Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Технология получения стрессоустойчивого исходного материала томата на основе методов гаметной селекции и молекулярного анализа

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Технология получения стрессоустойчивого исходного материала томата на основе методов гаметной селекции и молекулярного анализа"

На правах рукописи УДК 631 527 8 635 64

ВЕДАДЕВАГЕ СУНИЛА ПРАДИПА КУМАРИ

□03063296

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕССОУСТОЙЧИВОГО ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ТОМАТА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ГАМЕТНОЙ СЕЛЕКЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА

Специальности 06 01 05 - селекция и семеноводство 03 00 15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

2 к МАЙ 2007

МОСКВА - 2007

Работа выполнена в лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур и на кафедре генетики и селекции Российского Университета Дружбы Народов в 20042007 гг

Научные руководители доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Балашова И Т

доктор биологических наук,

профессор Гужов К) Л

Официальные оппоненты Доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Пыльнев В В

кандидат сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник Кан Л Ю

Ведущая организация - ГНУ «Московская опытная станция растениеводства» ГНУ Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства РАСХН

Защита состоится «_» мая 2007 г

в _ часов на заседании диссертационного совета Д 220 019 01 при

Всероссийском научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу 143080, Московская область, Одинцовский район, и/о Лесной городок, ВНИИССОК, сектор защиты диссертаций E-mail VNIISSOK@mail ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках ВНИИССОК и Российского Университета Дружбы Народов

Автореферат разослан «_» апреля 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук

У'Jé&uj -

Пышная О Н

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Томат занимает первое место в мире среди овощных культур по возделываемым площадям в открытом и защищенном грунте (4 млн га), поскольку имеет важное значение как культура для функционального и лечебного питания Холод, фитофтора и ВТМ являются основными стрессовыми факторами, экономически ограничивающими урожайность томата в мире До сих пор наиболее эффективным способом защиты от болезней и абиотических стрессов считается селекция устойчивых форм

Но объединение в одном генотипе комплекса генов устойчивости к различным стрессовым факторам не всегда возможно Часто устойчивость к одному из биотических или абиотических факторов среды отрицательно коррелирует с устойчивостью к другим факторам (Спэиапзеп й а1 1982)

Решение проблемы видится в использовании биоразнообразия генотипов томата, включающего как культурные формы, так и маркерные мутанты, дикорастущие, полукультурные виды, сорта разного географического происхождения, гибриды культурного томата и т д

Устойчивость растений к стрессорам - это довольно сложный механизм взаимодействия морфологических, механических, физиологических, биохимических и генетических структур растений (Скворцова, 2000) Поэтому для поиска источников и доноров устойчивости с целью получения в дальнейшем форм с комплексной устойчивостью к стрессам, необходима новая селекционная технология, включающая комплекс современных, быстрых и высокоточных методов оценки и отбора устойчивых генотипов

Цель исследований:

Создание технологии получения стрессоустойчивого исходного материала томата, на базе молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции

Задачи исследований:

1 Изучение устойчивости томата к абиотическому (холод) и биотическому (BTM, Phytophthora mfestans, Alternaría solam Sor ) стрессорам с помощью молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции

2 Отбор генотипов с комплексной стрессоустойчивостью, и использование их в скрещиваниях

3 Изучение сохранения признаков устойчивости к стрессорам в гибридном потомстве Fi - F3

Научная новизна. Установлено, что холодовой стресс на ранних стадиях спорофита не влияет на морфологические показатели надземной части сеянца, но оказывает значимое влияние на длину корешка, что позволяет проводить отбор холодостойких генотипов по данному показателю Впервые показано, что гены устойчивости томата к ВТМ - Тт-1 и Тт-2а по-разному реагируют на холодовой стресс на ранних стадиях спорофита ген Тт-2а теряет свою эффективность, в то время, как защитный эффект гена Тт-1 сохраняется. Выявлено, что низкотемпературный стресс на стадии микрогамето-фита значительно ухудшает функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства Fi — F3 С использованием генотипов разного географического происхождения показано, что растения томата могут адаптироваться к любой эконише при наличии генов устойчивости к абиотическим стрессорам (повышенным/пониженным температурам) и индукции температурного стресса на ранних стадиях онтогенеза

Практическая значимость. Разработана селекционная технология на базе молекулярно-генетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов исходного материала томата с комплексной устойчивостью к абиотическому (холод), биотическим (Ph 1 rifes tans, Alternaría solam Sor) стрессам, высокой продуктивностью и жизнеспособностью пыльцы Craigella Tm-l/Tm-1, Mobaci (коллекция лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции ВНИИССОК), №5173, (коллекция ВНИИР им Н И Вавилова), Тилина, Ражита (интродуцированы из Рес-

публики Шри- Ланка), Glossy 389 (из Таиланда), Дубок (лаб селекции и семеноводства пасленовых культур ВНИИССОК) Образцы Craigella Tm-1/Tm-1, №5173, Mobaci, Mo 409, Mo 463 обладают к тому же устойчивостью к ВТМ

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Холодовой стресс на ранних стадиях онтогенеза оказывает влияние на рост корешка у сеянца томата и эффективность гена Тт-2а устойчивости к ВТМ при сохранении основных морфо-биологических и функциональных параметров растения, включая эффективную защиту гена Тт-1 устойчивости к ВТМ и функциональные характеристики пыльцы

2 Технология получения исходного материала томата с комплексной устойчивостью к стрессам, разработанная на базе молекулярно-генетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов с комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам и высокой жизнеспособностью пыльцы

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию С И Жегалова «Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур» (7-9 августа, 2006г, ВНИИССОК), на Всероссийской научно-практической конференции «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур — важное направление в защите растений» (16-18 ноября, 2006г, ВНИИ фитопатологии, Большие Вя-земы Московской области), на отчетных сессиях аспирантов РУДН и на заседаниях ученого совета ВНИИССОК

Публикации результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 6 печатных работ

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена

на_страницах, состоит из введения, четырех глав, выводов, практических

рекомендаций, списка использованной литературы и приложения Диссертация содержит 32 таблицы, 16 рисунков, 10 приложений Список использованной литературы включает 180 наименований, в том числе 87 - иностранных авторов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась на кафедре генетики и селекции Российского университета Дружбы народов и в лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК) Институт расположен в Одинцовском районе Московской области Экспериментальная часть работы выполнена в 2005-2007гг на экспериментальной базе ВНИИССОК - в лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции и опытной теплице ВНИИССОК

При проведении исследований оценили 26 образцов 6 селекционных образцов томата Lycopersicon esculentum L и 1 образец Lycopersicon pimpmel-lifolium L (Missouri), 1 образец Lycopersicon esculentum var racemigerum и 4 гибридных комбинации Fj из коллекции ВНИИССОК, 6 образцов, из коллекции Horticultural Crop Research and Development Institute г Перадения, Республика Шри-Ланка, и 1 гибрид Fi из Республики Таиланд, 5 маркерных образцов из коллекции лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции, 3 образца из коллекции ВНИИР им Н И Вавилова, несущих гены устойчивости к вирусу табачной мозаики (ВТМ) и Phytophthora mfestans DB

В качестве стандартов устойчивости к ВТМ использовали сорта томата с генами Тт-1, Тт-2а в гомозиготе - Craigella, стандарта восприимчивости -сорт Дубок, в качестве стандарта устойчивости к фитофторозу использовали сорт Ottawa 30

Для заражения образцов использовали дикий штамм - ВТМ U1, полученный из отдела защита растений Главного Ботанического сада Российской Академии наук, идентифицированный в 2003г как штамм 0 ВТМ - дикого типа (Балашова и др , 2003)

В совместных исследованиях с Супруновой Т П по проведению cDNA-AFPL - анализа (2006) использовали два контрастных образца томата -восприимчивый {Lycopersicon esculentum cv Anath) и устойчивый (L esculentum var racemigerum) к холоду - которые подвергали холодовому

стрессу в климакамере (5°С, 24 часа) Тотальную РНК выделяли из листьев с помощью гуанидин-тиоционатного метода (Logemann et al, 1987) Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически Ро1у(А)+ РНК была выделена из 20 ng тотальной РНК с использованием набора PolyA Tract mRNA Isolation System IV (Sigma, USA) Синтез двухцепочечной кДЬЖ провели с Universal RiboClone cDNA Synthesis System (Promega, USA) в соответствии с протоколом cDNA-AFLP анализ был проведен в соответствии с Bachem и др (1998) с небольшими модификациями

Оценку устойчивости образцов томата к ВТМ провели на искусственном инфекционном фоне по общепринятой методике (Квасников, Игнатова и др,1984) Визуальное обследование и диагностику по симптомам проводили по European Handbook of Plant Diseases, 1988 Относительную устойчивость к ВТМ определяли по наличию/отсутствию симптомов болезни, а также по депрессии биометрических характеристик растения Диагностику исследуемых растений на содержание вирусов табачной мозаики (ВТМ), X-вируса картофеля (ХВК), У-вируса картофеля (УВК) в соке листьев проводили методом DAS-ELISA (Clark, Adams, 1977) с помощью диагностического набора, полученного из Биотехнологического центра ИКХ «Коренево» с моновалентными антисыворотками к ВТМ, ХВК, УВК Результаты иммуно-ферментного анализа (ИФА) оценивали визуально

Оценка на естественном инфекционном фоне (в пленочной теплице) включала проведение в течение всего вегетационного периода фенологических наблюдений, описание морфологических признаков, оценку поражаемо-сти образцов томата фитофторозом, альтернариозом и серой гнилью в период массового развития заболевания по 3-х балльной шкале (Методические указания ,1979), учет урожайности (Доспехов, 1985)

Оценку комплексной устойчивости образцов к абиотическому (холод) и биотическому (ВТМ) стрессорам проводили проращиванием семян и пыльцы при 10°С относительно контроля (25°С), по спорофиту (Смирнова, Га-

ранько,1990) и микрогаметофиту (Методические указания по гаметной селекции, 2001) с последующим наложением заражения ВТМ

Устойчивость к ВТМ, холодостойкость и продуктивность гибридного потомства F] - F3 оценивали по методикам, приведенным выше Оценку фи-тофтороустойчивости, устойчивости к серой гнили и продуктивности осуществляли на естественном инфекционном фоне в экспериментальной теплице по вышеуказанным методикам Статистическую обработку полученных результатов осуществляли на персональном компьютере, используя пакет прикладных программ Microsoft Excel

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование эффективности генов устойчивости к абиотическому

(холод) и биотическим (ВТМ, Ph. infestons, Alternaria solani Sor) стрессорам; отбор образцов с комплексной устойчивостью к стрессам

В совместных исследованиях с Т П Супруновой по изучению экспрессии генов, вовлеченных в ответную реакцию томатов на холодовой стресс, которые проводили с помощью cDNA-AFLP-техники на двух контрастных по устойчивости образцах томата (2006), было показано, что из общего количества амплифицированных фрагментов (около 700) выделяется группа, демонстрирующая дифференцированную экспрессию между устойчивым (L esculentum var racemigerum) и восприимчивым к холоду образцом (L esculentum cv Anath, Fal89) при стрессе холода Увеличение экспрессии наблюдали у фрагментов Ф1, Ф2, ФЗ, Ф4, Ф8, Ф9, Ф12, Ф18, принадлежащих кДНК устойчивого образца, в то время как у восприимчивого образца экспрессии этих фрагментов не наблюдалось (рис 1) У восприимчивого образца также присутствовали фрагменты, экспрессия которых увеличивалась под действием холода (Ф13, Ф11, Ф10), но количество таких фрагментов было значительно меньше по сравнению с устойчивым образцом

Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что холодостойкость у томата контролируется полигенно, резистентный образец содержит значительно большее количество генов устойчивости, уровень экспрессии этих генов

I

I

при холодовом стрессе у резистентного образца значительно выше, чем у восприимчивого. Следовательно, холодовой стресс - это достаточно мощный рычаг воздействия на геном, который может существенно изменить селекционно ценные параметры растения.

