Изучение взаимодействия патогенных грибов и растений: молекулярно-генетические и прикладные аспекты

Мухамедов, Рустам Султанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение взаимодействия патогенных грибов и растений: молекулярно-генетические и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия патогенных грибов и растений: молекулярно-генетические и прикладные аспекты"

АКАДЕМИЯ Н А УК, , РЕСПУБЛИКИ УЗБЕК№СТ) ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ) *

па правах рукописи

МУХАМЕДОВ РУСТАМ СУЛТАНОВИЧ

575.113:582.769.577.2:577.21:633.16.577.212.3

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И РАСТЕНИЙ: МОЛ ЕКУ Л Я Р Н 0-ГЕ11ЕТИ Ч ЕСКИЕ II ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

Специальность: 03.00.26. - Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент —1996

Работа выполнена в лаборатории генно- и клеточно- инженерной биотехнологии Института Генетики АН Узбекистан и Института биоорганической химии АН Узбекистана.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1. ИОрвпшов А.П., член-корреспондент АН РУз, доктор биологических наук, профессор.

2. Азимова Ш.С., доктор биологических наук, профессор.

3. Атаханова Б.А., доктор биологических наук, профессор.

ВЕДУЩАЯ у ОРГАНИЗАЦИЯ: Ташкентский Государственный Университет, биолого-почвенный факультет

Защита состоится " /l- UHJS/Á. _1ЭЭб г. в_час. на

заседании Специализированного Совета Д 015.80.01.при Институте Генетики АН РУз по адресу: 700000, Ташкент, Главпочтамт, аб/я.97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Генетики АН РУз.

Автореферат разослан " " U-/LWÁ 1996 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО СОВЕТА, доктор биологических наук

Ш. Юнусханов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ-Ы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Изучение механизмов 'защиты растений в ответ на различные воздействия окружающей среда, такие как засуха, засорение почв солями и химикатами, атака насекомых, инфекция, вызываемая пзтогенами, и другие стрессовые факторы, приобретает особое значение в условиях ухудшающейся экологической обстановки. Поэтому создание экологически чистых культурных сортов растений, устойчивых к разным стрессовым воздействиям, является центральной проблемой современной молекулярной биологии и генетики. Появление механизмов защитных реакций определяется целым семейством генов, связанных с синтезом фитоалексинов, фенольных соединений, накоплением гликопротеинов, ингибиторов протеиназ, литических ферментов, таких как хитиназы и глюкзназы, гены которых уже проклониро-ваны [begrand М. et al., 1987; Hedrick S.A. et al., 1988]. У ряда растений проклонированы и другие гены, кодирующие патоген-обусловленные белки (PR) СБе Wit P.J.G.M., 1989]. Изучен один из ключевых ферментов в одной из ветвей главного пути метаболизма фенилпропаноидов - халькон-синтетаза СКоез R.E. et al., 1987].

Фенилалэнин аммоний-лиаза (ФАЛ), являясь одним из наиболее изученных ферментов вторичного метаболизма растений, играет важную роль в развитии и устойчивости растений к стрессовым факторам [Dixon R.A. et al., 1983; Jones D.H., 1984]. Ферментный комплекс реагирует на различные воздействия окружающей среда, в частности, на свет, механическое повреждение, атаку грибов-патогенов, обработку элиситорами и фитогормонами. Поэтому экспрессию ФАЛ-генов можно использоЕать в качестве индикатора физиологических изменений в ответ на разные виды стресса.

Изучение семейства ФАЛ-генов на молекулярном уровне, используя соответствующие ДНК-овые зонда, позеолит наблюдать экспрессии генов после стрессового воздействия и разработать биотесты нз устойчивость растений к стрессовым факторам. Клонирование ФАЛ-генов и изучение регуляторных элементов в "их геноме позволит з будущем создать кассету, используя регуляторные последовательности в ее составе, для трансформации ДНК, ответственной за хозяйственно-ценные признаки.

Проблема понимания механизмов взаимодействия растений и грибов патогенов требует более углубленного изучения как структурной организации генома высших растений, так и грибов.

Изучение генетически-подвижных элементов у растений, в частности, у хлопчатника, может привести к более глубокому пониманию механизма вызываемых этими последовательностями изменений генома, а также фенотипических изменений, что может быть связано с защитными реакциями растений при стрессах.

Для генома эукариот характерно наличие большого количества фракций повторов СГазарян К.Г., Тарантул В.З., 1983], среди которых гены, кодирующие РНК рибосом, представляют большой интерес как структурная основа рибосом. Изучение 4,5S и 5S pFHK хлоро-пластов, 5.8S рРНК (ДНК) и прилегающих последовательностей у разных организмов, в частности, у грибов и растений, интересно как с точки зрения фундаментального направления исследований - молекулярной эволюции, процессинга пре-рРНК, трансляции, так и биотехнологических аспектов их использования. Углубленное изучение молекулярной структуры рибосомных генов грибов родов Verttcillturn и Fusarium позволит разработать на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) быстрые, специфические и высокочувствительные методики для диагностики заболевания хлопчатника - вилта, вызываемого этими патогенами.

Изучение определенных последовательностей рибосомного оперона у растений, в частности, у хлопчатника, позволит разработать новые молекулярно-биологические подходы к идентификации сортов а видов рода Gassyplm.

ЦЕЛИ РАБОТЫ. 1. Выделение семьи ФАЛ-генов томата Lycoperatcon sscdlsnim, изучение их структуры и функции, а также механизмов регуляции этих генов при различных, видах стресса.

2. Изучение структуры нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ВТС) и 5,8S рДНК, создание диагностических ДНК-зондов на основе различий в нуклеотидных последовательностях ВТС разных евдов грибов VertlciUium и Fusortunь для экспресс-диагностики фитопатогенов в растениях и почве.

3. Определение первичных структур генов 4,53 И 5S хлоропласт-ной рРНК Gossypiw hlrsutum, а также 5.8S ядерной рРКК и Непоследовательностей рибосомного оперона G.htrsutm и Medí cago sativa, сравнительный анализ этих последовательностей с последовательностями других высших растений, разработка новых подходов к идентификации сортов и евдов Gassyplm с целью выявления мегсор-. товых и межвидовых различий.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. а) Выделение ФАЛ-генов томата L. escalen-

tum из геномной библиотеки к Харон, определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов генов;

б) выявление альтернативных, участков инициации в 2'АЛ-генах томата при различных еидзх стресса с использованием S1-нуклеазно-го картирования; •

е) проведение полимеразной цепной реакции с целью получения фрагментов ФАЛ-генов, определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов ФАЛ-генов.

2. а) Клонирование и секвешфование фрагментов рибосомного оперона грибов Vertlclllim dahllae, V.albo-atrvm, V. trtcorpus и Fusaríum охузрогт 3'-конца 18S-5.8S- 5'-конца 28S рДНК (18S-5.8S-28S рДНК) с использованием е качестве зонда рДНК дрожжей, полученных с помощью полимеразной цепной реакции;

б) выявление внутривидовых различий между еидзми и изолятами родов Vertlclllim. и Fuaarlvm;

в) использование ПЦР-амплифицированных мекгенных последовательностей для диагностики видов грибов V.dahliae, V.tricorpua, V.Qlbo-atrvm и F.охузрогт в растениях и почЕе.

3. а) Клонирование и секвенирование генов 4.5S и 5S хлоро-пластной рибосомной РНК и внутренних транскрибируемых спейсеров хлопчатника G.hirsutvm и изучение их вторичной структуры;

0) клонирование и секвенирование фрагмента 18S-5.8S-25S рДНК хлопчатника G.hlrautum и люцерны Ы.sativa и их сравнительный анализ и изучение их вторичной структуры;

в) разработка ноеых молекулярно-биологических подходов для идентификации сортов и видов хлопчатника - метода рестрикционного анализа фрагментов 18S-5.8S-28S рДНК рибосомного оперона сортов и видов хлопчатника, полученных с помощью ПЦР, метода геномной "дактилоскопии" ДНК, анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ДЦРФ), используя в качестве гиОридаззциснных проб мобильные элементы кукурузы Zea туз и хлопчатника G.hirsu.tm. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. При выполнении настоящей рзбота получен ряд новых приоритетных результатов:

1. а) Показано, что в геноме томзтз L.escalentan содержатся фенилаланин аммоний-лиазные гены, состоящие из пяти фрагментов;

0) впервые выделены гены ФАЛ-1, -2, -3 и -5. Проклскиронзны гены ФАЛ-2 и ФАЛ-5 и определена i-lx первичная структура;

в) определены цис- и транс-регуляторные последовательности, индуцируемые в.ответ на стресс;

г) показано, что полиморфизм в белковых продуктах и их молекулярный вес зависят от положения стоп-кодонов в середине или конце экзонов в различных генах семейства ФАЛ-генов;

д) определено, что с помощью метода S1 -картирования мРНК можно определять регуляторный ответ ФАЛ-генов на различные виды стресса и выяелять сайты инициации транскрипции.

2. а) Впервые проклонированы и определены нуклеотидные последовательности 18S-5.8S-28S рДНК рибосомного оперона грибов F.dahUae, V.albo-atrm, V.albo-atrm 110, V.trlcorpua и F.oxyaporum. Показаны различия в ВТС-1 и ВТС-2 последовательностях этих грибов. Синтезированы специфические праймзра, используя которые можно отличить эти грибы с помощью полимеразной цепной реакции. Применен новый подход для выявления внутривидовых различий у природных изолятов V.albo-atrvm с использованием ПЦР;

б) Сравнение нуклеотидных последовательностей ВТС рибосомного оперона грибов Verttcilltm и Fusarivm показало, что они отличаются по составу ДНК;

в) Синтезированные специфические праймеры для грибов V.dahllae, V.alba-atrvm, V.albo-atrm 110, V.trlcorpua и

F.oxyaporm можно использовать для высокочувствительной экспресс-диагностики патогенов для различных объектов.

3. Впервые определены нуклеотидные ' последовательности генов 4,5S и 5S хлоропластной рибосомной РНК хлопчатника G.htrautwi с прилегающими к ним последовательностями, предложены возможные модели их вторичной структуры. Впервые определены последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров и 5,8S ядерной рДНК

G.hir3Utvm и il.sattva. Показана пространственная вторичная структура 5.8S рДНК и ВТС-1 и ВТС-2 рибосомного оперона хлопчатника G.hirstitm, выявлена еысокзя эволюционная консервативность 5,8S рДНК и вариабельность ВТС-последовательностей.

4. Предложен принципиально новый подход для обнаружения сортовых и видовых отличий у хлопчатника, заключающийся в выявлении рестрикционного полиморфизма ПЦР-продуктов рибосомных генов.

5. Клонирован и секвенкрован фрагмент Ds-подобкого элемента хлопчатника G.hirsutm (сорт 108-Ф).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. 1. разработан принципиально новый методический подход4 для тестирования растений при действии различных видов стресса на основе полученных данных по организации и функционированию генов семейства фенилаланин аммоний-лиаз томата.

что создает условия для диагностики устойчивости растений к различным патогенам.

2. Результаты исследований служат фундаментальной основой для разработки эффективных мер борьбы с вертицилезным вилтом растений. Полученные на основе спейсерных последовательностей специфические праймеры можно успешно использовать для экспресс-анализа изолятов, видов УегНсИИит и Р.охузрогит в различных объектах.

3. Последовательности 4,5Б и 53 хлоропластной и 5,85 ядерной рДНК хлопчатника могут быть использоеэны в составе векторов для трансформации растений ДНК, ответственной за хозяйственно-ценные признаки, с помощью сайт-специфической гомологичной рекомбинации.

4. а) Разработанный в диссертационной работе метод рестрикци-онного анализа фрагментов рибосомных генов, полученных с помощью ПЦР-реакции, может быть использован в качестве одного из подходов к идентификации сортов и видов растений;

б) Геномные фингерпринты ДНК хлопчатника, полученные методом гибридизации с ДНК фага М 13, могут бнть использованы как критерии для определения таксономической принадлежности, "генетической" паспортизации сортов и еидов;

в) Использование генетически-подвижных элементов хлопчатника и кукурузы в качестве гибридизационных зондов для анализа ПДРФ позволяет идентифицировать генотипы разных сортов и видов Созаур1т.

АПРОБАШЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на 4-м симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пушкино, 1984; 1988), Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Москва, 1984), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), 5-м Международном симпозиуме по Еертициллиуму (Ленинград, 1990), 2-м Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), 1-й Республиканской конференции молодых ученых "Теоретические и прикладные аспекты генетики и селекции животных, растений и микроорганизмов" (Тзшкент, 1990), 3-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений "Молекулярная биология роста и развития растений (Таксон, (Ж, 1991), 1-м съезде физиологов растений Узбекистана (Ташкент? 1991), 57-й. годичной конференции "Здоровье растения: Воздействия окружающей среды" (Банфф, Кан&дз, 1991), на 32-м годичном совещании американского обществз по Молекулярной

биологии клетки (Денвер, США, 1992), 3-м Канадском семинаре по культуре клеток растений и генетической инженерии (Гуэльф, Канада, 1992), на 5-м Международном конгрессе по клеточной биологии (Мадрид, Испания, 1992), на б-м Международном конгрессе по патологии растений (Монреаль, Канада, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 15 статей, 18 тезисов, 4 авторских свидетельства. Всего 37 работы. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав (обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения), выводов и списка использованной литературы, включающего 613 наименований отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 67 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИЗУЧЕНИЕ'ГЕНОВ СЕМЬИ ФЕНЮШШШН АММОНИЙ-ЛИАЗШХ ГЕНОВ ТОМАТА LYC0PERSIC0N ESCULENTUM I. Выделение и изучение свойств генов фенилаланин-аыонний-лиаз томата.

Фенилаланин вммоний-лиаза (ФАЛ; код Европейской классификации ЕС 4.3.1.5) играет важную роль в развитии и устойчивости растений к стрессовым факторам, являясь ферментом вторичного метаболизма растений. Эдварде К. с соавторами [Edwards К. et al., 1985] впервые определили нуклеотидную последовательность кДНК ФАЛ из суспензии культуры клеток гороха Pisrn aattvim, обработанных элиситорами. В дальнейшем эта проба была с успехом использована для 4 видов растений - арабидопсиса, фасоли, петрушки и риса (Ohl S. et al,. 1990; Cramer C.L. et al., 1989; Lois R. et al., 1989; Mlnaml E.-I. et al., 1989]. В каждом случае была определена группа фрагментов, состоящая, по крайней мере, из 4 генов. Была определены 4 формы активного ФАЛ-белка гороха, имеющие четвертичную структуру [Bolwell G.P. et al., 1986].

1.1. Анализ генома томата с помощью метода гибридизации по Саузерну. К началу экспериментов в нашем распоряжении имелась лишь одна кДНК-проба ФАЛ-мРНК гороха [Edwards К. et al., 19853. Предварительно был субклонирован EcoRI-фрагмент размером 580 н.п. ФАЛ-генз s пдзгмидё pTZl9R, определена его нукдестиднзя последовательность, сравнена с исходной кДНК, использованой в качестве пробы (ФАЛ-580 ). При гибридизации этого зонда по Саузерну :

EcoRI-переваром геномной ДНК томата, были выявлены 5 фрагментов (рис. 1). Полученные фрагменты были обозначены как SAJI-1 (самый длинный) размером 3,7 т.п.н., ФАЛ-2 - 2,0 т.п.н., представляющий собой новый ген, ФАЛ-3 - 1,4 т.п.н., ФАЛ-4 - 0,96 т.п.н. и ФАЛ-5 (самый короткий) - размером 0,58 т.п.н.. Следовательно, гены, кодирующие синтез ФАЛ-ферментов имеют кластерное расположение.

1.2. Выделение ФАЛ-генов томата. На основе скрининга геномных библиотек томата в X Харон (Charon) ЗА и 4А с использованием ФАЛ-580 пробы были выявлены позитивные клоны, из которых выделены рекомбинантные ДНК, обработаны рестриктазой EcoRI, и фрагменты были субклонированы в плазмиде pTZ19R. При скрининге рекомбинант-ных плазмид был использован предложенный нами ранее модифицированный метод грубого лизата.

Саузерн-блот гибридизация фаговых и плазмидных ДНК, обработанных рестриктазой EcoRI, с используемой в качестве пробы ФАЛ-580, показала положительную гибридизацию. 12 из 17 положительных Х.-клона содержали ФАЛ-1 (3,7 т.п.н.) фрагмент, 2 содержали'ФАЛ-3 (1,4 т.п.н.) фрагмент и только 1 клон содержал ФАЛ-2 (2,0 т.п.н.) соответственно. Многократные попытки выделения ФАЛ-4 из библиотеки генов томата не привели к успеху.

В 12 клонах, гибридизующихся с ФАЛ-580-пробой гороха, содержатся разные повторяющие друг друга фрагменты ДНК, кодирующие ФАЛ-белки. Сравнительный анализ 4 фрагментов показал, что начало их считывания совпадает с аналогичным участком второго зкзона. Исключением из данной закономерности представлялся позитивный \-клон, несущий фрагмент геномной ДНК, кодирующей синтез ФАЛ-5 гена (0,5 т.п.н.) и содержащей два сайта для эндонуклезы EcoRI, обнаруженные в области считывания ФАЛ-5 гена по ходу транскрипции от стартовой точки (upstream region) и в так назывемой "downstream" области, расположенной против хода транскрипции от стартовой точки, непосредственно связанной с синтезом фермента. Во всех кодирующих областях ФАЛ-генов имелись сайты для Hlnd III.

1.3. Определение нуклеотидных последовательностей ФАЛ-генов томата. СубклонироЕанные в плазмиде pTZ19R фрагменты ФАЛ были проанализированы с помощью метода Сенгера Ф. Для этого использовали универсальные праймеры pTZ19R и, в дальнейшем, внутренние праймеры для самих ФАЛ-генов. Нуклеотидная последовательность гена ФАЛ-2 состояла из 1703 п.н. Сравнение последовательностей всех 4 ФАЛ-генов показало высокую гомологи» экзоное, потенциально кс-

дарующих семейство ФАЛ-белков (ФАЛ-1, -2, -3, -5) (рис. 3). Эти данные хорошо согласуются и со структурными особенностями ферментов. Высокая гомология нуклеотидных последовательностей во фрагменте ДНК, ответственном за ФАЛ-5, специфична и для целого ряда ФАЛ-генов, выделенных из других растений. Сравнительный компьютерный анализ ДНК ФАЛ-генов томата с ФМ-генами других растений показал гомологичные области в экзонах около 67%, а сравнение аминокислот - около 81%. Интроны имели частичную гомологию в областях, ответственных за процессинг.

Полученные результаты показывают, что ФАЛ-гены у томата представляют собой семейство, содержащее, по крайней мере, 5 генов в геноме томата. Нами были частично или полностью клонированы 4 гена из геномной библиотеки томата. ФАЛ-4-ген не был выделен. Вероятно, геномная библиотека не была репрезентативна по ФАЛ-4-гену. Одним из объяснений этого может быть малокопийность ФАЛ-4-гена в геноме томата, что подтверждается результами блот-гибридазации, которые показали слабые сигналы для ФАЛ-4-, а также ФАЛ-2-генов при использовании ФАЛ-580-гена в виде пробы (рис. 1). Низкая степень гибридизации для этих генов может быть объяснена также меньшей степенью гомологии с данной пробой.

В случае ФАЛ-2 и ФАЛ-3 из гороха гомология в экзоне 1 составляла около 59$, а в экзоне 2 - около 743. При сравнении N-концевых аминокислотных последовательностей ФАЛ-2 и ФАЛ-3 гороха была показана существенная гетерогенность [Cramer C.L. et al., 1989]. Мы показали, что в 4 ФАЛ-генах томата наблюдается около 91% гомологии в части экзона 2 (рис. 2). Различие в амино- и карбоксильных концах ФАЛ-генов, а также гомология во внутренних областях могут, вероятно, стать основой для объяснения регуляторных и функциональных вариаций продуктов генов. Для клевера, гороха, петрушки и картофеля была обнаружена гомологичная область, состоящая из 32 аминокислот, которая, вероятно, игрзет важную роль в функции ФАЛ [Cramer C.L. et al., 1989]. В случае ФАЛ-5 томата эта последовательность имеет отличие от других растений на 3 аминокислоты. По-видимому, ферменты, вовлеченные в синтез фенилпропа-ноидов, кодируются семейством генов, игрзмцим определенную роль в структурной организации генома растения.

Интрон <МЛ-5-гбна томата состоит из 710 п.н., кодирукщх 139 аминокислот (аргининовый кодон). Другие известнее гены содержат одиночные интроны е той же основной позиции. Сравнение с другими

0 1(3.7кЫ

2(2 Л) 3(14) 4(0.96)

5(0.58)

ет&ттелелосллтагвсААТо^сАОАтеАТТ1»тееАттогг^ 1 <х а п есАлт ат*

Ш ТПСАСА0САПаГ0СААТааАСЛААТеАТТ0АТССАТТТГГ«М«Т9ГеТС^

спттсасаооггтоосдаттоаслалтсдттмт^

м Ш ими « Ьа апиити ва » чш вити дни —вммииц. ь

ттттсА*атот?тттттцмпстт|1П1~«ю

сгост-тсац-ааааа —.... дц^ее-гптгтад^ц»^гта**д*8<Т'«'^сгсТУТТгеа*тт«<ис гтстгмс *т<гт- -. ■ <гт«.ттгтсААйт 'СП 1 > пат»сетт«лтам.тч кп *бА*.ттм*жтй»тал.твгг4~7в»*сп-1 »тттотсметатт»-—стттеА**! чьтт!см ьтА^жттАСАатмттчАГТАТААТсАТААТ^тцттттА-ттатАтгттб й т ышлш кк * ■ а»«***

л г —< в т» »»

мелт(такцладдвй»дц*сглд^Ц7А7/<>~ст*е**т—тсто*ме«итдт*т<м~ ■■ си7ссттааларйлта7апб ттоа>татттдтсао^от*лс*ГО<цеа»(стш1тл»и1 п 1I дате«*атты тати. 1аа»аатсстсатттс

Т АТ7Л-ЛЛЛАЛТТ АТТТТТйАСТ АТ ААААТТТ-—■■■ТТТП1Г1 АТТ&*к*ТТАД>—ас ТС/итгг от отт С ТГТ С-СП-

асе-д та т ад та т«-— гатст апКСШ'Я« ал т- ■ — ттттотагта&Ггь—--огтталтгтталлдсалсдгдттд

а в Ь. ^ и ь-.

»ТйАМСАА^Т|Х»вГГСТГ ФАЛ 1

............ ФАЛ 2

ФАЛ 3

н Й-...... ФЛЛ5

Рис, I

Рис. 2

Рис. 1. Анализ продуктов гибридизации ЕсоШ-перевара ядерной ДНК томата. Очищенная ядерная ДНК (2 мкг) была обработана рестрикта-зой ЕсоМ, фракциошфована в 0,8% агарозном геле, перенесена электроблоттингом на нейлоновую мембрану и прогибридизована с ник-транслированной ФАЛ-580-пробой, кодирующей карбоксильный конец ФМ-5-гена. Размеры фрагментов определены, используя \+Н1лй Ш-маркер.

Рис. 2* Сравнение терминирующих областей ФАЛ-генов томата.

Примечание; Вертикальным прямоугольником отмечены стоп-кодоны. Горизонтальными прямоугольниками отмечены кластеры поли-аденилирования. Треугольниками - сигналы полиадешишрования.

♦ал i «

♦АЛ I Н^Ц -м»

_______________________ ... ____ ____|Цмк«чА|и№тшм4Ьст

• п. (ЕЭ 4 ЦЭ/Г ,

Неп мир |>«тиц*«ц*мттмЛт«цтаитт1м*и пццгп «Пс фгвтгмигттштп I

я» м* к*

и*

им 1« и«1'Пи <1 кит ^

гл ми и«цшии,м1 1 г п ш ц^т« ¿м

««•тваеотАияш* м т

ПТП ^

¡Ач^мХ н*»« «т-

Мтмцтютикмтин

Ацци»нии№»41цдШ1 «тг»»пи«пиЛ Ачсн - - * - 1 ' «им

1 521 , ч , г

»»с е к гг^пы пииипииштт^ и СНОП УПП-"*— ишмтПТСПМ и

I ***

11|111мТ1|11|ии1ии^Пи1ШС>С -I« П» «И и«

■№К1(!ЛГШ «¿¿тши' ¿«»ипттп Хоиил^шиил <м

^хг^ытпгимммгшми^^мшмны ТТ МШТ^ у ЫММ* уу» И

Рис. 3. Сравнение нуклеотидаых последовательностей, кодирующих карбоксильные концы 4 членов семьи ФАЛ-генов. Последовательности ДНК ФАЛ-2 (сверху) и ФАЛ-5-генов (снизу) совмещены вместе и показано различив в нуклеотидаой и аминокислотной последовательностях для ФАЛ-1 (сверху) и ФАЛ-3 (снизу) соответственно. Различия окрашены и представляют собой сдвиг рамки считывания.

растениями (баклажан, горох и рис [Cramer C.L. et al., 1989; Mlnaml E.-I. et al., 1989]) показало различие в длине этой области, колеблющейся от 447 до 172 п.н., вероятно, являющейся важной в экспрессии регуляторных механизмов ФАЛ-генов.

2. Изучение экспрессии генов фенилаланин-аммония-лиаз томата.

