Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конститутивная и индуцибельная экспрессия генов экспансинов в трансгенных растениях табака

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конститутивная и индуцибельная экспрессия генов экспансинов в трансгенных растениях табака"

На правах рукописи

САФИУЛЛИНА МИЛЯУША ГАЛИМЬЯНОВНА

КОНСТИТУТИВНАЯ И ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭКСПАНСИНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 ФЕВ 2015

005558924

Уфа-2015

005558924

Работа выполнена на кафедре генетики ФГБОУ ВПО Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы и в лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ФГБУН Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Кулуев Булат Разяпович

Кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Боронникова Светлана Витальевна доктор биологических наук, профессор

Заведующая кафедрой ботаники и генетики растений, заведующая научно-

исследовательской лабораторией биологии и генетики ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный

исследовательский университет»

Веселой Дмитрий Станиславович доктор биологических наук

Ведущая организация:

Ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии растений ФГБУН Уфимского института биологии Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН), г. Новосибирск

Защита диссертации состоится « / » 201S г. в « ! & » часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/disovet/zashita

e-mail: molgen@anrb.ru Автореферат разослан « »

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К наиболее важным белкам, обеспечивающим рост клеток растяжением относятся экспансины, в связи с чем эта группа белков все чаше становится объектом исследорания в области молекулярной генетики и физиологии растений,, Экспансины щ ^то белки, способствующие разрыву водородных связей между полимерами клеточной стенки, приводящему к ее релаксации, поступлению воды в центральную вакуоль и увелтенню размера клетки (Lee et al., 2001). Данные о том, что экспансины играют важную роль в росте и развитии растений, подтолкнуло исследователей к поиску их генов, в, р.азных видах растений, определению их роли в регуляции,.катонного растяжения и изучению влияния эктопической экспрессии данных генов на размеры органов растений.

В растительных организмах идентифицировано^ четыре класса белков экспансинов: а-экспансины, Р-экспансины, экспансин-подобные белки А и экспансин-подобные белки В (Шарова, 2007). Количество генов экспансинов носит видоспецифический характер, например, в геноме Arabidopsis thaliana идентифицировано 38 генов экспансинов (Li et al., 2002), в рисе (Оryza sativa) обнаружено 28 а- и Р-экспансинов (Shin et al., 2005), а в томате (Lycopersicum esculentum) найдено 12 генов экспансинов (Arru et al., 2008). На данный момент остается неясным функциональное значение наличия такого большого количества генов экспансинов в геномах растений. Путем использования трансгенных технологии выявлены корреляции между экспрессией генов экспансинов и ростом растительных органов (Cho et al., 2000; Choi et al., 2003; Pien et al„ 2001; Lee et al., 2003). Эксперименты показали, что изменяя экспрессию отдельных генов экспансинов, можно, лолучить трансгенные растения с измененными размерами вегетативных органов^>3£отя. исследования генов экспансинов ведутся довольно интенсивно, основные,механизмы регуляции экспрессии отдельных генов до сих пор не раскрыты. Определение функций тех или иных генов экспансинов, а также молекулярных механизмов регуляции их экспрессии открывает широкие возможности практического применения этих знаний в генной инженерии и биотехнологии растений.

Одним из наиболее удобных модельных объектов генетической инженерии при создании трансгенных растений является табак (Nicotiana tabacum L.). На данный MOMeirr геном табака не секвенирован, однако, у него идентифицировано шесть генов экспансинов, функции которых остаются до сих пор невыясненными. Определение функций данных генов экспансинов могло бы внести ясность в особенности регуляции клеточного растяжения. В практическом плане большой интерес представляет изучение экспансинов тополя, так как это пока единственное древесное растение, геном которого секвенирован. К тому же различные виды тополя, в

частности, тополь черный (Populus nigra L.), являются модельными объектами в лесной биотехнологии при создании трансгенных деревьев с измененным уровнем экспрессии различных генов.

В связи с этим, целью нашего исследования было «пучение вклада отдельных генов экспансинов табака и тополя в регуляцию клеточного растяжения при росте органов растений н создание трансгенных растений табака с измененными размерами органов.

Задачи псследоваппя:

1. Определить уровень транскрипции генов экспансинов NtEXPAI, NtEXPA4 и NtEXPA6 в различных органах табака и под влиянием экзогенных фитогормонов.

2. Создать трансгенные растения табаха с индуцибельной экспрессией гена ARGOS-LIKE A. thaliana и оценить влияние сверхэкспрессии этого гена на уровень транскрипции генов экспансинов табака.

3. Клонировать в бинарных векторах pCambia 1301, pCambia 1305.1 и pER8 гены экспансинов AtEXPAIO A. thaliana. PnEXPAl и РпЕХРАЗ Populus nigra, NtEXPAI, NtEXPAS и NIEXPA6 Nicotiana tabacum.

4. Получить трансгенные растения табака, экспрессирующие гены экспансинов под контролем конститутивных промоторов. каулимовирусов и эстрадиол-индуцибельной транскрипционной системы XVE.

