Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Идентификация вариабельности генома томата С с помощью маркеров на основе ДНК

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Идентификация вариабельности генома томата С с помощью маркеров на основе ДНК"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи УДК 635.64:575.2:631.52

СУПРУНОВА Татьяна Павловна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА ТОМАТА С ПОМОЩЬЮ МАРКЕРОВ НА ОСНОВЕ ДНК

Специальности: 06.01.05 — селекция и семеноводство 03.00.15 — генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва — 1997

Работа выполнена во ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур в 1994—1997 гг.

Научные руководители:

член-корреспондент АН РМ, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Н. Н. Балашова,

кандидат биологических наук Д. Б. Дорохов.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук Н. И. Тимин, кандидат биологических наук А. А. Поморцев.

Ведущее учреждение — ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН.

Защита диссертации состоится « . » .фе&яЛ^»^ 1997 г. в . 'час. на заседании специализированного совета К 120.89.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская область, Одинцовский район, п/о Лесной городок, п. ВНИИССОК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ¿в. * . {¿о^Я/Ь^-... 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 120.89.01, кандидат сельскохозяйственных наук

В. А. Епихов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. С введением в действие закона Российской Федерации "О селекционных достижениях" особую важность приобретают методы идентификации генотипов сельскохозяйственных растений - методы геномной паспортизации. Эти методы должны обладать следующими параметрами: достоверность, воспроизводимость, массовость, быстрота, а получаемые результаты не должны зависеть от условий выращивания и репродукции растительного материала. В настоящее время для молекулярного анализа растительного генома и идентификации сортов и видов наиболее широко применяется метод полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD) Результатом амплификации ДНК является спектр фрагментов, некоторые из которых могут быть использованы в качестве генетических маркеров для построения геномных карт, для видовой и сортовой идентификации, а также для определения таксономических взаимоотношений между видами. RAPD спектры уже широко используются при маркировании сортов и линий таких культур, как пшеница (Brown et al., 1993), рис (Fukuoka et al, 1992), цветная капуста ( Hu and Quiros, 1991, Demeke et al., 1992), соя (Williams et .al,, 1990) и ряда других.

Классическим объектом для генетических и молекулярных исследований являются томаты, которые представляют собой ценную сельскохозяйственную культуру и углубление знаний о геноме этих растений будет способствовать прогрессу в области генетики и селекции томатов. За последние пятнадцать лет был достигнут значительный прогресс в молекулярном маркировании генома томата. Получено свыше 1200 RFLP маркеров, с помощью которых была составлена подробная молекулярно-генетическая карта генома томата (Tanksley et al., 1992). Однако, до сих пор остается нерешенной проблема генотипирования, т.е. маркирования не отдельного локуса, а всего генома томата, которое позволило бы идентифицировать сорта, а также характеризовать линейный материал,

используемый в селекционных программах и межвидовые гибриды, полученные современными методами биотехнологии.

Несмотря на то, что с помощью RAPD метода был успешно картирован ряд генов устойчивости томатов к некоторым заболеваниям (Ohmori et al., 1995; Klein-Lankhorst е! а!., 1991; Stevens et al., 1995; Yaghoobi et al., 1995), однако консервативность генома томата, обусловленная процессами самоопыления, создает значительные трудности в выявлении геномного полиморфизма у сортов и линий томата с помощью молекулярных методов (Miller and Tanksley, 1990; Williams and Clair, 1993; Rom et al., 1995). Поэтому в настоящий момент довольно остро стоит проблема маркирования сортов томатов, а также выявления генетической структуры гибридов, полученных как при межвидовой, так и при внутривидовой гибридизации томатов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось молекулярное маркирование ядерного генома томата, выявление межвидового и межсортового полиморфизма, а также анализ половых и соматических гибридов томатов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1) оптимизировать условия проведения RAPD реакции, подобрать праймеры, выявляющие межвидовой и межсортовой полиморфизм у томатов; 2) провести RAPD паспортизацию отдельных сортов и линий томатов с помощью подобранной системы праймеров; 3) провести сравнительный RAPD анализ межвидовых половых и соматических гибридов томатов и их потомства; 4) провести молекулярный анализ фрагментов ДНК соматических асимметрических гибридов, амплифицированых в RAPD реакции.

Научная новнзна работы Оптимизированы условия полимеразной цепной реакции для быстрого получения RAPD спектров представителей сем. Пасленовые (Solatuiceac). Подобрана группа праймеров, позволяющая идентифицировать как межвидовой, так и внутривидовой полиморфизм. Получены индивидуальные RAPD спектры для отдельных

представителей маркерной мутантной коллекции томатов. Впервые была использована двухпраймерная система для сортовой идентификации томатов. Проведен детальный молекулярный анализ межвидовых гибридов томатов, который позволил доказать, что появляющиеся в 11ЛР[) спектрах потомства асимметрических соматических гибридов не родительские фрагменты амплифинированной ДНК не являются артефактом реакции амплификации. Впервые проведен молекулярный анализ некоторых КАРП фрагментов амплифинированной ДНК асимметрических соматических гибридов томатов. Нуклеотидная последовательность одной из не родительских зон обладает высокой степенью гомологии (80%) с геном катапсина В из ШсоНапа тхНса. Таким образом, нами впервые был клонирован и секвенирован фрагмент гена катапсина В у томата.