2.2. Сравнение терминирующих областей четырех членов семьи ФАЛ-генов томата. Нами были выделены частично и полностью 4 гена (ФАЛ-1, -2, -3, -5) L.esculentит. Консервативная область всех 4-х находилась в середине экзона 2. При сравнении ФАЛ-1, -2 или -3 области с ФАЛ-5 (рис. 2) мы обнаружили 4 стоп-кодона и 3 одиночные делешш или инсерции, которые не позволяют кодировать нормальный полипептид ФАЛ в случае ФАЛ-1 и ФАЛ-3. Чтобы исключить возможность ошибки при определении структуры ДНК, был использован метод секвенирования по Сэнгеру Ф. в обоих направлениях. В генах возможно присутствие как стоп-кодонов, так и/или мутаций сдвига рамки считывания как результата инактивации последовательностей гена или псевдогенов. Также известны данные о полиморфизме субъединиц [Jorrln J., Dixon R.A., 1990]. В каждом случае число изменений в областях "upstream" кодона 1 существенно ниже, чем в "downs 1;геат"-областях (табл. 1). Эти различия более выражены в случае, когда сравниваются последовательности белков.

Таблица 1.

Сравнение последовательностей белков ФАЛ-1 и ФАЛ-3 и кодирующих их генов

"Upstream" "Downstream"

Ген ФАЛ-ФАЛ- Последователь- Последовательность ДНК ность белка -1 1,2 0 -3 4,7 0,9 Последователь- Последовательность ДНК ность белка 11,6 12,9 9,6 10,2

2.2. S1-картирование сайтов полиаденилирования. Возможность существования областей терминвции была проверена с помощью метода Sl-нуклеазного картирования и секвенирования ДНК. При сравнении областей терминашш 4-х ФАЛ-генов имеются большие области гомологии (рис. 2), а также много коротких инсерций и делеций, но существенно меньше, чем в кодирующей области (рис. 3). Однако, консенсус сайтов полиаденилирования CProudfoot N.J., Erownlee G.G., 1976] очевиден для каждого гена и может повторяться, по крайней мере, один раз (ФАЛ-1). В случае ФАЛ-3, консенсус (ААТТАА) был немного другим, в сравнении с ФАЛ-1, -2, -5 (ААГАГА) (рис. 2).

Сайты полизденилирования продемонстрированы для 2 генов. D нормальной ФАЛ-5 последовательности полиаденшшрование начинается с AGA-последсвзтельности "upstream" кластере аденилирОЕЗния (АААСАА), который локализуется е 28 п.н. от ААТАТА-элемента (рис. 2), ФАЛ-1-ген является интересным не только потому, что полипептид, по-видимому, терминируется раньше, но и потому, что имеются два полипептида. Например, в случае ФАЛ-3, 47% различий в "upstream" ДНК-последовательностях соответствуют 0,9Ж различий в I аминокислотной последовательности, но в случае "downstream", 9,6% различий в ДНК представляют 10,2% различий в полипептиде. Следовательно, "ирз1геат"-последовательности экспрессируются и играют важную функциональную роль (табл. 1).

Процент различий определен относительно нормального ФАЛ-5-гена при сопоставлении с известными последовательностями потенциальных сайтов полиаденилирования. Терминируют обе мРНК, находящиеся на 13-31 п.н. от ААТАТА-элементов и ТССТ-области, которая также расположена по ходу транскрипции к зденилирукщему кластеру (AAAAGAA или AAAAGGA), и идентифицированные как открытые рамки считывания "(рис. 2).

• Видимо, исчезновение обоих фрагментов в гетерологичной РНК показывает, что мРНК имеет защиту, и это - не артефакт при Sl-нуклеазном расщеплении. Наш неоднократные попытки показать S1-картирование для ФАЛ-3 оказались безуспешными.

2.3. Полимеразная цепная реакция ФАЛ-транскриптов. Из литературы известно, что при Sl-нуклеазном картировании идет неправильное расщепление из-за аденилзт-богатих участков. Поэтому наш была проведена ПЦР-реакция с кДНК томата, полученной из тотальной РНК из листьев, используя обратную транскриптззу и специфические олигснуклеотидные праймеры для каждого из ФАЛ-генов. Любое загрязнение геномной ДНК было предотвращено гидролизом рестриктззами после синтеза кДНК. Были получены фрагменты ФАЛ-1, -3 и -5 ожидаемых размеров. Для ФАЛ-2 ПЦР-реакцию проводили отдельно. Подученный фрагмент секЕенировали после элюции из геля, проведя предварительную очистку.

Ген-специфическая амплификация кДНК-транскриптоа коррелирует с присутствием РНК при инфекшш грибом V'.do/Шсie. Это согласуется с исследованиями по змплифккзшм с помощью ПИР полисемией РЖ, с получением активно транслируемых транскриптов, выявляемых методом S1-картирования. Присутствие активно транскрибируемых ФАЛ-генов

говорит о регуляции экспрессии этой семьи генов.

3. Альтернативные участки инициации в ФАЛ-генах томата при различных видах стресса.

В настоящей главе уделяется внимание механизмам регуляции ФАЛ-генов. Как было сказано ранее, нами было изучено 4 гена семейства ФАЛ-генов томата. Анализ нуклеотидной последовательности ФАЛ-5 показал, что он включает в себя промотор, 2 экзона, 1 инт-рон и 3'-фланкирующую область.

3.1. Сайта инициации в гене синтеза ФАЛ-генов томата. Реком-бинантный клон для ФАЛ-5 гена содержал три EcoRI-сайта. Один из фрагментов имел 5'- upstream-оОласть, Еключающую в себя 1 экзон, интрон и часть 2 экзона. Полнзя нуклеотидная последовательность этого фрагмента с указанием олигонуклеотидных праймеров приведена на рис. 4. Для определения сайтов инициации транскрипции, меченная проба. ФАЛ-5 была подвергнута SI-нуклеазному расщеплению с клеточной РНК из поврежденных листьев томата, в результате чего были идентифицированы 2 фрагмента. Так как контрольная не гомологичная РНК из E.coll не показала защиты во всех дорожках, полученные защищенные фрагменты являются чистыми производными транскриптами из ФАЛ-5 и ФАЛ-2. Такой же олигонуклеотидный праймер был использован для получения сиквенсного маркера молекулярного веса.

В случае ФАЛ-5 перЕый сайт инициации транскрипции находится в 44 п.н., а второй - в 146 п.н. по ходу транскрипции от ATG-последовательности старт-кодона.

В случае ФАЛ-2 гена был синтезирован специфический праймер 18 п.н. к 3* концу (278 п.н. от стоп кодона) и использован в качестве затравки и введения (32Р)-АТР. После добавления немеченных нуклеотидов ДНК была расщеплена эндонуклеазой Hinc II. Меченный фрагмент размером 374 п.н. бил очищен электрофорезом в 68 ПААГ. Суммарную РНК из листьев, индуцированных механическим стрессом и грибом V.ctahliae, гибридизовали с меченой пробой, после инкубации при 42 , 16 ч. обрабатывали SI-нуклеазой. Продукты анализировали в 6%-денатурирукхцем ПААГ. Дальнейшим SI-расщеплением РНК-ДКК комплексов при различных концентрациях SI-нуклеазы мы обнаружили на радиоавтографии единичную полосу, что говорило о SI-запзте. Этот сайт находился в 93 п.н. против хода транскрипции от стоп кодона, сообщающего "ААТААА" элемент.

3.2. Ответы ФАЛ-генов на стрессы окружающей средн. Выявленные сайты инициации транскрипции были изучены при различных видах

стресса с целью определения их функциональных свойств. В случае облучения светом при экспозиции 12 часов в сайте инициации транскрипции 1 наблюдалось увеличение уровня транскркпци в 3 раза по .сравнению с контролем. По сайту инициации транскрипции 2 ответ был в 1,8 раза больше по сравнению с контролем (рис. 5А).

Многие важные патогены также индуцируют экспрессию ФАЛ-геков на уровне транскрипции (Lee S.-ff. et al., 1992]. При действии гриба V.albo-atrxm и V.dahlias наблюдается существенное увеличение стимуляции транскрипции с обеих точек инициации по сравнению таковой при механическом повреждении (рис. 5Б).

Данное исследование показывает, что ФАЛ-гены используют разные точки инициации транскрипции в ответ на различные вида стресса. Анализ нуклеотидной последовательности и SI-нуклеазное картирование ФАЛ-5 гена показывает, что имеются две точки инициации экспрессии, в 44 и 146 п.н. по ходу транскрипции от стартового кодона трансляции. Облучение светом растений увеличивает инициацию транскрипции в точке "I" в 3-8 раз при 2-4-часах осве-'щенияив точке "2" только при 12 часовой дозе. При действии гриба-патогена V.dahllae или механическом повреждении увеличиваются уровни инициации транскрипции с обоих точек в 3-7 раз (рис. 5Б).

Эти две точки инициации трансляции ассоциируются с двумя "TATA" элементами, идентифицированными в "upstream" области от точек (TATA 1) и (TATA 2) в 42 и 27 п.н. соответственно (рис. 4). Кроме того были обнаружены "СААТ" последовательности в 243 п.н. от точки 1 и в 212 п.н. от точки 2. Сравнение "upstream"-областей и промоторов из других фенилпропаноидных генов показало наличие дополнительных элементов, гомологичных двум боксам, консервативных во многих генах (Olli S. et al., 1990].

Для проверки функциональных свойств двух точек инициации, нами была использована Sl-нуклеазная защита при обработке растений механическим повреждением и грибами-патогенами. В случае ФАЛ-5 гена 2 точки инициации транскрипции по разному отвечают на различные виды стресса, существенное увеличение индукции светом не влияет на точку инициации 1 по сравнению с точкой 2, где наблюдается больше транскриптов, чем в точке 1.

При другом Евде" стресса - действии гриба-патогена 7.dahl ios на интактные растения через корневую систему наблюдалась индукция, в 3-3,7 раза больше с обоих точек инициации транскрипции после 2-х часовой инфекции. Инициация транскрипции с точки 1 была подобна

ш*тстсплал*с1ш*1шлпыто«1дпшИАл1»Л1*пмАТЛЛ1лглыАллеотсл*дпл*пшт -leu

ШАтИвТЫДШетС*иТ1ДПЛЫПЫШСЫЛЛТЛТиП*Д*«АЫ£"Д1ТЛТШЖЫТ1ЫСАД1ТЛА*(ТЛСД •»> АССЫПАДСАД7АА7ДПи1ДтАПтАТГ777ПАА7СГ1АОТЫТ7ЛАТ7СТТЫГ16ДДАС7АЛТ77САТДГГАЛАЛДАДТ -101

АТ7ААДстштстпшдААиттттсАстапииикдА7шшлишл7АЛАААСАСгсошшт^^ >iu

*шт**дмю*лм1штпАтп*тошттше11ПАОА*п*£АШТ*1*ты1хстттПАТ**л -7а ПА6ТПААА6СвТАТПА787СПА676ТТТТГ|АТСАС6А7ААААА7АЛАТТАЛ6АЬАСАССАААСТАА6А£А7АСАСАТ16А7АА7С -В1 ' ACTAAATCAA7ATTTAA7AAT7CTATAATAATTTA6CA767CTACAAAC7íA7ACCCfiA7AAATCAAATCAAAATSACCfiAA7ATTCAAC -(41 ССТАЛ7ЛТТА6ААА7ТТ7ТА7С7А76ПААТААТСЛ7ТТАСв7СТСТСА£СААСАТТАА6ААЬАЛАА6Ав78С7А6ДЛТТАСААТТ7ААС -«И СС7ТЛАТТТТС7ЦСААСААСССААААААААСТССАААСАТАТСС7АА4ТССАССААССССЦААААТТТАА1111111ПСЧВШЩ >9(1 TATTTnAAAAAAAATTATATCCATSTT6CATtAAATACtCACíTCATCCTtAAATCTtAACCCnAATC6CAATTAAA^¿gjgpeCTA -Í71 щпшсу'"•""•'"yTTmmTCA-n(r""r''*"'',gTCTCAmAAI IIICIПАСС1АСЦТССТТТСПСППС -1U ДДДсТСАССАСДТАТАТСА7С7АССААи^СААААААААТА<7ААТААТАСАСТАА7ЕАТАСТТСАСААСА7АТТТТТт^Д -II

^^Дштл*мтгсситтгтптстсаштгстспЖг*штстсип*слмтсшситтпттш -1.

Рис. 4. Нуклвотидаая последовательность ФМ-5-гена томвта, расположенная по хода транскрипции от стартовой точки ("sггеат"-область). Примечание: прямоугольником доказаны участки тртштя1рт транскрипции (определены S1 -картированием); треугольником обозначены сайты терминации транскршщии.

