуемого гена положительное влияние оказывал 24-эпибрассинолид (рис. 11 в). Полученные данные свидетельствуют о том, что особенности влияния фитогормонов на экспрессию OSR-генов зависит от возраста органа. В наиболее молодых органах важны цитокинины, а в органах старшего возраста важную регуляторную роль играют брассиностероиды. (а) (6)

П m

Молодые Зрелые лтетм лист*

00.

1ь

-О

Контроль

Верх) и: кп КАИ

НУК

1* *

i!: é з"

Мо.шлые KwrtfOJib

Моголые тнстм КАП

МоЛ"лис лнстм

НУК

Рис. 11. Анализ содержания транскриптов гена Р1гЛКС,03-1ЖЕ в различных органах осины (а) и под действием экзогенных фитогормонов (б, в).

MOKlJLJr

Э8

Далее нами были созданы и проанализированы трансгенные растения табака, сверхэкспрессиру ю щ ие ген PnARGOS-LIKE. Конститутивная экспрессия гена PnARGOS-LlKE способствовала увеличению размеров листьев и стебля табака за счет увеличения размеров клеток. Однако при определении функций тех или иных генов более ценными могут оказаться данные, полученные в гомологичной системе экспрессии (Wang et al., 2009а). Исходя из этого, нами была проведена трансформация осины апробированной на табаке конструкцией 35S::PnARGOS-LIKE.

В результате проведенной работы было получено 28 трансгенных растений осины, растущих в культуре in vitro. Из этих растений к условиям почвы удалось акклиматизировать 12 растений, которые выращивались в теплице при искусственном освещении. Для дальнейшего морфологического анализа были отобраны 4 типичных трансгенных растения осины, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии гена PnARGOS-LIKE. Для трансгенных растений осины было характерно достоверное увеличение длины нижних листьев. Также для трансгенных осин было характерно удлинение черешков нижних листьев. В то же время размеры верхних листьев и их черешков у трансгенных растений существенно не изменялись. Для всех проанализированных трансгенных растений осины было характерно уменьшение длины междоузлиев как в нижней части побега, так и в верхней его части. У трансгенных осин с увеличенными размерами листьев наблюдалось достоверное увеличение размеров клеток эпидермиса листьев. В целом, полученные нами данные указывают на важность продукта гена PnARGOS-LIKE в регуляции инициации зачатков листьев и роста листьев через контроль роста клеток растяжением.

Конститутивная экспрессия OSR-гетв способствовала увеличению размеров органов у модельных трансгенных растений табака Поэтому представляло большой интерес возможность испытания созданных нами и апробированных на табаке генно-инженерных конструкций на растениях, имеющих хозяйственное значение. Поэтому нами были созданы трансгенные растения рапса, сверхэкспрессирующие ген AtARL. Для обеспечения сверхэкспрессии целевого гена был использован конститутивный промотор ВМГ, так как нами ранее было показано, что генно-инженерная конструкция ВМГ.-.AtARL способствует наиболее существенному увеличению размеров большинства органов в трансгенных растениях табака Был проведен морфологический анализ 30-ти трансгенных растений сорта Ратник. У трансгенных растений рапса наблюдалось увеличение длины стебля в среднем на 27%, длины листьев на 58%, ширины листьев на 40%, цветков на 22%, объема семян на 23% и веса семян на 29% по сравнению с контрольными растениями дикого типа Площадь клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных растений увеличивалась в среднем на 18% по сравнению с контролем.

***

Экспрессия OSK-генов контролируется фитогормонами, которые могут по-разному влиять на содержание их транскриптов, причем это зависит не только от конкретного гена но и от возраста и типа органа С повышением уровня экспрессии OSR-генов, видимо, увеличивается количество соответствующих белковых продуктов на мембранах и тем самым интенсивность сигналов, поступающих от фитогормонов повышается. Причем под влиянием белков с OSR-доменом наблюдается многократное повышение уровня экспрессии АР2-транскрипционного фактора ANT. Столь существенное влияние белков с OSR-доменом на транскрипционные факторы указывает на усиление сигнала в этой части клеточного сигналинга. Далее

транскрипционные факторы специфически взаимодействуют с промоторами генов, участвующих в регуляции клеточного деления, например, кодирующих циклины и циклин-зависимые протеинкиназы. Таким образом, белки с ОЭа-доменом могут влиять на относительно молодые и в основном недифференцированные клетки, стимулируя в них клеточные деления. Другой мишенью транскрипционных факторов, которые контролируются белками с СЙЯ-доменом, являются промоторы генов, белковые продукты которых участвуют в обеспечении роста клеток растяжением. Здесь конечной целью гормональных сигналов, частично передаваемых через ОЗК-гены, являются большие семейства белков экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз. Нами впервые был клонирован 057?-ген древесных растений, а именно ауксин-индуцибельный ген РпАКО(Х-ЫКЕ тополя черного. При его исследовании были получены данные, свидетельствующие о том, что в наиболее молодых органах экспрессия 05/?-генов может регулироваться цитокининами, а в органах старшего возраста более заметным становится влияние брассиностероидов. Также было показано, что продукт гена РпАКвОБ-иКЕ участвует в регуляции инициации зачатков листьев и контролирует рост клеток растяжением в листьях.