5. Провести сравнительный морфологический анализ полученных трансгенных растений табака. •

Научная новизна. Установлено, что гены экспансинов табака NtEXPAI, . NtEXPA4 и NtEXPAS экспрессируются, преимущественно, в листьях, а экспансина ШХРА6 — в корнях. Цитокинины и ауксины стимулируют транскрипцию генов экспансинов NtEXPAI, N/EXPA4 и NtEXPA6 табака в верхушке побега и в растущих растяжением молодых листьях, а брассиностероиды могут негативно и позитивно ее регулировать в зависимости от органа растения и стадии его онтогенеза. Показано, что ген-регулятор клеточного растяжения A. thaliana ARGOS-LIKE способен регулировать транскрипцию генов экспансинов NtEXPAI, NIEXPA4 и NtEXPAS. Получены и проанализированы трансгенные растения табака со сверхэкспрессией генов NtEXPAI, NtEXPAS и NtEXPA6 N. tabacum и PnEXPAl, РпЕХРАЗ Populus nigra и с индуцибельной экспрессией гена NIEXPA6. Показано, что конститутивная экспрессия генов NtEXPAI и PnEXPAl способствует, в первую очередь, увеличению размеров листьев, а повышенная экспрессия генов NtEXPAS и РпЕХРАЗ влияет, в основном, на длину стебля.

Практическая значимость работы. Знания о взаимодействии генов, белковые продукты которых участвуют в регуляции и осуществлении роста растительных организмов, а также данные об их рецепции, особенностях сигналинга и регуляции экспрессии могут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-ценных растений с измененными размерами органов. Полученные в ходе исследования генно-инженерные конструкции, содержащие гены экспансинов NtEXPAS и РпЕХРАЗ, могут быть предложены для создания траисгенных растений с увеличенной длиной стебля, а гены NtEXPAl и PnEXPAl - для увеличения размеров листьев. Методы создания трансгенных растений с улучшенными ростовыми характеристиками вносят вклад в развитие сельскохозяйственной и лесной биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» (Уфа, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012), II и III Всероссийской школе-хонференщш молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика -наука XX века» (Уфа, 2011; 2012), VI Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии (Уфа, 2011), 11-й Международной междисциплинарной научно-практической конференции «Современные проблемы науки и образования» (Ялта, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 44 рисунка. Включает в себя введение, обзор литературы (глава 1), описание методов исследования (глава 2), результаты нсследовшшя и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы и список литературы (144 источника).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. Б.Р. Кулуеву, сотрудникам лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнолопш ИБГ УНЦ РАН к.б.н. А.В. Князеву, к.б.н. IO.M. Никонорову, а также д.б.н„ профессору кафедры «Генетика» БГПУ им. М. Акмуллы В.Ю. Горбуновой за помощь, оказанную при проведешш исследований н подготовке диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Материалы исследования. Объектами исследования в данной работе являлись растеши табака обыкновенного (Nicotiana tabacum L.) и гены NtEXPAl, NtEXPA4, NtEXPAS и NtEXPAÓ, а также гены PnEXPAl и РпЕХРАЗ тополя черного (Populus nigra) и AtEXPÂlO арабидопсиса (A. thalianá). Целевые гены клонировали из листьев ! A. tháliana экатхта Columbia О, N. tabacum сорта Petit Havana линии SRI и P. nigra.

Методы осследовавпя. Целевые гены NtEXPAl, NtEXPA5, NtEXPAÓ, AtEXPAlO, PnEXPAl, РпЕХРАЗ были амплифицированы из геномной ДНК растений табака, арабидопсиса и тополя методом полнмеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием смеси полимераз Taq/Pfu. Определение нуклеотидных последовательностей амплифнцироваиных генов растений проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенировання «Big Dye Terminator v. 3.0». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощь^,, пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Электропррацию компетентных клеток Agrobacterium tume/aciens проводили при помощи электропоратора фирмы «Bio-Rad» модели Micropulser. Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Gallois, Marinho 1994). Для проведения агробактериальной трансформации были использованы листья N. tabacum сорта Petit Havana линии SRI в возрасте двух месяцев. Для получения трансгенных форм табака применяли штамм AGL0 А. tumefacíais. Из плазмид были использованы Т-вектор pKRX, а также бинарные векторы pCambia 1301, 1305.1 и pERg с геном устойчивости к гигромицину (Cambia, Австралия) и с химерным эстрадиол-индуцибельным активатором транскрипции XVE (Zuo et al.,2000).

Наблюдения за трансгенными растениями поколения Ti осуществляли от стадии появления корешков до получения семян в течение 3-5 месяцев. Растения в течение первых 20 дней культивировали в климатостате при температуре 27°С, с фотопериодоы 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 5000 люкс в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом («Terra Vita», Россия). Далее, вплоть до стадии созревания семян, растения выращивались на светоплощадке при тех же условиях. Для каждого растения после посадки на почву проводили по три замера (через 30, 45 и во время цветения). В каждом варианте было отобрано по шесть растений, у которых измеряли длину трех нижних крупных листьев (первый, второй и третий настоящие листья), а затем вычисляли среднее значение для каждого растения. Длину стебля измеряли в период цветения. Площадь клеток нижнего эпидермиса и мезофилла листьев определяли при

помощи универсального флуоресце1ггного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия). Для оценки морфометрических различий между выборками контрольной и опытной групп растений использовали U-критерий Манна - Уитни.

