Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное маркирование генома картофеля

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное маркирование генома картофеля"

Р Г б О Л На правах рукописи

1 1 У,АР

ОГАНКСЯН Айк Суренович МОЛЕКУЛЯРНОЕ -МАРКИРОВАНИЕ ГЕНОМ КАРТОФЕЛЯ'.

специальность 03.00.03-молекулярная биология

Автореферат диссертации-на соискание учеЕой степени ■. • кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН'

Научные руководители:

доктор биологических наук,, профессор,

чл-корр. РАН A.IL Рысков..

кандидат биологических наук Нечаева.Е.З.

Официальные опоненты:

доктор биологических наук, профессор,

академик РЖ A.C. Антонов .

доктор биологических наук, профессор Д.А. Кргиаров..

Ведущая организация?

Всероссийский: научно- исследовательский институт- _ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН-.;

Защита диссертации состоится года-в -

" 11." час. на заседании Диссертационного совета-Д.200.30.01. при Институте биологии гена РАН го адресу: II7334, Москва,., ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно, ознакомиться в библиотеке Института, молекулярной биологии-им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат -разослан.""^вли»ргл 1995 года..

Ученый секретарь .Диссертационного совета.: '. канд.фарм.наук ^ТХя^^^Ь^^^абовская Л.С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблени.В НаСТО ЯДЕ0 Время КарТОфЗЛЬ

является одним из наименее изученных в молекулярном плане . сельскохозяйственных культур. Анализ генома, а также паспортизация многочисленных видов г сортов картофеля становится все более актуальной задачей в связи с проблемами определения сортовой однородности и контролем за качеством посадочного материала, а также для целей ранней селекции при выведении новых сортов.

Исторически вдентификация сортов картофеля базировалась на морфологических и физиологических признаках, таких как форма и цвет клубней, ростовые характеристики и т.п. Однако эти признаки плохо наследуются и подвержены влиянию внешней среды. Для маркирования видов и сортов картофеля использовались спектры, получаемые при изоферментном и электрофоретическом анализе белков клубня (Desbough and Peloquin, 1968; Oliver and liartinez-Zapater, 1995; Мусин и др.,.1988, Мелик-Саркисов и др., 1990, Douches and ludlam, 1991). Однако применение белкового анализа лимитируется количеством белковых маркеров, трудностью выявления различий у близкородственных сортов, а также тем, что белковый спектр легко подвергается * изменениям под воздействием условий выращивания или в процессе развития растения.

В настоящее время для анализа растительного генома и идентификации сортов и видов наиболее широко применяется метод полимеразной цепной реакции со случайными праймерами crapd3. Результатом амплификации ДНК является спектр фрагментов, некоторые из которых "могут быть использованы в • качестве генетических маркеров для построения геномных карт,

л

для видовой н сортовой идентификации, а такке для определения таксономических взаимоотношений мезду видами. . rapd pcr спектры уяе широко используются при маркировании сортов и линий, таких культур, как томаты (Дорохов ь др., 1993), ж.ен$ща (Бго'ш et al., 1993), рис (Pukuoka et al, 1992), цветная капуста (.Ни and Quiros, 1991, Demeke et al., 1992), соя (Williams et al.,1990), какао бобы (Wilde et al., 1992) и ряда других. ' '

Цели и задачи исследования. ЦеЛЬЮ ДЭННОЙ рабОТЫ

являлось молекулярное маркирование ядерного и цитоплазмати-ческого генома картофеля, Solanum tuberosum, паспортизация видов и сортов и получение клонированных ДНК маркеров генома картофеля.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи: I) провести KFLP анализ хлоропластнога. генома

Solanwn. tuberosum. ; 2) ОПТИМИЗИрОВаТЬ УСЛОВИЯ ПрОВеДвНИЯ

реакции rapd pcr на ДНК картофеля и подобрать праймеры, ■ выявляющие полиморфизм у ввдов и сортов картофеля; 3) провести rapd pcr паспортизацию анализируемых видов

Solanaceae И COpTOB Solanwn tuberosum.; 4) ПрОВвСТИ аНЭЛИЗ

фрагментов ДНК картофеля, амнлифицируемых с помощью rapd pcr; 5) клонировать и секвенировать. rapd pcr фрагменты для дальнейшего их использования в качестве rpep маркеров.

