Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМ. SOLANACEAE (РОД SOLANUM, РОД LYCOPERSUCON, РОД CAPSICUM)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМ. SOLANACEAE (РОД SOLANUM, РОД LYCOPERSUCON, РОД CAPSICUM)"

j-mn

г. На правах рукописи

КОЧИЕВА Елена Зауровна

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМ. SOLANACEAE (РОД SOLANUM, РОД LYCOPERSICON, РОД CAPSICUM)

03.00.15 — генетика 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в таборатории генетики растений Института обшей I енетики им Н И Вавилова РАН, иборатории организавдш генома Института биотогии гена РАН и на кафедре сельскохозяйственной биотехнотогии МСХА им К А Тимирязева

Научный консультант: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профи-сор Алексей Петрович Рысков

Официальные оппоненты: член корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Борис Федорович Вашошин

доктор биочогических наук, профессор Дмитрий Александрович Крамеров

доктор биологических наук, профессор Николай Казимировнч Янковский

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Зашита состоится «» декабря 2004 г в / / часов на заседай) Диссертационного совета Д 220 043 10 при Московске сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 12755" Москва, Тимирязевская ут , 49, огдеч защиты диссертаций Факс (095)972-40-72

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Автореферат разослан «_» ноября 2004 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Г И Картов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Семейство Solanaceae является одним из самых представительных семейств двудольных растений и, кроме того, включает виды, являющиеся основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель, томат и перец, относящиеся к трем основным родам (Solanum, Lycopersicon и Capsicum) этого семейства.

Род Solanum является самым многочисленным из родов семейства Solanaceae. Картофель {Solanum tuberosum) и родственные ему дикорастущие и культивируемые клубнеобразующие виды Solanum объединены в подсекцию Potatoe, которая, в свою очередь, была подразделена на 19-25 серий (Юзепчук, 1938, Букасов, 1955, Hawkes, 1990). Такая классификация основывалась прежде всего на морфо-физиологических данных и / или географии распространения видов, а также подразумевала наличие филогенетических отношений между видами, составляющими одну серию. Проводимая в последнее время ревизия и значительное расширение коллекций образцов видов Solanum выявили существенные проблемы, связанные с определением уровней биоразнообразия и филогенетических связей, а также установлением границ для видов и серий видов (Spooner, Castillo, 1997, Spooner, Hijmans, 2001, van der Berg et al., 2002). Для выявления спорных таксономических вопросов и более полной характеристики вида и серии видов рекомендовалось использовать молекулярные методы маркирования генома. Использование методов молекулярного анализа хлоропластной и ядерной ДНК картофеля показало часто встречающееся объединение в одну серию неродственных видов (Hosaka, 1996, Spooner, Castillo, 1997, 1998, Kardulos et al., 1998, van der Berg et al., 2001, Spooner, 2004). До настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне ясным, также не были проведены оценки межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений между сериями видов.

Несмотря на небольшое количество видов, составляющих род Lycopersicon, классификация его до сих пор окончательно не разработана. Исходно таксономия рода Lycopersicon базировалась на морфологических (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999), цитологических и биохимических (Rick, Yoder, 1988) характеристиках, на основании которых было предложено несколько классификаций рода (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999). Однако так же, как и в случае с родом Solanum, до настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне определенным.

Перец (рол С!ярГ|Ю1т)| "TITí с томатом и картофелем, является одной из основных 01 нако, в отличие от последних, представляет

соф-Йанных родов этого семейства. Несмотря на то,

что 5 из 27 выделяемых на сегодняшний день видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum слабо изучены как в генетическом, так и в молекулярном плане Данные по систематике рода Capsicum также весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980, Walsh, Hoot, 2001) При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды имеют перекрывающуюся морфологию, в результате чего идентификация, основывающаяся на морфологическом анализе, часто бывает весьма затруднительна Исследование запасных белков семян (Panda et al, 1986), цитологический анализ (Pickersgill, 1979) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей рода Capsicum (Jensen et al, 1979) нередко показывают невозможность выделить отдельные виды Все что свидетельствует о необходимости использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешаюшлч систем молекулярного маркирования

Большая часть биохимических и молекулярных исследований сем Solanaceae была сфокусирована, в основном, на анализе только культивируемых видов, таких как Solanum tuberosum Lvcopersicon ечси1ьпШт и Capsicum аппиит (Miller, Tanksley, 1986, Williams, Clair, 1993, Paran et al, 1948), в то время как потенциал биоразнообразия остальных как культивируемых, так и дикорастущих видов не изучался Между тем не исключено, что именно они могут стать донорами хозяйственно-ценных признаков, и, в первую очередь, устойчивости к фитопатогенам л вредителям (Б\ касов, Камераз, 1472, Pickersgill, 1480, Будин, 1994, Пивоваров 1494) Цель h задачи исследования: провести комплексный молекулярный анализ ядерного и хлоропгастного генома Solanaceae, который позволи i бы охарактеризовать различные компоненты генома, выявить потенциал меж и внутривидового геномного полиморфизма, в том числе и последовательностей семейств адаптивно-значимых генов, у представителей трех родов сем Solanaceae, определить филогению взятых в анализ культивирующихся и дикорастущих видов Solanum, Lycopersicon и Capsicum подтвердить таксономические статусы каждого образца и в ряде случаев определить таксономические границы вида Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи

1 Определение уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей Solanaceae с помощью методов молекулярного мультилокусного анализа (AFLP, RAPD, ISSR), маркирующих как уникальные, так и повторяющиеся участки генома

2 На основе данных комплексного молекулярного маркирования генома перца установление филогенетических связей между видами родов семейства Solanaceae

3. Определение уровней полиморфизма генома представителей видов и сортов Solanaceae по данным анализа микросателлитных локусов ядерного и хлропластного генома.

4. Разработка метода маркирования полиморфизма последовательностей основных адаптивно-значимых семейств растительных генов и определение потенциала биоразнообразия этих генов у представителей Solanaceae. Анализ представленности генов устойчивости в геноме и возможности генетической эрозии у современных сортов картофеля.

5. Создание коллекции SNP маркеров и применение ее для анализа и идентификации геномов сортов картофеля и томата.

6. Определение и характеристика последовательностей внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS 1, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5.8S рРНК у видов рода Solanum и рода Capsicum. Исследование нуклеотидного полиморфизма данных последовательностей.

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые проведено комплексное исследование хлоропластного и ядерного генома у 712 представителей трех родов (Solanum, Lycopersicon, Capsicum) сем. Solanaceae с использованием различных систем молекулярного маркирования. Анализ более 2800 полиморфных фрагментов ДНК позволил определить уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности у анализируемых представителей семейства, филогенетические связи и уточнить таксономический статус ряда образцов. Подтверждена и дополнена классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных таксонов. Показана возможность использования молекулярного анализа для идентификации неправильно классифицированных образцов Solanaceae, а также образцов, имеющих гибридное происхождение, что является важной информацией для организации и поддержания генетических коллекций Solanaceae в генбанках.

Впервые был определен уровень геномного полиморфизма и степень родства геномов 54 сортов картофеля отечественной селекции, что в дальнейшем может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания. Кроме того, для составления индивидуальной аллельной формулы и паспортизации сортов картофеля и перца был впервые применен микросателлитый анализ ядерного и хлоропластного генома. Впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля двух типов хлоропластной ДНК.

Был разработан новый метод - метод домен-направленного маркирования (Domen Directed Profiling, DDP) - и показана возможность его использования для определения уровней биоразнообразия семейства адаптивно-значимых генов (семейства генов устойчивости, гомеозисных генов и генов серин-треониновых протеинкиназ) у различных видов и сортов

растений сем Solanaceae, а также дтя филогенетического анализа соответствующих семейств генов Впервые проведена оценка представленности генов устойчивости в геноме 445 современных сортов картофеля отечественной и европейской селекции и определены группы сортов, наиболее дивергентные по этому признаку Впервые с использованием метода пиросеквенирования было проведено SNP маркирование и определен аллечьный статус SNP генома 350 сортов картофеля Полученные SNP могут быть также использованы для маркирования генов и отдельных хромосом при проведении маркер-ассоциативной селекции

Разработана модифицикация метода TAIL PCR для выявления фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном инсерционном мутагенезе Впервые показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно для прямого секвенирования без предварительного клонирования, а также в качестве зондов для сканирования геномных библиотек, что значительно ускоряет и удешевляет процесс идентификации и изолирования новых генов

Впервые выявлен и охарактеризован межвидовой полиморфизм последовательностей рибосомного оперона у видов рода Solarium подсекции Potatoe и видов рода Capsicum На основе данных анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомных генов (ITS) перца впервые показано одновременное присутствие в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК

Результаты диссертационной работы используются при чтении курса по мо текулярному маркированию генома растений на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К А. Тимирязева Полученные данные и обобщения следует учитывать при молекулярной паспортизации сортов и подборе родительских форм в селекционной практике, при проведении работ по анализу геномного полиморфизма и модек>лярной эволюции генома растений, а также при составлении кол лекции генбанков Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции по современным проблемам селекции растении (IC&WPB) (Киев, 1990), V symposium of plant metabohsm régulation (Soha, 1990), FASEB conférence (Vermont, 1993), конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 1996), конференции по молекулярно-генетическим маркерам (Ялта, 1996), Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке" (Москва, 2000), II и III съездах ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000, Москва, 2004), I и II Международных совещаниях по биоразнообразию PENXGEB Biodiversity of species and cultivars genomes (Florence, 1999, Санкт-Петербург, 2001), Международной научно-практическои конференции

«Генетические ресурсы культурных растений» (Санкт-Петербург, 2001); II конференции МОГиС (Москва, 2003); V Съезде общества физиологов растений (Пенза, 2003); Xllth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum & Eggplant (Noordwijkerhout, 2004); EUCARPIA General Congress (Tullin, 2004); на Международных семинарах Carnegie Institution (Baltimore, 1992, 1993), EMBL (Heidelberg, 1997), Department of Biodiversity and Identity (PRI) (Wageningen, 2001,2002) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 работ, из них 22 в российских и международных рецензируемых изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация, изложенная на 315 страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 29 таблицами и 54 рисунками.

Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Department of Biodiversity and Identity (PRI) (Нидерланды), a также с аспирантами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат также разработка программы исследования, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ геномного полиморфизма представителей трех родов сем. Solanaceae

В работе были использованы RAPD- и AFLP-методы молекулярного анализа, позволяющие исследовать полиморфизм селективно нейтральных преимущественно уникальных и умеренно повторяющихся последовательностей ДНК и метод IS SR, приводящий к амплификации межмикросателлитных последовательностей ДНК, локализованных, главным образом, в гетерохроматиновых районах генома (Wu et al., 1994, Klein et al., 2000).

3.1.1. Молекулярное маркирование генома методами AFLP, RAPD и ISSR и определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum

Методы молекулярного маркирования генома были использованы нами для комплексного анализа полиморфизма генома, а также для исследований таксономических и филогенетических взаимоотношений у клубнеобразующих видов рода Solanum, объединенных в подсекцию Potatoe. Для молекулярного анализа методом AFLP были подобраны 48 образцов из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова - представители 27 видов рода Solanum подсекции Potatoe. При этом виды S. kurtzianum, S. spegazzini, S. stoloniferum, S. sparsipilum, S. chacoense, S. demissum, S pinnatisectum, S. polytrichon были представлены 2-5 популяциями из различных мест произрастания.