Количественное определение содержания мРНК (после конверсии в кДНК) целевых генов проводили методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I на термощпслере Rotor-Gene™ 6000 (Coibett Research, Австралия). Для определения возможного влияния повышенной экспрессии генов экспансинов на плоидность трансгенных растений использовали метод подсчета числа хлоропластов в устьичных клетках (Малецкий и др., 2013). Для определения влияния экзогенных фитогормонов на уровень транскрипции целевых генов экспансинов в растениях табака дикого типа использовали следующие концентрации фитогормонов: 6-БАП (6-бензиламинопурин) - 50 мкМ, НУК (нафтилуксусная кислота) - 0,5 мкМ, ЭБ (24-эпибрассинолид) - 0,1 мкМ, ГКЗ (гибберелловая кислота) - 1 мкМ. Через 1,5 часа после опрыскивания вторые и третьи от верхушки побега листья табака замораживали в жидком азоте, выделяли из mix тотальную РНК и строили кДНК.

Работа выполнена частично на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологаи РЦКП «Агадель») и УНУ «КОДИНК».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Роль генов экспапсппов NtEXPAl п NtEXPA4 в рсгуляцпп клеточного растяжения при росте органов табака

Геном табака в настоящее время не секвенирован, но у него идентифицировано 6 генов а-экспансинов (Link et al., 1998), которые получили названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до б, зарегистрированными в Gen Bank нуклеотидными последовательностями AF049350 - AF049355. Вначале была поставлена задача по определению количественного содержания мРНК генов NtEXPAl и МЕХРА4 в , растениях табака дикого типа. При этом было установлено, что, начиная с третьего от верхушки побега листа, уровень транскрипции гена NtEXPAl снижался, а в прекративших рост зрелых листьях почти не детектировался (рис. 1а). Уровень транскрипции гена NtEXPA4 был выше, чем гена NtEXPAl в большинстве анализируемых органов. Наибольшее содержание мРНК гена NtEXPA4 было зафиксировано в молодых листьях и в растущих цветках (рис. 16). Основным отличием от гена NtEXPAl явилось то, что даже в зрелых листьях , мы всегда регистрировали транскрипцию гена NIEXPA4, хотя и на более шоком уровне.

1Г

л ю

И

о 5

ц

в-

\ \ 11 о а

ШЕХРА 1 -Ь

1 2 ШЕХРА4

) 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 1 Количественный анализ уровня транскрипции генов ШЕХРА! (а) и ШЕХРА4 (б) в различных органах табака: 1 - верхушка побега с первым листочком; 2 - верхняя часть стебля без листьев, 3 - второй от верхушки побега лист; 4 - третий от верхушки побега лист; 5 - пятый от верхушки побега лист; 6 - растущий цветок; 7 -зрелый цветок; 8 - корни. По оси ординат здесь и далее приведены значения относительного уровня транскрипции исследуемых генов по отношению к содержанию мРНК гена а-тубулина, которое принято за 100%.

Из литературы известно, что транскрипция генов экспансинов находится под контролем фитогормонов, где важная роль принадлежит ауксинам, цитокининам, брассиностероидам и гиббереллинам (Шарова, 2007). Поэтому большой интерес представляет определение особенностей регуляции транскрипции генов Ы1ЕХРА1 и ШЕХРА4 этими фитогормонами. Как видно из результатов проведенного эксперимента (рис. 2а) под влиянием 6-БАП и НУК во втором от верхушки побега листе уровень транскрипции гена ШЕХРА 1 соответственно повышалась в 1,5 и 3 раза, по сравнению с контролем. В этих же условиях в третьем листе, закончившем свой рост, если 6-БАП, НУК и ГКЗ практически не оказывали влияние на содержание мРНК исследуемого гена, то под влиянием ЭБ зарегистрировано, напротив, снижение уровня содержания транскриптов гена ШЕХРА I в 1,5 раза, по сравнению с контролем (рис. 26). Уровень транскрипции гена ШЕХРА4 во втором листе под влиянием 6-БАП и НУК также повышался в 2 и 19 раз соответственно, по сравнению с контролем (рис. 2в). Интересно, что в третьем листе если НУК практически не оказывал влияния на этот ген (рис. 2г), то он активировался под влиянием 6-БАП и ЭБ. Важно заметить,

что при экзогенной обработке ЭБ содержание мРНК гена ШЕХРА4 повышалось приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем (рис 2г).

г.

ti |£

ц

I I

I»

6 J

NtEXPAl 2-й лист

Койтраю. БАГ1

ШЕХРА4 2-й лист

НУК

ЭЕ

NtEXPAl 3-й лист g

И

II

КотроА БЛП NIEXPA4 3-й лист

НУК

г

псз

44 3-й лист ЗМ>>. j

fi

+-

-ь

Контроль БАЛ

Рисунок 2. Влияние экзогенной обработки фитогормонами на уровень транскрипции генов экспансинов в листьях табака. Здесь и далее данные представлены в виде среднего арифм. ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия Манна - Уитни (п=6; * - р < 0,05).

Ранее у A. thaliana был выделен и изучен ген ARGOS-LIKE, участвующий в регуляции роста клеток растяжением (Ни et al., 2006). Исходя из предположения, что белок ARGOS-LIKJE может принимать участие в регуляции транскрипции генов NtEXPAl и NtEXPA4, нами были созданы трансгенные растения табйка, экспрессирующие ген ARGOS-LIKE A. thaliana под контролем эстрадиол-индуцибельной транскрипционной системы XVE (Zuo et al., 2000). Молекулярный анализ полученных трансгенных растений показал, что в четвертых от верхуШки побега листьях при индуцировании экспрессии гена ARGÓS-LIKE, путем экзогенНоГг обработки эстрадиолом, содержание мРНК гена NtEXPAl повышалось в 1,7 раза, а гена NtEXPA4, наоборот снижалось в 1,2 раза (рис. 3) по сравнению с контрольнымн, необработанными эстрадиолом, растениями.

