Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и изучение полиморфизма генов-гомологов Sus4 и Rx1 у представителей рода Solanum секции Petota

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и изучение полиморфизма генов-гомологов Sus4 и Rx1 у представителей рода Solanum секции Petota"

На правах рукописи

Борис Ксения Витальевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ-ГОМОЛОГОВ SVS4 И RX1 У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА SOLANUM СЕКЦИИ РЕТОТА

(У

03.02.07 - генетика I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005544859

Москва - 2013

005544859

Работа выполнена в группе молекулярных методов анализа генома лаборатории генетической инженерии растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кочиева Елена Зауровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ежова Татьяна Анатольевна Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, профессор кафедры генетики

кандидат биологических наук Мельникова Наталия Владимировна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук г. Новосибирск

Защита состоится «12» декабря 2013 г. в 15.00 ч. на заседании диссертационного совета Д.002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, 3. www.vigg.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте института. Автореферат разослан «//» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Синелыцикова Т. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Картофель {Solatium tuberosum L.) принадлежит к семейству Solanaceae и является важнейшей сельскохозяйственной культурой. Российская Федерация занимает ведущие позиции по объемам производства картофеля (http://faostat.fao.org). Потери урожая картофеля вызывает воздействие целого ряда фитопатогенов, борьба с которыми является важнейшей и до сих пор нерешенной задачей. Помимо этого, большое значение имеет изучение факторов, влияющих на качество урожая картофеля, а именно содержание и состав углеводов в клубнях, основным из которых является крахмал.

В последние годы значительное внимание уделялось исследованию генов углеводного метаболизма картофеля. Был выявлен ряд локусов количественных признаков (QTL), связанных с накоплением и транспортом углеводов у картофеля (Li et al., 2008, 2010). Одним из них является ген Sus/SuSy, кодирующий фермент сахарозосинтазу, обеспечивающий обратимое расщепление сахарозы на УДФ-глюкозу и фруктозу, которые необходимы для синтеза крахмала в клубнях картофеля и являются основными запасными сахарами плодов томата. Показано также, что сахарозосинтаза вовлечена в ответные реакции растения на абиотический стресс, в том числе осмотический, анаэробный и температурный (Dejardin et al., 1999; Kleines et al., 1999; Liu et al., 2013). Однако, несмотря на важность этого фермента, на данный момент из всех представителей Solanaceae известны последовательности генов сахарозосинтазы только картофеля (S. tuberosum) и томата (5. lycopersicum). Полиморфизм генов сахарозосинтазы у представителей Solanaceae практически не изучен, отсутствуют данные об аллельном разнообразии гена и о численности данного семейства генов у видов Solarium секции Petota. Изучение вариабельности генов сахарозосинтазы у различных представителей семейства может прояснить общие вопросы, связанные не только с углеводным метаболизмом растений, но и с устойчивостью к абиотическому стрессу.

Одним из факторов, влияющих на урожайность картофеля и качество получаемой продукции, является зараженность посевов различными вирусными болезнями, при этом потери урожая могут достигать 70% (Анисимов и др., 2009). Одним из вредоносных является X вирус картофеля (PVX), поражающий надземные части растения. Несмотря на существенные потери от вирусных инфекций на сегодняшний день не существует надежных химических методов борьбы с ними. Наиболее перспективным методом является получение растений картофеля, несущих гены устойчивости к патогенным вирусам. Однако устойчивость современных сортов картофеля постепенно преодолевается новыми штаммами вируса в ходе коэволюции растение-вирус. Поэтому большое значение приобретает поиск новых источников генов устойчивости к X вирусу, которыми могут стать дикорастущие виды картофеля. Идентификация новых генов устойчивости к X вирусу и изучение их полиморфизма у этих видов может не только прояснить

ряд вопросов формирования ответной реакции растений на воздействие вирусной инфекции, но и способствовать селекции новых, более устойчивых к вирусам сортов. Следует отметить, что на сегодняшний день известны последовательности генов устойчивости к X вирусу только у двух образцов — S. tuberosum и S. acaule. Однако нет данных о полиморфизме этих генов у других представителей Solanum секции Petota, в том числе видов и образцов устойчивых к PVX.

Помимо идентификации генов сахарозосинтазы и генов устойчивости к PVX у дикорастущих видов картофеля, которые могут стать источниками ценных хозяйственных признаков, и изучения вариабельности их последовательностей, интерес представляет также изучение возможной эволюции данных генов у представителей Solanum и их использование для изучения филогенетических отношений в пределах рода Solanum.

Цели и задачи исследования. Целями работы стали идентификация генов сахарозосинтазы и генов устойчивости к X вирусу картофеля у широкого круга представителей рода Solarium секции Petota, а также изучение внутривидового и межвидового полиморфизма данных генов. Для достижения данных целей были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать и секвенировать гены-гомологи сахарозосинтазы Sus4 у видов рода Solanum секции Petota.

2. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей клонированных генов сахарозосинтазы представителей рода Solatium секции Petota. Охарактеризовать их экзон-интронную структуру и основные функциональные белковые домены.

3. Изучить внутривидовой полиморфизм фрагмента сахарозосинтазного домена гена Sus4 у сортов картофеля {S. tuberosum) отечественной и зарубежной селекции с различным содержанием крахмала в клубнях.

4. Провести анализ межвидового полиморфизма фрагментов сахарозосинтазного и глюкозилтрансферазного доменов генов-гомологов Sus4 у широкого круга представителей семейства Solanaceae. На основании полученных данных составить схему возможной эволюции данного гена у представителей семейства Solanaceae.

5. Клонировать и секвенировать гены-гомологи Rxl, определяющего устойчивость к PVX у видов рода Solanum секции Petota.

6. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Rxl генов у представителей рода Solanum секции Petota. Охарактеризовать их экзон-интронную структуру и основные функциональные белковые домены.

7. Провести оценку внутри- и межвидового полиморфизма NBS домена генов-гомологов Rxl у видов Solanum секции Petota и сортов S. tuberosum отечественной и зарубежной селекции методом EcoTILLING.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получены полные кодирующие последовательности генов сахарозосинтазы у 13 видов картофеля, представляющих 11 серий подсекций Potatoe и Estolonifera секции Petota. Изучена экзон-интронная структура, а также кодируемые данными генами белковые последовательности. Впервые определен уровень межвидового полиморфизма генов сахарозосинтазы у представителей рода Solanum секции Petota.

На основании данных о вариабельности последовательностей фрагментов сахарозосинтазного домена Sus4 гена впервые оценен внутривидовой полиморфизм 24 сортов картофеля (S. tuberosum) с различным содержанием крахмала в клубнях. Изучен внутри- и межвидовой полиморфизм по фрагменту сахарозосинтазного домена гена Sus2 у видов и сортов томата. Впервые оценен полиморфизм сахарозосинтазного и глюкозилтрансферазного доменов генов сахарозосинтазы у различных представителей семейства Solanaceae (роды Solanum, Capsicum, Datura, Atropa, Physalis, Lycium, Brunfelsia и Nicotiana). Предложена схема возможной эволюции данного гена у представителей Solanum. Показано, что Sus4 наравне с другими низкокопийными генами ядерного генома может быть успешно использован для изучения филогении и эволюции у Solanaceae.

