Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ SOLANVM МЕТОДОМ АНАЛИЗА УМЕРЕННО ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ SOLANVM МЕТОДОМ АНАЛИЗА УМЕРЕННО ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА"

уь-ъеуео

На правах рукописи

БИРЮКОВА Виктория Александровна

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ $01ЛРШМ МЕТОДОМ АНАЛИЗА УМЕРЕННО ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА

Специальность 03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии и в лаборатории клеточной инженерии Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им. AT. Jlopxa

профессор, доктор биологических наук, Хавкин Эмиль Ефимович кандидат биологических наук, Хромова Людмила Михайловна

доктор биологических наук, профессор, Гостимский Сергей Александрович кандидат биологических наук, доцент Соловьев Александр Александрович

Ведущая организация: Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова

Защите диссертации состоится ^/января 2007 г. в / ^асов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01. при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42; тая. (495) 97765-44, факс (495) 977-09-47; e-mail: iab@iato.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

Автореферат разослан ¿&&декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

{'"¿/'и-су С-А.Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство сортов картофеля являются сложными межвидовыми гибридами. На протяжении всей истории селекции картофеля важнейшие закономерности его изменчивости и наследственности изучались путем анализа полиморфных морфологических признаков, которые легли в основу общепринятой системы описания сортов картофеля (Зайцева, 1965, Костина, 1985, ЦРОУ, 1986). Однако проявление фенотипических признаков сильно зависит от условий произрастания и фазы развития растения, что затрудняет оценку сортов и требует проведения трудоемких повторных наблюдений. Особенно сложно различать генотипы на первых этапах селекционного процесса (отбор в популяциях), когда оценивают большую выборку индивидуальных растений. Поэтому генетика, селекция и систематика картофеля остро нуждаются в новых методах получения объективной информации о свойствах генотипа. Начиная с середины 1960 гг.) в качестве генетических и селекционных маркеров используются белки, однако со временем оказалось, что число идентифицированных таким образом л оку сов невелико, а проявление признака связано с определенным этапом развития растений и зависит от условий среды. За последнее время быстрое развитие получили ДНК технологии, которые позволяют оценить внутривидовое разнообразие и генотипировать культурные растения с целью идентификации сортов и защиты авторских прав селекционеров. По сравнению с методами, основанными на анализе фенотипических признаков, методы ДНК а наш за обладают высоким разрешением и хорошо воспроизводимы. Они помогают восстановить близкородственные связи, которые играют важную роль при подборе родительских форм в процессе селекции, и позволяют проследить за

ИНТрОГреССИеЙ ГенетИЧеСКОГО чат^рпаг П. ТП ""Рягтутт^у гг^ц^^-угтьтурцид—

растения. имени К.А. Тимирязева

ЦНБ имени Н И. Железнова

Известно, что большая часть генома растений представлена некодирующими повторяющимися последовательностями. К сожалению, у представителей рода Solanum генетический полиморфизм повторяющихся последовательностей исследован совершенно недостаточно, и методы генотипироаания по этим фрагментам генома остаются в основном эмпирическими.

Для анализа генетического разнообразия картофеля и его дикорастущих сородичей мы использовали праймеры PawS, которые были сконструированы для анализа умеренно повторяющихся последовательностей генома ржи, известных как семейство повторов R173 (Rogowsky et al., 1992). Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что эти праймеры пригодны для анализа полиморфизма растений других семейств растений, включая Solanaceae (Зайцев, Хавкин, 2001).

Целью данной работы было изучить возможности использования полиморфизма умеренных повторов для различения сортов картофеля и его дикорастущих сородичей.

В задачи исследования входило:

1, изучить полиморфизм умеренных повторов геномной ДНК у дикорастущих форм Solanum, вовлечённых в процесс селекции картофеля;

2, выявить интрогрессию генетического материала дикорастущих сородичей картофеля в современные сорта картофеля;

3, изучить полиморфизм умеренных повторов геномной ДНК у культурных форм картофеля;

4, провести сравнительный анализ полиморфизма умеренных повторов у близкородственных (сибсы и полусибсы) и отдалённых (сорта важнейших групп селекции) форм картофеля и оценить разрешающую способность умеренных повторов как дескрипторов для различения сортов.

5. сопоставить полученные результаты с родословными сортов и данными фенотипической и молекулярной систематики Solanum, полученными другими авторами.