И >1 «

II

> а

гЕХР!

ЕХР4

Контроль Эстрадная

Рисунок 3. Уровень транскрипции генов экслансинов при индуцибелыюй экспрессии гена АЯвОЗ-ИКЕ. ЕХР1, ЕХР4 - гены ШЕХРЛ1 и ШЕХРА4. Контроль -растения, обработанные 0,1% раствором ДМСО, эстрадиол - растения, обработанные 0,1 % ДМСО с эстрадиолом, 5мкМ

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что исследуемые нами два гена экспансина участвуют в брассиностероид-индуцированной системе регуляции клеточного растяжения и выполняют различные функции. В целом, исходя из наших и литературных данных (Ни ^ а1., 2006; Ие^ е1 а1., 2011), нами было выдвинуто предположение, что экспансии ШЕХРА1 участвует в инициации роста клеток растяжением, а экспансии ШХРА4 необходим, в основном, для более длительного поддержания клеточного растяжения.

Для доказательства влияния гена МЕХРА1 на рост клеток растяжением, нами были получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией исследуемого гена Для морфологического анализа трансгенных по гену МЕХРА1 растений табака были отобраны линии под номерами 1, 6, 7, 8, 11, 13, 15 и 20 с подтвержденным повышенным уровнем экспрессии целевого гена и содержанием единичной копии трансгена. Удлинение листьев в период цветения было характерно для линий 1, 7, 15 и 20 (рис. 4а), по площади листьев также многие трансгенные растения характеризовались их увеличением в среднем от 7% (по сравнению с контролем) у линии 13 до 51% у линии 7, по сравнению с контролем (рис. 46). Достоверное увеличение размеров стебля было зафиксировано для линий 1, 7 и И (рис. 4в). Причем степень увеличения размеров стебля достигала 23% по сравнению с контролем (линия 7). Размеры цветков под влиянием конститутивной экспрессии гена МЕХРА1 не увеличивались (рис. 4г). Линии 1, 7, 11, 15 и 20 характеризовались достоверным увеличением размеров клеток эпидермиса листьев, по сравнению с контролем (рис. 4д). Данные изменения размеров клеток листьев коррелировали с увеличением размеров листьев в линиях 1, 7, 15 и 20. Площадь клеток эпидермиса цветков у опытных растений также возрастала по сравнению с контролем (рис. 4е),

однако увеличения размеров цветков не происходило Отметим, что нами были получены также трансгенные растения с индуцибельной экспрессией гена Ы1ЕХРЛI, однако морфологический анализ не выявил существенных различий в размерах органов и клеток контрольных и опытных растений (данные не представлены). Ген М1ЕХРЛ4, несмотря на многочисленные попытки, клонировать нам не удалось.

Длина листьев. < г!-|

¿1°

¿1

eW ! 6

[+1 г+П

4,

Нп

4л

IXM •'

Длина стебля, см

ГГ

Длина цаеткоя, см

t JOI EXM EJCP1 ЕХР1 Р.Х>1 ЕХР1 F.XPI СХМ ЕХП

Площадь клеток нижнего 7пидерми£», мкм2

гЬ г- Г*!

SRI 1И1 ЕХР1 f.Xf EX PI EXPI EXPI EXPI RXFt EXPI

ПлвШ№ КЛ*ТОК ЭПИЛСрмИСВ ивето». MtjM^

Г+1 гН Г*П

SRI 1JOI EXPI EXPI EXPI EXPI EXPI UUN fcXPl EXP

Рисунок 4. Морфологические параметры трансгенных растений табака в период цветения, сверхэкспрессирующих ген NtEXPAI: SRI - контрольные растения табака дикого типа. 1301 - контрольные трансгенные растения табака, содержащие Т-ДНК бинарного вектора pCambia 1301 без целевого гена. ЕХР1/1-20 - лйнЙи опытных растений табака.

Конститутивная экспрессия гена NtEXPAS в трансгенных растениях табака

Нами были получены трансгенные растения табака, с конститутивной экспрессией гена NtEXPAS, которые ни через 30, ни через 45 дней после акклиматизации к условиям почвы практически не отличались по длине листьев от контрольных растений Однако в период цветения, через 80 - 100 дней после

акклиматизации, листья у опытных растений были длиннее на 10 - 22%, соответственно, их площадь также характеризовалась увеличением на 10 - 21%. По высоте стебля опытные растения были заметно выше контрольных, и разница составляла у линий 4 и 6 - 24%, а у линии 5 - 46%. По длине цветка различия между опытными и контрольными растениями были небольшими и, в целом, составили от 1% у линии 4, до 9% у линий 5 и 6. По форме листьев, стебля и цветков опытные и контрольные растения не различались (рис. 5). Трансгенные по гену ШЕХРА5 растения характеризовались увеличенными размерами клеток эпидермиса листьев. При этом у линии 4 клетки были больше на 57%, у линии 5 - на 51%, а у линии 6 - на 23% крупнее, чем у контрольных растений (рис 5). Повышенная экспрессия гена МЕХРА5 в первую очередь влияла на размеры клеток листьев, причем размеры клеток эпидермиса цветков изменялись в гораздо меньшей степени. Результаты наших исследований показывают, что ген ШЕХРА5 может быть применен для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов, и в особенности для изменения длины стебля, что может иметь практическое значение в биотехнологии растений.

