Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические аспекты системной индуцированной устойчивости к вирусным болезням у растений семейства Solanaceae Juss

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожнова, Наталья Анатольевна, Уфа

,<\./ , ¿7 п ,, С; .ч ... л '

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ОТДЕЛ БИОХИМИИ И ЦИТОХИМИИ

На правах рукописи УДК 581.1:581.2:632.938.2:632.953

Рожнова Наталья Анатольевна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СИСТЕМНОЙ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ВИРУСНЫМ БОЛЕЗНЯМ У РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА ЗОЬАШСЕАЕ ЛЖ.

03.00.12 - физиология растений

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н., Г.А. Геращенков

Научный консультант: к.б.н., Ш.Я. Гилязетдинов

Уфа - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1О

1.1. Перспективы селекции и генной инженерии в создании устойчивых к вирусам форм растений. 10

1.2. Системная индуцированная устойчивость растений

при вирусной инфекции. 13

1.3. О роли стресс-метаболитов растений в активации

индуцированной устойчивости. 16

1.4. Роль фитогормонов в метаболических изменениях при вирусной 19 инфекции.

1.5. Лектины как факторы антивирусной устойчивости. 22

1.6. Защитные белки растений при вирусной инфекции. 25

1.7. Участие активных окислителей и биоантиоксидантов в развитии резистентности растений к вирусным болезням. 27

1.8. Активаторы системной индуцированной устойчивости

к вирусному поражению растений. 29

1.8.1. Арахидоновая кислота. 3 О

1.8.2. Эмистим. 32

1.8.3. Альфа-токоферола ацетат. 33

1.8.4. Убихинон 50. 33 Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 5

2.1. Объекты исследований. 3 5

2.1.1. Растения. 35

2.1.2. Вирусы. 36

2.1.3. Индукторы антивирусной устойчивости липидной природы. 3 7

2.2. Модельные системы испытания препаратов

на противовирусную активность. 37

2.3. Обработка индукторами устойчивости и инокуляция вирусами растений табака и картофеля. 3 8

2.4. Метод количественного определения вирусов. 40

2.5. Подсчет числа некрозов и определение концентрации ВТМ. 40

2.6. Экстракция и иммуноферментный анализ фитогормонов. 41

2.7. Экстракция белков и определение гемагглютинирующей активности. 41

2.8. Экстракция водорастворимых белков. 43

2.9. Электрофорез белков в 10 %-ном ПААГ в неденатурирующих условиях. 45

2.10. Электрофорез белков в 10-13%-ном ПААГ в присутствии ДДС-

Na. 46

2.11. Изоэлектрическое фокусирование белков. 47

2.12. Статистическая обработка. 48

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ 49

3.1. Скрининг иммуностимулирующей активности препаратов липид-

ной природы на растениях табака и картофеля. 49

3.1.1. Определение активных концентраций исследуемых соединений с иммуностимулирующим эффектом. 49

3.1.2. Эффективность действия активаторов защитных реакций на табаке. 56

3.1.3. Динамика накопления фитовирусов в растениях

картофеля in vitro при прединфекционной обработке препаратами. 63

3.2. Динамика содержания фитогормонов при действии индукторов устойчивости в процессе развития вирусных инфекций. 65 3.2.1. Содержание фитогормонов в изолированных листьях гиперчувствительного табака. 65

3.2.2. Анализ содержания фитогормонов в растениях картофеля in

vitro. 71

3.3. Изучение гемагглютинирующей активности при формировании индуцированной антивирусной устойчивости. 76

3.3.1. Лектиновая активность в листьях табака. 76

3.3.2. Гемагглютинирующая активность белков в растениях

картофеля in vitro. 81

3.4. Молекулярная характеристика белков исследуемых фитовирусов. 84

3.5. Изучение белков растений при формировании системной антивирусной устойчивости. 84

3.5.1. Белковые спектры листьев табака при формировании системной антивирусной устойчивости. 86

3.5.1.1. Гель-электрофорез белков интактных листьев табака в недена-турирующих условиях. 86

