Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномный полиморфизм представителей сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм представителей сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum)"

На правахрукописи

КОЧИЕВА Елена Зауровна

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМ. SOLANACEAE (РОД SOLANUM, РОД LUCOPERSICO, РОД CAPSICUM)

03.00.15-генетика 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, лаборатории организации генома Института биологии гена РАН и на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева

Научный консультант: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Алексей Петрович Рысков

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Борис Федорович Ванюшин

доктор биологических наук, профессор Дмитрий Александрович Крамеров

доктор биологических наук, профессор Николай Казимирович Янковский

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «_» декабря 2004 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49, отдел защиты диссертаций. Факс: (095) 972-40-72

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «_» ноября 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Семейство Solanaceae является одним из самых представительных семейств двудольных растений и, кроме того, включает виды, являющиеся основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель, томат и перец, относящиеся к трем основным родам (Solatium, Lycopersicon и Capsicum) этого семейства.

Род Solanum является самым многочисленным из родов семейства Solanaceae. Картофель (Solanum tuberosum) и родственные ему дикорастущие и культивируемые клубнеобразующие виды Solanum объединены в подсекцию Potatoe, которая, в свою очередь, была подразделена на 19-25 серий (Юзепчук, 1938, Букасов, 1955, Hawkes, 1990). Такая классификация основывалась прежде всего на морфо-физиологических данных и / или географии распространения видов, а также подразумевала наличие филогенетических отношений между видами, составляющими одну серию. Проводимая в последнее время ревизия и значительное расширение коллекций образцов видов Solanum выявили существенные проблемы, связанные с определением уровней биоразнообразия и филогенетических связей, а также установлением границ для видов и серий видов (Spooner, Castillo, 1997, Spooner, Hijmans, 2001, van der Berg et al., 2002). Для выявления спорных таксономических вопросов и более полной характеристики вида и серии видов рекомендовалось использовать молекулярные методы маркирования генома. Использование методов молекулярного анализа хлороплатастной и ядерной ДНК картофеля показало часто встречающееся объединение в одну серию неродственных видов (Hosaka, 1996, Spooner, Castillo, 1997,1998, Kardulos et al., 1998, van der Berg et al., 2001, Spooner, 2004). До настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне ясным, также не были проведены оценки межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений между сериями видов.

Несмотря на небольшое количество видов, составляющих род Lycopersicon, классификация его до сих пор окончательно не разработана. Исходно таксономия рода Lycopersicon базировалась на морфологических (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999), цитологических и биохимических (Rick, Yoder, 1988) характеристиках, на основании которых было предложено несколько классификаций рода (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999). Однако так же, как и в случае с родом Solanum, до настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне определенным.

Перец (род Capsicum), наряду с томатом и картофелем, является одной из основных овощных культур, однако, в отличие от последних, представляет собой один из наименее исследованных ро ци(ЖАЛЬНА>Р М0ТРЯ на то>

библиотека

' STStUli

что 5 из 27 выделяемых на сегодняшний день видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum слабо изучены как в генетическом, так и в молекулярном плане. Данные по систематике рода Capsicum также весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980, Walsh, Hoot, 2001). При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды имеют перекрывающуюся морфологию, в результате чего идентификация, основывающаяся на морфологическом анализе, часто бывает весьма затруднительна. Исследование запасных белков семян (Panda et al., 1986), цитологический анализ (Pickersgill, 1979) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей рода Capsicum (Jensen et al., 1979) нередко показывают невозможность выделить отдельные виды. Все это свидетельствует о необходимости использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешающих систем молекулярного маркирования.

Большая часть биохимических и молекулярных исследований сем. Solanaceae была сфокусирована, в основном, на анализе только культивируемых видов, таких как Solarium tuberosum, Lycopersicon esculentum и Capsicum annuum (Miller, Tanksley, 1986, Williams, Clair, 1993, Paran et al., 1998), в то время как потенциал биоразнообразия остальных как культивируемых, так и дикорастущих видов не изучался. Между тем не исключено, что именно они могут стать донорами хозяйственно-ценных признаков, и, в первую очередь, устойчивости к фитопатогенам и вредителям (Букасов, Камераз, 1972, Pickersgill, 1980, Будин, 1994, Пивоваров, 1999). Цель и задачи исследования: провести комплексный молекулярный анализ ядерного и хлоропластного генома Solanaceae, который позволил бы охарактеризовать различные компоненты генома, выявить потенциал меж- и внутривидового геномного полиморфизма, в том числе и последовательностей семейств адаптивно-значимых генов, у представителей трех родов сем. Solanaceae; определить филогению взятых в анализ культивирующихся и дикорастущих видов Solanum, Lycopersicon и Capsicum; подтвердить таксономические статусы каждого образца и в ряде случаев определить таксономические границы вида. Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:

1. Определение уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей Solanaceae с помощью методов молекулярного мультилокусного анализа (AFLP, RAPD, ISSR), маркирующих как уникальные, так и повторяющиеся участки генома.

2. На основе данных комплексного молекулярного маркирования генома перца установление филогенетических связей между видами родов семейства Solanaceae.

, •'•>:» *i X, 1 L

; /.uro»;.

' i I 2

*«» k* A,l ¡

3. Определение уровней полиморфизма генома представителей видов и сортов Solanaceae по данным анализа микросателлитных локусов ядерного и хлропластного генома.

4. Разработка метода маркирования полиморфизма последовательностей основных адаптивно-значимых семейств растительных генов и определение потенциала биоразнообразия этих генов у представителей Solanaceae. Анализ представленности генов устойчивости в геноме и возможности генетической эрозии у современных сортов картофеля.

5. Создание коллекции SNP маркеров и применение ее для анализа и идентификации геномов сортов картофеля и томата.

6. Определение и характеристика последовательностей внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS I, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5.8S рРНК у видов рода Solanum и рода Capsicum. Исследование нуклеотидного полиморфизма данных последовательностей.

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые проведено комплексное исследование хлоропластного и ядерного генома у 712 представителей трех родов (Solanum, Lycopersicon, Capsicum) сем. Solanaceae с использованием различных систем молекулярного маркирования. Анализ более 2800 полиморфных фрагментов ДНК позволил определить уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности у анализируемых представителей семейства, филогенетические связи и уточнить таксономический статус ряда образцов. Подтверждена и дополнена классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных таксонов. Показана возможность использования молекулярного анализа для идентификации неправильно классифицированных образцов Solanaceae, а также образцов, имеющих гибридное происхождение, что является важной информацией для организации и поддержания генетических коллекций Solanaceae в генбанках.

Впервые был определен уровень геномного полиморфизма и степень родства геномов 54 сортов картофеля отечественной селекции, что в дальнейшем может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания. Кроме того, для составления индивидуальной аллельной формулы и паспортизации сортов картофеля и перца был впервые применен микросателлитый анализ ядерного и хлоропластного генома. Впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля двух типов хлоропластной ДНК.

Был разработан новый метод - метод домен-направленного маркирования (Domen Directed Profiling, DDP) - и показана возможность его использования для определения уровней биоразнообразия семейства адаптивно-значимых генов (семейства генов устойчивости, гомеозисных генов и генов серин-треониновых протеинкиназ) у различных видов и сортов

растений сем. Solanaceae, а также для филогенетического анализа соответствующих семейств генов. Впервые проведена оценка представленности генов устойчивости в геноме 445 современных сортов картофеля отечественной и европейской селекции и определены группы сортов, наиболее дивергентные по этому признаку. Впервые с использованием метода пиросеквенирования было проведено SNP маркирование и определен аллельный статус SNP генома 350 сортов картофеля. Полученные SNP могут быть также использованы для маркирования генов и отдельных хромосом при проведении маркер-ассоциативной селекции.

Разработана модифицикация метода TAIL PCR для выявления фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном инсерционном мутагенезе. Впервые показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно для прямого секвенирования без предварительного клонирования, а также в качестве зондов для сканирования геномных библиотек, что значительно ускоряет и удешевляет процесс идентификации и изолирования новых генов.

Впервые выявлен и охарактеризован межвидовой полиморфизм последовательностей рибосомного оперона у видов рода Solarium подсекции Potatoe и видов рода Capsicum. На основе данных анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомных генов (ITS) перца впервые показано одновременное присутствие в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК.

Результаты диссертационной работы используются при чтении курса по молекулярному маркированию генома растений на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева. Полученные данные и обобщения следует учитывать при молекулярной паспортизации сортов и подборе родительских форм в селекционной практике, при проведении работ по анализу геномного полиморфизма и молекулярной эволюции генома растений, а также при составлении коллекций генбанков. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции по современным проблемам селекции растений (IC&WPB) (Киев, 1990); V symposium of plant metabolism regulation (Sofia, 1990); FASEB conference (Vermont, 1993); конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 1996); конференции по молекулярно-генетическим маркерам (Ялта, 1996); Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке" (Москва, 2000); II и III съездах ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000, Москва, 2004); I и II Международных совещаниях по биоразнообразию PEN\GEB: Biodiversity of species and cultivars genomes (Florence, 1999, Санкт-Петербург, 2001); Международной научно-практической. конференции

«Генетические ресурсы культурных растений» (Санкт-Петербург, 2001); II конференции МОГиС (Москва, 2003); V Съезде общества физиологов растений (Пенза, 2003); Xllth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding ofCapsicum & Eggplant (Noordwijkerhout, 2004); EUCARPIA General Congress (Tullin, 2004); на Международных семинарах Carnegie Institution (Baltimore, 1992, 1993), EMBL (Heidelberg, 1997), Department of Biodiversity and Identity (PRI) (Wageningen, 2001,2002)и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 работ, из них 22 в российских и международных рецензируемых изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация, изложенная на 315 страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 29 таблицами и 54 рисунками.

Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Department of Biodiversity and Identity (PRI) (Нидерланды), а также с аспирантами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат также разработка программы исследования, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ геномного полиморфизма представителей трех родов сем. Solanaceae

В работе были использованы RAPD- и AFLP-методы молекулярного анализа, позволяющие исследовать полиморфизм селективно нейтральных преимущественно уникальных и умеренно повторяющихся последовательностей ДНК и метод ISSR, приводящий к амплификации межмикросателлитных последовательностей ДНК, локализованных, главным образом, в гетерохроматиновых районах генома (Wu et al., 1994, Klein et al., 2000).

3.1.1. Молекулярное маркирование генома методами AFLP, RAPD и ISSR и определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solatium

Методы молекулярного маркирования генома были использованы нами для комплексного анализа полиморфизма генома, а также для исследований таксономических и филогенетических взаимоотношений у клубнеобразующих видов рода Solanum, объединенных в подсекцию Potatoe. Для молекулярного анализа методом AFLP были подобраны 48 образцов из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова - представители 27 видов рода Solanum подсекции Potatoe. При этом виды S. kurtzianum, S. spegazzini, S. stoloniferum, S. sparsipilum, S. chacoense, S. demissum, S pinnatisectum, S. polytrichon были представлены 2-5 популяциями из различных мест произрастания.

AFLP маркирование генома Solanum при использовании четырех отобранных EcoRI/Msel праймерных комбинаций (Е12/М40, Е12/М38, Е12/М45, Е35/М41) выявило 415 полиморфных AFLP-фрагментов и позволило получить для каждого анализируемого представителя Solanum воспроизводимые полиморфные AFLP-спектры (рис.1). При этом любая из отобранных праймерных комбинаций позволяла идентифицировать генотипы каждого анализируемого образца. В результате для каждого вида и образца Solanum был получен специфичный спектр AFLP-фрагментов, при этом было выявлено 112 видоспецифичных фрагментов и 36 фрагментов, характерных для отдельных серий видов. На основании этих данных AFLP-анализа были определены уровни генетических различий представителей рода.

ИГУ

Рис.1 AFLP спектры представителей 27 видов рода Solanum подсекции Potatoe и сортов S tuberosum, полученные с использованием праймерной комбинации EcoRI+ACAJ/Мsel+AGG (предсишен фриментщщ)

Было установлено, что внутривидовой полиморфизм анализируемых видов Solanum варьировал в пределах от 0.017 (между образцами вида S demissum) до 0.13 (образцы S. sparsipilum). Для каждого из 8 выбранных видов были определены уровни внутривидового полиморфизма. Так, выявляемые уровни полиморфизма вида S. kurtzianum составляли 0.04-0.06, S. stolomferum -0.06-0.08, S pinnatisectum-0/01-0/11, S. chacoense-0.0З-0.08 Межвидовое разнообразие рода Solanum варьировало, как правило, в пределах от 0.1 (между видами S tuberosum и S andigenum) до 0.47 (между видами S pinnatisectum и S. tuberosum). Однако следует отметить, что виды S. tuberosum и S andigenum, выделяемые СМ. Букасовым, по систематике Дж. Хоукса объединены в один вид, и представители S. andigenum имеют статус подвида (Букасов, 1971, Hawkes, 1990). По всей видимости, условной границей для выделения видовых таксонов у Solanum может быть величина генетических различий большая, чем 0.12.

Также были определены генетические расстояния между различными сериями видов подсекции Potatoe. Наибольшие генетические расстояния были выявлены между сериями Pinnatisecta и Tuberosa (0.32), наименьшие - между

сериями Acaulia и Demissa (0.18). При этом генетические расстояния между сериями Acaulia и Demissa меньше, чем между некоторыми видами серии Tuberosa. Сходство серий Acaulia и Demissa географически разобщенных видов подтверждается также данными более подробного анализа морфологического и экологического сходства (Ochoa, 1990, Spooner et al., 1995), а также RFLP анализа ядерного генома (Debener et al., 1990), что говорит о возможности их объединения.

При анализе межвидового и внутривидового полиморфизма представителей рода Solatium методом RAPD было выявлено 243 полиморфных фрагмента. Для каждого образца были получены уникальные RAPD спектры, характеризующиеся своими видоспецифичными фрагментами. Так же, как и в случае AFLP анализа, было показано, что внутривидовая вариабельность исследованных представителей Solarium соответствует диапазону генетических расстояний равных 0.02-0.11. При этом минимальные показатели генетических различий так же, как и в случае AFLP, были характерны для вида S. demissum (0.02 - 0.06). Максимальный уровень полиморфизма был получен для образцов S. chacoense. Межвидовое разнообразие соответствовало диапазону различий 0.15-0.49 и было сопоставимо со значениями межвидового полиморфизма, выявляемого у Solanum методом AFLP.

При проведении ISSR маркирования было получено 192 полиморфных фрагмента генома Solanum. В результате каждый вид и образец Solanum были охарактеризованы специфическими наборами ISSR-фрагментов. Было показано, что внутривидовая вариабельность исследованных видов соответствует диапазону генетических расстояний, равному 0.04-0.13, в то время как межвидовая вариабельность соответствует 0.13-0.54. Как и в случае RAPD- и AFLP-маркирования наибольшей межвидовой вариабельностью отличались виды серии Tuberosa (S. incamayonese - S. gigantophyllum (0.25)) и Longipedicellata (S. polytrichon - S. papita (0.25)). Серия Acaulia характеризовалась наименьшим уровнем межвидового полимрфорфизма (0.15). Интересно отметить, что уровень межвидового и внутривидового разнообразия, детектируемого с помощью метода ISSR, в целом для большинства видов Solanum несколько увеличился при приблизительно сходных диапазонах вариабельности AFLP-, RAPD-, ISSR-маркеров (табл.1).

Определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum. Для определения филогении исследовавшихся видов Solanum были рассчитаны матрицы генетических расстояний с использованием коэффициента Жаккарда и проведен кластерный анализ методом UPGMA.

Табл. 1. Межвидовые и внутривидовые уровни геномного полиморфизма у представителей трех родов 8о1апасеае

Образцы видов AFLP данные RAPD данные ISSR данные

Род Solanum подсекция Potatoe

S. chacoense 003-0 08 0 05-0 10 0 03-0 28

У. denussum 0 01-0 04 0 02-0 06 0 02-0 06

У pmnataectum 0 04-0 11 0 02-0 10 0 07-013

S.mberosum- S. demissum 017-0 26 0 16-0 25 019-0 31

S.tuberosum S. pinnatisectum 0 31-0 47 028-0 49 0 35-0 54

серия Longipedicellata 0 13-0 19 015-0 23 0 12-0 24

серия Pinnatisecta 011-0 18 0 13-0 20 0 09-0 16

серия Tuberosa 018-0 37 015-0 31 0 17-0 33

Acaulta- Demlssa 0 16-019 015-018 0 16-0 18

Acaulia - Pmnutsecta 0 32-0 38 0 30-0 45 0 32-0 43

Pod Capsicum

C.baccatum 0 04-0 08 0 03-0 09 0 01-0 10

C.chacoense 0 06-0 13 0 08-0 13 0 04 0 12

C.annuum (сорта) 0 01-010 0 01-0 06 0 02-0 08

Cannuum -C galapagoense - 019-0 20 0 18-0 21

С exlmium-C. cardenasil - 017 0 18

C.frutescens-C.chlnense 013-0 20 016-0 20 016-0 20

Pod Lycoper ikon

L peruvianum 0 15-0 36 0 12-0 32 011-0 26

L plmplnelll/ohum 0 07-0 13 0 08-0 14 0 07-0 14

L esculentum (сорта) 0 01-010 0 02-0 08 0 02-0 06

L esculentum-L plmplneltifollum- 0 07-0 19 0 08-0 24 0 12-0 22

В результате были построены AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммы (рис. 1), отражающие филогенетические связи у анализируемых видов, а также проведен РСА (principal coordinate analysis) анализ (рис.2). Дендрограммы, полученные с помощью разных систем молекулярного маркирования, были сходны как по числу, так и по составу видовых кластеров и подкластеров. В целом, проведенный анализ совпал с классификацией, основанной на морфологических признаках (Букасов, Камераз, 1948, Hawkes, 1990). Так, виды, объединенные Дж. Хоуксом и СМ. Букасовым в серию Pinnatisecta, по данным молекулярного анализа также кластеризовались вместе. Виды серий Pinnatisecta (S. pinnatisectum, S. jamesii, S michoacantum) и Bulbocastana {S bulbocostanum) на AFLP, RAPD и ISSR дендрограммах образовывали наиболее удаленные от остальных видов кластеры, что подтверждается данными РСА-анализа (рис. 2) и совпадает с представлениями о сериях Pinnatisecta и Bulbocastana как наиболее древних таксонах подсекции Potatoe (Hawkes, 1990, van der Berg, Spooner, 2001). Проведенный молекулярный анализ также поддержал выделение серий Acaulia (виды S acaule, S albicans) и

Рис. 1. Дендрограмма генетических различий 47 представителей рода Solanum подсекции Potatoe, построенная на основе данных молекулярного анализа использованием метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) (STATISTICA)

Longipendicellata (S. papita, S. polytrichon, S. stoloniferum, S. fendleri, S. ajuscoense). Особый интерес представлял гексаплоидный вид S. demissum серии Demissa с крайне узким ареалом распространения в южных областях Мексики. S. demissum согласно нашим данным был крайне близок к представителям южноамериканской серии Acaulia, с видами которой образовывал на AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммах один кластер. Такое родство геномов представителей серий Acaulia и Demissa отличалось от данных исходного морфологического анализа (Букасов, 1955, 1971, Hawkes, 1990). Сходство S. demissum и S. albicans было также показано в работе по RFLP-анализу ядерного 1енома видов серии Acaulia (Debener et al., 1990, Kardolus et al., 1998). Тесное родство этих серий географически разобщенных видов также подтвердил более подробный анализ морфологического и экологического сходства (Ochoa, 1990, Spooner et al., 1995, Kardolus et al., 1998). Обращает на себя внимание расположение на AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммах образцов вида S. demissum в одном большом кластере с представителями серии Longipendicellata, что говорит о сходстве их геномов. Наши молекулярные данные подтверждаются ранее показанной возможностью участия диплоидного вида S. verrucosum серии Longipendicellata в происхождении гексаплоидного вида S. demissum (Marks, 1955, Correll, 1962, Hawkes, 1990). Однако наши результаты не полностью поддерживали дробность классификации рода

-0 01* / .

.1 о ............."-■■■-------—^-г- —--------'

00 01 02 «3 04 0,5 0,6 0? 06 09 fSfiiat 1 ,

Рис 2. Филогенетические отношения представителей рода Solanura выявляемые методом РСА (principal component analysis)(NTSYS) (буквами обозначены серии видов Т - Tuberosa (Ть- Skurtzianum, Tw -дикорастущие виды серии, Т с - культивируемые виды), В- Bulbocastana, Р-Pinnatisecta, A-Acaulia, Y- Yungasensa, L- Longipedicellatd)

Solanum и выделение большой (до 25) серии видов (Hawkes, 1990, Букасов, 1971). Так, согласно анализу хлоропластной ДНК, также не поддерживалась дробная классификация, и секция Petota подразделялась только на четыре группы (Spooner, Castillo, 1997).

Объединение конкретных видов в серии, как это было предложено Дж. Хоуксом и СМ. Букасовым, ставилось под сомнение и ранее (Spooner, van der Berg, 1992, Spooner et al., 1995, van der Berg, 2002). Многие серии, выделенные на основе только морфологических данных, объединяли неродственные виды. В ряде случаев таксономический статус серии и его дальнейшее дробление также ставились под сомнение. Так, по данным филогенетического анализа, проведенного нами на основе комплексного молекулярного маркирования, виды серии Tuberosa подразделяется на две основные группы, а не на пять, как было предложено (Hawkes, 1990). Одна включает преимущественно культивируемые виды (5 tuberosum, S andigenum, Sphureja и S weberbaueri), другая - все анализируемые дикорастущие виды серии. При этом не наблюдается более мелкого подразделения, предлагаемого Дж. Хоуксом и основанного на ареалах видов. Также не было совпадения с еще более дробной классификацией, основанной на эколого-географических сведениях по месту обитания и распространению вида (Юзепчук, 1938, Букасов, Камераз, 1948)

Наши данные о подразделении серии Tuberosa совпали с результатами AFLP, проведенного Дж. Кардолусом (Kardolus et al., 2000), который выделял третью группу, объединяющую виды S. tarijense (серия Yungastensa) и S. kurtzianum. По данным AFLP взятые нами в анализ 4 образца S. kurtzianum также образуют на дендрограммах обособленную ветвь, в то время как на RAPD- и ISSR-дендрограммах кластеризуются с дикорастущими видами секции Tuberosa. Представитель вида S. tarijense, относимый либо к серии Yungastensa (Hawkes, 1990), либо выделяемый в отдельную серию Tarijensa (Букасов,1971), на RAPD- и ISSR-дендрограммах также обнаруживает филогенетические связи с серией Tuberosa.

В целом, можно говорить о соответствии классификаций клубнеобразуюидах видов Solatium, основанных на морфологических и эколого-географических данных, и результатах филогенетических построений на основе молекулярного анализа генома(Букасов, 1971 , Hawkes, 1990). Были подтверждены границы видов. Также молекулярные данные подтвердили объединение видов в серии Pinnatisecta, Acaulia, Longipendicellata. При этом были показаны значительные отличия генома видов Pinnatisecta от представителей других серий, что совпадает с представлениями о серии Pinnatisecta как более древней и примитивной и подтверждается морфологическими данными. Однако использование различных типов молекулярных маркеров не поддержало дробление серии Tuberosa, основанное на географии произрастания видов. Молекулярные данные однозначно подтвердили предполагаемое по результатам морфо-экологического анализа сходство геномов географически разобщенных видов S. demissum и видов серии Acaulia. Для ряда видов (S. multidissectum, S. tarijense) показано филогенетическое родство с видами не своих серий.

3.1.2. Молекулярное маркирование генома методами RAPD, AFLP и ISSR и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon

Для молекулярного анализа методами RAPD и ISSR были подобраны 54 образца представителей 9 видов рода Lycopersicon. При этом виды L. peruvianum, L. parviflorum, L. pimpinellifolium, L. cheesmanii, L. esculentum были представлены 2-34 популяциями и/или разновидностями из различных мест произрастания, а также в анализ были взяты 10 сортов культурного томата. В AFLP-анализ было отобрано 23 образца рода, включающих представителей всех анализируемых видов.

При RAPD-маркировании 54 представителей рода Lycopersicon амплифицировано 248 полиморфных фрагментов ДНК. Для каждого из видов дикорастущего и культурного томата получены уникальные RAPD-спектры, характеризующиеся своими видоспецифичными фрагментами, ряд из которых

был клонирован и секвенирован. Наибольший уровень внутривидового полиморфизма наблюдался для L. peruvianum (табл. 1), что согласуется с ранее полученными молекулярными данными о геномной гетерогенности этого вида томата (Miller, Tanksley, 1990, Alvarez et al., 2001). Можно отметить, что в целом степень геномной дивергенции у перекрестноопыляемых видов (L. hirsutum, L. peruvianum) значительно выше, чем у самоопыляемых (L. pimpinellifolium, L. parviflorum, L. cheesmanii, Lesculentum).