Роль генов, контролирующих рост клеток растяжением в регуляции размеров органов

Нами была исследована роль гена ШЕХвТ в регуляции роста и размеров органов табака. Наиболее высокий уровень транскрипции гена МЕХвТ обнаруживался в молодых цветках и молодых листьях, расположенных рядом с верхушкой побега. В интенсивно растущих за счет клеточного растяжения листьях экспрессию гена ШЕХвТ индуцировали цитокинины, ауксины, брассиностероиды и гиббереллины. Индуцибельная экспрессия гена А1АШ оказывала положительное влияние на содержание транскриптов гена ШЕХвТ, тогда как продукты генов А1АЯС08 и МАИП не оказывали влияния на уровень экспрессии исследуемого гена. Уровень транскрипции гена МЕХвТ также повышался при воздействии ЫаС1, засухи, холода, кадмия, а также АБК. Были получены два варианта трансгенных растений табака сверхэкспрессирующие кДНК форму или геномную форму гена МЕХвТ. Трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией гена МЕХОТ мало отличались фенотипически от растений дикого типа и лишь для четырех из 20 линий было показано достоверное увеличение размеров листьев. Микроскопический анализ показал, что клетки листьев и цветков большинства трансгенных растений были увеличены по сравнению с контрольными растениями, при этом размеры самих органов часто оставались в пределах нормы. У трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена ШЕХвТ, наблюдалась повышенная по сравнению с контролем устойчивость к солевому стрессу, которая проявлялась более высокими показателями роста корней в условиях солевого стресса (рис. 12).

Целью следующего нашего исследования было изучение вклада отдельных

35S::NtEXGT геномная форм! линия №15

генов экснанеинов табака в регуляцию клеточного растяжения при росте органов растений и создание трансгенных растений табака с измененными размерами органов. У табака на данный момент идентифицировано лишь 6 генов а-экспансинов (Link, Cosgrove, 1998), которые получили названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до 6, и их нуклеотидные последовательности имеются в GenBank (AF049350-AF049355). Филогенетический анализ показал, что гены NtEXPA 1, NtEXPA2 и МЕХРАЗ очень близки между собой по нуклеотидной последовательности, поэтому можно было предполагать, что все эти три гена экспансинов, вероятнее всего, выполняют в табаке схожие функции. Исходя из этого, нами было решено изучить только один из генов данной группы, а именно ген NtEXPA!., предполагая, что тем самым будут определены возможные функции всех трех генов.

Рис. 12. Длина корней трансгенных растений, сверхэкспрессирующих ген NtEXGT при действии NaCl: а - проростки контрольной линии (SRI) и линии 15 через 10 дней проращивания на среде МС, содержащим 50мМ NaCl; б - длина корней контрольных и опытных растений через 10 дней проращивания на среде МС с 50мМ NaCl. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (п=15; * - р < 0,05).

Наиболее высокий уровень транскрипции генов NtEXPA 1, NtEXPA4 и NtEXPA5 был детектирован в листьях №2 и №3, которые, судя по всему, наиболее интенсивно растут за счет клеточного растяжения (рис. 13а, б, в). Отличие между генами NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPA5 заключалось в том, что уровень транскрипции первого из них резко уменьшался уже в листе №5, тогда как два последних гена в этом листе экспрессировались еще на довольно высоком уровне (рис. 13а, б, в). Отметим также, что в листе №6 уровень содержания транскриптов гена NtEXPA5 был выше, чем у генов NtEXPAl и NtEXPA4. В целом, в листьях табака наиболее высокий уровень содержания транскриптов был характерен для гена NtEXPA4, затем гена МЕХРА5, наименьший уровень транскрипции был характерен для гена NtEXPAl. Но еще более

низкий уровень транскрипции был показан для гена МЕХРА6 (рис. 13г). Этот ген экспрессировался лишь в верхушке побега и в трех листьях, расположенных возле него. Причем уже в листе №3 уровень транскрипции гена ШЕХРА6 резко уменьшался и в листьях расположенных ниже, совсем не детектировался. Таким образом, в целом, по уровню содержания транскриптов в листьях гены экспансинов табака расположились в следующий ряд: ШЕХРА4 > ШЕХРА5 > ШЕХРА1 > МЕХРА6. Судя по полученным данным, гипотетический ряд генов экспансинов табака, по стадиям роста клеток растяжением выглядит так: МЕХРА6 - МЕХРА1 - МЕХРА4 - МЕХРА5, где первый преимущественно участвует на начальных стадиях клеточного растяжения, а ген М1ЕХРА5 на последних стадиях.

(б)„

; f 150

И»

NIEXPA4

гЬ

Лист »3 Лист №5 Лист .4*

niexpa6

JtL

Рис. 13. Количественный анализ уровня транскрипции генов NtEXPAl (a), NtEXPA4 (б), NtEXPA5 (в) и NtEXPA6 (г) в органах табака различного возраста.

Хорошо известно, что каллус состоит из недифференцированных клеток и характеризуется высоким уровнем клеточных делений. Но судя по данным литературы (Blackman, Overall, 1995) можно предполагать, что в каллусе также происходят начальные стадии клеточного растяжения, связанные с инициацией этого процесса. Уровень экспрессии генов NtEXPAl, МЕХРА4 и МЕХРА5 в каллусе действительно уменьшался, по сравнению с листом №5, что является отражением уменьшения уровня роста клеток растяжением (рис. 14). Однако уровень экспрессии этих генов при этом уменьшался не очень значительно, так как для анализа был взят лист №5, в котором содержание транскриптов генов экспансинов изначально было не самым высоким (рис. 13). Что касается гена МЕХРА6, то как и в предыдущем исследовании транскрипты данного гена в листе №5 не обнаруживались, однако в каллусе его уровень транскрипции был наиболее высоким и при этом даже выше, чем у генов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPA5 (рис. 14).

160 _140

7120 —

и ¡¿100

I I 60 s а. до

5 = ,п

NIEXPA6

Рис. 14. Количественный анализ уровня транскрипции генов экспансинов табака в листьях №5 и каллусе, полученном из этого листа.