3.5.1.2. Гель-электрофорез белков интактных листьев табака в денатурирующих условиях. 89

3.5.1.3. Изоэлектрофокусирование белков интактных листьев табака. 93

3.5.2. Белки растений картофеля in vitro при формировании системной антивирусной устойчивости. 98

3.5.2.1. Гель-электрофорез белков растений картофеля in vitro в неде-натурирующих условиях. 98

3.5.2.2. Гель-электрофорез белков растений картофеля in vitro в денатурирующих условиях. 101

3.5.2.3. Исследование изоформ пероксидазы картофеля. 104 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 113 ВЫВОДЫ 124 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 126 ПРИЛОЖЕНИЯ 153

Список сокращений и обозначений

АБК - абсцизовая кислота

ИУК - индолилуксусная кислота

ЦК - цитокинины

ВТМ - вирус табачной мозаики

ХВК - X вирус картофеля

УВК - У вирус картофеля

МВК - М вирус картофеля

ИФА - иммуноферментный анализ

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

СИУ - системная индуцированная устойчивость

АК - арахидоновая кислота

ГА - гемагглютинирующая активность

ПААГ - полиакриламидный гель

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Использование иммуностимуляторов, способных индуцировать устойчивость к различным возбудителям болезней, является одним из важнейших направлений в современной физиологии и защите растений. Это особенно актуально в связи с тем, что ущерб, наносимый вирусными болезнями растениеводству, довольно велик и составляет, по разным оценкам, от 10 до 89% [1,2]. Таким образом, создание препаратов с широким спектром защитного действия позволит решить проблему комплексной защиты растений одновременно от патогенов разной природы. В связи с этим теоретический и практический интерес представляет изучение механизмов формирования системной индуцированной устойчивости при действии новых активаторов защитных реакций на моделях растений с разными типами иммунного ответа при вирусных инфекциях. Классическими объектами при изучении приобретенной устойчивости являются представители семейства БоШпасеае А^я., а именно, табак сорта Самсун N14, обладающий локусом некрозообразования и способный реагировать гиперчувствительно на ВТМ-инфекцию или действие индукторов и картофель сорта Невский, несущий ген Я (резистентности).

Синонимами системной индуцированной устойчивости, используемыми в настоящее время в литературе, являются такие термины как "иммунизация", "сенсибилизация", "приобретенная устойчивость", "вакцинация", или "перекрестная защита" (последний термин понимается как защита от патогена в результате прединфицирования растительных тканей слабопатогенными штаммами) [3]. Индукторы устойчивости в сверхмалых концентрациях активируют защитные механизмы растений в качестве аналогов эндогенных сигнальных соединений. Соответственно, актуальным является изучение, с одной стороны, общих механизмов формирования приобретенной устойчивости на генетически разных моделях растений и, с другой, физиологического действия новых активаторов устойчивости липидной природы против вирусных патогенов.

Цель данной работы состояла в изучении механизмов защитного действия новых иммуностимуляторов и оценки их эффективности в индукции устойчивости к вирусным инфекциям.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Скрининг иммуностимулирующей антивирусной активности арахидо-новой кислоты, эмистима, альфа-токоферола ацетата, убихинона 50 и композиции двух последних соединений на растениях сверхчувствительного табака и относительно устойчивого к вирусам картофеля;

2. Изучение динамики формирования и сохранения антивирусной устойчивости, индуцированной исследуемыми препаратами;

3. Анализ динамики изменения концентраций фитогормонов у модельных форм табака и картофеля в процессе формирования локальной и системной устойчивости, индуцированной вирусными патогенами и действием экзогенных активаторов устойчивости;

4. Изучение гемагглютинирующей активности белков при формировании локальной и системной индуцированной устойчивости у табака и картофеля;

5. Изучение молекулярных спектров тотальных белков, а также изофер-ментного состава пероксидазы и эстеразы при развитии вирусных инфекций и формировании системной индуцированной устойчивости.