Впервые идентифицированы последовательности 15 генов-гомологов Rxl, определяющего устойчивость к X вирусу у дикорастущих видов картофеля S. acaule, S. megistacrolobum, S. leptophyes, S. berthaultii, S. brevicaule, S. gourlayi. Определена экзон-интронная структура генов, выявлены и описаны все основные домены Rxl Solanum. Изучен полиморфизм их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Методом EcoTILLING впервые проведен анализ фрагментов NBS доменов Rxl генов 96 образцов, включающих 18 сортов S. tuberosum, а также 41 вид Solanum секции Petota. В результате оценен уровень как внутри-, так и межвидового полиморфизма фрагмента NBS домена генов-гомологов Rxl, а также выявлен ряд видо- и образецспецифичных SNP.

Полученные в результате работы данные о полиморфизме генов Sus4 и Rxl могут быть использованы в маркер-опосредованной селекции новых сортов картофеля, скрининге аллельного разнообразия коллекций, в том числе для идентификации новых источников хозяйственно-ценных признаков. Данные о полиморфизме гена Sus4 также могут использоваться для решения проблем систематики и эволюции видов Solanum.

Личный вклад автора заключается в самостоятельном проведении теоретических и экспериментальных исследований. Результаты работы получены лично автором или же при ее непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях, в том числе на 9'1' Plant GEM (Стамбул, 2011), MolPhy3 (Москва, 2012) и 16th ЕВМ (Марсель, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 работ, из них четыре - в рецензируемых научных журналах и шесть - в сборниках материалов конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 печатных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 наименований. Работа содержит 17 таблиц и 36 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация и анализ полиморфизма генов-гомологов Sus4 у видов Solatium секции

Petota

Для работы были отобраны 13 видов Solatium секции Petota из различных эколого-географических зон, относящиеся к надсериям Rotata и Stellata подсекции Potatoe, а также образец S. etuberosum подсекции Estolonifera (Hawkes, 1990) (табл. 1).

Клонирование полных кодирующих последовательностей генов-гомологов Sus4 у видов Solatium секции Petota. На основании известной последовательности гена Sus4 S. tuberosum (U24087) были разработаны праймеры, позволяющие амплифицировать полные кодирующие последовательности генов-гомологов Sus4 у дикорастущих видов картофеля, а также дифференцировать их от последовательностей гена Sus3, кодирующего другую изоформу сахарозосинтазы (рис. 1).

S3eF ,_ SSeR SWsF , ,S1?eg

SSeF> ,S10eR

Рис. 1. Схема расположения праймеров для клонирования и секвснирования Sus4 последовательностей

С использованием разработанных праймеров были амплифицированы полные кодирующие последовательности генов-гомологов Sus4 у 13 видов Solanum, выбранных для анализа. Длина всех полученных фрагментов составила около 4000 п.н. Амплифицированные фрагменты были клонированы при помощи Qiagen Cloning Plus Kit. Всего были получены 23 последовательности (табл. 1).

Таблица 1. Образцы Solanum секции Pelota, отобранные для клонирования генов-гомологов Sus4

№ коллекции CGN Вид Серия

подсекция Potatoe надсерия Rotata

2056В S. demissum Acaulia

21350 S. vernei Tuberosa

- S. tuberosum Приор Tuberosa

21316 S. boliviense Me ç istacroloba

17606 S. stoloniferum Longipedicellata

22720 S. limbaniense Conicibaccata

подсекция Potatoe надсерия Stellata

23775 S. chacoense Yungasensa

17723 S. lignicaule Lignicaulia

22698 S. bulbocastanum Bulbocastana

22345 S. pinnatisectum Pinnatisecta

17746 S. polvadenium Polyadenia

22767 S. circaeifolium Circaeifolia

подсекция Estolonifera

17714 S. etuberosum Estolonifera

Полиморфизм нуклеотидной последовательности генов-гомологов Sus4 видов Solanum секции Petota. Полученные последовательности были выровнены и проанализированы в программе MEGA 5.1 (Tamura et al., 2011).

Было показано, что все известные на сегодняшний день последовательности Sus генов растений можно разделить на четыре группы по их экзон-интронной структуре (Baud et al., 2004; Harada et al., 2005). Анализ клонированных последовательностей сахарозосинтазы видов Solanum секции Petota показал, что они относятся к SUSI группе сахарозосинтаз растений.

Длина клонированных последовательностей генов сахарозосинтазы составила от 3961 п.н. у S. demissum до 4033 п.н. у S. stoloniferum (табл. 2). Общий уровень межвидовой вариабельности составил 15,3%. Полиморфизм экзонных последовательностей варьировал от 6,6% в экзоне IX до 13,2% в экзоне IV. При этом наиболее полиморфными оказались последовательности экзона IV (13,2%), а также экзонов X (12,5%) и II (12,2%). В пределах экзонов был выявлен ряд видоспецифичных замен, а также SNPs, характерные для групп видов.

Вариабельность интронных последовательностей представляла отдельный интерес, так как они могут быть более информативны при решении проблем систематики и эволюции видов Solanum. Интроны были более полиморфны, и, помимо единичных замен, содержали индели. Так, специфичные индели были обнаружены в интронах образцов S. demissum и S. etuberosum. Помимо видоспецифичных, были выявлены также индели, характерные для групп видов. Так, все Sus4 последовательности видов надсерии Stellata содержали инсерцию АСАС/ТАСА в интроне V. Интересно, что такая же инсерция была обнаружена и у одного вида надсерии Rotata - S. demissum.

Таблица 2. Протяженность экзонов и интронов и полиморфизм клонированных последовательностей генов сахарозосинтазы видов Solanum

Экзоны Длина, п.н. SNPs (%) Интроны Длина, п.н. SNPs (%)

экзон II 98 12(12,2) интрон II 256-274 50(18,3)

экзон III 127 14(11,0) И1ГГРОН III 92-95 19 (20,0)

экзон IV 152 20(13,2) ИНТРОН IV 81-85 15(17,6)

экзон V 193 16 (8,2) интрон V 236-267 69 (25,8)

экзон VI 336 26 (7,7) интрон VI 86 17(19,7)

экзон VII 96 9 (9.4) интрон VII 86-90 10(11,1)

экзон VIII 174 16(9,2) интрон VIII 90-92 24 (26,0)

экзон IX 117 14(11,9) интронIX 97-107 24 (22,4)

экзон X 167 21 (12,5) интрон X 74-78 35 (44,8)

экзон XI 225 18 (8,0) интрон XI 245-272 75 (27,5)

экзон XII 564 58(10,3) интрон XII 80-85 17(20,0)

экзон XIII 139 14(10,0) интрон XIII 97-100 17(17,0)

экзон XIV 30 2(6,6)

Все экзоны 2418 240 (9,9) Все интроны 1520-1631 373 (22,8)

Наиболее полиморфными оказались последовательности сахарозосинтазы образца S. etuberosum, который является неклубнеобразующим видом и относится к подсекции Estolonifera (Hawkes, 1990; Spooner and Salas, 2006).

Сравнение полученных последовательностей генов-гомологов Sus4 13 видов Solanum с известной последовательностью гена Sus3, кодирующего другую изоформу сахарозосинтазы S. tuberosum (U24088), подтверждает полученные ранее данные о значительных отличиях генов Sus4 и Sus3 в интронных областях (Fu and Park, 1995). Полиморфизм аминокислотной последовательности Sus4 видов Solanum секции Pelota. Полученные нуклеотидные последовательности были транслированы и проанализированы на наличие аминокислотных замен. Протяженность всех 23 последовательностей составила 805 а.о. Из выявленных 240 полиморфных нуклеотидных позиций 63 SNPs приводили к образованию 27 консервативных и 36 радикальных аминокислотных замен.