Каллус НУК/Кинетин

В литературе имеются сведения о том, что некоторые экспансины экспрессируются преимущественно в корнях, то есть являются корнеспецифичными (Lee et al., 2002; Lee et al, 2003; Lin et al., 2011). Все исследуемые нами гены экспансинов табака в надземной части растения экспрессировались, но представлял определенный интерес сравнительный анализ их экспрессии в корнях и листьях табака В ходе проведенного исследования, было показано, что содержание транскриптов генов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPAS в корнях гораздо ниже, чем в листьях №3 (рис. 15). В то же время уровень транскрипции гена NtEXPАб в корнях был выше, чем в листьях №3 (рис. 15). Отметим, что в корнях содержание транскриптов гена NtEXPА б было сравнимо с его содержанием в верхушке побега и листьях №2 (рис. 13г). Таким образом, нами было показано, что уровень экспрессии гена NtEXP Аб наиболее высок в каллусе, верхушке побега и в корнях, поэтому можно предполагать, что данный экспансии специфичен для недифференцированных клеток. В целом, ни один из исследуемых нами генов экспансинов не может быть назван корнеспецифичным. Это, видимо, связано с тем, что все 6 секвенированных генов экспансинов табака были ранее выделены из суспензионной культуры клеток, полученной из листьев (Link, Cosgrove, 1998).

450 400

Í т350 300

'I Í 250 I Ï200

5 =150

х I

6 = 100 В 50

Л к

NtEXPAl

Л К

NIEXPA4

л к

NtEXPAS

Л К

NtEXP А в

Рис. 15. Количественный анализ уровня транскрипции генов экспансинов табака в листьях №3 и корнях. Л - листья, К - корни.

Исходя из того, что уровень экспрессии генов экспансинов табака изменялся в процессе развития листьев (рис. 13), мы предположили, что при обработке экзогенными фитогормонами изменения содержания их транскриптов также могут отличаться в зависимости от возраста органа Поэтому нами было проведено исследование уровня транскрипции генов экспансинов отдельно в верхушке побега с листом №1, листе №2, листе №5 и листе №8. Анализ показал, что в верхушке побега содержание транскриптов гена МЕХРА1 под влиянием экзогенных фитогормонов увеличивается незначительно, при этом стимулирующим эффектом обладали БАП, НУК и ЭБ. В листьях №2 и №5 цитокининьг, ауксины и гиббереллины способствовали увеличению содержания транскриптов гегга МЕХРА1, тогда как брассиностероиды, наоборот, уменьшали уровень транскрипции данного гена. В листьях №8 уровень экспрессии гегга МЕХРА1 был очень ггизким и не повышался даже под влиянием экзогенных фитогормонов. Уровень экспрессии гена ШЕХРА4 существенно увеличивался в ответ на экзогенную обработку цитокининами во всех проанализированных органах табака Содержаггие транскриптов гена МЕХРА4 также повышалось, но менее существенно под влиянием экзогенных ауксинов и гиббереллинов во всех проанализированных органах. Таким образом, в отличие от гена МЕХРА1, ген ШЕХРА4 оставался доступным для стимуляции его экспрессии даже в листьях, прекративших свой рост. Брассиностероиды лишь немного увеличивали уровень содержания транскриптов гена МЕХРА4 только в листьях №5 и №8. В верхушке побега уровень транскрипции гена ШЕХРА5 в ответ на экзогенные фитогормоны изменялся незначительно. Брассиностероиды, при этом, способствовали уменьшению уровня транскрипции гена МЕХРА5. В листе №2 экспрессию гегга ШЕХРА5 стимулировали цитокининьг и ауксины, тогда как в листьях №5 и №8 кроме этих фитогормонов, стимулирующим эффектом обладали также гиббереллины. Таким образом, экспрессия гена МЕХРА5 также как и гена МЕХРА4, оставалась доступной для стимуляции фитогормонами даже в листьях, прекративших свой рост. В ответ гга экзогенную обработку фитогормонами уровень экспрессии гена ШЕХРА6 повышался в верхушке побега и листьях №2 при использовании цитокининов и ауксинов. В листьях №5 и №8 транскрипты гена ШЕХРА6 не обнаруживались даже при экзогенной обработке фитогормонами. В ответ на обработку ЭБ в листе №2 уровень экспрессии гена МЕХРАб снижался. Таким образом, экспрессия генов экспансинов табака в интенсивно растущих листьях регулируется преимущественно цитокининами, ауксинами и гиббереллинами. Брассиностероиды способны как увеличивать, так и уменьшать уровень экспрессии генов экспансинов. Возможно, этой группой фитогормонов осуществляется более тонкая регуляция экспрессии генов экспансинов и если в той или иной ткани

потребность в конкретном экспансине падает, то брассиностероиды способны уменьшить их уровень экспрессии. Из наших данных также следует, что в тканях, где необходимость в тех или иных экспансинах полностью отпадает, их экспрессия при обработке экзогенными фитогормонами в большинстве случаев не повышается. Отсюда можно предположить, что важную роль при регуляции экспрессии генов экспансинов играют эпигенетические механизмы.

При выращивании табака дикого типа на гидропонике, было показано, что уровень транскрипции генов NtEXPAl, ШЕХРА4 и NtEXPA5 повышается при содержании NaCl в среде от 20 мМ, по крайней мере, в течение первых двух часов инкубации до достижения содержания соли в 350 мМ (рис. 16). Однако при действии еще более высокой концентрации соли (850 мМ) уровень транскрипции генов экспансинов уже не повышается. В то же время, уровень транскрипции гена ШЕХРА6 практически не зависит от содержания соли в среде. Интересно отметить, что в листьях табака, росших на почве и не поливавшихся в течение 2 дней, уровень содержания транскриптов генов NtEXPAl и NtEXPA4 был больше в среднем в 2 раза, чем в листьях табака, росших на гидропонике, что может свидетельствовать об участии экспансинов в регуляции устойчивости к стрессам, вызванным не только избытком NaCl, но и дефицитом влаги в целом. Уровень транскрипции всех исследуемых генов экспансинов в листьях №3 также повышался при действии низкой положительной температуры +10°С. При этом наиболее существенно (в среднем в 4 раза) возрастало содержание транскриптов генов NtEXPAl и NtEXPA4.