Научная новизна. Впервые в модельных системах растений семейства пасленовых обнаружена иммуностимулирующая антифитовирусная активность альфа-токоферола ацетата, убихинона 50 и их эквимолярной композиции. Установлены диапазоны их оптимальных концентраций и эффекты пролонгированного действия.

Установлено, что в ходе формирования индуцированной локальной и системной устойчивости у растений табака и картофеля наблюдаются сходные изменения в балансе эндогенных фитогормонов, которые сдвинуты во времени в связи с различием типов устойчивости к вирусным болезням. Показано, что предобработка растений до инфицирования индукторами устойчивости не

только ингибирует репродукцию вирусов растениями, но способствует уменьшению изменений в содержании отдельных фитогормонов.

Показано, что развитие устойчивости к вирусам, индуцированной эмисти-мом, арахидоновой кислотой, альфа-токоферола ацетатом и убихиноном 50 в растениях табака и картофеля, сопровождается повышением гемагглютини-рующей активности белков, свидетельствующей о вовлеченности лектинов в формирование системной индуцированной устойчивости к вирусам.

На основании анализа белковых спектров высказано предположение о наличии у растений табака и картофеля альтернативных путей сигнальной транс-дукции, обеспечивающих формирование системной устойчивости, индуцированной вирусной инфекцией и активаторами защитных реакций.

Практическая ценность. Альфа-токоферола ацетат и убихинон 50, как индукторы устойчивости растений к вирусным патогенам, могут использоваться в создании композиций с другими активаторами защитных реакций с целью расширения спектра действия и стабилизации препаративных форм, в том числе арахидоновой кислоты и эмистима.

Модельная система "сверхчувствительный табак - ВТМ" рекомендуется для ускоренного предварительного скрининга природных и синтетических индукторов системной устойчивости так же к возбудителям грибных и бактериальных болезней.

Положение, выносимое на защиту. На основании анализа всех экспериментальных данных высказано предположение о наличии у растений табака и картофеля альтернативных путей формирования системной устойчивости, специфически активируемой вирусной инфекцией и индукторами защитных реакций.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 3-ем ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Москва, 1997), Международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 254 работы отечественных и зарубежных авторов и приложения. Работа изложена на 152 страницах, содержит 1 таблицу, 26 рисунков в основной части и 30 иллюстраций в приложении.

Экспериментальная часть работы была выполнена в Отделе биохимии и цитохимии Уфимского научного центра, ИОГен РАН (г.Москва), Институте картофельного хозяйства РАСХН (Коренево Моск. обл.). Автор благодарит сотрудников этих институтов д.б.н., профессора Виталия Анатольевича Пухаль-ского, к.б.н. Татьяну Игоревну Одинцову, к.б.н. Эмму Николаевну Андрееву, к.б.н. Сайда Минахметовича Мусина, к.б.н. Александра Валентиновича Бабо-шу, за ценные замечания и полезные советы в процессе обсуждения данной работы.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вирусные инфекции поражают все растительное царство и их широкое распространение наносит существенный ущерб сельскому хозяйству, который по разным оценкам, составляет от 10 до 89% [1, 2]. Это вызывает необходимость разработки стратегий борьбы с патогенными вирусами растений по следующим направлениям:

1. Использование технологий классической селекции для создания сортов и форм, высокоустойчивых к вирусным болезням [4];

2. Создание устойчивых к вирусным болезням форм на основе генно-инженерных и биотехнологических подходов [5];

3. Внедрение высокоэффективных модуляторов защитных реакций растений, активирующих механизмы системной индуцированной устойчивости против вирусных болезней [3, 6].

Последняя из этих стратегий стала находить воплощение в практике сельского хозяйства лишь в последние годы. Так, в России внедрен новый коммерческий препарат "иммуноцитофит" - обогащенный препарат арахидоновой кислоты, выделяемый из суперпродуцентов микроорганизмов [7]. За рубежом корпорацией "С1Ьа-Ое1§у" создан препарат "Бион", относящийся к новому классу фиторегуляторов - активаторов защитных реакций. В представленном обзоре литературы дана оценка состояния проблемы индуцированной устойчивости к вирусным болезням и рассмотрены актуальные направления ее решения.