AFLP маркирование генома Solanum при использовании четырех отобранных EcoRI/Msel праймерных комбинаций (Е12/М40, Е12/М38, Е12/М45, Е35/М41) выявило 415 полиморфных AFLP-фрагментов и позволило получить для каждого анализируемого представителя Solanum воспроизводимые полиморфные AFLP-спекгры (рис 1) При этом побая из отобранных праймерных комбинаций позволяла идентифицировать генотипы каждого анализируемого образца В результате для каждого вида и образца Solanum был получен специфичный спектр AFLP фрагментов, при этом было выявлено 112 видоспецифичных фрагментов и 36 фрагментов, характерных д^я отдечьных серий видов На основании этих данных AFLP-анализа бьпл определены уровни генетических различий представите чей рода

Рис 1 AFLP спектры представитетея 27 видов рода Solanum подсекции РтаЮь и сортов S tuberosum потученные с испо ьзованием прайчерной комоннаи ш £t(JÄ/f-ACA \1sel~ACjCi (предстаален фрагмент гепя)

Было установлено, что внутривидовой полиморфизм анализируемых видов Solanum варьировал в пределах от 0 017 (между образцами вида S demissum) до 0 13 (образцы 5 sparstpdum) Для каждого из 8 выбранных видов бьгги определены уровни внутривидового полиморфизма Так, выявляемые уровни полиморфизма вида S kurtzianum составляли 0 04-0 Об, S stolomferum -0 06-0 08, S pinnatisectum-0 01-0 11, S chacocnse-0 03-0 08 Межвидовое разнообразие рода Solanum варьировало, как правило, в пределах от 0 1 (между видами S tuberosum и S andigenum) до 0 47 (между видами S pinnatisectum и S tuberosum) Однако следует отметить, что виды S tuberosum и S andigenum, выделяемые С М Букасовым, по систематике Дж Xovxca объединены в один вид, и представители S andigenum имеют статус подвида (Букасов, 1971, Hawkes, 1990) По всей видимости условной границей дтя выделения видовых таксонов у Solanum может быть величина генетических различий большая, чем 0 12

Также были определены генетические расстояния между различными сериями видов подсекции Potatoe Наибольшие генетические расстояния были выявлены между сериями Pmnatisecta и Tuberosa (О 32), наименьшие - между

сериями Acaulia и Demissa (0.18). При этом генетические расстояния между сериями Acaulia и Demissa меньше, чем между некоторыми видами серии Tuberosa. Сходство серий Acaulia и Demissa географически разобщенных видов подтверждается также данными более подробного анализа морфологического и экологического сходства (Ochoa, 1990, Spooner et al., 1995), а также RFLP анализа ядерного генома (Debener et al., 1990), что говорит о возможности их объединения.

При анализе межвидового и внутривидового полиморфизма представителей рода Solanum методом RAPD было выявлено 243 полиморфных фрагмента. Для каждого образца были получены уникальные RAPD спектры, характеризующиеся своими видоспецифичными фрагментами. Так же, как и в случае AFLP анализа, было показано, что внутривидовая вариабельность исследованных представителей Solanum соответствует диапазону генетических расстояний равных 0.02-0.11. При этом минимальные показатели генетических различий так же, как и в случае AFLP, были характерны для вида S. demissum (0.02 - 0.06). Максимальный уровень полиморфизма был получен для образцов S. chacoense. Межвидовое разнообразие соответствовало диапазону различий 0.15-0.49 и было сопоставимо со значениями межвидового полиморфизма, выявляемого у Solanum методом AFLP.

При проведении ISSR маркирования было получено 192 полиморфных фрагмента генома Solanum. В результате каждый вид и образец Solanum были охарактеризованы специфическими наборами . ISSR-фрагментов. Было показано, что внутривидовая вариабельность исследованных видов соответствует диапазону генетических расстояний, равному 0.04-0.13, в то время как межвидовая вариабельность соответствует 0.13-0.54. Как и в случае RAPD- и AFLP-маркирования наибольшей межвидовой вариабельностью отличались виды серии Tuberosa (S. incamayonese — S. gigantophyllum (0.25)) и Longipedicellata (S. pofytrichon - S. papita (0.25)). Серия Acaulia характеризовалась наименьшим уровнем межвидового полимрфорфизма (0.15). Интересно отметить, что уровень межвидового и внутривидового разнообразия, детектируемого с помощью метода ISSR, в целом для большинства видов Solanum несколько увеличился при приблизительно сходных диапазонах вариабельности AFLP-, RAPD-, ISSR-маркеров (табл.1).

Определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum.

Для определения филогении исследовавшихся видов Solanum были рассчитаны матрицы генетических расстояний с использованием коэффициента Жаккарда и проведен кластерный анализ методом UPGMA.

Табл I Межвидовые и внутривидовые уровни геномного полиморфизма V представителей грех родов 5о1апассае

[Образиы випов AFLP данные RAPD чадные ISSR данные

1 Род Solanum подсекция Potatoe

fS. chacoense 0 03 0 08 00;и'0 0 03 0 28

ÍV- demlssum 0 01 0 04 0 02 0 06 0 02 0 06

Л pmnatlsectum 0 04 0 П 0 02 0 10 0 0"" 0 13

fS1 tuberosum- S demissum 0 17 0 26 0 16 0 25 0 19 031

^SLtuberosum -S pinnatisectum 0 31-0 47 0 28 0 49 0 3Ь 0 54

серия Longtpedícellata 0 13 0 19 0 15 0 23 0 12 0 24

серия Pinnatisecta 0 110 18 0 13 0 20 0 09 0 16

* срия Tuberosa 0 J8 037 0 И 031 0 ^ 033

\\caulia- Demíssa 0 16 0 19 0 1*0 18 II 16 0 18

\4caulia - Pmnatsecta 0 32 0 38 0 ?0 0 4* 0 32 0 43

Pod Capsicum

С baccatum 0 04 0 08 0 03 0 09 001 0 10

< chacoense 0 06 0 13 0 08 0 13 0 0ч 0 12

|с аппиипг (сорта) 0 01 0 10 0 01 0Ü6 0 02 0 08

|С аппиит С galapagoense - 0 19 0 20 0 18 021

С extmlum-L cardenasii 0 17 0 18

C,frutescens С chínense 0 13 0 20 0 16 0 20 0 16 0 20

( Род Licopersicon

I- peruvianum 0 1' 036 0 12 0 32 0 4 0 26

У- pimptnelhfoUum 0 07 0 13 OOS 0 14 ОО^ОП

L. esculentum (сорта) 0 01 0 10 0 02 0 08 0 02 0 06

L.esculentum L.plmpinelllfolium- 0 07 0 14 С 08 0 24 0 12 0 22

В результате были построены AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммы (рис 1), отражающие филогенетические связи у анализируемых видов, а также проведен РСА (principal coordinate analysis.) анализ (рис 2) Денпрограммы полученные с помощью разных систем молекулярного маркирования, были сходны как по числу, так и по составу видовых кластеров и подкластеров В целом, проведенный анализ совпал с классификацией, основанной на морфологических признаках (Букасов, Камераз, 194S, Hawker, 1990) Так, виды, объединенные Дж Хоуксом и С М Букасовым в серию Pinnatisecta по данным молекулярного анализа также кластеризовались вместе Виды серий Pinnatisecta (S pwnatisectam S jamesit S michoacantum) и Bulbocastana (S bulbocostanum) на AFLP, RAPD и ISSR дендрограммах образовывали наиболее удаленные от остальных видов кластеры, что подтверждается данными РСА-анализа (рис 2) и совпадает с представлениями о сериях Pinnatisecta и Bulbocastana как наиболее древних таксонах подсекции Potatoe (Hawkes, 1990, van der Berg, Spooner, 2001) Проведенный молекулярный анализ также поддержал выделение серий Acanita (виды S acaule S albicans) и

М*С9 OwniM d*rri«t17 muiMls 13

р«рй»эв

polytr 4Q polytf 30 »tolonff *? •toionif «в itotanrf чв-t

chtcaB ehdco 10 СГМС013 cn*co 1) oar««» 20 gourt 23 9Üj«m2t incam 28

twslBpSl niiz-c«M4i

•peQBZ 44

рцгцавв watorSa tue«r 59 tubar S4

«nfligan 55 tuMr 60/2 tub*» 60/1

Kurtz 31 pinnai 5в l«meai 25

nvcftoac 32

pinnM 37

0.00 0.0в 0.Ю 0.15 0.20 0.25 0.30 0 35 0.40

Рис. 1. Дендрограмма генетических различий 47 представителей рода Solanum подсекции Potatoe, построенная на основе данных молекулярного анализа использованием метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) (STATIST1CA)

Longipendicellata (S. papiia, S. polytrichon, S. stoloniferum, S, fendleri, S. ajuscoense). Особый интерес представлял гексаплоидный вид S, demissum серии Demissa с крайне узким ареалом распространения в южных областях Мексики. S\ demissum согласно нашим данным был крайне близок к представителям южноамериканской серии Acaulia, с видами которой образовывал на AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммах один кластер. Такое родство геномов представителей серий Acaulia и Demissa отличалось от данных исходного морфологического анализа (Букасов, 1955, 1971, Hawkes, 1990). Сходство S. demissum и S. albicans было также показано в работе по RFLP-анализу ядерного генома видов серии Acaulia (Debener et al., 1990, Kardolus et al., 1998). Тесное родство этих серий географически разобщенных видов также подтвердил более подробный анализ морфологического и экологического сходства (Ochoa, 1990, Spooner et al., 1995, Kardolus et al., 1998). Обращает на себя внимание расположение на AFLP-, RAPD- и ISSR-дендрограммах образцов вида S. demissum в одном большом кластере с представителями серии Longipendicellata, что говорит о сходстве их геномов. Наши молекулярные данные подтверждаются ранее показанной возможностью участия диплоидного вида S. verrucosum серии Longipendicellata в происхождении гексаллоидного вида 5. demissum (Marks, 1955, Correll, 1962, Hawkes, 1990). Однако наши результаты не полностью поддерживали дробность, классификации рода

□-!- з н-- I —

--U- 1 i

ГЗ-1 !=Ь-!-:— :

г

•• ее

Р

$

о« as се о?

Factor 1

Рис 2 Филогенетические отношения представите 1ей рода Solanum выявтяемые методом РСА (principal component ana!vsis)(NTSYS) (буквами обозначены серии видов Т - Tuberosa (ТЬх- S kvrtz апит Г „ -дикорастущие виды серии Т с - ку ¡ьтинируемые виды ), В- Bulbocastara Р-Pinnatisecta A- Acauha Y- Yungasenia L- Longipedicellatu)

Solanum и выделение большой (до 25) серии видов (Hawkes, 1990, Бухасов, 1971) Так, сопасно анализу клоропластной ДНК, также не поддерживалась дробная классификация, и секция Petota под разлеталась только на четыре группы (Spooner, Castillo, 1997)

Объединение конкретных видов в серии, как это было предложено Дж Чоуксом и С М Букасовым, ставилось под сомнение и ранее (Spooner, van tier Berg, 1992, Spooner et al, 1995, van der Berg, 2002) Многие серии, выделенные на основе только морфологических данных, объединяли неродственные виды В ряде случаев таксономический статус серии и его дальнейшее дробление также ставились под сомнение Так, по данным филогенетического анализа, проведенного нами на основе комплексного молекулярного маркирования, виды серии Tuberosa подразделяется на две основные группы, а не на пять, как было предложено (Hawkes, 1990) Одна включает преимущественно культивируемые виды (S tuberosum S andigenum S phureja и S weberkaueri) другая - все анализируемые дикорастущие виды серии При этом не наблюдается более мелкого подразделения, предлагаемого Дж Хоуксом и основанного на ареалах видов Также не было совпадения с еше более дробной классификацией, основанной на эколого-географических сведениях по месту обитания и распространению вида (Юзепчук, 1938, Букасов, Камераз, 1948)

Наши данные о подразделении серии Tuberosa совпали с результатами AFLP, проведенного Дж. Кардолусом (Kardolus et al., 2000), который выделял третью группу, объединяющую виды S. tarijense (серия Yungastensa) и S. kurtzianum. По данным AFLP взятые нами в анализ 4 образца S. kurtzianum также образуют на дендрограммах обособленную ветвь, в то время как на RAPD- и ISSR-дендрограммах кластеризуются с дикорастущими видами секции Tuberosa. Представитель вида S. tarijense, относимый либо к серии Yungastensa (Hawkes, 1990), либо выделяемый в отдельную серию Tarijensa (Букасов,1971), на RAPD- и ISSR-дендрограммах также обнаруживает филогенетические связи с серией Tuberosa.

В целом, можно говорить о соответствии классификаций клубнеобразующих видов Solanum, основанных на морфологических и эколого-географических данных, и результатах филогенетических построений на основе молекулярного анализа генома(Букасов, 1971 , Hawkes, 1990). Были подтверждены границы видов. Также молекулярные данные подтвердили объединение видов в серии Pinnatisecta, Aeaulia, Longipendicellata. При этом были показаны значительные отличия генома видов Pinnatisecta от представителей других серий, что совпадает с представлениями о серии Pinnatisecta как более древней и примитивной и подтверждается морфологическими данными. Однако использование различных типов молекулярных маркеров не поддержало дробление серии Tuberosa, основанное на географии произрастания видов. Молекулярные данные однозначно подтвердили предполагаемое по результатам морфо-экологического анализа сходство геномов географически разобщенных видов S. demissum и видов серии Aeaulia. Для ряда видов (S. multidissectum, S. tarijense) показано филогенетическое родство с видами не своих серий.

3.1.2. Молекулярное маркирование генома методами RAPD, AFLP и ISSR и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon

Для молекулярного анализа методами RAPD и ISSR были подобраны 54 образца представителей 9 видов рода Lycopersicon. При этом виды L. peruvianum, L. parviflorum, L. pimpinellifolium, L. cheesmanii, L. esculentum были представлены 2-34 популяциями и/или разновидностями из различных мест произрастания, а также в анализ были взяты 10 сортов культурного томата. В AFLP-анализ было отобрано 23 образца рода, включающих представителей всех анализируемых видов.

При RAPD-маркировании 54 представителей рода Lycopersicon амплифицировано 248 полиморфных фрагментов ДНК. Для каждого из видов дикорастущего и культурного томата получены уникальные RAPD-спектры, характеризующиеся своими видоспецифичными фрагментами, ряд из которых

быт клонирован и секвенирован Наибольший уровень внутривидового почиморфизма наблюдался для L perimetrium (таит 1), что согласуется с ранее полученными молекулярными данными о геномной гетерогенности этого вида томата (Miller, Tanksley, 1990, Alvarez et al, 2001) Можно отметить, что в петом степень геномной дивергенции у перекрестноопыляемых видов (L hirsutum L peruvianum) значительно выше, чем у самоопыляечыч (L pimpinellifohum L parvißorum L cheesmann L esculentum)

На основании полученных RAPD-спектров были определены генетические расстояния между анализируемыми представителями рода Lycopersicon и, используя метод кластерного анализа (LPGMA), построена дендрограмма, на которой четко выделяются два кластера (рис 3) Первый образуют представители подрода Erioperstcon виды L hirsutum L peruvianum с разновидностями, L glandulosum L chítense L chmilewshi и L paruflorum, при этом близкородственные виды L chmilewshi и L pan. fit ¡гит формируют отдельный субкластер Сходство геномов этих двух видов выявленное в результате RAPD-чаркирования, подтверждается как морфологическими (Rick, 1979), так и молекулярными данными RFLP- и STMS-анализов (Smulders et al, 1997, Alvarez et al, 2001) Образцы L chítense и L glandulosum на дендрограмме не образуют обособленных ветвей, располагаясь внутри субкластера, образованного представителями гетерогенного вида L репмапит Второй кластер на дендрограмме образован красно плодными самоопылякншгоися видами подрода Lvcopersuon Eulycopersicon С Н Mull) - L pimpinellifohum L р mpinelhfolwm var racemigerum L cheesmami L cheesmanu var minor и L esculentum Уровень полиморфизма между этими видами подрода относительно низок (0 12-0 22) Виды L pimpinellifohum и L cheesmann обособлены от основных представителей L esculentum и образуют два субкластера Разновидности полVкультурного и культурного томата I. esculentum, за исключением некоторых представителей L esculentum ssp subspontaneum var ceratifoime, формируют отдельный субкластер При этом дальнейшее таксономическое деление L esculentum по результатам RAPD-анализа определить не удается

Трудности в молекулярной идентификации сортов L esculentum были описаны и ранее (Miller, Tanksley, 1990, Rom et al, 1495), и объяснялись высокой консервативностью генома томата С целью обогащения спектра при выявлении полиморфизма сортов томата отечественной и зарубежной селекции, в RAPD-реакции была использована двухпраймерная система При использовании двухпраймерной системы для каждого из анализируемых сортов томата был получен уникальный RAPD спектр При сортовой идентификации томатов нам не удалось детектировать сортоспецифические

фрагменты, за исключением сорта Талалихин 186. В отличие от межвидового, межсортовой полиморфизм томата значительно менее выражен, что соответствовало ожидаемым результатам и совпадало с исследованиями, проведенными на томатах ранее (Miller, Tanksley, 1990, Williams, Clair,1993, Rom et al., 1995). Можно предположить, что это связано с низкой вариабельностью генома L. esculentum, которую можно объяснить как

Генетические расстояния

Рис. 3. Дендрограмма 53 представителей 9 видов рода ЬусореЫсоп, построенная по результатам ЯАРО маркирования генома томата с использованием

метода иРСМА

естественной тенденцией к изолированию популяций томата благодаря самоопылению, так и ограниченным числом видов томатов, используемых при селекции новых сортов.

При проведении КвЛ-маркирования генома дикорастущих и культивируемых видов Ьусорегасоп было получено 304 полиморфных фрагмента генома. Показано, что количество фрагментов в КБЯ-спектрах и степень детектируемого полиморфизма пропорциональна вырожденности якорной последовательности используемого микросателлитного праймера. Для всех образцов Ьусорегекоп в спектрах амплифицировались видоспецифичные ^БЯ-фрагменты, часть из которых была клонирована. 1851*. также выявил

крайне низкий уровень межсортового полиморфизма генома культурного томата L esculentum (0 02-0 06)

В результате AFLP-маркирования 23 представителей видов и разновидностей рода Lycopersicon было получено 204 полиморфных фрагмента, что позволяло идентифицировать генотипы каждого анализируемого образца томата Величины геномного полиморфизма представителей рода, определенные в результате AFLP маркирования, были идентичны таковым, определенным в результате RAPD- и ISSR-анализов генома томата Внутривидовые геномные различия исследовавшихся видов варьировали в пределах от 0 03-0 23 (между образцами L esculentum sensu lato) до 0 15-0 36 (между образцами L регииапит) При этом геномные различия между образцами вида L peruvianum были значительно выше, чем различия между другими видами рода Lycopersicon Так, например, уровни межвидового полиморфизма L chmileusku и L parviflorum составляли 0 09-0 20 между L hirsutumiiL cheesmami - 0 21-0 28

Суммируя результаты проведенного комплексного молекулярного анализа генома видов, разновидностей и сортов Lycopersicon, можно отметить, что, используя каждый из методов, были определены генетические различия между видами рода Lycopersicon, популяциями видов L peruvianum L pimpinelhfohum и L esculentum а также современными сортами томата Наибольший уровень геномного полиморфизма детектировался у вида L рептапит При этом уровень внутривидовых различий L peruvianum ssp dentatum и другими представителями этого вида выше чем межвидовой полиморфизм L cheesmanti L pimpinelhfohum и L esculentum, что может говорить о возможности пересмотра таксономического статуса представителей вида L. peruvianum Филогения рода Lycopersicon, построенная по результатам RAPD, AFLP и ISSR, в большой степени совпадает с систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках и молекулярных данных ядерного и пластомного анализа (Palmer, Zarrnr, 1982, Miller and Tankslev, 1990) При этом следует отметить что представители вида L chetsmunu не выделяются в отдельный субкластер, а группируются вместе с представителями либо L pimpinelhfohum (RAPD, ISSR), либо с L esculentum (AFLP) Вид L cheesmami является эндемичным видом Галапагосских островов и, хотя и является близкородственным для L pimpinelhfohum и L esculentum, выделяется по всем классификациям в отдельный вид (Muller, 1940, Rick, Lamm, 1955, Храпалова, 1999) Данные молекулярного анализа 24 разновидностей и подразновидностей вида L esculentum не совпали с ботанической классификацией этого вида (Брежнев, 1958, Храпалова, 1949)

3.13. Молекулярное маркирование генома методами RAPD, AFLP и ISSR и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Capsicum

В анализ были взяты образцы ДНК 142 представителей 11 видов рода Capsicum, включающих как дикорастущие, так и культивируемые виды перца. Большинство исследовавшихся видов были представлены 4-27 образцами из различных мест произрастания. Было идентифицировано 1856 полиморфных фрагментов ДНК генома перца. Результаты, полученные при использовании различных систем мультилокусного маркирования, выявили значительное сходство данных о внутривидовом и межвидовом генетическом разнообразии рода Capsicum. При использовании различных молекулярных методов было показано, что внутривидовой полиморфизм исследовавшихся видов перца варьировал в пределах от 0.01 (между сортами С. аппиит) до 0.13-0.14 (образцы С. chínense). В свою очередь, межвидовое разнообразие рода Capsicum соответствовало диапазону 0.15-0.31. Величины генетических различий, равные 0.13-0.14, являлись условной границей, разделяющей под- и надвидовые таксоны рода Capsicum.

Проведенный тест Мантела (Mantel, 1965) подтвердил высокую степень корреляции между показателями генетического разнообразия образцов перца, полученных с использованием трех различных методов молекулярного анализа генома и конгруэнтность построенных на их основе дендрограмм.

Согласно результатам кластерного анализа, образцы исследовавшихся видов формируют на дендрограммах три основные таксономические группы, соответствующие трем комплексам близкородственных видов перца, каждый из которых включает как культивируемые, так и дикорастущие виды Capsicum (рис. 4). Последние, по всей видимости, представляют собой предковые формы современных культурных видов перца, что лежит в основе гипотезы о полифилетическом происхождении культивируемых таксонов рода Capsicum (McLeod et al., 1983). Обширный и полиморфный кластер на дендрограммах формируют виды, относимые к комплексу аппиит (С. аппиит, С. frutescens, С. chínense).

Наиболее актуальным таксономическим вопросом, связанным с этим комплексом, является вопрос об идентификации входящих в его состав видов, а, следовательно, правомочности их выделения как отдельных видовых таксонов. Трудность идентификации данных видов связана с их близкородственностью и, как результат, способностью образовывать межвидовые гибридные формы (Eshbaugh, 1993). Согласно нашим данным, представители каждого вида комплекса аппиит образуют на дендрограммах четкие видоспецифичные подкластеры, поддерживаемые высокими значениями бутстрепа (69-100%), тем самым подтверждая свои видовые

Рис 4 Ден дрофам via генетических различий 56 представителей 11 видов рода Capsicum, построенная на основе данных RAPD-анализа

статусы Близкородственные виды С frutescens и С üunerse формировали отдельные подкластеры, поддерживаемые высокими значениями бутстрепа (70%) Подкластер, объединяющий сорта С аппиит отличается самым низким уровнем генетического разнообразия в этой rpvnne видов (0 01-0 06) Не было также выявлено корреляции между дробной кластеризацией сортов С аппиит и их морфологическими признаками

Нами впервые получены молекулярные данные относительно филогенетического положения С galapagoense, недавно описанного и малоизученного вида перца, морфологически значительно отличающегося от других видов рода Capsicum (Heiser, Smith, 1958) Согласно этим результатам вид С galapagoense показал наибольшую степень сходства с представителями вида С pvtescens (0 17-0 20, RAPD-данные) и С аппиит (0 17-0 20, ISSR-данные), входя на дендрограммах в кластер генетического комплекса аппиит

Виды и разновидности перца, относимые к генетическому комплекс} baccatum (С baccatum var baccatum С baccatum var pendulum С praetermissum) на дендрограммах образуют отдельный кластер В противоположность мнению о том, что С praetermissum является разновидностью С baccatum (Bosland, Votava, 2000) образцы С baccatum и С praetermissum согласно полученным нами молекулярным данным, образуют компактные, удаленные друг от друга подкластеры (0 19-0 23),

поддерживаемые 100% бутстрепа, тем самым, подтверждая свои видовые статусы. Кроме того, в состав кластера комплекса baccatum вошел такой мало исследованный вид как С. tovarii. Ранее этот недавно описанный вид, согласно морфологическим данным, был отнесен к группе видов комплекса pubescens (Eshbaugh et al., 1983). Однако проведенный изоферментный анализ (McLeod et al., 1983) и анализ нуклеотидного полиморфизма последовательностей отдельных генов (Walsh, Hoot, 2001) не выявил родства между С. tovarii и другими комплексообразующими видами. Результаты же проведенного нами AFLP-анализа позволили детектировать сходство генома этого вида с геномами видов комплекса baccatum (100% бутстрепа), что совпало с данными гибридологического и цитологического анализов С. tovarii (Tong, Bosland, 1999).

Виды третьего генетического комплекса, комплекса pubescens, по данным молекулярного анализа, образуют отдельный полиморфный кластер, в котором наибольшее генетическое сходство отмечается между дикорастущими видами С. eximium и С. cardenasii (0.15-0.16) (98% бутстрепа). Действительно, оба диких вида имеют ряд схожих морфологических признаков, и, более того, это единственные виды из рода Capsicum, которые при скрещивании дают высоко фертильные гибридные растения (Eshbaugh, 1976). Представители культивируемого вида С. pubescens формируют несколько дистанцированный от дикорастущих представителей комплекса pubescens кластер, при этом наиболее близким С. pubescens видом в этой группе является С. eximium (0.220.24).

Согласно результатам молекулярного анализа, в зависимости от используемого метода маркирования, образцы вида С. chacoense проявляли либо большее сходство с представителями комплекса аппиит (0.16-0.24, ISSR-данные), либо с представителями комплекса baccatum (0.26-0.29 (AFLP), 0.200.23 (RAPD)), однако, при этом всегда формировали отдельный кластер, удаленный от остальных видов рода Capsicum, что подтверждалось результатами РСА. Полученные данные также совпали с результатами проведенного нами, молекулярного маркирования отдельных семейств генов, а также данными изоферментного анализа, где С. chacoense был охарактеризован как вид, равноудаленный от всех комплексообразующих видов перца (McLeod et al., 1983). В совокупности с данными о географическом распространении вида С. chacoense все вышесказанное позволяет сделать предположение о возможной роли данного вида как предкового для представителей всех трех комплексов близкородственных видов перца. И тогда отмечаемая нами нестабильность положения кластера С. chacoense относительно других групп видов Capsicum, зависящая от типа маркируемых последовательностей, могла бы отражать величину генетического вклада С.

сhacoense как предковой формы в геномы той или иной группы видов-потомков

Таким образом, основываясь на данных комплексного молеку шрного анализа, а также данных морфологии (Eshbaugh, 1480), межвидовой гибридизации (Tong, Bosland, 1499), цитологического анализа (Pickersgill, 1979), анализа ферментов (Jensen et al, 1979, McLeod et al, 1983) и анализа нуклеотидного полиморфизма спейсера хдороптастных atpB rbcL генов (Walsh, Hoot, 2001), мы предлагаем выделять следующие комплексы близкородственных видов перца

комплекс аппиит - дикорастущие и культивируемые формы С аппиит С Jrutescens, С chínense, а также вид С galapagoense,

комплекс baccatum - дикорастущие С tovaru С praetermissum, С baccatum var baccatum и культивируемая форма С baccatum var pendulum

комплекс pubescens - дикорастущие виды С eximium С cardenaiu культивируемый вид С pubescens,

комплекс chacoense — дикорастущий вид С chacotnse

3.2. Анализ полиморфизма основных семейств генов (RGA-, MADS- и РК-генов) у представителен сем. Solanaceae методом DDP- маркирования

Помимо анализа случайных последовательностей генома Solanaceae, проведенного посредством AFLP-, RAPD-, lSSR-маркирования, представляло интерес исследование вариабельности адаптивно-значимых семейств генов растений, таких как гены резистентности, MADS-box гены и гены протеинкиназ Для характеристики генетического разнообразия этой части генома Solanaceae впервые был использован разработанный совместно с группой X ван ден Линдена (PRI, Wagemngen, the Netherlands) метод домен-направленного маркирования (Domain Directed Profiling, DDP) Были разработаны модификации метода для маркирования семейств генов, содержащих специфические консервативные домены, такие как домены генов устойчивости (VBS-LLR), домены гомеозисных генов (MADS box) и домены серин/греониновых протеинкиназ Модификации метода DDP-маркирования были обозначены как NBS-маркирование (NBS-proflhng), MADS-маркирование (MADS box-profiling) и РК-маркирование генов протеинкиназ (PK-profiling)

Разработка вариантов метода DDP маркирования генома DDP-метод основан на использовании в селективной амплификации специфических вырожденных праймеров, гомологичных последовательностям консервативных доменов исследуемых семейств генов Для методики NBS-маркирования семейства генов резистентности (R-генов и RGAs) были разработаны

специфические праймеры к различным участкам NBS-домена: kinase-2 мотиву (NBS5A, NBS6), GLPL- мотиву (NBS9) и мотиву Р-петли (NBS1, NBS3), включающему последовательности TIR/non-TIR доменов. Было показано, что NBS праймеры, комплементарные одному и тому же мотиву, но несколько отличающиеся по расположению и нуклеотидному составу, могут приводить к амплификации различных NBS-спектров и, таким образом, генетическая вариабельность, детектируемая при NBS-маркировании, может быть увеличена путем адаптации праймерных последовательностей для маркирования новых RGAs. Возможность проведения NBS-маркирования, высокая специфичность и воспроизводимость полученных спектров были показаны нами не только для видов и сортов Solanaceae, но также и для представителей сем. Роасеае (виды и образцы Aegilops, виды Triticum, сорта твердых и мягких пшениц, виды и сорта Hordeum, подвиды Oriza sativa), Oleaceae (род Syringa) и Brassicaceae (экотипы Arabidopsis thaliana).

Для определения степени представленности R-генов и RGAs в NBS-спектрах проводили секвенирование и последующий анализ полученных NBS-фрагментов картофеля и томатов. Большинство проанализированных фрагментов (в случае NBS5 и NBS9 до 90%) были гомологичны известным последовательностям R-генов и RGAs различных видов растений. Ранее был опубликован ряд методик для определения уровней полиморфизма и биоразнообразия локусов, определяющих устойчивость к фитопатогенам (Waugh et al., 1997, Chen et al., 1998, Hayes et al., 2000), однако частота встречаемости RGA-последовательностей в спектрах не превышала 25% (Hayes et al., 2000). В случае NBS-маркирования, принимая в расчет все использованные праймеры и рестриктазы, для всех видов растений встречаемость RGAs в спектрах составляла 50-90%.

Принципы анализа семейства генов, имеющих консервативную доменную структуру, положенные в основу метода NBS-маркирования генов устойчивости, были использованы для разработки метода маркирования семейства гомеозисных MADS-box генов (MADS-маркирование) и генов серин-треониновых протеинкиназ (РК-маркирование).

Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Solanum. Метод NBS-маркирования был использован для широкомасштабного анализа полиморфизма NBS-LRR генов резистентности и их аналогов у 445 сортов картофеля европейской и отечественной селекции, а также 12 видов Solanum, наиболее активно использующихся при селекции новых сортов картофеля в рамках международной программы GEDIFLUX.

В анализе было использовано 6 комбинаций NBS-npañMep\ рестриктаза. Каждая из комбинаций приводила к амплификации 30 (NBS5A+NBS6) — 70 (NBS9) фрагментов. Для каждого анализируемого образца картофеля реакция

проводилась вповторах, и полученные спектры (рис 5, соседние дорожки) были идентичны, тем самым еще раз подтверждая высокую воспроизводимость DDP-спекгров Всего было получено 173 фрагмента 4BS-LRR семейства генов, 115 из которых были полиморфны Быт определен уровень полиморфизма RGA-фрагментов у дикорастущих видов Solanum, который составляет в среднем 0 26, что значительно выше такового у сортов картофеля (0 11) При сравнении уровней вариабельности RGA-фрагментов у дикорастущих Solanum с другими представителями сем Solanaceae было показано, что он несколько превышает уровень полиморфизма дикорастущих видов рода Capsicum и, по крайней мере, в два раза выше внутривидового RGA-полиморфизма у рода Lycopersicon

I Л 3 4 S 6 7 S Ч 10 11 12 и 14 15 ¡6 Г 1» 19 20 21 22 23 24 2* 26

Рис 5 NBb маркирование видов Solanum ( дор 1-10) и сорлов S tuberosum отечественной селекции (11-26) ( -*- - ссквенированные VBS-фрагменгы) (представлен фрагмент геля)

На дендрограмме, построенной на основе рассчитанных расстоянии генетического сходства, 445 сортов картофеля объединяются в довольно большое количество (>45) различающихся по размерам кластеров Были определены группы сортов, наиболее дивергентных по присутствию в их геноме NBS-LRR последовательностей Также определены группы сортов, для которых не было выявлено различий в MBS-спектрах и которые, вероятно, обладают одинаковым или очень схожим набором генов резистентности и аналогов генов резистентности Касаясь вопроса возможной генетической эрозии у современных сортов, можно отметить, что предварительный анализ пула R-генов, определенных для сортов, полученных в различные периоды XX века, показал сходные уровни полиморфизма и не выявил его снижения и генетической эрозии

Таким образом, метод NBS-маркирования был впервые использован для характеристики генетического разнообразия последовательностей семейства генов устойчивости и их аналогов у видов и сортов картофеля Выявленный

высокий полиморфизм RGA-последовательностей Solanum может отражать разнообразие существующих генов устойчивости к патогенам у различных видов, а также может быть связан с точковычи мутациями в сайтах рестрикции одного гена, которые не влияют на изменение специфичности в узнавании патогена В любом случае, полученные данные о представленности RGA-последовательностей у конкретных генотипов видов и сортов картофеля отечественной и европейской селекции позволят более обоснованно подходить к подбору родительских форм при селекционной работе

Молекулярный анализ семейства генов устойчивости, MADS- генов и генов протеинкиназ у представителей рода Capsicum. NBS- маркирование генома перца позволило впервые оценить уровни биоразнообразия R-генов и их аналогов у 57 представителей видов и сортов Capsicum Было получено 163 полиморфных RGA-фрагмента генома Capsicum При этом каждый вид перца был охарактеризован определенным набором RGA-маркеров, отражающим специфичность его устойчивости к патогенам Ряд маркеров присутствовал в спектрах лишь отдельных образцов перца Неожиданно высокий уровень

Рис 6 Дендрограмма генетических различий 57 представителей 11 видов рода Capsicum построенная на основе данных NBS маркирования

полиморфизма RGA-последовательностей (82 9%) был показан для дикорастущих представителей С' аппиит из Никарагуа и Гватемалы, в то время как уровень полиморфизма сортов С аппиит был крайне низок и составил

28.6%. Столь значительные отличия между RGA-генотипами дикорастущих и культивируемых представителей С. аппиит, с одной стороны, могут говорить об ограниченности пула генов устойчивости, вовлекаемых в создание сортов, а с другой стороны, демонстрируют возможный генетический потенциал использования дикорастущих С. аппиит в будущих селекционных работах. Секвенирование полиморфных RGA-фрагментов спектра NBS5A+6/MseI и их последующий анализ показал, что около 43% из них гомологичны последовательностям уже известных генов устойчивости или RGAs.

Особый интерес в работе представляло исследование филогении полученных при использовании метода NBS-маркирования последовательностей NBS-LRR семейства генов резистентности и их аналогов у видов рода Capsicum. Для каждой из комбинаций были рассчитаны матрицы генетических расстояний и построены дендрограммы (рис. б). Учитывая адаптивность генов резистентности, несколько неожиданным оказался тот факт, что топология RGA-дендрограммы совпадает с топологией AFLP-, RAPD- и ISSR дендрограмм: состав видовых подкластеров, а также кластеры групп видов, составляющих генетические комплексы у Capsicum практически полностью сохраняются (рис.6). Вариации касаются лишь положения кластера, сформированного представителями вида С. chacoense, который значительно обособляется от других видов. В целом же проанализированные образцы перца внутри своих мега-кластеров образуют компактные видовые подкластеры, которые, как правило, не смешиваются с представителями других кластеров. Исследование полиморфизма семейства гомеозисных MADS-box генов и генов, кодирующих протеинкиназы перца, как и в случае RGA-маркирования, позволило выявить целый ряд видо- и комплексоспецифичных фрагментов генома перца. Всего при MADS-маркировании было идентифицировано 30 видоспецифичных фрагментов. Наибольшим числом видоспецифичных фрагментов, выявленных с помощью комбинаций MADS5'R/Mre/, MADS3 'RJMsel характеризовались спектры представителей С. chínense (6 фрагментов) и С. tovarti (5 фрагментов). Специфические маркеры были получены для видов составляющих комплекс аппиит (5 фрагментов) и комплекс pubescens (1 фрагмент). 18 MADS-фрагментов были обнаружены в спектрах отдельных образцов видов перца. В целом, как и предполагалось, полиморфизм MADS-фрагментов Capsicum оказался ниже, чем полиморфизм RGA-фрагментов. Данные о более низкой вариабельности MADS-box генов, в принципе, согласуются с представлениями о природе этого семейства последовательностей, которое, в отличие от быстро эволюционирующего RGA-семейства, являются более консервативными (Theissen et al., 2000). Проведенный молекулярный анализ полиморфизма генов

протеинкиназ также выяви! относительно низкий уровень вариабельности РК-фрагментов у перца по сравнению с RGA-полиморфизмом Исключение составили представители видов С frutescens и С chínense (около 50%)

Секвенирование голиморфных фрагментов спектров РК4¡\lsel выявило ряд ранее ^охарактеризованных последовательностей генома перца, гомо югичных генам протеинкиназ томата LePK2, LePK3 LePK5 и картофеля StPKl Проведенный анализ филогенетического родства по результатам DDP-маркирования генома перца показал, что филогения Capsicum, основанная на данных о полиморфизме RGA-, MADS-, РК- последовательностей в цепом

Рлс 7 PK спектры образцов перца, полученные с исшгьзованием праичера РК4 (приведен фрагмент геля стрелками указаны РК-фрагменты гомо юшчные генам гротеинкиназ томата и картофеля)

сходна с филогенией этого рода, основанной на данных молекулярного анализа селективно нейлральных маркеров генома перца

Таким образом, разработанный совместно с группой X ван ден Ландена (PRI, Wagemngen, the Metherlands) DDP-метод мультгоюкусного анализа может широко применятся для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений DDP спектры высоко насыщены специфическими маркерными последовательностями генов и аналогов генов резистентности (NBS-маркирование) гомеозисныч генов (MADS-маркирование) и генов протеинкиназ (РК-мархирование) Корреляция между NBS-чаркерами и устойчивостью к фитопатогенам говорит о том, что данный подход может быть пригоден для поиска молекулярных маркеров, ассоциированных с признаками устойчивости к фитопатогенам у различных растении Кроме того, маркерный фрагмент может сам быть стартовой точкой для идентификации и клонирования новых генов Как было показано для видов и сортов картофеля, томата и перца, метод DDP-маркирование может быть использовано в качестве нового подхода для поиска генов хозяйственно-ценных признаков у дикорастущих сородичей сельскохозяйственных культур Также полученные спектры могут быть использованы для филогенетического анализа соответствующих семейств генов

3.3. Модификация метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном инсерционном мутагенезе

Отдельный интерес при анализе генома представляют области интеграции мобильных элементов, составляющие значительную часть растительного генома, что предполагает их первостепенную роль как в структурной организации, так и в эволюции генома растений (Turcotte et al., 2001, Bennetzen, 2000, 2002). Способность мобильных элементов генерировать мутации активно используется для получения мутантных коллекций различных растений, в том числе представителей сем. Solanaceae, таких как табак, томат и картофель (Yoder et al., 1988, Knapp et al., 1988). Метод TAIL PCR был модифицирован нами с целью использования его для анализа фланкирующих последовательностей сайтов инсерции Ds мобильного элемента при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе. Были разработаны специфические праймеры, комплементарные 5'- и З'-концам Ds-транспозона и случайные вырожденные AD-праймеры. Была показана возможность использования TAIL PCR фрагментов непосредственно, без предварительного клонирования для прямого секвенирования, а также в качестве зондов для сканирования фаговых, YAC- и ВАС-геномных библиотек. Используя систему ^elDs-транспозон маркированной ловушки генов (gene-trap lines), была получена мутантная коллекция линий арабидопсиса. Была показана высокая эффективность использования метода TAIL PCR для анализа фланкирующих транспозон последовательностей генома. Анализ методом TAIL PCR линии 59-5, характеризующейся эмбрио-летальным фенотипом в результате интеграции Ds-транспозона, позволил идентифицировать последовательность гена-мишени. Анализ транслированной аминокислотной последовательности выявил гомологию с рибосомальным белком RPS16 Е. coli. Ген этого белка, ранее у растений неидентифицированный, был нами обозначен как SSR16. Предполагается, что белок SSR16 участвует в сборке и стабилизации рибосомы, а также играет важную роль, либо качественную, либо количественную, в эмбриогенезе растений на постглобулярно-серцевидной стадии развития эмбриона. Было проведено картирование гена SSR16. Он был локализован на хромосоме IV между генами сег2 и АР2 (рис. 8).

_19сМ_

, 8сМ „ 4_10сМ „

_СН2_CER2_SSRI6_'_ÂP2

44сМ 52 сМ 60 сМ 68сМ

Рис.8. Локализация гена SSR16 на генетической карте IV хромосомы (положение на карте определено в результате анализа >100 растений Fi)

3.4. Исследование нуклеотидного полиморфизма гена 5.8S и транскрибируемых спенсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК у представителей сем. Solanaceae

Последовательности рибосомной ДНК (рДНК) широко применяются для исследования генетического разнообразия и реконструкции филогении у растений (Baldwin et al, 1995, Яцентюк и др , 2001, Marens et al, 2003) Был проведен сравнительный анализ полиморфизма ITS 1-5 8S-ITS2 фрагментов рибосомных оперонов у представителей родов Solanaceae для оценки межродовой и внутриродовой вариабельности области рДНК, а также для сравнения с данными, полученными для других участков генома

Для анализа полиморфизма ITS-фрагментов рода Solanum были взяты образцы ДНК индивидуальных растений 8 видов, представляющих различные серии подсекции Potatoe Всего было выявлено 200 точечных замен Из них 85 (42 5° о) были трансверсиями, 115 (57 50/о) - транзипиями При этом преобладали G—С грансверсии и Т—С транзиции. Показано, что расположение точковых замен в ITS последовательностях неравномерно, были выявлены области с повышенным (.«держанием нуклеотидных замен Наибольшее количество изменений детектировалось в спейсерном участке ITS1

Филогенетический анализ и исследование степени дивергенции районов рДНК у разных видов Solanum показал, что ITS-последовательности культивируемых видов серии Tuberosa и сорта вида S tuberosum кластеризуются вместе Дикорастущие виды этой же серии-Л' s;ourluvi и V spegazzini- образуют субкластеры с представителями других серий с S chaeoense (серия lungasensa) и S polvtrichon (серия Lon^ipediallata) соответственно Наиболее дивергентным является S IvcopersicoiJes, образующий на дендрограммах отдельную ветвь вид и представляющий другую подсекцию Petota - Estolonifera В целом полученные дендрограммы была сопоставимы с данными мультилокусного маркирования

Анализ аналогичного фрагмента ITS 1-5 8S-ITS2 районов рибосомального оперона представителей рода Lycopersicon выявил 178 точечных замен Так же, как и в случае анализа последовательностей рДНК видов Solanum, наиболее частый тип замен был представлен А-С транзициями, в то время как преобладающие транзиционные изменения были Т— С rana Сравнение ITS 1-последовательностей Solanum и Lycopersicon показало большую консерватвность miro района генома у видов и сортов томата Так, например количество нуклеотидных замен, отличающихся у двух видов томата L esculentum и L piirpinellijolnim (9) было меньше количества замен у сортов S tuberosum (11) Наибольшие изменения анализируемого ITS 1-5 8S-

ITS2 района были выявлены у представителя вида L. kirsutum, в то время как по результатам RAPD- и ISSR-анализа наиболее дистанцированным видом был L. peruvianum. Сравнительный анализ с аналогичными фрагментами рибосомного оперона видов Solanum также показал неравномерное распределение точковых замен в ITS-последовательностях, при этом области повышенной локализации замен у видов картофеля и томатов совпадали.

Неожиданные результаты были получены при анализе нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 района рДНК представителей 9 видов рода Capsicum. Амплификация этого района у индивидуальных растений видов перца выявила полиморфизм ITS-фрагментов не только по размеру, но и по их числу в спектрах. Так, у большинства видов перца детектировалось по два ITS-фрагмента. Фрагмент длиной 735 н.п. присутствовал в спектрах всех образцов перца. Второй, более короткий фрагмент, несколько различался по длине у разных видов Capsicum (рис. 9).

650 н.п._

Рис. 9. Результаты PCR -амплификации района ITS1-5.8S-ITS2

1- L. peruvianum, 2- С. cardenasii, 3- С. galapagoense, 4- С. pubescens, 5- С. baccatum, б, 7- С. chínense, 8- С. chacoense, 9- С. аппиит, M - lkb ladder ("Gibko BRL").

Ранее такой полиморфизм длин амплифицированных ITS-фрагментов и одновременное присутствие в геноме двух различающихся по длине копий ITS1-5.8S-ITS2 района не был описан ни для Solanaceae, ни для других представителей высших растений. Исключение составили виды рода Lophocereus (сем. Cactaceae), у которых были идентифицированы две разлетающиеся по длине, функциональная и нефункциональная (псевдогенная), копии ITS-района (Hartmann et al., 2001).

Сравнительный анализ последовательностей 20 клонированных как длинных (ITSL), так и коротких (ITSS) фрагментов рДНК 14 индивидуальных растений 9 видов рода Capsicum показал, что степень гомологии ITSL и ITSS для разных видов перца была достаточно низка и в среднем составила 70.174.6%. При этом по последовательности ITSS- фрагмента наблюдался больший полиморфизм. Выравнивание полученных первичных последовательностей ITSL и ITS S перца обнаружило наличие у 5 видов перца (С. galapagoense, С. chacoense, С. praetermissum, С. baccatum, С. аппиит) одинаковой 43-нуклеотидной делеции в ITSS с 126 п.н. по 169 п.н. относительно начала ITS1-

фрагмента (рис 10) Таким образом, в результате проведенного исследования была выявлена уникальная внутригеномная вариабельность ITS-последовательностей у видов Capsicum, связанная с присутствием в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК- ITSL и ITSS Как мы предполагаем, данные типы рДНК поддерживаются и эво хюиионируют в геноме перца независимо, что может быть связано с наличием у видов перца нескольких (2-14) локусов рибосомных оперонов, расположенных на разных хромосомах (Youn-Kyu et al, 1999)

Сравнение выравненных ITS последовательностей представителей всех трех родов показало большее сходство ITS1-5 8S-ITS2 районов рибосомных оперонов Solanum и Lycopersicon Последовательности Capsicum (в анализ брались только ITSL) значительно отличались от них как по размеру, так и по количеству нуклеотидных замен и протяженных инделел Наиболее консервативными районами исследованных последовательностей рибосомного оперона был ген 5 8S Во всех случаях в ITS-последовательностях

« л «и А , A-GAGAACCTTTC TT ^ТА^А'-лТОСА'ПЗСЛС; I. А1.~АГ J, ^ > ЛЬ'.А^.ГЛ..

С. Л АГ.А-.А: * „TTTT f" -CC- .«T.aCATGCACCCAG-AC.ACT -TCGGGCGACTAATGAACCCCAA „*.AAAAA~'_AA(..AA,.~>AATAC" „AAATT

ft -v; * ? L AGCACNAGAACCTT'-CC T ^TC T-AG-GCATGCAC „A5TACG-GCGTGGSC-ACTAATGAAC -AACuCAGAAAu^A ГААТТАА'А A

a. #45 AaCAC-A-AACC- Г . A ДАТ".АА:: С!*ААС— ^АЛЛА , АГ VAA;.:AA~A„'—АААТТ

ann«40t. AGCAC**AGAA r""f "ССТС Т'' TUT'А ТСГ:Л.ЛТ'АСГ^:(ТС:С'"" ^i^.A.jA _ Т АА Т.АА^ГТ^ААС.^ ЛХА А А''; А А.А: А.ЛАТ А- Т 'AAA ""

«т. •» А ,_А" .А ,АА —"Г ~ - 1 -CGG-CCATGU^CCCAG-ACaC-» -Т АС.АС AA"t: АЛ" ААГ"':" :АААА.....А ,АА^АА~А —AAA Т

Я . * 1 - AGCACCAOAAC TT С TCATCCTC^TSvA-OCACCCAGTATGCGCGCCGGGCSA-TAATGAATACCAA G_AAAAAGCACCAAGi*AATA 1 Т AAA -

bi ffisx. A_:_A -CA- .AC-ACAC:;-„T...~.,AC™AATV.;AA:JC~,AA:A:TAAAA.~A„ AA ,.A6"-A.."'AAA7~

fca HISS uTACCAGCuC*" ^ - CC'-AÄ .A.AA/v^ A.-AAiA-A A~ 6 f-.AAT

jл I 4 C'.VAC jAW^AI С СЧ. -C " С - UC-A-^_I>GAAAGCACCAAGuAA1A^T AAA-C

pr»*V a j-A^vjA-CvJOC ,T — ^TJ30GCGvAAA3C~-„AA3GAATJVC?"AAA'~"

arg#39S C3CACiWlm.QC*"" " TT—CC - - -CCAG-GCa-AAAG-OCCAAGGAATACATAAAT-

*оо*4Эа С,.. А GC "CCCC TT?— ----- - ---- :„ A.^.A:^TAAA:;T:;C.CAA~,AATA..A ! AAA~.T

С «MS SUi-GASCuCC-^C ТЦ-^С — -CCAG"G «GAAAGMC^AAuGAATACA""AAAT-

tM#5 Ci^TACGA^CGCC-CCCC-C—- T Г___ — -GCGCtKCGGGCAAC\JVACGAAC-CC3^^3*-AAAGCGCCAAGGAA-A~~r_J>AT~

h »5w C^-ACuAGCGC^-Ct-C.- С -TCC"*CGG-i*_ ÜCaC3CCG3GCAACCAACGAACTCC3Gi-»^JlAAu*, .ЛА* . .AATA ; AA~:

CATACGAGCACI"COrC-C—.AAAATA 1_AAGGAATAC~TAAAT-

I'l'-j T^-ATuATCuCC-CC-CCTTG- U^-A^-AAJTA .AAA..ТЛАТЛ-1 TACAT

Рис 10 Выравнивание последовательностей области 1TS1-S 8S ITS2 фрагментов ITSL и ITSS видов Capsicum (приведен фрагмент выравнивания)

расположение точковых замен было неравномерно Были выделены участки с повышенным содержанием замен и более консервативные районы, что связано, по всей видимости, с тем, что ITS-районы формируют необходимые вторичные структуры для правильного вырезания некодируюших районов три созревании транскрипта рРНК Наибольшей консервативностью ITS последовательностей и генов 5 8S отличался род Lycopersicon Род Capsicum характеризовался одновременным присутствием в геноме двух дивергентных типов рДНК- ITSL и ITSS, последний из которых, по всей видимости, является нефункциональной делегированной копией (псевдогеном) полноразмерного рибосомного оперона

Гахже был проведен сравнительный анализ межвидового полиморфизма ITS 1-5 8S ITS2 районов рибосомных оперонов у представителей различных родов сем Solanaceae и сем Роасеае (Злаковые) и выявлены даачительные

различия в эволюционировании этих участков генома. Скорости межвидовой дивергенции нуклеотидных последовательностей рибосомных оперонов у представителей сем. Solanaceae существенно превышали таковые у представителей сем. Роасеае.

3.5. Детекция SNP в генах Lycopersicon esculentum и Solatium tuberosum и SNP- маркирование генома сортов картофеля.

Точковый нуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) представляет собой мононуклеотидные замены, а также 1-3 нуклеотидные инсерции и делеции между гомологичными фрагментами ДНК. Круг видов, для которых были определены SNP и показано их применение для генотипирования, крайне узок и включает на сегодняшний день лишь такие культуры как кукуруза, соя, арабидопсис и рис (Nasu et. al., 2002, Jander et. al., 2002, Batley et. al., 2003).

В данной работе была проведена идентификация новых SNP в областях экзонов генов Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum, выяснение возможности их использования для широкомасштабного генотипирования и определения аллельного состояния генов у сортов картофеля. Подбор последовательностей ДНК известных генов Solanaceae для последующего выявления SNP проводился in silico с использованием баз данных SOLGENES и TIGR. Основными критериями отбора служили наличие у гена известной функции и расположение генов-мишеней на различных хромосомах\плечах хромосом для более широкого охвата генома. В целом из генбанков SOLGENES и TIGR было выбрано 84 кодирующих последовательности генов с известной функцией.

Для выявления SNP полиморфизма все выбранные праймеры были использованы для амплификации геномной ДНК 4 сортов томатов и 4 сортов картофеля, которые были получены из разных селекционных центров и, следовательно, потенциально имели наименее родственные геномы. Всего праймеры к 84 отобранным последовательностям экзонов амплифицировали 51 фрагмент ожидаемого размера, которые затем секвенировались. Всего было выявлено 120 нуклеотидных замен, 67 (56%) из которых были представлены трансзициями и 53 (44%)- трансверсиями.

В результате проведенных исследований были отобраны 45 SNP-маркеров в 35 различных генах Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum, которые могут быть использованы для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля, а также для маркирования генов и отдельных хромосом при проведении маркер-ассоцированной селекции. Было показано, что полученные SNP-маркеры являются специфичными для геномов

Lvcopersicon и Solanum и не могут быть использованы для анализа представителей рода Capsicum

Для массового анализа SNP у 350 сортов тетраплоидного картофеля был впервые использован метод мультиплексного пиросеквенирования, представляющего собой неэлектрофоретическое определение последовательности нуклеотидов в реальном времени (Ronaghi et al, 1998, Purmanad et al, 2002) Интенсивность сигнала в пирограмме коррелирует с количеством нуклеотидов, встраиваемых ДНК полимеразой Возможность количественной оценки и дискриминации различных аллельных вариантов SNP у тетраплоидного картофеля (4 0, 2 2, 3 1) явилась решающей при выборе метода детекции SNP (рис 11 ) Для адаптации метода пиросеквенирования к особенностям генома картофеля и возможности проводить мультиплексные реакции в стандартную методику нами были внесены некоторые модификации Для определения аллельного состояния и степени гетрозиготности 350 сортов картофеля были отобраны шесть SNP (LeMIR (/VC), СТ41(А\Т), САГ(Т\С) CWCH(A\T), PPC {A4}), ST206 (A\Q) Для каждого SNP был определен процент встречаимости каждого аллельного варианта Он оказался неодинаков, хотя в большинстве случаев у сортов детектировалась гетерозигота по SNP 2 2 Только в случае ST206 у сортов преобладала гомозигота 4G Для SNP LeMIR и РРС ни у одного из сортов не было выявлено гомозиготы 4С и 4G, соответственно, что, по всей видимости можно объяснить летальностью или понижением жизнеспособности в случае гомозиготного состояния SNP по этому HV клеотиду Как известно, точечные замены могут приводить к аминокислотным заменам в функционально значимых доменах или к образованию сайта герминации транскрипции, что в с iv чае гстеро ¡иготы может компенсироваться дозовым эффектом других чроматид, а в с 1\чае гомозиготы приводить к летальности

В результате для каждого из 350 сортов проведено SNP генотипирование, то есть определение совокупности отдельных вариантов и определение степени гетерозиготности шести анализируемых SNP-локусов Наиболее часто встречающимся генотипом был AvClkmir ЗТ\А cwi Л\'ГСНШ G\Gst206 A Gppc, ТС саг Для 138 сортов (38%) был характерен уникальный SNP генотип

3.6. Анализ полиморфизма чикросателлитных локусов ядерного генома

Solanaceae

Благодаря целому ряду свойств микросателлитов (SSRs Simple Sequence Repeats) таких как высокий уровень вариабельности, кодоминантность, простота детекции с помощью PCR, микросателлитные

повторы стали одними из наиболее популярных типов маркеров при исследовании внутривидового генетического разнообразия, популяционном анализе, предоставляя возможность оценки размеров генетического дрейфа и уровня инбридинга, а также при генотипирования отдельных образцов (Powel et al., 1996, Smulders et al., 1997, Ashkenazi et al., 2001, Wunsch, Hormaza, 2002). Высокая плотность и равномерность распределения по геному микросателлитных последовательностей делает их идеальными генетическими маркерами для построения насыщенных генетических карт (Milbourne et al., 1998, Gianfranceschi et al., 1998). Микросателлиты, расположенные в области промотора, оказывают влияние на экспрессию гена и приводят к модификации функций белка (Gerber et al., 1994, Perutz et al., 1994, Kashi et al., 1997). В основном микросателлитные маркеры применяются для идентификации и паспортизации сортов, а также для разработки диагностических маркеров важных агрономических признаков (Yu et al., 1994, Powell et al., 1996). Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов Solanum. Было проведено исследование возможности использования 19 микросателлитных локусов картофеля и томатов, которые имели различное местоположение локализацию, преимущественно на разных хромосомах, для маркирования 32 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции и анализа полиморфизма 11 видов Solanum, использующихся в селекции новых сортов и представляющих основные серии (Acaulia, Demissa, Longipedicellata, Pinnatisecta, Tuberosa и Yungasensa) подсекции Potatoe.

Табл.2. Аллельные варианты микросателлитных локусов 11 видов Solanum .

Виды Solanum ST47 ST83

F G i> I J К L M A в E D í С I N G O

с X s «N * <N a (< X 3 tí * s <N tí * O fN £ «N tí § »N tí к s «N IN tí * «N •3 с a: «o oí с X «»-» в * ©\ с с ОС В * KÍ e ai go в % S

S. acaule + +

S. ckacoense +

S. demissum + +

S. jamessii +

S. киЩшпит + +

S. pinnatisectum + +

S. spegazzini

S. stoloniferum + +

S. vernei +

S. phureia +

S.tuberosum +

S. tuberosum (сорт Раменский) + +

В результате предварительного тестирования праймеров для SSR-iokvcob проведенного на образцах ДНК одного дикорастущего вида картофеля и трех сортах S tuberosum были отобраны 9 микросателлитных локусов SSR1 STGBSS STM2005 STOAC58 STRBCSlb, STWIN12G STACC4S3 ST15 ST47 и STS3

Анализ межвидового полиморфизма двух микросателлитных юкуеов ST47 и ST83 был проведен у 11 видов картофеля В результате было детектировано 16 аллельных вариантов, большинство из которых были видоспецифичны Исключения составили виды S jamessii и S pinnatisectum, относящиеся к одной серии Pinnatisecta Представители данных видов имели одинаковые типы аллелей анализируемых SSRs Виды наиболее представленной в анализе серии Tuberosa характеризовались значительным ал!'с"ьным полиморфизмом микросателлитных токусов Каждый вид имел свой видоспецифичный аллельный вариант

Для исследования внутривидового полиморфизма и генотипирования быт провелен анализ вариабельности микросателлитных токусов 32 сортов 5 tuberosum В результате для девяти исследованных юкуеов микросателлитных 1 . * 4 5 <> * 8 « ю и и пи ms г 1» 1« :о :i 22 :зм г« 26 г :s .9 ч. л 3; п м ;s

Рис 11 Аллсльная вариабельность юк\са ST&BSS у сортов Л' tuhtrmum (1-32) м

видов Solanum (33-35)

1 - Rusbtt Burbanck, 2 - Mondeal, 3 - Bmtije, 4- Пушкинский 5- Чародеи 6- Невский 7 - Петербургский S - Лазурный 9 - Яхонт, 10- Частмгок, 11- Росинка, 12-Белор\сскии-3 13- Эффект, 14- Лорх, 15 -Лукьяновский, 16 - Раменский 17 -Никулинский, 18 Осень 19 - Скороплодный, 20 - Корона, 21 - Резерв 22 Удача 23 - Волжанин, 24- Ранняя Роза 25 - Красноярский, 26 - Бежецкий, 27 - Ильинский 28 - Бронницкий, 29 - Вестник, 30 - Жуковский, 31 - Луговской, 32 - Свитанок, 33-S phurLju, 34 S speguzzim, 3 demtssum

повторов было выявлено 86 аллельных вариантов При этом максимальное число аллельных вариантов (18) было идентифицировано для то куса SSR1, минимальное (5) - для локуса ST47 Информативность (Н) взятых в анализ SSR-локусов сортов S tuberosum была весьма высока и варьировала от 0 63

(STWIN12G) до 0.95 (SSRJ). Наибольшее число сортоспецифичных аллелей были свойственны сортам ВНИИКХ Никулинский, Красноярский, Ильинский, а также сорту Чародей селекции Северо-Западного НИИСХ. Нужно отметить, что в большинстве случаев, за исключением локуса STGBSS, отличался специфичными аллельными вариантами взятый в анализ дикорастущий представитель S. tuberosum (К-24532).

Сравнительный анализ полученных результатов с данными SSR-маркирования сортов картофеля голландской селекции (Esselink D., личное сообщение) показал у исследовавшихся в нашей работе сортов более широкий спектр детектированных аллельных фенотипов каждого локуса, что говорит о более широком генетическом пуле отечественных сортов.

Ранее было показано, что полиморфизм микросателлитов может быть использован также для идентификации и паспортизации сортов и отдельных генотипов (Powel et al., 1996, Ashkenazi et al., 2001, Wunsch, Hormaza, 2002). Для паспортизации взятых в анализ сортов картофеля из 9 микросателлитных локусов были выбраны три - ST15, ST47 и ST83 - из-за их высокой информативности и небольшого количества фрагментов (1-3), которые

Табл. 3. Характеристика микросателлитных локусов сортов S. tuberosum

Локус Число аллельных вариантов Встречаемость аллельного варианта, % Ин форматив ность, Н

ST15 7 А-27.6 В-13.8 С-13.8 D-6.9 Е-27.6 F-6.9 G - 3.4 0.89

ST4T 5 А-48.3; В -34.5; D-10.4; С.Е-3.5 0.64

ST83 12 А-19.2; В,С,Е-11.5; F, 1, J.K -7.86; D,G,H,L, -3.8 0.9

SSR1 18 А-18.8; В,С -9,4; D,E,F,G -6,3; H,l,J,K,L,M,N,0,P,R,S -3.1 0.95

STRBCSIb 12 А-18.8; В -15.6; C,D,H,I,J -6.3; E.F-9.4; K,L,M -3.1 0.92

sroAcsa 11 А-40.6; В-21.9; С -9.4.D -6.3; E,F,G,H,J,I,N -3.1 0.79

STGBSS 10 А-25.0; B,D,E -15.6; G -9.4; F -6.3; C.H.I.J -3.1 0.87

STM2005 7 А-31.3; В-18.8; C,D -12.5; E.F -6.3; G-3.1 0.84

STACCAS3 7 А.Е-29.6; В,С -11.1;D,F -7.4; G -3.7 0.82

STWIN12G 6 А -53.1; В -31.3; С -6.3; D,E,F -3.1 0.63

образуют спектр аллельного варианта. В результате проведенного исследования было показано, что использование только трех высоко информативных микросателлитных локусов является достаточным для составления индивидуальной аллельной формулы каждого сорта, которая может быть использована для его паспортизации. Интересно то, что для

паспортизации более 500 сортов роз (Rosa hybrida) было достаточно тишь 5 высоко информативных SSR-токусов (Esselink et al, 2003)

Полиморфизм SSR-локусов ядерного генома видов и сортов Capsicum.

Отдельный интерес в данной работе представляло исследование локусов ядерных микросателлитов у представителей рода Capsicum Как известно, на сегодняшний день не существует опубликованных данных о праймерах к микросателлитным локусам перца, поэтому для исследования SSR-локусов генома перца в нашей работе были проверены праймерные пары к 26 локусам, которые использовались для анализа полиморфизма ядерных SSR-локусов у картофеля Однако только лишь для 4 SSR-локусов наблюдалась амплификация фрагментов генома перца ожидаемой длины

При анализе межвидового и внутривидового полиморфизма ми крое ате л "итныч локусов LEGAST1, SSR1, STMAC47 и STRBCSI у 33 образцов 10 видов рода Capsicum было выявлено 26 типов аллельных вариантов Наибольший уровень полиморфизма ядерных микросателлитов был показан для локуса SSR1F Анализ полиморфизма этого локуса у перца выявил 9 аллельных вариантов При этом такие виды перца, как С galapa^oense С eximium С praetermissum и С pubescens характеризовались нхличием видоспецифичных аллельных вариантов Специфические аллельные варианты была получены для дикорастущих С аппгшт CGN924014 и CGV24U21 (Гватемага), которые так же, как и при AFLP-, RAPD- и ISSR-маркировании значительно отличались от других представителей своего вида

Таким образом, в резу штате проведенной работы показана ограниченная возможность использования праймеров, разработанных к ядерным микросателлитным локусам генома картофеля и томала для маркирования генома перца Из 26 праймерных пар только четыре позволили амплифицировать SSR-локусы у Capsicum Такое незначительное число микросателлитных локусов Capsicum, сходное по своим фланкирующим последовательностям с консервативными последовательностями Solanum и Lycopersicon может говорить об относительно невысокой синтении их геномов по сравнению с коллинеарностью геномов S tuberosum и L esculentum

3.7. Молекулярный анализ хлоропластного генома представителей родов Capsicum, Lycopersicon и Solanum

Хлоропластная ДНК (хдДНК) в настоящее время широко используется лля филогенетических исследований, особенно для выяснения филогенетических отношений как внутри, так и между родами растений, в связи с низкой вариабельностью, относительно малым размером генома и отсутствем дуплицированных генов (Olmstead, Palmer, 1992, 1944) Интерес к хлДНК также связан с выявлением корреляции между устойчивостью сортов

культивируемых растений к различным стрессовым факторам и изменениями в хлоропластной ДНК (Longdale, 1987).

В нашей работе для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов родов Capsicum и Lycopersicon, а также для генотипирования хлДНК сортов картофеля отечественной селекции был впервые использован микросателлитный анализ пластома.Также для маркирования пластома сортов картофеля был использован RFPL-анализ хлоропластной ДНК.

Анализ хлоропластной ДНК сортов картофеля. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК 15 сортов картофеля был проведен с использованием рестриктаз Hindlll, PstI, PvuII, BamHI, EcoRI, Clal, BgU, EcoRV. При этом было впервые показано помимо Т-типа хлДНК, характерного для S. tuberosum (Hosaka, Hanneman,1988), также присутствие у сортов пластома W-типа, свойственного дикорастущему виду S. chacoense, а также некоторым представителям вида S. andigenum. При этом количество сортов, имеющих W-тип хлоропластного генома, составляет треть от общего числа проанализированных сортов картофеля.

Проведенный анализ последовательностей хлоропластного генома сортов Т- и W-типов методом блот-гибридизации по Саузерну с Р32-меченными зондами, гомологичными известным районам хлоропластного генома герани, показал, что анализируемая хл ДНК Т- и W-типа различается делецией длиной ~ 230 н.п., которая была картирована в районе генов psaA-psbD пластома картофеля.

Исследование пластома сортов картофеля проводили также с помощью определения полиморфизма микросателлитных локусов хлДНК (cpSSRs). Для работы были отобраны праймеры к шести SSR локусам хлоропластной ДНК табака, гомологичным межгенным районам и последовательностям интронов (Bryan et al., 1999). При анализе трех полиморфных локусов (NTC6, NTC8 и NTC9) пластомов 29 сортов картофеля было выявлено 14 типов аллельных вариантов cpSSRs. Для каждого из анализируемых сортов был определен тип аллельного варианта. Также для этих локусов был определен коэффициент Н, оценивающий информативность данных микросателлитных локусов. Для 27 сортов из 29 был определен сортоспецифичный гаплотип хлоропластного генома. Было показано, что использование лишь трех информативных микросателлитных локусов позволяет маркировать пластомы сортов картофеля и использовать cpSSR в качестве маркеров при проведении межвидовых и межсортовых скрещиваний, а также при анализе цибридов. Кроме того, для анализа пластома была показана большая информативность микросателлитных локусов по сравнению с RFLP-зондами.

Анализ микросателлптных локусов хлоропластного генома представителей родов Capsicum и Lycopersicon. Для исследования полиморфизма хлоропластного генома 43 представителей 11 видов рода Capsicum был впервые использован микросателлитный анализ При этом наиболее распространенный и агрономически важный вид перпа, С с.тгиит, был представлен 28 образцами, включая разновидности и сорта В результате было выявлено 33 типа аллельных вариантов шести микросателлитных локусов пластома Capsicum Таким образом, для каждого анализируемого вида Capsicum был идентифицирован индивидуальный гаплотип хлороптастной ДНК При jtom некоторые виды перца, такие как С galapagoeme С cartLna.su С pubtsttm С ехгтшт С chacoense характеризовались наличием видоспецифичных аллелей Интересно отметить, что для вида С Ьассашт был характерен высокий внутривидовой полиморфизм cpSSRs, неотмеченный при анализе ядерного генома тех же представителей вида, что может говорить о специфических процессах, приводящих к повышенной вариабельности пластома С baccatum

Более детальное исследование микросателлитных локусов пластома у 28 представителей овощного перца С аппиит, включая 17 сортов, показало крайне низкую степень полиморфизма хлДНК этого вида cpSSRs были шбо мономорфны, либо характеризовались только двумя аллельными вариантами Причем у подавляющего большинства образцов детектировался одинаковый аллельный вариант cpSSR-локуеа Другой ал ле льны й вариант встречался крайне редко и только у дикорастущих представителей С аппиит Таким образом исследование внутривидового полиморфизма хлоропластной ДНК представителей С аппиит в дополнение к данным о полиморфизме ядерного генома подтвердило генетическую консервативность зтого вида и в особенности, кулылрных. форм овощного перца Набаю лаемое филогенетическое родство пластомов проанализированных видов рода Capsicum в целом конгруэнтно филогении, основанной на данных морфологии видов а также данных изоферментного и молекулярного анализов ядерного генома перца что, по всей видимости, может говорить о сходстве эволюционных процессов в ядерном и хлоропластном геномах перца

Анализ вариабельности микросателлитных локусов хлоропластного генома у представителей культивируемых видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon (подрод Eulvcopersicori) показал низкую вариабельность их хлДНК Так сорта L esculentum имели одинаковый гаплотип пластома Не было значительных различий и у дикорастущих разновидностей L esculentum Только образец L esculentum \ar humboldm (К2912) характеризовался присутствием специфического аллегьного варианта локусов ЧТС6 и NTC9 Микросагелтитные токусы других кутьтивируемых видов томата - L

pimpenellifolium и L. cheesmanii - также не отличались разнообразием выявляемых аллелей. Полученные результаты говорят о высокой гомогенности пластома культивируемых видов Lycopersicon и совпадают как с нашими, так и с литературными данными о низкой вариабельности как хлоропластного, так и ядерного генома томатов (Miller, Tanksley, 1990, Alvarez et al., 2001).