Содержание транскриптов генов экспансинов под влиянием экзогенного МеЖ в листьях №3 достоверно не изменяется ни в сторону увеличения, ни в сторону уменьшения (рис. 17). При действии экзогенной АБК в листьях №¡3 повышался уровень транскрипции генов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPAS (рис. 17а, б. в). Итак, именно в листе №3 содержание транскриптов генов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPAS повышалось под влиянием соли, засухи, холода и экзогенной АБК, поэтому можно предполагать, что все эти изменения связаны между собой. В то же время уровень транскрипции гена NtEXPAö под влиянием экзогенной АБК, наоборот снижался (рис. 17г), к тому же напомним, что уровень экспрессии этого гена при действии соли не

повышался (рис. 16).

Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что экспансины принимают участие в адаптации растений к стрессам, вызванным дефицитом влаги и, судя по всему, обеспечивают рост клеток растяжением, как при нормальных условиях, так и при действии неблагоприятных факторов среды. Причем при действии последних, вероятнее всего, потребность в экспансинах существенно возрастает, что приводит к увеличению уровня их экспрессии.

850 мМ NaCl

Рис. 16, Изменения уровня транскрипции генов экспансинов табака в листьях №3 в ответ на двухчасовую инкубацию в NaCl в условиях гидропоники.

Нами также были проведены исследования уровня транскрипции генов NtEXPAl и NŒXPA4 в трансгенных растениях табака с индуцибелыюй экспрессией OSR-гена AtARL. Было установлено, что в листе №5 уровень транскрипции гена NtEXPAl повышался в 1,7 раза, а гена МЕХРА4, наоборот, снижался в 1,2 раза под влиянием индуцибелыюй экспрессии гена AtARL (рис. 18). Полученные данные в очередной раз подтверждают, что гены экспансинов и белков с OSR-доменом взаимосвязаны в системе клеточной сигнализации. Из литературных данных следовало, что повышенный уровень экспрессии гена AtARL может способствовать стимуляции экспрессии генов экспансинов (Wang et al., 2009b). Однако вопреки ожиданиям, AtARL увеличивал уровень экспрессии одного экспансина и уменьшал его у другого экспансина Это говорит о существовании более сложных взаимоотношений между экспансинами и белками с OSR-доменом в системе клеточной сигнализации. Таким образом, два исследованных нами гена экспансина имеют, вероятнее всего, разные по строению промоторы и действительно, скорее всего, выполняют различные функции при регуляции роста органов табака

№

NtEXPA /

(б)

-4—]

(В)

* И

Контроль МеЖ

NIEXPA5

АЬК

Контроль

МсЖ

ЛБК

(г)

¡1 I-

Контроль МсЖ NtEXPA б

АБК

Контроль МсЖ

АБК

Рис 17 Изменения уровня транскрипции генов экспансинов под влиянием «стрессовых» фитогормонов в листьях №3. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (п-3; * - р < 0,05).

! ^ 5 ^ loo Е =

■ EXPI ЕХР4. , F.XP1 ЕХР4 ,

Контроль

Эстрадиол

Рис. 18. Уровень транскрипции генов ШЕХРА1 и ШЕХРА4 при индуцибельной экспрессии гена А1АКЬ. ЕХР1 - МЕХРА1, ЕХР4 -ШЕХРА4. Контроль - растения, обработанные 0,1% раствором ДМСО без эстрадиола. Эстрадиол -растения, обработанные 5 мкМ раствором эстрадиола в 0,1% ДМСО.

Для доказательства важной роли генов экспансинов при регуляции размеров органов нами были созданы трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией генов NlEXPAl, МЕХРА5 N. tabacum, AtEXPAlO A. thaliana, PnEXPAl и РпЕХРАЗ P. nigra. Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров листьев, стебля и цветков за счет стимуляции роста клеток растяжением. Конститутивная экспрессия гена NtEXPA 1 способствовала увеличению размеров, прежде всего листьев, тогда как трансген ШЕХРА5 большее влияние оказывал на длину стебля. Сверхэкспрессия генов экспансинов AtEXPAlO и PnEXPAl в гетерологичных условиях, а именно в трансгенных растениях табака, способствовала более существенному увеличению размеров органов, чем при использовании генов NtEXPA 1 и NtEXPA5. Трансгены AtEXPAlO и PnEXPAl большее влияние оказывали на размеры листьев, тогда как конститутивная экспрессия гена РпЕХРАЗ способствовала увеличению длины стебля. Конститутивная экспрессия генов

Л/ЕХРЛ10 и РпЕХРА1, в отличие от генов ШЕХРА1 и ШЕХРА5, способствовала большему увеличению размеров органов на ранних стадиях развития растения, что может быть связано с тем, что продукты генов А1ЕХРА10 и РпЕХРА! принимают участие на начальных стадиях клеточного растяжения. Нами также были получены трансгенные растения табака с пониженным уровнем экспрессии гена ШЕХРА4, которые характеризовались уменьшением размеров органов за счет уменьшения размеров клеток. Таким образом, путем получения и анализа трансгенных растений табака, была доказана функциональная полноценность исследованных генов экспансинов.