* « •

Ярок (чаем)

(Ü3" н«|>«

i^H Ннфошш

САЙТ Нмштш иРНК

рис. 5. Уровни транскрипции в ФАЛ-2-гене томата "при обучении светом (А) и механическом повреждении и действии гриба-патогена

7.<Ш11ае (Б)., __г.....................1

КП1Ш1

ФАЛ NPHK I

КаяорвшА Поврекдоом

Рис. 6. Гипотетическая схема" структурного и функционального изучения ФАЛ-генов томата.

Примечание: два сайта инициации транскрипции показаны стрелками, мРНК I и мРЩ. 2 отмечены прерывистой и непрерывной линиями соответственно. Разные предполагаемые ТАТА-регуляторные элементы связаны с каждым главным сайтом инициации, показаны предполагаемые множественные "upstream"- и транс-активные элементы (белковые факторы), которые могут по отдельности соответствовать любому из ТАТА-мотивов и сайтам инициации. Толщина каждой линии в длинных стрелках показывает уровень индукции посредством различных воздействий окружающей средн. -

эффекту от облучения. Наблюдаемый эффект со 2-й точки был более значительным, чем с точки 1 при инфекции У.<3а1\11аз.

Таким образом, настоящее исследование показало, что экспрессия ФАЛ-генов томата Ь.езсиТе^т может привести к появлению двух разных транскриптов в ответ нэ различные воздействия окружающей среды. Это - первое сообщение о гене защиты растения, продуцирующего альтернативные транскрипты из двух сайтов инициации в ответ на различные стрессы. Определение нуклеотидных последовательностей ФАЛ-генов позволило выявить комплекс промоторных элементов (рис. 6). ТАТА-последовательности локализованы на соответствующем расстоянии от каждого сайта инициации (например, СААТ-бокс). Другие предполагаемые "ирзггеапГ последовательности наблюдались в области по ходу транскрипции в двух сайтах, указывающих на существование независимых наборов регуляторных элементов, по-видимому, связанных с этими двумя сайтами инициации.

И поранение и патогенная инфекция активируют и стимулируют экспрессию из обоих сайтов инициации, но индукция явно более значительна в сайте инициации 1 и регулируется в результате связывания предполагаемого "ирзггеапГ-элементз с элементом 1 и ТАТА-элементом (рис. 6). В то время как для сайта инициации 2, полная индукция при поранении и патогенной инфекции не значительна. Клонирование и идентификация альтернативных сайтов инициации в промоторе ФАЛ-генов могут в будущем дать возможность наблюдать предполагаемые тканевые и клеточные эффекты на растительных системах.

МОЛЕКУЛЯРНО-НИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ГЕНОМОВ

ГРИБОВ РОДОВ ТЕННСШЯШ И РШМПИ I. Организация генов рибосомных РНК грибов рода УегИсШш.

1.1. Рестрикционный анализ ядерной ДНК грибов родов УегИсШш и 1ЪмюПт. Проблема диагностики еилтэ, вызываемого грибами, относящимися к родам УегНс111ит и Гизаг1т, очень сложна и трудно разрешима традиционными методами. Метод рестрикцион-ного анализа ДНК в некоторых случаях позволяет выявить существенные структурные отличия даже у близких еидое. Для У.&йхИае характерна сложная картина с большим количеством рестриктных полос, что резко отличает этот гриб от других видов грибов. Со всеми использованными рестриктазами наблюдается почти полнее отсутствие фона в области фрагментов ДКК с большой молекулярной массы, образующегося за счет расщепления уникальных последовательностей ге-

нома. В результатате рестрикционного анализа грибов разных .видов и рас родов Vertlclllivm и Fusarium показана разная интенсивность полос, свидетельствующая о различной частоте повторов отдельных последовательностей в геноме, но сам факт образования такой сравнительно простой рестриктной картины может отражать только наличие очень большого числа повторяющихся последовательностей в геноме гриба, представленных, в основном, рибосомной ДНК tLauer G.D. et al, 1977].

1.2. Клонирование генов рДНК грибов рода Verticillm. В последнее время получил распространение метод идентификации организмов, основанный на применении диагностических ДНК - фрагментов генома искомого организма, выделенных методами рекомбинантных ДНК, которые служат меченными зондами в реакции гибридизации нуклеиновых кислот {Southern Е.М. et al., 1975]. В сочетании с методом амплификации геномной ДНК-мишени [Salkl R.K. et al., 1985; 19881 метод позволяет обнаружить несколько молекул искомой ДНК.

Одним из универсальных классов повторяющихся последовательностей являются гены, кодирующие рибосомные ДНК (рДНК). Нуклео-тидные последовательности, кодирующие рДНК, консервативны, тогда как спейсерные области, разделяющие их, обладают большой изменчивостью CNazar R.N., 1982]. Спейсерные области, таким образом, представляют собой удобный источник диагностических ДНК.

По результатам рестрикционного анализа геномной ДНК грибов оказалось возможным различать, по крайней мере, виды, т.к. картины повторяющихся последовательностей различны и характерны для каждого вида (рис. 7А). Мы использовали для гидролиза ДНК рест-риктазы Hlndlll (дорожки 1-Ю) и EcoRI (дорожки 11-18). В результате гибридизации фрагментов ДНК с рекомбинантной плазмидой pSC4 наблюдались положительные сигналы с различными фрагментами (рис. 7Б). Только в случае действия Hlnd III на радиоавтографе присутствует одна полоса, характерная для Есех изучаемых грибов. В случае использования EcoRI наблюдается положительный сигнал с одним фрагментом ДНК из V.dahllae (коллекция ИБМФ) и с шестью •фрагментами ДНК вирулентного штамма 2 (коллекция САНШЗР). По два фрагмента из ДНК V.dahllae (коллекция отдела общей генетики Таджикистана) тзкже гибридизсЕзлись с рекомбинантной плазмидсй рЕС4. Еиды V.trtcorpue и V.nlgrescens отличались по одному из фрагментов.

Определив размеры двух гибридизующихся повтороЕ, мы провели расщепление ДНК гриба и препаративно выделили фрагменты размером

около 6,8 и 2,35 т.п.н., которые были проклонированы в векторе PTZ1SR. Их нуклеотидаая последовательность была определена по методу Сзнгерз. Анализ показал, что клонированные фрагменты, названные pVD4 (6,8 т.п.н.) и pVD131 (2,35 т.п.н.), действительно относятся к рЛНК, причем оба они в сумме составляют полную повторяющуюся единицу. Нами был проведен компьютерный анализ полученных нуклеотидных последовательностей размером около 9,1 т.п.н. Сравнение полученных последовательностей с рДНК дрожжей [Rubtsov P.M. et al., 1980] позволило локализовать кодирующие области и разделяющие их спейсеры, и построить схему организации повторяющейся единицы рДНК V.dahlloa (рис. 8). Клоны, вставки которых относятся к области внешнего транскрибируемого спейсера, были использованы для приготовления меченных зондов методом синтеза второй цепи. Гибридизация серии таких зондов с ДНК хлопчатника и исходных грибов позволила найти области, дающие положительный сигнал с ДНК грибов, но не дающих его с ДНК хлопчатника (рис. 9).

Далее нами был клонирован рибосомннй повтор другого евдэ гриба 7.albo-atrvm. При рестрикции EcoRI обычно наблюдается три фрагмента - 6, 3 и 1 т.п.н. Полученные фрагменты были субклониро-ваны е векторе М13тр18 и частично секвенированы по Сэнгеру.

2. Прикладные аспекты изучения рибосоыного оперона грибов родов Verticillum и Fusarium.

2.1. Использование ПЦР-амплифииированных межгенных последовательностей для диагностики V.tricorpus. Как первый шаг в адаптации технологии ПНР для диагностических целей мы определили первичную структуру 3'-конца 18S-5,85-5'-конца 28S рДКК гриба V.trtcorpu3. Сравнение этих последовательностей грибов V.albo-atrvm и V.dahUae показало, что 5,85 рДНК во всех грибах была полностью консервативна (рис. 10). V.albo-atrvm и V.dahlias тлеют различия по трем нуклеотидзм в ВТС-1 и по дез в ВТС-2 (рис. Ш. V.tricorpus оказался более даергентен. Различия в нуклеотидах по 20 позициям обнаружены при сравнении V.dahllae и V.tricorpus, по 10 - е каждом ВТС-регионе. При сравнении последовательностей V.alba-CLtrum и V. trlcorpua были найдены различия по 16 позициям, семь - е ВТС-1, и деЕять - в ВТС-2. V.albo-atrvm и V.tricorpjs имели различия по 5 "куклеотидам в сравнении с V.dahllae. Используя эти различия, были синтезированы специфические праймеры для ВТС-2 грибов V. dahliae и V. albo-airm. Тестирование изолятов из различных'объектов показало, что полученные зонды яеляются специ-

1 I ) « I I f •• m> » II I» 1» W w II

Рис. 7. Сравнительный рестриктный анализ ДНК грибов родов Vertlcllllum и Fusarium (А) и свузерн-блот-гибридазация (Б) ДНК этих грибов с с плазмидой pSC4.

Примечание: А - образцы геномных ДНК обработаны рестрикта-зама Hlnd III (дорожки f—10, 19) и EcoR1 (дорожки 11-18): 1, 10, 19 - ДНК фага X + Hlnd III; 2, 11 - ДНК v.dahllae (коллекции ИБФМ); 3, 12 - ДНК V.dahllae 2; 4, 13 - ДНК V.dahllae раса 1 (хл-1-3); 5, 14 - ДНК V.dahllae раса 2 (хл-78); 6, 15 - ДНК V.dahllae раса 3 (П-70); 7,16 - ДНК V.tricorpus П-112Э: 8, 17 -v.negrescens П-1033; 9, 18 - ДНК F.ozysporvm f.vaslnfectvm 235.

Б - радиоавтограмма того же геля после гибридизации.

г» 5.в s im im <• ■ I im а t

омвмр iifm i - рпя

Рис. 8. Схема организации рДНК V.ddhllae, построенная на основании данных структурного анализа клонированных и секвенированных

фрагментов геномной ДНК. Значения длин фрагментов даны в т.п.н.

111 4

Н^И Рис. 9. Определение специфичности • Г (А) и чувствительности (Б) метода Ц_| диагностики пзиба 7.<Ш11ае посред-7мг ством дот-гаоридизации с плазмидой КЗ л рУВ51б:

■яА А - последовательные 10-кратные ШЛ разведения (а - 1 - 4) ДНК плазми-КЯ да рУВ516, начиная с 0,1 нг/мл; (б М - 1 - 4) ДНК У.баПНае, начиная с ■В 0,01 нг/мл; (в - 1 - 4) ДНК в Р.охузрогит, начиная с 10 нг/мл; (г , , , 4 а , г-1-4) ДНК рВЙ 322, 10 НГ/МЛ. шнашниашн Б - последовательные 10-кратные

разведения (а -1 - 7) ДНК инфицированных грибом У.скЛИае (раса растений, начиная с 0,1 нг/мл; (б -1 -7) ДНК шйицированных грибом ШШШШШШШШШШШШШШ У-йаЬНае (раса 2) растений, начиная с 0,1 нг/мл.

фичннми для этих 2 видов грибов (рис. 12). Специфические праймеры, синтезированные наш для УЛПсогриз, не работали, когда использовались ДНК других видов грибов. ПЦР-тесты из других изолятов У.1г1согриз разных растений даЕзли положительный ответ при использовании этих специфических прэймеров (рис. 13, табл. 2).

Нзми также была сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК на основе ртг19й с фрагментом гетерологичной ДНК Г.оггузрогш 1.эр. vaзlnfect'Jm, амплифицированной с помощью специфических праймеров для УЛг1согриз, которая может быть использована в качестве внутреннего контроля в ПНР-реакции для количественного определения различных видов УегПсШш из почвы или различных органов растений. Определение биомассы грибов можно провести также по калибровочной кривой (рис. 14).

Таблица 2.

Анализ изолятов VЛПсогриз при помощи ПЦР, используя специфические праймеры для У.а1Ъо-с^гш ( У.А.), У.сйЛПае (У.Б.), V. ^{согриз (У.Т.).

Культура

хозяин

_праймеры_

V.A. I V.D. 1 V.T.

источник

25 хлопчатник + Калифорния, США

2 хлопчатник + Ташкент, Узбекистан

114 картофель + Голландия

115 картофель + Голландия

118 картофель + Остров Принца

Эдварда, Канада

117 картофель + Манитоба, Канада

133 картофель + Голландия

162 картофель + Голландия

163 картофэль + Голландия

16 4_картофель _-_+ Голландия_

2.2. Выявление внутривидовых различий у природных изолятов V.albo-aîrvm. Используя специфические праймеры к 3 видам грибов V.dahllae, V.îrlcorpus и V.albo-aîrwn - VD, VT и VA - с помощью ПЦР было проведено тестирование более сотни изолятое Vert ici Шш, выделенных из разных видов растений и показана высокая эффективность метода для таксономической идентификации. Каждая пара праймеров идентифицирует свой вид грибов. Однако, среди картофельных изолятов один, полученный нами как V.albo-atrwn (N 110) с острова Принца Эдварда (Канада), не реагировал на все 3 пары праймеров (рис. 15).