Научная новизна. На примере выборки размером более 180 генотипов Solanum впервые показана возможность использования умеренных повторов генома как дескрипторов для различения видов Solanum и сортов картофеля, в том числе близкородственных (сибсы и полусибсы).

Практическая значимость. Показано, что анализ умеренных повторов генома доступен для селекционных и контрольных лабораторий в качестве метода оценки и систематизации генетического разнообразия форм Solanum.

Основные положения работы были представлены на Международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию Института картофелеводства Национальной академии наук Беларуси в Минске в 2003 г., Международной конференции по отдаленной гибридизации в Москве в 2003 г. и на Втором и Третьем Международном Контрессах «Биотехнология -состояние и перспективы развития» в Москве в 2003 и 2005 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты" и "Обсуждение", заключения, выводов, списка литературы, включающего 112 названий, 2 приложения. Работа изложена на 138 машинописных страницах, содержит 57 рисунков и 5 таблиц,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе было использовано более 180 генотипов Solanum, в том числе

свыше 140 сортов и гибридов картофеля, созданных на территории бывшего

СССР и за его пределами, и 40 форм дикорастущих сородичей картофеля,

представляющих десять видов Solanum nigrum (L.) Em, Mill., Solanum

lycopersicoides Düna!, Solanum demissum Lindl., Solanum stoloniferum Schltdi.et

Bouchet., Solanum chacoense Bitter., Solanum kurtzianum Bitter., Solanum

5

bulbocasianum Dunal, Solanum phureja Juz. et Buk., Solanum rybinil Juz. et Buk. и Solanum tuberosum L. ssp. andigena (Juz. et Buk.) Hawkes. Клубни и пробирочные растения картофеля были получены из коллекций ВНИИ картофельного хозяйства (ВНИИКХ, нос. Коренево, Московская область, Россия); Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР, С. Петербург, Россия) и Института картофелеводства HAH Республики Беларусь, пос. Самохваловичи, Минская область. Дикорастущие виды Solanum были выращены из семян, полученных из ВИР, the Centre for Genetic Resources (CGN), Голландия; The International Potato Center (CIP), Перу; IPK Genbank Aussenstelle Nord, Германия; The ARS Potato Introduction Project (NRSP-6), США. Поскольку нельзя восстановить исходные формы дикорастущих видов Solanum, использованные при создании сортов 50-80 лет тому назад, для оценки интрогрессии генетического материала дикорастущих видов в сорта картофеля были исследованы отобранные случайным образом выборки соответствующих видов Solanum,

Большинство современных отечественных сортов картофеля содержат генетический материал S. demissum (сорта-демиссоиды), многие сорта содержат генетический материал других видов (Будин, 1986, Костина, 1971, 1991, 1992, Яшина и др., 1998, Рогозина и Киру, 2005). Мы исследовали семь форм S. demissum, девять форм S. stoloniferum„ семь форм S. chacoense, четыре формы S. phureja. одну форму S. кигШапит и одну форму S. bulbocasianum. Кроме того, были проанализированы пять форм S. tuberosum ssp. andigena и три аборигенных формы S. tuberosum ssp. tuberosum. Виды S. nigrum и S. lycoperslcoides, наиболее отдаленные от картофеля, использовали в качестве outgroup форм.

Для анализа полиморфизма умеренных повторов ДИК мы использовали

праймеры PawS 5 - A ACGAG GGGTTC GAG GCC, PawS 6 -

GAGTG TCAAACCCAACGA, PawS 11 - GAATTCTTGGAAAATGTA и PawS

16 - AACGAGGGGTTCGAGGCC (Rogowsky et al., 1992). С помощью

компьютерной программы OLIGO б для каждого праймера была определена

6

температура отжига: она составляла 56, 45, 36 и 55°С соответственно для PawS 5, PawS б, pawS 11 и PawS 16. Для комбинации двух праймеров температура отжига подбиралась с учётом температур отжига обоих праймеров.

Картофель является вегетативно размножаемой культурой, и растения в пределах сорта можно рассматривать как клоны. Поэтому при выделении ДНК мы составляли общую пробу из молодых листьев нескольких растений одного сорта. Геномную ДНК выделяли по протоколу, основанному на методе Sagai-Maroof et a!. (1984), Амплификация ДНК проводилась в термоциклере MJ Research РТС-100. Программа амплификации включала: 2 мин при 94°С; далее 35 циклов по 40 с при 94°С , 40 с при 45°-560С (в зависимости от праймера), 1 мин 40 с при 72°С; и 5 мин при 72°С. Присутствие специфических продуктов амплификации определяли электрофоретическим разделением в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Каждый амплифицированный фрагмент ДНК на агарозном геле рассматривался как индивидуальный дескриптор с определённой молекулярной массой, которую определяли, используя маркер 1 kb DNA Ladder (Fermentas, Литва) и программу BioCapt (Vilber Lourmat, Франция). Полученные данные заносили в таблицу, в которой для каждого генотипа и для всех праймеров было указано присутствие (1) или отсутствие (0) каждого дескриптора. На основе этих данных была построена матрица для расчета генетических расстояний по Нею (Nei, 1987) между сравниваемыми формами Solanum (рис. 1).

Для построения дендрограмм использовали алгоритм UPGMA и компьютерную программу TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994), Для сравнения полученных дендрограмм с родословными сортов использовали данные Костиной (1991), Яшиной и др. (Яшина и др. 1998; Яшина, 2000; Яшина, 2003) н Swiezynsky et al, (1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Воспроизводимость метода. Для оценки воспроизводимости использованного метода проводился сравнительный анализ образцов ДНК, выделенных в разные годы из одних и тех же сортов, а также сопоставлялись спектры амплификации, полученные в разные периоды времени. Сортовой материал был взят из разных коллекций. Результаты амплификации ДНК, полученные в разное время, сопоставимы между собой. Adretta

0000000001100100001011001010001101110001000110000110010101010101000000 0001101110100010101001010010010100010000000101010010011010000010000100 000100011000100111000101011о

Aquila

0000001000100100001011011010111111110001000110001110010101010101000000 0001100100001010001011010010010100010000000101010001001010000010000100 000100011000100110001001011о

Anoka

0000000000100100001011010010111111100001000110001110010101010101000000 0000101010001010001011010010010100010000000101010001С01010000010000100

000100011000100011000001011о

Рис 1. Фрагмент матрицы дескрипторов дня построения филогенетического дерева сортов картофеля.

Полиморфизм внутри рада и видов Solanum. Анализ полиморфизма умеренных повторов позволяет различить виды Solanum (рис. 2). Были обнаружены фрагменты ДНК, характерные для всех представителей рода Solanum, а также видоспецифичные фрагменты, характерные только для одного из исследуемых видов Solanum, В качестве примера (рис, 3) можно привести фрагмент ДНК размером 430 п.н,, который присутствует у всех представителей Solanum, S. bulbocastanum содержит фрагменты генома размером 690 п.н. и 1,7 т.п.н., которые отсутствуют у других видов Solanum. Эти фрагменты, а также видоспецифичные фрагменты генома S. stoloniferum

и S. demtssum размером в 2,2 т.гг.к. i

5.

Я

Ii № Я

Рис. 2. Полиморфизм умеренных повторов Д1IK у видов Solanum.

а. Праймеры PawS 5 и PawS 16. Генопшы: ) - sucrense, 2-5. microdontum, 3 - S. tuberosum ssp. andigerta, 4 - S. stoloniferum, 5 - S. fiofiviense, 6 - S. megtstacrolobum, 7 - S. marinasense, 8 - & verrucatum, 9-5. intmile, 10 - S. demissum, П - 5 tycoper sie oides, ] 2- S. stoloni/erum, 13 - маркер молекулярного веса 1Kb DMA Ladder, б. Праймер PawS 6. Генотипы: 1 - S. nigrum, 2-5. Iycopersicoldes, 3-5. bolivknse, 4-5. megistacrolobum, 5-5. chacoense, 6 — 5 demissum, 7-5. tuberosum ssp. andigena, 8-5. stoloni/erum, 9 • S. microdontum, 10-5 marinasense, 11-5. vemtcosum, 12-5 immUe, 13-5 sucrense, 14-5. kurtiianum, 15 - отрицательный контроль, 16- маркер молекулярного веса IkbDNA Ladder,

2,2 т. пл.......*.

1,7 т. пн.-".* l^T.n.H — —

0,69 тлл. •• < * 0.43 т. п-и. ■■ I»

Рис. 3. Полиморфизм умеренных повторов ДНК у видов Solanum.

Праймер PawS 16. Генотипы: 1-3-5. stoioniferum-, 4-6 - 5. demissum; 7-9 - 5. bulbocastanum; 10-14-формы картофеля; Early Rose, S. tuberosum ssp. tuberosum PI 245796, Никулинский, Голубизна и Эффект, 15 - отрицательный контроль, 16 - маркер молекулярного веса Ikb DNA Ladder.