Практическая ценность работы. В данной работе было проведено ЯЛРП маркирование генотипов некоторых видов сем. Яп/апасеае, которое продемонстрировало возможность использования в дальнейшем этих данных в филогенетических исследованиях. Предложена двухпраймерная система ЯДРО анализа для молекулярного маркирования сортов томатов, что может быть использовано для целей сортовой паспортизации, включающей в себя как выявление генетически полиморфных исходных форм, так и защиту селекционного материала. Характерные ЯАРО спектры, полученные для мутантных линий демонстрируют возможность насыщения этих многомаркерных линий еще и молекулярными маркерами, что позволит эффективнее проводить работы по изучению процессов рекомбинации. Предложенная в данной работе быстрая ЯЛР[) технология позволит значительно ускорить идентификацию гибридов и оценить размах генетической изменчивости генома гибридов и их потомства на самых ранних стадиях онтогенеза.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Агробиотехнология растений и животных" (Киев, 1997), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения", Пущино, 1997,

Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997).

Публикации. По теме диссертадии опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы Диссертация изложена на У/2. страницах и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя!*?-источников. Работа проиллюстрирована 1 таблицей, 3 схемами и 20рисунками.

Материалы и методы. Диссертационная работа выполнена по результатам экспериментальных исследований на базе ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, в лаборатории физиологии и биохимии растений, а также в институте биологии гена РАН (Москва).

Объектами исследования данной работы служили 16 видов сем. Solanaceae, полученных из коллекции ВНИИ растениеводства (г.Санкт-Петербург); 8 отечественных и зарубежных сортов культурного томата I.ycopersicon esculentuni из различных регионов селекции; 6 мутантных линии маркерной коллекции томатов ВНИИССОК, (любезно предоставлены Бочарниковой Н И., ВНИИССОК, Москва), 15 растений F5 полового потомства межвидовых половых гибридов I.ycopersicon esculenlum Mill (сорт Факел) х I.ycopersicon pennellii Cor., полученных с экзогешюй ДНК, как фактором генетической трансформации томата в процессе опыления - оплодотворения (Чесноков и др.,1995); 9 асимметрических соматических гибридов, полученных после слияния протопластов культурного томата Lycopersicon esculenlum и у-облученных протопластов дикого вида I.ycopersicon peruvkmum, а также 12 растений F| и F2, полученных после самоопыления данных асимметрических соматических гибридов (Ratushnyak et al., 1993) (Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАНУ, Киев, Украина).

В работе использовались следующие методы: полимеразиая цепная реакция с произвольными праймерамн (RAPD), электрофорез в агарозном геле, блот-гибридизация, клонирование и секвенирование, а также метод многомерного кластерного анализа (YVPGMA)

Для цепной полимеразной реакции использовали наборы реактивов производства "Biomaster" (Москва). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей IX буфер из соответствующего набора, 2мМ MgCh, 100 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 2,5 пМ/мкл соответствующего праймера; 0,25 единиц Taq полимеразы и 20 нг геномной ДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе "AMPLY - 250" (Biokom-Service, Россия). Амплификатор программировали на 35 циклов, которые выполнялись по следующей программе: 1) Змии 94°С; 1,5мин 37"С; 1,5мин 72"С - 1 цикл; 2) 1мин 94"С; 1,5мин 37"С; 1,5мин 72°С - 33 цикла; 3) 1мин 94°С; 1,5мин 37"С, 15мин 72°С - 1 цикл.

Результаты и обсуждение.

Прежде чем приступать к сортовой идентификации и анализу половых и соматических гибридов томатов, нам было необходимо оптимизировать условия реакции амплификации, а также подобрать праймеры, выявляющие межвидовой полиморфизм на уровне семейства Пасленовых (,Solanaceae), к которому принадлежит род f.ycopersicon.

Раздел I. Маркирование видов сем. Пасленовых.

Для проведения анализа нами были отобраны виды, являющиеся представителями основных родов и триб семейства Solanaceae, а также те, которые довольно часто используются для получения исходного материала при создании новых сортов.

RAPD реакцию видов сем. Пасленовых проводили с праймером BL-26 (GTAGCTGACG), ранее примененным в работе Brown et al. (1994). Как видно из рис.1 каждый из видов имеет

специфический спектр амплифицированной ДНК, отличающийся от других количеством фрагментов, их молекулярной массой и степенью выраженности (мажорности/минорности). С другой стороны, некоторые фрагменты являются общими для всех видов. Так, например, фрагмент 450 н.п., который встречается практически во всех RAPD спектрах изученных видов, по всей видимости может служить маркером для семейства Sotanaceae. Кроме того, среди продуктов амплификации изученных видов можно обнаружить фрагменты, являющиеся родоспецифичными. К примеру, два фрагмента -340 н.п. и 290 н.п. могут служить маркерами рода Solanum, так как встречаются только в RAPD спектрах данного рода (рис.1, дор. 5-12). Также в RAPD спектрах некоторых видов были выявлены уникальные фрагменты, которые не встречаются в RAPD спектрах других видов сем. Пасленовых и могут служить видовыми маркерами. Такими видовыми маркерами, по всей видимости, могут являться фрагменты молекулярной массы 410 н.п. и 160 н.п. у /,. hirxulum (рис.1, дор. 14), 220 н.п. у S. rickii (рис. 1, дор. 13), 190 н.п. у S. nigrum (рис.1, дор.5).