Мы амплифщдаровзли, клонировали и секЕенироЕали последовательность 3' конца 18S-5,SS-5'-конца 28S рДКК межгенной об-

• •1С

- в5 Yr

(шесш katuictct ст »UTTTTU—*JTT

336 Т.П.Н.

i—Г fz--Г -ХГ='_

Рис. II

Рис. Ю

Рис. 10. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ВТС) рДНК V.albo-atrum, V.trtcorpus и т.ваМлае сверху вниз соответственно. Стрелками показано расположение праймеров.

Рис. II. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров грибов: . abed а b

А - v.albo-atrvm; Б - V.dahllae: ,лл /т

; rv \р)

V. яЛжШпт ^ ЛЛЛ»

tMt npn4«* W

РИС. 12 РИС. 13 '

Рис. 12. Тестирование изолятов из различных растений, инфицированных грибами У.а1Ъо-аХгит и У.скШ1ае с помощью ПЦР-реакции.

Рис. 13. Определение и дифференциация 7.1г{согриз с помощью ПЦР. ДНК экстрагирована из спор грибов:

А: а) V. а1Ъо-аХгт из люцерны; Ъ) У. баЬНае из подсолнечника; с) УЛг1согриз из хлопчатника и й) из картофеля.

В: а) ДНК картофеля неинфицированного и Ь) инфицированного 7Лг1согриз. ц

10« 10 I 0.1 0.01 0.00) 0.0001

(А)

I Ксяйраль

Кояпкспо ДНК гриба (иг)

Рис. 14. Определение корреляции между количеством ДНК гриба УАг1согриз и продуктом ПЦР-реакции. Количество ДНК варьирует от 0,0001 до 10 нг. Геномная ДНК была амшшфицирована в присутствии 0,1 пкг гетерологичного внутреннего стандарта. А - Радиоавтография продуктов амплификации в 8% ПААГ; Б - Количественное определение продуктов амплификации в жидком ецшщиляторе.

ласти У.о1Ьо-а1гш1 (Н 110). Эта последовательность, а также последовательность У.йаЛКае, 7,а1Ъо-Мгт и 7ЛПсогриз приведены на рис. 16. Последовательность 5,8Б рДНК У.аТЬо-а£гш (Н 110) была консервативна, ВТС-области существенно отличались от исходных V.а1Ъо-аггт на 17 нуклеотидов. Изолят N 110 оказался более отличным от V.агЪо-агтт и имел близкое сходство с 7.?г£согриз, который в свою очередь имел рззличия с V. а!Ьо-аСгш на 18 нуклеотидов. Нами была синтезирована пара праймероз для У.а1Ьо-а£гют (И 110), которые использовали для тестирования изолятов из различных районов Канады (рис. 17, 18). ДНК всех островных изолятов позитивно реагировали на праймеры 7.а1Ъо-а1гит (И 110), несмотря на то, что присланная культура клеток была V.аТЪо^гия. Далее мы проверили картофельные изоляты из соседних провинций Канады и США, Европы и Средней Азии. Почти Есе они были УА-положительные и V110-отрицательные, некоторые изоляты из почв Ныо-Брунсвика положительно реагировали на У.110. Изоляты 7.а1Ъо-а1гит из Великобритании также отрицательно реагировали в реакции с 3 парами прайме-ров (УА, VI10, УТ). Ранее сильно вирулентный изолят У.а!Ьо-а£гш из клевера был проанализирован методом ЦДРФ и найдены отличия от 7.а1Ъо^гит 1Неа1 |Г.К., личное сообщение]. Нами также был про-клонирован фрагмент 18Б-253 рДНК 7.а1Ъо-агпм из Великобритании. Мы обнаружили, что он Есего на 1 нуклеотид отличается от 7.а1Ъо-Мтт с острова Принца Эдварда. Следовательно, оба изолята принадлежат к одной подгруппе 7.а1Ъо-аггит.

Данный диагноз был также подтвержден микологическими исследованиями (Нагтз Н.Б., личное сообщение). Вопрос об интерпретации родства этих 2 изолятов с разных континентов можно объяснить тем, что, вероятно, гриб был занесен в почву остроЕа Принца Эдвардз много лет назад с семенным материалом из Англии, что указывает на эволюционное происхождение этой подгруппы, в этой подгруппе возможны разные типы рекомбинаций, и также вероятно образование межвидовых гибридов. Следовательно, две субгруппы географически различающихся У.а1Ъо-<хгт могут быть точно определены с помощью специфических праймероз методом ПЦР, что невозможно продемонстрировать как обычными таксономическими методами, так и фитопатологии.

2.3. Получение ДНК зонда для гриба Р.охузрсглп методом ПИР. Проблема диагностики вилта актуальна также для гриба рода РизаЛит.. Используя наш опыт получения 185-5,85-235 рДНК из гри-

1. íjíHl» т В

Г. »IbO'itrum Т

I. «.«. 110 IES рРНК ,- ЛТТЛССеАеТАТСТАСТСАТААСССтетСААССАААТ7еТТ6СТ1СИСе "Т

Г. trlCorpus r С -l

тт с ce» t с

м т а 6 ^

6CTCGTCC~eC6A6CCC6CC6eTACATCAeTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCT6A6T6TTCT7A-CGAACTA7TA .

A J

S.»S гШ

с ее

TCAACCCTCGAeeCCTAeTGecCCGSTeTTGGeeATCTACTTCTeTACeCCCTTAAAATCAGTGGCGÜACCCGCGÜlCCC

е аса с е тт се

аса с тт с :

TTccTTeteTAeTAATTTTcecTcecATceeACTcccGTAeecACCAeccTcTAAAcccccTACAAeccCttTCTccTAcúác

с с s

т с

ААсипеАсстсеелтсАеетлсемт • 25$ рРНК

Рис. 15. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ВТС) рДНК из различных видов Vertlcllltш. Представлена полная последовательность изолята У.а1Ъо-аггт № 110). Различия в нуклеотидах 7.а1Ьо-аггш, УЛг1со1граз и 7.(ЗаЬИае приведены сверху и снизу от последовательности 7-.о1Ьоч^гт (N110).

Рис. 16

Рис. I?

Рис. 18

Рис. 16.

МОЩЬЮ ПЦР. ЛЦи-L, ¿JH.UÍI ля V.dahllae (V.d.J,

.еление и дифференциация видов Verticíllim с по-

ванная из спор грибов изолятов картофе-

.d.J, V.albo-atrm (V.a.a. f, ** ------- "" ■*■ ' ~

V.albo-atrvm (V.110), была тести

V.trlcorpúз (V.t.) и

и VI и получены продукты ai V.d.., 337 п.Н. - у V.t.

Рис. 17. Продукты

>вана с помощью гграймеров VD, VA :ации размером 334 у V.a.a. и

Рис. 17. Продукты аммшшфикашш изолятов грибов, полученные при использовании праймеров для V.albo-atrum IT 110 (V.110): 1. ДНК V.albo-atrvm N 110 (V.IIÓ); 2. ДНК V.albo-atrm (V.a.a.); 3. ДНК V.dahllae (V.d.); 4. ДНК V.tricorpus (V.t.).

Рис. 18. Сравнение изолятов грибов V.albo-atrvm картофеля из различных областей Канада при получении продуктов амплификации с помощью ПЦР используя таймеры V.albo-artm (V.a.a.) и V.albo-atrm N 110 (V.IIO): а -1 с Острова Принца Эдварда; b - Нью-Брунсвика; с - Квебека; d - Саскативана.

Оов Veriicllllum, мы провели ПЦР с рДНК гриба F.oxl3porvm, используя праймеры к концам 18S и 28S и в результате получили фрагмент около 950 п.н. (рис. 19). Чтобы еще более облегчить задачу, мы получили ПЦР-продукт внутреннего транскрибируемого спейсера ВТС-1 между 18S и 5.8S рДНК, состоящего примерно из 200 нуклеоти-дов. Нами были синтезированы синтетические дезоксинуклеотиды (5'-TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3' область, комплементарная 18S и 5'-GAACCAAGAGATCCGTTGTTCAAAG-3' область, комплементарная 28S рДНК), которые после снятия защитных групп использованы для ПЦР.

Результат использования этих прзймероЕ для амплификации клонированной и геномной ДНК V.dahlias, а также для геномной ДНК гриба F.oxysporvm f.vaslnfectm показан на рис. 20. Два рода гриба V.dahliœ и F.oxyaporvm дают амплифицироЕанные фрагменты разной длины. Материал основной полосы дорожки, соответствующей ДНК гриба F.oxysporvm, очищали электрофорезом в 2,5% агарозном геле, электроэлюировали на ДЕАЕ-мембрану, обрабатывали фосфатззой для получения тупых концов и использовали для клонирования.

Для клонирования использовали вектор PTZI9R, рзсщепленный по Sma I-сайту. Секвенировние проводили по Сэнгеру. Компьютерный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей грибов F.oxyspurm и V.dahliœ между генами 18S и 5,8S генами рРНК показал, что на концах клонированного фрагмента имеются области, гомологичные концам генов 18S РНК и 5.8S РНК (рис. 21). Эта области длинее, чем использованные праймеры, и всегда присутствуют на концах амплифицированного фрагмента. Таким образом, использованные праймеры позволяют специфично амплифицировать последовательности ВТС-1 рДНК гриба F.oxysporvm.

Анализ последовательностей ВТС-1 грибов F.orjsparvm и V.dahliœ показывает, что они отличаются по нуклеотидному составу (рис. 21). Так, GC+AT-пары F.ozysporum и V.dahlias примерно равны (V.dahliœ GC = 8 п.н., AT = 11 п.н., a F.oxysporvm GC = 9 п.н., AT = 9 п.н.). Однако, у гриба F.oxysporvm обнаруживается уникальный сэйт рестрикции - Sraa I (CCCGGG), который делает его одним из маркеров для проверки зонда.

С помощью 2 новых праймёрзв, последовательности которых не фланкируют консервативную часть генов 18S и 5.8S рРКК и амплифи-цируют лишь внутреннюю область БТС-1-участка рДНК, была проведена специфическая амплификация ДНК гриба F.oxysporvm из инфицированных листьев хлопчатника сорта 6037 О.ЪагЪайгпзе (рис. 22).

M t 3 3 4

rrst

tbi

mi m

я» та

rvsi TO

».g НЖ .

шшш ltcccrtcR сшсттт imima ticrmcw ыссадсм «сесггеп дшети штссст mcucutî

• •■•MB»** «а........ .•*.*.•«• .. * • ••••

¿шсшс1 пшсшс шсшссс сст-сптсс cccgcccc-t âCUCnJCC nttUftti UUUCAU сяатсслсс САШССАСС

tcïucscce ахгскяс tccccc-tcc сшссяхт ассвдспс ссюисо пигта гасшк -. » . * ' tes^gyt

досши 1UCXTSU2 uateau хсшшсс сысспие ссттсс ccaccffîjtc

CX1CCCU1

сиссеш

Рис. 19 Рис. 19. Анализ охувропт. 1 -

Рис. 20 Рис. 21

'дукта ПЦР 18S-5.8S-28S рДНК гриба Fusarium продукт; 2 - маркер 1 т.п.н. (лестница).

Рис. 20. Гель-электрофорез продуктов амплификации ДНК грибов V.äahllae и P.oxusporum с помощью полимеразной цепной реакции: 1

- Клонированная ДНК гриба V.dahXtae из плазмида pVU4: 2 - Геномная ДНК гриба F.cm/sporum; 3, 4 - Геномные ДНК гриба v.äahllae', М

- маркер длины (ДНК фага С-1В57, обработанная Hind III).

Рис. 21. Сравнение ВТС-1 -последовательностей рДНК грибов F.oxysporum кУ.ваЬНае.

Примечание: Звездочками отмечены области гомологии.

• f-1

Рис. 22.

Рис. 23

Рис. 22. ПЦР-фрагменты из тотальной ДНК грибов F.axysporm и У.dahlias, выделенных из инфицированных листьев хлопчатника G.barbaâense: 1 - ПЦР-фрагмент F.oxyaparum; 2, 3 - ПЦР-фрагменты V.äahllae; U - маркер А, + Hind III.

Рис. 23. Слот-блот-анализ ПЦР-фрагментов ДНК гриба F.oxysporum (выделенных из листьев хлопчатника G.barbadense) с клоном 14, содержащим ВТС-1 между 18S и 5,8S рРНК:

1 - Разведение ПЦР-фрагмента гриба F.oxysporum от 1 мкг/мл до 0,001 нг/мл; 2 - Гибридизация ПЦР-фрагмента F.oxysportm с грибом V.äahllae; 3 - Гибридизация ПЦР-фрагмента F.oxysporvm с геномной ДНК F.oxysporum, выделенных из листьев.