30 дней после пересадки на почву из среды МС

Период цветения

Клетки нижнего эпидермиса листьев (увеличение 200х)

контроль

трансгенные растения с конститутивной экспрессией гена №ЕХРА5

линия 4

линия 5

линия 6

Рисунок 5. Внешний вид трансгенных растений табака и данные микроскопического исследования.

Конститутивная и пндуцибельная экспрессия гена МЕХРА6 Для выяснения роли гена МЕХРА6 в регуляции клеточного растяжения и роста органов растения, нами было определено количественное содержание его мРНК в органах табака дикого типа. Показано, что уровень мРНК гена МЕХРА6 в несколько раз меньше по сравнению с генами N1ЕХРА1 и №ЕХРА4. Лишь в корнях наблюдался довольно высокий уровень мРНК данного гена (рис. 6), однако даже здесь он был ниже, чем у генов МЕХ РА 1 и МЕХРА4 (рис. 1, 6).

При определении влияния фитогормонов на регуляцию экспрессии гена ЛЧЕХРА6 было показано, что во втором от верхушки побега листе транскрипция гена МЕХРА6 повышается лишь под влиянием 6-БАП и НУК (рис. 6). В то же время во втором листе нами зарегистрировано негативное действие ЭБ на уровень содержания мРНК гена Ы1ЕХРА6 (рис. 6). В третьем от верхушки побега листе уровень транскрипции гена МЕХРА6 снижается в среднем в три раза по сравнению со вторым листом.

II

и

Г*1 гЩ пЬ

#

Ж:

щ ¡8

п,п п

ж

корпи 2 лист 2 лист 2 лист 2 лист 2 лист 3 лист 3 лист 3 лист 3 лист 3 лист БАП НУК ЭБ ГКЗ БАП НУК ЭБ ГКЗ

Рисунок 6. Количественный анализ уровня транскрипции гена МЕХРА6 в различных органах табака, а также под влиянием экзогенной обработки фитогормонами. По оси ординат приведет значения относительного уровня транскрипции гена МЕХРАб по отношению к содержанию мРНК гена а-тубулина, которое принято за 100%.

Для изучения вклада гена Ы1ЕХРА6 в регуляцию и обеспечение роста органов табака, нами были созданы трансгенные растения с конститутивной и индуцибельной экспрессией целевого гена. Для изучения конститутивной экспрессии гена МЕХРА6 его клонировали в векторе рСатЫа 1301. Трансгенные растения с единичной копией целевого гена под номерами 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14 и 15 использовались для морфологического анализа. Подсчет количества хлоропластов в устьичных клетках у опытных и контрольных растений, показал, что трансгенные растения являются

диплоидными и несут, как и контрольные, от 14 до 20 хлоропластов на устьичную клетку.

В среднем у всех линий, длина листьев увеличилась на 7,5% по сравнению с контрольными растениями, площадь листьев опытных растений в среднем была больше на 14,1%. Увеличение стебля на 15% было характерно для линии 8, тогда как среднее значение для всех лттй отличалось лишь на 7,5% по сравнению с контролем. Длина цветков трансгенных растений была меньше длины цветков контрольной группы - в среднем на 2,2%, а для линии 6 и 12 разница составила 4,2%. По размерам семенных коробочек особых отличий между контрольными и опытными растениями не наблюдалось. Что касается микроскопического анализа площади клеток эпидермиса венчика цветка, то среднее значение составило 19965,9 мкм2, что несколько превышает показатель контрольной группы (18357,9 мкм2). Эти и другие данные говорят о том, что экспансии №ЕХРА6 хоть и является, вероятнее всего, минорным белком, тем не менее, он все же активно участвует в обеспечении клеточного растяжения наземных органов растения.

Исследование индуцибельной экспрессии гена МЕХРА6 осуществляли при помощи вектора рЕЯ8. Трансгенные растения, содержащие целевой ген под контролем индуцибельного промотора, обрабатывали 20 мкМ раствором эстрадиола (в 0,1% ДМСО), разведенного в дистиллированной воде с добавлением сильвета (0,02%). Контрольные растения обрабатывали 0,1% ДМСО, также с добавлением сильвета, разведенного в дистиллированной воде. Полученные результаты показали, что размеры вегетативных органов трансгенных растений опытной группы оказались несколько меньше трансгенных растений контрольной группы. В среднем длина листьев у опытной группы была меньше на 4,5%, площадь листьев - на 12%, длина стебля - на '6,3%, размер цветков - на 9% по сравнению с контрольной группой. Однако при явном уменьшении размеров наземных органов у опытной группы трансгешшх растений, на микроскопическом уровне довольно часто наблюдалось увеличение размеров отдельных клеток.

Таким образом,,, конститутивная и индуцибельная экспрессия гена МЕХРА6 способствовала увеличению размеров клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных растений табака, однако пропорционального увеличения размеров листьев не происходило, что может быть связано с функционированием различных компенсаторных механизмов, направленных на сохранение размеров органов в пределах физиологической нормы. Таким образом, ген МЕХРАб, в отличие от других исследованных нами генов экспансинов табака, может быть рекомендован для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов только в сочетании с другими генами экспансинов, так как его сверхэкспрессия довольно

часто, вопреки ожиданиям, способствовала уменьшен!но размеров листьев, стебля и цветков.