В результате проведенного RAPD анализа с использованием праймера BL-26 было маркировано 16 видов сем. Solanaceae, для каждого из которых был получен характерный RAPD спектр. Был получен фрагмент, который может маркировать принадлежность данных видов к сем. Пасленовые, а также фрагменты, которые могут быть использованы в качестве родоспецифичных маркеров, для ряда видов были выявлены видоспецифичные маркеры.

С помощью компьютерной обработки по методу кластерного анализа (WPGMA) на основании фрагментов RAPD спектров была построена дендрограмма генетического сходства исследованных видов сем. Пасленовых. Степень сходства/отличия RAPD спектров видов пасленовых очень сходна с существующей систематикой семейства Solanuceue. Таким образом проведенные исследования показали, что классификация семейства Пасленовых по молекулярным и морфофизиологическим признакам дает сходные

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 12 13 14 15 16 М

Рис 1. RAPD полиморфизм различных видов семейства Solcmaceae, выявляемый при помощи праймера BL-26. Дор. 1 - ДНК Nicotiana tahaeum (v.Samson), 2 - ДНК Petunia hybrida, 3- ДНК I'hysalis peruviana , 4 - ДНК Capsicum annuum (сорт Ласточка), 5 - ДНК Solanum nigrum , 6 - ДНК Solanum melongena (сорт Викар), 7 - ДНК Solanum jamesii, 8 - ДНК Solanum stenotomum, 9 - ДНК Solanum tauripense, 10 - ДНК Solanum phureja, 11 - ДНК Solanum andigenum, 12 - ДНК Solanum tuberosum (сорт Бинтье), 13 - ДНК Solanum rickii, 14 - ДНК Lycopcrsicon hirsutum, 15 - ДНК Lycopersicon pimpinelhfolium, 16 - ДНК l.vcopersicon esculentum (сорт фунтовый Грибовский 1180). M - маркерные фрагменты 1 kb ladder.

результаты и RAPD метод может быть использован в дальнейшем в таксономии для уточнения систематического положения видов.

Раздел 2. Маркирование сортов и линий томатов.

2. /. Ныжаеш/е межсортового полиморфиз ма у томата.

Для разработки метода маркирования сортов томатов с помощью RAPD метода были выбраны 8 отечественных и зарубежных сортов из различных регионов селекции, отличающихся по ряду морфологических признаков. Для выявления межсортового полиморфизма у томатов был проведен скрининг 45 праймеров. Однако большинство из них не выявляли сортового полиморфизма, а некоторые праймеры (в том числе и праймер BL-26, который использовался нами для выявления межвидового полиморфизма) генерировали незначительные отличия в RAPD спектрах изучаемых сортов (рис.2 А, дор 3,5), которых было недостаточно для маркирования данных сортов томатов.

В ряде работ (Miller and Tanksley., 1990, Williams and Clair, 1993; Rom et al., 1995) было указано на трудности в сортовой идентификации томатов с помощью молекулярных методов (RAPD и RFLP), что связано с достаточной консервативностью генома томата, обусловленной процессами самоопыления. С целью обогащения RAPD спектра и выявления межсортового полиморфизма, нами была предпринята попытка использования в реакции одновременно двух "случайных" праймеров, в отличие от общепринятой RAPD реакции с одним праймером. Наиболее эффективным в выявлении сортового полиморфизма у томатов оказалось сочетание в RAPD реакции двух праймеров BL-26 и А-31 (GTAGCTGTACG), которые ранее уже использовались для маркирования сортов картофеля (Оганесян и др., 1996).

При использовании двухпраймерной системы (BL-26 + А-31) для каждого из анализируемых сортов был получен сортоспецифичный RAPD спектр (рис.2 Б) Спектр образован 9-15 фрагментами, область разделения которых располагается в районе 1.7-0.1 т.п.н. Каждый из полученных RAPD спектров различается как по количеству, так и по расположению амплифицированных фрагментов. При этом в RAPD спектрах всех сортов выявляются общие фрагменты, мажорные полосы молекулярной массы 600 п.н и 290 п.н., а также блок из двух минорных фрагментов 390 п.н. и 340 п.н.

Рис.2. RAPD спектры амплифицированной ДНК сортов томатов, полученные при помощи праймера BL-26 (А) и с праймерами BL-26 + А-31 (I»), Дорожки: I - с Талалихин 186, 2 - с. Алплтьева 905-а, 3 -с. Содружество, 4 - с. ВИР-Ю0, 5 - с. Прометей, 6 - с. Gimar, 7 - с. Bodelglut, 8 - с. Peto 94-С.

1 2 3 4 5 6 7 8 (А)

1 2 3 4 5 6 7 8 (G)

450 п.н.

29(1 ll.li.

600 ll.ll.

Тем не менее каждый из полученных спектров сортов томата характеризуется уникальным набором фрагментов. При этом следует отметить появление сортоспецифичного мажорного фрагмента длиной 1,6 т.п.н., выявляемого из анализируемых сортов только у растений сорта Талалихин 186 (рис.2 Б, дор. I), который может служить маркером данного сорта. Наибольшие отличия детектируются в сортах Прометей и Bodelglut (рис.2 Б, дор.5 и 7). Это, прежде всего, отсутствие в спектре сорта Прометей мажорного фрагмента молекулярной массы 450 н п. и у сорта Bodelglut целого блока фрагментов в верхней части спектра, присутствующих у всех остальных сортов томата.