1 2

Опыты по гибридизации ДНК-зонда с ПЦР-фрагментом геномной ДНК гриба F.oxysporm из \шфицированого хлопчатника подтверждают, что амплифицированный фрагмент является родоспеиифическим, так как он, гибридизуясь с геномной ДНК F.oxysporvm, не гибридизуется с геномной ДНК V.dahlias. С помощью метода слот-блот-гибридизации показана возможность использования полученного зонда для обнаружения гриба F.Qxysporvm в почве и растительных материалах с чувствительностью 1 пкг ДНК гриба в 1 г исследуемой пробы (рис. 23).

МОЛЕКУЛЛРНО-БМОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ГЕНОМ

ХЛОПЧАТНИКА GOSSYPIUM HIRSUTUM И ЛЩЕРНЫ MEDICAGQ SATIVA

I. Анализ гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента Ds-подобного элемента хлопчатника и Ds-6233-элеыента кукурузы.

Нами была выдвинута гипотеза горизонтального переноса генетически-подвижных элементов в процессе эволюции, в связи с этим была исследована способность гибридизации рестриктных фрагментов генома хлопчатника с одним из Ds-элементов кукурузы (Ds-6233),

являющимся производным автономного Ас-злемента кукурузы Zea тауз с делецией около 2,5 тыс. пар оснований центральной части Ас-элемента [Döring Н.Р. et al., 1989]. Было показано, что Ds-элемент гибридизуется с несколькими последовательностями геномов сортов и видов хлопчатника с различной степенью интенсивности гибридизации. ДНК хлопчатника 108-Ф G.hirsutvm обработали рест-риктазой Hlnd III. Полученные фрагменты ДНК лигировали с вектором pBR322 и после трансформации клеток штамма НВ-101 E.coll получили 5400 клонов. Произвольно было отобрано 300 клонов, 250 из которых оказались рекомбинантными по тесту чувствительности к тетрациклину (АргТсг). Г)з-6233-элемент кукурузы был переклонирован нами з плазмиду pBR322 и назван pDs. Используя в качестве зонда pDs, было проведено скринирование полученных клонов с помощью метода гибридизации колоний и отобрано 11 клонов, которые дали положительный ответ при гибридизации. Была выделена плазмидная ДНК этих клонов и прогибридизировэна с pDs зондом. Рестриктагный анализ этих плазмид эндонуклеаззми рестрикции Bspl, MspI показал, что величина естэеки в них варьирует от 1.5 до 4.5.т.п.н. Далее был выбран клон N2. С помощью блот-гибридизгшш Msp I-рестрицированной ДНК клона Н 2 с. зондом pDs было показано наличие фрагмента Ds-подобного элемента хлопчатника размером 1,2

т.п.н.. Клонированный фрагмент величиной в 1,2 т.п.н. был переклонирован в вектор pBR322 и назван pDsCOTTON. Далее мы секвени-ровали участок в 96 п.н. из вставки, сравнение нуклеотидной последовательности в 96 п.н. Бз-подобного элемента хлопчатника с последовательностью Bs-фрагмента кукурузы, равной 2,4 т.п.н. (pDs), показало 45,5% гомологии. В пределах сравниваемых последовательностей наблюдаются участки еысокой и низкой гомологии, а также определены возможные нуклеотидные делении по 5 позициям.

2. Нуклеотидные последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров и 5,8S рДНК хлопчатника и люцерны.

Нами были проведены ПЦР-реакции с целью получения фрагмента З'-конца 18S - 5,8S - 5'-конца 25S (18S-5,8S-25S) рДНК G.hlrsutvm и ¡l.aativa с помощью праймеров из области З'-конца 17S рДНК, прилегащей к ВТС-1 и из области 5'-конца 25S рДНК, прилегающей к ВТС-2 из томатов. ПЦР-фрагменты были клонированы в pTZ19R по Sma 1 сайту и названы pUz5,8S и pMS5,8S соответственно. Полученные клоны были скринировзны используя те же последовательности 18S-5,8S-25S рДНК в качестве меченных зондов. Плазмидная ДНК была выделена из позитивных колоний, рестрицирована EcoRl и BamHI. Рестриктный анализ показал, что имеются вставки размером около 800 п.н., что соответствует размеру ПЦР-фрагмента. Последовательности 18S-5,8S-25S рДНК хлопчатника и люцерны, состоящие из 769 и 708 н.п., зарегистрированы в EMBL Data Library.

Протяженность генов 5,8S рРНК хлопчатника и люцерны равна 163 н.п., содержание GO - 52,8%. Размер 5,8S рДНК меняется в небольших пределах, и у разных растений, в зависимости от вида, составляет от 155-164 н.п. В сраЕнении с животными 5,8S рДНК растений значительно короче [Yokota Y. et al., 19891.' Содержание GC-пар 5,8S рДНК варьирует в диапозоне 50,1-59,8%.

Размеры ВТС-1 и ВТС-2 у G.Mrsuítnt и ¡¡.sativa составляют 240 и 218, 287 и 231 п.н., содержание GC-пар у хлопчатника составляет 58,1 и 61,9%, у люцерны - 48,3 и 45,8% соответственно. Такая же вариабельность ВТС по длине и составу нуклеотидов наблюдается и у других видов высших растений. Последовательность БТС-1 G-hirsutw самзя длиннзя'из известных последовательностей.

На рис. 24 представлено сравнение нуклеотидных последовательностей 5,8S рДНК двух растений - G.hlrsutvm и М.sat iva. Гомология между этими последовательностями составляет 83,34%, что говорит о эволюционном консерватизме генов, кодирующих 5,3S рРНК.

10 20 30 40 50 60

-GAATCGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTrGCATCGlTGAAGAACGTAGCGAAAT •

XX* **ж*ж**жжж»жж*жжжжжжжжжжжжххх х****х**ж**жжжжжхххжж*жж*

AGAA-CGACTCICGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAAT

70 SO 90 100 110 ■ 120

GC—GATACTTGGTGTGAAÏTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTT-GAACGCAAGT

ж жжжжжжжжхх* ЛххжххЗхжжжж* ЖЖЖЖЖХЖЖЖЖХХХЖЖЖХХ ХЖЖжХХХЖкЖ

-CTAGATACTTGGTG—AATTGCAGAATCC-GTGAACCATCGAGICmCGAACGCAAGT

130 U0 150 ' 160 170

IGCGCCCAAA-GCCATTAGGCCAGGGCACGC—CTGCC-TGGGTGTCACAÎ

ХЖАЖК* XXX Ж Я ХЖХЖЖЖЖЖЖКЖХЖХХЖХ Ж Я. Ж Ж ЖХЖХЖЖЖЖЖ*

TGCGCC-AMCGC-ATTAGGCCAGGGCACGCGTCT-CCGÎGGGÏGTCACGG

Рис. 24. Сравнение нуклеотидных последовательностей 5,8S рДНК люцерны и хлопчатника. Примечание: * - показывает гомологию нуклео-тидов в соответствующих позициях.

1 10 20 30 40 S0 60 30 40 50 £0

еигатпссеиеяшсямкиииситстсы—тссстсисист fîÇWAîMcçneauAmcciimmtceincccreacccicutiro—

M»».M>»miM>M»**Mtt«HiM*»nm a..». > .... * " " "* * ^ ..*••• ... .

Ï-Л—eus- 1"c6—■

то «o_50

ТО 80 » too 110 tîO

ccue-ic—CKUUCÍGTT!S-Ur-Í-Uí—ИССТ-T-C-GC-T- . __________

». .« * ... . ... ... ..... ■ . ... TCGACCCTC(WIÎTCCJmCTC-6-CÎC-TCfl.

-uaucccconucc-ciMoutuacœcuœtcccc«œ«cctœccrc -.»"..»"««гш ™

т^с^-г^-и-сс^с^&тсгЛс-.^ -^г^^^сса^РсаллЛсдсс^

Я-Г-(

• гет гя no гао г*> зоо -2°-_m гт по хо

сикошгешпшппессш-са—ис-стсыго-гиссс»

с^шштш-c-i^iîcsœSm-Kîcii-iScI «^"^^«т^^ссотилсссятаа^

acc^-^ciîm-nc^TOT.m^ciT^-Tm- ---^^^сс-Аст^иси,^

lucre Ш

Рис. 25 Рис. 26

Рис. 25. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутреннего

G.hlrsutwi (* - показывает гомологию нуклеотидов в соответствующих позициях).

Рис. 26. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера ВТС-2 и прилегащего к нему участка 5-конца 2oS рДНК (подчеркнут прерывистой линией) М.sativa и G.hlrsutm (* - показывает гомологию нуклеотидов в соответствующих позициях).

Гомология последовательностей ВТС-1 и ВТС-2 люцерны и хлопчатника составляет 61,67 и 50,65% соответственно (рис. 25 и 26). Сопоставление первичных структур участков 3*-конца 18S и 5'-конца 2SS рДНК люцерны и хлопчатника, прилегающих к внутренним транскрибируемым спейсерам, показывает полную гомологию 3'-концов геноЕ 18S рРНК (100%) и частичную гомологию 5'-концов генов 28S рРНК (88,24%) (рис. 25 и 26). Высокий консерватизм генов, кодирующих рРНК, и вариабельность спейсерных последовательностей были подтверждены результатами дот-матриксного сравнения межгенного участка З'-конца 18S - 5,8Б- 5'конца 25S рДНК хлопчатника (769 н.п.) с люцерной (708 н.п.).

Таким образом, выявлена высокая эволюционная консервативность первичной структуры генов 5,8S рРНК и достаточная вариабельность внутренних транскрибируемых спейсеров разных видов высших растений, которая значительно выражена на фоне почти полной гомологии 5,8S рДНК. Олигонуклеотиды, используемые в данном исследовании, могут быть успешно применены для амплификации 5.8S рДНК и ВТС-1 и ВТС-2 у различных таксономически отдаленных групп растений.

Нами предложена возможная вторичная структура 5,8S рРНК, построенная на основе ранее сконструированных моделей для Canella Winterana [Sah Y. et al., 1992] Brassica париз lOkumura S., Shlmada H., 1992), включающим 4 основных ствола с петлевыми структурами (А,В,С,Л,).

3. Нуклеотидная последовательность хлоропласта генов 4,55 и 5S рибосомных РНК и внутренних транскрибируемых спейсеров G.hirBUtum.

Используя в качестве праймеров консервативные участки. 4,5S гена хлоропластной рРНК табака Nicotlana rustica и томата L.esculentm (Venkateswarlu К. et al., 1991] (3'-TGAGGCATCCTAACA-GACCG -5* и в тРНК^® - 3'- CTCCTAATCTCGTGCACCG -5') с помощью ПЦР был получен фрагмент хлопчатника размером 632 п.н., который содержал 3'-конец 4.5S, внутренний транскрибируемый спейсер (ВТС-1), 5S ген, ВТС-2 и 5'-конец TFKK (3'-4,5S-5S-TPHKA«r-5' )

(plie. 27) и клонирован в плазмиде pTZR19 по Smal-сзйту, названной pGUz5S. Позитивные клоны отбирали методом гибридизации колоний, используя в качестве зондз меченный згР 3'-4,5-5S-TFHK-5'-ПНР-фрагмент . Кодируицая область для 5S рДНК хлоропластов составила 119 п.н., ВТС-1 составляет 264 п.н., ВТС-2 - 249 п.н. Вся после-

довательностъ, состоящая из Б32 н.п. (рис. 29), зарегистрирована в EMBL Data Library.

В ВТС-2 мы обнаружили 18-членный повтор, который дважды повторяется в позициях 405-423 и 427-444. Функцией этой последовательности является терминация транскрипции гена 5S РНК.

Для определения структуры 4,5S FHK был Еыделен препарат тотальной хлоропластной РНК хлопчатника, затем РНК была очищена, помечена згР и фракционирована в 8% полиэкриламидном геле (рис. 28). Из ПААГ отдельно выделены фракции 4.5S и далее проведено секвенирование по методу Пити D.A. CPeattle, 1979).

Нами были предложены возможные модели пространственной вторичной структуры 5S и 4,5S хлоропластных рРНК (рис. 30) G.hlrautт. Эти модели укладываются в модели вторичных структур, предложенных для эукариотических 5S и 4,5S рРНК tNasar R.N., 19821. Основное различие этих моделей заключается в длине Р-спирали.

Нуклеотидная последовательность 5S хлоропластной рРНК хлопчатника почти идентична 5S рРНК из хлоропластов табака и томата [Takaiwa Р., Sugiura М., 1981).

4. Прикладные аспекты ыолекулярно-биологического изучения структуры генома хлопчатника: разработка новых подходов к паспортизации сортов и видов хлопчатника.