Анализ аминокислотных последовательностей сахарозосинтазного (экзоны I-XI) и глюкозилтрансферазного (экзон XII) доменов, характерных для Sus белков, позволил выявить у всех изученных последовательностей два высоко консервативных трансмембранных мотива: FLGRIPMVFNVVILSPHGYFA (экзон VI) и FGLTVEAMTCGLPTFATN (экзон XII), ранее описанные только у Fabaceae (Silvente et al, 2003). В пределах последовательностей данных мотивов у всех исследованных образцов Solanum аминокислотных замен выявлено не было. На N-конце всех проанализированных последовательностей было показано наличие сайта фосфорилирования Serll, характерного для большинства известных генов сахарозосинтазы (Winter et al., 1997; Silvente et al, 2003).

Проведенный сравнительный анализ показал, что, в отличие от проанализированных Sus4 последовательностей, Sus3 S. tuberosum имеет замену треонин/серин в трансмембранном мотиве 2.

Филогенетический анализ последовательностей генов-гомологов Sus4 видов Solanum секции Petota. На основе полученных данных о нуклеотидном полиморфизме анализируемых Sus4 последовательностей была построена дендрограмма (рис. 2).

Рис. 2. Дендрограмма генетических различий, построенная по результатам анализа нуклеотидного полиморфизма генов сахарозосинтазы видов Solatium секции Petota методом MP (Maximum Parsimony)

На дендрограмме изученные последовательности формируют три основных кластера. Как и ожидалось, первый кластер (ИБ=100) образуют последовательности неклубнеобразующего вида S. etuberosum подсекции Estolonifera. Остальные два кластера включают виды клубнеобразующего картофеля. Второй кластер состоит из видов надсерии Stellata, которые принято считать наиболее древними (Hawkes, 1990; Spooner and Salas, 2006). Интересно, что два вида надсерии Stellata: S. chacoense и S. lignicaule, образуют отдельный подкластер в пределах третьего крупного кластера, образованного видами надсерии Rotata. В целом положение на дендрограмме изученных видов соответствует современной классификации (Olmstead et al., 2008).

Анализ внутривидового полиморфизма фрагмента сахарозосинтазного домена гена Sus4. Для анализа внутривидового полиморфизма был выбран фрагмент гена Sus4 с III по VI экзон, кодирующий основную часть сахарозосинтазного домена, определяющего функции фермента. В работе были использованы сорта S. tuberosum с различными показателями крахмалистости, сроками созревания и рекомендованные для выращивания в различных зонах, что могло позволить определить возможную корреляцию между выявленными нуклеотидными/аминокислотными заменами и хозяйственными характеристиками (табл. 3).

0 02

№ Сорт Страна Срок созревания* Крахмалистость, %* Регионы*

1 Бинтье Нидерланды - различная -

2 Фрегата Польша среднепоздний 14-21 -

3 Гранола Германия - низкая-средняя -

4 Адретга Германия среднеранний 13-18 7, 10, И, 12

5 Ресурс Россия среднеспелый 13-16 2, 3, 4, 5

6 Яхонт Белоруссия - - -

7 Атлант Белоруссия позднеспелый 17-22 3

8 Петербургский Россия среднеспелый 13-16 1,2, 3,4, 7, 12

9 Невский Россия среднеранний 10-12 все регионы

10 Чародей Россия среднеранний 15-17 1,2,4,5,6,7,12

11 Жуковский ранний Россия раннеспелый 10-12 2,3,4,5,6,7,8,9,10,12

12 Русеет Бурбанк США - высокая -

13 Шепорд США - - -

14 Никита Нидерланды среднеранний 13.5-18 -

15 Ласунак Белоруссия позднеспелый 15-22 2,3,4,5,6

16 Лазурит Белоруссия раннеспелый 14-16 3,4,5

17 Явар Белоруссия среднеранний 10-13 4

18 Раменский Россия среднепоздний 14-19 2

19 Любимец Россия среднеранний 11-15 3

20 Альтаир Россия среднеспелый 13-17 -

21 Брянский ранний Россия раннеспелый 14-16 3,4,6

22 Вестник Россия среднеспелый 16-18 3

23 Голубизна Россия среднеспелый 17-19 3, 4, 5, 6

24 Дезире Нидерланды среднеспелый 13-21 7

Регионы: 1 - Северный, 2 - Северо-Западный, 3 - Центральный, 4 - Волго-Вятский, 5 - Центральночерноземный, 6 - Северо-Кавказский, 7 - Средневолжский, 8 - Нижневолжский, 9 - Уральский, Ю - ЗападноСибирский, 11 - Восточно-Сибирский, 12 - Дальневосточный (*по данным Симаков и др, 2010)

Анализ нуклеотидпой последовательности фрагментов сахарозосиптазного домена гена Sus4 сортов S. tuberosum. Длина секвенированных фрагментов гена Sus4 у 24 сортов картофеля варьировала от 938 до 974 п.н. (табл. 4). Общий уровень нуклеотидной вариабельности среди 24 сортов составил 10,5%. В составе изучаемых последовательностей были детектированы как точковые замены, так и индели. В целом полиморфизм в последовательностях интронов более чем в два раза превосходил полиморфизм в экзонах. Таблица 4. Характеристика нуклеотидной последовательности фрагмента гена Sus4 у 24 сортов картофеля

Участок гена Длина, п.н. Число вариабельных сайтов (%)

фрагмент шггрона III 73 11 (15%)

экзон IV 152 9 (5,9%)

интрон IV 78-83 15 (18-19,2%)

экзон V 193 12(6,2%)

интрон V 235-272 38 (14-16,2%)

фрагмент экзопа VI 207 14 (6,7%)

все интроны 386-428 64 (14,9-16,5%)

все экзоны 552 35 (6,3%)

общая длина 938-974 99(10-10,5%)

В пределах экзонов были выявлены ЗОТв, в том числе сортоспецифичные, которые могут быть использованы для маркирования сортов картофеля (табл. 4). Наиболее вариабельным по длине оказался интрон V, последовательность которого содержала две

инсерции: 30-нуклеотидная инсерция встречалась у 11 сортов. У 13 сортов в 3'- концевом участке интрона присутствовала (Т)8-последовательность. Интрон IV у 17 анализируемых образцов содержал инсерцию ATGTT.

По наличию инсерций в интронах IV и V все изученные последовательности гена Sus4 картофеля можно разделить на четыре основных типа (рис. 3). Самыми распространенными у изученных Sus4 последовательностей сортов оказались I и IV типы. I тип был обнаружен у 13 сортов с различным содержанием крахмала в клубнях. IV тип также характеризовал смешанную по характеристикам крахмалистости группу из 15 сортов. Последовательность II типа обнаружена у трех сортов (Ласунак, Атлант, Дезире), III тип - у двух сортов (Раменский, Альтаир) (рис. 3).

i тип .W

umpöHUIj ---•_трон г. • 1 интрон V fSSTTTI .. ., ,

-fey^'ij—'. Er? ' *.}- • i И Tim Sm4

5 im

интроиш кнтрои ГУ инчрон V

£3~:«»HHTpoiirv ~ Щ итрон V > '"1.., ,. _ IdM* VI-л ..... Щ „ Д ШтапЛгм*?

5ин ml

iniipiülIH I V^'-y^i'in-l.jll ИНТрОМ V

А

---—...........Г" pjjgffi IV тяп Sus4

5 пи 30 ПН <T)S

Рис. 3. Структура исследованного участка и типы последовательностей фрагмента гена Sus4 картофеля (треугольниками обозначены ииссрции)

Кластерный анализ последовательностей фрагментов сахарозосинтазпого домена гена Sus4 сортов S. tuberosum. На дендрограмме, построенной на основании данных о нуклеотидном полиморфизме изученных последовательностей, сорта картофеля объединяются в пять основных групп (рис. 4). В целом такая кластеризация совпала с описанным выше делением Sus4 последовательностей картофеля на типы по наличию инсерций в интронах (рис. 3).