1.1. Перспективы селекции и генной инженерии в создании устойчивых к вирусам форм растений

Наиболее перспективным способом защиты растений в настоящее время считается создание трансгенных форм, устойчивых к вирусным инфекциям [5].

Именно генная инженерия позволяет создавать формы растений с высокой устойчивостью к некоторым из вирусов [8-10], а в некоторых случаях удается создать трансгенные формы с широким спектром антивирусной устойчивости [11].

Для создания трансгенных форм используют разные методы, в том числе, введение генов белка оболочки вируса [8], генов, кодирующих репликазу [9], гена транспортного белка вируса [10], другие последовательности РНК вирусов [11], а также генов многих растений или животных [8]. Устойчивость к вирусам можно индуцировать внесением генов, кодирующих рибозимы, способные расщеплять РНК вирусов, в обычной или антисмысловой ориентации [12]. Полевые испытания трансгенных томатов [13] и картофеля [14] с антивирусной устойчивостью, как правило, демонстрируют эффективность подобной защиты

[15].

Эти успехи позволили говорить о создании нового направления - иммунотерапии вирусных болезней на основе "генетической иммунизации" растений

[16]. Тем не менее, полагают, что сами трансгенные растения могут представлять определенную опасность для диких форм растений. В настоящее время возможный риск при коммерческом использовании трансгенных форм связывают, главным образом, с экспрессией генов белков оболочки вирусов [8, 11]. Кроме того, вновь созданные сорта часто служат благоприятным фоном для гиперэволюции новых вирусных изолятов [17]. В этом случае полагают, что в трансгенных растениях может происходить трансдукция генов белка оболочки вирусов [5]. Это явление наблюдали в растениях трансгенной репы между вирусом мозаики цветной капусты и соответствующим трансгеном, локализованным в растительной хромосоме [18]. Кроме того, устойчивость обычно ограничена только тем вирусом, ген оболочки которого трансформирован в донорное растение, причем она может быть настолько специфической, что проявляется лишь для мутантной формы вируса и оказывается неэффективной против вируса дикого типа, если введен ген белка оболочки этого мутантного вируса [19]. Однако конститутивная защита в трансгенных растениях, обеспечиваемая од-

ним геном, намного уже, чем защита, обеспечиваемая механизмами системной индуцированной устойчивости, и степень такой устойчивости менее значима. Системная индуцированная устойчивость является результатом концертиро-ванной экспрессии комплекса PR-генов, а не функцией одного из генов. Таким образом, изучение молекулярных механизмов формирования системной индуцированной устойчивости и идентификация генов, вовлеченных в сигнальную трансдукцию при индуцибельной защите, представляются новой точкой пересечения стратегий защиты растений на основе генной инженерии и иммунизации растений [20].

Безусловно, селекция и конструирование вирусоустойчивых форм растений является самым радикальным и перспективным методом защиты растений. Тем не менее, традиционная селекция и генная инженерия не всегда эффективны из-за длительности выведения и недолговечности существования новых устойчивых сортов и форм растений [21]. Так, если прежде выведенные сорта сохраняли свою устойчивость в течение десятилетий, то в настоящее время они вновь поражаются этими болезнями уже через 5-7 лет [22]. Зачастую это сводит на нет многолетнюю работу селекционеров.

С другой стороны, успех селекционной работы в значительной степени зависит от наличия доноров генов устойчивости и достигнутого методического уровня исследований при создании перспективных форм [23]. Часто оптимизм прогнозов в отношении селекции оказывается преждевременным. Так, в 1990 г. с использованием метода экспертных оценок (метод Delphi) был составлен прогноз тенденций развития защиты растений на перспективу до 1997 и 2007 гг. [24]. Специалисты оценивали пути селекции культурных растений на устойчивость к гербицидам, вредителям и возбудителям болезней, а также использование в растениеводстве регуляторов роста. Прогнозировалась малая вероятность успешной селекции в ближайшие 10-20 лет сортов зерновых культур