Среди дикорастущих форм Solanum наибольший внутривидовой полиморфизм был обнаружен у S. chacoense (рис. 4а), что можно объяснить

1,3 т.п.н. показаны стрелками на рис. 3-

б

обширным ареалом произрастания данного вида. Л Ьи1Ьосаз1апит представлен в нашей работе генотипами внутри одной формы. Анализ полиморфизма умеренных повторов позволяет находить различия даже внутри формы. На рис, 46 фрагмент размером в 1,3 п.н. отличает первые два генотипа от остальных.

Рис. 4. Полиморфизм умеренных повторов ДНК у Solanum chacoeme (а) и Solanum bulbocastanum (б).

Праймер PawS 6. Генотипы: fa) 1 - отрицательный контроль; 1 - S. ktirtzianum; 3-9 - S. cltacoense-, 10 - маркер молекулярного веса 1kb DNA Ladder, (б) 1-6 - S. bulbocastanum-, 7 -маркер молекулярного веса 1Kb DNA Ladder,

Большинство сортов картофеля получено методами межвидовой гибридизации и последующими возвратными скрещиваниями. Поэтому неудивительно, что наибольший полиморфизм внутри вида наблюдается у культурных форм S. tuberosum (рис. 5), представленных в нашей работе сортами картофеля.

Для анализа полиморфизма умеренных повторов у картофеля было исследовано около 140 форм, представляющих сорта и гибриды, созданные в важнейших центрах отечественной и зарубежной селекции с участием генетического материала различных дикорастущих и культурных видов Solanum; особое внимание уделялось близкородственным сортам, имеющим одного (полусибсы) или двух (сибсы) общих родителей.

В результате проведенного анализа было получено 168 дескрипторов. Наибольший полиморфизм наблюдали при использовании прайм еров PawS б и PawS 16(42и37 полиморфных фрагмента); праймеры PawS И и PawS 16 +

а

Ратл/8 5 давали по 31 фрагменту, а праймер PawS 5 оказался наименее информативным: с ним было получено всего 27 фрагментов ДНК. Этих праймеров оказалось достаточно для различения видов 5о!апит и сортов картофеля.

Рис, 5, Полиморфизм умеренных повторов ДНК у разных форм картофеля,

Праймер PawS б, 1- отрицательный контроль. Генотипы; 2 - гибрид 128/6, 3 - Березка, 4 -Голубизна, 5 - Приекульский ранний, 6 - Камераэ, 7 -Смена, 8 - Эффект, 9 - Раменскнй, 10 - Брянский ранний, П - Осень, 12 — Скороплодный, 13- маркер молекулярного веса 1 kb DNA Ladder.

Изучение процесса интрогрессии генетического материала с помощью анализа полшюрфихма умеренных повторов. По данным Росса (1989), большинство европейских сортов картофеля являются демиссондами * гибридами S. tuberosum и S. demissum, который является основным донором генов устойчивости к фитофторозу. В спектрах умеренных повторов мы обнаружили фрагменты, общие для дикорастущих видов Solanum и сортов, в происхождении которых участвовали эти виды (рис, 6 и 7). Фрагменты ДНК, которые переходят из генома дикорастущих видов в культурный картофель, можно рассматривать как потенциальные видоспецифичные маркеры, и в дальнейшем их идентификация позволит значительно облегчить исследование процесса интрогрессии.

То обстоятельство, что у сорта картофеля не всегда обнаруживаются фрагменты, общие с дикорастущими сородичами, которые входядят в его

Рис. 6. Полиморфизм умеренных повторов у различных форм S. chacoense Bitter, и сортов картофеля, в происхождении которых участвует S chacoense.

Праймеры PawSS + PawS16. Генотипы: 1 - S chacoense (Pt 189219); 2 - S. chacoense (PI 133713); 3 - £ cltacoense (PI 472828); 4 - S, chacoense (PI 472832); S- S. chacoense (PI 472810); 6-S. chacoense (PI 762268); 7 • S. chacoense (PI 265576); 8-16- S. tuberosum: 8 -Луговской 20; 9 - Луговской 700; 10 - Жуковский ранний ВИР; 11 - Жуковский ранний 25; 12 • Белоснежка; 13 - Atlantic; 14 - Ильинский 30; 15 - Итьннский 23; 16 - Никулинский 8; 17 - отрицательный контроль; 18 - маркер молекулярного веса Ikb. DNA Ladder, Стрелкой показан фрагмент ДНК, предположительно перенесенный из £ chacoense в картофель.