***

Нами впервые были проведены исследования гена эндоксилоглюкантрансферазы табака NtEXGT и четырех генов экспансинов табака: NtEXPAl, NIEXPA4, МЕХРА5, NtEXPA6, которые относятся к разным субгруппам и выполняют разные функции в процессе роста и развития растения. Гены NtEXPAl, NtEXPA4 и Nl EXP А 5 являются в основном листоспецифичными и экспрессируются только в первых шести от верхушки побега листьях, тогда как ген NtEXPA6 только в первых трех. В прекративших свой рост листьях гены экспансинов табака не экспрессируются. Наиболее высокий уровень транскрипции гена NtEXPA6 был обнаружен в тканях с высоким содержанием недифференцированных клеток, а именно в каллусе, верхушке побега и корнях. В верхушке побега экзогенные фитогормоньг оказывают незначительное влияние на уровень экспрессии генов экспансинов. В наиболее интенсивно растущих растяжением листьях все группы фитогормонов, кроме брассиностероидов стимулировали экспрессию генов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPAS. Эффект брассиностероидов на экспрессию генов экспансинов зависел от возраста листа и эта группа фитогормонов, в отличие от остальных, была способна как повышать, так и снижать содержание транскриптов исследуемых генов. Судя по всему, часть внутриклеточных сигналов от брассиностероидов к экспансинам поступает через белки с OSR-доменом. ЭБ в листе №5 не повышал содержание транскриптов гена NtEXPAl и не снижал уровень экспрессии гена N/EXPA4. В то же время индуцируемый брассиностероидами продукт OSR-гена AtARL (Feng et al„ 2011) повышал уровень экспрессии гена NtEXPAl и снижал его у гена NIEXPA4. Это позволяет предположить, что регуляция чувствительности экспансинов NtEXPAl и NtEXPA4 к фитогормонам в системе клеточной сигнализации происходит на уровне, расположенном до белков с OSR-доменом. Согласно данным литературы' (Тарчевский, 2001; Кошкин, 2010), специфичность фитогормонального сигнала и чувствительность к нему клеток преимущественно обеспечивается на уровне рецепторов гормонов. В целом, гены NtEXPAl и NIEXPA5 являются ауксин-индуцибельными, а ген МЕХРА4, преимущественно цитокинин-индуцибельным. Также нами были получены экспериментальные данные, говорящие о вовлеченности экспансинов и эндоксилоглюкантрансфераз в ответ растений на стрессовые факторы

и более того, свидетельствующие в пользу участия этих групп белков в обеспечении роста при изменяющихся условиях среды. Результаты наших исследовании показывают, что гены AtEXPAlO и PnEXPAl могут быть предложены в качестве целевых для создания трансгенных растений с увеличенными размерами листьев, а ген РпЕХРАЗ для увеличения длины стебля, причем они могут оказаться более эффективными в неродственных A. thaliana растениях. В целом, полученные нами генно-инженерные конструкции на основе генов NtEXPAI, МЕХРА4, ШЕХРА5, AtEXPAlO, PnEXPAl и РпЕХРАЗ могут быть использованы для получения трансгенных растений с измененными размерами органов.

Создание трансгенных растеши, с увеличенными и уменьшенными размерами органов

Одна из прикладных задач данной работы заключалась в увеличении или уменьшении размеров органов растений путем изменения уровня экспрессии генов ANT OSR экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз. В целом в рамках всей работы было создано и апробировано на табаке 93 целевых генно-инженерных конструкции. Для морфологического анализа было использовано 346 линии трансгенных растений табака второго поколения. Так как выборка составляла 5, то в итоге было проанализировано 1730 трансгенных растений табака. На рисунке 19 представлены обобщенные результаты морфологического анализа листьев, стебля и цветков основных групп трансгенньгх растений табака Наибольшая степень увеличения длины листьев в среднем на 39%, была характерна для трансгенных растений табака, содержащих генно-инженерную конструкцию ВМГ.-.AtARL (рис. 19а) Наибольшая степень уменьшения длины листьев была характерна для трансгенных растений с пониженной экспрессией гена NtANTL, причем для одной из линий, содержащих конструкцию 1301/Regl А, разница в среднем составила 83% (рис. 19а) Высоту стебля удалось уменьшить в среднем на 38% для одной из линии, которая экспрессировала участок гена NtANTL как в сенс-ориентации, так и в антисенс-ориентации, то есть содержащая конструкцию 35S::NtANTLi (рис. 196). Наибольшая степень увеличения высоты стебля в среднем на 46% наблюдалась у одной из линий, сверхэкспрессируюгцих ген NtEXPAS, содержащих конструкцию 35S-NtEXPA5 (рис. 196). Размеры цветков удалось уменьшить в среднем до 13/о (на 13% по сравнению с контролем) у линий с пониженной экспрессией гена NtANTL, содержащих конструкцию 1301/ReglA (рис. 19в). Наибольшая степень увеличения длины цветка (на 16%) была характерна для трансгенных растений с конститутивном экспрессией гена AtARGOS под контролем промотора ВМГ (рис. 19в). Одинаково положительно на размеры всех трех параметров роста влиял OSR-гсн AtARL совместно с промотором ВМГ, поэтому для дальнейших работ по трансформации хозяйственно-ценных культур была отобрана генно-инженерная конструкция ВМГ::AtARL. Данная конструкция была уже апробирована нами на рапсе (стр. 30), в

будущем же планируется использовать его и для трансформации других важных культур, в которых увеличение размеров листьев и стебля является экономически целесообразным.

(а) Средние значения изменения Lдлины листьев в % к контролю

OOOOOOOor!

туглт

BWrbUHT

¡.V.PeAKJtl l.<S::Pn.4ynj

JSS'KlEXUr BHT.S-tEXnil НЬМЕХПг «та ГГ"

МЬЕХР.НО JX.Ptf.mt

(б) Средние значения изменения высоты стебля в % к контролю

S^SSooSSgn

3SS::\'M\TL

ВМГ.ВпАМ 33S::PnASTLl 3SS::PnAKTL2

1301/Reg/A I

B№::AtARGOS 3SS::AtARL BMT-A/ARL chiAr.AtARL XVE::AtARGOS XVE:.AtARL 35S::A<ARGi 35S::PnARGOS-UKF. 33S::.K>EXGT BMr.SiEXPAl 35S::NiEXPA5 JSS::XfEXPi I

33S::AlEXPAI0 3!S::PnEXPAI SSS::PnEXPA3

(в) Средние значения изменения длины цветков в % к контролю

JSS::NiANTL З&ШМГПЩ

BMT:BnANT 3SS::PnA.\'TLI <5S::PnANTL2 I.W/XcsrlAl ~

ВМГ::AtARGOS 3SS::AiARL BUT .MARL chsA::AtARL XVEr.AiARGOS XVE::AtARL J5S..AlARGi I 3}S::PnARGOS-UKE 3S&:NiEXCT BMr.siF.mi 3SS::\iEXPAS

JSS::\iEXPi |-

3SS::AtEXPAI0 3SS::P»EXPAI 3SS::PnEXPA3\

Рис. 19. Средние значения изменения длины листьев (а), высоты стебля (б) и длины цветков (в) трансгенных растений табака в % к контролю (по сравнению с растениями табака дикого типа и трансгенными растениями табака, содержащими Т-ДНК вектора рСатЫа 1301 без целевого гена).