Научная нопизна работч. В результате ДЭННОЙ' рабОТЫ

впервые было показано наличие у сортов soianw?, tuberosum, помимо Т-типа, Taise W-тип хлоропластного ДНК. Для целей -, маркирования ядерного генома были подобраны три праймера, шявлявдие rapd полиморфизм у картофеля, что позволило провести паспортизацию анализируемых - видов и сортов. Показана возможность использования PiPD PCR спектров при

определении систематического положения видов. Был проведен молекулярный анализ амшшфицированной с помощьв rapd pcr днк. Показано, rapd спектр представлен как повторяющимися, так и уникальными кодирующими последовательностями генома картофеля. Проведено клонирование л секвенирование некоторых rapd продуктов.Показано, .что некоторые из них, являющиеся повторяющимися элементами генома, могут использоваться в качестве RHP маркеров при выявлении межвидового и межсортового полиморфизма.

Практическая ценность работы.В ДЗНН0Й.. раООТб бЫЛО

проведено RAPD маркироваше генотипов картофеля для решения практической задачи паспортизации ' сортов и гибридов картофеля, семейного контроля, ранней диагностики генетически вариантных линий, получаемых как путем классической селекции, так и методами клеточной инженерии. Получены клонированные ДНК маркеры, пригодные для выявления межвидового и межсортового полиморфизма.

Аппробация работы. Материалы диссертации, были представлены на Y международной молодежной конференции по метаболизму растений (Варна, 1990г.), меклабораторном семинаре Института Карнеги (Балтимор, 1993г.), на совещании PAS ЕВ по развитию растений и клеточной биологии (Saxton River,1994r.),

Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

, Структура и объем работы. Диссертация ИЗЛОЖвНЭ На

страницах и состоит из ищущих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя; -¿¿^источников. Работа проиллюстрирована I таблицой, I схемой и 12 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 1. АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМА КАРТОФЕЛЯ

Одной из задач работы был анализ хлоропластного генома сортов картофеля методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Хлоропластную ДНК 15. сортов картофе.гт обрабатывали эндонуклеазами Hind III, Pst I, Pvu II, Bam HI, EooR I, EooR V, Bgl I, Cla I. Рестриктазы Hihd III, Pst I, Ptu II, ciai, Bgll не выявляли.межсотрового полиморфизма хл ДНК картофеля. В то же время при гидролизе хл ДНК эндонуклеазой BamHi анализируемые сорта картофеля разделялись на две группы.по набору рестриционных фрагментов хл ДНК. При этом в Bam HI рестрикционном паттерне хл ДНК сортов Невский, Сотка, LG1 и LG2 отсутствовал фрагмент длиной 12.2 т.н.п. и появлялось два новых фрагмента 10.0 т.н.п. и 2.32 т.н.п. Аналогичным^ образом хл ДНК сортов Невский, Сотка, Роза, LG1 и LG2 отличались от всех остальных сортов по дополнительному фрагменту 3.2 т.н.п. при рестрикции хл ДНК этих сортов.эндонуклеазой.EcoRi,. а также го отсутствию фрагмента длиной 17.1 т.н.п. и появлению фрагментов 13.5 и 3.6 т.н.п. при обработке эндонуклеазой EooR Y. Схематично полученные спектры изображены на рис I.