4.1. Выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, используя Рз-элемент кукурузы и Рз-подобный элемент хлопчатника в качестве высокоспецифических зондов для паспортизации различных сортов и видов хлопчатника. Рестрикционный анализ IHK Goasypium с помощью Вага HI, Hind III и EcoRI позволил выявить в ней большое количество дискретных фракций рззного размерз. Наблюдались отличия в наборах последовательностей, а картины расщепления разных видов несходны существенно. Использование ЦДРФ-анализа представляется более обнадеживающим для идентификации сортов и видов, так как его разрешающая способность значительно выше.

Нами была исследоЕана степень гибридизации Bam HI и EcoRi рестрикционных фрагментов генома хлопчатника разных сортов и видов с последовательностью Ds-элемента кукурузы (Ds-6233), относящейся к фракции средних повторов и встречающейся в геноме десятки раз, и позволяющей получить высокоразрешакше картины расщепления фрагментов ДНК. Было показано, что Ds-элемент гибридизуется с несколькими последовательностями генома G.htrsutm 108-Ф и Таш-

■—у». ..-.

-5'

Рис. 27. Электрофорети-ческое разделение продукта амплификации хлоропластнойрДНК СМгзиИлп: 1 _ пир-продукт 3'- 4,55 -5Б -тРНК 8 хлоропластной рДНК; 2 -рВЮ22+Н1пГ1.

Рис. 28. Электрофорез тотальных препаратов малых рибосомных РНК хлопчатника в ей ПААГ.

«« 4» 1П

ившм «цстмт

««иге« акясхш сссшюш сяооешв с

Рис. 29. Последовательность ДНК фрагмента хлоропластной рДНК С.Ыгаигт, содержащего З'-конец 4,55, внутренний транскрибируемый спейсер ВТС-1, ген 55, ВТО-2 и 5'-конец тРНК^® рДНК.

с е

I •

« «ее»ссжх1 'I I I ■ II I I | пески«

* \ V А

е » с I > I

А!

с в

С А С,

« С

С Р

I г

« 'А

( I С|)

I ММ

А А А'

* И Ь

С II в А те с1 1111111 в С С в о. с о с

»5:1. е с А»с 11111-с V с с «

1Ш

сАсг

в А6

и-в б-с

8-8 а1 А-иШАЦС 5АА56ЦС

,СА

аиайби5сса аацасаби ИНН II . 1ПП °

65аса с с с а

АиСиДСббд

вис«Ас

<ШисиАЛ

, " ^бАб АЦЦиС ААС •

Рис. 30 Возможная модель вторичных структур хлоропластной 55 (А) и 4,55 (Б) рРНК хлопчатника, созданных согласно метода Шша-кава К. и Такемура и. ШеМкада К., Такешига Б., 1974 3.

кент 1, G.hirsuttim зэр. mexlcanum и G.herbaceum, причем интенсивность гибридизации различна. В случае гибридизации с EcoRl фрагментами наблюдались другие наборы рестрикционных полос. Наблюдались различия по электрофоретической подвижности фрагментов между видами, а между сортами - различия в интенсивности полос гибридизации (108-Ф и Ташкент 1 G.hlrsutvm).

Для выявления полиморЗ^зма длины рестрикционных фрагментов в качестве гибридизанионного зонда использовали ДНК pDsCOTTON. Наблюдались различия по количеству и положению полос гибридизации не только между видами, но и между сортами. Следовательно, Ds-подобный элемент G.hlrsutm сорта 108-Ф, также как и Ds-элемент кукурузы Z.mays, можно использовать в качестве высокоспецифического зонда для идентификации разных сортов и видов Goasyplum.

4.2. Геномная "дактилоскопия" хлопчатника. Метод геномной "дактилоскопии" был применен нами для выявления диапазона возможностей использования ДНК фага М 13 в качестве гибридизационного зонда для фингерпринтирования ДНК хлопчатника, а именно, для обнаружения межвидовых и межсортовых различий.

Были выявлены гибридизующиеся фрагменты у ДНК хлопчатника (от 13-16 полос), что свидетельствует о наличии участков гомологии с гибридизационной пробой (рис. 31 А). Результаты сканирования гибридизационных сигналов с радиоавтограммой представлены нз схеме Б (рис. 31).,Сравнительный анализ гипервариабельных участков 2 видов показывает, что G.hlrsutvm (Ташкент-1 и 108-Ф) отличается от G.hsrbaceum А-833 по количеству (3 и 2 фрагмента), расположению и по интенсивности полос гибридизации. При фингерпркнтировз-нии ДНК сортов Ташкент-1 и 108-Ф одного вида G.hlrsutvm картины гибридизации также отличаются, несмотря на еысокий процент совпадающих полос. Таким образом, данный метод позволяет еыяеить межвидовые и межсортовые разлитая у хлопчатника.

4.3. Выявление полиморфизма длины рестрикционных 'фрагментов, используя метод ПИР для паспортизации различных сортов и видов хлопчатника. Мы предположили, что изучение продуктов амплификации 1SS-5.3S-25S рДНК рибосомного оперона разных сортов и зилов хлопчатника позволяет выявить высокую видоспецифичность за счет достаточной вариабельности ВТС-1 и ВТС-2 спейсеров. Был проведен рестриктный анализ полученых 18S-5.8S-25S ПЦР-фрагментов рДНК с помощью рестриктазы Hin' 1 у £ видов хлопчатника. Б случае

О.ЪагЬайепэе наблюдалась 21 полоса, в случае С.ЬегЪасеж - 17, причем полосы соответствовали разным фрагментам рестрицированной ДНК (рис. 32). Предложенный нами метод позволяет использоезть его при идентификации сортоЕ и еидов Созвур1ш для получения их "молекулярного паспорта".

Рис. 31 Рис. 32

Рис. 31. А - Гипервариабельные участки, детектируемые ДНК фага М 13, в геноме человеке (3), сортов хлопчатника - Ташкент-1 (6,7), 108-Ф (4) G.hlrautum и А-833 G.herbaceum (5), холерного вибриона Vibrio choleras (2), фага X (1); Б - сканограмма гибридизуемых сигналов с радиоавтограммой.

Рис. 32. Рестрикционный анализ (Hlní 1) продуктов амплификации 18S-5.8S-25S рдНК видов хлопчатника.

ДНК G.barbaúense (сорт С-6037) (1), G.herbacevm (сорт Гуза 2929) (2), обработанные Н1пГ 1 ДНК G.barbadense (сорт С-6037) (3), G.hsrbaceum (сорт Гузв 2Э2Э) (4).

ВЫВОДЫ

1. Впервые из генома томата L.eэculenim выделены фенилзла-нин аммоний-лиазные гены - ФАЛ-1, -2, -3 и -5. Проклонированы гены ФАЛ-2 и ФМ-5 и определена их первичная структура.

2. В геноме томата Ь.езси1еп1ш определены регуляторные последовательности (промоторы, экзоны, интроны, рамки считывания.

стоп-кодоны, сигналы полиаденилирования), связанные с экспрессией генов в ответ на различные виды стресса (механическое повреждение, свет, атака грибов-патогенов Y.ûahli'je и V.alba-atrvm).

3. С помощью метода S1-картирования мРНК определен регуля-торный ответ ФАЛ-генов томата L.esculentwn при механическом повреждении, воздействии светом и при атаке гриба-патогена V.dahltae и выявлены сайты терминации транскрипции.

4. Впервые проклонироЕаны и определены нуклеотиднае последовательности 18S-5.8S-28S рДНК рибосомного оперона грибоа V.dahliae, V.albo-atrvm, V.albo-atrvm 110, V.tricorpus и Р.охузрогш. Разработан принципиально новый подход для высокочувствительной диагностики грибов-патогенов с использованием ПНР-технологии на основе различий в ВТС-1 и ВТС-2 последовательностях вышеуказанных грибов и применен для выявления внутривидовых различий у природных изолятов V.albo-atrvm.

5. Впервые определены нуклеотидные последовательности генов 4,55 и 5S хлоропластной рДНК хлопчатника G.hlr3utvm и 5,8S ядерной рРНК G.htrsutw и люцерны M.sat ira с прилегающими к ним последовательностями. Выявлена высокая эволюционная консервативность 5.8S рДНК и достаточная вариабельность последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ВТС-1 и ВТС-2. Предложены возможные модели пространственных вторичных структур этих последовательностей.

6. В качестве одного из подходов к идентификации сортоЕ и еи-дов хлопчатника предложен метод рестрикционного анализа фрагментов 18S-25S рибосомной ДНК, полученных на осноЕе ПНР-реакции. Показано, что метод фингерпринтирования ДНК применительно к хлопчатнику с использованием ДНК фэга M 13 как гибридагационной пробы позволяет обнаружить межсортовые и межвидовые различия. Клонирован и секвенирован фрагмент Ds-подобного элемента хлопчатника сорта 103—Ф G.hlrsuivm, который также как и Ds-6233-элемент кукурузы Z.mays может быть использован как гибридизационкый зонд для анализов ДДРФ с целью выявления межсортовой и межвидовой специфичности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

СТАТЬИ: 1. ДееЕ C.M?, Мухамедов P.C., Карлышев А.В., Денисова

Р.Ф» f Á С Л 2 НС 2 "'"i А МОД2*^11Д1*рСВЗННЫ** М^ТСД Гру^ОГО ДЗ'ЗЗТЗ 71

Qtir>mjrOC» ntffrtntítnjtrv ТТЯВ9»И»П // VlrtCiVn'WVtflt п1ЯГ\Т1Г\Г»Ш1ЛГ>угГ& -¿МГТ-HJCkn Л*Г

<J ¿ tilltUWKUtiH / / V WVVtkWA«Mt W «4 "iV l»rWiJ4 ^«twut .-U fc

УзССР.- 1981.- JK.- С.9-12.

2. Абдукаримов A.A., Абидова М.А., Джатаев O.A., Калонтаров А.И., Кузнецова H.H., Мухамедов P.C. Марцинковская А.И., Махмудова A.A., Мухамедханова Ф.С., Нуриджанянц С.С., Ташпулатов A.A., Усаченко С.И., Холмуратов Э.Г., Ханазарова Д.К. Состояние и перспективы генно- и кле точно-инженерной биотехнологии хлопчатника // В кн: Проблемы и перспективы развития химии природных и физиологически активных веществ / Под ред. Абдувахабова A.A.: АН УзССР, Институт биоорганической химии им. акад. А.С.Садыковэ.- Ташкент: Изд-во "Фан" УзССР.- 1988. С.393-411.

3. Мухамедов P.C., Холмуратов Э.Г., Абдукаримов A.A. Рестрик-ционный анализ ядерной ДНК гриба Verttctlltm dahïiae Kleb. // Биополимеры и клетка.- 1988.- Т.4.- Jfö.- С.275-277.

4. Садыков A.C., Мухамедов P.C., Тунеев В.М., Гизатуллин Р.З., Абдукаримов A.A. Обнаружение последовательностей гомологичных мобильному''элементу кукурузы, в ядерном и хлоропластном геномах хлопчатника // Биополимеры и клетка.- 1988.- Т.4.- JM.-С.218-220.

5. Абдукаримов A.A., Мухамедов P.C. Структура генетически подвижных элементов растений // В кн: Структура и функции физиологически активных соединений / Под ред. Абдувахабова A.A.- Т.: Издательство "ФАН" Узбекистана, 1990.- С.131-153.

6. Мухамедов P.C., Краев A.C., Абдукаримов A.A., Скрябин К.Г. Организация генов рибосомных РНК гриба Vertlcllllum dahllae // Молекулярная биология.- 1990.- Т.24.- Л6.~ С.1675-1678.

7. Марцинковская А.И., Мотин В.Л., Мухамедов P.C., Абдукаримов A.A. Геномная "дактилоскопия" хлопчатника Gossypium : использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага M 13 // Биополимеры и клетка. -1933.- Т.9.- №1.- С.51-53.

8. Мухамедов P.C., Ирисбаев Б.К., Краев A.C., Скрябин К.Г., Абдукаримов A.A. Анализ структуры и использование внутренних • транскрибируемых спейсеров грибов Fusarium охуаропт и Vert ici I Hum dahl iae в качестве диагностических зондов // ДАН РУз.- 1993.- Т.-10.- С.47-49.

9. Robb J., Moukhamedov R.S., Hu X., Platt H., Nasar R.N. Putative subgroups of Verticillívm albo-atrum distinguishable by PCR-based assays // Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1993.- V.43.- P. 423-436.

10. Мухамедов P.C., Марцинковская A.il., X. Шу, Абдукаримов

А.А. Нуклеотидкне последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров и 5,8S рДКК рибосомного оперона у люцерны Uedlcago satlva и хлопчатника Gossyplum hirsutism L. // Молекулярная биология.- 1994.- Т.28,- ЛИ.- С.204-209.