>гт пос уст вое уст нос уст вое уст une

<DJ -

I

И

111

IV

Г«сЛ . cDNA-APLP анализ дежже-фздф^кшшй дифферакикальную зкспрессуж* геноа & процессе колодсиаото стресса в двух образцах томата - L escutentum var. racemigerum- устойчивый к холоду (уст) и 1 estaientшп cv. Analh (Fa 189) - восприимчивый к холоду (вое). Линии: к - контрольные растения, х - растения, подвергшиеся обработке холодом. Комбинации нраймеров, использованные в анализе: 1 - £coRI-C + Afrel-TC; Il - EcoRl-C + Mse\-CG: NI - EcoRt-AC + Msel-GG; IV - £coRÏ-AC + Msel-CC; V - fcoRI-CA + MseMC. Стрелки указывают на дифференциально экспрессирующиеся фрагменты в различных образцах томата.

3.2. Изучение влияния холодового стресса на стадии прорастания семени на сохранение/изменение селекционно ценных характеристик исходного

материала томата

3.2 1 Влияние холодового стресса на морфологические параметры сеянца Двухфакторный дисперсионный анализ данных по изучению влияния холодового стресса на стадии семени на морфологические параметры сеянца показал, что холодовой стресс на этом этапе значимо влияет только на длину корешка у сеянца (табл 1, 2)

Таблица 1

Влияние температуры проращивания семян на высоту сеянцев, длину

_первого настоящего листа и длину корешка_

Образец Высота, см Длина листа см Длина корешка, см

контроль 25°С опыт Ю°С разница с контролем контроль 25°С опыт 10 "С разница с контролем кон-тропь 25°С опыт 10 °С разница с контролем

Мо463 3,78 3,70 -0 08 2,14 2,21 +0 07 5 22 3,8 -1 42

Mobaci 4,16 4,17 +0 01 2 44 2,23 -0,21 5,78 4,72 -1 06

Тилина 4 54 4,77 +0 23 2 49 2 22 -0 27 4,75 4,17 -0 58

Талалихин 4 56 4 48 -0 08 2 71 2,75 +0,04 4 19 5,57 +1,38

845 5,15 5,47 +0,32 2,51 2,35 -0,16 5 50 5 17 -0,33

Рашми 3,98 3 76 -0 22 2,63 2,56 -0,07 6 60 5 53 -1,07

4987 4,31 4,59 +0,28 2,65 2 78 +0 13 5,77 5 43 -0,34

Рави 4 60 4 44 -0 16 2,62 2,60 -0 02 6,09 5 34 -0 75

5173 5,23 4 78 -0 45 2 95 2,59 -0 36 5 91 5 58 -0,33

Craigella Tm-l/Tm-t 5 48 4 69 -0,79 3,25 3 34 +0,09 7 31 6 94 -0,37

Таринду 6 66 619 -0 47 6 51 6 88 +0,37 7,60 6,43 -1 17

Мо35 7,19 7 36 +0,17 5,43 4,55 -0,88 6,27 4 93 -1,34

Т 245 4 99 5,32 +0,33 5,09 4,75 -0,34 6 71 5 46 -1,25

Мо387 5 05 5 25 +0 2 3 18 2 87 -0,31 6 22 5 36 -0,86

Дубок 7,28 7,26 -0,02 6,66 6,25 -0,41 6,85 6 56 -0,29

Мо137 5,04 5,09 +0,05 3,96 3,73 -0 23 5,59 5 45 -0 14

Ражита 6 33 5,86 -0 47 5,99 5,81 -0 18 6,43 6,38 -0 05

Мо409 3,58 3 60 +0 02 221 20 -0 21 6 20 7,23 +1,03

Ottawa 30 4 42 4,15 -0,27 4,98 4,57 -0,41 5,97 5 15 -0,82

Glossy 389 3 70 404 +0,34 3,83 3 61 -0 22 7,88 7 12 -0 76

Craigella Тт-2а/Тт-2а 3,51 4,19 +0,68 0,84 1,67 +0,83 3,38 4,82 +1,44

НСРо, 0,72 0,71 1 72

Таблица 2

Результаты двухфакторного дисперсионного аначиза влияния генотипа и температуры проращивания семян на длину корешка сеянцев томата

Источник вариации Сумма квадратов Степени свободы Средний квадрат F Р-Значение F критическое

Генотип 32,45326 20 1,622663 4,78 0,0005 2 12

Температура прора- 1,966826 , 1,966826 5,79 0,0258 4,35

Остаток (ошибка) 6,785225 19 0 339261

Итого 41,20531 40

Изменение остальных параметров в основном определяется генотипом растений Наиболее холодостойкими по этому показателю оказались сорто-образцы Талалихин, Мо 409 и СгащеНа Тт-2а/Тт-2а

3.2.2 Влияние холодового стресса на функциональные характеристики пыльцы В таблице 3 показано, что влияние низкотемпературного стресса на стадии прорастания семени, и на стадии микрогаметофита на функциональные показатели пыльцы (жизнеспособность и длину пыльцевой трубки) у изучаемых образцов при оценке ее холодостойкости

Таблица 3

Отбор холодостойких генотипов на фоне холодовых стрессов I - на стадии микрогаметофита, II - на стадиях семени и микрогаметофита

Образец Депрессия жиз гаметос неспособности >ита, % Депрессия длины пыльцевой трубки,%

I II 1 II

Т245 -21,99 20,10 18,48 22,95

Дубок -117,95 -0,92 -174,17 -8,84

Рашми -86,85 28,21 -32,79 21,67

Ражита -8,32 -29,50 -64,77 53,52

Рави 66,87 76,39 -3,71 -5,87

Тилина 86,20 57,94 15,00 31,51

Glossy 389 -66,93 -0,86 -153,00 2,91

Таринду 86,50 64,15 52,00 39,68

5173 -25,67 -29,00 4,33 -50,53

4987 37,98 25,49 55,63 23,91

Ottawa 30 -622,02 -374,38 -39,82 7,02

Craigella Tm-l/Tm-I 41,23 -139,58 -29,03 54,61

Мо409 100,00 65,38 100,00 43 27

Мо35 -1,28 90,07 -39,02 69,38

Мо 137 100,00 32,75 100 00 66,20

Мо387 27,16 17,62 20,25 -50,00

Мо463 66,28 22,04 21,30 55,06

Mobaci 58,69 -42,91 59,56 -17,11

Craigella Тт-2а/Тт-2а 14,17 -84,71 18,75 -92,86

На основании реакции микрогаметофита на стресс из 19 исследованных образцов было выделено И холодостойких - Дубок, № 5173, № 4987, Ottawa 30, Mobaci, Craigella Тт-2а/Тт-2а, Mo 387 , Т 245, Рашми, Ражита, Glossy 389 (депрессия показателей пыльцы менее 25%, табл 3) Мы предполагаем, что микрогаметофит интродуцированных образцов - Т 245, Рашми, Ражита, Glossy 389 - обладает высокой адаптивной способностью к разным климатическим условиям

3 2.3. Влияние холодового стресса на проявление устойчивости к вирусу табачной мозаики

При оценке сохранения устойчивости к ВТМ у образцов, отобранных ранее, и нового материала из Республики Шри-Ланка в условиях низкотемпературного стресса в период прорастания семени, у растений с геном Тт-1 наблюдали сохранение защитного эффекта целевого гена, а у растений с геном Тт-2а - утрату этого эффекта (табл 4) Следовательно, холодовой стресс на стадии прорастания семени способен снизить эффективность гена Тт-2а, тогда как ген Тт-1 сохраняет свою эффективность при данном стрессе

Таблица 4

Степень распространения заболевания (ВТМ) на растениях томата

Варианты Степень распространения заболевания, %

на 21 сутки после заражения на 36 сутки после заражения

контроль -25°С опыт - 10°С контроль -25°С опыт - 10°С

Дубок — st восприимчивости 85,7 91,7 100,0 100,0

4987 61,5 47,4 15,4 10,5

Mobaci (Тт-1, . ) 11,1 20,0 0,0 0,0

Мо 137 0,0 0,0 50 50

Мо 35 16,7 50,0 38,5 83,3

Craigella (Tm-1/Tm-I) 0,0 0,0 0,0 0,0

845 37,5 14,3 60,0 77,8

5173 (Тт-1, ) 0,0 0,0 0,0 0,0

Мо 387 0,0 0,0 54,5 100,0

Мо 463 23,1 33,3 15,4 0,0

Мо 409 0,0 0,0 0,0 0,0

Ottawa 30 6,7 13,6 80,0 63,6

Таринду 50,0 75,0 93,3 100,0

Рашми 56,3 57,1 94,1 85,7

Рави 66,7 61,5 100,0 92,3

Ражита 80,0 90,0 93,3 100,0

Тилина 76,9 91,7 84,6 90,9

Glossy 389 60,0 38,5 87,5 72,7

Талалихин 100,0 87,5 100,0 71,4

Т245 70,0 66,7 70,0 37,5

Craigella (Тт-2а/Тт-2а>) 16,7 77,8 20,0 100,0

Устойчивость к ВТМ на фоне холодового стресса проявили образцы Мо 409, МоЬас!, Сга^еПа Тт-1/Тт-1 и №5173

3 2.4 Влияние холодового стресса на устойчивость к грибным заболеваниям в закрытом грунте

При общей незначительной степени поражения растений фитофторо-зом, отмечено, образцы из Республики Шри-Ланка Ражита, Тилина, и Glossy 389 из Таиланда фитофторозом не поразились Образцы Ottawa 30, Craigella Tm-2aJTm-2a, Mobaci, Mo387 проявили определенную степень устойчивости к фитофторе под действием низкотемпературного стресса Вся коллекция сильно поразилась серой гнилью Менее всех под действием стресса этим заболеванием поразились образцы № 4987 и Рави

3.2 5 Влияние холодового стресса на продуктивность растений и качество плодов

При оценке влияния холодового стресса на продуктивность учитывали такие показатели продуктивности, как количество плодов и масса плодов с 1 растения (табл 5)

Таблица 5

Влияние низкотемпературного стресса на показатели продуктивности

Кол-во плодов с 1 растения, шт Масса плодов с 1 растения, г

Образец Температура, при которой проращивались семена

контроль 25°С опыт 10°С разница с контролем контроль 25°С опыт 10°С разница с контролем