Заключение

В целом, в ходе всей работы была рассмотрена небольшая часть клеточной сигнализации, участвующей в регуляции размеров органов, общая схема которой приводится на рисунке 20. В ответ на определенные воздействия повышается содержание активных форм фитогормонов, которые взаимодействуют со своими рецепторами, причем именно на этом уровне, видимо, обеспечивается специфичность сигнала за счет регуляции компетентности клеток к восприятию этого сигнала. Далее сигналы частично поступают к белкам с OSR-доменом, где происходит транедукция сигнала по направлению стимуляции клеточного деления или же роста клеток растяжением. После белков с OSR-доменом происходит амплификация сигнала, и он поступает к таким транскрипционным факторам, как ANT, которые запускают экспрессию генов, продукты которых участвуют в обеспечении клеточного деления или роста клеток растяжением (рис. 20). В свою очередь, избирательное действие белков с OSR-доменом и транскрипционных факторов на клеточное деление или же на рост клеток растяжением зависит от возраста органа и клеток. Например, в верхушках побегов и зачатках органов данные белки преимущественно влияют на

клеточное деление, а в интенсивно растущих органах наблюдается влияние на рост клеток растяжением. Это говорит о важной роли не только генетических, но и эпигенетических механизмов регуляции размеров органов, которые на данный момент остаются малоизученными.

[воздействие: внутриклеточные сигналы, внешние факторы

т ~

[ Фитогормоны ]

''компетентность клето|Г\__^ рецепторы фИТОГОрМОНОВ~| . к фитогормону ---г---

Трансдукция сигнала: преимущественная стимуляция клеточного деления или роста клеток

растяжением

Циклины и циклин-зависимые киназы /

Белки, участвующие Экспансины,

в клеточном КСИлоглюканэндотрансгпикозилазы и др.

делении |

Клеточное деление Рост клеток растяжением

Рис. 20. Общая схема рассмотренной в ходе работы части клеточной сигнализации, вовлеченной в регуляцию размеров органов растении.

Выводы

1 Установлено, что промотор вируса мозаики георгина в трансгенных растениях табака характеризуется большей активностью, чем классический 35Б промотор, что выражается в виде возрастания уровня транскрипции целевых генов, а также более существенным влиянием последних на фенотип.

2. Конститутивная экспрессия гена СЬАУАТАЗ в трансгенных растениях табака способствует уменьшению числа клеток в растущих органах, при этом в листьях увеличивается концентрация цитокининов, которые стимулируют экспрессию генов, кодирующих экспансии №ЕХРА4 и эндоксилоглюкантрансферазу №ЕХОТ, которые, в свою очередь, обеспечивают компенсаторный рост клеток растяжением.

3. Выявлено, что экспрессия транскрипционного фактора АЮТЕОиМЕЖА обнаруживается только в зонах с высоким содержанием недифференцированных клеток и регулируется цитокининами, ауксинами и брассиностероидами, причем сигналы от фитогормонов к нему поступают через белковые продукты 05К-генов, после которых происходит трансдукция и амплификация сигнала. Транскрипционный фактор АШТЕСиМЕЫТА контролирует клеточные деления в верхушках побегов и

молодых листьях совмесгно с циклинами и циклин-зависимыми протеинкиназами и участвует в регуляции роста клеток растяжением через стимуляцию экспрессии генов экспансинов.

4. Показано, что бИЯ-гены кодируют группу белков, ассоциированных с регуляцией размеров органов в целом, так как одновременно контролируют деление клеток, инициацию клегочного растяжения и участвуют в поддержании роста клеток растяжением путем регуляции экспрессии транскрипционного фактора АШТЕСиМЕЛТА, экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз. Экспрессия ОБ7?-гена АПСЮЗ-ЫКЕ тополя преимущественно контролируется ауксинами, причем этот ген участвует в регуляции размеров органов через влияние на рост клеток растяжением.

5. Наиболее высокий уровень содержания транскриптов гена эндоксилоглюкантрансферазы МЕХйТ обнаруживается в молодых цветках и листьях, расположенных рядом с верхушкой побега. В интенсивно растущих за счет клеточного растяжения листьях экспрессию гена МЕХОТ индуцируют цитокинины, ауксины, брассиностероиды и гиббереллины. Содержание транскриптов гена МЕХОТ повышается в ответ на воздействие №С1, засухи, холода, кадмия и АБК. Трансгенные растения табака, с конститутивной экспрессией гена МЕХОТ характеризуются высокими показателями роста корней в условиях солевого стресса. Совокупность полученных данных свидетельствует об участии продукта гена МЕХОТ в обеспечении роста клеток растяжением, как в нормальных условиях, так и при воздействии стрессовых факторов.

6. Установлено, что гены экспансинов МЕХРА1, МЕХРА4 и МЕХРА5 являются листоспецифичными и экспрессируются только в первых шести от верхушки побега листьях под контролем цитокининов, ауксинов, брассиносгероидов и гиббереллинов. Наиболее высокий уровень экспрессии гена МЕХРА6 обнаруживается в тканях с высоким содержанием недифференцированных клеток, при этом транскрипция данного гена контролируется ауксинами и цитокининами.

7. Показано, что воздействие фитогормонов на транскрипцию генов экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз зависит от возраста листа. Установлено, что часть сигналов от фитогормонов к экспансинам и ксилоглюканэндотрансгликозилазам поступает через продукты 05Я-генов, однако регуляция чувствительности исследуемых генов к фитогормонам происходит на вышерасположенных уровнях клеточного сигналинга.