Как следует из представленного материала, в отличие от межвидового, межсортовой полиморфизм значительно менее выражен. Это в целом соответствовало ожидаемым результатам и совпадало с исследованиями, проведенными не только на томатах (Williams and Clair, 1993), но и на картофеле (Оганесян и др., 1996) и баклажанах (Karihaloo et al., 1995). Можно предположить, что это связано с низкой вариабельностью генома L. esculenlum, которую можно объяснить, во-первых, естественной тенденцией к изолированию популяций благодаря самоопылению; во-вторых, ограниченным числом диких видов томатов, вовлекаемых в скрещивания; и в-третьих, тем, что современные селекционные программы способствует низкому уровню полиморфизма, так как типовое однообразие культуры является желаемой характеристикой. Тем не менее, использование в RAPD реакции двухпраймерной системы увеличивает потенциал RAPD технологии в обнаружении полиморфизма и позволяет выявлять межсортовые различия даже на уровне такого консервативного генома как геном томата и получать индивидуальные RAPD спектры, которые могут быть использованы для паспортизации данных сортов.

2.2. Использование RÂPI) технологии для анализа мутантной коллекции томатов.

В генетических исследованиях широко используется многомаркерная мутангная коллекция томатов. Эта коллекция находит применение не только в фундаментальных исследованиях (картирование генома, изучение рекомбинационной изменчивости и т.д.), но и может служить для целей практической селекции..

Предыдущие исследования, проведенные нами, продемонстрировали трудности в выявлении межсортового полиморфизма, поэтому для дальнейшей работы были отобраны линии, заведомо отличающиеся по нескольким признакам, и была продемонстрирована принципиальная возможность использования ЯДРО технологии для маркирования конкретных линий. С этой целью были взяты 6 мутантных линий с маркерными генами в хромосоме 2: одномаркерные - Мо588 (оа), Мо24 (усу), Мо438 (ои/); двухмаркерная - Мо305 (ту,т>) и трехмаркерные линии - Мо755 (т'.аа.ф, Мо938 (ит,«»>,</).

ЯДРО реакцию проводили с праймером 2-60-1 (в АСТСТОТСО), который позволил получить характерные ЯАРО спектры для всех шести мутантных линий. Из результатов, представленных на рис.3 видно, что наряду с общими фрагментами (1400 п.н. и 300 п.н.), в ЯДРО спектрах некоторых генотипов появляются характерные фрагменты молекулярной массы 1100 п.н. для Мо 438 (як1), 1450 п.н. для Мо 938 (с/.аи'.ну) и 200 п.н. для Мо 755 (и>у,аа,!1) (рис.3, дор. 1,3,6 соответственно), которые могут служить маркерами для данных мутантных линий. Оиращает на себя внимание также отсутствие в 1Ъ\РО спектре Мо 588 (И'У) мажорного фрагмента 900 п.н., который присутствует в спектрах остальных мутантных линий (рис.3, дор. 4).

Таким образом, используя КАРО метод для анализа образцов мутантной коллекции, нам удалось получить спектры амплифицированной ДНК шести мутантных линий, характеризующиеся уникальным набором фрагментов. Полученные данные демонстрируют возможности 1Ъ\Р13 технологии по насыщению многомаркерных линий еще и

1 г 3 4 5 6

1400 л.и. 900 ii.ii.

+ 311(1 пл. —► 200 п. н.

Рис.3. КАРГ) спектры амплифицированной геномной ДНК различных мутантных линий с использованием праймера 2-60-1.Дорожки: 1 - Мо438 (яи>); 2 - Мо305 (ои'.нт); 3 - Мо938 (¿ян'.от); 4 - Мо588 ((От); 5 - Мо24 (ит); 6 - Мо755 (wv.an.cf).

молекулярными маркерами, что позволит успешнее проводить работы по рекомбинационной изменчивости не только на морфологическом, но и на молекулярном уровне.

Раздел 3. Молекулярный анализ межвидовых гибридов томатов, полученных при половой н соматической гибридизации.

3.1 Молекулярный анализ половых межвидовых гибридов томата. Для молекулярного анализа межвидовых гибридов томатов нами было использовано половое потомство межвидовых гибридов между культурным томатом 1,усорегясоп ехсик'Шит (сорт Факел ) и диким видом Ьусорегмсоп реппеИИ, полученных при участии экзогенной ДНК для генетической трансформации томата в процессе опыления -оплодотворения (Чесноков н др ,1995).

Для исследования уровня ннтрогрессии геномов партнеров гибридизации межвидовых гибридов I,. еяси!еп1ит х Л. реппеИИ нами была проанализирована ДНК родительских форм,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис.4. ЯЛРП спектры эмлифнцированной ДНК межвидовых гибридов 1л'сорег.ч1ат еш^спшт и ¡.усрсгмит реппеИа, полученных при использовании экзогенной ДНК, с применением праймера 470-1. Дорожки: 1 - рсгтеПи; 2 - /.. тси1еп1ит\ 3-17 - полового потомства гибридов(/.. ехси/сшит х /.. рчптИпХ полученного после рада самоопылений.