Коистптутпвнаа экспрессов гена AtEXPAlO в трансгенных растеипях

табака

Дальнейшие наши исследования были связаны с анализом трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих гены экспансинов в гетерологичных условиях. В первую очередь, нами была поставлена задача по клонированию генов экспансинов А. thaliana, сверхэкспрессия которых, по литературным данным, способствует существенному увеличению размеров органов. Именно такимпараметрам соответствует, прежде всего, ген AtEXPAlO (Cho et al., 2000). Планировалось получить трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие ген AtEXPAlO с целью выяснения эффективности его экспрессии в гетерологичных условиях.

Фрагмент молекулы ДНК А. thaliana размером около 1000 п.н., включающий ген AtEXPAlO был амплифицирован и клонирован в векторе pKRX. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что выделенная нами копия гена не содержит нуклеотидных замен и полностью совпадает с теоретически ожидаемой последовательностью. Затем ген AtEXPAlO был вырезан из вектора pKRX по сайту ßsePl и клонирован в модифицированном векторе pCambia 1301 по сайту рестрикции Smal. В ходе агробактериальной трансформации листовых дисков табака целевой генно-инженерной конструкцией <вектора pCambia 1301 с геном AtEXPAlO было отобрано 44. первичных побега. Из iuix укоренились на селективной среде 13 растений, у 10 из которых обнаружилась активность репортерного гена GUS в листьях. Из этих растений шесть были успешно акклиматизированы к условиям почвы и отобраны для дальнейшей работы. Было показано, что все шесть отобранных растений содержат в своем геноме как ген AtEXPAlO А. thaliana, так и 35S промотор. Экспрессия целевого гена в трансгенных растениях табака была доказана при помощи ОТ-ПЦР. Через 30 дней после пересадки на почву трансгенные растения опережали контрольные растения по длине листьев в среднем на 85%, через 45 дней - на 83%, через 60 дней - на 41%, во время цветения - на 33% (рис. 7). Площадь листьев трансгенных растений была больше, чем у контрольных в среднем на 43%, высота стебля - на 29%, длина цветка всего лишь - на 9%, сырая масса растения — на 41%. В целом, наиболее заметным было увеличетше размеров листьев у трансгенных растений по сравнению с контролем. Визуальной разницы между размерами цветков контрольных и опытных растений не наблюдалось, в отличие от листьев и стеблей.

30 дней 45 дней 60 дней период цветения

Рисунок 7. Размеры листьев анализируемых линий табака в разные периоды времени.

При помощи микроскопического анализа было показано, что площадь отдельно взятых клеток эпидермиса листьев трансгенных по гену АгЕХРАЮ растений в среднем была больше на 18%, а средняя площадь листьев больше на 43%, чем у контрольных растений. Площадь клеток палисадного мезофилла у трансгенных растений была больше в среднем на 24% по сравнению с контрольными растениями. Это свидетельствует о том, что причиной увеличения размеров листьев опытных растений было не только увеличение размеров клеток, но и их количества.

В результате проведенных исследований нами было показано ощутимое влияние сверхэкспрессии гена А1ЕХРА10 на размеры вегетативных органов трансгенных растений табака Несмотря на то, что данный ген был выделен из А. IкаНапа, он также оказался эффективным в трансгенных растениях табака, что объясняется наличием гомологов гена А1ЕХРАЮ в геноме табака и высоким уровнем консервативности генов экспансинов. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что ген АгЕХРА 10 может быть использован в качестве целевого для создания трансгенных растений с увеличенными размерами листьев

Клонирование и нсследованне гена экснансина РпЕХРА! тополя черного

Участок ДНК, содержащий полноразмерный ген РпЕХРА/, был амплифицирован из геномной ДНК тополя черного, и его размер составил около 2000 п.н. Ампликон был клонирован в векторе рКЮС и секвенирован, причем было показано отсутствие замен нуклеотидов (АУ4350991). Целевой ген РпЕХРА1 был вырезан из вектора рКЯХ по сайту Яле/Ч и обработан Т4-ДНК-полимеразой для формирования «тупых» концов. Далее в бинарный вектор рСатЫа 1301 по сайту 5»ш! осуществили ненаправленное клонирование целевого гена за З'-концом 358

промотора. Бинарные векторы с геном PnEXPAI были внедрены в клетки А. tumefaciens и произведена агробактериальная трансформация листовых дисков табака В результате трансформации было получено 63 растения, из которых успешно укоренились 19, которые окрашивались в синий цвет при инкубации в субстрате х-gluc за счет проявления активности репортерного гена GUS. Во время выращивать на почве было замечено, что, по крайней мере, две линии трансгенных растений отличались увеличенными размерами листьев, по сравнению с контрольными. Через 30 дней после акклиматизации трансгенные растения в среднем опережали контроль по длине листьев на 53%, через 45 дней - на 60%, через 60 дней - на 24%, и в период цветения - на 21% (рис 8).

20 18 -16

г И rf 12 s 10 § 86

4 -2 0

30 лней

□ контрольные

растения ■ трансгенные растения

45 дней

Рисунок 8. Размеры листьев трансгенных растений табака в разные периоды времени. -<• ...„

Площадь листьев трансгенных растений была больше, чем у контрольных в среднем на 37%, высота стебля - на 16%, длина цветка - на 9%, сырая масса растения - на 23%

Микроскопическое исследование площади клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных растений, с повышенной экспрессией гена РпЕХРА/, показало увеличение размеров отдельно взятых клеток на 53% (рис. 9).