Ранее было показано, что сахарозосинтаза является одним из основных ферментов, вовлеченных в метаболизм крахмала в клубнях картофеля, а также участвует в ответных реакциях на абиотический стресс. Поэтому отдельный интерес представлял поиск возможной корреляции между выявленным полиморфизмом последовательности гена Sus4 и хозяйственными характеристиками. В анализ были взяты сорта картофеля, различающиеся по крахмалистости, срокам созревания и рекомендуемым регионам выращивания (табл. 3).

0.020 0.0 f 5 ö.fllü 0.ЗД5 0

Рис. 4. Дспдрограмма генетических различий, построенная на основании анализа нуклеотидного полиморфизма фрагмента гена Sus4 24 сортов картофеля методом NJ. 1-5 — кластеры; цифры в узлах ветвей - индексы бутстрепа; S. tub - Solanum tuberosum, S. lyc. - Solanum lycopersicum)

Однако в результате проведенного анализа выявленных SNPs, а также кластерного анализа прямой зависимости между полиморфизмом изученных последовательностей и хозяйственными характеристиками сортов картофеля выявлено не было. Это может быть связано с тем, что несмотря на участие гена Sus4 в формировании углеводного состава клубней на данный признак также влияют и другие гены, например, Gbssl и Stp23 (Li et al., 2008). При этом степень влияния каждого из них до сих пор не определена. Анализ аминокислотной последовательности фрагмента сахарозосинтазного домена Sus4 сортов S. tuberosum. Полученные нуклеотидные последовательности фрагмента гена Sus4 картофеля были транслированы и проанализированы.

Таблица 5. Аминокислотные замены, выявленные в результате анализа последовательностей фрагмента сахарозосиптазы Sus4 у 24 сортов картофеля

Jfi Аминокислотная замена Порядковый номер а.о. Кодон Сорт,образец Тип замен*

1 Q/E 76 CAA/GAA Лазурит R

2 I/V 98 ATC/GTC Русеет Бурбанк, Шепорд, Никита С

3 Т/К 119 ACG/AAG Явар R

4 N/D 136 AAT/GAT Ресурс R

5 К/Е 138 AAG/GAG Брянский ратшй R

б V/A 142 GTA/GCA Руссет Бурбанк С

7 Т/К 151 АСА/ААА Ресурс R

8 C/F 169 TGC/TTC Дезире R

9 AA- 176 GCC/ACC Руссет Бурбанк, Шепорд, Никита С

10 S/T 203 ТСГ/АСТ Жуковский ранний С

11 V/L 207 CTC/GTC Невский С

12 т/м 217 ACG/ATG Петербургский R

13 E/D 221 GAA/GAT 11 образцов" С

14 H/L 254 САТ/СТТ Петербургский R

15 R/L 257 CGC/CTC Адретта R

16 A/E 259 GCG/GAG Петербургский R

*С - консервативная аминокислотная замена, R - радикальная аминокислотная замена (Zhang, 2000) ♦♦Петербургский, Голубизна, Вестник, Лазурит, Явар, Фрегата, Адретта, Атлант, Ласунак, Никита, Руссет Бурбанк.

Длина аминокислотной последовательности составила 184 а.о. В анализируемых последовательностях были детектированы 35 полиморфных нуклеотидных позиций, из которых 16 (45%) приводили к шести консервативным и 10 радикальным аминокислотным заменам (табл. 5).

Сравнительный анализ полиморфизма сахарозосинтазного домена Sus генов культурных и дикорастущих видов картофеля и томата. Помимо изучения гена сахарозосинтазы у картофеля представлялось интересным изучить полиморфизм данного гена у другого близкородственного представителя рода Solanum подрода Potatoe — томата. Известно, что гомологом гена Sus4 картофеля у томата является ген Sus2 (Fu and Park, 1995). Для проведения анализа полиморфизма гена Sus2 у культурных и дикорастущих видов томата был выбран тот же фрагмент сахарозосинтазного домена с III по VI экзон, который был ранее проанализирован у картофеля.

В работе были использованы 28 образцов пяти видов томата: S. cheesmaniae, S. peruvianum, S. habrochaites, S. pimpinellifolium и S. lycopersicum, при этом обыкновенный томат S. lycopersicum был представлен шестью разновидностями и 14 сортами.

Длина полученных фрагментов сахарозосинтазного домена гена Sus2 томата составила от 904 до 907 п.н. Наибольшее число замен и инделей выявлено в последовательности интрона V. При этом 80% всех обнаруженных нуклеотидных замен были детектированы в Sus2 последовательностях диких видов томата 5. cheesmaniae, S. peruvianum, S. habrochaites, S. pimpinellifolium. Для них также было характерно наличие специфичного набора SNPs. Помимо этого, в пятом интроне образца S. habrochaites выявлена делеция четырех нуклеотидов ТТСС, а также мононуклеотидная инсерция.

Уровень полиморфизма по изучаемому фрагменту гена Sus2 томата был крайне низким, причем не только внутривидовой (0,6%), но и межвидовой (6,8%). Интересно, что межвидовой полиморфизм по изученному фрагменту у томата оказался ниже, чем внутривидовой полиморфизм по аналогичному участку у S. tuberosum (10,5%).

Сравнение полученных Sus4 последовательностей с известными последовательностями гена Sus3 S. tuberosum (U24088) и гена Sus2 S. lycopersicum подтверждает данные о более высоком сходстве последовательностей гена Sus4 картофеля с Sus2 томата, чем с геном Sus3 картофеля. Это может служить непрямым доказательством в поддержку гипотезы о том, что гены Sus4 и Sus2 возникли до разделения эволюционных линий S. tuberosum и S. lycopersicum (Fu and Park, 1995).

Полиморфизм генов-гомологов Sus4 у представителей семейства Solanaceae. Ген Sus4 картофеля является монокопнйным, что делает возможным его использование для реконструкции филогении и изучения таксономических отношений внутри семейства. Поэтому представлялось интересным изучить полиморфизм гена сахарозосинтазы у представителей семейства, относящихся к различным таксономическим группам, что позволило проследить эволюцию генов сахарозосинтазы у Solanaceae.

Для проведения анализа были отобраны представители подсемейств Nicotianoideae, Petunioideae, а также представители шести триб подсемейства Solanoideae: Capsiceae, Datureae, Hyoscyameae, Lycieae, Physaleae и Solaneae. Триба Solaneae представлена видами рода Solatium, пяти подродов (Leptostemonum, Minon, Solanum, Brevartlherum, Potatoe), семи секций (Crinitum, Melongena, Dulcamara, Solanum, Brevantherum, Petota, Lycopersicori). Полиморфизм фрагмента сахарозосиптазпого домена у представителей семейства Solanaceae. Изученный фрагмент сахарозосинтазного домена включал участок с IV по VI экзон. Протяженность экзонных последовательностей у 47 образцов Solanaceae составила 405 п.н. Наиболее полиморфной была последовательность экзона V (192 п.н.), которая содержала ряд SNPs, в том числе видоспецифичных.