и 15 растений р5, полученных после ряда самоопылений межвидовых половых гибридов и которые отличались по ряду морфологических признаков, не свойственных для потомства межвидовых гибридов /.. ехсикшит х /.. реппеНп, полученных обычным путем без участия экзогенной ДНК (Бочарникова и др., 1995). Из ЯАРО спектров амллифицированной ДНК растений р5 межвидовых гибридов /.. ехсн/еп/ит х /.. реппеПИ, полученных с применением праймера 4-70-1 (ОССССТСТТО), видно, что только у шести генотипов выявлены фрагменты амплифиннрованной ДНК, характерные как для /.. ехсн/еШит, так и для /,. ре/теНИ, что подтверждает гибридную природу данных генотипов (рис.4, дор.3,4,7,12,14,17). Гибридность этих растений определялась также и другими праймерами -2-60-1 (САйТСТОТСО), ОРА-09(ОООТААСОСС), Р-ОЦАССАОСОТСС.), 3-70-1 (ТСССТОТОСС). У остальных генотипов хотя и преобладают ЯДРО спектры близкие по , своему характеру к ЛАРО спектру /.. ежи/еШшп, однако наблюдается появление новых фрагментов как в верхней, так и в нижней части спектра (рис.4, дор. 6,8-13,15,16,).

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что большая часть гибридов наследует геном культурного томата Л. е.чси/ен/нт, а появление новых фрагментов амплифицированной ДНК, наряду с не характерными морфологическими признаками в потомстве гибридов, может свидетельствовать об активном рекомбинационном процессе либо о процессах, приводящих к значительной перестройке генома (транслокации, делеции и т.д.), что связано, по всей видимости, с мутагенным действием экзогенной ДНК, которая использовалась в процессе опыления-оплодотворения.

Таким образом, нами было показано, что использование КАРИ метода в анализе генетической вариабельности половых межвидовых гибридов позволяет не только детектировать гибридность получаемых форм, но и выявлять специфические изменения в структуре геномов последующих поколений по сравнению с геномами их родительских форм, которые проявляются в появлении новых фрагментов амплифицированной ДНК.

3.2 Молекулярный анализ межвидовых асимметрических соматических гибридов томата.

Для проведения анализа нами были взяты девять асимметрических соматических гибридов, полученных после слияния протопластов культурного томата I.усорегысоп еяси/еШит и у-облученных протопластов дикого вида I.усореп/соп рептапит, а также двенадцать растений Р, и Р2, полученных после самоопыления данных асимметрических соматических гибридов (КаШвЬпуак М а!., 1993). Проведенная ранее морфологическая, цитологическая и изоферментная оценка, а также рестриктный анализ митохондриальной и хлоропластной ДНК подтвердили гибридность полученных соматических асимметрических гибридов и показали их вариабельность (ЯаШБЬпуак е1 а!., 1993). Однако, использование ЯАРЭ технологии для молекулярного анализа ядерного генома соматических гибридов позволило нам впервые выявить значительные перестройки в геноме соматических гибридов и их потомства.

ЯДРО спектры соматических гибридов между 1,. е.чсн/епН/т и /,. регипттт и их родительских форм были получены с помощью праймера Р-01, который индуцировал наиболее информативные ИАРЭ профили в широком диапазоне молекулярных масс амплифицируемых фрагментов ДНК. Из рис.5 (А) видно, что у всех соматических гибридов преобладают КАРО спектры, близкие по своему характеру к Л. слсн/е/Инт, однако наблюдаются также фрагменты амплифицированной ДНК, характерные и для /,. рептапнт, например, полоса молекулярной массы 940 п.н..

Однако, сравнительный ЯДРО анализ выявил, что у всех соматических гибридов наблюдается потеря части фрагментов амплифицированной ДНК, характерных для ЯДРО спектра I.. ехси!епШт, и индукция новых полос, не характерных для партнеров гибридизации. Это два мажорных фрагмента в нижней части спектра молекулярных масс 220 п.н. и 260 п.н., а также фрагмент 560 п.н., которые встречаются в ЯАРО спектрах всех соматических гибридов (рис.5А, дор.3-21).

Сравнительный ЯАРО анализ и Рг потомства, полученного после самоопыления соматических гибридов, выявил еще больший уровень гетерогенности геномов Из рис.5А (дор. 12-21) видно, что в ЯАРЭ профилях растений И], полученных после самоопыления соматических гибридов, наблюдаются изменения (появляются новые фрагменты в высокомолекулярной части спектра) по сравнению с ЯДРО спектрами соматических гибридов, хотя морфологический анализ показал, что растения Г| практически не отличаются от соматических гибридов. Особенно интересным является появление нового мажорного фрагмента ЗООп.н. у одного из растений И) (рис. 5А, дор. 18), который не встречается больше ни в одном ЯДРО спектре. Еще более существенные изменения характера ЯАРО спектра наблюдаются у растений Р2: исчезают мажорные полосы в средней (560п.н.) и нижней (220п.н.) части спектра, и появляются новые фрагменты (ЗООп.н) и целый блок минорных полос в средней части спектра (рис.5А, дор.22-23). Характерные

Р ДРу 1 я

* I 11 ^

I _ • - .___ >_ „»; I I- * т- V-* ■ * <

; - - - {

5

^ ~~ ^ " „V " У *" "Г?

* Л ~~ *

.-- - _ . --г?««-„ ; ••

(А) Цс Ь.[) БН К,

Рис 5. (А) ЯАРЭ спектры амплифицироваиной ДНК асимметрических соматических гибридов 1.т>рип1соп ехсиЫпЫт и ¡.усоретсоп рептапит ., с использованием праймера Р-01. Дорожки: 1

- /.. е*си\еппип\ 2 - /.. репмапит; 3-11- соматические гибриды (X. е.чси1еп1ит х /.. репмапшп); 12 -21

- И, потомства, полученного после самоопыления соматических гибридов; 22,23 - Кг потомства, полученного после самоопыления одного из растений Г,.