Т245 27,80 32,20 +4,4 1628,89 2174,91 +546,02

Таринду 48,90 44,00 -4,9 989,15 824,45 -164,7

F, Glossy 389 41,70 31,90 -9,8 2450,37 2322,62 -127,8

Ражита 21,50 17,44 -4,06 1012,83 932,94 -79,89

Рави 24,70 20,80 -3,9 1349,00 1034,48 -314,5

Рашчи 12,70 22,30 +9,6 1069,40 1605,70 +336,3

Тилина 19,90 27,60 +7,7 1111,59 1464,86 +353,27

Дубок 20,60 21,30 +0,7 1378,88 1388,60 +9,72

Талалихин 20,50 19,20 -1,3 1624,67 1234,14 -390,5

Craigella Tm-1/Tm-l 20,73 37,10 +16,37 911,15 1342,18 +431,03

Craigella Тт-2а/Тт-2а 24,08 19,27 -4,81 646,84 801,33 +154,49

Mobaci 33,40 36,40 +3 1703,78 1715,57 +11,79

Мо137 20,09 18,38 -1,71 1378,58 1199,66 -178,9

Мо463 36,70 35,10 -1,6 1748,32 1695,00 -53,32

Мо35 43,27 31,30 -11,97 2456,70 1856,67 -600

Мо387 8,40 11,70 +3,3 336,53 469,10 +132,57

Мо 409 13,11 11,22 -1,89 818,84 707,11 -111,7

MS173 16,82 16,10 -0,72 1013,45 1364,61 +351,16

№4987 38,00 36,50 -1,5 2017,92 1767,41 -250,5

НСР05 6,37 329,7

Наиболее продуктивными были образцы из республики Таиланда — Glossy 389, из Республики Шри Ланка - Т 245, Рашми, Тилина, из коллекции ВНИИССОК-CraigellaTm-1/Tm-l, Дубок, Mobaci, Мо 463 и из коллекции ВНИИР №5173

При этом образы Т245, Craigella Tm-2a/Tm-2a, Craigella Tm-l/Tm-1, №5173, Тилина, Mo 387 значимо повышали свою продуктивность при холо-довом стрессе на стадии семени (табл 5)

В результате исследований из 26 образцов, проанализированных по новой технологии (рис 2), мы отобрали 7 с устойчивостью к абиотическим (холод) и биотическим (Ph infestans DB, Alternaría solani Sor) стрессам, обладающих высокой продуктивностью и качеством плодов с высокой жизнеспособностью пыльцы Craigella Tm-1/Tm-l, № 5173, Тилина, Ражита, Glossy 389, Mobaci, Дубок Образы Craigella Tm-lfTm-l, № 5173, Mobaci и маркерный мутант Мо 409 подтвердили свою устойчивость к дикому (природному) штамму ВТМ

Рис 2 Схема селекционной технологии для получения стпессоустойчиного исходного мятепиапя томятя

4. СОХРАНЕНИЕ ПРИЗНАКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АБИОТИЧЕСИМ (ХОЛОД) И БИОТИЧЕСКИМ (ВТМ) СТРЕССАМ В ПОТОМСТВЕ

F,-F3

4.1. Результаты оценки стрессоустончивости и продуктивности гибридов Fi - отбор устойчивых образцов

В результате оценки биометрических показателей спорофита как наиболее холодостойкое отобраны гибриды Ft Craigella (Tm-2a/Tm-2a) х Талалихин 186, Craigella (Tm-l/Tm-J) х Дубок Гибрид Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок отнесен к относительно холодостойким

Пыльца у образцов Fi Craigella (Tm-l/Tm-1) х Талалихин 186, Craigella (Tm-I/Tm-1) х Дубок, проращиваемых в оптимальных условиях, отличалась наибольшей жизнеспособностью Слабожизнеспособная пыльца образца Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 значительно стимулировалась низкотемпературным воздействием, что позволяет предположить высокую адаптивность микрогаметофита данного образца Пыльца гибридов Craigella ('Тт-2а/Тт-2а) х Дубок характеризуется слабой холодостойкостью В целом, у образцов, подвергнутых холодовому стрессу на стадии семени, отмечено укорачивание длины пыльцевой трубки и уменьшение жизнеспособности пыльцы Образец Craigella (Ttn-l/Tm-I) х Дубок, тем не менее, сохранял функциональные характеристики пыльцы при холодовом стрессе

При заражении ВТМ у гибридных образцов обнаружили присутствие симптомов мозаики (обыкновенной зеленой и желтой), папоротниковидность и некротические повреждения листьев По результатам визуальной оценки можно выделить гибриды Craigella (Tm-l/Tm-1) х Дубок и Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186, характеризующиеся уменьшением степени распространения заболевания по сравнению с восприимчивыми родителями (с Дубок, с Талалихин 186) Среди родительских форм отсутствие типичной симптоматики проявил сорт Craigella (Tm-l/Tm-1) Отмечено высокое поражение вирусом стандарта устойчивости сорта Craigella (Тт-2а/Тт-2а)

По совокупности результатов визуальной оценки степени распространения болезни и анализа изменений биометрических показателей растений в качестве устойчивой формы отобран гибридный образец Craigella (Tm-1/Tm-T) х Дубок В качестве толерантной формы с незначительным угнетением ростовых процессов и слабым проявлением симптоматики выделен Craigella (Tm-2a/Tm-2a) х Талалихин 186

В то же время гибридные образцы Craigella (Tm-2a/Tm-2a) х Дубок и Craigella (Tm-1/Tm-l) х Талалихин 186 проявили себя как наиболее продуктивные и в нормальных, и в стрессовых условиях

4.2. Результаты оценки стрессоустойчивости и продуктивности гибридов F2 - отбор устойчивых образцов

В популяции F2 наибольшей холодостойкостью спорофита характеризовались гибриды генотипов Fi, семена которых подвергались холодовому стрессу Из них наибольшую холодостойкость по всем измеряемым показателям проявил гибрид F2 Craigella (Tm-2a/Tm-2a) х Дубок, популяция которого была и наиболее однородна

У образца Craigella (Tm-2a/Ttn-2a) х Талалихин 186, холодовой стресс значительно стимулировал прорастание пыльцы У образца Craigella (Tm-1/Tm-l) х Дубок под действием холодового стресса наблюдались незначительные различия по жизнеспособности микрогаметофита и длине пыльцевой трубки при низкотемпературном проращивании in vitro относительно контроля Поэтому эти образцы были выделены как высокохолодостойкие

Через 20 суток после заражения с ВТМ на гибридах F2 были отмечены слабые симптомы мозаичности Полностью отсутствовали симптомы мозаики на стандартах вирусоустойчивости сортах Craigella (Tm-2a/Tm-2a), Craigella (Tm-l/Tm-1) На многих образцах и на Craigella (Tm-2a/Tm-2a) наблюдалась слабая деформация листьев или пузырчатость

Через 35 суток после заражения увеличивается степень распространения мозаичности и деформации листьев Полностью отсутствовали симпто-

мы у сорта СгащеПа (Тт-1/Тт-1) и гибрида Р2 СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 Растения последней комбинации при действии холодового стресса на стадии семени проявили стимуляцию роста стебля и корня

Наименьшим средним баллом поражения фитофторозом характеризуются гибриды ¥2 СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок и Сгаще11а (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок Они были отобраны нами как образцы, толерантные к фитофторозу

Анализ продуктивности гибридных комбинаций показал, что стрес-сирование холодом семян Р] способствует повышению продуктивности в Р2 у гибридов СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок. Они были отобраны нами как наиболее устойчивые и продуктивные

4.3. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов Рзи отбор

устойчивых образцов

Проводя оценку холодостойкости спорофита, биометрические показатели у гибридов Р3, сравнивали с сортом Дубок - стандартом холодостойкости и продуктивности По высоте все образцы превосходили сорт Дубок, но по длине 3-го настоящего листа все образцы ему уступали Судя по длине корешка, наиболее холодостойкими по спорофиту являются популяции Р3 С^е11а (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 и Сга1§е11а (Тт-1/Тт-1) х Дубок (табл 6) Образец СгащеИа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 можно отнести ко второй группе холодостойкости по спорофиту

Таблица 6

Характеристика холодостойкости спорофита у гибридов Из

Гибриды Биометрические показатели

Высота см Длина листа, см Длина корешка

см отношение к контролю, %

Дубок 7,3±0,6 6,3±0,9 6,6±1,1

СгащеИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 9,7±1,4 2,1±0,6 6,7±1,5 101,7

Сга^еНа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 9,8±1,8 2,8±0,7 5,5±1,4 84,0

СгащеИа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 9,9±1,9 2,3±0,6 4,7±1,0 71,0

Сга^еИа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 9,1±1,6 4,8±1,1 6,9±1,4 103,9

Анализ популяции Бз показал, что микрогаметофит образца СгащеНа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 является нехолодостойким, пыльца у образцов СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок и Сга^еНа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок , судя по депрессии функциональных показателей, является среднехолодостойкой Образец Craigella (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 дает самый высокий показатель холодостойкости по функциональным характеристикам пыльцы (табл 7)

Таблица 7

Характеристика устойчивости микрогаметофита гибридных Рз образцов томата к низкотемпературному стрессу

Гибрид Жизнеспособность, % Депрессия, % Длина пыльцевых трубок Депрессия, %

контроль 25°С опыт 10°С контроль 25°С опыт 10°С

СгащеИа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 45,5 16,6 63,5 52,3 19,6 62,5

СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 22,1 12,3 44,3 64,2 41 36,1

СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 16 14,4 10,0 44 40 9,1

Ста^еНа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 37,2 27 27,4 24,2 18,1 25,2

Дисперсионный анализ показывает, что низкотемпературный стресс на стадии микрогаметофита значительно влияет на функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства Рз СгащеНа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186, СгащеНа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, Сга^еИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок, но не влияет на данные показатели у гибридного потомства Р3 Сга^еНа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186

На 21 и 36 сутки после заражения визуально оценивали степень распространения симптомов ВТМ Обнаружили мозаичность, папоротниковид-ность, деформации и некротические повреждения листьев На 21 сутки после заражения установили, что у растений, подвергнутых низкотемпературному стрессу на стадии семени, степень распространения заболевания была выше, чем у растений, семена которых прорастали при оптимальной температуре (рис 3)

J а

0 25*С

а ю*с

51«

Гибриды, потомстово РЗ

X

г-

= я 5

Г I £ 1 ¿ - I -

□ 25Х' ■ 1№С

о Е Е « ^ Я

Гибриды, потомство 1-3

Рис. 3. Процентное значение проявления симптомов: А - через 21 сутки, В - через 36 суток после заражения

Анализируя биометрические показатели гибридов Р3, можно сказать, что под действием низкотемпературного стресса гибриды Рд Сга1§е!1а (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 и СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок оказываются более устойчивыми к ВТМ (табл. 8). Показатель «масса надземной части растения», который значительно увеличивается в результате холодового стресса на стадии семени, при заражении утрачивает положительную динамику.