Последовательности интронов также были высоко полиморфны и помимо SNPs содержали индели. Так, длина интрона V значительно варьировала из-за наличия инделей, в том числе видо- и образецспецифичных. Все без исключения проанализированные последовательности Solanaceae содержали в интроне IV инсерцию ATGTT, отсутствие которой было характерно только для ряда проанализированных ранее Sus4 последовательностей сортов S. tuberosum (рис. 3). Сравнение последовательностей фрагмента сахарозосинтазного домена сортов S. tuberosum и дикорастущих видов Solanum секции Petota позволило выявить новые типы Sus4 по наличию инсерций в интронах. При этом последовательности ряда дикорастущих видов Solanum секции Petota можно отнести к ранее описанным у сортов S. tuberosum типам (рис. 5). Также было показано, что межсортовой полиморфизм S. tuberosum по изученному фрагменту гена Sus4 достаточно высок и сравним с межвидовым полиморфизмом видов Solanum секции Petota. Это может быть связано с широким использованием дикорастущих видов картофеля в селекции современных сортов.

Сравнение последовательностей сахарозосинтазного домена гена Sus2 томата и гомологичного ему гена Sus4 картофеля показало, что ген Sus2 содержит специфичную для всех видов томата инсерцию GAATTATTA в интроне V (рис. 5).

Инсерция 30 п.н. в интроне V, выявленная у ряда образцов Solanum секции Petota, была также характерна и для других изученных последовательностей сахарозосинтаз

изученного фрагмента составила 513 п.н. При этом уровень межвидового нуклеотидного полиморфизма был достаточно высок для такого консервативного функционального домена и составил 27%. Полиморфизм среди видов Solanum был значительно ниже и составил 16%.

Все изученные последовательности были транслированы. Длина полученного фрагмента составила 170 а.о. Было показано, что они содержат консервативный трансмембранный мотив (FGLTVVEAMTCGLPTFATNH), наличие которого характерно для генов сахарозосинтазы разных видов растений (Winter et al., 1997; Silvente et aly 2003). В пределах данного домена были выявлены 18 SNPs, не приводящих к аминокислотным заменам. В других участках глюкозилтрансферазного домена были выявлены 30 аминокислотных замен, 17 из них - у видов рода Solanum. Некоторые замены характеризовали группы видов. Так, например, аминокислотная замена Lys/Glu была обнаружена у всех изученных видов Solanum.

На основании полученных данных о полиморфизме последовательностей экзона XII гена Sus4 и его гомологов у различных представителей семейства Solanaceae были построены дендрограммы методами NJ, MP и ML (рис. 6). Полученные дендрограммы были конгруэнтны.

- S s» 2

- S sfc-'s'r. V..T? 1 -S sK»zr..ft'sr 2 -S f-e;su

-S 3W.j. -S эе-яз.

тгЭ

Solanum

- S эе-я-*$.ч» t secL Pelota

- S J

- S c.'c«e

- S c.tjf b „*> t

_ S ut*-cs.TÊ.te

-S

-S ute-zsu">3'â-K't -S '-с-...

- S C'Jv-î«1îe

_s r.ic'-bccs -ej Lycopenicon

- S ¡jco&e's.cs* AJ011S3S -S -S

-S {¡.тх.жип -S pi.',a:en,.T, -S Cbixira

- S tJcxts'i"jtn 1

- S et.te-zi.-m 2

- S ef-ie'î J.-ч 3 _

- S з-.гвта-в

Is рижым àpyeueeudu -Sit rr'r t- n Solanum

гл..»т! другие виды r..:tx i'.ca Soi ¿пасем

Рис. 6. Дендрограмма, отражающая сходство последовательностей глюкозилтрансферазного домена генов сахарозосинтазы представителей Solanaceae. Метод ML (Maximum Likelihood).

Разработка праймеров для амплификации генов-гомологов Rxl у видов Solanum секции Petota. Подбор праймеров для амплификации Rxl генов у видов клубнеобразующего картофеля является ключевым этапом работы. Это связано с тем, что, с одной стороны, разрабатываемые праймеры должны быть высокоспецифичными, чтобы амплифицировать только гомологи Rxl гена, с другой - праймеры, разрабатываемые на ограниченном массиве данных, представленных в генбанке, должны приводить к амплифицикации Rxl гомологов у филогенетически отдаленных видов картофеля секции Petota.

3159 п.н.

LRK19SR Rx231R

Рис. 7. Расположение праймеров, разработашпдх для амплификации и секвепирования генов-гомологов Rxl

При помощи разработанных праймеров были амплифицированы, клонированы и секвенированы 45 последовательностей генов-гомологов Rx 17 образцов 13 видов, относящихся к четырем сериям и двум надсериям секции Petota Solatium (рис. 7, табл. 6). Экзон-интропная структура последовательностей генов-гомологов Rxl видов Solatium секции Petota. При исследовании Rxl локуса хромосомы XII S. tuberosum было показано наличие в нем девяти последовательностей со степенью сходства с Rxl 85 - 95%, так называемых RGH (Resistance Gene Homologues) (Bakker et al., 2003). При этом только одна из девяти RGH является доказанным псевдогеном - RGH3 делетированным с 3' конца. Для остальных обнаруженных последовательностей нет данных о функциональном статусе, и считается, что их можно рассматривать как функциональные гены-кандидаты RGC (Resistance Gene Candidates), не имеющие протяженных делеций, сдвигов открытой рамки считывания (ОРС) и преждевременных терминаторных кодонов (Bakker et al., 2003).

Так как одной из задач работы было изучение полиморфизма семейства Rx генов, интерес представляли как потенциально функциональные гены (гены-кандидаты (RGC/RGH)), так и последовательности псевдогенов. Проведенный сравнительный анализ показал, что все 45 клонированных последовательностей были гомологичны, но не идентичны известной последовательности гена Rxl S. tuberosum (AJ011801), и состояли из трех экзонов и двух интронов.

Общая протяженность анализируемых последовательностей составила от 2643 до 3282 п.н. Интересно отметить, что наиболее вариабельными по длине оказались не интронные, а экзонные последовательности. Так, длина наиболее протяженного экзона I варьировала от 2338 до 2723 п.н., а экзона II от 3 до 210 п.н. Экзон III у всех изученных

последовательностей состоял из 7 п.н. При этом длины интронов варьировали от 156 до 236 п.н. у первого и от 87 до 113 п.н. у второго интрона (табл. 7).

Полиморфизм последовательностей генов-гомологов Rxl видов Solanum секции Petota.

Общий уровень нуклеотидного полиморфизма полученных последовательностей генов-гомологов Rxl в экзонных областях был достаточно высок и сравним с полиморфизмом интронов (табл. 7).

Таблица 7. Полиморфизм последовательностей экзоиов и интронов клонированных последовательностей генов-гомологов Rxl _

Участок гена Протяженность, п.н. Число вариабельных сайтов %

экзоп I 2338-2723 436 17,2

интрон I 156-236 44 22,5

экзон II 3-210 30 14,3

интрон II 87-113 25 25

экзон III 7 3 43

Длина последовательности экзона I варьировала от 2338 до 2723 п.н. Ряд инделей, выявленных в пределах экзона I изученных последовательностей, оказались образецепецифичными. Так, например, у двух клонов образца S. microdontum была выявлена характерная только для них 12-нуклеотидная делеция в экзоне I. Интересно отметить, что все клонированные последовательности имеют вставку СТС в экзоне I, в то время как последовательность гена Rxl сорта Кара S. tuberosum (AJ011801) такой инсерции не имеет.

Длина последовательности интрона I варьировала от 156 до 236 п.н. из-за наличия инделей. Так, четыре клонированные последовательности S. berthaultii (CGN № 18030) имели делению 22 п.н., а два клона S. microdontum делецию 80 п.н. в интроне I.

Последовательность экзона II изученных клонов оказалась наиболее вариабельной по длине 3-210 п.н., что было связано с наличием большого числа инделей. Последовательность интрона II была менее вариабельна по длине 87-113 п.н. Два клона образца S. marinasense имели две специфичные делеции 14 и 13 п.н. в интроне И.

Полиморфизм аминокислотных последовательностей Rxl видов Solanum секции Petota.

Полученные нуклеотидные последовательности генов-гомологов Rxl были транслированы и проанализированы.

Из всех изученных последовательностей 15 клонов образцов S. acaule, S. megistacrolobum, S. leptophyes, S. berthaultii, S. brevicaule, S. gourlayi оказались гомологичны известной Rxl последовательности (транслированная AJ011801), протяженность которой составляет 937 а.о. (Bendahmane et al., 1999). Основные различия аминокислотных последовательностей клонов от известной Rxl последовательности находились в районе «кислотного хвоста», который полностью соответствует второму экзону Rxl гена и значение которого в функционировании R-белка пока не установлено. Все перечисленные выше 15 последовательностей не содержали преждевременных стоп-кодонов, а также сдвигов ОРС.

потенциально функциональных генов, у ряда изученных последовательностей были выявлены делеции, затрагивающие области высококонсервативных мотивов, сдвиги рамки считывания и преждевременные стоп-кодоны, препятствующие образованию Ях1 белка. Подобные последовательности, по-видимому, представляют собой псевдогены.

IÍ

Р.пртпя кинлэл 1 иннллл я аде МНР

Рис. 8. Консервативные мотивы СС и ЫВв-АЯС доменов клонированных последовательностей

Проведенный кластерный анализ транслированных последовательностей полученных генов-гомологов подтверждает их высокое сходство с известными

последовательностями Ях1 и его гомологов из баз данных (рис. 9).

5 1ер1ор/>уез 1 в /вр/орЛувв 3 /вр/орЛувз 2 в 1ер1орЬуеа 4 в ЬеПЬаиНч 2 в ЬеПЬаиПп 1 1 в Ы/вюиНИ 1 3 Э ОвПЬвиИи 1 б 5 т*д131асп)1оЬит 1

тод151асгг>1оЬит 2

Э Ы&лсаи/в 14

АР26674в5 1иЬегоаит ЯССЗо5еи<Зодепе в асаи!е 11

образцы устойчивые к X вирусу

S acaule 1 2 AJ011801S tuberosum Rx gene S gourlayi 3 lOOL s gourlayi 5 S acaule 2 S berthaultn 1 4 100 I S berthaultn 1 5

AF266747S tuberosum RGC1

Рис. 9. Дендрограмма, построенная па основании анализа аминокислотных последовательностей Rxl гомологов представителей Solarium секции Petota методом NJ (Neighbor Joining)

На дендрограмме отдельную группу образуют Rxl последовательности образцов S. gourlayi и S. acaule, иммунных к X вирусу картофеля.

Анализ полиморфизма последовательностей NBS доменов генов-гомологов Rxl методом EcoTILLING. EcoTILLING является точным, не требующим больших затрат и высокоэффективным методом анализа нуклеотидного полиморфизма фрагмента ДНК. Данный метод является менее затратным по сравнению с секвенированием и позволяет быстро проанализировать большое количество образцов (Cornai et al.y 2004).

5. При помощи метода EcoTILLING впервые проведен анализ внутри- и межвидового полиморфизма консервативного NBS домена гена Rxl и его гомологов у 78 образцов 41 вида Solatium секции Petota и 18 сортов S. tuberosum, выявлен 61 полиморфный сайт, включающий ряд видо- и образецспецифичных SNPs.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи из перечня рецензируемых научных журналов:

1. Борис, К.В. Изучение полиморфизма гена сахарозосинтазы Sus2 у культурных и дикорастущих видов томата / К.В. Борис, Н.Н. Рыжова, К.Г. Скрябин // Доклады академии наук. - 2010. - Т.433. - №5. - С.703 - 706.

2. Борис, К.В. Изучение внутривидового полиморфизма фрагмента гена сахарозосинтазы Sus4 картофеля (Solatium tuberosum) / К.В. Борис, Н.Н. Рыжова, Е.З. Кочиева // Генетика. - 2011. - Т.47. - №2. - С.190 - 198.

3. Борис, К.В. Вариабельность последовательностей кодирующих NBS-ARC домен у гомологов Rxl из различных видов картофеля / К.В. Борис, Н.Н. Рыжова, Е.З. Кочиева // Молекулярная биология. - 2012. - Т.46. - № 1. - С. 118 - 121.

4. Борис, К.В. NBS-LRR гены устойчивости к X вирусу картофеля / К.В. Борис, Е.З. Кочиева // Успехи современной биологии. - 2013. - Т.133. - №2. - С.120 - 128.

Тезисы докладов:

5. Boris, K.V. Rx gene homologues in Solatium sect. Petota species / K.V. Boris, E.Z.

th

Kochieva // 16 Evolutionary Biology Meeting. Марсель. - 2012. - С. 161.

6. Boris, K.V. EcoTILLING for the identification of SNPs in the NBS domain of Rxl gene in Solarium sect. Petota species / K.V. Boris, E.Z. Kochieva // MolPhy3. Москва. - 2012. - С. 100.

7. Boris, К. Sus2 homologues in Solarium lycopersicum varieties and related wild species / K. Boris, N. Ryzhova, E. Kochieva //9th Plant Genomics European Meeting. Стамбул. -2011.-C.28.

8. Boris, K. NB-ARC domain variability in Rx homologues in Solatium species / K. Boris, N. Ryzhova, R. Hoekstra, E. Kochieva // 9th Plant Genomics European Meeting. Стамбул. - 2011. - С. 29.

9. Борис, K.B. Rx гены видов Solarium: полиморфизм CC-NBS-ARC доменов / К.В. Борис // 2-я Международная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Звенигород. — 2011. - С. 24.

10. Boris, К. Identification and characterization of variability in Sus4 homologues in Solatium tuberosum varieties / K. Boris, N. Ryzhova, E. Davletshina, E. Kochieva // 2nd International Symposium on Genomics of Plant Genetic Resources. Болонья - 2010.

Заказ № 16-аУ11/2013 Подписано в печать 08.11.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maitzak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борис, Ксения Витальевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

04201365679

БОРИС КСЕНИЯ ВИТАЛЬЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ-ГОМОЛОГОВ SUS4 И RX1 У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА SOLANUM

СЕКЦИИ РЕТОТА

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кочиева Е.З.