Рис 6. Молекулярный анализ фрагмента РЯ, 830 п.н (Б) ЯАРЭ спектры асимметрических соматических гибридов и их родителей, индуцируемые праймером Р-01 ( дорожки: 1 - ¡.усорегхк'оп С5а//1'п(ши, 2 - ¡.усорсгнсоп рептстит, 3 - асимметрический соматический гибрид между Л. ехсиктпт и /.. рету1апит\ 4, 5, 6 - Р) соматического асимметрического гибрида, полученные после самоопыления; 7, 8 - соматического асимметрического гибрида). (В) Блат-гибридизация фрагмента РЯ с ЧАРЭ спектром соматических гибридов и их родителей.

изменения в ЯАРЭ спектрах соматических гибридов и их потомства, выявляемые с. помощью праймера Р-01, детектировались также и другими праймерами. Из выше

(Г

изложенного следует, что ЯАРЭ технология может успешно использоваться для анализа генетической вариабельности межвидовых соматических гибридов. Она позволяет не только идентифицировать гибридность уже на ранней стадии развития растения, но и дает возможность исследовать уровень гетерогенности асимметрических соматических гибридов. Выявляемый с помощью ЯДРО анализа полиморфизм ядерного генома асимметрических соматических гибридов может быть связан с нарушениями процессов репарации, индукции митотической и/или мейотической рекомбинации, вызванными (как предполагалось нами и в случае с межвидовыми половыми гибридами, полученными при участии экзогенной ДНК) короткими фрагментами ДНК, образующимися при у-облучении протопластов одного из партнеров гибридизации. Эти значительные изменения с одной стороны делают геном не стабильным, а с другой стороны могут являться необходимым источником генетической изменчивости и представлять практический интерес для селекционных программ.

Раздел 4: Молекулярный анализ структуры ЯДРО спектров соматических асимметрических гибридов.

Применение ЯДРО технологии при анализе асимметрических соматических гибридов и их потомства позволило выявить значительные 'изменения в их геномах, что вызвало необходимость в дополнительном молекулярном анализе фрагментов амплифицированной ДНК. Во-первых, необходимо было выяснить молекулярную природу амплифицируемых с помощью ЯДРО реакции не родительских фрагментов у соматических гибридов и установить не являются ли они артефактом реакции. Это связано с тем, что эффект появления не родительских зон наблюдался рядом авторов при ЯДРО анализе генома

персика (Rajapakse et al., 1995), приматов (Riedy et al., 1992) и пчел (Hunt and Page, 1993) и они посчитали это артефактом реакции амплификации. Во-вторых, на основании анализа RAPD спектров нельзя однозначно утверждать, что одинаковые по размеру полосы соответствуют гомологичным последовательностям ДНК. Кроме того, представлялось интересным выяснить молекулярную природу амплифицированных с помощью RAPD реакции фрагментов: являются ли они уникальными или повторяющимися последовательностями генома томата. С этой целью был проведен молекулярный анализ с использованием таких методов, как клонирование, секвенирование и гибридизация. 4.1. Молекулярный анализ фрагмента PR.

Прежде всего, представляли интерес фрагменты амплифицированной ДНК, которые присутствуют как у родителей, так и у гибридов. В молекулярный анализ был взят общий фрагмент размером 830п.н., обозначенный нами как фрагмент PR, который присутствует в RAPD спектре у одного из родителей, а именно у L peruvianum (рис.6 Б, дор.2), исчезает у соматического гибрида (рис.6 Б, дор.З) и вновь появляется в RAPD спектрах растений Fi (рис.6 Б, дор.4,5,6) и F2 (рис.6 Б, дор.7,8). Этот фрагмент был элюирован из геля после проведения RAPD реакции ДНК /-. peruvianum и был использован в качестве меченого зонда Р32 для гибридизации с блот-фильтром RAPD спектра родителей и гибридов. Как видно из рис.6 В (дор.2,4,6,7,8) этот фрагмент присутствует только у /,. peruvianum, отсутствует у соматического гибрида и вновь появляется у растений F) и F2.

Таким образом, молекулярный анализ фрагмента PR показал следующее: во-первых, фрагмент PR одинаков не только по своей молекулярной массе, но и гомологичен по своей последовательности у всех генотипов, в RAPD спектрах которых он присутствует; во-вторых, эта последовательность уникальна и не перекрывается ни с одним из фрагментов RAPD спектров, что представляет собой дополнительное подтверждение того, что одна и

(А)

1 2 3 4 5 6 7

Г

- -- '(-■ " " ' - 'Л .- г- ' .

- 'Л

>г ;11 •ч'

V»

1 . * -- I—

_

»у.-.ц,*..^ Ц. ,-г?

■ ( >«■

£ ¿».Я? \

(В)

1 2 3 4 5 6

¡¡Ш

г»"" .Л ,

Фрагмент Ю, 390 п.н.

(Б)

3 4 5

Рис. 7. Молекулярный анализ фрагмента ЯЗ." 390 п н. (А) ЯАРО спектры асимметрических соматических гибридов и их родителей, индуцируемые праймером Р-01 (дорожки:! - !.усорепнсоп схеи/епшт, 2 - ¡.усоретсоп рептапит, 3 - асимметрический соматический гибрид между /,. е.1си1спШт и Л. рептапит; 4,5,6 - р! соматического асимметрического гибрида, полученные после самоопыления; 7,8 - Р2 соматического асимметрического гибрида). (Б) Блот- 'гибридизация фрагмента ЯЗ с ЯАРЭ спектром соматических гибридов и их родителей. (В) Блот-гибридизация фрагмента ЯЗ с геномной ДНК I.. есикмит (1),/,. рет/Шпит (2),асимметрического соматического гибрида (3) и его (4, 5,6), рестрицированной эндонукпеазой Нтс! III.