Таблица 8

Высота сеянцев и площадь верхнего сегмента 3 настоящего листа у гибридов Рз _через 36 суток после заражения ВТМ_

Гибрид Высота сеянцев (36 суток после заражения), см Площадь верхнего сегмента 3 листа сеянцев (36 суток после заражения) см2

Контроль Опыт - ВТМ Контроль Опыт - ВТМ

25 С ЮС Дп* 25 С ЮС Дп* 25 С ЮС Дп* 25 С ЮС Дп*

Сга^еПа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 14,5 13,7 5,5 9,4 9,1 3,2 85,1 106,8 -25 5 65,2 66,6 -2,1

Сга^еИа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 13,9 17,6 -26,6 7,5 11,8 -57,3 67,0 86,9 -29,7 45,9 5!,6 -12,4

Сга^еИа (Тт-ЧТт-1) х Дубок 13,4 15,2 -13,4 5,6 12,7 -126,8 69,0 79,6 -15,4 20,5 36,3 -77,1

Сга^еИа (Тт-2а/Тт~2а) х Талалихин 186 18,6 20,2 -8,6 9,8 12,3 -25,5 121,1 132,5 -9,4 66,2 70,5 -6,5

* Дп - депрессия, %

Гибридная популяция Бз практически полностью поражалась фитофто-розом, за исключением гибрида Р3 Сга^еПа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, в популяции которого было выделено 53,7% бессимптомных растений и средний балл поражения являлся низким (табл 9) Установленный факт может свидетельствовать о том, что низкотемпературный стресс на стадии семени способствует снижению устойчивости растений к фитофторозу Гибрид Рз Сга^еНа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок выделен как наиболее выносливый - толерантный - к данному заболеванию

Таблица 9

Распространение РИ т/еэ 1ат РВ в гибридном потомстве Рз_

Гибрид Рз Степень распространения заболевания, % Средний балл поражения

Сга^еИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 94 1,2

СгашеПа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 80 1,5

С га^еПа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 75,9 1,1

СгашеПа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 46,3 1,0

Популяция Б3 оценивалась также на устойчивость к серой гнили Кроме гибрида CraigeIla (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 (31,8% растений не поражались), все остальные гибриды были поражены полностью (степень распространения заболевания -100%, табл 10)

Таблица 10

Распространение серой гнили в гибридном потомстве Рз

Гибрид Из Степень распространения заболевания, % Средний балл поражения

СгадеИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 100 2,0

Сга^еИа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 68,2 1,4

СгащеЦа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 100,0 1,6

Сга^еНа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 98,2 1,1

Анализ продуктивности гибридных потомств Р3, приведенный в таблице 30, свидетельствует о положительном эффекте гибридизации - все исследуемые гибриды по продуктивности превышают стандарт - сорт Дубок При этом как наиболее продуктивный был отмечен гибрид Р3 СгащеНа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186, он представляет собой и наиболее однородную популяцию Этот гибрид по показателям продуктивности с одного растения и по средней массе одного плода превосходит все остальные гибриды Второе место по продуктивности занимает образец Р3 Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок (табл 11)

Таблица 11

Продуктивность гибридного потомства Рз

Гибрид Р3 Продуктивность 1 растения, г Кол-во плодов с 1 растения, шт Средняя масса плода, г

Сга^еИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 1015,8 30,8 33,0

Сга^еИа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок 1492,1 33,4 44,6

Сга^еПа (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 2167,4 30,6 70,8

Сгаще11а (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 1450,8 31 46,8

Дубок - в! 1388,6 21,3 65,2

4 4. Анализ сохранения признаков устойчивости в гибридном потомстве Р] - Р3

Анализ сохранения признаков устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам, результаты которого представлены в сводной таблице 12, выявил следующие закономерности

Таблица 12

Сохранение признаков устойчивости к абиотическому (холод) и биотическим (ВТМ, Рк

РВ) стрессам гибридным потомством И] - Гд

Гибридное потомство Холодостойкость Устойчш действием го ст зость под холодово- ресса Продуктивность Отборе комплексной устойчивостью

спорофита микрогаметофита ВТМ РЬ т-/еШж БВ

И, 1)4 а 2) с а 1)а 2) А а с, Ь а

Рз 1)с 2) а, а Ой 2) а Ъ а,с а а

Рз а, а 1)Ь 2) а, с Ь, а с 1)Ъ 2) с а, Ь, с

а - Cralgella (Тт-1/Тт-1) х Дубок

Ь - Сга^еИа {Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186

с - Сга^еПа (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок

11 - Сга^еПа (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186

Гибридная комбинация Сга»ае11а (Тт-1/Тт-1\ х Дубок сохраняет холодостойкость микрогаметофита, спорофита и устойчивость к ВТМ во всех поколениях, хотя устойчивость к фитофторе в Рз утрачивается Однако, этот гибрид, обычно, и наиболее низкоурожайный, хотя плоды его отличаются высоким качеством отмечено наибольшее содержание сухого вещества, моносахаров и калия (табл 13)

Гибридная комбинация Сга1ее11а (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 сохраняет холодостойкость микрогаметофита и вирусоустойчивость Холодо-вой стресс не влияет на сохранение продуктивности - этот гибрид наиболее урожайный и содержит наибольшее количество витамина С (табл 13)

Гибридная комбинация Сга1ес11а (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок сохраняет относительную холодостойкость микрогаметофита и фитофтороустойчи-вость Низкотемпературный стресс оказывает слабое влияние на продуктивность - гибрид среднеурожайный, но показатели качества плодов снижены по сравнению с родителями (табл 13)

Гибридная комбинация Сга|'ее11а (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 -сохраняет только устойчивость спорофита, все остальные качества утрачиваются в поколении Рз

Представленные биохимические показатели плодов томата гибридных образцов Р3 и их родительских форм (табл 13) свидетельствуют об эффективности гибридизации Гибриды Р3 Cгaigella (Тт-1/Тт-1) х Дубок и Сгаще11а (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186 превосходят родительские формы по показателям качества плодов

Таблица 13

Образец Сухое вещество, % Моносахара, % Кислотность, % Витамин С, мг% Калий (К+), мг%

Craigella(7»!-Í/Tт-1)х Талалихин 186 4,6 5,08 0,43 33,4 129,0

Craigella (Тт-2а/Тm-2á) х Дубок 6,6 4,36 0,54 24,1 184,3

Сга^е11а(7иг-.2а/7>и-2£1)хТалалихин 186 7,0 4,58 0,48 17,6 192,2

Craigella (Tm-l/Tm-1) х Дубок 7,75 5,28 0,51 22,9 199,1

Cnagella (Tm-l/Tm-1) 5,9 3,78 0,37 17,6 112,0

Craigella (Tm-2aJTm-2a) 7Д 3,78 0,62 24,6 192,0

Талалихин 6,7 4,32 0,63 21,1 155,4

Дубок 6,3 3,78 0,41 25,0 193,3

ВЫВОДЫ

1 Анализ 26 образцов томата с предполагаемой устойчивостью к стрессам показал, что холодовой стресс в период прорастания семени не оказывает влияния на морфологические характеристики надземной части сеянца, но влияет на длину корешка сеянцев Установленная закономерность позволяет использовать длину корешка сеянцев как тестерный показатель при селекции по спорофиту

2 Оценка устойчивости исходного материала и гибридного потомства томата при моделировании искусственных стрессов выявила, что холодовой стресс в период прорастания семени значительно снижает эффективность гена Тт-2а устойчивости томата к ВТМ, в то время, как эффективность гена Тт-1 сохраняется.

3 Источниками устойчивости к абиотическим (холод), биотическим (Ph infesíans DB, Alternaría solam Sor) стрессам и продуктивности с высокой жизнеспособностью пыльцы являются образцы из коллекции ВНИИР им Н И Вавилова Craigella Тт-1/Тт-1, №5173, Mobaci, образцы, интродуци-рованные нами из Республики Шри-Ланка Тилина, Ражита, образец селек-

ции лаборатории пасленовых культур ВНИИССОК - Дубок, образец из коллекции маркерных мутантов томата лаборатории молекулярных и гаметных методов селекции ВНИИССОК - Мо463

4 В результате исследования исходного материала (22 образцов) и гибридного потомства (4 комбинации скрещивания) установлено, что холодовой стресс на стадии семени вызывает повышение продуктивности устойчивых к стрессам генотипов

5 Холодовой стресс на стадии микрогаметофита, значительно ухудшает функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства F3 Craig-ella (Tm-l/Tm-1) x Дубок, Craigella (Tm-2a/Tm-2a) x Дубок, Craigella (Tm-2а/Тт-2а) x Талалихин 186 (за исключением, F3 Craigella (Tm-l/Tm-1) x Талалихин 186)

6 Комплексной стрессоустойчивостью (к ВТМ, пониженным положительным температурам, фитофторозу) и хорошим качеством плодов, которые сохраняются до третьего поколения, обладает гибридная комбинация Craigella {Tm-1/Tm-T) х Дубок, но она является низкоурожайной

7 Интерес для практической селекции представляют комбинации Craigella {Tm-l/Tm-1) х Талалихин 186 и Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, сохраняющие продуктивность и стрессоустойчивость

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для получения исходного материала томата, обладающего комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам, предлагается новая селекционная технология, базирующаяся на методах молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции С помощью данной технологии получено 7 образцов томата с комплексной устойчивостью к основным стрессовым факторам (холод, Ph infestans, Alternaría solam Sor), высокой продуктивностью и жизнеспособностью пыльцы из источников разного происхождения для использования в качестве исходного материала Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci (коллекция ВНИИР им НИ Вавилова), Тилина, Разкшпа (интродуцированы из республики Шри Ланки), Glossy 389 (интро-дуцирован из Таиланда), Дубок (лаб селекции и семеноводства пасленовых культур ВНИИССОК) Образцы Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci, Mo 409, Mo 463 обладают устойчивостью к ВТМ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Балашова ИТ, Балашова НН, Супрунова ТП, Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Ю JI Гужов и др Современные технологии молекулярного анализа в создании исходного материала томата, обладающего устойчивостью к стрессам //Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур - Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию С И Жегалова - М , 2006 - Т 1 - С 40—47

2 Балашова И Т , Козарь Е Г , Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, JO JI Гужов и др Изменение эффективности генов устойчивости томата к ВТоМ под действием низких положительных температур //Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур -важное направление в защите растений - Материалы Всероссийской научно-практической конференции - Большие Вяземы, Московской обл -2006-С 110-112

3 Балашова И Т , Урсул Н А , Супрунова Т П , Козарь Е Г , Пивоваров В Ф , Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Ю JI Гужов Изучение эффективности генов устойчивости томата к стрессам с последующим отбором исходного материла с комплексной устойчивостью //Селекция и семеноводство - М , 2007

4 Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Гужов Ю JI, Урсул Н А , Козарь Е Г , Балашова И Т Влияние холодового стресса на селекционно ценные характеристики исходного материала томата и отбор холодостойких образцов //Сборник Трудов ВНИИССОК - М , 2007

5 Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Гужов Ю Л , Урсул Н А , Балашова И Т Анализ изменений морфологических параметров спорофита томата под действием холодового стресса для последующего отбора на холодостойкость //Вестник РУДН - М , 2007

6 Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Гужов Ю Л , Урсул Н А , Козарь Е Г , Балашова И Т Влияние холодового стресса на стадии прорастания семени на эффективность генов устойчивости томата к ВТМ //Вестник РУДН - М, 2007

Подписано в печать 17 04 07 Формат 60х84'/16 Уел печ л 1,4 Зак 373 Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика томата как интродуцированной культуры для Российской Федерации и Республики Шри-Ланка.