На правах рукддиси

Москва-2013

Содержание

Введение..................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы.........................................................................9

1.1.1 Состав и классификация семейства Solanaceae (Пасленовые)....................................9

1.1.2 Род Solanum секции Petota и Lycopersicon..........................................................10

1.1.3 Картофель. Углеводный состав клубней.............................................................12

1.1.4 Ферменты углеводного обмена растений и кодирующие их гены.............................13

1.1.5 Метаболизм углеводов в клубнях картофеля.......................................................15

1.1.6 Фермент сахарозосинтаза и его функции в растениях...........................................15

1.1.6.1 Семейство генов Sus, кодирующих сахарозосинтазу растений....................17

1.1.6.2 Гены сахарозосинтазы семейства Solanaceae.........................................20

1.2.1 Иммунитет растений и гены устойчивости растений к биотическим факторам............24

1.2.1.1 .Модели узнавания патогена..............................................................26

1.2.1.2. Классификация генов устойчивости растений.......................................29

1.2.1.3 Классификация NBS-LRR белков........................................................30

1.2.1.4. Эволюция генов устойчивости растений..............................................32

1.2.1.5 Эволюция NBS-LRR белков..............................................................33

1.2.2 Вирусные болезни картофеля..........................................................................34

1.2.3 Гены, определяющие устойчивость картофеля к X вирусу.....................................36

< 1.2.3.1 Строение основных доменов гена Rxl...........................................37

1.2.3.1.1 Структура и функции СС-домена...............................................39

1.2.3.1.2 Структура и функции NBS-ARC домена (NBS домена)....................40

1.2.3.1.3 Структура и функции LRR домена.............................................42

1.2.4 Модель действия NBS-LRR белков...................................................................44

Глава 2. Материалы и методы....................................................................46

Глава 3. Результаты и обсуждение...............................................................55

3.1 Идентификация и анализ полиморфизма генов, кодирующих

сахарозосинтазу у видов Solanum секции Petota..........................................................55

3.1.1 Клонирование полных кодирующих последовательностей

генов-гомологов Sus4 у представителей рода Solanum секции Petota......................55

3.1.2 Полиморфизм нуклеотидной последовательности генов

сахарозосинтазы видов Solanum секции Petota..................................................57

3.1.3 Полиморфизм аминокислотной последовательности Sus4 белка

видов Solanum секции Petota.........................................................................60

3.1.4 Филогенетический анализ последовательностей

генов сахарозосинтазы видов Solanum секции Petota...........................................63

3.2 Внутривидовой полиморфизм фрагмента сахарозосинтазного

домена гена Sus4.................................................................................................65

3.2.1 Полиморфизм нуклеотидной последовательности

фрагментов генов Sus4 S. tuberosum................................................................65

3.2.2 Кластерный анализ последовательностей фрагментов гена Sus4......................68

3.2.3 Полиморфизм аминокислотной последовательности

фрагмента белка Sus4 сортов S". tuberosum.........................................................70

3.3 Полиморфизм генов сахарозосинтазы у культурных и дикорастущих

видов томата.....................................................................................................73

3.3.1 Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов

генов Sus2 томата.......................................................................................73

3.3.2 Анализ аминокислотной последовательности фрагмента

белка Sus2................................................................................................76

3.4 Полиморфизм генов сахарозосинтазы у представителей семейства Solanaceae и возможность их использования для проведения филогенетического анализа......................78

3.4.1 Полиморфизм фрагмента сахарозосинтазного домена

генов-гомологов Sus4 у представителей семейства Solanaceae...............................79

3.4.2 Полиморфизм глюкозилтрансферазного домена

генов-гомологов Sus4 у представителей семейства Solanaceae...............................81

3.4.3 Филогенетический анализ последовательностей, кодирующих глюкозилтрансферазный домен у видов Solanaceae.....................................................84

3.5 Идентификация генов-гомологов Rxl у видов Solanum секции Petota

и изучение их полиморфизма.................................................................................86

3.5.1 Подбор образцов для получения генов-гомологов Rx....................................86

3.5.2 Разработка праймеров для амплификации генов-гомологов Rxl

у видов Solanum секции Petota......................................................................87

3.5.3 Экзон-интронная структура генов-гомологов Rxl видов Solanum

секции Petota.............................................................................................90

3.5.4 Полиморфизм последовательностей генов-гомологов Rxl

видов Solanum секции Petota.......................................................................93

3.5.5 Полиморфизм аминокислотных последовательностей

генов-гомологов Rxl видов Solanum секции Petota.............................................98

3.5.6. Кластерный анализ аминокислотных последовательностей

Rxl белков видов Solanum секции Petota........................................................101

3.6 Анализ полиморфизма NBS доменов генов-гомологов Rxl

методом EcoTILLING.........................................................................................103

Заключение............................................................................................108

Основные выводы...................................................................................113

Список сокращений................................................................................114

Публикации по теме диссертации.............................................................116

Список литературы.................................................................................117

Приложение 1........................................................................................139

Введение

Картофель (Solanum tuberosum L.) принадлежит к семейству Solanaceae и является важнейшей сельскохозяйственной культурой. Российская Федерация занимает ведущие позиции по объемам производства картофеля (http://faostat.fao.org). Потери урожая картофеля вызывает воздействие целого ряда фитопатогенов, борьба с которыми является важнейшей и до сих пор нерешенной задачей. Помимо этого, большое значение имеет изучение факторов, влияющих на качество урожая картофеля, а именно содержание и состав углеводов в клубнях, основным из которых является крахмал.

В последние годы значительное внимание уделялось исследованию генов углеводного метаболизма картофеля. Был выявлен ряд локусов количественных признаков (QTL), связанных с накоплением и транспортом углеводов у картофеля (Li et al., 2008, 2010). Одним из них является ген Sus/SuSy, кодирующий фермент сахарозосинтазу, обеспечивающий обратимое расщепление сахарозы на УДФ-глюкозу и фруктозу, которые необходимы для синтеза крахмала в клубнях картофеля и являются основными запасными сахарами плодов томата. Показано также, что сахарозосинтаза вовлечена в ответные реакции растения на абиотический стресс, в том числе осмотический, анаэробный и температурный (Dejardin et al., 1999; Kleines et aL, 1999; Liu et al., 2013). Однако, несмотря на важность этого фермента, на данный момент из всех представителей Solanaceae известны последовательности генов сахарозосинтазы только картофеля (S. tuberosum) и томата (S. lycopersicum). Полиморфизм генов сахарозосинтазы у представителей Solanaceae практически не изучен, отсутствуют данные об аллельном разнообразии гена и о численности данного семейства генов у видов Solanum секции Petota. Изучение вариабельности генов сахарозосинтазы у различных представителей семейства может прояснить общие вопросы, связанные не только с углеводным метаболизмом растений, но и с устойчивостью к абиотическому стрессу.

Одним из факторов, влияющих на урожайность картофеля и качество получаемой продукции, является зараженность посевов различными вирусными болезнями, при этом потери урожая могут достигать 70% (Анисимов и др., 2009). Одним из вредоносных является X вирус картофеля (PVX), поражающий надземные части растения. Несмотря на существенные потери от вирусных инфекций на сегодняшний день не существует надежных химических методов борьбы с ними. Наиболее перспективным методом является получение растений картофеля, несущих гены устойчивости к патогенным вирусам. Однако устойчивость современных сортов картофеля постепенно преодолевается новыми штаммами вируса в ходе коэволюции растение-вирус. Поэтому большое значение приобретает поиск новых источников генов устойчивости к X вирусу, которыми могут стать дикорастущие

виды картофеля. Идентификация новых генов устойчивости к X вирусу и изучение их полиморфизма у этих видов может не только прояснить ряд вопросов формирования ответной реакции растений на воздействие вирусной инфекции, но и способствовать селекции новых, более устойчивых к вирусам сортов. Следует отметить, что на сегодняшний день известны последовательности генов устойчивости к X вирусу только у двух образцов -S. tuberosum и S. acaule. Однако нет данных о полиморфизме этих генов у других представителей Solatium секции Petota, в том числе видов и образцов устойчивых к PVX.

Помимо идентификации генов сахарозосинтазы и генов устойчивости к PVX у дикорастущих видов картофеля, которые могут стать источниками ценных хозяйственных признаков, и изучения вариабельности их последовательностей, интерес представляет также изучение возможной эволюции данных генов у представителей Solatium и их использование для изучения филогенетических отношений в пределах рода Solarium.

Цели и задачи исследования. Целями работы стали идентификация генов сахарозосинтазы и генов устойчивости к X вирусу картофеля у широкого круга представителей рода Solarium секции Petota, а также изучение внутривидового и межвидового полиморфизма данных генов.