та же последовательность ДНК не является матрицей для амплификации нескольких RAPD фрагментов; в-третьих, результаты молекулярного анализа фрагмента PR подтвердили наши предположения о том, что, по всей видимости, гамма-облучение не до конца разрушает ядро протопласта L peruvianum перед слиянием с протопластом L. esculentum, часть ядерного материала /,. peruvianum сохраняется и участвует в формировании ядерного генома соматических гибридов.

4.2. Молекулярный анализ фрагмента КЗ.

Для того, чтобы выяснить молекулярную природу амплифицнрованных с помощью RAPD реакции не родительских фрагментов, нами был взят в анализ фрагмент длиной 390п н., который присутствовал в RAPD спектре одного из растений Fi (рис.7 А, дор.6) и при этом не выявлялся больше ни в одном из рассматриваемых RAPD спектров. Данный фрагмент был обозначен нами как фрагмент R3 и выделен из геля после проведения RAPD реакции ДНК данного растения F, .

Для того, чтобы выяснить будет ли фрагмент R3 перекрываться с уже существующими фрагментами RAPD спектров родителей и гибридов или это уникальный фрагмент, который появляется у растения F, в результате мутационных изменений ДНК, фрагмент R3 был использован в качестве зонда при гибридизации с блот-фильтром RAPD спектров гибридов и их родителей. Из рис.7 Б видно, что фрагмент R3 гибридизовался с 390 п.н. фрагментом RAPD спектра данного растения, т.е. этот фрагмент уникален для RAPD спектра данного растения.

Необходимо было также выяснить является ли фрагмент R3 уникальной или повторяющейся последовательностью в геноме. Для этого с тем же радиоактивным зондом была проведена блот-гибридизация с геномной ДНК родителей и гибридов, рестрицированной рестриктазой Hint! 111. Результаты радиоавтографического анализа

показывают (рис.7 В), что фрагмент R3 является уникальным и присутствует в количестве одной копии в геноме.

4.3. Молекулярный anana фрагмента SH2.

Другой не родительский фрагмент молекулярной массы 560 п.н, был обозначен нами как фрагмент SH2. Из рис.5 (А) видно, что фрагмент SH2 встречается во всех без исключения RAPD спектрах соматических гибридов и- растений F| (дорЗ-21), но отсутствует в RAPD спектрах обоих родителей (дор.1 и 2) и исчезает у растений F2 (дор.22, 23). Фрагмент SH2 был элюирован из геля после проведения RAPD реакции ДНК соматического гибрида и был использован в качестве меченного зонда Р52 для гибридизации с блот-фильтром RAPD спектров гибридов и их родителей. Как видно из рисунка рис.8 (Б) фрагмент SH2 гибридизовался только с 560 п.н. фрагментом RAPD спектров соматического гибрида (рис.8 Б, дор.З) и его Fi (рис.8 Б, дор.4,6).Таким образом, фрагмент SH2 идентичен по размеру и уникален для RAPD спектров соматического гибрида и его Fi потомства.

Для того, чтобы выяснить природу изменений, происходящих при соматической гибридизации, определить затрагивают ли эти изменения повторяющиеся последовательности генома или они связаны с уникальными генами, была проведена гибридизация меченой пробы фрагмента SH2 с геномным блот-фильтром ДНК гибридов и их родителей, рестрицированной рестриктазой ЕсоК\. Как видно из рис.8 (В) по характеру гибридизации фрагмент SH2 можно отнести к слабоповторяющимся последовательностям. Представлялось интересным выяснить в каком участке генома гибридов произошли мутационные изменения, которые привели к появлению нового сайта отжига для праймера, результатом которого стала амплификация фрагмента SH2 у гибридов и их F] потомства. Для этого фрагмент SH2 был клонирован в плазмиду pGEM-T и секвенирован.

(Л)

(В)

2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 М

иш зшш&щ

; ^ !-« - .-.-Г^ Т. ; / ]

! —Г'1 ieejtwi • ".

I ■ ;r * , •_.., • • : ... .■

^ - ' > ■ "-MS* - ' ' - -

ШШ1

(Б)

SII2,560 п.н.

Рис. 8. Молекулярный анализ фрагмента SH2, 560 п.н.

(A) RAPD спектры асимметрических соматических гибридов и их родителей, индуцируемые праймером Р-01 (дорожки; 1 -¡xcopersicon L'sculenlum, 2 - Lycoperstcon peruviamun, 3 -асимметри-ческий соматический гибрид между Levculentunt и L peruvianunr, 4, 5, 6 - F( соматического асимметрического гибрида, полученные после самоопыления; 7, 8 - Ft соматического асимметрического гибрида).

(Б) Блот-гпбриднтация фрагмента SH2 с RAPD спектром соматических гибридов и их родителей.

(B) Блот-гибридиюцмя фрагмента SH2 с геномной ДНК L. etitleniu»} (1), L. рептапит (2), асимметрического соматического гибрида (3) и его Fj (4, 5, 6), рестрицированной эндонуклеачой КсоК\. М - маркер молекулярной массы ДНК ■ 1 kb ladder.