родословную, можно объяснить двумя причинами: (1) каждый из дикорастущих видов характеризуется большим внутривидовым полиморфизмом, и в настоящее время нельзя установить, какие конкретные генотипы дикорастущих видов были нспользованы в качестве родительских форм при создании исследуемых сортов картофеля; (2) некоторые фрагменты генома, выявляемые в дикорастущих формах, могли быть зли минированы в беккроссах. Интрогрессированные фрагменты генома представляют особый интерес, если они связаны с конкретными хозяйственными признаками, ради которого картофель скрещивали с дикорастущими видами. Однако чтобы доказать связь такого фрагмента генома с хозяйственным признаком, потребуются специальные исследования.

А

юоо

500

Рис, 7. Ннтрогрессия генетического материала от дикорастущих видов ((А) Л chacoense и (Б) S. dembsum) в S. tuberosum.

А. Праймер PawS 11.1 - отрицательный контроль, Генотипы: 2-£ chacoense (P1189219); 3 - S chacoense (PI 133713); 4 - £ chacoense (PI 472S28); 5 - S. chacoense (PI 472832); 6 - S. chacoense (PI 472810); 7 -S. chacoense (PI 762268); S-S chacoense (PI 265576); 9 - Atlantic; 10 - Жуковский ранний; 11 - Луговской; 12 - Белоснежка; 13- Ильинский, 14 - маркер молекулярного веса Ikb DNA Ladder. Стрелками показан фрагмент Д11К, предположительно перенесенный от диких видов в картофель, Б. Праймер PawS 6, Генотипы; ] - Ж demissum, 2 - Эффект, 3 - Голубизна, 4 - Скороплодный, М - маркер молекулярного веса 1 kb DNA Ladder,

Границы разрешения метода. Анализ полиморфизма умеренных повторов позволяет устанавливать различия между близкими формами картофеля, в частности, между сибсами (сорта у которых оба родителя являются общими) и полусибсами (сорта у которых один из родителей является общим) (рис. 8). Однако в использованных нами условиях разделения фрагментов ДИК меристемные линии картофеля не различались (рис. 9). Для изучения сомаклональной изменчивости и различий внутри меристемных линий необходимы методы разделения продуктов амплификации с более высоким разрешением.

Полуснбсы

I Cralgi РеЯапс» |

[ 80-1 (Фанал x Смена) |

1 - Crrtgs Royal;

2 - CraJds SnowWnüe:

М-маркер мол. меа

1Kb C№ Ladder

\ Добро *77MD-5T |

j Калинка |

тшт

Сибсы

| Альтаир|

Аксамит

1 -Агътаир:

2-Аксамит:

М - ы«р«р мол. в*са 1Kb DNA Ladder

1 - Cut на; I - Kimwa: 3 - Прянее: 4-Фаиал: i- игркор мол. в ft с в 1Kb DM* Ladder

17im-1i7m хБвл.Зипр.

804/14 |

i-se, 16Д0:

2-ее.

М - маркер мол. веса 1Kb DNA L«derer

Рис. 8. Сравнение спектров умеренных повторов у сортов картофеля, имеющих общее происхождение, Праймер Рач.^ 6.

Рис. 9, Полиморфизм умеренных повторов у меристемных линий картофеля. Праймер PawS 6,1 - Жуковский раштй ВНР; 2 - Жуковский ранний 25; 3- Голубима R-25; 4- Голубизна £0; 5 - Никулинский 8; 6 - Никулинский 1; 7 — Ильинский 30; 8 -Ильинский 23; 9 - отрицательный контроль; 10 - маркер молекулярного веса Ikb DNA Lad der,

ОБСУЖДЕНИЕ

Главными требованиями, предъявляемыми к методам различения генотипов с помощью ДНК анализа, являются доступность (простота в исполнении н невысокая стоимость анализов), информативность (число дескрипторов и разрешающая способность) и надежность (воспроизводимость метода). Анализ полиморфизма умеренных повторов оказался достаточно информативным и надежным методом, позволяющим различить виды Solanum и сорта картофеля. Умеренные повторы равномерно распределены по всему геному, что делает их очень удобными для генотнпировання растений. По сравнению с AFLP и SSR методами генотипнроваиия, метод анализа полиморфизма умеренных повторов дешевле и проще в исполнении, что делает его доступным для рядовых селекционных лабораторий.

Природа фрагментов ДНК, использованных в качестве дескрипторов в нашей работе, подробно не исследовалась, В нашей лаборатории было показано, что у пяти видов Solanum фрагмент длиной около 800 п,н., амплифицируемый с праймсром PawS 5, представлен серией гомологов (8590% идентичности), которые распределены как рассеянные повторы на коротком плече хромосомы 5. Анализ полиморфизма этих повторов позволяет различать близкородственные сорта, а также сорта - двойники, что позволяет использовать описанный метод как дополнение к существующим методам регистрации сорта, основанным на критериях отличимости, однородности и стабильности. Кроме того, с помощью этого метода можно устанавливать генетические связи между отдельными видами Solanum и сортами картофеля, что позволяет уточнять родословные сортов.

Тесные генетические связи, высокий полиморфизм морфологических признаков и межвидовая гибридизация видов Solanum секции Petota делают чрезвычайно трудным анализ эволюции данной группы растений, в которую входит картофель и дикорастущие виды, используемые в селекции

картофеля, В последние годы важный вклад в разрешение этой проблемы удалось внести с помощью методов молекулярного анализа (Volkov et al., 2001, Spooner et al. 2002, 2005). Для того, чтобы сопоставить наши данные с результатами классификации этих видов с помощью традиционных и молекулярных методов, мы построили филогенетическое дерево видов Solanum (рис. 10). Оно хорошо согласуется с ботанической классификацией. Систематики разделяют все клубнеобразукмцие виды Solanum (подсекция Potatoe G. Dun) на две географические группы: южноамериканскую и североамериканскую. На нашей дендрограмме южноамериканские виды S, phureja, 5 tuberosum, S. kurtzianum (серия Tuberosa) и S. chacoense (Серия Yungasensa) отчетливо отделены от североамериканских видов S. stoloniferum (серия Longi pedicel lata), S. demissum (серия Demissa), S. btdbocastanwn (серия Bulbocastana). При этом тетраплоидные виды S. stoloniferum и S. tuberosum и диплоидные виды S. chacoense, S. kurtzianum и S. buíbocastanum образуют отдельные кластеры. Культурные виды S. phureja, S. tuberosum ssp. andigena и S. tuberosum ssp, tuberosum, в том числе группы chilotanum (Frutilla, Bastoneza) отделены от дикорастущих видов 5. kurtzianum и S, chacoense. S. phureja образует общий кластер вместе с S. tuberosum ssp. andigena, а чилийские сорта Frutilla и Bastoneza входят в общий кластер с S. tuberosum ssp. tuberosum (сорта-ветераны Early Rose, Katahdin, Jubel и Wolthman, свободные от генетического материала дикорастущих видов Solanum). Дикорастущие виды S. chacoense, S. kurtzianum, S. demissum, S. stoloniferum и 5. buíbocastanum на этой депдрограмме образуют отдельные кластеры, Неклубнеобразующие виды S. lycopersicoides (серия Juglandifolia) и S. nigrum служат формами, внешними (outgroup) по отношению к исследуемой выборке клуб необразующих видов Solanum. Такая картина распределения видов Solanum в основном согласуется с результатами филогенетических исследований, в которых использовали другие молекулярные маркеры: RAPD, RFLP, AFLP и микросателлиты. (Bonierbale, 1990, Bryan et al., 1999, Marshall et al., 2001 и др.).

Современные сорта S. tuberosum являются сложными межвидовыми гибридами, в селекции которых участвует сравнительно небольшое число сортов-родоначальников, вовлеченных в процесс возвратных скрещиваний (Будин, 1986), Вероятно, поэтому при сравнении молекулярных данных для сортов картофеля с их родословными картина оказалась более сложной, чем при анализе видов Solanum, Картина упрощается, если рассматривать не все сорта сразу, а группы сортов, объединенных одним хозяйственно-ценным признаком (скороспелость, устойчивость к конкретному патогену и т.п.). Генетическими источниками этих признаков являются либо дикорастущие виды Solanum, либо сорта-ветераны, несущие данный признак. Сравнивая формы внутри таких групп, можно восстановить «молекулярные родословные» сортов по отношению к донору ведущего признака, который был целью селекции. В качестве примера на рис. 11 н 12 приведены родословные раннеспелых сортов, восходящих к сорту Early Rose, в происхождении которых участвуют сорта Агрономический, Приекульский ранний и Минский ранний.

На дереве, построенном по результатам анализа полиморфизма умеренных повторов (рис. 13), ближе всего к сорту Early Rose — донору скороспелости - стоит сорт Брянский ранний, наиболее отдалены сорта Смена и Пригожий-2. Сорта Детскосельский, Белорусский ранний и Приекульский ранний - первые раннеспелые сорта — производные сорта Early Rose, на дендрограмме образуют отдельный кластер.

Другим наглядным примером могут служить устойчивые х вирусу Y сорта, созданные с использованием генетического материала S. stoloniferum (рис. 14 и 15).

Аналогичные результаты дал анализ сортов, полученных во Ш1ИИКХ с участием генетического материала S, chacoense, донора устойчивости к вирусным болезням и нематоде; сортов, в происхождении которых в качестве источника раннеспелости принимал участие гибрид USDA X 96-95 или

устойчивых к нематоде сортов, в происхождении которых участвовал S. tuberosum ssp, andigena.

I

S

в fr

ж

fr

I fr

Рис.10, Дендрограмма видов Solanum на основе анализа полиморфизма умеренных повторов, построенная методом UPGMA с помощью программы TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994),

ж CeMlfoHa I (ГШ) СоЫ)(вг

_* Белорусский ранний

Очень ранний

Early Rose

x Jubel

Irish Cobbler

раИНИЙ

Приекульский ранний

ОЧ9НЬ Е

х Приекульский

хнив Агрономический ранний Минский среднеранннй ранний

очень ранний

к 5. ifem/sium х

S.^g^um^t^M^ Детскосельский

среонеранний

Рис. 11. Родословные сортов, в селекции которых участвовал сорт Early Rose,

* 44Í7 сШ

Приекульский

ранний очень ранний

• Светлячок

Р8ННИЙ ¡

х Камера! к Fanal !

- Смена -80-1

X Ma вне

среднеранний

x 131-3

ходтг

Агрономический хШу*" ервдиеранний

Изора

сред(вра«нмй я Эрос Брянский 15с-11- ранний

ранний х Anoka

Прайса

среднеранний

Калинка

среднеранний

хБервзка -15с-31-128-6

- Скороплодный

ранннй

к Рамеисиий

Эффект

средне ранний

* W67-5Î

X 69413-93

Минский ранний очень ранний

-70074-17 -

-Добро

* 77540-57

Аксамит

XM1Î39-SÎ

Каприз

X 319946 X Комсомолец » * 4841-71 _ -71019-7-Ласунак-Выток

X 737-в

Пригожий-2

ранний

Рис, 12. Родословные сортов, в селекции которых участвовал сорта Агрономический, Приекульский ранний и Минский ранний.

Ч-

Emily Rose*

Бртсхнй ранний* *

Аитит""

Иэора***

Лгрономпвсккй*

Праига***

Сгароплшный* *

Калпкка***

Светлячок***

Эффект"

Ksnpio*'"

Детг косе пскнй*

Бе .пруте хпй ракшей*

Высок*

Пркек;льск1Й ранний* СменаГ*'

Пригожий-J"*f

Рис. 13. Дендро грамма на основе анализа полиморфизма умеренных повторов для сортов, которые происходят от Early Rose.

* - сорта, произошедшие от сорта Early Rose; ** • сорта, произошедшие от сорта

Агрономический, *** - сорта, произошедшие от сорта Приекульский ранний; '***- сорта, в происхождении которых участвовал сорт Минский ранний.

—lie - 11 Брянский ранний (Ry)

abtonttwuit г Wrwun

РУt

,_183у-5в

I |Ry)

15с - 31-

-128-6, tRy> г

Голубизна iRy)

1 СкорОГ1ПОдНЫй;Р!у)

'Осень

i,f*"*HC"1*. Эффвкг(Ку)I

I— 18Э ч - 61-Чернский

(Ry>

Рис. 14. Родословные сортов, в селекции которых использовался S, stoloniferum.

Бирючь етеран

Генетические расстояния

Di

Х-

03

■ Гояувкпа*

- СК0[»ИЛ)ДИЫЙ*

■Ш**

■ Брянский ртниий*

■ Осень*

• крикни*

• Енрщь* 1 Эффект* ' Евтфан*

Детсикялъский

$. itoloniffnimPl 17ЛОТ S. ssobt^nmSlS S. sSobf^enanSü S. ¡Ь>ЬщГетт59а S. хЫогцрелтй3 S. Ш&нфпяп PI 17ЯИ 3. s*>b»4femm6l S. ЯоЪнфляпП IS348 S. stoknfinm\>\ 23072

Рис. 15. Дендрограмма на основе анализа полиморфизма умеренных повторов для 5. siolonifcrum к сортов, полученных с его участием, *- сорта, полученные с участием S, stoloniferum.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Система анализа геномов методом амплификации умеренных повторов с PawS праймерами, ранее продемонстрированная для ржи, подсолнечника, ячменя и других видов растений, оказалась приемлемой для широкого круга представителей рода Solanum, что свидетельствует об универсальных свойствах этих праймеров.

Полученные данные показывают, что дендрограммы, построенные на основе генетических расстояний по результатам анализа умеренных повторов полностью согласуются с ботанической систематикой н географическим распределением видов Solanum по ареалам их происхожден и я. Близкие генетические расстояния среди форм внутри вида и далекие между видами в соответствии с увеличением степени родства между видами свидетельствуют о том, что полиморфизм умеренных повторов можно эффективно использовать для различения видов и форм внутри вида.

Анализ полиморфизма умеренных повторов у исследованных сортов, среди которых есть европейские, американские, российские сорта и сорта стран СНГ, всего более 140 образцов, демонстрирует индивидуальность спектров распределения дескрипторов, что свидетельствует о перспективности системы анализа, описанной в диссертации, для составления генетических паспортов сортов.

Полиморфизм умеренных повторов позволяет проследить за процессом интрогрессии генетического материала родителей, более отдаленных родственных форм и диких видов, стоящих у истоков селекционной истории сорта.

Изучение процесса интрогрессии на основе анализа полиморфизма умеренных повторов позволяет получать ДНК маркеры генетического материала дикорастущих сородичей, среди которых могут оказаться маркеры хозяйственно ценных признаков.

Собранные данные по длинам амплифицированных умеренных повторов по пяти парам праймеров для 180 генотипов Solanum (из них -свыше 140 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции и 40 образцов 9 видов Solanum) с известными селекционными и хозяйственно ценными признаками являются базой данных для компьютерного анализа, маркирования отдельных признаков, генотипирования и паспортизации сортов картофеля.

выводы

1. Методом анализа полиморфизма умеренных повторов ДНК было изучено более 180 генотипов Solanum, в том числе свыше 140 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции и 40 образцов 9 видов Solanum.

2. Установлено, что метод анализа полиморфизма умеренных повторов надежно различает как виды Solanum, так и сорта картофеля, в том числе близкородственные: сибсы и полусибсы.

3. Анализ полиморфизма умеренных повторов позволил проследить за интрогрессией генетического материала от дикорастущих сородичей (X demissum, S. stoloniferum, S chacoense и др.) в культурные формы картофеля и создать на этой основе ДНК маркеры генетического материала этих сородичей.

4. Показано согласие родословных и классификации методом анализа полиморфизма умеренных повторов в пределах групп сортов картофеля, связанных селекцией на определенный хозяйствен но-ценный признак (раннеспелость, устойчивость к вирусу Y и золотистой нематоде).

5. Результаты молекулярного анализа видов Solanum полностью согласуются с традиционной фенотипической систематикой этого рода.

6. Метод анализа полиморфизма умеренных повторов можно использовать для восстановления родословных сортов картофеля и облегчения подбора родительских пар для скрещивания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бирюкова В.А., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М., Шилов И.А. ДНК-маркеры в селекции картофеля. Достижения науки и техники АПК, 2003, №10, с. 38-41.

2, Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М., Шилов И.А. ДНК-дактилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей. Вопросы картофелеводства. ВНИИКХ, Москва, 2004, сЛ 14-123.

3. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Панкин A.A., Прибылова Т,А,, Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК-генотипирование растений родов Brassica и Solanum,, Сельскохозяйственная биология, 2005, №1, с. 110119.

4, Бирюкова В.А., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова J1.M. Генотипирование сортов картофеля на основе анализа полиморфизма умеренных повторов. Вопросы картофелеводства, ВНИИКХ, Москва, 2006, с. 54-62.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем 1,5 печ. л._Зак. 862._Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44