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

контрольные растения трансгенные растения

Рисунок 9. Размеры клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных линий с конститутивной экспрессией гена PnEXPAI.

В отличие от гена AtEXPAlO, в случае с геном PnEXPAI размеры клеток у трансгенных растений были гораздо больше, и именно стимулирование роста клеток растяжением было определяющим в увеличении размеров органов. Увеличение количества цветков у изученных нами линий трансгенных Табаков по сравнению с контрольными растениями подтверждает тот факт, что экспансины, как это было показано ранее, участвуют в закладке зачатков органов (Fleming et al., 1997).

Таким образом, ген экспансина тополя черного PnEXPAI также может быть использован в качестве целевого при создании трансгенных растений с увеличенными размерами листьев.

Морфофнзпологический анализ трансгенных растений табака, с повышенной экспрессией гена РпЕХРАЗ

Фрагмент ДНК, содержащий полноразмерный ген РпЕХРАЗ был амплифицирован из геномной ДНК тополя черного, размер ампликона составил около 1500 п.н. Ампликон был клонирован в векторе рКЮС и секвенирован. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что выделенная нами копия гена совпадает с теоретически ожидаемой (АУ435101.1) Клоны, содержащие векторы с целевым геном в смысловой ориентации использовались для агробактериальной трансформации табака и получения трансгенных растений. С генно-инженерной конструкцией рСатЫа 1305.1/РпЕХРАЭ было получено 16 первичных трансгенных побегов, девять из которых были акклиматизированы к условиям почвы. Из данных растений была выделена геномная ДНК и проведен ПЦР-анализ на наличие гена РпЕХРАЗ и 355 промотора. От этих растений были собраны семена с целью получения второго поколения трансгенных растений и проведения морфологического

анализа. Семена трех линий растений второго поколения были высеяны на селективную среду, а затем пересажены на почву В качестве контроля использовали линию трансгенных растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора без целевого гена (рСашЫа 1305.1). По длине листьев трансгенные и контрольные растения после пересадки на почву практически не различались ни через 30, ни 45 дней, ни в период цветения (рис. 10). По площади листьев трансгенные растения также не превышали ко1ггрольные растения.

25

20,.-

2 15

и

се" X 10

§

5

0

■ д .-:•;

■ -"'

ёвШШ Ш

контрольные трансгенные трансгенные грансгенные растения растения линии растения линии растения линии №5 №7

№9

Рисунок 10. Размеры листьев трансгенных растении, с повышенной экспрессией гена РпЕХРАЗ.

В то же время по высоте стебля опытные растения были заметно выше контрольных, и разница составила для линии 5 - 23%, линии 7 - 20%, линии 9 - 26% (рис 11). По длине цветка различий также не наблюдалось.

120

контрольные трансгенные трансгенные тр^нсгенные растения растения растения растения

линии №5

линии №7

лийии Х«9

Рисунок 11. Длина стебля трансгенных растений с повышенной экспрессией гена РпЕХРАЗ.

Траисгенные по гену РпЕХРАЗ растения в отличие от контрольных характеризовались увеличенными размерами клеток эпидермиса листьев. При этом у линии 5 клетки в среднем были больше на 60%, линии 7 на 62%, линии 9 на 74% крупнее, чем у контрольных растений (рис. 12).

35000

30000

'г

ж г 25000

л

1 20000

3

о с; 15000

С

10000

5000 -

контрольные трансгенные трансгенные трансгенные растения растения растения растения линии №5 линии №7 линии №9

Рисунок 12. Размеры клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных линий с конститутивной экспрессией гена РпЕХРАЗ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что конститутивная экспрессия гена РпЕХРАЗ в первую очередь стимулирует рост стебля в длину, а на рост листьев практически не влияет. Все полученные трансгенные растения отличались увеличенными размерами клеток эпидермиса и паренхимы листьев. В среднем размеры клеток увеличивались на 60%, при этом размеры листьев у анализируемых растений оставались в пределах нормы. Следовательно, ген РпЕХРАЗ может быть использован в качестве целевого при создании трансгенных растений с увеличенными размерами стебля.

***

Таким образом, в ходе проведенных нами исследований было установлено, что повышенная экспрессия генов экспансинов табака и тополя приводит к увеличению размеров клеток и вегетативных органов модельных растений табака, при этом уровень транскрипции отдельных генов экспансинов существенно отличается в зависимости от органа и регулируется фигогормонами Полученные данные говорят о том, что изученные нами гены могут быть использованы в качестве целевых при создании трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Однако следует отметить, что их влияние может быть ограничено возрастом растения и состоянием его органов, когда стенки клеток перестают быть чувствительными к действию таких

белков, как экспансины. Их воздействие на рост растений также может сдерживаться внутренними компенсаторными механизмами, направленными на поддержание роста в целом и размеров органов в частности, в пределах физиологической нормы. В связи с вышесказанным, в этом направлении исследований существует необходимость поиска и изучения других генов-регуляторов роста и развития растения, ответственных, к примеру, за регуляцию клеточной пролиферации, эндоредупликации и др. Представляется необходимым также при создании трансгенных растений использование не только конститутивных, но и тканеспецифичных и индуцибелыгых промоторов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что наиболее высокий уровень транскрипции генов экспансинов табака наблюдается в верхушке побега и расположенных рядом наиболее молодых листьях, при этом ген МЕХРА1 преимущественно экспрессируется в первом и во втором листе, ген ШЕХРА4 в третьем, а ген МЕХРА6 в корнях и верхушке побега.