Для достижения данных целей были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать и секвенировать гены-гомологи сахарозосинтазы Sus4 у видов рода Solarium секции Petota.

2. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей клонированных генов сахарозосинтазы представителей рода Solarium секции Petota. Охарактеризовать их экзон-интронную структуру и основные функциональные белковые домены.

3. Изучить внутривидовой полиморфизм фрагмента сахарозосинтазного домена гена Sus4 у сортов картофеля (S. tuberosum) отечественной и зарубежной селекции с различным содержанием крахмала в клубнях.

4. Провести анализ межвидового полиморфизма фрагментов сахарозосинтазного и глюкозилтрансферазного доменов генов-гомологов Sus4 у широкого круга представителей семейства Solanaceae. На основании полученных данных составить схему возможной эволюции данного гена у представителей семейства Solanaceae.

5. Клонировать и секвенировать гены-гомологи Rxl, определяющего устойчивость к PVX у видов рода Solatium секции Petota.

6. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Rxl генов у представителей рода Solarium секции Petota.

Охарактеризовать их экзон-интронную структуру и основные функциональные белковые домены.

7. Провести оценку внутри- и межвидового полиморфизма NBS домена генов-гомологов Rxl у видов Solarium секции Petota и сортов S. tuberosum отечественной и зарубежной селекции методом EcoTILLING.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получены полные кодирующие последовательности генов сахарозосинтазы у 13 видов картофеля, представляющих 11 серий подсекций Potatoe и Estolonifera секции Petota. Изучена экзон-интронная структура, а также кодируемые данными генами белковые последовательности. Впервые определен уровень межвидового полиморфизма генов сахарозосинтазы у представителей рода Solarium секции Petota.

На основании данных о вариабельности последовательностей фрагментов сахарозосинтазного домена Sus4 гена впервые оценен внутривидовой полиморфизм 24 сортов картофеля (S. tuberosum) с различным содержанием крахмала в клубнях. Изучен внутри- и межвидовой полиморфизм по фрагменту сахарозосинтазного домена гена Sus2 у видов и сортов томата. Впервые оценен полиморфизм сахарозосинтазного и глюкозилтрансферазного доменов генов сахарозосинтазы у различных представителей семейства Solanaceae (роды Solarium, Capsicum, Datura, Atropa, Physalis, Lycium, Brunfelsia и Nicotiana). Предложена схема возможной эволюции данного гена у представителей Solarium. Показано, что Sus4 наравне с другими низкокопийными генами ядерного генома может быть успешно использован для изучения филогении и эволюции у Solanaceae.

Впервые идентифицированы последовательности 15 генов-гомологов Rxl, определяющего устойчивость к X вирусу у дикорастущих видов картофеля S. acaule, S. megistacrolobum, S. leptophyes, S. berthaultii, S. brevicaule, S. gourlayi. Определена экзон-интронная структура генов, выявлены и описаны все основные домены Rxl Solarium. Изучен полиморфизм их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Методом EcoTILLING впервые проведен анализ фрагментов NBS доменов Rxl генов 96 образцов, включающих 18 сортов S. tuberosum, а также 41 вид Solatium секции Petota. В результате оценен уровень как внутри-, так и межвидового полиморфизма фрагмента NBS домена генов-гомологов Rxl, а также выявлен ряд видо- и образецспецифичных SNP.

Полученные в результате работы данные о полиморфизме генов Sus4 и Rxl могут быть использованы в маркер-опосредованной селекции новых сортов картофеля, скрининге аллельного разнообразия коллекций, в том числе для идентификации новых источников

хозяйственно-ценных признаков. Данные о полиморфизме гена Sus4 также могут

использоваться для решения проблем систематики и эволюции видов Solarium.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на отечественных и

международных конференциях, в том числе на 9th Plant Genomics European Meeting (Стамбул,

th

2011), Molecular Phylogenetics MolPhy-3 (Москва, 2012) и 16 Evolutionary Biology Meeting (Марсель, 2012).

Глава 1. Обзор литературы

1.1.1 Состав и классификация семейства Solanaceae (Пасленовые)

Семейство Solanaceae включает по разным оценкам 2000-3000 видов и около 90-100 различных родов растений распространенных как в умеренном климате, так и в тропиках от Центральной и Южной Америки до Австралии. Особенно широко представители данного семейства распространены в тропиках Латинской Америки, для которых эндемичными являются более 40 родов.

Solanaceae является одним из трех наиболее ценных с экономической точки зрения семейств растений. В пределах данного семейства представлено значительное разнообразие видов используемых в различных областях хозяйственной деятельности человека. Помимо клубнеобразующего картофеля (S. tuberosum L.) к семейству Solanaceae принадлежат такие важнейшие овощные культуры как томат (S. lycopersicum L.), баклажан (S. melongena L.), перец (Capsicum L.), а также ряд менее распространенных видов, плоды и листья которых употребляют в пищу (S. stoloniferum Schltdl. & Bouché, S. quitoense Lam., S. torvum Sw., S. muricatum Ait., S. aethiopicum L., S. macrocarpon L.).

К лекарственным растениям относят такие содержащие алкалоиды представители семейства Solanaceae как, например, красавка обыкновенная (Atropa belladonna L.J, скополия (Scopolia Lam.), белена (Hyoscyamus L.). Среди декоративных представителей семейства -петуния (Petunia Juss.), физалис (Physalis L.), брунфельсия {Brunfelsia L.).

Такие представители семейства Solanaceae как табак, томат и петуния являются важными модельными биологическими объектами для изучения защитных механизмов растений, процессов формирования и созревания плодов, а также многих других биологических процессов.

Благодаря огромному экономическому значению Solanaceae были предметом многих биологических и систематических исследований. В традиционной классификации семейства обычно выделяли два подсемейства: Cestroideae и Solanoideae (D'Arcy, 1979; 1991; Hunziker, 1979, 2001; Olmstead & Palmer 1992). Дополнительное подсемейство Nolanoideae, выделялось некоторыми исследователями в отдельное семейство Nolanaceae (Cronquist, 1981; Thome, 1992; Hunziker, 2001). Подсемейство Solanoideae считалось предковым в пределах семейства.

Основанная главным образом на морфологии и, в меньшей степени, на химическом составе, классификация, предложенная Armando Hunziker, отражает традиционные взгляды с некоторыми модификациями (Hunziker, 2001). В дополнение к двум основным семействам Cestroideae и Solanoideae были выделены еще четыре небольших подсемейства: Anthocercidoideae, Juanulloideae, Salpiglossoideae, Schizanthoideae.

С начала 1990-х филогенетические отношения в пределах семейства Solanaceae исследовали с использованием молекулярных методов, в частности по данным вариабельности последовательности хлоропластной ДНК (Spooner et al., 1993; Olmstead et al, 1999; Santiago-Valentín and Olmstead, 2003; Clarkson et al., 2004; Bohs, 2005; Levin et al., 2005, 2006; Weese and Bohs, 2007). Это привело к изменению как таксономического состава всего семейства и отдельных его родов, так и к изменению статуса некоторых таксонов. Например, таксономический статус родов Lycopersicon (томат), Cyphomandra, Normania, Triguera был понижен, и они были включены в состав Solanum (Olmstead and Palmer, 1992; Spooner et al., 1993; Bohs and Olmstead, 2001).

Однако, несмотря на важность семейства и достаточно большое количество проведенных исследований, множество вопросов, как таксономии, так и филогении семейства Solanaceae остаются окончательно нерешенными из-за большого видового состава семейства, сложности и неоднозначности морфологии, особенно видовой, ограничен