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1. Впервые проведено комплексное молекулярное маркирование ядерного и хлоропластного генома трех родов сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum), включая анонимные участки генома, микросателлитные повторы, рибосомные опероны, семейства генов (гены устойчивости, гомеозисные MADS-box гены, гены серин-треониновых протеинкиназ).

2. На основе AFLP-, RAPD-, ISSR-маркирования определены уровни межвидового и внутривидового полиморфизма геномов каждого из анализируемых родов. Показано, что уровень межвидовых различий у исследованных представителей трех родов семейства Solanaceae в целом сходен и находится в пределах 0.14-0.53.

3. На основе ДНК маркеров определены филогенетические связи и таксономический статус представителей семейства Solanaceae.

- Молекулярная филогения видов рода Solanum подсекции Potatoe, построенная по AFLP-, RAPD- и ISSR-маркерам, в целом совпадает с морфологической. Виды серии Tuberosa подразделяются на две основные группы: культивируемые и дикорастущие. Молекулярными методами подтверждены данные морфо-экологического анализа о сходстве геномов географически разобщенных видов серии Demissa (S. demissum) и видов серии Acaulia. Для видов S. multidissectum и S. tarijense показано филогенетическое родство с видами других серий.

-Подтверждены видовые статусы близкородственных таксонов рода Capsicum (С. аппиит, С. frutescens, С. chinens;, С. baccatum, С. praetermissuni) и выявлены филогенетические связи между И видами перца, в том числе и ранее неисследованными. Впервые проведен молекулярный анализ генома видов С. galapagoense и С. tovarii и определено их филогенетическое положение. Предложена неформальная классификация рода Capsicum, подразделяющая его на комплексы близкородственных видов.

Показано, что молекулярная филогения рода Lycopersicon, построенная по маркерам AFLP, RAPD и ISSR, коррелирует с систематикой этого рода, основанной на морфологических характеристиках. Предложен пересмотр таксономического статуса представителей вида L. peruvianum и возможное выделение L. peruvianum ssp. dentatum в отдельный вид.

3 Установлена молекулярная природа амплифицируемых RAPD-фрагментов Обнаружено, что анализируемый RAPD-спектр гредставлен преимущественно уникальными, а также слабо повторяющимися последовательностями генома Показаны возможности использования клонированных фрагментов ДНК в качестве зондов для определения межвидовых и межсортовых различий у картофеля Определен геномный полиморфизм и уровень родства геномов 54 сортов картофеля отечественной селекции

4 Для определения уровней биоразнообразия у различных видов и сортов растений сем Solanaceae разработан и использован метод домен-направленного маркирования (DDP) семейства адаптивно-значимых генов Клонированием и секвенированием ДНК показано, что DDP спектры содержат нос тдовательности гомологичные генам устойчивости, гомеозисным генам и генам серин-треониновых протеинкиназ, в том числе и ранее неизвестным для данного семейства растений Показано, что DDP-маркирование может быть использовано для филогенетического анализа соответствующих семейств генов Впервые проведена оценка представленности генов устойчивости в геноме 445 современных сортов картофеля отечественной и европейской селекции и определены фунпы сортов, наиболее дивергентные no >tomv признаку Анализ nv ia генов устойчивости не выявил возможной генетической зрозии у современных сортов картофеля

з Разработана модифицикация метода TAIL PCR д~я маркирования О ынкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ль инсерционном мутагенезе Показана возможность ни ользования TAIL PCR-фрагментов непосредственно для прямого секвенирования без предварительного клонирования, а также в качестве зондов для сканирования геномных библиотек Использование TAIL PCR позволило выявить новый ген SSR16, отвечающий за развитие эмбриона в постглобу лярно-серцевидной стадии

6 Создана коллекция SNP маркеров генов L\<.opersicon esculentum и Solanum tuberosum, которые могут быть применены для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля Впервые с использованием метода пиросеквенирования проведено SNP-маркирование генома 350 сортов S tuberosum и определен аллельный статус SNP у тетраплоидного картофеля

7 Проведен анализ микросателлитов ядерного генома видов и сортов Capsicum и Solanum Идентифицированы ал тельные варианты 4 микросателлитных юкусов генома перца и 10 локусов генома картофеля, определены частоты встречаемости и информативность каждого локуса Данные использованы для составления индивидуальной аллельной формулы и паспортизации 32 сортов картофеля и 33 образцов 10 видов и сортов Capsicum

8. Проведен анализ эволюционной изменчивости ITS1-5.8S-ITS2 фрагмента рибосомного оперона у 15 видов сем. Solanaceae. Обнаружен и охарактеризован межвидовой полиморфизм у видов рода Solanum подсекции Potatoe и видов рода Capsicum. На основе данных анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомных генов (ITS) перца выявлена внутригеномная вариабельность ITS-фрагментов и впервые показано одновременное присутствие в геномах индивидуальных растений двух дивергентных типов рДНК, различающихся наличием 43-нуклеотидной делеции.

9. Микросателлитный анализ был использован для исследования полиморфизма хлоропластного генома видов и сортов Capsicum и Solanum. Охарактеризованы 6 микросателлитных локусов хлДНК 43 представителей 11 видов рода Capsicum, определены частоты встречаемости, и информативность каждого локуса. Для каждого вида перца идентифицирован свой специфический гаплотип хлоропластной ДНК. Впервые продемонстрировано наличие у сортов картофеля хлоропластной ДНК двух типов- Т и W. Показано, эти различия в хлДНК связаны с делецией длиной -230 н.п. в районе генов psaA-psbD пластома.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Оганесян A.C., Кочиева Е.З. Использование различных эндонуклеаз для выявления межсортового полиморфизма хлоропластной ДНК у картофеля // Известия ТСХА. 1995. №2. С.214-217.

2. Оганесян A.C., Кочиева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR// Генетика. 1996. Т.32. С.448-451.

3. Кочиева Е.З. Присутствие двух типов хлоропластной ДНК у сортов картофеля // Генетика. 1997. Т.З. С.1323-1326.

4. Tsugeki R., Kochieva E.Z, Fedoroff N. A transposon insertion in the Arabidopsis SSR16 gene causes an embryo-defective lethal mutation// Plant Journal. 1997. V.10. P.479-489.

5. Кочиева E.3., Оганесян A.C., Рысков А.П. RAPD-маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий // Молекулярная биология. 1999. Т.ЗЗ. С.893-897.

6. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для маркирования генома растений // Сельскохозяйственная биология. 1999. № 1. С.1-19.

7. Кочиева Е.З., Супрунова Т.П. Идентификация меж- и внутривидового полиморфизма у томатов // Генетика . 1999. Т.35. С. 1194-1197.

8 Рыжова Н Н , Пышная О Н , Кочиева Е.З. Молекулярный RAPD-анализ генома перцев // Сельскохозяйственная биология 1999 С 25 29

9 Kochieva E.Z. Molecular markers of potato and tomato species and cultivare genome

in PEN/GEB Biodiversity and identity 1999 P 14-23

10 Кочиева E 3 , CvnpvHoea Г П , Семенова С К Использование RAPD анализа для идентификации сортов баклажанов (Solanum melon^era Li Генетика 19(W I 35 С 1165-1168

11 Рыжова Н Н, Пышная О Н, Кочиева Е.З RAPD анализ гибридов перца

Се 1Ьскохозяйственная биология 2000 Xo5 С 103-106

12 Тугучева ЕМ, Кочиева ЕЗ Использование микроеателлн шых последовательностей (STR) при анализе филогенетических отношений и маркировании генотипов злаков/ в сборнике Сельскохозяйственная биотехнология 2000 Т 1 С 32-38

13 XvcceiiH И. Кочиева Е.З, Хадеева Н В Изменения спектров пероксидаз v регенерантов Stuclns sieboldu (Miq) в результате гормональных и мутагенных воздействии Генетика 2000 Г 36 С 1093 1099

14 Кочиева Е.З. Мочек\лярное маркирование сортов баклажанов (Solanum mtlon^ena 1 ) в сборнике Сельскохозяйственная биотехнология 2000 Г 1 С 17-24

15 Кочиева Е.З Рыжова Н Н Использование праймеров на основе повторяющихся последовате1ьноегей для маркирования генома перцев / Се 1ьскохозяисл венная биология 2001 So2 С 37-42

Кочиева ЕЗ, Оганисян АС Молекулярный анализ RAPD-маркеров генома картофеля в сборнике Сельскохозяйственная биотехнология 2000 Г 1 С 2432

17 Храпалова ИЛ, Рыжова НН, Пухальскии В А, Кочиева Е 3. Филогенетические отношения видов рода Lvcoperbicon (I'oum ) Mill и молекулярные данные RAPD- и ISSR-анализов / Генетические коллекции овошных растении 2001 С 244-251

18 Кочиева ЕЗ, Хуссейн И Хадеева HB Испо1ьзованис биохими 1еских и \толек\ лярных маркеров для выявления полиморфизма генома овощного стахиса при микроклональном размножении / Сельскохозяйственная биотехнология 2001 Т2 С 54-61

19 (Сочнева ЕЗ, Рыжова НН, Храпалова И А, Пухальский В А Использование метода RAPD анализа в определении генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Licopersicon (1 oum ) Mill / Генетика 2002 Г 38 С1298-1303

20 Кочиева Е.З, Рыжова Н Н , Храпалова И А . Пухальский В А Определение генетического по шморфизма и филогенетических связей у пределавителеи

рода Lyctopersicon (Tourn.) Mill, методом маркирования межмикросателлитных последовательностей (ISSR) // Генетика. 2002. Т.38. С.1133-1142.

21. Рыжова Н.Н., Горюнова С.В., Томилов А.А., Кочпева Е.З. Выявление двух типов внутренних транскрибируемых' спейсеров (ITS) рДНК в геноме представителей рода Capsicum // Доклады Академии Наук. 2002. Т.387. Т.2. С.282-285.

22. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н. Молекулярное AFLP маркирование генотипов сортов перца (Capsicum аппиит L) // Генетика. 2003. Т.39. С.1589-1593.

23. Kochieva E.Z., Ryzhova N.N., van Dooijeweert W., Boukema I.W., Arens P. Assessment of genetic relationships in the genus Capsicum using different DNA marker systems // Eucarpia. 2004. P. 44-50.

24. Рыжова H.H., Кочиева E.3. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома перца (род Capsicum) // Генетика. 2004. Т.40. С.892-896.

25. Reeves J.C., Chiapparino Е., Donini P., Ganal M., van Kaauwen M., Kochieva E., van der Linden CG, Schulman A., Vosman В., Zhang D. Changes over time in the genetic diversity of four major European crops // Eucarpia. 2004. P. 3-9.

26. Кочиева E.3., Рыжова НЛ., Молканова О.И., Упелниек В.П., КудрявцевА.М., Окунева И.Б. Род Syringa: молекулярное маркирование видов и сортов // Генетика. 2004. Т. 40. С.37-40.

27. van der Linden CG, Wouters DC, Mihalka V, Kochieva EZ, Smulders MJ, Vosman B. Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling H Theor. Appl. Genet. 2004. V.109. P. 384-393.

Объем 2 5 п л_Зак 252_Тир 100 экз

Издательство МСХА 127550, Москва ул Тимирязевская 44