Сравнение Bam Hl- и EcoRl-рестрикционных спектров хл ДНК сортов с данными полученными Hosaka et al. (1988а) показало, что они аналогичны спектрам т- и w-типов хл ДНК картофеля. Таким образом сорта картофеля Невский, Сотка, LG1,. LG2, LG4 имеют хл ДНК W-типа, в то время как у всех остальных 1о сортов - Т-тип пластома. Количество сортов, имеющих W-тип хлоропластного генома составляет ЗЗЖ от общего числа проанализированных сортов, w-тип пластома характерен для вида s. chacoense, а также для некоторых представителей вида s.andigenvm, (Hosaka et al., 1988b). Растения этих видов

г.пм

9.4 6. в

Ч.Ч

м т v/ m.tw- mtw .mtw

П П П тадП П П ТП.н. п П П т.п.н. n pi п 7т/т.н.

£.3 3.0

W12.2 io.o

SI Ч-.Ч

ч.ъ ,55

ZD

1.4

i.6 232 ХЗ

212

•3.2

3.5

2.0 i?

6.1

212

5.i «2

3.5

20 ¿7

9.6 5.2

BamHI

EooRI

EcoRV-

EcoRI+fiinJlII

T—тип хл ДНК у сортов Биптье, Гатчинский, Марфона, Ранняя Роза, Лайидотта, Аусоння, Мопдеал, Нриекульский ранний, VI,- V2. W—тип хл ДНК у сортов Невский, Сотка, Роза.-LGl, LG2.

Рис 1. Схематическое изображение рестрикционных спектров хлоропластной ДНК сортов Solanum tuberosum.'

довольно часто используются при селекции новых сортов, чем МОЖНО объяснить присутствие У сортов £иЬегогпл71 Я-ТИПЗ хлоропластного генома.

Таким образом было впервые продемонстрировано наличие у сортов э. 1иЬегозгя1 ПОМИМО ХЛОрОШШСТНОЙ ДЕК Т-ТИПЭ, Т?-ТШ1 пластома. Кроме того впервые был' -получен ЕсоКУ спектр хлоропластной ДНК картофеля, содержащий характерные маркерные фрагменты рестрикции.

Раздел 2. АНАЛИЗ СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ С ПОМОЩЬЮ ТАКСОПРИНТНОГО АНАЛИЗА ГЕНОМНОЙ ДНК

Для решения поставленной задачи паспортизации видов и сортов картофеля и маркирования межсортового полиморфизма была исследована возможность применения метода таксопринтного анаша (Федоров А.Н. и др. 1992).

Метод таксопринтного анализа ДНК картофеля вида Solanum

phureja, Solanum, andigenvm. И So I amm tvberosvm. ССОрТЭ

Невский, Бинтье и Аусония) с использованием рестриктаз Mspl, Hinf I , Ввр143 I, С1а I, Еоо 130 не выявил полиморфизма в спектрах у анализируемых видов и сортов. Полученные данные в целом соответствуют результатам других авторов (Федоров и др.,1992, Гречко и др 1993, Потапов и Рысков i 1993, Потапов и др.1994), показавшим эффективность данного метода при дифференциации лишь отдаленных видов.

Раздел 3. МАРКИРОВАНИЕ ЯДЕРНОГО ГЕНОМА КАРТООЕЛЯ МЕТОДОМ RAPD PCX

3.1 Маркирование восьми видов картофеля с помощью. RAPD PCR

Для проведения анализа наш были отобраны виды из рода Solanum, довольнно часто используемые в скрещиваниях с

Solanum, tvberosvm. при СвЛеКЦИИ НОВЫХ COpTOB (Plaisted and.

Hoopers, 1989). Кроме того в анализ было взято растение томата (Lycopersicon escvlentvm. OV М0рК0ВНЫЙ>. ОТНОСЯЩИЙСЯ к другому роду семейства пасленовых.

RAPD PCR ВИДОВ Solemaceae ПРОВОДИЛИ С ПраЙМврЭМИ BL 26(GTAGCTGACG), A30(GTAGCAGACG) И A3I (GTAGCTGTACG). Как видно из рис 2 каждый из видов имеет специфический спектр амшшфицируеынх RAPD-продуктов, отличающийся от других количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности

5 6 ? 8 М

<с 2. RAPD PCR полиморфизм различных видов картофеля и томата, ¿являемых при помощи праймера DL 26. 1- ДИК томата Lycopersicon sculentum (сорт Морковный), 2- ДНК Solanum jamesii, 3- ДНК Solanum innatisectum, 4-ДНК Solanum vernei, 5- ДНК Solanum stenotomum, 6-1K Solanum and igeпит (K3115) 7- ДНК Solanum tuberosum (сорт 1нтье), 8- ДНК Solanum tuberosum (сорт Невский) M - маркерные эагмеиты • lkfr ladiler. • .

(мажорности). С другой стороны, некоторые фрагменты (550нп, 420нп) являются общими для всех видов, обычно это четкие мажорные полосы. Большая часть минорных полос,, которые имеют полную воспроизводимость в независимых опытах, часто являются видоспецифичными. Интересно, что спектр амшшфицированных ДНК для томата (рис 2, 1), за исключением одного мажорного фрагмента 1030 ни, который присутствует также у всех ВИДОВ анализируемых 5о1апасеае, довольно беден и почти полностью отличается от ядро паттерна видов, рода 5о1апш1 срис 2, г-6). Последнее может свидетельствовать о родоспецифичности в праймированш виге.

В результате проведенного rapd.. pcr анализа с выбранными праймерами было маркировано G видов картофелл, для каждого из видов бнл получен характерный rapd паттерн. Для пяти видов были получены индивидуальные фрагменты, которые могут быть использованы в качестве видоспецифичных маркеров и применятся в селекционной работе при анализе гибридов.

На основе маркеров ВШ) PCR спектров были построены дендрограммы генетического сходства исследованных видов картофеля и томата. Степень сходства rapd pcr спектров видов картофеля адекватно отражает степень родства между видами рода soiamm.. Таким образом проведенные исследования показали, ЧТО разделение секции Tuberarium CDviO Buk на группы родственных видов по молекулярным и морфофизоилогическим признакам дает сходные результаты, и метод rapd pcr монет быть использован в таксономии картофеля для уточнения систематического положения вида.

З.г Выявление полиморфизма ¿НК сортов картофеля S. tuberosum.

Для разработки метода маркирования сортов с помощью RAPD PCR были выбраны 8 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, районированных и возделываемых в восокогорных районах Армении. Амплификацию проводили с использованием праймеров, выявляющих межвидовой полиморфизм

рОДа Solanum.

На рисунке 3 представлены результаты rapd pcr амплификяций ДНК исследуемых сортов картофеля с помощью праймеров bl-ss срис За), а-зо-срис Збэ.и а-з1 срис Зв).

При использовании праймера ВЬ2б (рис За) для каждого из анализируемых сортов был получен сортоспецифичный паттерн rapd pcr фрагментов. Спектр образован . 10-14 фрагментами, ласть разделения которых располагается в районе 0.3-1.8

'Mi 2 3 4 5 6 7 8

Рис 3. ¡¡APD РСК ДИК сортов картофеля, выявляемые прн помощи райыерсп BL 26 (а), Л 30 (б) н А 31 {□). 1 - ДНК сорта Невский, - ДНК сорта Еинтье, Зг ДНК сорта Лусопнг,, 4- ДНК сорта Мондеал, 5-ИК сорта Лойидота, 6- ДНК сорта Марфоиа, 7- ДНК сорта Драга, 8-НК сорта Ронано. М (а) - маркерные фрагнеити ДНК фага XJ74 идролизованные рестркктаэой Haelll; Н (б,в) - маркерные фрагменты kb ladder.

т.н.п. Какдий из полученных rape pcr паттернов различается как по количеству, так и по взаиморасположению амшшфицированных полос.. При этом для rapd bl26 спектра у всех сортов выявлялись общие фрагменты: одиночные полосы длиной 1380 н.п. и 1030 н.п., а также блок из трех фрагментов 540 н.п., 490 н.п. и 420 н.п. Кроме того следует отметить, что фрагменты 1030 н.п. и 420 н.п. присутствуют в rapd pcr спектрах практически всех анализируемых видов рода soianun, а фрагмент 1030 н.п. выявляется также и. у представителя другого рода - томата Lycopersicon esc-ulentuií, то есть этот фрагмент является не только родоспецифичным, как фрагмент 420 н.п., но и, по всей видимости, характерным ДЛЯ всего семейства Solenaceae.

Единственный сортоспецифячный фрагмент длиной 510 н.п. был обнаружен в rapd-bl26 спектре сорта Невский. Интересно появление мажорной полосы 750 н.п. в паттерне rapd pcr фрагментов сортов Аусовия и Драга, которая присутствует лишь в спектрах этих двух сортов- и аналогична такому же фрагменту спектра.s. andigenwn. v. choia. jte рисунке.3 6,в представлены.■ rapd pcr спектры ДНК сортов картофеля, полученные с помощью других двух праймеров. Как видно из рисунка, праймеры АЗО.и A3I также обладают высокой эффективностью при выявлении полиморфизма сортов картофеля.

Как следует из представленного материала, в отличие.от межвидового, межсортовой полиморфизм значительно менее выражен, что в целом соответствовало ожидаемым результатам и совпадало с исследованиям проведенными на пшенице (Brom et . al, 1993) и крестоцветных. ( Hu et al., 1991 э. В целом следует отметить следующую' закономерность для полученных на. сортах картофеля rapd pcr паттернов: для большинства сортов не было получено сортоспецифичных полос, что в целом представляется вполне логичным, если учитывать тот факт, что

при получении новых сортов в скрещивания вводится ограниченное количество, в основном одних и тех же, видов картофеля. При этом доля генома исходного сорта, который используется в обратных скрещиваниях при получении нового сорта, может составлять 85% (Будин, 1986).

Таким образом метод rapd pgr с тремя подобранными праймерами bl26, азо, а31 может быть использован для целей видовой идентификации и маркирования, а также для паспортизации сортов картофеля, что значительно облегчит процесс анализа гибридов при ранней селекции новых сортов. Кроме того появление в спекре уникальных фрагментов может быть индикатором полиморфных локусов, и эти фрагменты могут использоваться в качестве молекулярных зондов в генотипировании и анализе таксономических взаимоотношений.

3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК, АМШШМЩИРУЕМЫХ С ПОМОЩЬЮ RAPD PCR

3.4.1. Влияние одиночной замени в праОмере на перекриваемость спектров .RAPD- фрагментов...

Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для rapd маркирования картофеля, были родственные и представляли либо" точечную замену, либо инсерцию дополнительного нуклеотида. Однако следует отметить, что такие незначительные изменения в структуре праймеров привели к получению различных rapd pcr спектров картофеля, не имеющих ни одной сходной по длине полосы.

Представлялось. ,интересным выяснить, приводит ли незначительное изменение. последовательности праймера к кардинальному изменению сайтов " отжига, либо идет амплифпсация тех же ДНК матриц, с которых во время этапов элонгадии нарабатываются продукты различной длины, что и приводит к различиям в размерах фрагментов.

Для выяснения этого вопроса проводили поочередно гибридизацию иммобилизованных, на ■мембранах продуктов RAPD PCR амплификации. ДНК сортов картофеля с использованием праймеров BL26, АЗО и A3I, с Р32 меченшся зондами, которыми являлись суммарные ДНК RAPD PCR спектра сорта Бинтье, полученные I) с праймэром A3I,-2) BL26, 3) АЗО. ни в одном из трех случаев не наблюдалось кросс-гибридизации. Таким образом RAPD спектры, амшшфнцированныа при использовании одного из праймеров BL26, АЗО к A3I не перекрываются ни с одним из других RAPD PCR паттернов, что можно объяснить высокой спещфшостыо выбранных праймеров для генома картофеля, а также тем, что при подобранных условиях проведения реакции геномная ДНК праймируется по максимально возможной гомологии, и замена хотя бы одного основания в олигонуклеощцз приводит к перераспределению мест праймирования ДНК согластно новым константам связывания, в результате чего меняется спектр -амшпфщированной ДНК.

Таким образом молекулярный анализ полученных RAPD PCR фрагментов показал целесообразность использования всех трех праймеров BI26, АЗО, 131 для RAPD паспортизации сортов и видов soianwT., так как в следствии отсутствия перекрывшая RAPD PCR спектров происходит более полнее .маркирование генома картофеля.

3.4.г. Клонирование и характеристика RAPD продуктов

На основе анализа PCR спектров нельзя однозначно утверждать, что одинаковые по размеру полосы соответствуют гомологичным последовательностям ДНК. Кроме того возможно, что при проведении ■ RAPD PCR на основе одного фрагмента ДНК-матрицы синтезируются разные по длине последовательности,. что резко сникает уровень представленности генома в данном RAPD PCR спектре. Наконец

представлялось интересным выяснить молекулярную природу агпиифицировзнных с помощью RAPD PCR фрагментов: являются ли они уникальными или повторяющимися последовательностями генома картофеля.

С этой целью был проведен молекулярный анализ, клонирование и секвенирование основных макорных полос RAPD BI26 паттерна. Было проанализировано 4 фрагмента (AU6, НЕЗ, НЕ7 и НЕ9), являющихся общими для спектров всех сортов, и два (ют и НЕ2), присутствующие в rapd паттернах лишь отдельных сортов.

АОб фрагмент (1,3 т.п.н.) выявлялся не только у rapd BL26 спектров сортов s. tuberosum., а также в паттернах видов

S.cndigenum. И S. stenotomvm, ТО еСТЬ У ПреДСТЭВИТеЛеЙ ТОЛЬКО

серии т-uberosa. ДНК, соответствущая по размеру АОб фрагменту, была элюирована из геля после проведения rapd pcr ДНК сорта Аусония. АОб фрагмент был клонирован в составе плазмиды pGEM-T и использован как меченная проба для гибридизации с rapd pcr блот-фзльтром сортов картофеля. Как видно из рис. 46. наблюдалась гибридизация только с полосой 1.3 т.н.п., которая выявляется в спектрах Есех линий. То есть АОб идентичен по размеру и характерен для всех rapd pcr паттернов.

Были проведены предварительные эксперимента по анализу копийности данного фрагмента. Для ' этого проводили гибридизацию меченной пробы AU6 с геномным блот-фильтром ДНК сортов картофеля, рестрицированной эндонуклеазами EcoRi, Ваал, Hindlll. Как видно из рис.4в. АОб фрагмент детектирует ограниченное число мазорных и значительное'число минорных полос. Hozho предположить, что АОб выявляет серию слабо повторяющихся последовательностей ДНК (типа семейства генов с псевдогенам). Кроме того блот-гибридизационшй анализ с АОб фрагментом обнаруживает межвидовой и

J 23 Ч 5 б 7 я 9 10 MS¿1111 Ч

а.

12 3 1 23 1 2 4

i 23456789 10

Б.

EcoRI BamHI Hind.Ill

Рис.4 Молекулярный анализ AU6 фрагмента. a.RAPD спектры картофеля, индуцироранные праймером BL26 (1-иевскин, -2-Бинтье, З-Аусония, 4-Мондеал, 5-Лаиидота, 6-Марфона, 7-Драга, 8-Романо, 9-S.sndigenum г. chola, 10-S.steñotотит, б.Блат гибридизация AU6 фрагмента с. RAPD спектром. В.Блот гибридизация AU6 фрагмента с геномной ЛИК картофеля, рестрицирооапнон андонуклеазами EcoRI, BaoIII, HindiII, (1-Невский, 2-Бянтье, 3-S.stcnotomvm, Л-S.andigenum г. chola)

межсортовой полиморфизм, то есть, может использоваться как-НИР маркер генома картофеля: Был проведен - анализ первичной структуры AU6 клона. Поиск гомологичных последовательностей с использованием банка данных здвь не выявил высокой степени гомологии ни с одной из известных последовательностей.

Аналогичным образом были клонированы и охарактеризованы • три других общих фрагмента- НЕЗ, НЕ7 и НЕ9. RAPD фрагмент НЕ9 имеет длину 1030 шиш характеру гибридизации с рестрицированной геномной ДНК (сложный паттерн из 20 полос) монет быть также отнесен слабо повторяющимся последовательностям генома. Как и в случае AU6, фрагмент НЕ9 выявляет межсортовой: полиморфизм картофеля, что позволяет использовать НЕ9 фрагмент в качестве RFIP маркера. Клоны НЕЗ и НЕ7, также присутствущие в RAPD спектрах всех проанализированных сортов, представляют собой уникальные . фрагменты генома картофеля. Это следует как из данных, по • гибридизации с геномной ДНК, так и из данных го секвестрованию. В частности, первичная структура НЕЗ фрагмента имеет высокую степень гомологии (86.3%) с D ЭК30Н0М субединицы I гена ШДН дегидрогеназы Glycine max. у картофеля соответствупций ген еще не секвенирован, но можно предположить, что НЕЗ фрагмент, является- частью- экзона гена НАДН дегидрогеназны картофеля..

Фрагмент AUI (780н.п.) присутствовал только в-RAPD BL26 спектрах сортов Аусония и Драга s. tuberosum и соответствовал такому же фрагменту спектра S.cmdigenum. и. chola (рис.5.а). AUI фрагмент был использован в качестве зонда при гибридизации. с блот-фильтром RAPD PCR • паттернов сортов картофеля. Как видно из рис.5 б, AU1 гибридизовался лишь с 780 н.п. фрагментом RAPD паттернов сортов Аусония и Драга, и

S.cmdigenvm. v. Chola. При ГИбрИДИЗЗЦИИ фИЛЬТрОВ

рестрицированной геномной ДНК с меченной пробой AU1 фрагмента выявляется наряду, с одной мажорной - полосой несколько слабо гибридизупцихся фрагментов. Компьютерный анализ показал, что секвенированная нами последовательность AU1 гомологична псевдогену белка пататина картофеля, что объясняет результаты-блот гибридизации AÜ1 с геномной ДНК:

an.

970-?82-

i. 2. ЗУ 5 S 1 2 ъ ч В 6 у

■5 •• SlISSff ШЯ

t; i - - ;¡v »• J» -i- j^j

•»-• t;!}

Hindia

EcoRl

Б.

970

ЛИ.

не 2

EcoRI

Ват HI Л.

HindlU

Ряс 5.* Молекулярный анализ AU1 я НЕ2 фрагментов а.RAPD PCR спектры .картофеля, пдуцнрованные ирам мерой DL26 (1-Невский, 2-Бинтье, 3-Лусония, 4-Мондеал, 5~Лаймлота, б-Иарфоиа( 7-Драга, В-Рокано, 9-5.andigcauM г. chola, 10-5. stenotonum. .6« Блот гибридизация AU1 фрагиента с RAPD спектром сортов- D. Блот гибридизация I1E2 фрагмента с RAPD спектром сортов. Г. Слот гибрядяэапия ПЕ2 фрагмента с геномной ДНК картофеля, рестрицированноА эндонуклеаэами llindlII и EcoRI (1-0свскн&, 2-Аусопия, Э-Романо, 4-Драга, 5-Марфона, 6-5. stenotomua, 7-Винтье) Д. Плот гбридизация AUI фрагмента с геномной Д11К Невский)1), Аусопяя (2), S.madigeaum(3), рестрицированной эплонуклеазами EcoRl, Danlll, IiindIII. '

псевдоген пататина является уникальным участком генома (мажорная полоса) и частично гомологичен пататиновнм генам, гибридизация с которыми-дает- несколько минорных полос.

Другой фрагмент, НЕ2, был выделен из RAPD PCR спектра сорта Невский и имеет длину около 900 н.п. Как видно из рис 5.а НЕ2 фрагмент присутствует в RAPD PCR паттернах только лишь четырех сортов: Невский, Аусония, Марфэна и Драга, что и было подтверждено гибридизацией меченного клонированного НЕ2 фрагмента с блот-фильтром RAPD PCR спектра сортов картофеля (рис. 5 в). Блот ■ гибридизация меченного НЕ2 фрагмента с геномной ДНК сортов выявила множество гибридизувдихся. рестриктов • ДНК,, что также интерпретируется нами как обнаружение, слабо повторяющегося НЕ2 семейства гомологичных ДНК, которое присутвует в геноме всех сортов картофеля. Отсутствие амплификации НЕ2 фрагмента в некоторых RAPD PCR спектрах можно объяснить наличием в ДНК этих сортов полиморфизма по первичной последовательности,, на которой происходит отжиг праймера, что и приводит к отсутствию НЕ2 продукта в-RAPD паттернах этих сортов. Как-и-в случае других клонированных и проанализированных- наш повторов, последовательность НЕ2 фрагмента, не имеет высокой степени гомологии с известными последовательностями ДНК в банке данных.

Таким образом проведенный, анализ всех мажорных,. фрагментов RAPD BI26 - спектра позволил выяснить молекулярную • природу амплифицированных ДНК-. Было показано, что паттерна представлен фрагментами как уникальных. (НЕЗ, HE7.AU1), так и слабо повторящихся (AU6, НЕ2, НЕЭ,) последовательностей , генома картофеля.. При этом клонированные повторяющиеся фрагменты можно • использовать как зонды для HFEP маркирования.

выводы

1. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК . впервые ВЫЯВИЛ У сортов Solanum, tuberosum. ПОМИМО Т, ТЭКХе W-ТИП шастома. Показано,. что W-тип хлоропластного генома, шест., треть из всех исследованных.сортов..

2. Оптимизированы условия проведения RAPB • PCR и подобраны праймеры, выявлящие геномный полиморфизм .у картофеля. Показано, что одиночные замены в нуклеотидаой. последовательности праймзра- приводят- к изменению всего • спектра HAPD-продуктов, что " свидетельствует о - высокой специфичности используемых праймеров.

v 3. Для каждого из изученных видов и сортов картофеля получены индивидуальные RAPD спектры, позволяющие проводить • их паспортизацию и дифференциацию. Показано, что выявляемые •• RAPD-маркеры могут быть использованы в таксономии картофеля-для уточнения систематического положения вида..

4. Показано, что паттерн RAPD-продуктов представлен •. фрагментами как уникальных, так и слабо повторяшцихся. последовательностей генома картофеля. В двух, из шести исследованных фрагментов (АШ. и НЕЗ), клонированные ДНК была гомологичны растительному • гену НАДНТ дегидрогеназы- -и ., пататиновому псевдогену. .

5. Продемонстрировано, что три клонированных фрагмента (AU6, НЕ2, НЕ9), которые • относятся, к слабо ювторящимся • последовательностям генома, могут быть -использованы как .пробы для НИР анализа межвидовых и межсортовых различий . у... картофеля.

Синеет рпбот, опубликовании по теме диссертации

1. Кочиева Е.З., Оганисян A.C., Бадоян М.В. Использование ресгрикщюнных эпдснуклеаз для выявления полиморфизма хло-ропластнои ДНК у сортов, видов и • гкбригсз картофеля //Тез.докл.г_'ег.дунар.конф. "Современные проблемы генетики и селекции".-Киев.-1992.-С.93.

2. Оганисян A.C..Кочиева Е.З. Использование различных.зн-донуклеаз для выявления межсортового полиморфизма хлоро-пластпсй ДНК картофеля/УИзвестия ТСХА.-1995.-вып.2.-С.214-217.

3. Оганисян A.C. .Кочиева Е.З..Рысков А.П. Маркирование видов и сортов'картофеля с поыоцыэ метода RAPD РС1?//Генети-ка.-199б.-Т.32.-М,3.-С.448-451.

/