2. Показано, что цитокинины и ауксины стимулируют транскрипцию генов экспансинов табака МЕХРА1, ШЕХРА4 и МЕХРА6 в верхушке побега и в растущих растяжением молодых листьях, тогда как брассиностероиды способствуют снижению уровня транскрипции генов МЕХРА1 и ШЕХРА6 в этих молодых листьях, но стимулируют транскрипцию гена МЕХРА4 в третьих от верхушки побега листьях.

3. Установлено, что конститутивная экспрессия генов экспансинов МЕХРА1, МЕХРА5, МЕХРАб, А1ЕХРА10 и РпЕХРА1 способствует увеличению размеров органов трансгенных растений табака.

4. Показано, что трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие гены экспансинов МЕХРА1, МЕХРА5, МЕХРАб, А1ЕХРА10, РпЕХРАI и РпЕХРАЗ отличаются от контрольных существенным увеличением размеров клеток, при этом конечные размеры органов могут изменяться в меньшей степени за счет компенсаторных механизмов, направленных на уменьшение количества клеток, приходящихся на один орган.

5. Установлено, что сверхэкспрессия генов А1ЕХРАЮ, РпЕХРАI и ШЕХРА1 оказывает наибольшее влияние на рост листьев, а трансгены РпЕХРАЗ и МЕХРА5 преимущественно способствуют увеличению высоты стебля.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах Hi перечня ВАК:

1.Кулуев, Б.Р. Влияние конститутивной экспрессии mia ARGOS-LIKE на размеры клеток и органов трансгенных растений табака / Б.Р.-Кулусв^АВ Князев, ! М Г ■ Сафиуллииа // Генетика. - 2013. - Т.49. - №5. - С. 587-594.. , . ., , . I.. -2. Кулуев,-,, Б.Р. Морфологический анализ трансгенны*, растений репрессирующих ген РпЕХРАЗ тополя черного / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина. А.В. Князев // Онтогенез. - 2013. - Т. 44. - №. 1. - С. 34-41.

3. Кулуев, Б.Р. Влияш1е эктопической экспрессии гена NtEXPAS на размеры клеток и рост органов трансгенных растений табака / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина. А.В. Князев // Онтогенез. - 2013. - Т. 44. - С. 166-173;

Статьи я тезисы:

1. Сафиуллина М.Г. Создание трансгенных растений табака с эктопической экспрессией' генов AtEXPIO и PnEXPAl // Материалы 11-^ Международной междиецнплинарной научно-практической конференции «Современные проблемы нау£й и образования»Ялта. - 2011.-С. 169-170.

'■■ 2\ Кулуев,- Б.Р: Создание трансгенных растений табака экспрессирующих ген РпЕХРАЗ тополя черного / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина. А.В. Князев // Материалы VI Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образованиям области био- и органической химии и биотехнологии». - Уфа. - 2011. -С. 107-108.,

3. Сафиуллина. М.Г. Конститутивная экспрессия гена NtEXPAS под контролем 35S промотора / М.Г. Сафиуллина. Б.Р. Кулуев // Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов». - Уфа. — 2012. — С. 145-147.

4. Сафиуллина. М.Г. Морфологический анализ трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих экспансины / М.Г. Сафиуллина. Б.Р. Кулуев // Материалы Всероссийской "молодёжной конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки». - Уфа. - 2012. - С. 58-59.

5. Кулуев, Б.Р. Морфофизиологическая характеристика трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих ген ARL арабидопсиса / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина. Я.П. Лебедев, Е.В. Михайлова // Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН «Биомика». - Уфа. - 2011. - Т.2. - №2. - С. 62-63.

6. Сафиуллина. М.Г. Получение трансгенных растений табака с эктопической экспрессией гена РпЕХРАЗ тополя черного / М.Г. Сафиуллина. Б.Р. Кулуев, Я.П. Лебедев // Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН «Биомика». - Уфа. - 2011. - Т.2. -№2.-С. 113-114.

7. Сафиуллина. М.Г. Амплификация и клонирование генов NtEXPAl и NtEXPA6 табака / М.Г. Сафиуллина. А.М. Хасанова, Л.Р. Хасанова, Б.Р. Кулуев // Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН «Биомика». - Уфа. - 2012. - Т.З. - №1. - С.91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота 6 - БАП - 6-бензиламинопурин БР - брассиностероиды ГКЗ - гибберелловая кислота ДМСО - диметилсульфоксид ИУК - индол-3-уксусная кислота НУК — нафтилуксусная кислота

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭБ - 24-эпибрассинолид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ARGOS-LIKE - ген-регулятор клеточного растяжения Arabidopsis thaliana AtEXPAlO-тт экспансинаЛ. thaliana СКХ — цитокининоксидаза

ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4 - рецепторы этилена GID1 - рецептор гиббереллинов

NtEXPAl, NtEXPA2, NtEXPA3, NtEXPA4, NtEXPA5, MEXPA6- гены экспансинов табака (Nicotiana tabacum)

PnEXPAl, PnEXPA2, РпЕХРАЗ - гены экспансинов тополя черного (Populus nigra)

TIR1 - рецептор ауксина

XVE — эстрадиол-индуцибельный активатор транскрипции

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ № 383, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.