1. 1. 1 .История интродукции, регионы возделывания.

1.1.2. Ботаническая и биологическая характеристики.

1.2. Основные стрессовые факторы для томата.

1.2.1. Абиотические стрессоры томата в Нечернозёмной зоне России и в горной зоне Республики Шри-Ланка.

1.2.2. Биотические стрессоры томата в горной зоне Республики Шри-Ланка и в Нечернозёмной зоне России.

1.3. Генетический контроль устойчивости томата к основным биотическим стрессорам.

1.3.1. Генетический контроль устойчивости к ВТМ.

1.3.2. Генетический контроль устойчивости к Phytophthora infestans (Mont) de Вагу.

1.4. Проблемы получения исходного материала с комплексной устойчивостью к стрессам.

1.5. Молекулярное маркирование в селекции.

1.6. Гаметная селекция на устойчивость к стрессам.

1.7. Характеристика коллекции маркерных мутантов томата как инструмента для генетических исследований.■.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материал исследований.

2.2. Методика исследований.

2.2.1. Оценка устойчивости к ВТМ на искусственном инфекционном фоне.

2.2.2. Диагностика растительного материала на содержание фитовирусов.

2.2.3. cDNA-AFLP анализ.

2.2.4. Оценка на естественном инфекционном фоне.

2.2.5. Оценка холодостойкости спорофита.

2.2.6. Оценка холодостойкости микрогаметофита.

2.3. Анализ наследования признаков стрессоустойчивости.

2.4. Анализ сохранения комплекса хозяйственно ценных признаков. у гибридного потомства Fi - F3.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Исследование эффективности генов устойчивости к абиотическому (холод) и биотическим (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani) стрессорам. Отбор образцов с комплексной устойчивостью к стрессам.

3.1.1. Исследование экспрессии генов устойчивости к холоду у восприимчивого и устойчивого генотипов с помощью cDNA-AFLP.

3.2. Изучение влияния холодового стресса на стадии прорастания семени на сохранение/изменение селекционно ценных характеристик исходного материала томата.

3.2.1.Влияние холодового стресса на морфологические параметры сеянца.

3.2.2. Влияние холодового стресса на функциональные характеристики пыльцы.

3.2.3. Влияние холодового стресса на проявление устойчивости к вирусу таба чной мозаики.

3.2.4. Влияние холодового стресса на устойчивость к грибным заболеваниям в закрытом грунте.

3.2.5. Влияние холодового стресса на продуктивность растений и качество плодов.

4. СОХРАНЕНИЕ ПРИЗНАКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АБИОТИЧЕСИМ (ХОЛОД) И БИОТИЧЕСКИМ (ВТМ) СТРЕССАМ В ПОТОМСТВЕ F, - F3.

4.1. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов Fi.

4.1.1. Оценка холодостойкости спорофита.

4.1.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита.

4.1.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики.

4.1.4. Оценка фитофтороустойчивости.

4.1.5. Оценка урожайности.

4.2. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов F2.

4.2.1. Оценка холодостойкости спорофита.

4.2.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита.

4.2.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики.

4.2.4. Оценка фитофтороустойчивости.

4.2.5. Оценка урожайности.

4.3. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов F3.

4.3.1. Оценка холодостойкости спорофита.

4.3.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита.

4.3.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики.

4.3.4. Оценка фитофтороустойчивости и устойчивости к серой гнили.

4.3.5. Оценка урожайности.

4.4. Анализ сохранения признаков устойчивости гибридным потомством F! - F3.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Технология получения стрессоустойчивого исходного материала томата на основе методов гаметной селекции и молекулярного анализа"

Томат занимает первое место в мире среди овощных культур по возделываемым площадям в открытом и защищенном грунте - 4 млн га. Больше всего площадей томата в Китае - 974 тыс.га (ежегодное производство - 25 млн тонн), далее следуют Индия - 520 тыс.га (7,4 млн тонн), Турция -225 тыс. га (9 млн тонн), Египет - 180 тыс. га (6,3 млн тонн), США - 177 тыс. га (12 млн тонн). Россия стоит на 6-ом месте по площади (142 тыс. га) и на 11-ом по производству томата в год (1,82 млн тонн). В Республике Шри-Ланка ежегодно производится около 90 тыс. тонн плодов томата, урожайность составляет 91,7 ц/га (FAO, 2005).

Томат имеет важное народнохозяйственное значение как культура для функционального питания: при невысокой калорийности - 160-200 ккал/кг (Курганская и др., 2006) он содержит 4-8% сухого вещества, в котором сахара занимают 1,5-6% от общей массы плодов, белки - 0,6-1,1%, органические кислоты - 0,5%, крахмал - 0,07-0,35, минеральные вещества -0,6%; а также - каротиноиды, витамины В| , В2 , Вз , В5 , фолиевую и аскорбиновую кислоты (Пивоваров и др., 2002). Современная медицина рекомендует плоды томата в качестве лечебно диетического средства больным с нарушением обмена веществ, при пониженной кислотности желудочного сока, заболеваниях печени, сердечно-сосудистой системы и особенно в тех случаях, когда имеются нарушения процесса обмена калия в организме. Имеющейся в плодах холин понижает содержание холестерина в крови, предупреждает жировое перерождение печени, повышает иммунные свойства организма, способствует образованию гемоглобина (Мамедов и др., 2002).

Несмотря на высокую экологическую пластичность (Жученко, 1973), томат подвержен абиотическим и биотическим стрессорам, свойственным зонам рискованного земледелия России (Нечернозёмной зоне и др.) и горной зоне Республики Шри-Ланка (основной регион возделывания томата в этой стране), которые могут вызывать значительные потери урожая (30-100%).

Создание адаптированных к комплексу стрессовых факторов сортов и гибридов томата сохраняет свою актуальность и в настоящее время. Но сочетание в одном генотипе комплекса хозяйственно ценных признаков основная проблема традиционной селекции. Решить эту трудную задачу возможно, разработав новую технологию селекции, включающую современные методы молекулярного анализа, гаметной селекции, и используя биоресурсы томата, собранные в морфологически маркированных генетических коллекциях.

Цель исследований:

Создание технологии получения стрессоустойчивого исходного материала томата, на базе молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции.

Задачи исследований:

1. Изучение устойчивости томата к абиотическому (холод) и биотическому (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani Sor.) стрессорам с помощью молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции.

2. Отбор генотипов с комплексной стрессоустойчивостью к стрессам, и использование их в скрещиваниях.

3. Изучение сохранения признаков устойчивости к стрессорам в гибридном потомстве Fi - F3.

Научная новизна:

Установлено, что холодовой стресс на ранних стадиях спорофита воздействие на семена температурой 10°С в течение 2-х недель) не влияет на морфологические показатели надземной части сеянца, но оказывает значимое влияние на длину корешка, что позволяет проводить отбор холодостойких генотипов по данному показателю.

Впервые показано, что гены устойчивости томата к ВТМ - Тт-1 и Тт-2а по-разному реагируют на холодовой стресс на ранних стадиях спорофита: ген Тт-2а теряет свою эффективность, в то время, как защитный эффект гена Тт-1 сохраняется.

Выявлено, что низкотемпературный стресс на стадии микрогаметофита значительно ухудшает функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства F\- F3.

С использованием генотипов разного географического происхождения показано, что растения томата могут адаптироваться к любой эконише при наличии генов устойчивости к абиотическим стрессорам (повышенным/пониженным температурам) и индукции температурного стресса на ранних стадиях онтогенеза.

Практическая значимость:

Разработана селекционная технология на базе молекулярногенетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов исходного материала томата с комплексной устойчивостью к абиотическому (холод), биотическим (Ph. infestans, Alternaria solani Sor.) стрессам, высокой продуктивностью и жизнеспособностью пыльцы: Craigella Tm-l/Tm-1, Mobaci (коллекция лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции ВНИИССОК), №5173, (коллекция ВНИИР им. Н.И. Вавилова), Тилина, Ражита (интродуцированы из Республики Шри- Ланка), Glossy 389 (из Таиланда), Дубок (лаб. селекции и семеноводства пасленовых культур ВНИИССОК). Образцы Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci, Mo 409, Mo 463 обладают к тому же устойчивостью к ВТМ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Холодовой стресс на ранних стадиях онтогенеза оказывает влияние на рост корешка у сеянца томата и эффективность гена Тт-2а устойчивости к ВТМ при сохранении основных морфо-биологических и функциональных параметров растения, включая эффективную защиту гена Тт-1 устойчивости к ВТМ и функциональные характеристики пыльцы.

2. Технология получения исходного материала томата с комплексной устойчивостью к стрессам, разработанная на базе молекулярно-генетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов с комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам и высокой жизнеспособностью пыльцы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари

ВЫВОДЫ

1. Анализ 26 образцов томата с предполагаемой устойчивостью к стрессам показал, что холодовой стресс в период прорастания семени не оказывает влияния на морфологические характеристики надземной части сеянца, но влияет на длину корешка сеянцев. Установленная закономерность позволяет использовать длину корешка сеянцев как тестерный показатель при селекции по спорофиту.

2. Оценка устойчивости исходного материала и гибридного потомства томата при моделировании искусственных стрессов выявила, что холодовой стресс в период прорастания семени значительно снижает эффективность гена Тт-2а устойчивости томата к ВТМ, в то время, как эффективность гена Тт-1 сохраняется.

3. Источниками устойчивости к абиотическим (холод), биотическим (Ph. infestans DB, Alternaria solani Sor.) стрессам и продуктивности с высокой жизнеспособностью пыльцы являются: образцы из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова: Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci\ образцы, интродуцированные нами из Республики Шри-Ланка: Тилипа, Ражита; образец селекции лаборатории паслёновых культур ВНИИССОК - Дубок, образец из коллекции маркерных мутантов томата лаборатории молекулярных и гаметных методов селекции ВНИИССОК - Мо463.

4. В результате исследования исходного материала (22 образцов) и гибридного потомства (4 комбинации скрещивания) установлено, что холодовой стресс на стадии семени вызывает повышение продуктивности устойчивых к стрессам генотипов.

5. Холодовой стресс на стадии микрогаметофита, значительно ухудшает функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства F3 Craigella (Тт-1/Тт-1) х Дубок, Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 (за исключением, F3 Craigella (Тт-1/Тт-1) х Талалихин 186).

6. Комплексной стрессоустойчивостью (к ВТМ, пониженным положительным температурам, фитофторозу) и хорошим качеством плодов, которые сохраняются до третьего поколения, обладает гибридная комбинация Craigella {Tm-l/Tm-l) х Дубок, но она является низкоурожайной.