Была определена нуклеотидная последовательность длиной 525 пар нуклеотидов. Полученные результаты были проанализированы на гомологию с известными последовательностями банка данных EMBL. Была выявлена высокая степень гомологии (80%) RAPD фрагмента SH2 с геном катапсина В.

Таким образом, нами впервые был выделен фрагмент гена катапсина В и впервые определена последовательность этого фрагмента у томатов Был создан маркерный фрагмент, который может служить зондом для RFLP анализа и при дальнейшей локализации на хромосоме может быть использован в генетическом анализе. Кроме того, нами было доказано, что неродительские зоны, появляющиеся в RAPD спектрах соматических гибридов и их потомства, не являются артефактом реакции амплификации.

В результате проведенного молекулярного анализа фрагментов ДНК, амплифицируемых в RAPD реакции, нами было показано, что RAPD метод позволяет, во-первых, детектировать уникальные последовательности генома; во-вторых, использовать продукты RAPD реакции для клонирования и секвенирования полиморфных зон генома, что подтверждает проведенный нами сиквенс гена катапсина В.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированы условия проведения RAPD реакции геномной ДНК томата и • подобраны праймеры, выявляющие межвидовой полиморфизм у растений сем. Solanaceae. Было маркировано 16 видов сем. Solanaceae, для каждого из которых был получен характерный RAPD спектр. Показано, что выявляемые RAPD маркеры могут быть использованы в таксономии для уточнения систематического положения видов.

2. Была подобрана система праймеров для детектирования межсортового полиморфизма томатов. Для каждого из изученных сортов томатов получены индивидуальные RAPD спектры, позволяющие проводить их паспортизацию и дифференциацию.

3. Продемонстрирована возможность использования RAPD технологии для молекулярного маркирования линий томатов. Были получены характерные RAPD паттерны шести маркерных мутантных линий.

4. При анализе межвидовых половых и соматических асимметрических гибридов томатов было показано, что RAPD технология позволяет не только детектировать гибридность получаемых форм, но и выявлять специфические изменения в структуре их геномов, которые проявляются в появлении не родительских фрагментов амплнфицированной ДНК, при этом было доказано, что они не являются артефактом реакции амплификации.

5. Показано, что RAPD метод позволяет детектировать уникальные последовательности генома томата. Проведенный сиквенс клонированного RAPD фрагмента SH2 выявил гомологию с растительным геном катапсина В, и продемонстрировал, что он может быть использован как проба для RFLP анализа и при дальнейшей локализации на хромосоме может быть использован в генетическом анализе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Дорохов Д.Б., Супрунова Т.П., Ратушняк Л И., Глеба Ю.Ю. RAPD фертильных асимметрических соматических гибридов Lycopersicon esaiieiHum Mill, и I.ycopersicon penivkmum var. dentatum dun. // Тез. докл. междунар. конф., посвященной памяти акад. Баева A.A. - Москва, 1996, с.33.

2. Супрунова Т.П., Бочарникова Н.И., Позмогова Г.Е., Дорохов Д.Б. RAPD анализ межвидовых гибридов I.ycopersicon escitlentum Mil! и Solanum pennellii cor., полученных при опылении с экзогенной ДНК, II Тез. докл. междунар. конф., посвященной памяти акад. Баева A.A. - Москва, 1996, с.40.

3. Супрунова Т.П., Кочиева Е.З., Ратушняк Я.И., Дорохов Д Б. Не родительские зоны амплифицированной ДНК при RAPD анализе растительного генома. // Тез. докл. междунар. конф. "Молекулярно-генетические маркеры растений", Ялта, 1996, с.36-37.

4. Супрунова Т.П., Тиеме Р., Гавриленко Т А., Дорохов Д Б. RAPD анализ межвидовых соматических гибридов между селекционными клонами S. tuberosum L. и дикими видами S. pinnatisectum dun. и S. hulbocaslanum dun.// Тез. докл. междунар. конф. "Молекулярно-генетические маркеры растений", Ялта, 1996, с.36.

5. Suprunova T.P., Bocharnicova N.I., Pozmogova G.E., Dorokhov D.B._RAPD analysis of interspecific hybrids I.ycoper.sicon e.sculenlum Mill, and Solanum /Kimellii Cor. Obtained by means of pollination with exogenous DNA.// The 7th International Polination Symposium, June 23-28, 1996, Lethbridge, Canada P. 82

6. Comarov Galina, Suprunov Tatiana, Dorochov D., Rotaru A. Folosirea complexé a metodelor markerilor proteici §i a markerilor pe baza ADN-ului pentru identicarea genotipurilor de porumb //Luerärile çtiintifice ale Universität» Agrare de Stat din Moldova, Chiçinâu, V. IV, 1997, p. 5660.

7. Супрунова Т.П., Кочиева E.3., Дорохов Д Б. Природа не родительских зон амплифицированной ДНК при RAPD анализе растительного генома. // Тез. докл. междунар. конф. "Агробиотехнология растений и животных", Киев, 1997, стр. 35-36

8. Супрунова Т.П., Лаптева М.Н. Дорохов ДБ. Молекулярный анализ межвидовых и межродовых гибридов культивируемых растений. // Тез. докл. Второго междунар. симпозиума "Новые и нетрадиционные растения", Пущино, 1997, стр. 987-988

9. Супрунова Т.П., Лаптева М.Н., Кочиева Е.З., Позмогова Г.Е. Дорохов ДБ. Молекулярный анализ вариабельности генома соматических гибридов. // Тез. докл. VII международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда", Москва, 1997 (в печати).