8. Содержание транскриптов генов экспансинов МЕХРА1, МЕХРА4 и МЕХРА5 повышается в ответ на воздействие №С1, засухи, холода и АБК. Экспрессия гена МЕХРА6 при воздействии тех же абиотических факторов не изменяется, а в ответ на

АБК содержание транскриптов данного гена уменьшается. Совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о вовлеченности экспансинов NtEXPAl, NtEXPA4 и NtEXPA5 в ответ растений на стрессовые факторы и об их участии в обеспечении роста при изменяющихся условиях среды.

9. Показано, что конститутивная экспрессия генов NtANTL, BnaX.ANT.b, PnANTL2 и AtARGOS в трансгенных растениях табака способствует увеличению размеров органов за счет влияния как на клеточное деление, так и на рост клеток растяжением. Трансгены PnANTLl, AtARGOS-LIKE, PnARGOS-LIKE, NtEXGT, NtEXPAl. NtEXPA5, PnEXPAl и РпЕХРАЗ способствуют увеличению размеров органов табака в основном за счет стимуляции роста клеток растяжением.

10. Наибольшая степень увеличения длины и площади листьев в среднем на 39 и 60% соответственно, была характерна для трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих ген AtARGOS-LIKE под контролем промотора вируса мозаики георгина. Растения рапса, трансформированные данной генно-инженерной конструкцией, характеризовались увеличением длины листьев и веса семян в среднем

на 58 и 29% соответственно.

11. Показано, что для увеличения длины стебля табака наиболее эффективной

является генно-инженерная конструкция 35S::NtEXPA5, причем при ее использовании, длина стебля у одной из линий увеличивалась в среднем на 46%. Сверхэкспрессия всех использованных в работе трансгенов в меньшей степени влияла на размеры цветков, и максимальная степень увеличения длины данного органа, составившая в среднем 16%, была выявлена у одной из линий трансгенных растений табака сверхэкспрессирующих ген AtARGOS под контролем промотора вируса мозаики георгина

12. Наибольшая степень уменьшения размеров органов была характерна для трансгенных растений табака с пониженной экспрессией гена NtANTL, причем для одной из линий было показано уменьшение длины листьев, высоты стебля и длины цветков в среднем на 83, 38 и 13% соответственно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК РФ

1. Кулуев, Б.Р. Поиск каулимовирусов на территории Республики Башкортостан и исследование их полногеномных промоторов / Б.Р. Кулуев A.B. Чемерис, Р.И. Ибрагимов // Вестник Башкирского университета. 2007. Т. 12. №2.

С. 24-26.'

2. Кулуев, Б.Р. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики / Б.Р. Кулуев, A.B. Чемерис // Генетика 2007. Т. 43. №12. С. 1682-1684.

3. Кулуев, Б.Р. Применение амплификации по типу катящегося кольца и ДНК-шаффлинга для генетической рекомбинации промоторных последовательностей с низким уровнем гомологии / Б.Р. Кулуев, A.B. Чемерис, Р.И. Ибрагимов // Вестник Башкирского университета 2008. Т. 13. №1. С. 39-42.

4. Кулуев, Б.Р. Активность промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака / Б.Р. Кулуев, A.B. Чемерис, A.B. Князев // Физиология растений. 2008. Т. 55. №5. С. 763-770.

5. Кулуев, Б.Р. Амплификация и клонирование полноразмерного гена AINTEGUMENTA рапса / Б.Р. Кулуев, A.B. Чемерис // Аграрная Россия. 2009. С. 124.

6. Кулуев, Б.Р. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов и анализ их активности в трансгенных растениях / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев Я.П.Лебедев, А.А.Ильясова, A.B. Чемерис // Физиология растений. 2010 Т 51 С. 623-632.

7. Кулуев, Б.Р. Конститутивная экспрессия гена ARGOS в растениях табака под контролем промотора вируса мозаики георгина / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, А А

Ильясова, A.B. Чемерис//Физиология растений. 2011. Т. 58. №3. С. 443-452.

8. Кулуев, Б.Р. Морфофизиологическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих гены экспансинов AtEXPAlO арабидопсиса и PnEXPAl тополя / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, Я.П. Лебедев, A.B. Чемерис // Физиология растений. 2012. Т. 59. №1. С. 108-117.

9. Кулуев, Б.Р. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих консервативные участки гена AINTEGUMENTA в антисмысловой ориентации / Б Р Кулуев, A.B. Князев, Я.П. Лебедев, Б.Н. Постригань, A.B. Чемерис // Физиология

растений. 2012. №3. С. 341-353.

10. Кулуев, Б.Р. Эктопическая экспрессия генов PnANTLl и PnANTU тополя черного в трансгенных растениях табака / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, A.B. Чемерис // Генетика 2012. Т. 48. №10. С. 1162-1170.

11. Кулуев, Б.Р. Влияние эктопической экспрессии гена NtEXPA5 на размеры клеток и рост органов трансгенных растений табака / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина, A.B. Князев, A.B. Чемерис//Онтогенез. 2013. Т. 44. №1. С. 34-41.

12. Кулуев, Б.Р. Морфологические особенности трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AINTEGUMENTA рапса под контролем промотора вируса мозаики георгина / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, A.B. Чемерис И Онтогенез. 2013 Т 44 №2. С. 110-114. '

13. Кулуев, Б.Р. Влияние конститутивной экспрессии гена ARGOS-L1KE на размеры клеток и органов трансгенных растений табака / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев М.Г. Сафиуллина, A.B. Чемерис // Генетика 2013. Т. 49. №5. С. 587-594.

14. Кулуев, Б.Р. Морфологический анализ трансгенных растений табака экспрессирующих ген РпЕХРАЗ тополя черного / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина, А В Князев, A.B. Чемерис//Онтогенез. 2013. Т. 44. №3. С. 166-173.

15. Кулуев, Б.Р. Перенос трансгенов ARGOS-LIKE и AtEXPAlO в нетрансгенные формы табака и фенотипические проявления их конститутивной экспрессии / Б Р Кулуев, Е.В. Михайлова, A.B. Чемерис // Вавиловский журнал генетики и селекции 2013. Т. 17. №1. С. 81-88.