7. Интерес для практической селекции представляют комбинации Craigella (Tm-l/Tm-l) х Талалихин 186 и Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, сохраняющие продуктивность и стрессоустойчивость.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для получения исходного материала томата, обладающего комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам, предлагается новая селекционная технология, базирующаяся на методах молекулярно-генетического анализа и гаметной селекции. С помощью данной технологии получено 7 образцов томата с комплексной устойчивостью к основным стрессовым факторам (холод, Ph. infestans, Alternaria solani Sor.), высокой продуктивностью и жизнеспособностью пыльцы из источников разного происхождения для использования в качестве исходного материала: Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci (коллекция ВНИИР им. Н.И. Вавилова), Тилипа, Ражшпа (интродуцированы из республики Шри Ланки), Glossy 389 (интродуцирован из Таиланда), Дубок (лаб. селекции и семеноводства пасленовых культур ВНИИССОК). Образцы Craigella Tm-1/Tm-l, №5173, Mobaci, Mo 409, Mo 463 обладают устойчивостью к ВТМ.

100

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Ведадеваге Сунила Прадипа Кумари, Москва

1. Авдеев, А.В. Селекция томатов/ А.В. Авдеев. - Кишинёв: Штиинца, 1982. -282с.

2. Акишин, Д.В. Защита томата от фитофтороза /Д.В. Акишин // Роль науки в повышении устойчивости функционирования АПК Тамбовской области.- Мичурин.- 2004. Т. 2. - С. 83-87.

3. Алпатьев, А.В. К вопросу об эволюции томата вида Lycopersicon esculentum Mill. /А.В. Алпатьев //Биология растений. М.: Изд-во Колос.-1981.- Т. 16.-№ 1.-С. 61-65.

4. Алпатьев, А.В. Помидоры /А.В. Алпатьев. М.: Колос, 1981. - 304 с.

5. Атлас-справочник. Всё о странах мира. - Санкт-Петербург: СЭКО. -«КРИСТАЛЛ». - М.: «ОНИКС», 2006. - С. 228.

6. Балашова, Н.Н. /Н.Н. Балашова, Морозова Н.А., Простакова Ж.Г., Дараков О.Б., Мелиян Л.Г., Бронштейн А.И., Лазу М.Н., Юрку А.И. // Известия АН РМ: Биологические и химические науки. 2004.- № 2. - С. 3-11.

7. Балашова, Н.Н. Генетические основы селекции овощных культур на устойчивость к ВТМ / Н. Н. Балашова, М. М. Король, О.О.Тимина, B.C. Рущук.-Кишинёв: Штиинца, 1983.- 113 с.

8. Балашова, Н.Н. Генетические основы селекции сельскохозяйственных культур в Молдавии / Н.Н. Балашова, Ж. Г. Простакова, А.И. Юрку, А.И. Бронштейн.- Кишинёв, 1986.- С. 14-26.

9. П.Балашова, Н.Н. Фитофтороустойчивость рода Lycopersicon Tourn. и методы использования ее в селекции томата / Н.Н. Балашова. Кишинев: Штиинца, 1979.- 166 с.

10. Балина, Н.В. Действие обезвоживания и повышенной температуры на микроспоро- и гаметогенез растений // Автореф.дисс.канд.биол.наук.-1977.- 18с.

11. Бочарникова, Н.И. Мутантные формы томатов / Н.И. Бочарникова, В.М.Козлова. Кишинев: Штиинца, 1992.- 62с.

12. Н.Брежнев, Д.Д. Использование гетерозиса у томата/ Д.Д. Брежнев // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. JI. - 1949. - №28. -С 2-14.

13. Брежнев, Д.Д. Современная классификация рода Lycorpersicon Tourn. / Д.Д. Брежнев // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -1954.-Т. 31.-№ 1. С.25-37.

14. Бровко, Г.Ф. Научные и практические основы выращивания овощных культур в зимних теплицах Дальнего Востока /Г.Ф.Бровко. Владивосток. -2003.-С. 114-172.

15. Вавилов, Н.И. Роль Евразии и Нового Света в происхождении культурных растений /Н.И. Вавилов // Проблемы селекции: Избранные труды. 1960. -Т. 2.-519с.

16. Ващенко, С.Ф. Овощеводство защищенного грунта /С.Ф. Ващенко, 3. И. Чекунова, Н.И. Гаврилова. М.: Колос, 1974.- 352с.

17. Гаметная и зиготная селекция растений /Ред. А.А. Жученко.- Институт экологической генетики АН МССР. Кишинёв: Штиинца, 1987. - 206 с.

18. Гаранько, И.Б. Исходный материал для различных направленный селекции томата / И.Б. Гаранько // Научно-технический бюллетень ВИР.-1992.-№228.-С. 12-14.

19. Голубинский, И.Н. Биология прорастания пыльцы / И.Н. Голубинский. -Киев: Наукова думка, 1974. -368с.

20. Гостимский, С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, В.К. Боброва // Генетика. 1999. -№35. - С. 1538-1543.

21. Гуркина, J1.K. Расовый состав возбудителя фитофтороза томата для Московской области / JI.K. Гуркина // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке. 2000. -Т.1. - С.211-214.

22. Дорохов, Д.Б. Быстрая технология RAPD-анализа генотипов луков. / Д.Б. Дорохов, М.Н. Лаптева // Сельскохозяйственная биология. 1997. - №5. -С.22-28.

23. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта /Б.А. Доспехов М.:Колос, 1985. -415 с.

24. Дьяков, Ю.Т. Общая и молекулярная фитопатология / Ю.Т. Дьяков, O.JI. Озерецковская, В.Г. Джавахия, С.Ф. Багирова М.: Издательство Общества фитопатологов, 2001. - 302с.

25. Дьяков, Ю.Т. Фитопатогенные вирусы /Ю.Т. Дьяков М.:Изд-во Моск.ун-та, 1984.- 128 с.

26. Жученко, А.А. Гаметный отбор на устойчивость к температурному фактору у томатов / А.А. Жученко, А.Н. Кравченко, Н.Н. Балашова и др. // Генетические основы селекции сельскохозяйственных культур в Молдавии. Кишинев: Штиинца. - 1986. - С.4-14.

27. Жученко, А.А. Генетика томатов / А.А. Жученко. Кишинёв: Штиинца, 1973.-663 с.

28. Жученко, А.А. Развитие мужской генеративной сферы у растений / А.А. Жученко, А.Н. Кравченко, А.И. Суружиу // Тезисы Всесоюзного симпозиума: Симферополь. 1983. - С. 31-32.

29. Жученко, А.А. Рекомбинация в эволюции и селекции / А.А. Жученко, А.Б. Король. Кишинёв: Штиинца, 1985. - 325с.

30. Жученко, А.А. Экологическая генетика культурных растений / А.А. Жученко. Кишинёв: Штиинца, 1980. -420с.

31. Иванюк, В.Г. Взаимосвязь устойчивость томатов к альтернариозу и абиотическим факторам среды / В.Г. Иванюк // Сб. Экологическая генетика растений и животных.- Кишинёв: Штиинца. 1987. - С.128-135.

32. Квасников, Б.В. Методика селекции сортов и гибридов томата, устойчивых к вирусу табачной мозаики в связи с его вариабельностью / Б.В. Квасников, С.И. Игнатова, Н.С. Горшкова, К.С. Сухов и др. Москва, 1984.-28с.

33. Коваль, B.C. Использование гаметного отбора в селекции на адаптивность / B.C. Коваль, Н.Н. Макарова// Сб.: Задачи селекции и пути их решения в Сибири,- 1983.-С.227-231.

34. Коваль, B.C. Повышение результативности искусственного отбора при селекции самоопылителей / B.C. Коваль, С.Ф. Коваль // Сектор генетических основ селекции растений ИЦиГ СОР АН. Новосибирск. -№5. - 1998. - С.35-42.

35. Козлова, В.М Селекция томата на холодостойкость по спорофиту и микрогаметофиту/ В.М. Козлова, Н.Н. Балашова // Доклады РАСХН. -2000.-№3.-С. 7-12.

36. Козлова, В.М. Жизнеспособность пыльцы маркерных форм томата / В.М. Козлова // Научные труды по селекции и семеноводству (к 75-летию ВНИИССОК). 1995. - М.: ВНИИССОК. - Т. 1. - С. 261-263.

37. Кочиева, Е.З. RAPD маркеры генома картофеля: Клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий /

38. Е.З. Кочиева, А.С. Оганисян, А.П. Рысков // Молекулярная биология.1999.-Т. 33. -N5.-C. 893-897.

39. Кочиева, Е.З. Молекулярное маркирование сортов баклажанов (Solanum melongena L.) / Е.З. Кочиева // Сельскохозяйственная биотехнология.2000.-Т. 1. С. 17-24.

40. Кочиева, Е.З. Молекулярный анализ RAPD-маркеров генома картофеля / Е.З. Кочиева, А.С. Оганисян // Сельскохозяйственная биотехнология. -2000. Т. 1. - С. 24-32.

41. Кравченко, А.Н. Методы гаметной и зиготной селекции томатов / А.Н. Кравченко, В.А. Лях, Л.Г. Тодераш и др. Кишинёв: Штиинца, 1988. -152с.

42. Кравченко, А.Н. Особенности элиминации гамет у растений /А.Н. Кравченко // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке. -М.: ВНИИССОК. 2000. - Т. 1. - С. 282-283.

43. Крутилин, А.С. Физиология овощных и бахчевых культур / А.С. Крутилин // Физиология сельскохозяйственных растений.- М.: Изд-во МГУ, 1951. -Т. 18.-С. 320-343.

44. Курганская, Н.В. Томат / Н.В. Курганская, Л.И. Романова.- М.: Изд-во Алейрон, 2006. 80с.

45. Лях, В.А./В.А. Лях// Известия АН МССР: Серия биологических и химических наук. 1984. - № 6. - С. 38-41.

46. Лях, В.А. Методы отбора ценных генотипов на уровне пыльцы / В.А. Лях, А.И. Сорока, Л.Ю. Мищенко и др. // Методические указания по гаметной селекции сельскохозяйственных растений. М.: ВНИИССОК. - 2001. -С.149-195.

47. Лях, В.А. Эффективность микрогаметного отбора на устойчивость кукурузы к температурному фактору / В.А. Лях, А.И. Сорока // Сельскохозяйственная биология. 1993. - N 3. - С.38-44.

48. Маковей, М. Д. Применение метода пыльцевой оценки в селекции тепличного томата на устойчивость к стрессовым абиотическим факторам / М. Д. Маковей // Дис. канд. с.-х. наук. М. - 1992. - 198 с.

49. Мамедов, М.И. Селекция томата, перца и баклажана на адаптивность / М.И.Мамедов, В.Ф. Пивоваров, О.Н. Пышная.- М.: 2002. 370 с.

50. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук.- М.: Мир, 1984. 479 с.

51. Матвеев, В.П. Овощеводство / В.П. Матвеев, М.И. Рубцов.- М.: Колос, 1978.-С. 292-314.

52. Методика ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха / Инструкция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. Коренёво, 2006 -7с.

53. Методические указания по гаметной селекции сельскохозяйственных растений (методология, результаты и перспективы) / Н.Н. Балашова, Е.Г. Козарь.- М.: ВНИИССОК, 2001. 386с.

54. Методические указания по оценке и селекционному отбору томатов на устойчивость к фитофторозу / М.:ВНИИССОК, 1970. Юс.

55. Методические указания по селекции и семеноводству овощных культур, возделываемых в защищённом грунте (томаты, перец). М., - 1979. - 84с.

56. Методические указания по селекции сортов и гибридов томата для открытого и защищённого грунта. М., - 1986. - 112с.

57. Мищенко, Л.Ю. Влияние отбора по конкурентоспособности пыльцы на соотношение по скороспелости потомства гибридов льна масличного/ Л.Ю. Мищенко, В.А. Лях // Цитология и генетика. 1998. - № 4. - С. 3136.

58. Молдаван, М.Я. Вирусные болезни табака и меры борьбы с ними /М.Я. Молдаван. Кишинёв: Штиинца, 1979. - 228 с.

59. Мотова, М.В. Оценка генетической устойчивости томата к вирусу мозаики томата / М.В. Мотова, А.Е. Цыпленков // Вестник Защиты растений. 2005. - №3. - С. 55-58.

60. Мощков, Б.С. Выращивание растений на искусственном освещении / Б.С. Мощков.- М.: Колос. 1966. - 263с.

61. Мэтьюз Р. Вирусы растений / Р. Мэтьюз М.: Мир, 1973.- 600с.

62. Пивоваров, В.Ф. Экологическая селекция сельскохозяйственных растений / В.Ф. Пивоваров, Е.Г. Добруцкая, Н.Н. Балашова М.: ВНИИССОК, 1994.-248 с.

63. Пивоваров, В.Ф. Экологическая селекция томата / В.Ф. Пивоваров, М.Х. Арамов. М.: ВНИИССОК, 1997. - 232 с.

64. Пивоваров, В.Ф. Паслёновые культуры: томат, перец, баклажан, физалис / В.Ф. Пивоваров, М.И. Мамедов, Н.И. Бочарникова. М.: ВНИИССОК, 1998.-293 с.

65. Пивоваров, В.Ф. Частная селекция пасленовых культур / В.Ф. Пивоваров, Р.В. Скворцова, И.Ю. Кондратьева. М.: ВНИИССОК, 2002. - 285 с.

66. Потокина, Е.К. Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количественных признаков у растений / Е.К. Потокина, Ю.В. Чесноков // Сельскохозяйственная биология. 2005. - №3.- С.3-18.

67. Простакова, Ж.Г. Реакция на токсин как тест-система оценки устойчивости сои к фузариозу / Ж.Г. Простакова, А.И. Бронштейн, Н.Н. Балашова // Сельскохозяйственная биология. 1993. - № 3. - С.32-37.

68. Самсонова, JI.H. Диагностика вирусных и фитоплазменных болезней овощных культур и картофеля / Л.Н.Самсонова, А.Е. Цыпленков, Т.А. Якуткина. С-Пб., 2001. - 48 с.

69. Скворцова, Р.В. Результаты работ по селекции томата на устойчивость к фитофторозу / Р.В. Скворцова, Л.К. Гуркина // Селекция на устойчивость к основным заболеваниям овощных культур. М.- 1984. - С.72-84.

70. Скворцова, Р.В. Селекционные аспекты резистентности томата к фитофторозу / Р.В. Скворцова // Селекция и семеноводство овощных и бахчевых культур. М,- 2000. - С. 192-196.

71. Скворцова, Р.В. Селекция томата для Нечернозёмной зоны России: сорта томата для Нечернозёмной зоны России / Р.В. Скворцова, Л.К. Гуркина // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке. М. - 2000. - Т.2. - С.188-192.

72. Слепцова, Т.Г. Горизонтальная устойчивость томатов к фитофторозу в системе общей адаптивности / Т.Г. Слепцова, Н.Н. Балашова // Сельскохозяйственная биология.- 1995. № 9. - 42-47.

73. Смирнова, B.C. Диагностика холодостойкости образцов культурного томата: Методические указания / B.C. Смирнова, И.Б. Гаранько Л.: ВИР, 1990.-22с.

74. Супрунова, Т.П. Идентификация вариабельности генома томата с помощью маркеров на основе ДНК / Т.П. Супрунова Автореф. дисс. канд с.-х. наук - М.: ВНИИССОК, 1997. - 27с. - Илл.

75. Тепличный практикум: Томаты // Дайджест журнала «Мир теплиц». М., 2002.- 136 с.

76. Удовенко, Г.В. Общие требования к методам и принципам диагностики устойчивости растений к стрессовым воздействиям.- JI., 1988.- С.5-10.

77. Фортэ, А.В. Технология RAPD анализа генотипов яблони: Методические указания / А.В. Фортэ, Д.Б. Дорохов и др. Мичуринск: Изд-во ГНУ, 2002. - 26 с.

78. Шатило, В.И. Использование маркерной коллекции мутантов томата для выявления механизмов устойчивости к вирусам / В.И. Шатило, Н.И. Бочарникова, В.П. Музыкантов, Н.Н. Балашова // Генетические коллекции овощных растений. Санкт-Петербург.- 1999. - С.5-17.

79. Шкаликов, В.А. Защита растений от болезней: Учебник / В.А. Шкаликов, О.О. Белошапкина, Д.Д. Букреев. М.: Колос, 2003. - 255с.

80. Шкаликов, В.А. Индуцированный иммунитет в защите растений от болезней / В.А. Шкаликов, П.С. Хохлов, Д.А. Орехов // Плодородие.-2001.-№4.-С. 22-24.

81. Agriculture Journal. Agriculture department of Sri Lanka. - 2002. - Vol.1. - № 40. -P.21-33.

82. Akkaya, M.S. Integration of simple sequence repeat DNA markers into a soybean linkage map / M.S. Akkaya, R.C. Shoemaker, J.E. Specht., A.A. Bhagwat, P.B. Cregan // Crop science. 1995. - №35. - P.1439-1445.

83. Alexander, L.J. Host-pathogen dynamics of tobacco mosaic virus on tomato: / L.J. Alexander // Phytopathology. 1963. - №61.- P.611 -617.

84. Annual Report of the Economics Division: HORDI Sri Lanka.- 2006. P.15-20.

85. Avrora, D.P. Systemic acquired resistance / D.P. Avrora, X. Dong // Annual review of phytopathology.- 2003.- Vol.42.- P. 185-209.

86. Bachem, C.W.B. Transcript imaging with с DNA-AFLP: A step-by-step protocol / C.W.B. Bachem, R.J.F.J. Oomen, R.G.F. Visser. //Plant Molecular Biology Report.- 1998.- Vol. -16.- P. 157-173.

87. Bawden, F.C. Photosynthesis and predisposition of plants to infection with certain viruses / F.C. Bawden, F.M. Roberts // Annals of Applied Biology. -1948.-417 p.

88. Beachy, R.N. / R.N. Beachy, M. Zaitlin, G. Bruening, H.W. Israel // Virology. 1976. - № 73. - P.498-507.

89. Bell, C. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis / C. Bell, J.R. Ecker// Genomics. 1994. - №19. - P.137-144.

90. Black, W. A Proposal for an international nomenclature of Phytophthora infestans md of genes controlling immunity in Solanum demissum derivatives / W. Black, C. Mastenbrock, W.R. Mills, I.C. Peterson // Euphytica. 1953. -Vol. 2. - № 3. - P.173-179.

91. Cirulli, M. Influence of temperature and strain of tobacco mosaic virus on resistance in a tomato breeding line derived from Lycopersicon peruvianum / M. Cirulli, L.J. Alexander //Phytopathology. 1969. - №59. - P. 1287-1297.

92. Clark, A.F. General Virology / A.F. Clark, A.N. Adams. 1977. - Vol. 34. -№3. - P.475-483.

93. Clayberg, C.D. The Тт-2-nvlinkage / C.D. Clayberg // TGC Report. №9. -1959.-28p.

94. Cnops, G. Chromosome landing at the Arabidopsis TORNADOI locus using AFLP-based strategy / G. Cnops, B. den Boer, A. Gerats, M. Van Montagu, M. Van Lijsebettens // Mol. Gen. Genet. 1996. - №253. - P.32-41.

95. Cristiansen, M. N. Breeding plants for less donorable environments / M. N. Cristiansen, C.F. Levis // Wiley Interscience Publication. New York: Chichester, Toronto. - 1982. -P.250-265.

96. Devos, K.M. Genome relationships: The Grass model in current research / K.M. Devos, M.D. Gale // Plant Cell. 2000. - №12. - P.637-646.

97. Duirant, W.E. cDNA-AFLP reveals a striking overlap in race specific resistance and wound response gene expression profiles / W.E. Durrant, O. Rowland, P. Piedras, K. Hammond-Kosack, D.G. Jones // Plant Cell .- 2000.-Vol.12.- №6 P. 963-977.

98. European Handbook of Plant Diseases. Blackwell Scientific Publications Oxford, London, Edinburg, Boston, Palo Alto, Melburne. - 1988. - 583p.

99. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). -www.fao.org. 2005

100. Foolad, M.R. RAPD markers for constracting intraspecific tomato genetic maps / M.R. Foolad, R.A. Jones, R.L. Rodriguez // Plant Cell Reports.- 1993.-№12.- P.293-297.

101. Frova, C. Sporophytic and gametophytic components of thermo tolerance affected by pollen selection / C. Frova, P. Portaluppi, M. Villa, M. Sari Gorla // Journal of Heredity. 1995. - Vol. 86. - № 1. - P.50-54.

102. Goelet, P. Nucleotide Sequence of Tobacco Mosaic Virus RNA / P. Goelet, G.P.Lomonossoff, P. J. G. Butler, M. E. Akam, M. J. Gait, and J. Karn // High Wire Press-hosted journal. 1982. - №19. - Vol.79. - P. 5818-5822.

103. Gonzalez, L.C. The response to temperature of cabbage virus A infection in Nicotiana glutinosa / L.C. Gonzalez, G.S. Pound // Phytopathology. 1963. -№53.- P.l041-1045.

104. Gottschalk, W. Bibl. Genetica / W. Gottschalk. 1956. - № 17. - P. 1-109.

105. Guilley, H. / H. Guilley, G. Jonard, B. Kukla, E.E. Richards // Nucleic Acids Research. 1979. - №6. - P. 1287-1307.

106. Gusttafasson, A. Acta Agri. Scand / A. Gusttafasson, O. Tedin. 1954. - № 4. - 463 p.

107. Hall, T.J. Resistance at the Tm-2 locus in the tomato to tomato mosaic virus /T.J. Hall //Euphytica. 1980. -№29. - P. 189-197.

108. Hamamoto, H. Amino-acid changes in the putative replicase of tomato mosaic tobamovirus, that overcome resistance in Tm-1 tomato / H. Hamamoto,

109. Y. Watanabe, H. Kamada, Y. Okada // Journal General Virology. 1997. -№78. - P.461-464.

110. Hunter, T.R. / T.R. Hunter, T. Hunt, J. Knowland, D. Zimmern // Nature. -1976.-№260.-P.759-764.

111. Jones J.P. Analysis of quantitative traits in barley by the use of amplified fragment length polymorphisms / J.P. Jones, B. Harrow // Heredity.- 1998.-Vol.79.- P. 48-59.

112. Jones, R.A. Pollen selection / R.A. Jones et al. // California Agriculture. -2000.-Vol.38.-№8.-P.26-27.

113. Kalloo, G. Genetic Improvement of Tomato / G. Kalloo. Berlin, 1991. -358p.

114. Khush, G.S. Genetic activity in a heterochromatic chromosome segment of the tomato / G.S. Khush, C.M. Rick, R.W. Robinson // Science.- 1964. V. 145. - P.l 432-1434.

115. Kikuta, K. Preliminary report on breeding tomatoes for resistance to tobacco mosaic virus / K. Kikuta, W.A. Frazier // Proceedings of Am. Soc. Hort. Science. -1947. №49. - P.256-262.

116. Kimmins, W.C. The effect of darkening on the susceptibility of French bean to tobacco necrosis virus / W.C. Kimmins // Can. Journal. Botany. 1967. -№45. - P.543-553.

117. Klein-Lankhorst, R. Isolation of molecular markers for tomato (L. esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD) / R. Klein-Lankhorst, A. Vermunt, R. Weide, T. Liharska, P. Zabel // Theoretical and Applied Genetics. -1991.-№83.-P. 108-114.

118. Kohler, E. Die Virusanfulligkeit der Blatter in Abhondigkein von ihrer Socuenz an Sprof. Versuche mit dem Tabakmosaik virus an Nicotiana glutinosa L. / E. Kohler // Biol. Zol. 1966. - Vol.85. - P. 1 -5.

119. Lanfermeijer, F.C. Cloning and characterization of the durable tomato• • • 2mosaic virus resistance gene Tm-2 from Lycopersicon esculentum / F.C.1.nfermeijer, J. Dijkhuis, M.J.G. Sturre // Plant Molecular Biology. 2003.-Vol.52. - P.l037-1049.

120. Logemann, J. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues / J. Logemann, J. Schell, L. Willmitzer // Annals of Biochemistry. 1987.-Vol. 163.- P.l6-20.

121. Maisonneuve, B. Pollen selection in breeding tomato for adaptation to low temperature /В. Maisonneuve // Euphytica.- 1983.- T. 35. № 3.- P. 983 992.

122. Maluf, Relationship between fatty acid composition and low temperature seed germination in tomato / Maluf //Amer. Soc. Hortic. Science. 1982. -№107.-Vol.4.-P.620-623.

123. Mckenna, M.A. Pollen: Biology and Implicate / M.A. Mckenna, D.L. Mulcahy // Plant Breed. Proc. Symp. New York: Lake Garda. - 1983. -P.419-424.

124. Meskem, K. A high resolution map of the vicinity of the RI locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers / K. Maksem, D. Leister, J. Peleman, M. Zabeau, F. Salamini, C. Gebhardt // Mol. Gen. Genet. -1995.-№249.-P. 74-81.

125. Meyers, B.C. The major resistance gene cluster in lettuce is highly duplicated and spans several mega bases / B.C. Meyers, D.B. Chin, K.A. Shen, S. Sivaramakrishan, D.O. Lavelle, Z. Zhang, R.W. Michelmore // Plant cell. -1998.-№10.-P. 1817-1832.

126. Motoyoshi, F. Expression of genetically controlled resistance to tobacco mosaic virus infection in isolated tomato leaf mesophyll protoplasts / F. Motoyoshi, N. Oshima // Journal General Virology. 1977. -Vol.34. - P.499-506.

127. Motoyoshi, F. Molecular characterization of heterochromatic regions around the Tm-2 locus in chromosome 9 of tomato / F. Motoyoshi, T. Ohmori, M. Murata // Symposium of Soc. Exp. Biology. 1996. - №50. - P.65-70.

128. Muckill, D.J. Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice / D.J. Mackill, Z. Zhang, E.D. Redona, P.M. Colowit // Genome. 1996. Vol.39. - P.969-977

129. Mulcahy, D.L. / D.L. Mulcahy // Science. 1979. - Vol. - №206. - P.20-24.

130. Mulcahy, D.L. Pollen: Biology and Implicate. / D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy // Plant Breed. Proc. Symp. New York: Lake Garda. - 1983.- P. 1517.

131. Mulcahy, D.L. Gametophytic self incompatibility or the more things change / D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy // Heredity.- 1982.- T. 54.- №1.- P. 138144.

132. Mullis, K.B. Methods in enzymology /. K.B. Mullis, F.A. Faloona // Academic press. New York. - 1987. - Vol. 155. - 335p.

133. Nishigushi, M. Resistance mechanisms of tobacco mosaic virus strains in tomato and tobacco / M. Nishigushi, F. Motoyoshi // Plant resistance to viruses. Chichester: John Wiley and Sons. - 1987. - P. 38-46.

134. Ohmori, T. Molecular characterization of the SCAR markers tightly linked to the Tm-2 locus of the genus Lycopersicon / T. Ohmori, M. Murata, F. Motoyoshi //Theoretical and Applied Genetics. -2000. № 101. -P. 64-69.

135. Ohmori, Т. Identification of RAPD-markers linked to the Tm-2 locus in tomato / T. Ohmori, M. Murata, F. Motoyoshi // Theoretical and Applied Genetics. 1995. - №90. - P.307-311.

136. Ohno, T. Single amino acid substitution in 30k protein of TMV defective in virus transport function / T. Ohno I/ Virology. 1984. - V. 131.- P.255-258.

137. Ottaviano, E. / E. Ottaviano, M. Sari Gorla // Theoretical and Applied Genetics. 1982. - Vol. 63. № 3. - P. 249-254.

138. Ottaviano, E. Genetics of angiosperm pollen / E. Ottaviano, D.L. Mulcahy // Advances in genetics. 1989. - № 26. - P. 1-64.

139. Pelham, J. Necrosis of Tm-2 /+ plants / J. Pelham // Report of the Tomato Genetics Cooperative. 1970. - №20. - P.36-40.

140. Pelham, J. Resistance in tomato to tobacco mosaic virus / J. Pelham // Euphytica. 1966. -№15. - P.258-267.

141. Pelham, J. Strain-genotype interaction of tobacco mosaic virus in tomato / J. Pelham // Annals of Applied Biology. 1972. - №71. - P. 219-228.

142. Pfahler, P.L. Comparative effectiveness of pollen genotype selection in Higher Plants / P.L. Pfahler // Biology and Implications for Plant Breeding. -1983.-P.361-366.

143. Quiros, C.F. Use of RAPD markers in potato genetics: segregation in diploid and tetraploid families / C.F. Quiros, A. Caeda, A. Georgescu Hu // American Potato Journal. 1993. Vol. 70. - P. 35-40.

144. Robinson, R.W. / R.W. Robinson, C.M. Rick // Heredity. 1954. -№45. - P. 241-247.

145. Saliba-Colombani, V. Efficiency of RFLP, RAPD, and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome / V. Saliba-Colombani, M. Causse, L. Gervais, J. Philouze // Genome. 2000. -№43. - P. 29-40.

146. Scarlat, A. / A. Scarlat // An.Univ.Bucuresti Biol. 1978. - Vol.27. -P.83-88.

147. Smith, O. Agri. Exper. Sta. / О. Smith. -Cornel.Univ.-1935. -№184. -P.3-16.

148. Takamatsu, N. / N. Takamatsu, Т. Ohno, Т. Meshi, Y. Okada // Nucleic Acids Research. 1983. - № 11. - P.3767-3778.

149. Tanksley, S.D. Evidence for extensive overlap of sporophytic gene expression in Lycopersicon esculentum / S.D. Tanksley, D. Zamir, C.M. Rick // Science.-1981,- Vol.213. P.453-455.

150. Tanksley, S.D. High density moleculer linkage maps of the tomato and potato genomes / S.D. Tanksley, M.C. Ganal, J.P. Prince // Genetics. 1992. №132. -P. 1141-1160.

151. Tanksley, S.D. Mapping polygenes / S.D. Tanksley // ANNU. Rev. Gent. 1993.-№27.-P. 205-233.

152. Tanksley, S.D. Use of molecular markers in breeding for soluble solids content in tomato / S.D. Tanksley, J. Hewitt // Theoretical Applied Genetics. -1988.-№75.-P. 811-823.

153. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. Van de Lee, M. Hones // Nucl. Acids Res. 1995. №23.-P. 4407-4414.

154. Watanabe, Y. Characterization of Tm-1 gene action on replication of common isolates and a resistance-breaking isolate of TMV / Y. Watanabe, N. Kishibayashi, F. Motoyoshi, Y. Okada // Virorlogy. 1984. - Vol.161. - P. 527532.

155. Weber, H. The Tomato mosaic vims 30 kDa movement protein interacts differentially with the resistance genes Tm-2 and Tm-T / H. Weber, S. Ohnesorge, M.V. Silber, A.J.P. Pfitzner // Archives of Virology. 2004. - P. 45-50.

156. Weber, H. Tm-2(2) resistance in tomato requires recognition of the carboxy terminus of the movement protein of tomato mosaic virus / H. Weber, A.J. Pfitzner. Molecular Plant Microbe Interaction. -1998. -№11.- P. 498-503.

157. Weber, J. L. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction / J. L Weber, P.E. May // American Journal of Human Genetics. 1989. - Vol. 44. - P. 388-396.

158. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland//Nucl. Acids Res. 1990.- Vol. 18.-P. 7213-7218.

159. Wicking, C. From linked markers to gene / C. Wicking, B. Williamson // Trends Genetics. -1991. №7. - P. 288-293.

160. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, S.V.Tingey//Nucleic Acids Research. 1990. - №18. -P.6531-6535.

161. Williamson, V.M. A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene M'in tomato / V.M. Williamson, J.Y .Ho, F.F. Wu, N. Miller, I. Kaloshian // Theoretical Applied Genetics. -1994. № 87. - P.757-763.

162. Wilson, J. B. The interrelationship of potato and tomato races of Phytophthora infestans/. B. Wilson, M.E. Gallegly // Phytopathology. 1955. -№45. - P. 473-476.

163. Work, K.M. The tomato Origin / K.M. Work. New York: Judd Publishing Co. - 1952. - 630p.

164. Xu, L.C. Application of Atomic Force Microscopy in the Study of Microbiologically Influenced Corrosion / L.C. Xu, K.Y. Chan, H. H. P. Fang, // Materials Characterization. 1997. -№ 48. - P. 195-203.

165. Young, N.D. Use of isogenic lines and simultaneous probing to identify of DNA markers tightly linked to the Tm-2a gene in tomato /. N.D. Young, D. Zamir, M.V. Ganal, S.D. Tanksley // Genetics. 1988. - №120. - P.579-585.

166. Zamir, D. Haploid selection for low temperature tolerance of tomato pollen / D. Zamir, S.D. Tanksley, C.M. Rick // Genetics. 1982. - Vol. 1. - P. 129-137.

167. Zamir, D. Low temperature effect on selective fertilization by pollen mixtures of wild and cultivated tomato species // D. Zamir, S.D.Tanksley, R.A.

168. Jones I I Theoretical and Applied Genetics. 1981. - Vol. 59. - №4. - P.235-238.

169. Zamir, D. Temperature effects on haploid selection of tomato microspores and pollen grains / D. Zamir, E. Vallejos // Biology and Implication for Plant Breeding.- 1983.- P.335-342.118