На основании полученных RAPD-спектров были определены генетические расстояния между анализируемыми представителями рода Lycopersicon и, используя метод кластерного анализа (UPGMA), построена дендрограмма, на которой четко выделяются два кластера (рис. 3). Первый образуют представители подрода Eriopersicon: виды L. hirsutum, L. peruvianum с разновидностями, L. glandulosum, L. chilense, L chmilewskii и L. parviflorum, при этом близкородственные виды L. chmilewskii и L. parviflorum формируют отдельный субкластер. Сходство геномов этих двух видов, выявленное в результате RAPD-маркирования, подтверждается как морфологическими (Rick, 1979), так и молекулярными данными RFLP- и STMS-анализов (Smulders et al., 1997, Alvarez et al., 2001). Образцы L. chilense и L. glandulosum на дендрограмме не образуют обособленных ветвей, располагаясь внутри субкластера, образованного представителями гетерогенного вида L. peruvianum. Второй кластер на дендрограмме образован красноплодными самоопыляющимися видами подрода Lycopersicon (=Eulycopersicon C.H.Mull.) - L. pimpinellifolium, L. pimpinellifolium var. racemigerum, L. cheesmanii, L. cheesmanii var. minor и L. esculentum. Уровень полиморфизма между этими видами подрода относительно низок (0.12-0.22). Виды L. pimpinellifolium и L cheesmanii обособлены от основных представителей L. esculentum и образуют два субкластера. Разновидности полукультурного и культурного томата L. esculentum, за исключением некоторых представителей L. esculentum ssp. subspontaneum var. cerasiforme, формируют отдельный субкластер. При этом дальнейшее таксономическое деление L. esculentum по результатам RAPD-анализа определить не удается.

Трудности в молекулярной идентификации сортов L. esculentum были описаны и ранее (Miller, Tanksley, 1990, Rom et al., 1995), и объяснялись высокой консервативностью генома томата. С целью обогащения спектра при выявлении полиморфизма сортов томата отечественной и зарубежной селекции, в RAPD-реакции была использована двухпраймерная система. При использовании двухпраймерной системы для каждого из анализируемых сортов томата был получен уникальный RAPD спектр. При сортовой идентификации томатов нам не удалось детектировать сортоспецифические

фрагменты, за исключением сорта Талалихин 186. В отличие от межвидового, межсортовой полиморфизм томата значительно менее выражен, что соответствовало ожидаемым результатам и совпадало с исследованиями, проведенными на томатах ранее (Miller, Tanksley, 1990, Williams, Clair, 1993, Rom et al., 1995). Можно предположить, что это связано с низкой вариабельностью генома L. esculentum, которую можно объяснить как

Генетические расстояния

Рис. 3. Дендрограмма 53 представителей 9 видов рода Ьуеоретеоп, построенная по результатам RAPD маркирования генома томата с использованием

метода UPGMA

естественной тенденцией к изолированию популяций томата благодаря самоопылению, так и ограниченным числом видов томатов, используемых при селекции новых сортов.

При проведении КЗК-маркирования генома дикорастущих и культивируемых видов Lycopersicon было получено 304 полиморфных фрагмента генома. Показано, что количество фрагментов в ISSR-спектрах и степень детектируемого полиморфизма пропорциональна вырожденности якорной последовательности используемого микросателлитного праймера. Для всех образцов Lycopersicon в спектрах амплифицировались видоспецифичные ISSR-фрагменты, часть из которых была клонирована. ISSR также выявил

крайне низкий уровень межсортового полиморфизма генома культурного томата L. esculentum (0.02-0.06).

В результате AFLP-маркирования 23 представителей видов и разновидностей рода Lycopersicon было получено 204 полиморфных фрагмента, что позволяло идентифицировать генотипы каждого анализируемого образца томата. Величины геномного полиморфизма представителей рода, определенные в результате AFLP маркирования, были идентичны таковым, определенным в результате RAPD- и ISSR-анализов генома томата. Внутривидовые геномные различия исследовавшихся видов варьировали в пределах от 0.03-0.23 (между образцами L. esculentum sensu lato) до 0.15-0.36 (между образцами L. peruvianum). При этом геномные различия между образцами вида L. peruvianum были значительно выше, чем различия между другими видами рода Lycopersicon. Так, например, уровни межвидового полиморфизма L. chmilewskii и L. parviflorum составляли 0.09-0.20, между L. hirsutum и L. cheesmanii - 0.21-0.28.

Суммируя результаты проведенного комплексного молекулярного анализа генома видов, разновидностей и сортов Lycopersicon, можно отметить, что, используя каждый из методов, были определены генетические различия между видами рода Lycopersicon, популяциями видов L. peruvianum, L pimpinellifolium и L. esculentum, а также современными сортами томата. Наибольший уровень геномного полиморфизма детектировался у вида L. peruvianum. При этом уровень внутривидовых различий L peruvianum ssp. dentatum и другими представителями этого вида выше, чем межвидовой полиморфизм L. cheesmanii, L. pimpinellifolium и L. esculentum, что может говорить о возможности пересмотра таксономического статуса представителей вида L. peruvianum. Филогения рода Lycopersicon, построенная по результатам RAPD, AFLP и ISSR, в большой степени совпадает с систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках и молекулярных данных ядерного и пластомного анализа (Palmer, Zamir, 1982, Miller and Tanksley, 1990). При этом следует отметить, что представители вида L cheesmanii не выделяются в отдельный субкластер, а группируются вместе с представителями либо L. pimpinellifolium (RAPD, ISSR), либо с L esculentum (AFLP). Вид L. cheesmanii является эндемичным видом Галапагосских островов и, хотя и является близкородственным для L. pimpinellifolium и L. esculentum, выделяется по всем классификациям в отдельный вид (Muller, 1940, Rick, Lamm, 1955, Храпалова, 1999). Данные молекулярного анализа 24 разновидностей и подразновидностей вида L. esculentum не совпали с ботанической классификацией этого вида (Брежнев, 1958, Храпалова, 1999).

3.1.3. Молекулярное маркирование генома методами RAPD, AFLP и ISSR и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Capsicum

В анализ были взяты образцы ДНК 142 представителей 11 видов рода Capsicum, включающих как дикорастущие, так и культивируемые виды перца Большинство исследовавшихся видов были представлены 4-27 образцами из различных мест произрастания. Было идентифицировано 1856 полиморфных фрагментов ДНК генома перца. Результаты, полученные при использовании различных систем мультилокусного маркирования, выявили значительное сходство данных о внутривидовом и межвидовом генетическом разнообразии рода Capsicum. При использовании различных молекулярных методов было показано, что внутривидовой полиморфизм исследовавшихся видов перца варьировал в пределах от 0.01 (между сортами С. аппиит) до 0.13-0.14 (образцы С. chínense). В свою очередь, межвидовое разнообразие рода Capsicum соответствовало диапазону 0.15-0.31. Величины генетических различий, равные 0.13-0.14, являлись условной границей, разделяющей под- и надвидовые таксоны рода Capsicum.

Проведенный тест Мантела (Mantel, 1965) подтвердил высокую степень корреляции между показателями генетического разнообразия образцов перца, полученных с использованием трех различных методов молекулярного анализа генома и конгруэнтность построенных на их основе дендрограмм.

Согласно результатам кластерного анализа, образцы исследовавшихся видов формируют на дендрограммах три основные таксономические группы, соответствующие трем комплексам близкородственных видов перца, каждый из которых включает как культивируемые, так и дикорастущие виды Capsicum (рис. 4). Последние, по всей видимости, представляют собой предковые формы современных культурных видов перца, что лежит в основе гипотезы о полифилетическом происхождении культивируемых таксонов рода Capsicum (McLeod et al., 1983). Обширный и полиморфный кластер на дендрограммах формируют виды, относимые к комплексу аппиит (С. аппиит, С. frutescens, С. chinense).

Наиболее актуальным таксономическим вопросом, связанным с этим комплексом, является вопрос об идентификации входящих в его состав видов, а, следовательно, правомочности их выделения как отдельных видовых таксонов. Трудность идентификации данных видов связана с их близкородственностью и, как результат, способностью образовывать межвидовые гибридные формы (Eshbaugh, 1993). Согласно нашим данным, представители каждого вида комплекса аппиит образуют на дендрограммах четкие видоспецифичные подкластеры, поддерживаемые высокими значениями бутстрепа (69-100%), тем самым подтверждая свои видовые

0,00 0,05 0,10 0.15 0.20 0,25 0 30

Рис. 4. Дендрограмма генетических различий 56 представителей 11 видов рода Capsicum, построенная на основе данных RAPD-анализа

статусы. Близкородственные виды С. frutescens и С. chinense формировали отдельные подкластеры, поддерживаемые высокими значениями бутстрепа (70%). Подкластер, объединяющий сорта С. аппиит, отличается самым низким уровнем генетического разнообразия в этой группе видов (0.01-0.06). Не было также выявлено корреляции между дробной кластеризацией сортов С. аппиит и их морфологическими признаками.

Нами впервые получены молекулярные данные относительно филогенетического положения С. galapagoense, недавно описанного и малоизученного вида перца, морфологически значительно отличающегося от других видов рода Capsicum (Heiser, Smith, 1958). Согласно этим результатам вид С. galapagoense показал наибольшую степень сходства с представителями вида С. frutescens (0.17-0.20, RAPD-данные) и С. аппиит (0.17-0.20, ISSR-данные), входя на дендрограммах в кластер генетического комплекса аппиит.

Виды и разновидности перца, относимые к генетическому комплексу baccatum (С. baccatum var. baccatum, С. baccatum var. pendulum, С. praetermissum) на дендрограммах образуют отдельный кластер. В противоположность мнению о том, что С. praetermissum является разновидностью С. baccatum (Bosland, Votava, 2000), образцы С. baccatum и С. praetermissum, согласно полученным нами молекулярным данным, образуют компактные, удаленные друг от друга подкластеры (0.19-0.23),

поддерживаемые 100% бутстрепа, тем самым, подтверждая свои видовые статусы. Кроме того, в состав кластера комплекса baccatum вошел такой мало исследованный вид как С. tovarii. Ранее этот недавно описанный вид, согласно морфологическим данным, был отнесен к группе видов комплекса pubescens (Eshbaugh et al., 1983). Однако проведенный изоферментный анализ (McLeod et al., 1983) и анализ нуклеотидного полиморфизма последовательностей отдельных генов (Walsh, Hoot, 2001) не выявил родства между С. tovarii и другими комплексообразующими видами. Результаты же проведенного нами AFLP-анализа позволили детектировать сходство генома этого вида с геномами видов комплекса baccatum (100% бутстрепа), что совпало с данными гибридологического и цитологического анализов С. tovarii (Tong, Bosland, 1999).

Виды третьего генетического комплекса, комплекса pubescens, по данным молекулярного анализа, образуют отдельный полиморфный кластер, в котором наибольшее генетическое сходство отмечается между дикорастущими видами С. eximium и С. cardenasii (0.15-0.16) (98% бутстрепа). Действительно, оба диких вида имеют ряд схожих морфологических признаков, и, более того, это единственные виды из рода Capsicum, которые при скрещивании дают высоко фертильные гибридные растения (Eshbaugh, 1976). Представители культивируемого вида С. pubescens формируют несколько дистанцированный от дикорастущих представителей комплекса pubescens кластер, при этом наиболее близким С. pubescens видом в этой группе является С. eximium (0.220.24).

Согласно результатам молекулярного анализа, в зависимости от используемого метода маркирования, образцы вида С. chacoense проявляли либо большее сходство с представителями комплекса аппиит (0.16-0.24, ISSR-данные), либо с представителями комплекса baccatum (0.26-0.29 (AFLP), 0.200.23 (RAPD)), однако, при этом всегда формировали отдельный кластер, удаленный от остальных видов рода Capsicum, что подтверждалось результатами РСА. Полученные данные также совпали с результатами проведенного нами, молекулярного маркирования отдельных семейств генов, а также данными изоферментного анализа, где С. chacoense был охарактеризован как вид, равноудаленный от всех комплексообразующих видов перца (McLeod et al., 1983). В совокупности с данными о географическом распространении вида С. chacoense все вышесказанное позволяет сделать предположение о возможной роли данного вида как предкового для представителей всех трех комплексов близкородственных видов перца. И тогда отмечаемая нами нестабильность положения кластера С. chacoense относительно других групп видов Capsicum, зависящая от типа маркируемых последовательностей, могла бы отражать величину генетического вклада С.

chacoense как предковой формы в геномы той или иной группы видов-потомков.

Таким образом, основываясь на данных комплексного молекулярного анализа, а также данных морфологии (Eshbaugh, 1980), межвидовой гибридизации (Tong, Bosland, 1999), цитологического анализа (Pickersgill, 1979), анализа ферментов (Jensen et al, 1979, McLeod et al., 1983) и анализа нуклеотидного полиморфизма спейсера хлоропластных atpB-rbcL генов (Walsh, Hoot, 2001), мы предлагаем выделять следующие комплексы близкородственных видов перца:

комплекс annuum- дикорастущие и культивируемые формы С. annuum, C.frutescens, С. chinense, а также вид С. galapagoense;

комплекс baccatum - дикорастущие С. tovarii, С. praetermissum, С. baccatum var. baccatum и культивируемая форма С. baccatum var. pendulum;

комплекс pubescens - дикорастущие виды С. eximium, С. cardenasii, культивируемый вид С. pubescens;

комплекс chacoense - дикорастущий вид С. chacoense.

3.2. Анализ полиморфизма основных семейств генов (RGA-, MADS- и РК-генов) у представителей сем. Solanaceae методом DDP- маркирования

Помимо анализа случайных последовательностей генома Solanaceae, проведенного посредством AFLP-, RAPD-, ISSR-маркирования, представляло интерес исследование вариабельности адаптивно-значимых семейств генов растений, таких как гены резистентности, MADS-box гены и гены протеинкиназ. Для характеристики генетического разнообразия этой части генома Solanaceae впервые был использован разработанный совместно с группой X. ван ден Линдена (PRI, Wageningen, the Netherlands) метод домен-направленного маркирования (Domain Directed Profiling, DDP). Были разработаны модификации метода для маркирования семейств генов, содержащих специфические консервативные домены, такие как домены генов устойчивости (NBS-LLR), домены гомеозисных генов (MADS-box) и домены серин/треониновых протеинкиназ. Модификации метода DDP-маркирования были обозначены как NBS-маркирование (NBS-profiling), MADS-маркирование (MADS box-profiling) и РК-маркирование генов протеинкиназ (PK-profiling).

Разработка вариантов метода DDP маркирования генома. DDP-метод основан на использовании в селективной амплификации специфических вырожденных праймеров, гомологичных последовательностям консервативных доменов исследуемых семейств генов. Для методики NBS-маркирования семейства генов резистентности (R-генов и RGAs) были разработаны

специфические праймеры к различным участкам NBS-домена: kinase-2 мотиву (NBS5A, NBS6), GLPL- мотиву (NBS9) и мотиву Р-петли (NBS1, NBS3), включающему последовательности TIR/non-TIR доменов. Было показано, что NBS праймеры, комплементарные одному и тому же мотиву, но несколько отличающиеся по расположению и нуклеотидному составу, могут приводить к амплификации различных NBS-спектров и, таким образом, генетическая вариабельность, детектируемая при NBS-маркировании, может быть увеличена путем адаптации праймерных последовательностей для маркирования новых RGAs. Возможность проведения NBS-маркирования, высокая специфичность и воспроизводимость полученных спектров были показаны нами не только для видов и сортов Solanaceae, но также и для представителей сем. Роасеае (виды и образцы Aegilops, виды Triticum, сорта твердых и мягких пшениц, виды и сорта Hordeum, подвиды Oriza sativa), Oleaceae (род Syringa) и Brassicaceae (экотипы Arabidopsis thaliana).

Для определения степени представленности R-генов и RGAs в NBS-спектрах проводили секвенирование и последующий анализ полученных NBS-фрагментов картофеля и томатов. Большинство проанализированных фрагментов (в случае NBS5 и NBS9 до 90%) были гомологичны известным последовательностям R-генов и RGAs различных видов растений. Ранее был опубликован ряд методик для определения уровней полиморфизма и биоразнообразия локусов, определяющих устойчивость к фитопатогенам (Waugh et al., 1997, Chen et al., 1998, Hayes et al., 2000), однако частота встречаемости RGA-последовательностей в спектрах не превышала 25% (Hayes et al., 2000). В случае NBS-маркирования, принимая в расчет все использованные праймеры и рестриктазы, для всех видов растений встречаемость RGAs в спектрах составляла 50-90%.

Принципы анализа семейства генов, имеющих консервативную доменную структуру, положенные в основу метода NBS-маркирования генов устойчивости, были использованы для разработки метода маркирования семейства гомеозисных MADS-box генов (MADS-маркирование) и генов серин-треониновых протеинкиназ (РК-маркирование).

Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Solanum. Метод NBS-маркирования был использован для широкомасштабного анализа полиморфизма NBS-LRR генов резистентности и их аналогов у 445 сортов картофеля европейской и отечественной селекции, а также 12 видов Solatium, наиболее активно использующихся при селекции новых сортов картофеля в рамках международной программы GEDIFLUX.

В анализе было использовано 6 комбинаций NBS-праймерХ рестриктаза. Каждая из комбинаций приводила к амплификации 30 (NBS5A+NBS6) - 70 (NBS9) фрагментов. Для каждого анализируемого образца картофеля реакция

проводилась вповторах, и полученные спектры (рис. 5, соседние дорожки) были идентичны, тем самым еще раз подтверждая высокую воспроизводимость DDP-спектров. Всего было получено 173 фрагмента NBS-LRR семейства генов, 115 из которых были полиморфны. Был определен уровень полиморфизма RGA-фрагментов у дикорастущих видов Solanum, который составляет в среднем 0.26, что значительно выше такового у сортов картофеля (0.11). При сравнении уровней вариабельности RGA-фрагментов у дикорастущих Solanum с другими представителями сем. Solanaceae было показано, что он несколько превышает уровень полиморфизма дикорастущих видов рода Capsicum и, по крайней мере, в два раза выше внутривидового RGA-полиморфизма у рода Lycopersicon.

На дендрограмме, построенной на основе рассчитанных расстояний генетического сходства, 445 сортов картофеля объединяются в довольно большое количество (>45) различающихся по размерам кластеров. Были определены группы сортов, наиболее дивергентных по присутствию в их геноме NBS-LRR последовательностей. Также определены группы сортов, для которых не было выявлено различий в NBS-спектрах и которые, вероятно, обладают одинаковым или очень схожим набором генов резистентности и аналогов генов резистентности. Касаясь вопроса возможной генетической эрозии у современных сортов, можно отметить, что предварительный анализ пула R-генов, определенных для сортов, полученных в различные периоды XX века, показал сходные уровни полиморфизма и не выявил его снижения и генетической эрозии.

Таким образом, метод NBS-маркирования был впервые использован для характеристики генетического разнообразия последовательностей семейства генов устойчивости и их аналогов у видов и сортов картофеля. Выявленный

высокий полиморфизм RGA-последовательностей Solanum может отражать разнообразие существующих генов устойчивости к патогенам у различных видов, а также может быть связан с точковыми мутациями в сайтах рестрикции одного гена, которые не влияют на изменение специфичности в узнавании патогена. В любом случае, полученные данные о представленности RGA-последовательностей у конкретных генотипов видов и сортов картофеля отечественной и европейской селекции позволят более обоснованно подходить к подбору родительских форм при селекционной работе.

Молекулярный анализ семейства генов устойчивости, MADS- генов и генов протеинкиназ у представителей рода Capsicum. NBS- маркирование генома перца позволило впервые оценить уровни биоразнообразия R-генов и их аналогов у 57 представителей видов и сортов Capsicum. Было получено 163 полиморфных RGA-фрагмента генома Capsicum. При этом каждый вид перца был охарактеризован определенным набором RGA-маркеров, отражающим специфичность его устойчивости к патогенам. Ряд маркеров присутствовал в спектрах лишь отдельных образцов перца. Неожиданно высокий уровень

ОП 009 010 01t ах оя ' О» 030

Рис.6. Дендрограмма генетических различий 57 представителей 11 видов рода Capsicum, построенная на основе данных NBS- маркирования

полиморфизма RGA-последовательностей (82.9%) был показан для дикорастущих представителей С. annuum из Никарагуа и Гватемалы, в то время как уровень полиморфизма сортов С. аппиит был крайне низок и составил

28.6%. Столь значительные отличия между RGA-генотипами дикорастущих и культивируемых представителей С. annuum, с одной стороны, могут говорить об ограниченности пула генов устойчивости, вовлекаемых в создание сортов, а с другой стороны, демонстрируют возможный генетический потенциал использования дикорастущих С. аппиит в будущих селекционных работах. Секвенирование полиморфных RGA-фрагментов спектра NBS5A+6/MseI и их последующий анализ показал, что около 43% из них гомологичны последовательностям уже известных генов устойчивости или RGAs.

Особый интерес в работе представляло исследование филогении полученных при использовании метода NBS-маркирования последовательностей NBS-LRR семейства генов резистентности и их аналогов у видов рода Capsicum. Для каждой из комбинаций были рассчитаны матрицы генетических расстояний и построены дендрограммы (рис. 6). Учитывая адаптивность генов резистентности, несколько неожиданным оказался тот факт, что топология RGA-дендрограммы совпадает с топологией AFLP-, RAPD- и ISSR дендрограмм: состав видовых подкластеров, а также кластеры групп видов, составляющих генетические комплексы у Capsicum практически полностью сохраняются (рис.6). Вариации касаются лишь положения кластера, сформированного представителями вида С. chacoense, который значительно обособляется от других видов. В целом же проанализированные образцы перца внутри своих мега-кластеров образуют компактные видовые подкластеры, которые, как правило, не смешиваются с представителями других кластеров. Исследование полиморфизма семейства гомеозисных MADS-box генов и генов, кодирующих протеинкиназы перца, как и в случае RGA-маркирования, позволило выявить целый ряд видо- и комплексоспецифичных фрагментов генома перца. Всего при MADS-маркировании было идентифицировано 30 видоспецифичных фрагментов. Наибольшим числом видоспецифичных фрагментов, выявленных с помощью комбинаций MADS5'R/Msel, MADSS/Msel характеризовались спектры представителей С. chínense (6 фрагментов) и С. tovarii (5 фрагментов). Специфические маркеры были получены для видов составляющих комплекс аппиит (5 фрагментов) и комплекс pubescens (1 фрагмент). 18 MADS-фрагментов были обнаружены в спектрах отдельных образцов видов перца. В целом, как и предполагалось, полиморфизм MADS-фрагментов Capsicum оказался ниже, чем полиморфизм RGA-фрагментов. Данные о более низкой вариабельности MADS-box генов, в принципе, согласуются с представлениями о природе этого семейства последовательностей, которое, в отличие от быстро эволюционирующего RGA-семейства, являются более консервативными (Theissen et al., 2000). Проведенный молекулярный анализ полиморфизма генов

протеинкиназ также выявил относительно низкий уровень вариабельности РК-фрагментов у перца по сравнению с RGA-полиморфизмом. Исключение составили представители видов C.jrutescens и С. chinense (около 50%).

Секвенирование полиморфных фрагментов спектров VK4/MseI выявило ряд ранее неохарактеризованных последовательностей генома перца, гомологичных генам протеинкиназ томата LePK2, LePK3, LePK5 и картофеля StPKl. Проведенный анализ филогенетического родства по результатам DDP-маркирования генома перца показал, что филогения Capsicum, основанная на данных о полиморфизме RGA-, MADS-, PK-последовательностей в целом

Рис. 7. РК-спектры образцов перца, полученные с использованием праймера РК4 (приведен фрагмент геля, стрелками указаны РК-фрагменты, гомологичные генам прагеинкиназ томата и картофеля)

сходна с филогенией этого рода, основанной на данных молекулярного анализа селективно нейтральных маркеров генома перца.