16. Кулуев, Б.Р. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих фрагменты генов ARGOS и NtEXPA4 в антисмысловой ориентации / Б.Р. Кулуев, А В

Князев, A.B. Чемерис//Генетика. 2014. Т. 50. №1. С. 44-51.

17 Кулуев Б Р. Роль генов NtEXPAl и NtEXPA4 в регуляции клеточного растяжения при росте листьев табака / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, Ю.М. Никоноров, А В Чемерис // Генетика. 2014. Т. 50. №5. С. 560-569.

18. Кулуев, Б.Р. Эстрадиол-индуцибельная и цветокспецифичная экспрессия генов ARGOS и ARGOS-LIKE в трансгенных растениях табака / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, Ю.М. Никоноров, A.B. Чемерис // Генетика. 2014. Т. 50. №8. С. 918-929.

19 Нургалеева, Э.З. Морфологический анализ трансгенных растении табака, сверхэкспрессирующих ген CLAV AT A3 A. thaliana / Э.З. Нургалеева, Б.Р. Кулуев // Вестник Башкирского университета. 2014. Т. 19. №1. С. 61-66.

20. Кулуев, Б.Р. Регуляция роста клеток растяжением в растениях / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина // Успехи современной биологии. 2015. Т. 135. №2. С. 148-163.

Статьи в рецензируемых журналах не входящих в перечень ВАК РФ

21. Кулуев, Б.Р. Генетическая регуляция величины органов у растений / Б.Р.

Кулуев//Биомика. 2011. Т. 2. №1. С. 33-46.

22. Кулуев, Б.Р. Каулимовирусы и их полногеномные промоторы / Ь.Р. Кулуев

//Биомика. 2012. Т. 4. №1*. С. 1-19. „

23 Кулуев, Б.Р. Сравнительная характеристика трансгенных растении таОака экспрессирующих ген ARGOS под контролем промоторов каулимовирусов / Б_Р. Кулуев A.B. Князев //Известия Уфимского научного центраРАН. 2012. №1. С. 19-26.

24 Кулуев Б Р. Роль гена NtEXPА6 в регуляции роста органов табака / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина, A.B. Князев, Ю.М. Никоноров, A.B. Чемерис // Биомика. Т. 6. №1. С. 1-12.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференции

25. Кулуев, Б.Р. Создание эффективных промоторных конструкций для получения трансгенных растений с измененными размерами органов / Б.Р. Кулуев // Материалы 2-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Москва. 2007. С. 58.

26. Кулуев, Б.Р. Создание конструкций с геном AINTEGUMtNJA и промоторами каулимовирусов для получения трансгенных растений с измененными размерами органов / Б.Р. Кулуев, A.B. Чемерис // Материалы II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы

биотехнологии». Казань. 2008. С. 65-66.

27. Кулуев, Б.Р. Получение гибридных и модифицированных форм промоторов вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики / Б.Р. Кулуев, A.A. Ильясова, Я. П. Лебедев // Материалы школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино. 2008. С. 55.

28. Кулуев, Б.Р. Модификация сильных промоторов каулимовирусов гвоздики и георгина и получение конструкций для анализа их активности в трансгенных растениях / Б.Р. Кулуев, Е.О. Ключникова, A.B. Князев, A.B. Чемерис // Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем» №4. А. 2008. С. 404-411.

29 Кулуев Б.Р. Создание генно-инженерных конструкций для постгранскрипционного сайленсинга гена AINTEGUMENTA / Б.Р. Кулуев, A.A. Ильясова И Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино. 2010. Т. 2. С. 150.

30. Кулуев, Б.Р. Морфофизиологические особенности трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих ген AtEXPAlO A. thaliana / Б.Р. Кулуев Я П Лебедев A.B. Князев // Материалы Третьего Международного симпозиума «Клеточная' сигнализация у растений». Казань. 2011. С. 88-89.

31. Кулуев, Б.Р. Выделение и исследование гомолога гена ARGOS из тополя черного / Б.Р. Кулуев, А.Р. Кулуев, A.B. Князев // Материалы VII-го Съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Нижний Новгород. 2011. С. 395-396

32. Кулуев, Б.Р. Получение трансгенных растений табака с увеличенными размерами листьев и стебля / Б.Р. Кулуев, A.B. Князев, A.B. Чемерис // Материалы IV Всероссийского симпозиума «Трансгенные растения: технологии создания биологические свойства, биобезопасность». Москва. 2012. С. 62.

33. Кулуев, Б.Р. Получение трансгенных растений осины при помощи Agrobactenum rhizogenes с использованием микрочастиц карбида кремния / БР Кулуев, A.B. Князев // Сборник тезисов X Международной конференции «Биология клеток растении in vitro и биотехнология». Казань. 2013. С. 239-240.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота

АМП - апикальная меристема побега

БАП - 6-бензиламинопурин

ВКГГ - вирус кольцевой гравировки гвоздики

ВМГ - вирус мозаики георгина

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

ГКЗ - гибберелловая кислота

ИУК - индолилуксусная кислота

МеЖ- метилжасмонат

НУК- 1-нафтилуксусная кислота

ОТ-ПЦР - обратно транскрипционная ПЦР

ЭБ - 24-эпибрассинолид

ARGOS - от Auxin-Regulated Gene Involved in Organ Size ANT - AINTEGUMENTA CLV3-CLAVATA3

NtANTL - A INTEGUMENT A - нодобп ы й ген табака NtEXPAl- NtEXPA6- гены экспансинов табака NtEXGT- ген эндоксилоглюкантрансферазы табака OSR - от Organ Size Related

РпЕХРА1-РпЕХРАЗ - гены экспансинов тополя черного

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 07. Подписано в печать 06.10.2015г. Формат 60x84, 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 02,56 Уч.-изд. л. 03,00 Тираж 100 экз.

Информация о работе

Кулуев, Булат Разяпович
доктора биологических наук
Уфа, 2015
ВАК 03.01.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции размеров органов у растений
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология