Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТА С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ СТРЕССОРАМ НЕЧЕРНОЗЁМНОЙ ЗОНЫ, ПОЛУЧЕННЫЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА И ГАМЕТНОЙ СЕЛЕКЦИИ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТА С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ СТРЕССОРАМ НЕЧЕРНОЗЁМНОЙ ЗОНЫ, ПОЛУЧЕННЫЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА И ГАМЕТНОЙ СЕЛЕКЦИИ"

у? ¿63%!-

На правах рукописи

ПИНЧУК Елена Владимировна

ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТА С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ СТРЕССОРАМ НЕЧЕРНОЗЁМНОЙ ЗОНЫ, ПОЛУЧЕННЫЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА И ГАМЕТНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Специальность Об .01.05 ~ селекция и семеноводство

Автореферат диссертации па соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции ВНИИ селекции и семеноводства овошных культур в 2003-2005 гг.

Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотру дай к

Балашова И.Т.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук

Бухаров А.Ф.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Шатило В.И,

Ведущая организация - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Зашита состоится «_» января 2006 г.

в У/? $0 часов на заседании диссертационного совета Д 220.019.01 при Всероссийским научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская область, Одинцовский район, п/о Лесной городок, ВНИИССОК, сектор зашиты диссертаций.

E-mail: VNIlSSOK@mail.ni

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИССОК

Автореферат разослан «__» декабря 2005г,

Учёный секретарь диссертационного совета доктор с.-х. наук, профессор

Добруцкая Е,Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основные стрессовые факторы, экономически ограничивающие урожайность томата в Нечернозёмной зоне - пониженная теплообеспечепIюсть и фитопатогены, наиболее вредоносна из которых фитофтора {РЬуЮрЫЬога т/е$1апз £>£.). Нарастает также вредоносность вирусных инфекций, в частности вируса табачной мозаики, селекция на устойчивость к которому сталкивается с рядом трудностей, обусловленных как изменчивостью патогена, так и характером экспрессии генов устойчивости к ВТМ под влиянием абиотических факторов. Кроме того, в результате вирусного инфицирования могут подавляться реакции неспеинфической устойчивости растений (Лахматова и др., 2000). Поэтому подбор л создание исходного материала с высоким общим потенциалом устойчивости является актуальным.

Взаимосвязь между устойчивостью к патогенам и к абиотическим факторам внешней среды позволяет проводить отбор на комплексную устойчивость (Балашова, 1986), эффективность которого можно повысить при использовании молекулярного анализа (в частности ДНК-маркированля признака устойчивости) и методов гаметной селекции.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось создание исходного материала для селекции томата с комплексной устойчивостью к абиотическим (пониженные положительные температуры) и биотическим (ВТМ и фитофтороз) стрессорам на основе методов молекулярного анализа и гаметной селекции.

В задачи исследований входило:

1. Идентификация стрессоустойчивости селекционного и коллекционного материала: а) с помощью молекулярных маркеров устойчивости;

б) при моделировании искусственных стрессов;

в) на фоне естественны 2. Отбор форм С комплексно!

3. Изучение наследования гибридным потомством признаков устойчивости к стрессорам.

Научная новизна исследований. Разработаны элементы системы ускоренной оценки комплексной стрессоустойчивости растений томата, которые включают RAPD-маркировапне генов устойчивости к ВТМ, анализ эффектов генов устойчивости при моделировании искусственных стрессов, оценку холодостойкости образцов по микрогаметофиту и спорофиту. Показано положительное влияние низкотемпературного воздействия на стадии прорастания семян на устойчивость растений томата к ВТМ.

Определена надёжность защитных эффектов гена Тт-2контролирующего устойчивость томата к ВТМ на тканевом уровне, после воздействия низких положительных температур. Изучен характер наследования комплексной стрессоустойчивости в различных комбинациях скрещиваний с участием виру coy стой чнвых образцов с генами Тт-27 и Тт-1.

Практическая значимость исследований заключается в отборе 11 форм томата с комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессорам для использования их в качестве исходного материала в селекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Элементы комплексной оценки устойчивости растений томата к абиотическим и биотическим стрессорам Нечернозёмной зоны, включающие методы молекулярного анализа, гаметнон селекции и моделирование искусственных стрессов.

2. Отбор генисточников томата с комплексной устойчивостью на основании предложенной системы: 9 образцов, обладающих устойчивостью к пониженным положительным температурам, ВТМ и относительной устойчивостью к фитофторозу, 2 образца, обладающие устойчивостью к ВТМ и пониженным положительным температурам.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (15-18 декабря 2003г.), Ш Съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: состояние и перспективы развития» (6-12 июня 2004г.), III Международной научно-практической конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (19 октября 2004г.), на отчётных сессиях аспирантов В1ШИССОК в 2003-2005гг., на заседаниях научно-методического совета ВНИИССОК,

Публикации результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах, состоит из введения, трёх глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложения. Диссертация содержит 23 таблицы, 14 рисунков, 10 приложений. Список использованной литературы включает 238 наименований, ь том числе 94 - иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научные исследования проводили в 2003-2005 гг. в лаборатории молекулярных и гаметных методов селекции ВНИИССОК. Институт расположен в Одинцовском районе Московской области.

Все годы исследований были малоблагоприятны для роста н развития растений томата: 2003 год — из-за повышенной влажности воздуха и пониженных среднесуточных температур в июне, большого количества осадков и резких перепадов дневных и ночных температур в августе-сентябре; 2004 год — из-за низкой освещенности, низкой температуры воздуха и тепличного грунта в мае-июне, продолжительных похолоданий и осадков в июле-сентябре; 2005 год - из-за длительного похолодания в мае-июне.

Материалом исследований являлись 60 селекционных и коллекционных образцов томата Lycopersicon esculentum L., 7 гибрвдов Fj н 6 гибридов Fj, полученных иа основании скрещиваний с участием родительских форм, несущих гены устойчивости к ВТМ, и восприимчивых форм.

Для заражения образцов использовали штамм ВТМ, принадлежащий к группе 0 ВТоМ по классификации Pelham J. (1972), то есть к дикому типу.

Оценку устойчивости образцов томата к ВТМ проводили на искусственном инфекционном фоне по общепринятой методике (Квасников, Игнатова и др., 1984). Визуальная оценка поражаемости дублировалась DAS-ELISA с помощью диагностического набора, полученного из Биотехнолош-ческого центра ИКХ «Коренёво».

Определение содержания хлорофилла в листьях зараженных и контрольных образцов проводили в лабораторных условиях по методике В.Л. Налобовой (1991).

Оценку материала на присутствие гена устойчивости к ВТМ проводили с помощью RA PD-техно ло г и и, адаптированной к идентификации геномов томата (Суггрунова, 1997). Для маркирования генов Тт-2 и Тт-22 использовали нраймер OPG 097оо, разработанный в Японии (Ohmori, Murata, Motoyo-shi, 1995).

Оценка на естественном инфекционном фоне (в плёночной теплице) включала проведение в течение всего вегетационного периода фенологических наблюдений, описание морфологических признаков, учёт степени распространения заболеваний и поражения растений (Методические указания .... 1979), учёт урожайности.

Оценку холодостойкости образцов проводили по спорофиту (Смирнова, Гаранько, 1990) и гаметофнту (Методическиеуказания..., 2001).

С целью анализа наследуемости признака устойчивости к ВТМ были проведены скрещивания с участием родителей, несущих гены устойчивости к ВТМ, и восприимчивых форм. Коэффициент наследуемости (h~) определя-

ли по Доспехову Б.А. (1985). Для установления характера наследования гибридами Ft признаков устойчивости к стрессам использовали показатель степени наследования (Нр).

Анализ характера расщепления гибридов Fj по комплексу признаков проводили на искусственном инфекционном фоне: растения каждой гибридной комбинации заражали ВТМ и проводили учёты по вышеуказанной методике. На естественном инфекционном фоне в теплице проводили оценку фи-тофтороустойчивости, холодостойкости.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли на ПК, используя пакет прикладных программ Microsoft Excel 95, а также методы дисперсионного и корреляционного анализов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Отбор форм томата, устойчивых к ВТМ, на основе картирования генов Тт-2 и Тт-21. Анализ эффектов генов устойчивости к ВТМ

* RAPD-маркирование устойчивости к ВТМ осуществили у 11 образцов

томата. Праймер OPG 097«) использовали для идентификации полиморфного фрагмента 700 Ьр, тесно связанного с локусом генов Тт-2 и Тт-22, При контрольном тестировании присутствие фрагмента 700 Ьр подтверждено в стандарте устойчивости Craigella (Г/в-ЛГт-2*1), его отсутствие установлено в стандарте восприимчивости — сорте Дубок.

Присутствие молекулярного маркера выявлено у следующих исследованных образцов:

F| Красная стрела (ВИИ И О) (рис.1 А);

№ 159 (ВНИИССОК) (рис.1 В);

Оттава 30 (ВНИИССОК) (рис.1 В);

Craigella (Tm-l/Tm-ï) (ВНИИР) (рис.2);

№ 11638 (ВНИИР) (рис.2);

№ 12435 (Мутант но пгну Тт) (ВНИИР) (рис.2).

А В

Рис.1. Электрофоретические образцы ПЦР-амплифицированных продуктов геномной ДНК, выделенной из образцов томата, проявивших устойчивость к ВТМ на искусственном инфекционном фоне (2003-2005 гг.): А: 2-5 — Р] Красная стрела; В: 1-4-Оттава 30,5-8159;

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

¿00

Рис.2. Электрофоретические образцы ПЦР-амплифицированных продуктов геномной ДНК, выделенной из образцов томата, проявивших устойчивость к ВТМ на искусственном инфекционном фоне (2003-2005 гг.): 1-4 - № 11638, 5-8 - № 12435 (Мутант по гену 7т), 9-12- СодеНа (Тт~1/Тт~1), 13-15 - С^-е11а(Гот-2г/Гт-2г), М-маркер молекулярной массы

Отсутствие молекулярного маркера выявлено у образцов:

Сага-1(ВНИИССОК) (рис.3);

Грот (ВНИИССОК) (рис.3);

Кг 12437 (Мутант по гену Тт-2) (ВНИИР) (рис.4).

1 2 3456739 10 11

Рис.З. Электрофоретичсскне образцы I ЩР-ам п ли фицироваш|ых продуктов геномной ДНК, выделенной из различных по устойчивости к ВТМ образцов томата (2003-2005 гг.): К 10 - Дубок; 2,11 - Сп^сИа (Тт-22 ГГпи?); 3 - Сага-1; 4, 5 - Грот; 6,7 - Сга1§е11з (Гте-У/7/я-/); 8, 9 - № 159; М - маркер молекулярной массы

1234 5 6 7 8 9 10

Рис.4, Электрофоре т и ческие образцы ПЦР-амп лифи цироваш гых продуктов геномной ДНК, выделенной из различных по устойчивости к ВТМ образцов томата (2003-2005 гг.): 1, 2,7, 8 - Дубок; 3, 4, 9, 10-Сп^е11а {Тт-21 /Тт-22); 5, б - № 12347 (Мутант но гену Тт-2); М - маркер молекулярной массы

Наличие генов устойчивости в геноме растения-хозяина является важной предпосылкой генетического контроля этого признака в популяции хозяев, но не всегда обеспечивает данный контроль. Эффекты генов устойчн-

вости проявляются, как правило, в отсутствии типичных симптомов заболевания (мозаики). Однако реакция на патогенез различается в зависимости от генотипа растения-хозяина.

При моделировании искусственной эпифитотии ВТМ более слабую защиту обеспечивали гетерозиготы. Генотипы с геном Тт-1 в гомозиготе — Сга!£еНа {Тт~1/Тт-1) реагировали снижением ростовых показателей при сохранении массы растения. У генотипов с геном Тт-22 в гомозиготе - Сга1§-е)1а (Тт-22/Тт-22) на стадии сеянцев незначительно снижалась высота стебля (табл.1).

Таблица I

Оценка эффектов генов устойчивости к ВТМ (2003-2004 гг.)

Степень рас- Отклонение от контроля1*

Образец пространения высота, мм масса

заболевания, сеянца расте- растения,

% ния г

Дубок ^ в) 100 -44,0 -121,0 -1,78

Сага-1 100 -63,8 -119,5 -0,98

Грог 100 -39,6 -61,5 -1,0

№ 12437 (Мутант по гену Тт-2) 100 -73,1 -63,0 -

Марииа-2 25 -19,4 -49,0 -1,86

МоЬаЫ 0 -25,7 -14,5 -

№159 0 -7,3 -38,5 -2,8

№ 644 (Оттава 30) 0 -14,2 -15,5 -0,44

Красная стрела 0 -40,4 -97,5 -0,06

СпиёеНа [Тт-1/Тт-1) 0 -24,9 -92,5 -0,2

№11638 0 -42,0 -70,0 -0,9

№ 12435 (Мутант по гену Тт) 0 -21,8 + 10,0 -

№845 0 -5,4 -47,9 -1,36

Сга&еПа {Тт-Г/Тт-22) ( - у) 0 -26,0 -19,0 +0,04

НСР05 17,1 46,9 0,9

*контроль - без заражения ВТМ

Нами отмечен различный ответ на заражение штаммом 0 группы ВТМ образцов, мутантных по генам Тт-} и Тт-2, Генотип, мутантаый по гену Тт (Ка 12435), но содержащий ген Тт-22 (рис.2), был достаточно надёжно защищен геном Тт-22. Генотип, мутантный по гену Тт-2 (№ 12437) (рис.4),

был неустойчив к ВТМ, что проявилось в высокой степени развития болезни и значимом снижении ростовых показателей.

Известно, что гетерозиготы по гену Тт-23 при постоянном внесении инфекции ВТМ на фоне повышенных температур и освещённости сильно кекротнзнруются. В гомозиготе ген Тт-22 вызывает повышенную чувствительность растений к неблагоприятным внешним условиям (Квасников, Игнатова и др., 1984). Однако, несмотря на некоторые нежелательные для селекции последствия интрогрессии гена Тт-22 в новые сорта и гибриды томата, его присутствие в популяции растений-хозяев для защиты от дикого штамма ВТМ обязательно.

3.2. Оценка устойчивости коллекционных и селекционных образцов томата при моделировании искусственных стрессов По совокупности результатов фитопатодогической визуальной оценки, биометрических измерений и иммуноферментного анализа из группы селекционных образцов ВНИИССОК выделены следующие, устойчивые и толерантные к заражению штаммом 0 группы ВТМ: № 772, № 775, № 639. Эти же образцы, кроме того, отобраны нами как холодостойкие по спорофиту.

Для выяснения влияния пониженных положительных температур в период прорастания семян на устойчивость растений к вирусной инфекции был проведён эксперимент, заключающийся в поэтапном наложении низкотемпературного воздействия и заражения ВТМ.

При инфицировании ВТМ растений томата, предварительно подвергнутых прорашиванию при пониженных температурах (10°С)> было отмечено, по сравнению с растениями из семян, проращиваемых при оптимальных температурах (25°С), более слабое проявление симптомов вирусной инфекции, а также стимуляция роста и развития инфицированных растений (рис.5). Однако наблюдалось поражение вирусом сорта Сгс^Па (Тт-^/Тт-22), что выражалось в более сильном проявлении симптомов ВТМ — степень развития болезни при проращивании в низкотемпературных условиях составляла

) 00% (тогда как при проращивании в оптимальных условиях — 40%) и значительном угнетении ростовых показателей под влиянием вирусной инфекции.

Рис.5. Показатели виру coy стойчивости маркерных и селекционных образцов томата: контроль — проращивание семян при 25°С, стресс - проращивание семян при 10°С (2004 г.)

То есть, наряду с положительным влиянием на вирусоустойчивость растений низкотемпературного воздействия на них, наблюдается потеря защитных свойств геном Тт-22 после проращивания растений, несущих его в гомози]TiTe, при пониженных положительных температурах.

3.2. Оценка внрусоустойчнвых коллекционных образной томата по комплексу признаков

Для оценки потенциала устойчивости и выявления наиболее адаптивных форм из группы коллекционных вирусоустойчивых образцов была проведена оценка данного материала в условиях плёночной теплицы.

Толерантные .и устойчивые к DTM образцы, отобранные с помощью молекулярного анализа (маркирование гена устойчивости) и на искусственном инфекционном фоне (оценка эффектов генов устойчивости), не только подтвердили свою устойчивость к ВТМ, но и оказались устойчивыми к комплексу вирусов других групп, свойственных природным ценозам Нечернозёмной зоны России (ХВК, УВК), Латентное инфицирование образцов

№ 159, Р, Красная стрела, Сго£е11а (Тт- 1/Тт-1\ Сп^еНа (Тм-?/Тт-2г) не повлияло на их продуктивность.

По данным трёхлетней оценки поражаемое™ образцов томата фитоф-торозом в условиях плёночной теплицы относительной устойчивостью к этому заболеванию обладали следующие: 845, № 5173, № 4987 (Линия 50), СгащеНа (Тт-22/Тт'27), МоЬас!, Р, Красная страда (рис.6).

Рис.б. Степень поражения фитофторозом (средний балл) коллекционных образцов томата (2003-2005 гг.)

Данные образцы по совокупности поражения листьев, стебля и плодов имели среднюю слепень развития болезни менее 25%.

Проведённый корреляционный анализ в изучаемой группе образцов выявил тесную взаимосвязь между степенью поражения листа и стебля (Сг = 0,78) и степенью поражения стебля и плода (Сг = 0,82), тогда как между степенью поражения листа и плода зависимость была более слабой (Сг = 0,52).

При определении холодостойкости спорофита использовали показатели степени снижения всхожести семян в низкотемпературных условиях (10°С) относительно оптимальных (25°С) и изменение биометрических параметров сеянцев, выращенных из этих семян.

Образцы разделены по группам холодостойкости спорофита: высокохолодостойкие - Яа 11638, № 5173, № 845, Сга^еПа (Тт-1/Тт-Г), Марица-2,

о

3, 2. 1.

проявившие после воздействия пониженными температурами на семена стимуляцию роста корня и стебля. К среднехолодостойким отнесены № 4987 (Линия 50), Сга'^еПа (Тт-^/Тт-22), Премьера, проявившие незначительную стимуляцию и депрессию биометрических параметров в пределах от 0 до 25% (табл.2).

Таблица 2

Холодостойкость по спорофиту коллекционных образцов томата (2003-2004 гг.)

Всхожесть семян, % Дгшка, мм

корня стебля

Образец 25°С Ю°С степень 25^ 10°С степень

10"С 25"С стече- сниже-

ния, % ния, %

<520/+ (Эг-у) 76 66 - - - 76,1 88,7 -16

СгашеПа (Тт-1/Тт-1) 100 100 53,6 62 -16 83,8 113,5 -35

Марица-2 35 100 43,6 62,2 -43 97,4 109,1 -12

№ II638 75 58 37,6 53,6 -43 83,6 93,0 -11

№5173 57 58 40 63,4 -59 94 103,0 -10

№845 100 50 98 60,4 -50 90,6 115,5 -28

Сг^еИа {Тт-Г/Тт-?} 96 71 56 58 -4 81,2 96,8 -19

№ 4987 (Линия 50) 90 85 65,8 51 22 100,6 99,2 1

Премьера 73 78 46 40,2 13 89,2 78,2 12

МоЬас 1 90 100 49,4 44,5 10 98 21,1 78

НСРм 8,7 11,6

Выделенные образцы могут быть использованы в скрещиваниях с целью создания холодостойких генотипов в качестве материнской формы.

По признаку холодостойкости микрогаметофита все исследуемые коллекционные образцы были разделены ло группам устойчивости (табл.3).

К высокохолодостойким отнесён сорт Премьера, у которого отсутствуй *

ет депрессия прорастания микрогаметофита при низкой температуре. К среднехолодостойким отнесены образцы МоЬас ¡, Cгaigella (Тт-^/Тт-22), »

№ 4987 (Линия 50), № 5566, № 5173, Р, Красная стрела, № §45 (средняя степень снижения по совокупности показателей жизнеспособности пыльцы и длины пыльцевой трубки не превышает 50%).

Таблица 3

Холодостойкость но микрогаметофиту коллекционных образцов томата

(2003-2004 гг.)

Жизнеспособность Длина пыльцевой Группа

пыльцы,% трубки, ед. окуляр мкм холо-

Образец 25°С 10°С «лепень 25°С 10°С СТьПСНЬ лос ■

сниже- сниже- тонко-

ния, % ния, % сти*

Премьера 5,7 18,4 0 11,8 25,8 0 1

Р) Красная стрела 10,6 5,9 44 27,5 55 0 2

№ 4987 (Линия 50) 50,0 26,8 46 15 16,3 0 2

Яй 845 5,4 1,6 70 20,8 27,1 0 2

Спо^Ол (Тт^/Пп^ 29,2 17,6 40 53,9 48,3 10 2

№ 5173 233 13,1 44 25,2 12,6 50 2

МоЬаы 15 12,8 15 39,6 14 65 2

Хг5566 12,2 9,3 24 53,3 45 16 2

№ 159 28,2 1,7 94 25 20 20 3

№ 12435 (Мутант Тп») 20,2 2,3 89 20 12,5 38 3

Сгакеиа {Тт-1/Тт-1) 12,7 2 84 41 25,5 38 3

Марица-2 3 1,5 50 27,5 13,8 50 3

№ 11638 15 3,5 77 21,3 10,6 50 3

№4990(Линия 71) 20,6 8,2 60 40 15 63 3

№ 11607 28,1 6,9 75 60 0 100 3

НСР„5 4,9 9,5

* Групп а холодостойкости; 1 - высокоустойчивые (степень снижения показателей от 0 до 25%), 2 - среднеустойчивые (от 25 до 50%), 3 - слабоустойчивые и неустойчивые (от 50 до 100%)

Выделенные образцы целесообразно использовать в скрещиваниях в качестве отцовского компонента.

По результатам трёхлетней оценки вирусоустойчивых коллекционных образцов в качестве источников комплексной устойчивости к ВТМ, пониженным положительным температурам и относительной устойчивости к фи-тофторозу выделены образцы: № 845, № 5173, № 4987 (Линия 50), МоЬас!, СгаЗееНа (Тт~2}/Тт-27). В эту группу также можно включить образцы Оттава 30, Мо 387, Мо 409, Мо 137 (из коллекции ВНИИССОК), которые были отобраны как устойчивые к ВТМ на искусственном инфекционном фоне из 27

маркерных образцов, относительно устойчивых к пониженным положительным температурам и фитофторозу (Козарь и др., 2003).

В ходе исследований ежегодно проводили индивидуальную оценку растений в популяциях выделенных образцов, на основании которой отбирали наиболее ненные генотипы с комплексной стрессоустойчивостью. Отдельные из них были включены в скрещивания для анализа характера наследования этих признаков в гибридном потомстве.

3.3- Комплексная оценка стрессоустойч и воет н и продуктивности

гибридов

По совокупности результатов фитопатологической оценки и анализа изменений линейных параметров растений на искусственном инфекционном фоне в качестве устойчивых к ВТМ выделены гибрилы Р| следующих комбинаций скрещиваний: № 4987 {Линия 50) х Сга10е11а (Тт-^/Тт-!2)^ Сп^е11а (Тт-1/Тт-1) х Дубок. В качестве толерантных форм с незначительным угнетением ростовых процессов и слабым проявлением симптоматики - гибриды Р, Сгш§е11а (Тт-?/Тт-22) х Талалихин 186, С^еПа (Тт-1/Тт-1) х № 4987 (Линия 50).

Наследование устойчивости гибридов Р| к ВТМ оценивали по проценту бессимптомных растений в образце. Анализ наследования выявил большее влияние гена Тт-22 по сравнению с геном Г/и-/. Доминирование и сверхдоминирование отмечалось в комбинациях с использованием сорта Спн^сИа (Тт-^/Тт-22) в качестве материнской формы при скрещивании с восприимчивыми образцами и в качестве отцовской - при скрещивании с вирусоустойчивым образцом № 4987 (Линия 50). Ген Тт-1 доминировал, когда наследовался по материнской линии только в комбинации CгaigeHa (7т-¡/Тт-1) х Дубок (табл.4).

Таблица 4

Наследование признака устойчивости к ВТМ гибридами (2004 г.)

Гибрид Р| Процен! бессимптомных растений Нр

Р. Р*

Сга^еИа (Тт-22/Тт-Т:) х Талалихин 186 55 50 70 7

Талалихин 186 х СпизеШ (Тт-Т'/Тм-?4) 50 55 30 -9

№ 4987 (Линия 50) х СпадеНа (Тт-?ГГт-¥) 80 50 85 1,3

Сга1ёе11а (Тт-?,Тт-?) х Дубок 50 10 50 1

Сга^йеПа (Тт-1/Ттп-1) х Талалихин 186 100 50 50 -1

СшяеНа (Тт-1/Тт-1) х № 4987 (Линия 50) 100 80 60 -3

СгшееИа (Тт-1/Тт-1) х Дубок 100 10 80 0,6

В результате вычислеиия коэффициента наследуемости (Ь2) изучаемого признака, определяемого изменением длины стебля под влиянием вирусной инфекции, выявлено существенное влияние отцовских форм в комбинациях скрещиваний с участием в качестве материнских форм сортов Cгaigelta (Тт-Т/Тт-22) (Ь2 = 68,5%) и С^еПа {Тт-1/Тт-}) (Ь2 = 74,4%).

Относительную устойчивость к фитофторозу (степень развития болезни до 50%) проявили большинство гибридов Рь в том числе и комбинации с участием восприимчивого сорта Талалихин 186 в качестве материнской формы. При использовании данного сорта в качестве отцовской формы, полученные гибриды были восприимчивы к фитофторозу (рис.7).

. ¡Слстрвйй

Шц

I I

I I £ I

II

§

е.

I'

3

- ТЕГ -т' гй'^гп

3 . ? .5 1 г. „ г,

5 ^ !1 II 1 И I ■

I * 7 II Н £ I

3 ||

и 11 "I

I]

£ I

г г

11

я £

£

е. &

ё

I §

? I

Рис.7, Степень развития фитофтороза у гибридов томата, полученных из семян, которые проращивали При 25 С (контроль) и при 10°С (стресс); в среднем но листу, стеблю, плоду (2004г.)

По признаку холодостойкости спорофита, определяемому способностью семян прорастать при пониженных положительных температурах, доминирование (Нр от -0,4 до 1,4) проявляли гибриды полученные с участием Сп^еНа {Тт-^/Тт-?).

По изменению биометрических параметров растений, полученных из семян, проращиваемых при пониженных температурах относительно оптимальных, большинство гибридов Р| превосходили родительские формы (табл.5).

Таблица 5

Холодостойкость по спорофиту родительских форм и гибридов Г7! (2004 г.)

Образец Всхожесть семян, % Длина, мм

КО| эня стебля

2SV 1(ГС 25 С 1№С степень снижения. % 2УС ИГС ста тень снижения, %

Родительские формы

Craigella (Tm-f/Tm-Г} 96 71 56 58 -4 81,2 96,8 -19

Cratgella (Tm-J/Tm-l) 100 100 53т6 62 -16 83,8 113,5 -35

№4987 (Линия 50) 90 85 65,8 51 22 100,6 99,2 1

Талалихин 186 86 82 72,4 75,0 -4 126,8 103,3 19

Дубок 100 100 - - - 112,4 100 11

Гибриды р]

Сга)ёе11а (Тт-Г'/Тт-^) х Талалихин 186 90 80 46,8 52 -11 67,6 963 -42

Талалихин 186х Craigella {Тпъ?/Тт-Т2} 88 88 51,2 59,3 -16 100,2 94,9 5

№ 4987 (Линия 50) х Сга^еИа [Тт-2*/Тт~2?) 100 98 53,6 57,4 -7 84,2 94,1 -12

С^еНа (Тт-Т/Тт-22) х Дубок 98 80 61 55,7 9 106,4 112,0 -5

Сга^еПа (Тт-Шт-!) х Ха 4987 (Линия 50) 96 60 48,2 50,8 -5 111,2 99,9 10

Сга1$е11а (Тт-1/Тт-1) х Дубок 80 78 48,8 57,2 -17 94,8 114,4 -21

НСРоз 10^3 12,9

Но совокупности изученных признаков к высокохолодостойким по спорофиту отнесены гибриды Fi Craigella (Тт-^/Тт-г?) х Талалихин 186, Та-

лалихин 186 х Сга^еПа (Тт-22/Тт-22Х № 4987 (Линия 50) х Сп^еНа (Тгп-21ЛГт-?), а также Сп^еИа (Тт-1/Гт-1) х Дубок.

Фенологические наблюдения показали, что все изученные гибриды являлись среднеспелыми. Известно, что в целом гибрид по скороспелости в большинстве случаев превосходит наиболее скороспелый родительский сорт (Мамедов, 2002). Нашими исследованиями подтверждена такая закономерность - по данному признаку наблюдалось положительное сверхдоминирование.

11родуктивность гибридов была на уровне родительских форм. Однако наибольшими значениями данного показателя характеризовались более позднеспелые гибриды, полученные из семян, которые проращивали при пониженных температурах. Повышение продуктивности таких гибридов наблюдалось за счёт увеличения числа плодов с одного растения и средней массы плодов. В качестве наиболее раннеспелых и продуктивных отобраны гибриды следующих комбинаций скрещиваний: CraigeUa (Тт-21/Тт-2?) х Дубок, Сш%е1Ы(Тт-1/Гт-1) х Дубок (рис.8).

8,' а

'Ж -1 8 | у* ¡8

11 Е 1

С |

(В а 5

□ контроль 1

Всходы-созре»а [ нив <сут | (

I

э но нтрз.пь Продуктивность

М

со .Л

? I £ $

!: 1

а

Ш стресс I В «од» | нив (сут.)

Вгходы-соэрвва |

ЕЭСТрвСС |

Продуктивноет» '

С) |

Рис.8, Показатели скороспелости и урожайности гибридов Р| томата, полученных из семян, которые проращивали при 25°С (контроль) и при 10°С (стресс) (2004г.)

В ходе наших исследований было установлено, что низкотемпературное воздействие на стадии проращивания семян приводит к увеличению

продуктивности (рис.8) и повышению устойчивости гибридных растений Р| к фитофторозу (особенно у восприимчивых образцов — степень развитии фи-тофюроза не превышала 50%) (рис.7). То есть, низкотемпературное воздействие на ранних этапах онтогенеза способствует повышению неспсцифичс-ской устойчивости растений томата и отбору наиболее ценных генотипов, что отмечали и другие исследователи (Балашова и др., 2002).

По результатам исследований гибридов Р[ нами выявлены устойчивые к каждому стрессовому фактору комбинации скрещиваний, а также комбинации с комплексной устойчивостью. Для опенки способности каждою признака устойчивости сохраняться в поколении Р2 щадводили анализ расщепления этих признаков.

Характер проявлении признаков стрессоустомчиносгн в потомстве Г*

В большинстве комбинаций признак вирусоустойчивости (табл.6) значительно сохранялся в потомстве, особенно в комбинациях с участием виру-соустойчивых материнских форм: Сга1£с11а (Тт-2г-'Тт-22\ Сгш*£с11а (7т-}.'Тт-Г), № 4987 (Линия 50).

Таблица 6

Проявление признаков сгрессоустойчивости в потомстве Тг (2005 г.)

Гибридная популяиид Рг Процент устойчивых форм

втм холодостойкость спорофита фитоф-тороз

Сга^ёсЧ^{Тт^ Тт-^) х Талалихин 186 49 100 14

Талалихин 186 х Сга^еПа (Тт-2'.Пт-Т) 46 100 28

№ 4987 (Линия 50) х СгарсНа (Тт^/Тт-Т2) 95 70 22

Ста»ее11а {Тт^Тт-!'} х Дубок 81 100 38

Сга^Ма ('1т-}/7>п-1) х Талалихин 186 93 80 28

СпавсПа (Тт-1>Тт-}) х № 4987 (Линия 50) 86 81 0

СгащеИа {Тт-1/Тт-}) х Дубок 55 80 57

По фитофтороустойчивости наблюдалось значительное варьирование признака в пределах каждой гибридной популяции. Максимальный процент

относительно устойчивых к фитофторозу форм наблюдался в комбинациях с наименьшей степенью поражения: Craigella {Tm-l/Tm-1) х Дубок, Craigella (Tm-^/Tm-l2) х Дубок.

Высокая холодостойкость спорофита отмечена в потомстве практически всех комбинаций скрещиваний. Из лучших комбинаций были отобраны ценные генотипы, которые будут использованы в нашей дальнейшей работе по селекции на комплексную стрессоустойчивость.

ВЫВОДЫ

1. Элементы системы ускоренной (1,5-2 года) оценки комплексной стрессо-устойчивости растений томата, включающие RAPD-маркировзние генов устойчивости к ВТМ, анализ эффектов генов устойчивости при моделировании искусственных стрессов, оценку холодостойкости по микрогамето-фиту (пыльца) и спорофиту (семена и сеянцы) позволили выделить 11 сор-тообразцов - источников комплексной устойчивости к основным стрессорам Нечернозёмной зоны России.

2. RAPD-маркирование является важным звеном в изучении эффектов генов устойчивости к ВТМ у томата при моделировании искусственных стрессов (пониженные положительные температуры, искусственный инфекционный фон).

3. Эффективный при заражении диким штаммом ВТМ ген Тт-21 снижает свои защитные свойства при воздействии на растения-хозяева пониженных положительных температур на ранних стадиях онтогенеза.

4. Доминирование и сверхдоминирование по признаку вирусоустойчивости у гибридов Fi, наблюдается во всех комбинациях скрещиваний, где в качестве материнской формы используется Craigella {Тт-22/Тт-22), при этом выявлено существенное влияние отцовских форм на степень изменения длины стебля под влиянием вирусной инфекции (h2 = 68,5%).

5. По комплексной стрессоустойчивостн (устойчивость к ВТМ, пониженным положительным температурам и фитофторозу) интерес представляют комбинации скрещиваний вирусоустойчивых образцов с адаптированным для открытого грунта Нечернозёмной зоны России сортом Дубок: Craigella {Тт-2*/Тт-2*) х Дубок, СкидеНа (Тт-1/Тт-1) х Дубок, из которых во втором поколении выделены наиболее ценные генотипы для дальнейшей селекционной работы.

6. Низкотемпературное воздействие на ранних стадиях онтогенеза (при проращивании семян) способствует повышению устойчивости большинства образцов томата к ВТМ; к увеличению продуктивности и повышению относительной устойчивости гибридных растений Р| к фитофторозу (особенно у восприимчивых образцов).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для Нечернозёмной зоны России рекомендуются 11 сортообразцов — источников комплексной устойчивости к основным стрессовым факторам: 9 образцов, обладающие устойчивостью к пониженным положительным температурам, ВТМ в относительной устойчивостью фитофторозу (Оттава 30, № 845, № 5173, МоЬаЫ, р, Красная стрела, СгащеНа Мо 387, Мо 409, Мо 137), и 2 образца, обладающие устойчивостью к ВТМ и пониженным положительным температурам — № 4987 (Линия 50) и СгащеПа (Тт-1/Тт-1).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балашова И.Т., Пинчук Е.В. и др. Стратегические подходы к повышению стрессоустойчивостн растений в агроценозах (на примере томата) II Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Межд. научно-практ. конф,- М., 2003,- С.334-355.

2. Балашова И.Т., Скворцова Р.В., Пинчук Е.В. и др. Селекционная программа по повышению стрессоустойчивости томата в агроценозах // Сб. Селекция и семеноводство овощных культур. - М„ 2003.- С.44-57.

Л. Балашова И.Т., Скворцова Р.В., Пинчук Е.В. и др. Комплексная устойчивость томата в условиях Нечернозёмной зоны России // Сб. Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития, М., 2004,- Т. I С.420.

4. Балашова И.Т., Пинчук Е.В. и др. Использование RAPD в селекционной программе: оценка содержания генов устойчивости томата к ВТоМ // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Ш Международная научно-практическая конференция,- М., 2004,- С.14-17.

5. Балашова И.Т.» Балашова H.H., Пинчук Е.В. и др. Первые результаты программы ВНИИССОК «Томат, устойчивый к абиотическим и биотическим стрессам Нечернозёмной зоны России» // Сб. Селекция и семеноводство овощных культур,- М„ 2005. - Вып. 40,- С Л 7-26.

6. Пинчук П.В., Балашова И.Т. и др. Программа «Повышение комплексной устойчивости томата к основным стрессам Нечернозёмной зоны России» // Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур: Межд. симпозиум ВНИИССОК, М„ 2005,- С.414-427.

7. Пивоваров В.Ф., Балашова И.Т., Пннчук Е.В. и др. Селекционные технологии, созданные во ВНИИССОК на основе методов молекулярного анализа и селекции по микрогаметофиту // Сельскохозяйственная бнология.-2005, №3.-С.91-100.

8. Балашова И.Т., Балашова H.H., Пинчук Е.В. и др. Селекционная программа ВНИИССОК «Стрессоустойчивый томат» // Материалы VHI-ro съезда научного общества генетиков и селекционеров Республики Молдова, 2005 (в печати).

Отпечатано в Одинцовском Фонде "СЭПИН" 143007, г.Одинцово, Можайское ш., д. 71 т.591-63-79 Подписано в печать 15.12.2005г. Формат 60x90/16 Тираж 100