Таким образом, разработанный совместно с группой X. ван ден Линдена (PRI, Wageningen, the Netherlands) DDP-метод мультилокусного анализа может широко применятся для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений. DDP-спектры высоко насыщены специфическими маркерными последовательностями генов и аналогов генов резистентности (NBS-маркирование), гомеозисных генов (MADS-маркирование) и генов протеинкиназ (РК-маркирование). Корреляция между NBS-маркерами и устойчивостью к фитопатогенам говорит о том, что данный подход может быть пригоден для поиска молекулярных маркеров, ассоциированных с признаками устойчивости к фитопатогенам у различных растений. Кроме того, маркерный фрагмент может сам быть стартовой точкой для идентификации и клонирования новых генов. Как было показано для видов и сортов картофеля, томата и перца, метод DDP-маркирование может быть использовано в качестве нового подхода для поиска генов хозяйственно-ценных признаков у дикорастущих сородичей сельскохозяйственных культур. Также полученные спектры могут быть использованы для филогенетического анализа соответствующих семейств генов.

3.3. Модификация метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном

Отдельный интерес при анализе генома представляют области интеграции мобильных элементов, составляющие значительную часть растительного генома, что предполагает их первостепенную роль как в структурной организации, так и в эволюции генома растений (Turcotte et al., 2001, Bennetzen, 2000, 2002). Способность мобильных элементов генерировать мутации активно используется для получения мутантных коллекций различных растений, в том числе представителей сем. Solanaceae, таких как табак, томат и картофель (Yoder et al., 1988, Knapp et al., 1988). Метод TAIL PCR был модифицирован нами с целью использования его для анализа фланкирующих последовательностей сайтов инсерции Ds мобильного элемента при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе. Были разработаны специфические праймеры, комплементарные 5'- и 3'-концам Ds-транспозона и случайные вырожденные AD-праймеры. Была показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно, без предварительного клонирования для прямого секвенирования, а также в качестве зондов для сканирования фаговых, YAC- и ВАС-геномных библиотек. Используя систему Ac/Ds-транспозон маркированной ловушки генов (gene-trap lines), была получена мутантная коллекция линий арабидопсиса. Была показана высокая эффективность использования метода TAIL PCR для анализа фланкирующих транспозон последовательностей генома. Анализ методом TAIL PCR линии 59-5, характеризующейся эмбрио-летальным фенотипом в результате интеграции Ds-транспозона, позволил идентифицировать последовательность гена-мишени. Анализ транслированной аминокислотной последовательности выявил гомологию с рибосомальным белком RPS16 Е. coli. Ген этого белка, ранее у растений неидентифицированный, был нами обозначен как SSR16. Предполагается, что белок SSR16 участвует в сборке и стабилизации рибосомы, а также играет важную роль, либо качественную, либо количественную, в эмбриогенезе растений на постглобулярно-серцевидной стадии развития эмбриона. Было проведено картирование гена SSR16. Он был локализован на хромосоме IV между генами сег2 иАР2 (рис. 8).

инсерционном мутагенезе

19сМ

8сМ

ЮсМ

СН2

CER2

SSRI6

АР2

44сМ

52 сМ

60 сМ

68сМ

Рис.8. Локализация гена SSR16 на генетической карте IV хромосомы (положение на карте определено в результате анализа > 100 растений Б2)

3.4. Исследование нуклеотидного полиморфизма гена 5^ и транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК у представителей сем. Solaпaceae

Последовательности рибосомной ДНК (рДНК) широко применяются для исследования генетического разнообразия и реконструкции филогении у растений (Baldwin et al., 1995, Яцентюк и др., 2001, Martins et al., 2003). Был проведен сравнительный анализ полиморфизма ITS1-5.8S-ITS2 фрагментов рибосомных оперонов у представителей родов Solanaceae для оценки межродовой и внутриродовой вариабельности области рДНК, а также для сравнения с данными, полученными для других участков генома.

Для анализа полиморфизма ITS-фрагментов рода Solanum были взяты образцы ДНК индивидуальных растений 8 видов, представляющих различные серии подсекции Potatoe. Всего было выявлено 200 точечных замен. Из них 85 (42.5%) были трансверсиями, 115 (57.5%) - транзициями. При этом преобладали G--C трансверсии и Т--С транзиции. Показано, что расположение точковых замен в ITS последовательностях неравномерно, были выявлены области с повышенным содержанием нуклеотидных замен. Наибольшее количество изменений детектировалось в спейсерном участке ITS 1.

Филогенетический анализ и исследование степени дивергенции районов рДНК у разных видов Solanum показал, что ITS-последовательности культивируемых видов серии Tuberosa и сорта вида S. tuberosum кластеризуются вместе. Дикорастущие виды этой же серии-S, gourlayi и S. spegazzini- образуют субкластеры с представителями других серий: с S. chacoense (серия Yungasensa) и S. polytrichon (серия Longipedicillata) соответственно. Наиболее дивергентным является S. lycopersicoides, образующий на дендрограммах отдельную ветвь вид и представляющий другую подсекцию Petota - Estolonifera. В целом полученные дендрограммы была сопоставимы с данными мультилокусного маркирования.

Анализ аналогичного фрагмента ITS1-5.8S-ITS2 районов рибосомального оперона представителей рода Lycopersicon выявил 178 точечных замен. Так же, как и в случае анализа последовательностей рДНК видов Solanum, наиболее частый тип замен был представлен А-С транзициями, в то время как преобладающие традиционные изменения были Т— С типа. Сравнение ITS 1-последовательностей Solanum и Lycopersicon показало большую консерватвность этого района генома у видов и сортов томата. Так, например, количество нуклеотидных замен, отличающихся у двух видов томата L. esculentum и L pimpinellifolium (9), было меньше количества замен у сортов S. tuberosum (11). Наибольшие изменения анализируемого ITS1-5.8S-

ITS2 района были выявлены у представителя вида L. hirsutum, в то время как по результатам RAPD- и ISSR-анализа наиболее дистанцированным видом был L peruvianum. Сравнительный анализ с аналогичными фрагментами рибосомного оперона видов Solatium также показал неравномерное распределение точковых замен в ITS-последовательностях, при этом области повышенной локализации замен у видов картофеля и томатов совпадали.'

Неожиданные результаты были получены при анализе нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 района рДНК представителей 9 видов рода Capsicum. Амплификация этого района у индивидуальных растений видов перца выявила полиморфизм ITS-фрагментов не только по размеру, но и по их числу в спектрах. Так, у большинства видов перца детектировалось по два ITS-фрагмента. Фрагмент длиной 735 н.п. присутствовал в спектрах всех образцов перца. Второй, более короткий фрагмент, несколько различался по длине у разных видов Capsicum (рис. 9).

750 н.п

700 н.п.

650 н.п.

Рис. 9. Результаты PCR -амплификации района ITS1-5.8S-ITS2

1- L. peruvianum, 2- С. cardenasii, 3- С. galapagoense, 4- С. pubescens, 5- С. baccatum, б, 7- С. chinense, S- С. chacoense, 9- С. annuum, M - lkb ladder ("Gibko BRL").

Ранее такой полиморфизм длин амплифицированных ITS-фрагментов и одновременное присутствие в геноме двух различающихся по длине копий ITS1-5.8S-ITS2 района не был описан ни для Solanaceae, ни для других представителей высших растений. Исключение составили виды рода Lophocereus (сем. Cactaceae), у которых были идентифицированы две различающиеся по длине, функциональная и нефункциональная (псевдогенная), копии ITS-района (Hartmann et al., 2001).

Сравнительный анализ последовательностей 20 клонированных как длинных (ITSL), так и коротких (ITSS) фрагментов рДНК 14 индивидуальных растений 9 видов рода Capsicum показал, что степень гомологии ITSL и ITSS для разных видов перца была достаточно низка и в среднем составила 70.1-74.б%. При этом по последовательности ITSS- фрагмента наблюдался больший полиморфизм. Выравнивание полученных первичных последовательностей ITSL и ITSS перца обнаружило наличие у 5 видов перца (С. galapagoense, С. chacoense, С. praetermissum, С. baccatum, С. аппиит) одинаковой 43-нуклеотидной делеции в ITSS с 12б п.н. по 1б9 п.н. относительно начала ITS1-

фрагмента (рис. 10). Таким образом, в результате проведенного исследования была выявлена уникальная внутригеномная вариабельность ITS-последовательностей у видов Capsicum, связанная с присутствием в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК- ITSL и ITSS. Как мы предполагаем, данные типы рДНК поддерживаются и эволюционируют в геноме перца независимо, что может быть связано с наличием у видов перца нескольких (2-14) локусов рибосомных оперонов, расположенных на разных хромосомах (Youn-Kyu et al., 1999).

Сравнение выравненных ITS последовательностей представителей всех трех родов показало большее сходство ITS1-5.8S-ITS2 районов рибосомных оперонов Solanum и Lycopersicon. Последовательности Capsicum (в анализ брались только ITSL) значительно отличались от них как по размеру, так и по количеству нуклеотидных замен и протяженных инделей. Наиболее консервативными районами исследованных последовательностей рибосомного оперона был ген 5.8S. Во всех случаях в ITS-последовательностях

ChaH4L AGCATGAGJJhCCTTTTC-TTSTCCTCGGTGCATQCACCCAG?AC(KTCTTCGeGCGACTAATGAACCCCAACGCAAAAA?CACCAAGGAATACTCAAAT7 ChaOL AKATGAGAACCTTTTC-TTGTCCTCGGTGCAT jCACCCAGTXCSCTCTTCGGGCGACTMTOAACCCCAACSCAAMATCACCAAGJAATACTCAAATT

»ngl39L AGGAaiAÜAA^TTCCC TTjTCCTGAGIGCA7G<TACCCAG7ÄCj7^G?TGGGCGÄC7AATGAACCCCAACGCA0A>ASCAC:7iAGG/iATAC7T;'JlArr

ann*40L AGCACGAGAACCT7CCC-TCGTCCTCGGTGCATGCACCCAGTACGCSCGTCGGGAGACTAATGAACCCCAACGGGAAAAGCACCAAGGAA1ACTTAAA

алпй4Э1< XQCXCGXOAACCTTGCC-TCGTCCTCCMTGCATGCACCCAGiAC3CQCGTCGGGAQACTAATGAACCCCAAC31SAAAAGCACCAAGGAATACTTAAATT

lb AGCACGAGAACCTICCC-TCATCCICGGTGCATGCACCCAGrATGCGCGCCGGGCGACTAATGAATACCAACGCAAAAAGCACCAAGGAATACTTAAATT bacl*19L AGCACGAGAACCT^CCC-ICATCCTCOQTQCACOCACCCAeTACACCTGTCGGQCQACTAATGAACCCCAATACGAAAAGCAClAAGGAATACTCAAATT

fcec#19S CGTACGAGCGCCrCCCC-CCGICC-------------------------------------------CCGACGCASAAAGCACTAAGGAATACTTGAATC

g»l#lS CCCACGAflCATCTCCCCCTCSTCC-------------------------------------------CCGATGCGGAAAGCACCAAGGAATACTTAAATC

prft#10S CGTACQATCGCCTCCCCCTCGTCC--------------------------------------CTGGCGCGGAAAGCOCCAAGCAAtACTTAAATC

•nfl#39S CGCACOAOCOCCTCCCC-TTTTCC------------------------------------------CCAGTCCGOAAAOTOCCAAGGAATACATAAATC

■TO H93 CGCACÖAGCGCCTCCCC-ТТГГСС-------------------------------------------CCASTGCGGAAAGTOCCAAGGAATACATAAATC

cha#4S CflCACGASCGCCTCCCC-TTITCC-------------------------------------------CCAGTGCGGAAAGTOCCAAGGAATACArAAATC

chl#5 CGCACGAOCOCCTCCCCCCCGTCCTCGGTGC-------------OCüCGCCGQOCAACCAACGAACTCCOCCGCOGAAAGCGCCAMiGAATACTKSAATC

cht#30 CGCACGAGCGCCTCCCCCCCGTCCTCSGTGC-------------GCOCGCCGOGCAACCAACGAACTCCGQCGCGGAAAGCGCCAAGGAATACTTGAATC

pub#16 CATACGAGCACTCCCCCTCTTTCGTGCOTTO--------AGCGCGCeCGTCGOGCGACTAACAATCCCTQACÜTGaAAAGCACCAAGGAATACTTAAATC

Ch«#78 TGGATGATCGCCTCCCCCTTGTCC--—----—---------------------------—---CCGACAIGGAAATAGCCAAöTAATACTTACATC

Рис.10. Выравнивание последовательностей области 1TS1-5.8S-ITS2 фрагментов ITSL и ITSS видов Capsicum (приведен фрагмент выравнивания)

расположение точковых замен было неравномерно. Были выделены участки с повышенным содержанием замен и более консервативные районы, что связано, по всей видимости, с тем, что ITS-районы формируют необходимые вторичные структуры для правильного вырезания некодирующих районов при созревании транскрипта рРНК. Наибольшей консервативностью ITS последовательностей и генов 5.8S отличался род Lycopersicon. Род Capsicum характеризовался одновременным присутствием в геноме двух дивергентных типов рДНК- ITSL и ITSS, последний из которых, по всей видимости, является нефункциональной делетированной копией (псевдогеном) полноразмерного рибосомного оперона.

Также был проведен сравнительный анализ межвидового полиморфизма ITS 1-5.8 S-ITS2 районов рибосомных оперонов у представителей различных родов сем. Solanaceae и сем. Роасеае (Злаковые) и выявлены значительные

различия в эволюционировании этих участков генома. Скорости межвидовой дивергенции нуклеотидных последовательностей рибосомных оперонов у представителей сем. Solanaceae существенно превышали таковые у представителей сем. Роасеае.

3.5. Детекция SNP в генах Lycopersicon esculentum и Solatium tuberosum и SNP- маркирование генома сортов картофеля.

Точковый нуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) представляет собой мононуклеотидные замены, а также 1-3 нуклеотидные инсерции и делеции между гомологичными фрагментами ДНК. Круг видов, для которых были определены SNP и показано их применение для генотипирования, крайне узок и включает на сегодняшний день лишь такие культуры как кукуруза, соя, арабидопсис и рис (Nasu et. al., 2002, Jander et. al., 2002, Batley et. al., 2003).

В данной работе была проведена идентификация новых SNP в областях экзонов генов Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum, выяснение возможности их использования для широкомасштабного генотипирования и определения аллельного состояния генов у сортов картофеля. Подбор последовательностей ДНК известных генов Solanaceae для последующего выявления SNP проводился in silico с использованием баз данных SOLGENES и TIGR. Основными критериями отбора служили наличие у гена известной функции и расположение генов-мишеней на различных хромосомах\плечах хромосом для более широкого охвата генома. В целом из генбанков SOLGENES и TIGR было выбрано 84 кодирующих последовательности генов с известной функцией.

Для выявления SNP полиморфизма все выбранные праймеры были использованы для амплификации геномной ДНК 4 сортов томатов и 4 сортов картофеля, которые были получены из разных селекционных центров и, следовательно, потенциально имели наименее родственные геномы. Всего праймеры к 84 отобранным последовательностям экзонов амплифицировали 51 фрагмент ожидаемого размера, которые затем секвенировались. Всего было выявлено 120 нуклеотидных замен, 67 (56%) из которых были представлены трансзициями и 53 (44%)- трансверсиями.

В результате проведенных исследований были отобраны 45 SNP-маркеров в 35 различных генах Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum, которые могут быть использованы для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля, а также для маркирования генов и отдельных хромосом при проведении маркер-ассоцированной селекции. Было показано, что полученные SNP-маркеры являются специфичными для геномов

Lycopersicon и Solanum и не могут быть использованы для анализа представителей рода Capsicum.

Для массового анализа SNP у 350 сортов тетраплоидного картофеля был впервые использован метод мультиплексного пиросеквенирования, представляющего собой неэлектрофоретическое определение

последовательности нуклеотидов в реальном времени (Ronaghi et al., 1998, Purmanad et al., 2002). Интенсивность сигнала в пирограмме коррелирует с количеством нуклеотидов, встраиваемых ДНК полимеразой. Возможность количественной оценки и дискриминации различных аллельных вариантов SNP у тетраплоидного картофеля (4:0, 2:2, 3:1) явилась решающей при выборе метода детекции SNP (рис. 11). Для адаптации метода пиросеквенирования к особенностям генома картофеля и возможности проводить мультиплексные реакции в стандартную методику нами были внесены некоторые модификации.

Для определения аллельного состояния и степени гетрозиготности 350 сортов картофеля были отобраны шесть SNP. (LeMIR (A\C), СТ41(А\Т), САТ(Т\С), CWCH(AYT), PPC (A\G), ST206 (А\С). Для каждого SNP был определен процент встречаимости каждого аллельного варианта. Он оказался неодинаков, хотя в большинстве случаев у сортов детектировалась гетерозигота по SNP 2:2. Только в случае ST206 у сортов преобладала гомозигота 4G. Для SNP LeMIR и РРС ни у одного из сортов не было выявлено гомозиготы 4С и 4G, соответственно, что, по всей видимости, можно объяснить летальностью или понижением жизнеспособности в случае гомозиготного состояния SNP по этому нуклеотиду. Как известно, точечные замены могут приводить к аминокислотным заменам в функционально значимых доменах или к образованию сайта терминации транскрипции, что в случае гстерозиготы может компенсироваться дозовым эффектом других хроматид, а в случае гомозиготы приводить к летальности.

В результате для каждого из 350 сортов проведено SNP генотипирование, то есть определение совокупности аллельных вариантов и определение степени гетерозиготности шести анализируемых SNP-локусов.Наиболее часто встречающимся генотипом был A\CLEMIR 31АД AYTchln G\Gst2û6 A\Gppc, Т\С cat- Для 138 сортов (38%) был характерен уникальный SNP генотип.

3.6. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома

Solanaceae

Благодаря целому ряду свойств микросателлитов (SSRs, Simple Sequence Repeats), таких как высокий уровень вариабельности, кодоминантность, простота детекции с помощью PCR, микросателлитные

повторы стали одними из наиболее популярных типов маркеров при исследовании внутривидового генетического разнообразия, популяционном анализе, предоставляя возможность оценки размеров генетического дрейфа и уровня инбридинга, а также при генотипирования отдельных образцов (Powel et al., 1996, Smulders et al., 1997, Ashkenazi et al., 2001, Wunsch, Hormaza, 2002). Высокая плотность и равномерность распределения по геному микросателлитных последовательностей делает их идеальными генетическими маркерами для построения насыщенных генетических карт (Milbourne et al., 1998, Gianfranceschi et al., 1998). Микросателлиты, расположенные в области промотора, оказывают влияние на экспрессию гена и приводят к модификации функций белка (Gerber et al., 1994, Perutz et al., 1994, Kashi et al., 1997). В основном микросателлитные маркеры применяются для идентификации и паспортизации сортов, а также для разработки диагностических маркеров важных агрономических признаков (Yu et al., 1994, Powell et al., 1996). Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов Solatium. Было проведено исследование возможности использования 19 микросателлитных локусов картофеля и томатов, которые имели различное местоположение локализацию, преимущественно на разных хромосомах, для маркирования 32 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции и анализа полиморфизма 11 видов Solanum, использующихся в селекции новых сортов и представляющих основные серии (Acaulia, Demissa, Longipedicellata, Pinnatisecta, Tuberosa и Yungasensa) подсекции Potatoe.

Табл.2. Аллельные варианты микросателлитных локусов 11 видов Solanum.

ST47 ST83

F G D I J к L M A в E D с N G 0

Виды Solanum с X § с s * t 1 e X « ■f с * s с * o, > e * 5 X R « с * 3 с * e a с к

Í 5 § <4 3" <4 i 8' «N c» s" oC >* o? £ o; > ¡5" g 's

S. acaule + +

S. chacoense + +

S. demissum + +

S. iamessii + +

S. kurtzianum + +

S. pinnatisectum + +

S. spegazzini + +

S. sloloniferum + +

S. vernei + +

S. phureja + •f

S.tuberosum + +

S.tuberosum (сорт Раменский) + +

В результате предварительного тестирования праймеров для SSR-локусов, проведенного на образцах ДНК одного дикорастущего вида картофеля и трех сортах S. tuberosum, были отобраны 9 микросателлитных локусов SSR1, STGBSS, STM2005, STOAC58, STRBCSlb, STWIN12G, STACCAS3, ST15, ST47и ST83.

Анализ межвидового полиморфизма двух микросателлитных локусов ST47 и ST83 был проведен у 11 видов картофеля. В результате было детектировано 16 аллельных вариантов, большинство из которых были видоспецифичны. Исключения составили виды S. jamessii и & pinnatisectum, относящиеся к одной серии Pinnatisecta. Представители данных видов имели одинаковые типы аллелей анализируемых SSRs. Виды наиболее представленной в анализе серии Tuberosa характеризовались значительным аллельным полиморфизмом микросателлитных локусов. Каждый вид имел свой видоспецифичный аллельный вариант.

Для исследования внутривидового полиморфизма и генотипирования был проведен анализ вариабельности микросателлитных локусов 32 сортов S. tuberosum. В результате для девяти исследованных локусов микросателлитных 1 2 3 * 5 6 7 8 9 10 И 12 1314 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Рис. И. Аллсльная вариабельность локуса STGBSS у сортов S tuberosum (1-32) и

видов Solanum (33-35)

1 - Russet Buibanck, 2 - Mondeal, 3 - Bintije, 4- Пушкинский, 5- Чародей, 6- Невский, 7 - Пстербурккий, 8 - Лазурный, 9 - Яхонт, 10- Ластунок, 11- Росинка, 12-Белорусский-3, 13- Эффект, 14- Лорх, 15 -Лукьяновский, 16 - Раменский, 17 -Никулинский, 18 - Осень, 19 - Скороплодный, 20 - Корона, 21 - Резерв, 22 - Удача, 23 - Волжанин, 24- Ранняя Роза, 25 - Красноярский, 26 - Бежецкий, 27 - Ильинский, 28 - Бронницкий, 29 - Вестник, 30 - Жуковский, 31 - Луговской, 32 - Свитанок; 33-S phureja, 34 - Sspegazzini, 35-5 demissum.

повторов было выявлено 86 аллельных вариантов. При этом максимальное число аллельных вариантов (18) было идентифицировано для локуса SSR1, минимальное (5) - для локуса ST47. Информативность (Н) взятых в анализ SSR-локусов сортов 5. tuberosum была весьма высока и варьировала от 0.63

(STWIN12G) до 0.95 (SSRJ). Наибольшее число сортоспецифичных аллелей были свойственны сортам ВНИИКХ Никулинский, Красноярский, Ильинский, а также сорту Чародей селекции Северо-Западного НИИСХ. Нужно отметить, что в большинстве случаев, за исключением локуса STGBSS, отличался специфичными аллельными вариантами взятый в анализ дикорастущий представитель S. tuberosum (K-24532).

Сравнительный анализ полученных результатов с данными SSR-маркирования сортов картофеля голландской селекции (Esselink D., личное сообщение) показал у исследовавшихся в нашей работе сортов более широкий спектр детектированных аллельных фенотипов каждого локуса, что говорит о более широком генетическом пуле отечественных сортов.

Ранее было показано, что полиморфизм микросателлитов может быть использован также для идентификации и паспортизации сортов и отдельных генотипов (Powel et al., 1996, Ashkenazi et al., 2001, Wunsch, Hoimaza, 2002). Для паспортизации взятых в анализ сортов картофеля из 9 микросателлитных локусов были выбраны три - ST15, ST47 и ST83 - из-за их высокой информативности и небольшого количества фрагментов (1-3), которые

Табл. 3. Характеристика микросателлитных локусов сортов S. tuberosum

Локус Число аллельных вариантов Встречаемость аллельного варианта, % Информатив ность, Н

ST15 7 А-27.6 В-13.8 С-13.8 D- 6.9 Е- 27.6 F- 6.9 G - 3.4 0.89

ST47 5 А-48.3; В -34.5; D-10.4; С.Е-3.5 0.64

STS3 12 А-19.2; В,С,Е-11.5; F, 1, J.K -7.86; D,G,H,L, -3.8 0.9

SSR1 18 А-18 8; В,С -9,4, D,E,F,G -6,3; H,l,J,K,L,M,N,0,P,R,S -3.1 0.95

STRBCSIb 12 А-18.8; В -15.6; C,D,H,I,J -6.3; E.F-9.4; K,L,M -3.1 0.92

STOAC58 11 А-40.6; В-21.9; С-9.4,D-6.3; E,F,G,H,J,I,N-3.1 0.79

STGBSS 10 А-25.0; B,D,E -15,6, G -9.4; F -6.3; C,H,I,J -3.1 0.87

STM2005 7 А-31.3; В-18 8; C,D -12.5; E,F -6.3; G-3.1 0 84

STACCAS3 7 А.Е-29.6; В,С -11.1,D,F -7.4; G -3.7 0.82

STWIN12G 6 А -53.1; В -31.3; С -6.3; D,E,F-3.1 0 63

образуют спектр аллельного варианта. В результате проведенного исследования было показано, что использование только трех высоко информативных микросателлитных локусов является достаточным для составления индивидуальной аллельной формулы каждого сорта, которая может быть использована для его паспортизации. Интересно то, что для

паспортизации более 500 сортов роз (Rosa hybrida) было достаточно лишь 5 высоко информативных SSR-локусов (Esselink et al., 2003)

Полиморфизм SSR-локусов ядерного генома видов и сортов Capsicum.

Отдельный интерес в данной работе представляло исследование локусов ядерных микросателлитов у представителей рода Capsicum. Как известно, на сегодняшний день не существует опубликованных данных о праймерах к микросателлитным локусам перца, поэтому для исследования SSR-локусов генома перца в нашей работе были проверены праймерные пары к 26 локусам, которые использовались для анализа полиморфизма ядерных SSR-локусов у картофеля. Однако только лишь для 4 SSR-локусов наблюдалась амплификация фрагментов генома перца ожидаемой длины.

При анализе межвидового и внутривидового полиморфизма микросателлитных локусов LEGAST1, SSR1, STMAC47 и STRBCS1 у 33 образцов 10 видов рода Capsicum было выявлено 26 типов аллельных вариантов Наибольший уровень полиморфизма ядерных микросателлитов был показан для локуса SSR1F. Анализ полиморфизма этого локуса у перца выявил 9 аллельных вариантов. При этом такие виды перца, как С. galapagoense, С. eximium, С. praetermissum и С. pubescens характеризовались наличием видоспецифичных аллельных вариантов. Специфические аллельные варианты были получены для дикорастущих С. annuum CGN924019 и CGN924021 (Гватемала), которые так же, как и при AFLP-, RAPD- и ISSR-маркировании, значительно отличались от других представителей своего вида.

Таким образом, в результате проведенной работы показана ограниченная возможность использования праймеров, разработанных к ядерным микросателлитным локусам генома картофеля и томата для маркирования генома перца. Из 26 праймерных пар только четыре позволили амплифицировать SSR-локусы у Capsicum. Такое незначительное число микросателлитных локусов Capsicum, сходное по своим фланкирующим последовательностям с консервативными последовательностями Solanum и Lycopersicon, может говорить об относительно невысокой синтении их геномов по сравнению с коллинеарностью геномов S. tuberosum и L. esculentum.

3.7. Молекулярный анализ хлоропластного генома представителей родов Capsicum, Lycopersicon и Solanum

Хлоропластная ДНК (хлДНК) в настоящее время широко используется для филогенетических исследований, особенно для выяснения филогенетических отношений как внутри, так и между родами растений, в связи с низкой вариабельностью, относительно малым размером генома и отсутствем дуплицированных генов (Olmstead, Palmer, 1992, 1994). Интерес к хлДНК также связан с выявлением корреляции иаиждо Ctmnfoui ШИД*Ф сортов

i БИБЛИОТЕКА I 33 J СПемрвург I М М № I

культивируемых растений к различным стрессовым факторам и изменениями в хлоропластной ДНК (Longdale, 1987).

В нашей работе для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов родов Capsicum и Lycopersicon, а также для генотипирования хлДНК сортов картофеля отечественной селекции был впервые использован микросателлитный анализ пластома.Также для маркирования пластома сортов картофеля был использован RFPL-анализ хлоропластной ДНК.

Анализ хлоропластной ДНК сортов картофеля. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК 15 сортов картофеля был проведен с использованием рестриктаз Hindlll, PstI, PvuII, BamHI, EcoRI, CM, Bgll, EcoRV. При этом было впервые показано помимо Т-типа хлДНК, характерного для S. tuberosum (Hosaka, Hanneman, 1988), также присутствие у сортов пластома W-типа, свойственного дикорастущему виду S. chacoense, а также некоторым представителям вида S. andigenum. При этом количество сортов, имеющих W-тип хлоропластного генома, составляет треть от общего числа проанализированных сортов картофеля.

Проведенный анализ последовательностей хлоропластного генома сортов Т- и W-типов методом блот-гибридизации по Саузерну с Р32-меченными зондами, гомологичными известным районам хлоропластного генома герани, показал, что анализируемая хл ДНК Т- и W-типа различается делецией длиной ~ 230 н.п., которая была картирована в районе генов psaA-psbD пластома картофеля.

Исследование пластома сортов картофеля проводили также с помощью определения полиморфизма микросателлитных локусов хлДНК (cpSSRs). Для работы были отобраны праймеры к шести SSR локусам хлоропластной ДНК табака, гомологичным межгенным районам и последовательностям интронов (Bryan et al., 1999). При анализе трех полиморфных локусов (NTC6, NTC8 и NTC9) пластомов 29 сортов картофеля было выявлено 14 типов аллельных вариантов cpSSRs. Для каждого из анализируемых сортов был определен тип аллельного варианта. Также для этих локусов был определен коэффициент Н, оценивающий информативность данных микросателлитных локусов. Для 27 сортов из 29 был определен сортоспецифичный гаплотип хлоропластного генома. Было показано, что использование лишь трех информативных микросателлитных локусов позволяет маркировать пластомы сортов картофеля и использовать cpSSR в качестве маркеров при проведении межвидовых и межсортовых скрещиваний, а также при анализе цибридов. Кроме того, для анализа пластома была показана большая информативность микросателлитных локусов по сравнению с RFLP-зондами.

Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома представителей родов Capsicum и Lycopersicon. Для исследования полиморфизма хлоропластного генома 43 представителей 11 видов рода Capsicum был впервые использован микросателлитный анализ. При этом наиболее распространенный и агрономически важный вид перца, С. annuum, был представлен 28 образцами, включая разновидности и сорта. В результате было выявлено 33 типа аллельных вариантов шести микросателлитных локусов пластома Capsicum. Таким образом, для каждого анализируемого вида Capsicum был идентифицирован индивидуальный гаплотип хлоропластной ДНК. При этом некоторые виды перца, такие как С. galapagoeme, С. cardenasii, С. pubescens, С. eximium, С. chacoense характеризовались наличием видоспецифичных аллелей. Интересно отметить, что для вида С. baccatum был характерен высокий внутривидовой полиморфизм cpSSRs, неотмеченный при анализе ядерного генома тех же представителей вида, что может говорить о специфических процессах, приводящих к повышенной вариабельности пластома С. baccatum.

Более детальное исследование микросателлитных локусов пластома у 28 представителей овощного перца С. аппиит, включая 17 сортов, показало крайне низкую степень полиморфизма хлДНК этого вида: cpSSRs были либо мономорфны, либо характеризовались только двумя аллельными вариантами. Причем у подавляющего большинства образцов детектировался одинаковый аллельный вариант cpSSR-локуса. Другой аллельный вариант встречался крайне редко и только у дикорастущих представителей С. аппиит. Таким образом, исследование внутривидового полиморфизма хлоропластной ДНК представителей С. аппиит в дополнение к данным о полиморфизме ядерного генома подтвердило генетическую консервативность этого вида и, в особенности, культурных форм овощного перца. Наблюдаемое филогенетическое родство пластомов проанализированных видов рода Capsicum в целом конгруэнтно филогении, основанной на данных морфологии видов, а также данных изоферментного и молекулярного анализов ядерного генома перца, что, по всей видимости, может говорить о сходстве эволюционных процессов в ядерном и хлоропластом геномах перца.

Анализ вариабельности микросателлитных локусов хлоропластного генома у представителей культивируемых видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon (подрод Eulycopersicon) показал низкую вариабельность их хлДНК. Так сорта L. esculentum имели одинаковый гаплотип пластома. Не было значительных различий и у дикорастущих разновидностей L. esculentum. Только образец L. esculentum var. humboldtii (K2912) характеризовался присутствием специфического аллельного варианта локусов NTC6 и NTC9. Микросателлитные локусы других культивируемых видов томата - L.

pimpenellifolium и L. cheesmanii - также не отличались разнообразием выявляемых аллелей. Полученные результаты говорят о высокой гомогенности пластома культивируемых видов Lycopersicon и совпадают как с нашими, так и с литературными данными о низкой вариабельности как хлоропластного, так и ядерного генома томатов (Miller, Tanksley, 1990, Alvarez et al., 2001).

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1. Впервые проведено комплексное молекулярное маркирование ядерного и хлоропластного генома трех родов сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum), включая анонимные участки генома, микросателлитные повторы, рибосомные опероны, семейства генов (гены устойчивости, гомеозисные MADS-box гены, гены серин-треониновых протеинкиназ).

2. На основе AFLP-, RAPD-, ISSR-маркирования определены уровни межвидового и внутривидового полиморфизма геномов каждого из анализируемых родов. Показано, что уровень межвидовых различий у исследованных представителей трех родов семейства Solanaceae в целом сходен и находится в пределах 0.14-0.53.

3. На основе ДНК маркеров определены филогенетические связи и таксономический статус представителей семейства Solanaceae.

- Молекулярная филогения видов рода Solanum подсекции Potatoe, построенная по AFLP-, RAPD- и ISSR-маркерам, в целом совпадает с морфологической. Виды серии Tuberosa подразделяются на две основные группы: культивируемые и дикорастущие. Молекулярными методами подтверждены данные морфо-экологического анализа о сходстве геномов географически разобщенных видов серии Demissa (S. demissum) и видов серии Acaulia. Дня видов S. multidissectum и £ tarijense показано филогенетическое родство с видами других серий.

-Подтверждены видовые статусы близкородственных таксонов рода Capsicum (С. аппиит, C.frutescens, С. chinens;, С. baccatum, С. praetermissum) и выявлены филогенетические связи между 11 видами перца, в том числе и ранее неисследованными. Впервые проведен молекулярный анализ генома видов С. galapagoense и С. tovarii и определено их филогенетическое положение. Предложена неформальная классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных видов.

- Показано, что молекулярная филогения рода Lycopersicon, построенная по маркерам AFLP, RAPD и ISSR, коррелирует с систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках. Предложен пересмотр таксономического статуса представителей вида L. peruvianum и возможное выделение L. peruvianum ssp. dentatum в отдельный вид.

3. Установлена молекулярная природа амплифицируемых RAPD-фрагментов. Обнаружено, что анализируемый RAPD-спектр представлен преимущественно уникальными, а также слабо повторяющимися последовательностями генома. Показаны возможности использования клонированных фрагментов ДНК в качестве зондов для определения межвидовых и межсортовых различий у картофеля. Определен геномный полиморфизм и уровень родства геномов 54 сортов картофеля отечественной селекции.

4. Для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений сем Solanaceae разработан и использован метод домен-направленного маркирования (DDP) семейства адаптивно-значимых генов. Клонированием и секвенированием ДНК показано, что DDP-спектры содержат последовательности, гомологичные генам устойчивости, гомеозисным генам и i енам серин-треониновых протеинкиназ, в том числе и ранее неизвестным для данного семейства растений. Показано, что DDP-маркирование может быть использовано для филогенетического анализа соответствующих семейств генов. Впервые проведена оценка представленности генов устойчивости в геноме 445 современных сортов картофеля отечественной и европейской селекции и определены группы сортов, наиболее дивергентные по этому признаку. Анализ пула генов устойчивости не выявил возможной генетической эрозии у современных сортов картофеля.

5. Разработана модифицикация метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе. Показана возможность использования TAIL PCR-фрагментов непосредственно для прямого секвенирования без предварительного клонирования, а также в качестве зондов для сканирования геномных библиотек. Использование TAIL PCR позволило выявить новый ген SSR16, отвечающий за развитие эмбриона в постглобулярно-серцевидной стадии.

6. Создана коллекция SNP-маркеров генов Lycopersicon esculentum и Solarium tuberoswn, которые могут быть применены для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля. Впервые с использованием метода пиросеквенирования проведено SNP-маркирование генома 350 сортов S. tuberoswn и определен аллельный статус SNP у тетраплоидного картофеля.

7. Проведен анализ микросателлитов ядерного генома видов и сортов Capsicum и Solatium. Идентифицированы аллельные варианты 4 микросателлитных локусов генома перца и 10 локусов генома картофеля; определены частоты встречаемости и информативность каждого локуса. Данные использованы для составления индивидуальной аллельной формулы и паспортизации 32 сортов картофеля и 33 образцов 10 видов и сортов Capsicum.

8. Проведен анализ эволюционной изменчивости ITS1-5.8S-ITS2 фрагмента рибосомного оперона у 15 видов сем. Solanaceae. Обнаружен и охарактеризован межвидовой полиморфизм у видов рода Solatium подсекции Potatoe и видов рода Capsicum. На основе данных анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомных генов (ITS) перца выявлена внутригеномная вариабельность ITS-фрагментов и впервые показано одновременное присутствие в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов р ДНК, различающихся наличием 43-нуклеотидной делеции.

9. Микросателлитный анализ был использован для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов Capsicum и Solanum. Охарактеризованы 6 микросателлитных локусов хлДНК 43 представителей 11 видов рода Capsicum, определены частоты встречаемости, и информативность каждого локуса. Для каждого вида перца идентифицирован свой специфический гаплотип хлоропластной ДНК. Впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля хлоропластной ДНК двух типов- Т и W. Показано, эти различия в хлДНК связаны с делецией длиной ~230 н.п. в районе генов psaA-psbD пластома.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Оганесян А.С., Кочиева Е.З. Использование различных эндонуклеаз для выявления межсортового полиморфизма хлоропластной ДНК у картофеля // Известия ТСХА. 1995. №2. С.214-217.

2. Оганесян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR// Генетика. 1996. Т.32. С.448-451.

3. Кочиева Е.З. Присутствие двух типов хлоропластной ДНК у сортов картофеля // Генетика. 1997. Т.З. С.1323-1326.

4. Tsugeki R., Kochieva E.Z, Fedoroff N. A transposon insertion in the Arabidopsis SSR16 gene causes an embryo-defective lethal mutation//Plant Journal. 1997. V.10. P.479-489.

5. Кочиева Е.З., Оганесян A.C., Рысков А.П. RAPD-маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий//Молекулярная биология. 1999. Т.ЗЗ. С.893-897.

6. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для маркирования генома растений // Сельскохозяйственная биология. 1999. № 1.С.1-19.

7. Кочиева Е.З., Супрунова Т.П. Идентификация меж- и внутривидового полиморфизма у томатов // Генетика. 1999. Т.35. С. 1194-1197.

8. Рыжова Н.Н., Пышная О.Н., Кочиева Е.З. Молекулярный RAPD-анализ генома перцев // Сельскохозяйственная биология. 1999. №2. С.25-29.

9. Kochieva E.Z. Molecular markers ofpotato and tomato species and cultivars genome // in: PEN/GEB: Biodiversity and Identity. 1999. P. 14-23.

10. Кочиева Е.З., Супрунова Т.П., Семенова С.К. Использование RAPD-анализа для идентификации сортов баклажанов (Solarium melongena L.)l/ Генетика. 1999. Т.35.С.1165-1168.

11. Рыжова Н.Н., Пышная О.Н., Кочиева Е.З RAPD-анализ гибридов перца //Сельскохозяйственная биология. 2000. №5. С.103-106.

12. Тугучева Е.М., Кочиева Е.З. Использование микросателлитных последовательностей (STR) при анализе филогенетических отношений и маркировании генотипов злаков// в сборнике: Сельскохозяйственная биотехнология. 2000. T.I. C.32-38.

13. Хуссейн И., Кочиева Е.З., Хадеева Н.В. Изменения спектров пероксидаз у регенерантов Stachys sieboldii (Miq) в результате гормональных и мутагенных воздействий // Генетика. 2000. Т.36. С.1093-1099.

14. Кочиева Е.З. Молекулярное маркирование сортов баклажанов (Solanum melongena L.) // в сборнике: Сельскохозяйственная биотехнология. 2000. Т.1. С.17-24.

15. Кочиева Е.З, Рыжова Н.Н. Использование праймеров на основе повторяющихся последовательностей для маркирования генома перцев //Сельскохозяйственная биология. 2001. №2. С.37-42.

16. Кочиева Е.З., Оганисян А.С. Молекулярный анализ RAPD-маркеров генома картофеля // в сборнике: Сельскохозяйственная биотехнология. 2000. Т.1. С.24-32.

17. Храпалова И.А., Рыжова Н.Н., Пухальский ВА., Кочиева Е.З. Филогенетические отношения видов рода Lycopersicon (Tourn.) Mill, и молекулярные данные RAPD- и ISSR-анализов // Генетические коллекции овощных растении. 2001. С.244-251.

18. Кочиева Е.З., Хуссейн И., Хадеева Н.В. Использование биохимических и молекулярных маркеров для выявления полиморфизма генома овощною стахиса при микроклональном размножении // Сельскохозяйственная биотехнология. 2001. Т.2. С.54-61.

19. Кочиева Е.З, Рыжова Н.Н., Храпалова И.А., Пухальский В.А. Использование метода RAPD анализа в определении генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Licopersicon (Tourn.) Mill // Генетика. 2002. Т.38. С1298-1303.

20. Кочиева Е.З, Рыжова Н.Н., Храпалова И.А., Пухальский В.А. Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей

рода LyCopersicon (Tourn.) Mill, методом маркирования межмикросателлитных последовательностей (ISSR) // Генетика. 2002. Т.38. С.1133-1142.

21. Рыжова Н.Н., Горюнова СВ., Томилов А.А., Кочиева Е.З. Выявление двух типов внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) рДНК в геноме представителей рода Capsicum // Доклады Академии Наук. 2002. Т.387. Т.2. С.282-285.

22. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н. Молекулярное AFLP маркирование генотипов сортов перца (Capsicum annuumL) // Генетика. 2003. Т.39. С.1589-1593.

23. Kochieva E.Z., Ryzhova N.N., van Dooijeweert W., Boukema I.W., Arens P. Assessment of genetic relationships in the genus Capsicum using different DNA marker systems // Eucarpia. 2004. P. 44-50.

24. Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома перца (род Capsicum) // Генетика. 2004. Т.40. С.892-896.

25. Reeves J.C., Chiapparino E., Donini P., Ganal M., van Kaauwen M., Kochieva E., van der Linden CG, Schulman A., Vosman В., Zhang D. Changes over time in the genetic diversity of four major European crops // Eucarpia. 2004. P. 3-9.

26. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н., Молканова О.И., Упелниек В.П., КудрявцевА.М., Окунева И.Б. Род Syringa: молекулярное маркирование видов и сортов // Генетика. 2004. Т. 40. С.37-40.

27. van der Linden CG, Wouters DC, Mihalka V, Kochieva EZ, Smulders MJ, Vosman B. Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling // Theor. Appl. Genet. 2004. V.109. P. 384-393.

Объем 2,5 п. л.

Зак.252

Тир. 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

•26804

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кочиева, Елена Зауровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурно-функциональная организация генома растений W 1.1. Уникальные последовательности генома растений

1.2. Характеристика основных семейств генов растительного генома

1.2.1. Семейство генов устойчивости растений

1.2.2. Семейство MADS-box генов

1.2.3. Семейство генов протеинкиназ растений

1.3. Повторяющиеся последовательности генома растений

1.3.1. Фракция высокоповторяющейся ДНК

1.3.2. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: гены рРНК и их спейсерные участки

1.3.3. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы % генома растений

1.4. Молекулярные методы анализа растительного генома

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В

3.1. Анализ геномного полиморфизма представителей трех родов сем. Solanaceae

3.1.1. Молекулярное маркирование генома методами AFLP-, RAPD- и ISSR анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum L $

3.1.1.1. Анализ межвидового и внутри видового полиморфизма представителей рода Solanum методом AFLP

3.1.1.2. Анализ межвидового и внутривидового полиморфизма представителей рода Solanum методом RAPD

3.1.1.4. Анализ генома представителей рода Solanum методом

ISSR маркирования межмикросателлитных ^ последовательностей

3.1.1.5. Определение филогенетических отношений представителей рода Solanum

3.1.1.6. Выявление межсортового полиморфизма у представителей Solanum: AFLP-, RAPD- и ISSR-маркирование сортов картофеля (S. tuberosum) и RAPD анализ сортов баклажана (S. melongena)

3.1.1.7. Молекулярный анализ фрагментов RAPD-спектра генома картофеля ^

3.1.1.7. Влияние одиночной замены в праймере на перекрьшаемость спектров RAPD- фрагментов 3.1.7.2. Анализ молекулярной природы полученных RAPD фрагментов

3.1.2. Молекулярное маркирование генома методами RAPD-, AFLP- и ISSR-анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon (Tourn.)Mill.

3.1.2.1.Определения генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом RAPD 3.1.2.2. RAPD-анализ сортов культивируемого томата Lycopersicon esculentum

3.1.2.3.Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon. методом ISSR

3.1.2.4. Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом AFLP

3.1.2.5. Таксономические и филогенетические взаимоотношения у дикорастущих и культивируемых видов Lycopersicon, выявляемые при использовании RAPD-, АР LP- и ISSR- маркирования генома

3.1.3. Молекулярное маркирование генома RAPD-, AFLP- и ISSR- методами и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Capsicum L.

3.1.3.1. Анализ межвидового полиморфизма видов и сортов рода

Capsicum методом AFLP

3.1.3.2. Анализ внутривидового полиморфизма у Capsicum, выявляемого методом AFLP

3.1.3.3. Использование AFLP-системы молекулярного маркирования для определения филогении видов рода Capsicum.

3.1.3.4. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum RAPD-методом

3.1.3.5. RAPD-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении рода Capsicum

3.1.3.6. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum методом ISSRмаркирования межмикросателлитных последовательностей ^^

3.1.3.7. ISSR-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении видов рода Capsicum ^

3.1.3.8. Использование систем молекулярного маркирования для определения таксономически спорных образцов генетических коллекций Capsicum

3.1.3.9. Комплексный анализ генетического разнообразия видов Capsicum chinense и Capsicum frutescens с использованием

AFLP-, RAPD-, ISSR- систем молекулярного маркирования ^

3.1.3.10. Комплексный анализ генома рода Capsicum с использованием AFLP-, RAPD- и ISSR-систем молекулярного маркирования.

3.2. Молекулярный анализ основных адаптивно значимых семейств генов (генов резистентности, MADS-box генов и генов, кодирующих протеинкиназы) у представителей сем. Solanaceae

3.2.1. Разработка метода DDP-маркирования генома.

3.2.1.1. NBS-маркирование семейства генов резистентности (R-генов и RGAs)

3.2.1.2. MADS- маркирование семейства гомеозисных генов и РК-маркирование семейства генов серин-треониновых протеинкиназ.

3.2.2. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Solanum

3.2.2.1. Определение полиморфизма семейства генов резистентности у

445 сортов картофеля европейской и отечественной селекции ^^

3.2.3. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Capsicum

3.2.3.1. Общая характеристика полиморфизма RGA-фрагментов видов перца, выяв ленного при использовании метода NBS-маркирования

3.2.3.2. Использование метода NBS-маркирования для определения филогении RGA-семейства последовательностей у Capsicum

3.2.3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных RGA-фрагментов генома Capsicum

3.2.4. Молекулярный анализ семейства MADS-box генов и их аналогов у представителей рода Capsicum

3.2.4.1. Использование метода MADS-маркирования для определения филогении семейства MADS-содержащих последовательностей генома Capsicum

3.2.5. Молекулярный анализ семейства генов, кодирующих серинтреониновые протеинкиназы у представителей рода Capsicum

3.2.5.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных РКфрагментов ^

3.3. Разработка метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе

3.3.1. Использование метода TAIL PCR для анализа эмбрио-дефектной летальной мутации, вызванной инсерцией мобильного элемента

3.4. Исследование нуклеотидного полиморфизма гена 5.8S и транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК у представителей сем. Solanaceae

3.4.1. Анализ последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных последовательностей рибосомной ДНК у видов рода Solanum и Lycopersicon

3.4.2. Анализ последовательности ITS1-5.8S-ITS2 рибосомной ДНК у видов рода Capsicum

3.5. Детекция SNP в генах Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum и SNP- маркирование генома сортов картофеля

3.5.1. Выявление SNP в генах томата, картофеля и перца

3.5.2. Использование SNP для маркирования сортов S. tuberosum генома и определения аллельного статуса методом пиросеквенирования

3.6. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома Solanaceae

3.6.1. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов картофеля

3.6.2. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов перца.

3.7. Молекулярный анализ хлоропластного генома представителей родов Solanum, Lycopersicon и Capsicum

3.7.1. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК сортов картофеля

3.7.2. Анализ микросателлитных локусов хлоропластной ДНК сортов картофеля

3.7.3. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома представителей родов Capsicum и Lycopersicon

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномный полиморфизм представителей сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum)"

Семейство Solanaceae является одним из самых представительных семейств двудольных растений и, кроме того, включает виды, являющиеся основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель, томат и перец, относящиеся к трем основным родам семейства Solanum, Lycopersicon и Capsicum.

Род Solanum является самым многочисленным из родов семейства Solanaceae. Картофель {Solanum tuberosum) и родственные ему дикорастущие и культивируемые клубнеобразующие виды Solanum объединены в подсекцию Potatoe, которая, была подразделена на 19-25 серий (Юзепчук, 1938, Букасов, 1955, 1980, Жуковский 1964, Букасов, Камераз, 1972, Hawkes, 1990, 1994). Такая классификация основывалась прежде всего на морфо-физиологических данных и / или географии распространения видов, а также подразумевала наличие филогенетических отношений между видами, составляющими одну серию. Проводимая в последнее время ревизия и значительное расширение коллекций образцов видов Solanum выявили существенные проблемы, связанные с определением уровней биоразнообразия и филогенетических связей, а также установлением границ для видов и серий видов (Spooner, Castillo, 1997, Spooner, Hijmans, 2001, van der Berg et al., 2002). Для выявления спорных таксономических вопросов и более полной характеристики вида и серии видов рекомендовалось использовать молекулярные методы маркирования генома. Использование методов молекулярного анализа хлоропластной и ядерной ДНК картофеля показало часто встречающееся объединение в одну серию неродственных видов (Hosaka, 1996, Spooner, Castillo, 1997, Kardulos et al., 1998, Brayen et al., 1999, van der Berg et al., 2001). До настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне ясным, также не были проведены оценки межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений между сериями видов.

Несмотря на небольшое количество видов, составляющих род Lycopersicon (9-11), классификация томатов до сих пор окончательно не разработана. Исходно таксономия рода Lycopersicon базировалась на морфологических (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999), цитологических (Rick, Yoder, 1988), а так же биохимических (Rick, 1983, Rick, Yoder, 1988) характеристиках, на основании которых было предложено несколько классификаций рода (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999). Однако также как и в случае с родом Solanum, до настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне определенным.

Перец (род Capsicum) наряду с томатом и картофелем, является одной из основных овощных культур, однако, в отличие от последних представляет собой один из наименее исследованных родов этого семейства. Несмотря на то, что пять из двадцати семи, выделяемых на сегодняшний день, видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum изучены весьма скудно как в генетическом, так и молекулярном плане.

Данные по систематике рода Capsicum также весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980; Walsh, Hoot, 2001). Некоторые систематики описывали свыше 100 видов, в то время как другие выделяли лишь несколько видов, составляющих этот род (Eshbaugh, 1980). При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды имеют перекрывающуюся морфологию, в результате чего идентификация, основывающаяся на морфологическом анализе, часто бывает весьма затруднительна. Исследование запасных белков семян (Panda et al., 1986) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей рода Capsicum (Jensen et al., 1979) нередко показывает невозможность выделить отдельные виды. Схожие трудности в идентификации возникают и при использовании цитологического анализа (Pickersgill, 1979). Все это указывает на необходимость использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешающих систем молекулярного маркирования.

Также крайне актуальны вопросы, связанные с оценкой и анализом геномного полиморфизма основных родов и видов, составляющих семейство Solanaceae. Большая часть биохимических и молекулярных исследований были сфокусированы в основном на анализе только культивируемых видов, таких как Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum и Capsicum annuum (Prince et al, 1992,

Paran et al, 1998, Rodriguez et al, 1999), в то время как потенциал биоразнообразия остальных как культивируемых, так и дикорастущих видов упускался из виду. Между тем не исключено, что именно они могут стать донорами важных агрономических признаков, и в первую очередь устойчивости к фитопатогенам и вредителям (Pickersgill, 1980; Тимина, Балашова, 1983; Мамедов, Пивоваров, 2002).

Исходя из выше изложенного, целью данного исследования было проведение комплексного мультилокусного молекулярного анализа ядерного и хлоропластного генома Solanaceae, который позволил бы охарактеризовать различные его участки; выявление уровней межвидового и внутривидового геномного полиморфизма, в том числе и последовательностей семейств адаптивно-значимых генов, у представителей трех родов сем. Solanaceae. Также особый интерес представляло определение филогении взятых в анализ культурных и дикорастущих видов Solanum, Lycopersicon и Capsicum и подтверждение таксономические статусы каждого образца, а также в ряде случаев определение таксономических границ вида. Для достижения поставленных были целей сформулированы следующие задачи:

1. Использование методов молекулярного мультилокусного анализа (AFLP, RAPD, ISSR), маркирующие как уникальные, так и повторяющиеся участки генома, для определения уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей Solanaceae. Определение молекулярной природы амплифицированных RAPD фрагментов. Выявление уровней полиморфизма и степени родства у сортов картофеля, томата и перца.

2. На основе комплексного молекулярного маркирования генома перца установление филогенетические связи между видами родов семейства.

3. Использование метода анализа микросателлитных локусов ядерного и хлропластного генома для определения уровней полиморфизма этих локусов и маркирования генома представителей Solanaceae.

4.Разработка метода маркирования полиморфизма последовательностей основных адаптивно-значимых семейств растительных генов (семейства генов устойчивости, гомеозисных генов и генов протеинкиназ), и определение потенциала биоразнообразия этих генов у представителей Solanaceae. Анализ представленности генов устойчивости в геноме и определения возможности генетической эрозии у современных сортов картофеля.

5. Создание коллекции SNP маркеров и применение ее для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля.

6. Определение и характеристика последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5.8S рРНК у видов рода Solanum и Capsicum. Исследование нуклеотидного полиморфизма данных последовательностей.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кочиева, Елена Зауровна

ВЫВОДЫ.

1. Впервые проведено комплексное молекулярное маркирование ядерного и хлоропластного генома трех родов сем Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum), включая анонимные участки генома, микросателлитные повторы рибосомальные опероны, семейства генов (гены устойчивости, гомеозисные MADS-box гены, гены серин-треониновых протеинкиназ).

2. На основе AFLP-, RAPD-, ISSR-маркирования определены уровни межвидового и внутривидового полиморфизма геномов каждого из анализируемых родов. Показано, что уровень межвидовых различий у исследованных представителей трех родов семейства Solanaceae в целом сходен и укладывается в рамки 0.14-0.53.

3. На основе ДНК маркеров определены филогенетические связи и таксономический статус представителей семейства Solanaceae.

- Молекулярная филогения видов рода Solanum подсекции Potatoe, построенная по AFLP, RAPD и ISSR маркерам, в целом совпадает с морфологической. Виды серии Tuberosa подразделяются на две основные группы: культивируемые и дикорастущие виды серии. В соответствии с морфо-экологическими данными показано сходство геномов географически разобщенных видов S. demissum серии Demissa и видов серии Acaulia. Для ряда видов (S. multidissectum, S. tarijense) показано филогенетическое родство с видами других серий.

-Подтверждены видовые статусы близкородственных таксонов рода Capsicum (С. аппиит, С. frutescens, С. chinense, С. baccatum, С. praetermissum) и установлены филогенетические связи между 11 видами перца, в том числе и ранее неисследованными. Впервые проведен молекулярный анализ генома видов С. galapagoense и С. tovarii и определено их филогенетическое положение. Предложена неформальная классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных видов.

- Показано, что молекулярная филогения рода Lycopersicon, построенная по маркерам AFLP, RAPD и ISSR, коррелирует с систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках. Предложен пересмотр таксономического статуса представителей вида L. peruvianum и возможное выделение образцов L, peruvianum ssp. dentatum в отдельный вид.

3. Установлена молекулярная природа амплифицируемых RAPD-фрагментов. Обнаружено, что анализируемый RAPD-спектр представлен преимущественно уникальными, а также слабо повторяющимися последовательностями генома. Показаны возможности использования клонированных фрагментов ДНК в качестве зондов для определения межвидовых и межсортовых различий у картофеля. Определен геномный полиморфизм и уровень родства геномов 54 сортов картофеля отечественной селекции.

4.Разработан и использован для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений сем Solanaceae метод домен-направленного маркирования (DDP) семейства адаптивно-значимых генов. Клонированием и секвенированием ДНК показано, что DDP-спектры содержат последовательности, гомологичные генам устойчивости, гомеозисным генам и генам серин-треониновых протеинкиназ, в том числе и ранее неизвестным для данного семейства растений. Показано, что DDP-маркирование может быть использовано для филогенетического анализа соответствующих семейств генов. Впервые проведена оценка представленности генов устойчивости в геноме 445 современных сортов картофеля отечественной и европейской селекции и определены группы сортов наиболее дивергентные по этому признаку. Анализ пула генов устойчивости не выявил возможной генетической эрозии у современных сортов картофеля.

5. Разработана модифицикация метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе. Показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно для прямого секвенирования без предварительного клонирования, а также в качестве зондов для сканирования геномных библиотек. Использование TAIL PCR позволило выявить новый ген SSR16, отвечающий за развитие эмбриона в постглобулярно-серцевидной стадии.

6. Создана панель SNP-маркеров генов Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum, которые могут быть использованы для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля. Впервые с использованием методом пиросеквенирования проведено SNP-маркирование генома 350 сортов S. tuberosum и определен аллельный статус SNP у тетраплоидного картофеля.

7. Проведен анализ микросателлитов ядерного генома видов и сортов Capsicum и Solanum. Идентифицированы аллельные варианты 4 микросателлитных локусов генома перца и 10 локусов генома картофеля; определены частоты встречаемости и информативность каждого локуса. Данные использованы для составления индивидуальной аллельной формулы и паспортизации 32 сортов картофеля и 33 образцов 10 видов и сортов Capsicum.

8. Проведен анализ эволюционной изменчивости ITS1-5.8S-ITS2 фрагмента рибосомного оперона у 15 видов сем Solanaceae. Впервые обнаружен и охарактеризован межвидовой полиморфизм у видов рода Solanum подсекции Potatoe и видов рода Capsicum. На основе данных анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомных генов (ITS) перца выявлена внутригеномная вариабельность ITS-фрагментов и впервые показано одновременное присутствие в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК, различающихся наличием 43-нуклеотидной делеции.

9. Микросателлитный анализ был использован для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов родов Capsicum и Solanum. Охарактеризованы 6 микросателлитных локусов хлДНК 43 представителей 11 видов рода Capsicum, определены частоты встречаемости, и информативность каждого локуса. Для каждого вида перца идентифицирован свой специфический гаплотип хлоропластной ДНК. Впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля хлоропластной ДНК двух типов- Т и W. Показано, эти различия в хл ДНК связаны с делецией длиной ~ 230 н.п. в районе геновpsaA-psbD пластома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Был проведен молекулярный мультилокусный анализ представителей трех родов сем. Solanaceae - рода Solanum, рода Lycopersicon и рода Capsicum - с использованием методов AFLP, RAPD и ISSR, маркирующих как уникальные, так и повторяющиеся участки генома. По данным AFLP-, RAPD- и ISSR-маркирования были определены уровни межвидового и внутривидового полиморфизма геномов каждого из анализируемых родов. Показано, что уровень межвидовых различий у представителей трех родов сем. Solanaceae, в целом, сходен и укладывается в рамки 0.14-0.53. Был определен уровень внутривидовой вариабельности, который не превышал значений 0.12-0.13.

На основе данных проведенного комплексного анализа были определены филогенетические связи и таксономический статус исследуемых представителей сем. Solanaceae. Было проведено определение филогенетических отношений по данным комплексного AFLP-, RAPD- и ISSR-анализа и сравнение полученных результатов с известными классификациями клубнеобразующих видов Solanum, основанными на морфологическом анализе (Букасов 1955, 1960, Hawkes, 1990). В целом, можно говорить о соответствии классификаций, основанных на морфологических и эколого-географических данных, результатам филогенетических построений на основе молекулярного анализа генома. Были подтверждены видовые границы. Молекулярные данные также подтвердили объединение видов в серии Pinnatisecta, Acaulia, Longipendicellata. При этом отмечены значительные отличия генома видов Pinnatisecta от генома представителей других серий, что совпадает с представлениями о серии Pinnatisecta, как более древней и примитивной и подтверждается морфологическими данными. Однако использование различных типов молекулярных маркеров не поддержало дробление серии Tuberosa, основанное на географии произрастания видов. Так, по данным проведенного нами филогенетического анализа, основанного на результатах комплексного молекулярного маркирования, взятые в анализ виды серии Tuberosa, подразделяются лишь на две основные группы, а не на пять, как было предложено

Hawkes, 1990). Одна включает преимущественно культивируемые виды (S. tuberosum, S. andigenum, S phureja и S. weberbaueri), другая - все анализируемые дикорастущие виды серии. При этом не наблюдается более мелкого подразделения, основанного на видовых ареалах (Букасов, 1955, 1971, Hawkes, 1990). Молекулярные данные однозначно подтвердили предполагаемое по результатам морфо-экологического анализа сходство геномов географически разобщенных видов S. demissum и видов серии Acaulia. Для ряда видов (S. multidissectum, S. tarijense) показано филогенетическое родство с видами не своих серий.

В работе впервые был проведен AFLP-, RAPD- и ISSR-анализ вариабельности культивируемых Solanum и определен геномный полиморфизм и уровень родства геномов 54 сортов картофеля S. tuberosum и 12 сортов баклажан S. melongena отечественной селекции.

В данной работе была также впервые определена молекулярная филогения рода Capsicum, включающая все 11 видов перца, выделяемых на сегодняшний день, в том числе и ранее неисследованные. Были подтверждены видовые статусы близкородственных таксонов рода Capsicum (С. аппиит, С. frutescens, С. chinense; С. baccatum, С. praetermissum) и установлены филогенетические связи между видами. Впервые проведен молекулярный анализ генома видов С. galapagoense и С. tovarii и определено их филогенетическое положение. По результатам молекулярного маркирования нами была предложена неформальная классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных видов.

Была выявлена корреляция молекулярной филогении рода Lycopersicon, построенная по маркерам AFLP, RAPD и ISSR, и систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках. По результатам маркирования генома нами предложен пересмотр таксономического статуса представителей вида L. peruvianum и возможное выделение образцов L. peruvianum ssp. dentatum в отдельный вид.

На основании полученных данных было показано, что разработанный в сотрудничестве с голландскими учеными метод домен-направленного маркирования (DDP) адаптивно-значимых генов, характеризующихся присутствием консервативных доменных структур, может быть широко применен для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений. В работе было показано, что DDP-спектры высоко насыщены последовательностями генов и аналогов генов резистентности, гомеозисных генов и генов протеинкиназ. Выявленная на картофеле и перце корреляция между NBS-маркерами и устойчивостью к фитопатогенам может говорить о возможности применения метода DDP для поиска молекулярных маркеров, ассоциированных с признаками устойчивости у различных растений не только трех родов сем Solanaceae, а также других семейств (Poaceae, Brassicaceae, Oleaceae и др.). Помимо этого, маркерный фрагмент сам может быть начальной точкой для идентификации и клонирования новых адаптивно-значимых генов. Так, в работе были приведены данные по идентификации ряда новых для сем. Solanaceae R-генов, RGA- и РК-последовательностей.

Проведенное нами сравнение современных сортов картофеля европейской и отечественной селекции позволило оценить степень представленности в их геномах RGA-фрагментов, выявить наиболее дивергентные группы, а также сорта, не отличающиеся по присутствию в их геномах последовательностей генов устойчивости. Впервые проведенная сравнительная оценка пула резистентных генов сортов, полученных в различные периоды времени (1902-1940, 1940-1970, 1970-1995 гг.), показала отсутствие процессов генетической эрозии у современных сортов картофеля. Как было показано для сортов S. tuberosum и С. аппиит, DDP-маркирование может быть использовано в качестве нового подхода для поиска образцов дикорастущих видов-доноров генов хозяйственно-ценных признаков и дальнейшего использования их в селекционной практике. Основываясь на данных анализа представителей сем. Solanaceae, можно сказать, что DDP-маркирование может быть надежным источником ДНК-маркеров различных процессов в клетке, таких как устойчивость к фитопатогенам, морфогенез и реакции, контролируемые различными протеинкиназами.

В результате проведенной работы нами был модифицирован метод TAIL PCR, позволяющий детектировать фланкирующие последовательностей при транспозон-опосредованном А с Шз-инсер ционном мутагенезе. Разработаны специфические праймеры комплементарные 5'- и 3'-концам Ds-транспозона и случайные вырожденные AD праймеры. Показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно, без предварительного клонирования для прямого секвенирования, а также в качестве зондов для сканирования фаговых, YAC- и ВАС- геномных библиотек.

Нами была получена мутантная коллекция линий арабидопсиса, основанная на использовании системы/!сlDs-транспозон-маркированной ловушки генов. Анализ линии, характеризующейся эмбрио-летальным фенотипом, методом TAIL PCR позволил идентифицировать последовательность гена-мишени. Это оказался ген, ранее у растений неидентифицированный и обозначенный нами как SSR16. Предполагается, что белок SSR16 участвует в сборке и стабилизации рибосомы, а также играет важную роль, либо качественную, либо количественную, в эмбриогенезе растений.

Проведенный в нашей работе анализ рибосомных оперонов позволил идентифицировать нуклеотидные последовательности ITS l-5.8S-ITS2-paftoHa и определить уровни его вариабельности у представителей видов подсекции Potatoe рода Solanum и видов Capsicum. Была впервые вьмвлена внутригеномная вариабельность ITS-фрагментов и одновременное присутствие в геноме двух дивергентных типов рДНК -ITSL и ITSS- последний из которых, по всей видимости, является нефункциональной делегированной копией (псевдогеном) полноразмерного экспрессирующегося рибосомного оперона. Существование двух типов ITS в геноме рода Capsicum связывается нами с возможным существованием нескольких независимо корректируемых паралогов оперона рибосомных генов, локализованных на разных хромосомах. Сопоставление последовательностей рДНК трех родов Solanaceae показал сходство уровней межвидовой дивергенции, было выявлено неравномерное расположение точковых замен и выделены участки с повышенным их содержанием.

Сравнительный анализ рибосомных оперонов представителей всех трех родов показал большее сходство ITS1-5.8S-ITS2 районов Solanum и Lycopersicon. Последовательности Capsicum значительно отличались от них как по размеру, так и по количеству нуклеотидных замен и протяженных инделей. Наибольшим консерватизмом ITS-последовательностей и генов 5.8S отличался род Lycopersicon. Сравнение степени межвидового полиморфизма ITS1-5.8S-ITS2 районов рибосомных оперонов у представителей различных родов сем. Solanaceae с семейством однодольных - сем. Роасеае (род Aegilops)- выявило значительные различия в эволюционировании этих участков генома. Скорости межвидовой дивергенции у представителей сем. Solanaceae существенно превышали таковые у представителей сем. Роасеае.

На основании анализа 45 экзонных последовательностей генов в данной работе было выявлено 45 новых SNP-маркеров генома томата и картофеля. Для широкомасштабного анализа SNP генома растений впервые был использован метод пиросеквенирования. Было показано, что использование метода пиросеквенирования позволяет с высокой точностью определить степень гетерозиготности SNP-аллелей у полиплоидных геномов картофеля. По шести SNP было проведено генотипирование 350 сортов картофеля, были определены аллельные варианты и степень гетерозиготности шести анализируемых SNP локусов. Наиболее часто встречающимся генотипом был A\Clemir 3T\Act4i AYTchln G\Gst206 A\Gppc T\Ccat- Для 138 (38%) сортов был характерен уникальный SNP генотип.

Для детекции вариабельности 11 микросателлитных локусов видов и сортов картофеля был использован метод SSR-анализа. Для каждого SSR-локуса было определено количество аллельных вариантов и степень информативности микросателлита для выявления и маркирования полиморфизма генома представителей рода Solanum. В результате для каждого анализируемого генотипа был получен свой специфический набор аллельных вариантов микросателлитных локусов, который может являться своеобразным молекулярным паспортом данных сортов и образцов картофеля.

В результате проведенной работы показана ограниченная возможность использования для маркирования генома перца праймеров, разработанных к ядерным микросателлитным локусам генома картофеля и томата. Из 26 праймерных пар только четыре позволили амплифицировать SSR-локусы у

Capsicum и было выявлено 26 аллельных фенотипов, а для ряда видов идентифицированы видоспецифичные варианты аллелей. Такое незначительное число микросателлитных локусов Capsicum, сходных по своим фланкирующим последовательностям с консервативными последовательностями Solanum и Lycopersicon, может говорить об относительно невысокой синтении их геномов по щ сравнению с коллинеарностью геномов S. tuberosum и L. esculentum.

В данной работе впервые вариабельность микросателлитных локусов хлоропластной ДНК была использована для анализа пластома сортов картофеля отечественной селекции. Для 27 сортов из 28анализируемых был определен сортоспецифичный гаплотип хлоропластного генома. Также в работе у сортов картофеля были определены аллельные варианты хлоропластных локусов и коэффициент информативности каждого. Показано, что использование лишь трех информативных микросателлитных локусов- NTC6, NTC8, NTC9- позволяет маркировать пластом сортов картофеля и использовать их в качестве маркеров при проведении межвидовых и межсортовых скрещиваний и при анализе

• цибридов. Кроме того, методом RFLP нами впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля хлоропластной ДНК двух типов - Т и W. Показано, что эти различия в хлДНК связаны с делецией длиной ~ 230 н.п. в районе геновpsaA-psbD пластома.

В нашей работе микросателлитный анализ был также впервые использован для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов родов Capsicum и Lycopersicon. Так, для каждого вида перца был идентифицирован свой специфический гаплотип хлоропластной ДНК. Исследование внутривидового полиморфизма хлоропластной ДНК представителей С. аппиит в дополнение к данным о полиморфизме ядерного

• генома подтвердило генетическую консервативность этого вида и в особенности культурных форм овощного перца. Наблюдаемое филогенетическое родство пластома проанализированных видов рода Capsicum в целом конгруэнтно филогении, основанной на данных морфологии видов, а также результатах изоферментного и молекулярного анализов ядерного генома перца, что, по всей видимости, может говорить о сходстве эволюционных процессов в ядерном и хлоропластном геномах перца. Сравнительный анализ cpSSR-локуеов пластома всех анализируемых сортов Lycopersicon показал их мономорфизм: все они имели одинаковый гаплотип пластома.

Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о высокой эффективности применения различных молекулярных методов для комплексной характеристики генома растений, оценки уровней вариабельности и идентификации отдельных образцов, а также для филогенетических построений.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кочиева, Елена Зауровна, Москва

1. Брежнев Д.Д. Томаты. Л., 1955. 349 с.

2. Брежнев Д.Д. Томат Lycopersicon Tourn. // Культурная флора СССР. М.; Л. 1958. С. 1-288.

3. Буднн К.З. Использование мирового генофонда картофеля в селекции. // Доклады Рос. акад. с.-х. Наук. 1994а. №3. С. 12-14.

4. Будин К.З. Мировой генофонд растений ВИР и его использование в селекции. // С.-х. Биология. Серия "Биология растений". 19946. №3. С.32-39.

5. Будин К.З., Гавриленко Т.А. Генетические основы отдаленной гибридизации картофеля. //Генетика. 1994. Т.ЗО. №10. С.1413-1422.

6. Букасов С.М. Огородные пасленовые./Возделываемые растения Мексики, Гватемалы, Колумбии. Л. 1930. С.261-278.

7. Букасов С.М. Система видов картофеля.// В кн. Проблемы ботаники. М-Л., 1955. С. 317-326.

8. Букасов С.М. Систематика видов картофеля секции Tuberarium (Dun)Buk. Рода Solanum L.// Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1971, Т.46. С. 3-44.

9. Букасов С.М., Камераз А.Я. Селекция и семеноводство картофеля. Л.: Колос, 1972. С. 358.

10. Букасов С.М., Трулева Л.М. Очерк ботанической географии диких видов картофеля.// Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1982, Т.73. С.91-94.

11. Букасов С.М. К систематике вилов картофеля. // В кн. Вопросы эволюции, биогеографии, генетики и селекции. М-Л., 1980. С.61-67.

12. Бухарова А.Р., Бухаров А.Ф. Анализ репродуктивных взаимоотношений четырех видов перца.// Сб. науч. тр. Всеросс. НИИ селекции и семеноводства овощных культур. 1998. Вып.35.

13. Вавилов Н.И. Мексика и центральная Америка, как основной центр происхождения культурных растений Нового Света.//Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1931. Т.26. Вып.З. С. 135-178.

14. Вавилов Н.И. Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости. JL: Наука. 1987. 259 с.

15. Газенбуш B.JI. Овощные пасленовые. / Культурная флора СССР. М.: 1958. Т. XX. С. 289-393.

16. Гикало Г.С. Перец Capsicum Tourn. Автореф. дис. на соиск. уч. степени д-ра с.-х. наук. Л. 1974.

17. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений.// Генетика. 1999. Т. 35. № 11. С. 15381549.

18. Ежова Т.А. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Как модельный объект для изучения генетического контроля морфогенеза.//Генетика. 1999. Т.35. С. 1522-1537.

19. Жуковский П.М. Перец овощной (Capsicum L.). / Культурные растения и их сородичи. Ленинград. 1971. С.639-642.

20. Жученко А.А., Балашова Н.Н., Король А.Б., Самовол А.П., Грати В.Г., Кравченко А.Н., Добрянский В.А., Смирнов В.А., Бочарникова Н.И. Эколого-генетические основы селекции томатов. Кишинев: Штиинца. 1988. 429 с.

21. Картофель// под ред. Н. С. Бацанова, М., 1970.

22. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Петрова Т.В., Осипова Е.С. Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum sativum L.) на основании RAPD-анализа.// Генетика. 2001. Т. 37. №4. Р. 574-581.

23. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. RAPD-анализ самоклональной и межсортовой изменчивости гороха.// Докл АН. 1997. Т.355. № 1. С. 134-136.

24. Мамедов М.И., Пивоваров В.Ф. и др. Селекция томата, перца и баклажана на адаптивность / Всеросс. НИИ селекции и семеноводства овощ, культур. М.: 2002.

25. Мамедов М.И., Пышная О.Н. Интродукция некоторых видов Capsicum в условиях Нечерноземья России. // Междунар. науч.-практ. конф. Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в. М.: 2000. Т.2.С. 182-183.

26. Молекулярные основы геносистематики//под ред. Антонова А.С.,Изд-во МГУ, М., 1980

27. Пивоваров В.Ф. Селекция и семеноводство овощных культур. М.:1999. С.

28. Рудас В. А. Получение пластомных хлорофиллдефектных мутантов у видов семейства Пасленовых.// Цитология и генетика, 1994, т.38, № 2, с.42-48.

29. Сидоренко А.П., Муха Д.Б. Выявление внутривидового внутреннего полиморфизма внутренних спейсеров рибосомной ДНК кукурузы.//Молекулярная биология.2000.Т.34. С.308-310.

30. Сидоров В.А., Самойлов В.М., Самойлов A.M. и др. Цибриды картофеля с цитоплазмой различных видов пасленовых // Докл. АН СССР. 1989, т.308, №3, с.741-743.

31. Тимина О.О., Балашова Н.Н. Доноры устойчивости к болезням в генофонде рода Capsicum L.II Изв. АН МССР. Биол. и хим. науки. 1985. Т.2. С. 27-32.

32. Троицкий А.В. Исследование по молекулярной филогенетике расстений: от внутривидового полиморфизма до макросистематики. Автореф. дисс.д-ра биол. наукМ.: МГУ. 1999. 64с.

33. Храпалова И. А. Род Lycopersicon (Tourn.) Mill. // Труды по прикл. бот., ген. и сел. СПб., 1999. Т. 157. С. 24-55.

34. Храпалова И.А. История таксономии и наменклатуры рода Lycopersicon (Solanaceae). // Труды по прикл. бот., ген. и сел. СПб., 1999. Т. 157. С. 13-24.

35. Шамрай С.Н. Гены устойчивости растений: молекулярная и генетическая организация, функция и эволюция.//Журнал Общей Биологии. 2003. Т.64. С. 195-214.

36. Aarts M.G.M., Те Lintel Hekkert В., Holub Е.В., Beynon J.L., Stiekema W.J. Pereira A. Identification of R-gene homologous DNA fragmentsgenetc ically linked to disease resistance loci in Arabidopsis thaliana.// MPMI. 1998. V. 11. P. 251-258.

37. Ainouche M.L., Bayer R.J. On the origins of the tetraploid Bromus species (section Bromus, Роасеае): Insights from the internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA. // Genome. 1997. V.40. P.730 -743.

38. Altschul S.F., Madden T.L., Schifer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.//Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

39. Angenent G.C., Colombo L. Molecular control of ovule development.//Trends Plant Sci. 1996. V.l P.228-232.

40. Arabidopsis Genome Initiative, Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.//Nature. 2000. V. 408. P.796-815. » Araujo P.G., Casacuberta, J.M., Costa A.P., Hashimoto R.Y., Grandbastien M.A., Van

41. Arumuganathan K., Earle E.D. Nuclear DNA Content of Some Important Plant Species.

42. Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman and Hall, New York.

43. Avramova Z., Tikhonov A., SanMiguel P., Jin Y.-K., Liu C., Woo S.-S., Wing R. A. and Bennetzen J. L. Gene identification in a complex chromosomal continuum by local genomic cross-referencing.//Plant J. 1996. V.10. P.l 163-1168.

44. Baker В., Shell J., Lorz H., Fedoroff NV. Transposition of the maize controlling element Activator in tobacco// Pros Natl Acad Sci USA, 1986, V.83, P. 4844-4848.

45. Baker В., Zambryski P., Staskawicz В., Dinesh-Kumar S.P. Signaling in plant-microbe interactions.//Science. 1997. V. 276. P. 726-733.

46. Ballard R.E., McClure J.W., Eshbaugh W.H., Wilson K.G. A chemosystematic study of ^ selected taxa of Capsicum.ilAm J Bot. 1970.V.57.P.225-233.

47. Barakat A., Matassi G., Bernardi G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implication for the genome organization in plants.// Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V.95. P. 10044-10049.

48. Barkman T.J., Simpson B.B. Hybrid origin and parentage of Dendrochilum acuiferum (Orchidaceae)inferred in a phylogenetic context using nuclear and plastid DNA sequence data.// Syst.Bot. 2002. V.27. P. 209 -220.

49. Batley J., Barker G., O'Sullivan H., Edwards K.J., Edwards D. Mining for Single Nucleotide Polymorphinsms and Insertions/Deletions in Maize Expressed Sequence Tag Data.// Plant Physiology. 2003. V. 132, P. 84-91.

50. Baumel A., Ainouche M.L., Levasseur J.E. Molecular investigations in populations of Spartina anglica C.E.Hubbard (Poaceae) invading coastal Brittany (France).// Mol.Ecol. 2001. V.10. P.1689 -1701.

51. Belfiore N.M., Hoffman F.G., Baker R. J. and Dewoody J.A. The use of nuclear and mitochondrial single nucleotide polymorphisms to identify cryptic species.// Molecular Ecology. 2003. V.12. P. 2011-2017.

52. Benito M.I., Walbot V. Characterization of the maize Mutator transposable element

53. MURA transposase as a DNA-binding protein. //Mol. Cell Biol., 1997,V. 17, P. 5165-5175.

54. Bennetzen J. L. Mechanisms and rates of genome expansion and contraction inflowering plants.// Genetica. 2002 V.115. P. 29-36. Bennetzen J. Plant genomics takes root, branches out.// Trends Genet. 1999. V.15. P.85-87.

55. Bent A.F. Plant disease resistance genes: function meets structure.// Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1757-1771.

56. Blanco A., Bellomo M.P., Cenci A., De Goiovanni C., D'Ovidio R., Iacono E., Laddomada В., Pagnotta M.A., Porceddu E., Sciancalepore A., Simeone R,

57. Tanzarella О.A. A genetic linkage map of durum wheat.// Theor. Appl. Genet. 1998. V.97. P.721-728.

58. Boniebale MW., Plaisted RL., Tanksley SD. RFLP maps based on a common set of clones reveal modes of chromosomal evolution in potato and tomato.// Genetics. 1988. V. 120. P. 1095-1103.

59. Bonnema AB, Melzer JM, Murray LW, O'Connell MA Non-random inheritance of organell genomes in symmetric somatic hybrids, between Lycopersicon esculentum and L. pennellii// Theor Appl. Genet. 1992. 84: 435-442.

60. Borodulina O.R., Kramerov D.A. Short interspersed elements (SINEs) from insectivores. Two classes of mammalian SINEs distinguished by A-rich tail structure // Mammalian Genome. 2001. 12, 779-786.

61. Bosland P.W. and Votava E.J. Vegetable and spice Capsicums.// Crop production science in horticulture series. CABI Publishing, CAB International. 2000.

62. Braun D.M., Garcia X.U., Stone J.M. Protein phosphorylation: examining the plant PU.// Trends Plant Sci. 1996. V.l.P.289-291.

63. Brochmann C., Nilsson Т., Gabrielsen T.M. A classic example of postglacial allopolyploid speciation reexamined using RAPD markers and nucleotide sequences: Saxifraga osloensis (Saxifragaceae).//Symb.Bot.Ups. 1996. V.31. P.75-89.

64. Bryan G.J., McNicoll J., Ramsay G., Meyer R.C., De Jong W.S. Polymorphic simple sequence repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants. // Theor Appl Genet. 1999. V.99. P.859-867.

65. Buckler E.S., Holtsford T.P. Zea ribosomal repeat evolution and substitution patterns.// Mol.Biol.Evol. 1996a. V.13. P. 623-632.

66. Buckler E.S., Holtsford T.P. Zea systematics: Ribosomal ITS evidence.// Mol.Biol.Evol. 1996b. V.13. P.612 -622.

67. Buckler E.S., Ippolito A. and Holtsford T.P. The evolution of riobosomal DNA: divergent paralogues and phylogenetic implication. // Genetics. 1997. V.145. P.826-832.

68. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. Primer-template interactions during DNA amplification fingerprinting with single arbitrary oligonucleotides. //Mol Gen. Genet. V. 235. P. 157-165.

69. Caicedo A.L., Schaal B.A., Kunkel B.N. Diversity and molecular evolution of the RPS2 resistance gene in Arabidopsis thaliana. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 302-306.

70. Casacuberta E., Casacuberta J.M., Puigdomenech P., Monfort, A. Presence of miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) in the genome of Arabidopsis thaliana: characterisation of the Emigrant family of elements. Plant J., 1998, V.16, P.79-85.

71. Cekic C., Battey N.H., Wilkinson M.J. The potantial of ISSR-PCR primer pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 103. P. 540-546.

72. Charmet G., Ravel C.> Balfourier F. Phylogenetic analysis in the Festuca-Lolium complex using molecular markers and ITS rDNA.// Theor. Appl. Genet. 1997. V.94(8).P. 1038- 1046.

73. Chavanne F, Zhang DX, Liaud MF, Cerff R. Structure and evolution of Ty3/Gypsy family highly amplified in pea and other legume species.// Plant. Mol. Biol. 1998. V.37. P. 363-.375.

74. Chen M., SanMiguel P. and Bennetzen J.L. Sequence organization and conservation in Sh2/Al-homologous regions of sorghum and rice.//Genetics. 1998. V.148. P.435-443.

75. Chen X.M., Line R.F. and Leung H. Genome scanning for resistance-gene analogs in rice, barley, and wheat by high-resolution electrophoresis. //Theor. Appl.Genet. 1997. V.97. P.345-355.

76. Chopra S, Brendel V, Zhang J, Axtell JD, Peterson T Molecular characterization of a mutable pigmintation phenotype and isolation of the first active transposable element from Sorghun bicolor. PNAS 1999, V.96, P. 15330-15335.

77. Chung S-M, Staub E.J. The development and evalution of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequense regions in a diverse array of plant taxa. // Theor Appl Genet. 2003. Y.107. P.757-767.

78. Clark S.E.,Williams R.W.,Meyerowitz E.M. The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in „ Arabidopsis.//Cell. 1997. V.89.P.575-585.

79. Clegg MT., Cummings MP, Durbin ML. The evolution of plant nuclear genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997, V.94, P.7791-7798.

80. Coen E.S., Meyerowitz E.M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. //Nature. 1991. V.353. P.31-37.

81. Collins N.C., Webb C.A., Seah S., Ellis J.G., Hulbert S.H. and Pryor A. The isolation and mapping of disease resistance gene analogs in maize.// MPMI. 1998. P. 968978

82. Cooley M.B., Pathirana S„ Wu H.J., Kach-roo P., Klessig D.F. 2000. Members of the Arabidopsis HRT/RPP8 family of resis-tance genes confer resistance to both vi-ral „ and oomycete pathogens.//Plant Cell. V. 12. P.663-676.

83. Correll DS. The potato and its wild relatives.// Contr Taxas Res Found, Bot Stud., 1962, V.4, P. 1-606.

84. Cunillera N., Boronat A. and Ferrer A. Spatial and temporal patterns of GUS expression directed by 5 regions of the Arabidopsis thaliana farnesyl diphosphate synthase genes FPS1 and FPS2./I Plant Mol. Biol., 2000, V. 44, P. 747-758.

85. D'Arcy W.G., Eshbaugh W.H. New World peppers (Capsicum— Solanaceae) north of Colombia: a resume.//Baileya. 1974.V.19.P.93-105.

86. Daunay M.C., Maggioni L., Lipman E. Solanaceae genetic resources in Europe. Report of two meetings 21 September 2001, Nijmegen, The Netherlands / 22 may 2003, Skierniewice, Poland. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy, 2003.

87. Davenport W.A. Progress report on the domestication of Capsicum (chili peppers).// Proc Assoc Am Geogr. 1970.V.2.P.46-47.

88. Davies В., Motte P., Keck E., Saedler H., Sommer H. & Schwarz-Sommer Z. PLENA and FARINELLI: Reduncancy and regulatory interactions between two Antirrhinum MADS-box factors controlling flower development.//EMBO J. 1999. V.18. P. 4023-4034.

89. De Bodt S., Raes J., Florquin K., Rombauts S., Rouze P., Theissen, G. & Van de Peer, Y. Genomewide Structural Annotation and Evolutionary Analysis of the Type I MADS-Box Genes in Plants. // J. Mol. Evol. 2003. V.56. P.573-586.

90. Debener Т., Salamini F., Gebhart C. Phylogeny of wild and cultivated Solanum species based on nuclear restriction fragment polymorphisms (RFLPs).// Theor Appl Genet., 1990, V.79, P.360-368.

91. Deng Z., Huang S., Ling P., Chen C., Yu C., Weber C.A., Moore G.A. Gmitter Jr., F.G. Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance gene candidate sequences in citrus. //Theor. Appl. Genet. 2000. V.101. P. 814-822.

92. Downward J, Graves JD, Warne PH, Rayter S, Cantrell DA. Stimulation of p21ras upon T-cell activation. //Nature. 1990. V.346. P.719-723.

93. Dubcovsky J., Ramakrishna W., SanMiguel P.J., Busso C.S., Yan L.L., Shiloff B.A., Bennetzen J.L. Comparative sequence analysis of colinear barley and rice bacterial artificial chromosomes.//Plant Physiol. 2001. V.125. P.1342-1353.

94. Dubouzet J. G., Shinoda K.ITS DNA sequence relationships between Lilium concolor Salisb., L. dauricum Ker-Gawl. and their putative hybrid, L. maculatum Thunb.// Theor. Appl. Genet. 1999.V.98(2).P.213 218.

95. Dwain N., Fluhr R., Eshed Y., Zamir D., Tanksley SD. Mapping of Ve in tomato: a gene conferring resistance to the broad-spectrum pathogen, Verticillium dahliae race 1.// Theor. Appl. Genet. 1999.V. 98:315-319.

96. Eamens AL.,. Blanchard CL,. Dennis ES, Narayana M.A bidirectional gene trap construct suitable for T-DNA and Ds-mediated insertional mutagenesis in rice (Oryza sativa L.).// Plant Biotechnology Journal, 2004, 2: 5, 367-380.

97. Edwards S.K., Johonstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analyses. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

98. Egea-Cortines M., Saedler H. & Sommer H. Ternary complex formation between the MADS-box proteins SQUAMOSA, DEFICIENS and GLOBOSA is involved in the control of floral architecture in Antirrhinum majus.//EMBO J. 1999. V.18. P. 5370-5379.

99. Eickbush TH, Malik HS. Origins and evolution of retrotransposons.// In: Craig et al. (eds) Mobile DNA II. ASM Press, USA, 2002. P. 1111-1144.

100. Elder J.F. and Turner B.J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes.// Quart. Rev. Biol. 1995. V.70. P. 297-320.

101. Ellis J., Dodds P. and Pryor T. Structure, function and evolution of plant disease resistance genes. //Curr. Opin. Plant Biol., 2000a,V.3, Р/ 278-284

102. Ellis J.G., Lawrence G.J., Luck J.E., Dodds P.N. Identification of regions in alleles of the flax rust resistanse gene L that determine differences in gene-for-gene specificity.// Plant Cell. 1999. V. 11. P. 495-506.

103. Ellis, M.C. 'Spot-On' SNP Genotyping.// Genome Res., 2000 , V. 10,P/895-897.

104. Emboden W.A. Jr. A preliminary study of the crossing relationships of Capsicum baccatum.I/Butler Univ Bot Stud. 1961.V. 14.P. 1-5.

105. Eshbaugh W.H. The taxonomy of the genus Capsicum (Solanaceae).//Phytologia. 1980. V.47.P. 153-166.

106. Eshbaugh W.H. A biosystematic and evolutionary study of Capsicum baccatum (Solanaceae).//Brittonia. 1970.V.22.P.31-43.

107. Eshbaugh W.H., Smith P.G. & Nickrent D.L. Capsicum tovarii (Solanaceae), a new species of pepper from Peru.//Brittonia. 1983. V.35(l).P.55-60.

108. Eshbaugh W.H., Smith P.G., Nickrent D.L. Capsicum tovarii (Solanaceae), a new species of pepper from Peru.//Brittonia. 1983. V.35.P.55-60.

109. Eshbaugh, W.H. Peppers: history and exploitation of a serendipitous new crop discovery. In: Janick, J. & J.E. Simon (Eds), New Crops, pp. 132-139. JohnWiley and Sons, Inc., New York. 1993.

110. Fang D.Q., Roose M.L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeats markers.// Theor Appl Genet. 1997. V.95. P.408-417.

111. Fans J.D., Haen K.M. and Gill B.S. Saturation mapping of a gene-rich recombination hot spot region in wheat.//Genetics. 2000. V.154. P.823-835.

112. Federici C.T., Fang D.Q., Scora R.W., Roose M.L. Phylogenetic relationships within the genus Citrus (Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis.// Theor. Appl. Genet. 1998. V.96. P.812-822.

113. Fedoroff N. The Supressor-mutator element andevolutiomary riddle of transposons/ Genes Cells 1999, V.4. P. 11-19.

114. Fedoroff N. Transposones and genome evolution in plants.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2000, V.97. P.7002-7007.

115. Fedoroff N.V. and Smith D.L. A versatile system for detecting transposition in Arabidopsis. //Plant J., 1993, V.3, P. 273-289.

116. Feiler H.S., JacobsT.W. Cell division in higher plants: a cdc2 gene, its 34 kDa product, and histone HI kinase activity in pea.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87.P.5397-5401.

117. Feng Q., Zhang Y., Hao, P., et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4.// Nature. 2002. V.420. P. 316-320.

118. Feschotte C., Jiang N., Wessler S.R. Plant transposable elements: where genetics meets genomics.//Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P.329-341.

119. Feschotte С., Wessler S.R. Mariner-like transposases are widespread and diverse in flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, V.99, P.280-285.

120. Fischer A., Baum N., Saedler H., Theissen G. Chromosomal mapping of the MADS-box multigene family in Zea mays reveals dispersed distribution of allelic genes as well as transposed copies.//Nucleic Acids Res. 1995. V.23. P. 1901-1911.

121. Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept.//Annu. Rev. Phytopathol. 1971. V. 9. P. 275-296.

122. Foolad M.R., Chen F.Q. RAPD markers associated with salt tolerance in an interspecific cross of tomato (Lycopersicon esculentum x L. pennellii).//Plant Cell Reports. 1998. V.17. P.306-312.

123. Forapani S., Carboni A., Castellani E., Mandolino G., Rannalli P. RAPD markers for potato germplasm characterization.// J.Genet &Breed. 1999. V53. P. 143-147.

124. Fuertes Aguilar J., Rosselloo J.A., Nieto Feliner G. Nuclear ribosomal DNA (nrDNA) concerted evolution in natural and articial hybrids of Armeria (Plumbaginaceae).// Mol. Ecol. 1999. V.8. P. 1341-1346.

125. Gassmann W, Hinsch ME, Staskawicz BJ. The Arabidopsis RPS4 bacterial-resistance gene is a member of the TIR-NBS-LRR family of disease-resistance genes.// Plant J. 1999. V.20. P. 265-277.

126. Gebhardt C, Valkonen J P.T. Organization of genes controlling disease resistance in the potato genome.// Anuual Review of Phytopath. 2001. V.39. P.79-102.

127. Germano J. and Klein A.S. Species-specific nuclear and chloroplast single nuclotide polymorphisms to distinguish Picea glauca, P. mariana and P. rubens.// Theot. Appl. Genet. 1999. V.99. P. 37-99.

128. Gianfranceschi L., Seglias N., Tarchini R., Komjanc M., Gessler C. Simple sequence repeats for genetic analysis of apple. // Theor Appl Genet. 1998. V.96. P. 10691076.

129. Gilbert J.E., Lewis R.V., Wilkinnson M.J., Caligari P.D.S. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections.//Theor. Appl. Genet. 1999. V.98. P. 1125-1131.

130. Gill K.S., Gill B.S., Endo T.R. and Boyko E. Identification and high-density mapping of gene-rich regions in chromosome group 5 of wheat.//Genetics. 1996. V.143. P.1001-1012.

131. Gill K.S., Gill B.S., Endo T.R., Taylor T. Identification and high-density mapping of gene-rich regions in chromosome group 1 of wheat.//Genetics. 1996a. V.144. P.1883-1891.

132. Goff S.A., Ricke D., Lan Т.Н., Presting G., Wang R., Dunn M., Glazebrook J., Sessions

133. A., Oeller P., Varma H., Hadley D., Hutchison D., Martin C., Katagiri F., Lange

134. Gorg R., Ritter E., Salamini F Gebhardt C. Discrimination among 136 tetraploid potato varaities by fingerprints using highly polymorphic DNA markers.// Crop Sci. 1992. V.32. P.815-819.

135. Grant M.R., Godiard L., Straube E., Ashfield Т., Lewald J., Sattler A., Innes R.W., Dangl J.L. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance.// Science. 1995. V.269. P.843-846.

136. Greco R, Ouwerkerk PBF, De Kam RJ, Sallaud C, Favalli C, Colombo L, Guiderdoni E, Meijer AH, Hoge JHC, Pereira A. Transpositional behaviour of an Ac/Ds system for reverse genetics in rice. // Theor Appl Genet. 2003. V.108. P. 10-24.

137. Greco R, Ouwerkerk PBF, Taal AJC, Favalli C, Beguiristain T, Puigdomenech P, Colombo L, Hoge JHC, Pereira A Early and multiple Ac transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis. //Plant Mol Biol. 2001. V. 46. P. 215-227.

138. Grimm D.A., Denesh D., Mudge J., Young N.D. Cregan P.B Assessment of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in soybean. Proceedings of Plant and AnimalGenome Conference, 1999. P. 140.

139. Grube R.C., Radwanski E.R., Jahn M. Comperative genetics of disease resistance within the Solanacae // Genetics, 2000, 155: 873-887

140. Halushka M.K., Fan J.B., Bentley K., Hsie L., Shen N., Weder A., Cooper R., Lipshutz R., Chakravarti A. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood-pressure homeostasis.// Nature Genet., 1999, V.22, P. 239-247.

141. Hamalainen JH, Sorri VA, Watanabe KN, Gebhardt C, Valkonen JPT Molecular examination of a chromosome region that controls resistance to potato Y and A potyviruses in potato.// Theor Applied Genet. 1998. V. 96. P. 1036-1043

142. Hancock J.M. The contribution of slippage-like processes to genome evolution. //J. Mol. Evol. 1995. V.41. P. 1038-1047.

143. Hardie D.G., Carling D., Carlson M. The AMP-activated/SNFl protein kinase subfamily: metabolic sensors of the eukaryotic cell?//Annu. Rev. Biochem. 1998. V.67. P.821-855.

144. Harmon A.C., Putnam-Evans C., Cormier M.J. A calcium-dependent but calmodulin-independent protein kinase from soybean.//Plant Physiol. 1987. V.83.P.830-837.

145. Hartmann S., Nason J.D., Bhattacharya D. Extensive ribosomal DNA genie variation in the columnar cactus Lophocereus. // J Mol Evol. 2001. V.53. P. 124-134.

146. Hauge B.M., Hanley S.M., Cartinhor S., Cherry J.M., Goodman H.M. An integrated genetic/RFLP map of Arabidopsis thaliana genome.//The Plant J. 1993. V. 3. P. 745754.

147. Hawkes JG. The potato: evolution, biodiversity and genetic resources// 1990, Belhaven Press, London.

148. Hawkes, J.G. Origins of cultivated potatoes and species relationships. //In: Potato genetics, Bradshaw, J.E.& Mackay, G.R. (eds.). 1994. CAB International, Wallingford. pp. 3-42.

149. Hayes A.J. and Saghai Maroof M.A. Targeted resistance gene mapping in soy bean using modified AFLPs. //Theor. Appl. Genet. 2000. V. 100. P. 1279-1283

150. Hehl R., Faurie E., Hesselbach J., Salamini F., Whitham S., Baker В., Gebhardt C. TMV resistance gene N homologues are linked to Synchytrium endobioticum resistance in potato. //Theor. Appl. Genet. 1999. V.98. P. 379-386

151. Heiser C.B. Jr., Smith P.G. New species of Capsicum from South America.//Brittonia 1958. V.10. P. 194-201.

152. Hemerly A., Engler J.D., Bergounioux C., Vanmontagu M., Engler G., et al. Dominant negative mutants of the cdc2 kinase uncouple cell division from iterative plant development.// EMBO J. 1995. V.14. P.3925-3936.

153. Henikoff, S. and Comai, L. A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis.// Genetics, 1998. V. 149. P. 307-318.

154. Henschel, K. Two ancient classes of MIKC-type MADS-box genes are present in the moss Physcomitrella patens.// Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19. P. 801-814.

155. Heslop-Harrison J.S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes.//Plant Cell. 2000. V.12. P.617-635.

156. Hijmans, R. and D.M. Spooner. Geographic distribution of wild potato species.// Amer.

157. J. Bot. 2001. V.88. P.2101-2112.

158. Hirochika H. Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome analysis. Plant. Mol. Biol. 1997. V.35. P. 231-240.

159. Hosaka K., Mori M., Ogawa K. Genetic relationships of Japanese potato cultivars assessed by RAPD analysis // Am/ Potato J. 1994. V.71. P.535-546.

160. Hosaka, K. and Hannemann, R.E. A rapid and simple method for determination of chloroplast DNA type.// Am. Potato J. 1987 64: 345-352

161. Hosaka, K. and Hannemann, R.E. The origin of the cultivated tetraploid potato based on chloroplast DNA.// Theor. Appl. Genet. 1988. V. 76. P. 172-176

162. Hosaka, К., Ogihara, Y., Matsubayashi, M., & Tsunewaki, K. Phylogenetic relationship between the tuberous Solanum species as revealed by restriction endonuclease analysis of chloroplast DNA. // Jap. J. Genet. 1984. V.59. P. 349-369.

163. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H. and Jensen K.B. Phylogenetic relationships of the monogenomic species of the wheat tribe, Triticeae (Роасеае), inferred from nuclear rDNA (internal transcribed spacer) sequences.// Genome. 1995. V.38. P.211-223.

164. Hu J., van Eysden J., Quiros C.F. Generation of DNA-based markers in specific genome regions by two-primer RAPD reactions. // PCR Methods Appl. 1995. V.4. P. 346351.

165. Jaccard P. Nouvelles recherches sur la distribution florale.//Bull Soc Vaud Sci Nat. 1908.V.44.P.223-270.

166. Jander G, Norris SR, Rounsley SD, Bush DF, Levin IM, Last RL. Arabidopsis Map-Based Cloning in the Post-Genome Era .//Plant Physiol. 2002. V. 129. P.440-450

167. Jensen R. J., McLeod M. J., Eshbaugh W.H., Guttman S.I. Numerical taxonomic analyses of allozymic variation in Capsicum (Solanaceae).//Taxon. 1979. V.28. P.315-327.

168. Jeong S. С., Saghai Maroof M. A. Detection and genotyping of SNPs tightly linked to two disease resistance loci, Rsvl and Rsv3, of soybean.// Plant Breeding. 2004. V. 123. P.305-314.

169. Jia, Y., McAdams, S.A., Bryan, G.T., Hershey, H.P., Valent, B. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance.// EMBO J. 2000. V. 19. P.4004-4014.

170. Jones J.D.G. Putting knowledge of plant disease resistance genes to work.//Curr. Opin. Plant Biol. 2001. V.4.P.281-287.

171. Jones, D.A., and Jones, J.D.G. The roles of leucine rich repeats in plant defences.// Adv. Bot. Res. 1996. V. 24. P.89-167.

172. Jones, D.A., Thomas, C.M., Hammond-Kosack, K.E., Balint-Kurti, P.J., and Jones, J.D. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. //Science. 1994. V.266. P.789-793.

173. Joosten M, de Wit P. The Tomato-Cladosporium Fulvum Interaction: A Versatile Experimental System to Study Plant-Pathogen Interactions.// Annu. Rev. Phytopathol. 1999. V.37. P. 335-367.

174. Joseph J. L., Sentry J. W. and Smyth D. R. Interspecies distribution of abundant DNA sequences in Lilium.//J. Mol. Evol. 1990. V.30. P. 146-154.

175. Joshi S.P., Gupta V.S., Aggarwal R.K., Ranjekar P.K., Brar D.S. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza.ll Theor Appl Genet. 2000. V.100. P. 13111320.

176. Kajikawa M., Okada N. LINEs mobilize SINEs in the eel through a shared 30 sequence.// Cell, 2002, V. Ill, P.433-444.

177. Kalendar R., Tanskanen J., Immonen S., Nevo E., Schulman A.H. Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE-1 retrotransposon dynamics inresponse to sharp microclimatic divergence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, V.97, P.6603-6607.

178. Karp A., Edvards K. Molecular techniques in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity.// Molecular genetic techniques for plant genetic resourse. Report of an IPGRI Workshop, oktober 1995. Rome, Italy. 1997. P. 11-22.

179. Kasai K, Morikawa Y, Sorri VA, Valkonen JPT, Gebhardt C, Watanabe KN Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes.// Genome. 2000. V.43. P. 1-8

180. Kashkush K., Feldman M., Levy A.A. Transcriptional activation ofretrotransposons alters the expression of adjacent genes in wheat.// Nat. Genet., 2003 V.33, P. 102106.

181. Katti M.V., Ranjekar P.K. and Gupta V.S. Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences. // Mol. Biol. Evol. 2001. V.18. P. 11611167.

182. Kaziro, Y., Itoh, H., Kozasa, Т., Nakafuku, M., and Satoh, T. Structure and function of signal-transducing GTP-binding proteins.// Annual Review of Biochemistry. 1991. V.60. P.349-400

183. Kearney В and Staskawicz BJ Widespread distribution and fitness contritution of Xanthomonas campestris avirulence gene avrBs2 // Nature. 1990.V.346. P.385-386.

184. Keen, N. T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions.// Annu. Rev. Genet. 1990. V.24. P.447-463.

185. Kim K.N. and Guiltinan M.J. Identification of cw-acting elements important for expression of the starch-branching enzyme I gene in maize endosperm.// Plant Physiol. 1999. V. 121, P. 225-236.

186. Klein-Lankhorst R.M., Vermut A., Weide R., Liharska Т., Yabel P. Isolation of molecular markers for tomato (Lycopersicon esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD). // Theor. Appl.Genet. 1991. V. 83. P. 108-114.

187. Knapp S., Coupland G., Uhrig H., Starlinger P., Salamini F. Transposition of the maize transposable element Ac in Solanum tuberosum!I Mol. Gen. Genet. 1988. V. 213. P.285-290

188. Ко K.S., Jung H.S. Three nonorthologous ITS1 types are present in a polypore fungus Trichaptum a6iermi<m.//Mol.Phylogenet.Evol. 2002. V.23. P. 112-122.

189. Kobe В., Deisenhofer J. Crystal glutaryl-CoA reductase kinase. Eur. J. Biochem.

190. Kofuji R. et al. Evolution and divergence of MADS-box gene family based on genome wide expression analyses. // Mol. Biol. Evol. 2003. V.10. P. 1093

191. Kollipara K. P., Singh R. J., Hymowitz T. Phylogenetic and genomic relationship in the genus Glycine wild, based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA.//Genome. 1997. V.40.P.57-68.

192. Kollipara K. P., Singh R. J. and Hymowitz T. Phylogenetic and genomic relationship in the genus Glycine wild, based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA.//Genome. 1997. V.40.P.57-68.

193. Koopman W. J.M., Zevenbergen M. J.,van den Berg R.G. Species relationship in Lactuca s.l. (Lactuceae, Asteraceae) inferred from AFLP fingerprints. //American Journal of Botany. 1998. V.85. P. 1517-1530.

194. Kuhlman, P., Palmer J. D. Isolation, expression, and evolution of the gene encoding mitochondrial elongation factor Tu in Arabidopsis thalianaJ/ Plant Mol. Biol. 1995. V.29. P. 1057-1070.

195. Maeda Т., Wurglermurphy S.M., Saito H. A two-component system that regulates an osmosensing MAP kinase cascade in yeast.//Nature. 1994. V.369.P.242-245.

196. Mago R., Nair S. and Mohan M. Resistance gene analogues from rice: Cloning, sequencing and mapping.// Theor. Appl. Genet. 1999. V.99. P. 50-57

197. Manly B.F.J. The Statistics of Natural Selection. Chapman and Hall. 1985. London. 484 pp.

198. Mantel N. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. //Cancer Research. 1967. V.27. P.209-220.

199. Mao L., Wood T.C., Yu, Y., Budiman M.A., Tomkins J., Woo S., Sasinowski M., Presting G., Frisch D., Goff S., Dean R.A., Wing R.A. Rice transposable elements: a survey of 73,000 sequencetagged-connectors.// Genome Res., 2000, V. 10, P. 982-990.

200. Marks, G. E. Cytogenetic studies in tuberousSolanum species.I. Genomic differentiation in the group Demissa.H Journal of Genetics, 1955, V.53, P. 262-269.

201. Marth G.T., Korf I., Yandell M.D., Yeh R.T., Gu Z., Zakeri H., Stitziel N.O., Hillier L., Kwok P.-K., Gish, W.R. A general approach to single-nucleotide polymorphism discovery.// Nature Genetics. 1999. V. 23. P. 452-456.

202. Mayer M.S. and Soltis P.S. Intraspecific phylogeny analysis using ITS sequences: insights from studies of the Streptanthus glandulosus complex (cruciferae).// Syst Bot. 1999. V.24. P. 47-61.

203. Mayol M., Rosselloo J.A. Why nuclear ribosomal DNA spacers (ITS) tell dierent stories in QwercHS.//Mol.Phylogenet.Evol. 2001. V.19.P.167 -176.

204. Mayol M., Rosselloo J. A. Why nuclear ribosomal DNA spacers (ITS) tell dierent stories in 0wercms.//Mol.Phylogenet.Evol. 2001. V.19.P.167 -176.

205. McClean P.E., Hanson M.R. Mitochordrial DNA sequence divergence among Lycopersicon and related Solanum species.// Genetics. 1986. V.112. P.649-667.

206. McClintock, B. The significance of responses of the genome to challenge. Science, 1984, V. 226, P.792-801.

207. McGregor, C.E., Lambert, C.A., Greyling, M.M., Louw, J.H., Warnich, L. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L.) germplasm. // Euphytica. 2000. V. 113. P. 135-144.

208. McLeod M.J., Eshbaugh W.H., Guttman S.I. An electrophoretic study of Capsicum (Solanaceae): the purple flowered taxa.//Bull Torrey Bot Club. 1979a. V. 106.P.326-333.

209. Melotto M., Afanador L., Kelly J.D. Development of a SCAR markers linked to the 1 gene in common bean.// Genome. 1996. V.39. P. 1216-1219.

210. Meyers B.C., Chin D.B., Shen K.A., Sivaramakrishnan S., Lavelle D.O., Zhang Z., Mitchelmore R.W. The major resistance gene cluster in lettuce is highly duplicated and spans several megabases// Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1817-1832

211. Meyers B.C., Tingey S.V., Morgante M. Abundance, distribution, and transcriptional activity of repetitive elements in the maize genome.// Genome Res.,2001, V. 11, P. 1660-1676.

212. Michelmore R.W. and Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process.// Genome Res., 1998, V.8, P.1113-1130.

213. Michelmore R.W. The impact zone: genomics and breeding for durable disease resistance.// Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V.6 . P. 397-404.

214. Michelmore R.W. The impact zone: genomics and breeding for durable disease resistance.// Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V.6. P. 397-404.

215. Michelmore R.W., Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process. // Genome Res. 1998. V.8. P.l 113-1130.

216. Milbourne D., Meyer R.C., Collins A.J., Ramsay L.D., Gebhardt C., Waugh R. Isolation, characterisation and mapping of simple sequence repeat loci in potato // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 233-245.

217. Miller J. Т., D. M. Spooner. Collapse of species boundaries in the wild potato Solanum brevicaule complex (Solanaceae, S. sect. Petota): molecular data. HPlant Systematics and Evolution, 1999, V.214, P. 103-130

218. Miller J.C. and Tanksley S.D. RFLP analysis of phylogenetic relationships and genetic variation in the genus Lycopersicon.//Theor. Appl. Genet. 1990. V. 80. P.437-448.

219. Milligan S. В., Bodeau J., Yaghoobi J., Kaloshian I., Zabel P., Williamson V.M. The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is 29 genes.// Plant Cell. 1998. V.10. P. 1307-1319

220. Mione, Т., Olmstead, R.G., Jansen, R.K., & Anderson, GJ. 1994. Systematic implications of chloroplast DNA variation in Jaltomata and selected physaloid genera (Solanaceae).// Amer. J. Bot. 1994. V.81. P. 912-918.

221. Mishima M., Ohmido N., Fukui K.,Yahara T. Trends in site number change of rDNA loci during polyploid evolution in Sanguisorba (Rosaceae).//Chromosoma. 2002.V. 110. P.550-558.

222. Moreno S., Martin J.P, Ortiz J.M. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm.// Euphytica.1998. V. 101. P.117-125.

223. Moscone E.A., Lambrou M., Hunziker A.T., Ehrendorfer F. Giemsa C-banded karyotypes in Capsicum (Solanaceae).// Plant Syst Evol. 1993. V.186.P.213-229.

224. Motte P., Saedler H. & Schwarz-Sommer Z. Stylosa and Fistulata: Regulatory components of the homeotic control of Antirhhinum floral organogenesis. // Development. 1998. V.125. P. 71-84.

225. Mouradov A., Hamdorf В., Teasdale R.D., Kim J., Winter K.-U., Theissen G. A DEF/GLO-like MADS-box gene from a gymnosperm: Pinus radiata contains an ortholog of angiosperm В class floral homeotic genes. // Dev. Genet. 1999. V.25. P.245-252.

226. Muira A., Yonebayashi S, Watanabe K, Toyama T, Shimada H, Kakutani T. Mobilization of transposons by a mutation abolishing full DNA methilation in Arabidopsis. //Nature. 2001. V.411. P.212-214.

227. Muller C.H. A revision of the genus Lycopersicon.// USDA Misc. Publ. 1940. V.328. P.29.

228. Murray B.G. Trees, maps and FISH: The application of genome based technologies to the analysis of chromosome evolution.//Curr.Genom. 2002. V.3.P.539 -550.

229. Myakishev M.V., Khripin Y., Hu S., Hamer D.H. High-throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with universal energy-transfer-labeled primers.//Genome Research. 2001. V. 11. P. 163-169.

230. Nacken WKF, Piotrowiak R, Saedler H, Sommer H The transposable element ТАМ-1 of A. majus shows structural homology to the maize transposon En/Spm and had no sequence specificity of insertion. Mol Gen Genet., 1991, V.228, P.201-208.

231. Nagaoka T and Ogihara Y. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. //Theor Appl Genet .1997. V.94. P.597-602.

232. Navarro-Quezada A. and Schoen, D.J. Sequence evolution and copy number of Tyl-copia retrotransposons in diverse plant genomes.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2002 V. 99, P.268-273.

233. Nebauer S.G., del Castillo-Agudo L., Segura J. RAPD variation within and among natural population of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.).// Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 985-994.

234. Nebauer S.G., del Castillo-Agudo L., Segura J. RAPD variation within and among natural population of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.).// Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 985-994.

235. Nei M., Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases.// Proc Natl Acad Sci USA. 1979. V.76.P.5269- 5273.

236. Ng, M. and Yanofsky, M.F. Function and evolution of the plant MADS-box gene family.//Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 186-195.

237. Noir S., Combes M.-C., Anthony F., Lashermes, P. Origin, diversity and evolution of NBS-type disease-resistance gene homologues in coffee trees (Coffea L.). //Mol. Genet. Genom. 2001. V.265. P. 654-662

238. Nues R.V., Venema J., Rientjes J.M.J., Dirksmulder A. and Raue H.A. Processing of eukaryotic pre-rRNA: the role of the transcribed spacers.//Biochem. Cell Biol. 1995. V.73. P.789-801.

239. Ochman H., Gerber A.S., Hartl DL. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction.//Genetics. 1988. V.120. P. 621-623.

240. Ochoa С M. The Potatoes of South America: V.l Bolivia//1991. Cambridge University Press, 512 p.

241. Ogden R. and Thorpe R.S. The usefulness of amplified fragment length polymorphism markers for taxon discrimination across graduated fine evolutionary levels in Caribbean Anolis lizards. // Molecular Ecology. 2002. V.l 1. P.437-445.

242. Ogura Y, Inohara N, Benito A, Chen FF, Yamaoka S, Nunez G. NOD2, a NODl/Aaf-1-family member that is restricted to monocytes and activates NF-кВ.// J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 4812-4818.

243. Olmstead RG. Species concept and plesiomorphic species.// Syst Bot., 1995, V.20, P. 623-630.

244. Olmstead, R.G. & Palmer, J.D. 1992. A chloroplast DNA phylogeny of the relationships in Lycopersicon. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 79. P. 50065010.

245. Olmstead, R.G. & Palmer, J.D. Chloroplast DNA systematics: a review of methods and data analysis. // Amer. J. Bot. 1994. V.81. P. 1205-1224.

246. Palmer J.D., Zamir D. Chloroplast DNA evolution and phylogenetic relationships in Lycopersicon.//Proc.Natl. Acad. Sci USA. 1982. V.79. P.5006-5010.

247. Pan, Q.; Wendel, J.; Fluhr, R. Divergent Evolution of Plant NBS-LRR Resistance Gene Homologues in Dicot and Cereal Genomes. //J.Mol.Evol. 2000.V. 50. P. 203-213

248. Panda R.C., Aniel Kumar O., Raja Rao K.G. The use of seed protein electrophoresis in the study of phylogenetic relationships in Chilli pepper (Capsicum L.).//Theor Appl Genet. 1986. V.72.P.665-670.

249. Panstruga R., Buschges R., Piffanelli P. and Schulze-Lefert P. A contiguous 60 kb genomic stretch from barley reveals molecular evidence for gene islands in a monocot genome.//Nucl. Acids. Res. 1998. V.26. P. 1056-1062.

250. Paran I, Aftergoot E, Shifriss C. Variation in Capsicum annuum revealed by RAPD and AFLP markers // Euphitica .1998. V. 99. P. 167-174.

251. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to down mildew resistance genes in lettuce.// Theor. Appl. Genet. 1993. V.85. P. 985-993.

252. Parani M., Lakshmi M., Senthilkumar P., Nivedita Ram., Ajay Panda. Molecular phylogeny of mangroves V. Analysis of genome relationships in mangrove species using RAPD and RFLP markers.// Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 617-625.

253. Parani M., Lakshmi M., Senthilkumar P., Nivedita Ram., Ajay Parida. Molecular phylogeny of mangroves V. Analysis of genome relationships in mangrove species using RAPD and RFLP markers.// Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 617-625.

254. Parenicova L. et al. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis.new openings to the MADS world. // Plant Cell. 2003. V.15. P. 1538-1551.

255. Parniske M., Jones J.D.G. Recombination between diverged clusters of the tomato Cf-9 plant disease resistance gene family.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V.96. P.5850-5855.

256. Payne R.W., Lane P.W., Digby P.G.N. Genstat 5 Reference Manual. 1993. Release 3. Oxford University Press.

257. Pearce S.R., Knox M., Ellis Т.Н., Flavell A.J., Kumar A. Pea Tyl-copia group retrotransposons: transpositional activity and use as markers to study genetic diversity in Pisum. Mol. Gen. Genet., 2000, V.263, P.898-907.

258. Pelaz, S. et al. В and С floral organ identity function require SEPALLATA MADS-box genes.// Nature. 2000. V.405. P. 200-203.

259. Pickersgil B. Genetic resourses and breeding of Capsicum spp.//Euphitica.l997.V.96.P. 129-133.

260. Pickersgil В., Heiser C.B., McNeill J. Numerical taxonomic studies on variation and domestication in some species of Capsicum// in: The biology and taxonomy of the Solanaceae. Academic Press. Hawkes J.G., Lester R.N., Skelding A.D, edg. London. 1979.

261. Pickersgill B. Relationships between weedy and cultivated forms in some species of chili peppers (genus Capszcww).//Evolution.l971.V.25.P.683-691.

262. Pickersgill В. Some aspects of interspecific hybridization.// In: Capsicum. Unpublished and preliminary report at the IVth Eucarpia Capsicum working group meetings in Wageningen. The Netherlands. 1980.

263. Picoult-Newberg L, Ideker R, Pohl M, Taylor S, Addelston MB, Nickerson DA, Boyce-Jacino M. Mining single nucleotide polymorphisms (SNPs) from expressed sequence tag (EST) databases. // Genome Res. 1999. V. 9. P. 167-174.

264. Porceddu A., Albertini E., Barcaccia G., Marconi G., Bertoli F.B., Veronesi F. Development of S SAP markers based on an LTR-like sequence from Medicago sativa L.// Mol.Genet Genomics. 2002. V.267. P. 107-114.

265. Powel W., Machray G.C., Pro van J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. // Trends in plant science. 1996. V. 1. P. 215-221.

266. Prevost A., Wilkinson M.J. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars.// Theor Appl Genet. 1999. V.98. P. 107-112.

267. Prince J.P., Lackney V.K., Angeles C., Blauth J.R., Kyle M.M. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsicum and the fingerprinting of pepper cultivars.//Genome. 1995. V.38.P.224-231.

268. Prince J.P., Loaiza-Figueroa F. and Tanksley S.D. Restriction fragment length polymorphisms and genetic distance among Mexican accession of Capsicum.// Genome. 1992. V. 35. P. 726-732.

269. Prince J.P., Pochard E. and Tanksley S.D. Construction of a molecular linkage map of pepper and comparison of synteny with tomato. // Genome. 1992. V.36. P.404-417.

270. Procunier J.D., Knox R.E., Bernier A.M. DNA markers linked to T10 loose smut resistance gene in wheat (Triticum aestivum L.).// Genome. 1997.V.40.P. 176-179.

271. Provan J, Powell W, Hollingsworth P. Chloroplast microsatellites: new tools for studiesin plant ecology and systematics// Trends in Ecology and Evolution.2001. V.16. P. 142-147.

272. Purugganan M.D., Rounsley S.D., Schmidt R.J., Yanofsky M. Molecular evolution of flower development: diversification of the plant MADS-box regulatory gene family .//Genetics. 1995. V. 140.P.345-356.

273. Rafalski, A. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics.// Curr. Opin. Plant Bio., 2002, V. 5, P.94-100

274. Raina R., Schlappi M., Karunanandaa В., Elhofy A., Fedoroff N. Concerted formation of macromoleculs Supressor-mutator transposition complex. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, V.95, P. 8526-8531.

275. Raina S, Mahalingam R, Chen F, Fedoroff N. A collection of sequenced and mapped Ds transposon insertion sites in Arabidopsis thaliana//Plant Mol Biol 2002, V.50 P. 93-110.

276. Reamon-Buttner SM, Schmidt T, Jung C. AFLP represents highly repetitive sequences in Asparagus officinalis L. // Chromosome Res. 1999. V.7. P.279-304.

277. Renganayaki K., Read J.C., Fritz A.K. Geenetic diversity among Texas bluegrass genotypes (Poa arachnifera Torr.) revealed by AFLP and RAPD markers.// Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 1037-1045.

278. Ribeiro M.M., Plomion C., Petit R., Vendramin G.G., Szmidt A.E. Variation in chloroplast single-sequence repeats in Portuguese maritime pine (Pinus pinaster Ait.). // Theor Appl Genet. 2001. V.102. P.97-103.

279. Richter, Т.Е., Ronald, P.C. The evolution of disease resistance genes.// Plant Mol. Biol., 2000, V.42, P. 195-204.

280. Rick C.M. Tomato.// In Evolutoin of crop plants. Edited by N.W. Simmonds. Longman Group. London. 1976. P.268-273.

281. Rick С. M. Tomato (Lycopersicon), in isozymes in Plant Genetics and Breeding// (eds S.D. Tanksley and T.J. Orton), 1983, Eisevier, Amsterdam, p. 147-165

282. Rick C.M. and Lamm R. Biosystematic studies on the status of Lycopersicon chilense.ll Am. J. Bot. 1955. V.42. P.663-675.

283. Rick C.M. Biosystematic stadies in Lycopersicon and closely related species of Solanum In: The biology and taxonomy of Solanaceae.// Hawkes J.G (eds), 1979, Academic Press. London. P. 667-678.

284. Rick C.M., and Yoder J.I. Classical and molecular genetics of the tomato: highlights and prospects.// Annu. Rev. Gen. 1988. V.22. P.282-300

285. Rickert AM, Premstaller A, Gebhardt C, Oefner PJ. Genotyping of SNPs in a Polyploid Genome by Pyrosequencing™.// BioTechniques. 2002. V.32. P.592-603

286. Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. MADS domain proteins in plant development. // Biol Chem. 1997. V.378. P. 1079-1101.

287. Riely B.K. and Martin G.B. Ancient origin of pathogen recognition specificity conferred by the tomato disease resistance gene Pto.ll Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98. P.2059-2064.

288. Rivas S., Romeis Т., Jones J.D.G. The Cf-9 Disease Resistance Protein Is Present in an ~420-Kilodalton Heteromultimeric Membrane-Associated Complex at One Molecule per Complex.// Plant Cell. 2002. V.14. P. 689-702.

289. Robertson H.M. Molecular evolution of DNA transposons.// In: Craig N., Craigie R., Gellert M., Lambowitz A. (Eds.), Mobile DNA II,American Society of Microbiology Press, Washington, DC., 2002. P. 1020-1038.

290. Rodriguez J.M., Berke Т., Engle L., Nienhuis J. Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. // Theor. Appl. Genet. 1999. V.99. P. 147-156.

291. Rom M., Bar M., Rom A., Pilowsky M., Gidoni D. Purity control of F1 hybrid tomato cultivars у RAPD markers.// Plant Breeding. 1995. v. 114. P. 188-190.

292. Rommens C.M., Kishore G.M. Exploiting the full potential of disease-resistance genes for agricultural use.//Curr. Opin. Biotechnol. 2000.V. 11. P. 120-125.

293. Ronaghi M, Uhlem M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate.// Science, 1998, V.281, P.363-365

294. Ronald P.C. Resistance gene evolution. // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. V.l. P.294-298.

295. Rounsley S.D., Ditta G.S., Yanofsky M.F. Diverse roles for MADS box genes in Arabidopsis development.//Plant Cell. 1995.V.7. P. 1259-1269.

296. Sablowski R.W.M., Meyerowitz E.M. A homolog of NO APICAL MERISTEM is an immediate target of the floral homeotic genes APETALA 3/PISTILLA ТА .//Cell. 1998.V.92. P.93-103.

297. Salimath SS., de Oliveira AC, Gogwin ID., Bennetzen JL Assessment of genome origins and genetic diversity in the genus Eleusine with DNA markers.// Genome. 1995. V.38. P.757-763

298. Salmeron J.M., Oldroyd G.E.D., Rommens C.M.T., Scofield S.R., Kim H.S., et al. Tomato Prf is a member of the leucinerich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.//Cell. 1996. V.86. P.123-133.

299. Sandhu D. ,Gill K.S. Gene-Containing Regions of Wheat and the Other Grass Genomes.//Plant Physiology. 2002a. V.128. P.803-811.

300. Sandhu D. and Gill K.S. Structural and functional organization of 'ISO.8 gene-rich region' in Triticeae.//Plant Molecular Biology. 2002b. V.48. P.791-804.

301. Sandhu, D., Champoux, J. A., Bondareva, S. N., Gill, K. S. Identification and physicallocalization of useful genes and markers to a major gene-rich region on wheat group IS chromosomes.// Genetics. 2001. V.157. P. 1735-1747.

302. Sang-Min Chung, Staub E.J. The development and evalution of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequense regions in a diverse array of plant taxa. // Theor Appl Genet. 2003. V.107. P.757-767.

303. Santiago N., Herraiz C., Goni, J.R., Messeguer X., Casacuberta J. Genome-wide analysis of the Emigrant family of MITEs of Arabidopsis thaliana.// Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19. P.2285-2293.

304. Saraste, M., Sibbald, P.R., Wittinghofer, A. The P-loop, a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. //Trends Biotechnol. 1990. V.15 P. 430-435.

305. Satterlee J.S., Sussman M.R. Unusual membrane-associated protein kinases in higher plants.//J. Membr. Biol. 1998.V.164.P.205-213.

306. Schierholt A., Becker H.C., Ecke W. Mapping a high oleic acid mutation in winter oilseed rape (Brassica napus L.).// Theor. Appl. Genet. 2000. V.101. P.897-901.

307. Schmidt R.J, Veit В., Mandel M.A., Mena M., Hake S., Yanofsky M.F. Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS.//Plant Cell. 1993. V.5. P. 729-737.

308. Schwarz-Sommer Z., Huijser P., Nacken W., Saedler H., Sommer H. Genetic control of flower development by homeotic genes in Antirrhinum majus.llScience. 1990. V.250.P.931-936.

309. Schwarz-Sommer Z., Shepherd N., Таске E., Gierl A., Rohde W.Influence of • transposable elements on the structure and function of the Al gene of Zeamays.//The EMBO Journal. 1987.V.6.P.287-294.

310. Sharma T.R., Jana S. Species relationship in Fagopyrum reveald by PCR-based DNA fingerprinting.// Theor. Appl. Genet. 2002. V.105. P.306-312.

311. Shore P., Sharrocks A.D. The MADS-box family of transcrip-tion factors. // Eur J Biochem. 1995. V.229. P. 1-13.

312. Simons G., Groenendijk J., Wijbrandi J., Reijans M., Groenen J. Dissection of the Fusarium 12 gene cluster in tomato reveals six homologs and one active gene copy. // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1055-1068.

313. Smith P.G., Heiser C.B. Jr. Taxonomy of Capsicum sinense Jacq. and the geographic distribution of the cultivated Capsicum species.//Bull Torrey Bot Club. 1957. V.84.P.413-420.

314. Smulders M.J.M., Bredemeijer G., Rus-Kortekaas W., Arens P., Vosman B. Use of short microsatellites from database sequences to generate polymorphisms among Licopersicon esculentum cultivars and accessions of other Licopersicon species. //

315. Sneath P.H., Sokal R.R. Numerical taxonomy. W.H. Freedman & Co. San Francisco. 1973. 573pp.

316. Soleimani V.D., Baum B.R., Johnson D.A. AFLP and pedigree-based genetic diversity estimates in modern cultivars of durum wheat Triticum turgidum L. subsp. Durum (Desf.) Husn..// Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 350-357.

317. Song SU, Gerasimova T, Kurkulos M, Boeke JD, Corces VC. An env-\ike protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus. //Genes Dev. 1994. V.8. P.2046-2057.

318. Song W.-Y., Wang G.-L., Chen L.-L., Kim H.-S., Pi L.-Y. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa2\.//Science. 1995. V. 270. P. 1804-1806.

319. Spooner DM., Hijmans R. Potato systematics and germplasm collecting, 1987-2000.//Am J Pot Res, 2001c, V. 78, P.237-268.

320. Spooner DM., Van der Berg RG. An analysis of recent taxonomic concepts in wild potatoes (Solanum sect. Petota).H Genetic Resources and Crop Evolution. 1992.V.39. P. 23-37.

321. Spooner DM., van der Berg RG., Miller JT Species and series Longipedicellata ( Solanaceae) and phonetically similar species in ser. Demissa and ser. Tuberosa: implication for a praet Vical taxonomy of sect. Petota. // Am J Bot, 2001a, V.88, P.113-130.

322. Spooner DM., van der Berg RG.,Rivera-Pena A., Velguth P., del Rio A., Salas A. Taxonomy of Mexican and Central American members of Solanum Series Conicibaccata ( sect. Petota)// Syst Bot. 2001b. V.26. P.743-756.

323. Spooner DV., Castillo RO. Reexamination of series relationships of South American wild potatoes ( Solanaceae, Solanum sect. Petota): evidence from chloroplast DNA restriction site variation.// Am J Bot, 1997,V. 84, P. 671-685.

324. Spooner, D.M., Anderson, G.J., and Jansen, R.K. 1993. Chloroplast DNA evidence for Solanaceae: the interrelationships of tomatoes, potatoes, and pepinos (Solanaceae)//Amer. J. Bot. 1993. V.80. P. 676-688.

325. Spooner, D.M., R. Hoekstra, R.G. van den Berg, and V. Martinez. Solanum sect. Petota in Guatemala: taxonomy and genetic resources.// Amer. J. Potato Res. 1998. V.75. P.3-17.

326. Spooner, D.M., R.G. van den Berg, W. Garcia, and M.L. Ugarte. Bolivia potato collecting expeditions 1993, 1994: taxonomy and new germplasm resources.// Euphytica. 1994. V. 79, P. 137-148.

327. Stein J.C., Dixit R., Nasrallah M.E., Nasrallah J.B. SRK, the stigma-specific S-locus receptor kinase of Brassica, is targeted to the plasma membrane in transgenic tobacco.//Plant Cell. 1996.V.8. P.429-445.

328. Stratmann J.W., Ryan C.A. Myelin basic protein kinase activity in tomato leaves is induced systemically by wounding and increases in response to systemin and oligosaccharide elicitors.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94.P. 1185-1189.

329. Straub J.E., Serquen F.C., Gupta M. Genetic markers, map construction and their application in plant breeding. //Hort Science . 1996. V.31P.729-741.

330. Suoniemi A., Tanskanen J., Schulman A.H. Gypsy-like retrotransposons are widespread in the plant kingdom.//Plant J. 1998. V. 13.P.699-705.

331. Tai Т., Dahlbeck D., Stall R.E., Peleman J., Staskawicz B.J. High-resolution genetic and physical mapping of the region containing the Bs2 resistance gene of pepper.// Theor. Appl. Genet. 1999. V.99. P. 1201-1206.

332. Tang X., Xie M., Kim YL., Zhou J., Klessing DF., Martin GB. Overexpression of Pto activaties defense responces and confers broad resistance// Plant Cel. 1999. V.ll. P. 15-30

333. TanksleySD and McCoughSR Seed banks amd molecular maps: unlocking geneticpotential from the wild//Science. 1997. V.277. P. 1063-1066. Tautz D. and Schlotterer C. Simple sequences. //Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V. 4. P. 832-837.

334. Tautz D., Trick M. and Dover G. Cryptic simplicity in DNA is a major source of geneticvariation. //Nature. 1986. V.322. P.652-656. Theissen G. Development of floral organ identity: stories from the MADS house. //

335. Curr. Opin. Plant Biol. 2001. V.4. P.75-85. Theissen G., Becker A., Di Rosa A., Kanno A., Kim J.T., Mtinster Т., Winter K.-U. & Saedler, H. A short history of MADS-box genes in plants. // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 115-149.

336. Curr. Opin. Plant Biol. 2001. V. 4. P. 75-85. Theissen, G., Becker, A., Di Rosa, A., Kanno, A., Kim, J.T., Mtinster, Т., Winter, K.-U. & Saedler, H. A short history of MADS-box genes in plants.// Plant Mol. Biol.2000. V.42. P. 115.149.

337. Thomas H.M., Harper J.A., Morgan W.G. Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum.//Chrom.Res.2001.V.9.P.585 -590.

338. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewnial F., Jeanmougin F. & Higgons D. G. The CLASTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.// Nucleic Acids Res. 1997. V.24. P. 4876-4882.

339. Tilly J.J., Allen D.W., Jack T. The CArG boxes in the promoter of the Arabidopsis floral organ identity gene APETALA3 mediate diverse regulatory effects. // Development. 1998. V.125. P. 1647-1657.

340. Timmerman-Vaughan G.M., Frew T.J. ,Weerden N.F. Characterization and linkage mapping of R-gene analogous DNA sequences in pea (Pisum sativum L). //Theor. Appl. Genet. 2000. V.101. P.241-247

341. Tiwari K.R., Penner G.A., Warkentin T.D. Identification of coupling and repulsion phase RAPD markers for powdery mildew resistance gene er-1 in pea.//Genome. 1998.V.41. P.440-444.

342. Tommiska J, Hamalainen JH, Watanabe KN, Valkonen JPT. Mapping of the gene Nxphu that controls hypersensitive resistance to potato virus X in Solanum phureja IvP35.// Theor Applied Genet. 1998. V. 96. P. 840-843

343. Tong N. & Bosland P.W. Capsicum tovarii, a new member of the Capsicum baccatum complex.//Euphitica. 1999. V.109.P.71-77.

344. Torii K.U., Mitsukawa N., Oosumi Т., Matsuura Y., Yokoyama R., et al. The Arabidopsis erecta gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats.// Plant Cell. 1996.V.8.P.735-746.

345. Toth G., Gaspari Z. and Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. // Genome Research. 2000. V. 10. P. 967-981.

346. Tsuchimoto S., van der Krol A.R., Chua N.-H. Ectopic expression of pMADS3 in transgenic petunia phenocopies the petunia blind mutant. // Plant Cell. 1993. V.5. P. 843-853.

347. Turcotte K, Srinivasan S, Bureau T. Survay of transposable elements from rice genomic sequences .// Plant J. 2001. V.25. P. 169-179.

348. Turpeinen Т., Vanhala Т., Nevo E., Nissila. AFLP genetic polymorphism in wild barley (Hordeum spontaneurri) population in Israel. // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 1333-1339.

349. Vaillancourt R.E., Jackson H.D. A chloroplast DNA hypervariable region in eucalypts. // Theor Appl Genet. 2000. V.101. P.473-477.

350. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput. Applic. Biosci. 1994. V.10. P.569-570.

351. Van den Berg, R.G., J.T. Miller, M L. Ugarte, J. P. Kardolus, J. Villand, J. Nienhuis, and D.M. Spooner. Collapse of morphological species in the wild potato Solanum brevicaule complex (sect. Petota).// Amer. J. Bot. 1998, V. 85, P.92-109.

352. Van der Berg R.G., Bryan G.J., del Rio A., Spooner D.M. Reduction of species of the wild potato Solanum section Petota series Longipedicellata: AFLP, RAPD and chloroplast SSR data.//Theor. Appl. Genet. 2002. V.105. P.l 109-114.

353. Van der Linden C.G., Wouters D.C.A.E., Mihalka V., Kochieva E.Z., Smulders M.J.M., Vosman B. Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling.// Theor. Appl. Genet. 2004. V.109

354. Van der Sande C.A.F.M., Kwa M., van Nues R.W., van Heerikhuizen H., Raue H.A., Planta R.J. Functional analysis of internal transcribed spacer 2 of Saccharomyces cerevisiae ribosomal DNA.// J.Mol.Biol. 1992. V.223.P.899-908.

355. Van der Vossen E.A.G., Rouppe van der Voort J.N.A.M., Kanyuka K., Bendahmane

356. A., Sandbrink S., Baulcombe D.C., Bakker J., Stiekema W.J. Klein-Lankhorst, R.M. Homologues of a single resistance-gene cluster in potato confer resistance to distinct pathogens: a virus and a nematode. //Plant J. 2000. V.23. P.567-576

357. Van Nues R.V., Venema J., Rientjes J.M.J., Dirksmulder A. and Raue H.A. Processing of eukaryotic pre-rRNA: the role of the transcribed spacers.//Biochem. Cell Biol. 1995. V.73. P.789-801.

358. Van Tienderen P.H. , De Haan A.A. , Van der Linden C.G., Vosman, B. Biodiversity assessment using markers for ecologically important traits. //Trends Ecol. Evol. 2002. V. 17. 577-582

359. Vargas P., McAllister H.A., Morton C., Jury S.L., Wilkinson M.J. Polyploid speciation in Hedera (Araliaceae): Phylogenetic and biogeographic insights based on chromosome counts and ITS sequences.//Plant Syst.Evol. 1999.V.219.P.165 -179.

360. Vicente JG and King GJ (2001) Characterization of disease resistance gene-like sequences in Brassica oleracea L.// Theor Appl Genet. 2001. V.102. P. 555-563.

361. Vicient C.M., Kalendar R., Schulman A.H. Envelope-retrovirus-like elements are widespread, transcribed and spliced, insertionally polymorphic in plants.// Genome Res. 2001b. V.ll . P.2041-2049.

362. Vicient C.M., Suoniemi A., Anamthawat-Jonsson K., Tanskanen J., Beharav A., Nevo E., Schulman A.H. Retrotransposon BARE1 and Its Role in Genome Evolution in the Genus Hordeum. //Plant. 1999. V.ll. P.1769-1784.

363. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee Т., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zebeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.//Nucleic. Acids. Res. 1995. V.23. P. 4407- 4414.

364. Walker J.C. Structure and function of the receptor-like protein kinases of higher plants.//Plant Mol. Biol. 1994. V.26.P. 1599-1609.

365. Walsh B.M., Hoot S.B. Phylogenetic relationships of Capsicum (Solanaceae) using DNA sequences from two noncoding regions: the chloroplast atpB-rbcL spacer region and nuclear waxy introns.//Int J Plant Sci. 2001. V.162(6).P. 1409-1418.

366. Wang D.G., Fan J.-В., Siao C.-J. Large-scale identification,mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome.// Science. 1998. V. 280. P. 1077-1082.

367. Wang G., Mahalingam R., Knap H.T. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max (L.) Merr. //Theor. Appl. Genet. 1998. V.96. P. 1086-1096.

368. Wang G., Mahalingam R., Knap H.T. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max (L.) Merr.// Theor Appl Genet. 1998. V.96. P.1086-1096.

369. Wang GL., Song WY., Ruan DL., Sideris S., Ronald PC. The clond gene Xa 21 confers resistance to multiple Xanthomonas orizae pv orizae isolates in transgenic plants// Mol Plant Microbe Interact. 1996. V. 9. P. 850-855.

370. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of plant short-tandem DNA repeats .// Theor Appl Genet. 1994. V.88. P. 1-6.

371. Warnock S.J. A review of taxonomy and phylogeny of the genus Lycopersicon. HortScience. 1988. V.23. P.669-673.

372. Weigel D., Meyerowitz E.M. The ABCs of floral homeotic genes. // Cell. 1994. V.78. P.203-209.

373. Wendel J.F., Schnabel A., Seelanan T. Bidirectional interlocus concerted evolution following allopolyploid speciation in cotton (Gossypium). И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995.V.92.P.280-284.

374. Wendel, J.F. Genome evolution in polyploids. // Plant. Mol. Biol. 2000. V.42. P.225-249.

375. Wessler S.R. Transposable elements associated with normal plant genes. //Physiol. Plant. 1998. V.103. P.581-586.

376. Wessler S.R., Bureau Т.Е., White S.E. LTR-retrotransposons and MITEs: important players in the evolution of plant genomes.// Curr.Opin.Genet. Dev. 1995. V. 5. P.814-821.

377. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R, Corr C., Baker B. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the interleukin-1 receptor.//Cell. 1994. V.78. P. 1101-1115.

378. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R., Corr., Baker B. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similaryti to Toll and the interleukin-1 receptor.//Cell. 1994.V.78 (6).P. 1011-1015.

379. Wicker T, Guyot R, Yahiaoui N, Keller В. CACTA transposons in triticeae. A Divice family of high copy elements . Plant Phys. 2003, V.132, p.52-63.

380. Williams C.E., Clair D.A. Phenetic relationships and levels of variability detected by restriction fragment length polymorphisms and random amplified polymorphic DNA analysis of cultivated and wild accessions of Lycopersicon esculentum. II

381. Genome, 1993, V.36. P.619-630.

382. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucleic Acids Res. 1990. V.18. P.6531-6535.

383. Wissemann V. Molecular evidence for allopolyploid origin of the Rosa canina complex (Rosaceae, Rosoideae).//J.Appl.Bot. 2002.V.76. P. 176 -178.

384. Wolfe A.D., Xiang Q-Y., Kephard SR. Assessing hybridizatoin in natural populations of Pestemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat (ISSR) bands. //Mol. Ecol 1998 V.7 P. 1107-1125.

385. Wolff K. Morgan-Richards M. PCR markers distinguish Plantago majer subspecies.// Theor. Appl. Genet. 1998. V.96. P.282-286.

386. Wu C, Li X, Yuan W, Chen G, Kilian A, Li J, Xu C, Li X, Zhang Q. Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome//Plant Journal, 2003, V.35, P. 418-427.

387. Wu K.-S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P.A. Detection of microsatellite * polymorphism without cloning // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 3257-3258.

388. Wunsch A. and Hormaza J.I. Molecular characterisation of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach Prunus persica (L.) Batsch. SSR sequences. // Heredity. 2002. V.89. P.56-63.

389. Xiong Y. and Eickbush Т.Н. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences.//EMBO J. 1990.V.9.P.3353-3362.

390. Xiong Y. and Eickbush Т.Н. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. EMBO J., 1990 V. 9, P.3353-3362.

391. Xu D.H., Abe J., Gai J.Y., Shimamoto Y. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans: evidence for multiple origins of cultivated soybean. // Theor Appl Genet. 2002. V.105. P.645-653.

392. Yang W., Bai X., Eaton C., Kamoun S., van der Knaap E., Francis Discovery of single nucleotide polymorphisms in Lycopersicon esculentum by computer aided analysis of expressed sequence tags.// Molecular Breeding. 2004. V. 14. P.21-34.

393. Yang G., Dong J., Chandrasekharan M.B., Hall T.C. Kiddo a new transposable element family closely associated with rice genes.// Mol. Genet. Genomics. 2001.V.266.P.417-424.

394. Yanofsky M.F., Ma H., Bowman J.L., Drews G.N., Feldmann K.A., Meyerowitz E.M The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors. //Nature. 1990. V.346. P.35-39.

395. Yoshimura S., Yamanouchi U., Katayose Y., Toki S., Wang Z.-X. Expression of Xal, a bacterial blightresistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 5. P. 1663-1668.

396. Young N.D. The genetic architecture of resistance.//Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V.3. P. 285-290.

397. Young N.D., Cregan P.B. Single-Nucleotide Polymorphisms in Soybean Genetics. 2003. V. 163. P.1123-1134.

398. Youn-Kyu P., Kim B.-D., Kim B.-S., Armstrong K.C., Kim N.-S. Kariotyping of the chromosomes and physical mapping the 5S rRNA and 18S-26S gene families in five different species in Capsicum.//Genes Genet Syst. 1999. V.74. P. 149-157.

399. Yu Z, Wright SI, Bureau T. Mutatio like elements in Arabidopsis thaliana: Structure, Diversity and Evolution// Genetics. 2000. V.156. P. 2019-2030.

400. Zhang K., Letham D.S., John P.C.L. Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34(cdc2)-like hi histone kinase.//Planta. 1996. V.200. P.2-12.

401. Zhang Q., Arbuckle J., Wessler S.R. Recent, extensive, and preferential insertion of members of the miniature inverted-repeat transposable element family Heartbreaker into genie regions of maize.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 1160-1165.

402. Zhao Z.M., Boerwinkle E. Neighboring-Nucleotide Effects on Single Nucleotide Polymorphisms: A Study of 2.6 Million Polymorphisms Across the Human Genome. //Genome Research. 2002. V. 12. P. 1679-1686

403. Zhong C.X., Marshall J.В., Topp C., Mroczek R., Kato A., Nagaki K., Birchler J.A., Jiang J., Dawe R.K. Centromeric retroelements and satellites interact with maize kinetochore protein CENH3. //Plant Cell. 2002. V.14. P.2825-2836.

404. Zhou J.M., Loh Y.T., Bressan R.A., Martin G.B. The tomato gene Ptil encodes a serine/threonine kinase that is phosphorylated by Pto and is involved in the hypersensitive response.// Cell. 1995. V.83.P.925-935.

405. Zhu Y. L.„ Song Q. J.,. Hyten D. L, Van Tassell C. P., Matukumalli L. K.,Grimm D. R., Hyatt S. M., Fickus E. W., Young and N. D., Cregan P. B. Single-Nucleotide Polymorphisms in Soybean//Genetics,2003, V.163, P. 1123-1134

406. Zietkiewicz E, Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification.// Genetics. 1994.1. V.20. Р176-183.

407. Zou J., Wei Y., Jako C., Kumar A., Selvaraj G. and Taylor D.C. The Arabidopsis thaliana TAG1 mutant has a mutation in a diacylglycerol acyltransferase gene.// Plant J. 1999, V.19, P. 645-653.