11. Moukhamedov R.S., Ни X., Robb J., Nazar R.N. Use of polymerase chain reaction-amplified ribosomal intergenic sequences for the diagnosis of Yertlcllllum trlcorpus ft Phytopathology.- 1994.- V.84.- P. 256-259.

12. Moukhamedov R.S., Martinkovskaya A.I., Shu X., Abdoukarimov A.A. Nucleotide sequences of ribosomal operon inner transcribed spacers and 5,8S rDNA of Keatcago satlva and Gossyplum hirsutism // Molecular Biology.- 1994,- No.1.- Part 2.-P. 135-139.

13. Moukhamedov R.S., Robb J. Nasar R.N. Characterization and analysis oi the PAL-2 gene from tomato // ДАН РУз.- 1994.- №.6.-C.46-49.

14. Мухамедов P.C., Тунеев B.M., Марцинковская А.И., Абдука-римов А.А. Анализ гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента Ds-подобного элемента хлопчатника Gossyplum hirsutum и Ds-6233-элемента кукурузы Zea mays // ДАН РУз.- 1995.- J65-6.-С.66-68.

15. Martsinkovskaya A.I., Moukhamedov R.S., Abdoukarlmov A.A.Potential use of polymerase chain reaction-amplified ribosomal intergenic sequences for the differentiation of Gossyplum cotton varieties and species // Plant Mol. Biol. Reporter.- 1996.- V.13.- No.4.- P.33-38.

ТЕЗИСЫ: 16. Садыков А.С., Мухамедов P.С., Абдукаримов А.А. Анализ повторяющихся последовательностей ядерных ДНК различных видов хлопчатника // Всес. конф. "Новые направления биотехнологии". Тезисы докл.- Пущино, 22-24 октября 1984.- С.76.

17. Садыков А.С., МухамедоЕ Р.С., Тунеев В.М., Мусаханов М.М., Абдукаримов А.А. Исследование структуры повторяющихся последовательностей генома хлопчатнике // Труды Всес. конф. "Макромолекулы клетки", Институт Молекулярной биологии АН СССР.-МоскЕа, 1934.- J620.- С. 11.

18. Садыков А.С., Мухамедов Р.С., Тунеев В.М., Ташпулатсв А.Ш., Абдукаримов А.А. Сравнение повторяющихся последовательностей геномной ДНК различных видов хлопчатника и возбудителей еидтэ // 4 симпозиум СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей

клетке".- Киев.: Наукова думка, Б-Э июля 1984.- С.107.

19. Мухамедов P.C., Тунеев В.М. Анализ повторяющихся последовательностей ядерных ДНК различных видов хлопчатника // Юбилейная научная конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летию Ленинского комсомола Узбекистана. Тезисы докл.- Ташкент, 11-12 марта 1985.- Часть II.- С.145.

20. Мухамедов P.C., Абдукаримов A.A. Выявление родо- и видо-специфических фрагментов генома грибов Vertlclllium dahlias и Fusarium oiysporvm // Всесоюз. конф. "НоЕые направления биотехнологии. Тезисы докл.- Пущино, 3-5 октября 1988.- С.74-75.

21. Мухамедов P.C., Марцинковская А.И., Абдукаримов A.A. Анализ и клонирование последовательностей генома G.hirsuîm, гомологичных Ds-элементу кукурузы // Международная конференция "Биология культивируемых клеток и биотехнология".- Новосибирск: Изд-во АН СССР, 2-6 августа 1988.- Т.2.- С.398.

22. Ирисбаев Б.К., Мухамедов P.C., Краев A.C., Абдукаримов A.A. Структура гена 18S рРНК гриба Verticllllw dahlias // 2 Всесоюзное совещание "Генетика развития". Тезисы докладов.-Ташкент, 1990.- С.114.

23. Марцинковская А.И., Мухамедов P.C. Паспортизация сортов, видов хлопчатника и видов и рас возбудителя вилта методом геномной "дактилоскипии" // 1 Республиканская конференция молодых ученых "Теоретические и прикладные аспекты генетики и селекции животных, растений и микроорганизмов".- Ташкент, 19-20 июня 1990.-С.59-60.

24. Мухамедов P.C., Ирисбаев Б.К., Ханазарова Д.К. Полиморфизм длины рестрикционнкх фрагментов грибов рода VerticillIm dahlias Kleb. // V Международный симпозиум по вертициллиуму. Тезисы докл.- Ленинград, 25-30 июня 1990.- С.133.

25. Ирисбаев Б.К., Мухамедов P.C., Абдукаримов A.A. Структурная организация спейсеров 5,8S рРНК гриба Fusarium ощзрогит // Первый съезд физиологов растений Узбекистана. Тезисы докладов.-Ташкент, 1991,- С.28.

26. Hu X., MoukiiamedOY R.S., Nazar R.S., Robb J. Identification of Verticillium pathogens using PCR probes // 57th Annual Meeting "Plant Health: The Environmental Challenge" oí the Canadian Phytopathological Society.- Banff, Albert3, Canada, 23rd-26th June, 1991.- P.26.- Abstract No.13.

27. Moukhamedov R.S., Heins R.A., Robb J., Lee S.W., Nasar

R.N. Isolation and analysis of phenylalanine ammonia-lyase genes Iran tomato // 32nd Annual Meeting Molecular Biology of the Cell, oi the American Society lor Cell Biology.- Denver, Colorado, USA, 15th-19th November 1992. - P.82a.- Abstract Ho.4-75.

28. Moukhamedov R.S., Ни X., Robb J., Nazar R.N. Nucleotide sequence оГ 18S-25S spacer region from rDNA oi cotton (Gosaypium hirsutum) and alfalfa (ifedlcago aativa L.) // Proceedings of the 3rd Canadian workshop on Plant Tissue Culture and Genetic Engineering University of Guelph.- Guelph, Ontario, Canada, 17th-20th June, 1992.- P.29.

29. Moukhamedov R.S., Martinkovskaya A.I., Abdoukarlmov A.A. The nucleotide sequence oi 18S-5.8S-28S lntergenlc transcribed spacers and 5,8S rDNA Irom G.hlrsutm // 5th International Congress on Cell Biology.- Madrid, Spain, 26th-31st July, 1992.-P-1.1.- Abstract No.11.

30. Moukhamedov R.S., Robb J., Nazar R.N. Characterization and analysis of the PAL-2 gene irom tomato // Proceedings oi the G.hlrsutvm 3rd Canadian Workshop on Plant Tissue Culture and Genetic Engineering, University of Guelph.- Guelph, Ontario, Canada, 17th- 20th June, 1992, - P.29.

31. Moukhamedov R.S., Abdoukarlmov R.S. Nucleotide sequences or chloroplast genes oi 4.5S and 5S ribosomal PNA and Internal transcribed spacerreglons ol cotton Gossyplum htrsutum L. // II International Conference "Biology oi plant cell culture and Biotechnology".- Almaty, 1993. P.22.

32. Heinz R.A. Moukhamedov R.S., Robb J., Lee S.-W., Nazar R.N. Isolation and analysis of phenylalanine ammonia-lyase genes from tomato // 6th International Congress of Plant Pathology.-Montreal, Quebec, Canada, 28th July - 6th August 1993.-' P.185.-Abstract No. 10.1.10.

33. Ни X., Moukhamedov R.S., Nasar R.S., Piatt H., Robb J. Distinct subgroup niches of Verticalium albo-atnai // 6th International Congress of Plant Pathology.- Montreal, Quebec, Canada, 28th July- 6th August, 1993.- Abstract Ho.2.1.18.

АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА: 34. Марцинковска.ч A.M., Мухамедоэ P.С., АСдукаримов А.А. Получение паспорта ДНК организмов // принято положительной по заявке НН DP 9500258.1. на патент. -1996.

СВИДЕТЕЛЬСТВА, полученные по поводу регистрации секвенировз-

иных последовательностей ДНК в Европейском EMBL-банке:

35. Moukhamedov R.S. G.hirautwi DNA Гог 5S rDNA, tRNA-Arg "and lntergenic transcribed spacers // EMBL Data Library Heidelberg.- 27 November, 1991.- P.1/1.- DS9119.- No.X63124.

36 Moukhamedov R.S. G.hirautw DNA for 5.8S rDNA and 18S-25S lntergenic transcribed spacers // EMBL Data Library Heidelberg.-8 January, 1992.- P.1/1.- DS9478.- NO.X63750.

37 Moukhamedov R.S. M.aattva DNA ior 5.8S rDNA and 18S-25S lntergenic transcribed spacers // EMBL Data Library Heidelberg.-8 January. 1992.- P.1/1.- DS9479.- N0.X63751.

УЗБЕКИСТОН ФАН1АР АКАДЕМИЯСИ

ГЕНЕТИКА ИНСТИТУТИ МУХАМЕДОВ РУСТАМ СУЛТОНОВИЧ ПАТОГЕН ЗАМБУРШАРИ ВА УСИМЛИКЛАР УЗАРО МУНОСАБАТЛАРИНИ УРГАНИШ ВА МОЛЕКУЛЯР-ГЕНЕТИК ЦУЛЛАНИШ МУАММОЛАРИ

ИШНИНГ УМУММ МАЗМУНИ Томат Lycoperaicon eaculentum геномидан ФАЛ-1, -2, -3, ва -5 генлар ажратилди, ФАЛ-2 ва -5 генлари клонланда ва нуклеотид кетма-кетлиги аницланди.

Хар-^ил мухит стресслари (механик жаро^атлар, еруглик таьси-ри, V.dahlias ва V.albo-atrum патоген замбуруглар хужуми) га ка-вобан генлар экспрессиясига боглик регулятор кетма-кетликларнинг (промоторлар, экзонлар, интронларни у^иш рамкалари, стоп кодонлзр, полиаденилланган сайтлари зшщланди.

Механик, еруглик ва V.dahlias замбуруганинг патоген таьсири-га жавоб берувчи L.Eaculentxm нинг томат ФАЛ генлари регулятор кетма-кетлиги S1 карталаштириш усули билан аншушзди. • Транскриб-цияни чегараловчи сайт топилди.

Биринчи булиб V. idahliae, V.albQ~atrum,V.alba-atnjm 110, V.tricorpue ва Fusarlum охузрогит замбуругларининг рибосомал опе-рони 18S - 5.8S - 283 рРНК генларининг нуклеотид кетма-кетлиги клонланди ва ашоуинди.

ИТС-1 ва ИТС-2ни фар^ ^илувчи кетма-кетликлари эсослда ПНР технологиясидан фойдзлэниб патоген замбурурларининг ю:-;сри сезгирликда диагностика ^шшшга янгича ёндошиш ривожлантирилди ва V.albo-atrvm турига хос замбуругларни ангауюшда Фойдаланилди.

Биринчи булиб, 4,5S хлоропласт ва G.hlrsutwi 5S рибоссмал

ДНКси, G.htr3utw ва Uedicago aatlva 5,8S РНК генларини Луклеотид кетма-кетлиги анщланди.

5,8S рибосомал ДНК нуклеотидлари кетмз-кетлигвда юг^ори эволю-цшн туррунлик ва ИТС-1 , ИТС-2 ичхи трзнскрибциясида етарли уз-гарувчанлик курсатилди.

Рузанинг хар-^ил нав ва турларида, масалан, Gossypivm авло-дида, 18S - 5,8S - 28S рДНК ГЩР фрагментларининг билан рестриктазалар билан тахлил ^илиш усули ишлаб чюделди.

Gossypium аЕлодадаги тур ва навлзрда гипервариабелли поли-морфик намуналарни солиштирма анализи курсзтишича "бэрмок изи" усулидэн М13 фаги ДНКсини дурагайлашда фойдаланиш тур ва нав ур-тасидзги фар^ни топшга имкон беради.

Гуза G.htrsutm да Вз-ухшаш элементлар клонлвнда.

INSTITUTE OP GENETICS ACADEMY OF SCIENCES, REPUBLIC OF UZBEKISTAN MOUKHAMEDOV RUSTAM SULTANOVICH STUDY 0? THE INTERACTION OP FUNGAL PATHOGENS. AND PLANTS: MOLECULAR AND GENETIC. APPLIED ASPECTS

SUMMARY

First phenylalanine aminonia-lyase (PAL) genes - PAL-1, -2, -3, -5 from L.eaculentwn tomato genome were isolated. PAL-2 and -5 genes were cloned and tlieir nucleotide sequences were determined.

Regulatory sequences (promoters, ехопз, introns, reading frames, stop-codons, polyadenyllng signals) connected with gene expression in response to various environmental stresses (mechanical wounding, light induction, attack of V.dahllae and V.albo-atrxm fungal pathogens) were determined.

The regulatory response of L.eaculentm tomato PAL genes to mechanical damage, eriect of light, attack of V.dahllae fungal pathogens was determined by the method of SI mapping. Termination transcription sites were revealed.

First the nucleotide sequences of 18S-5.8S-28S rRNA genes of ribosomal operon of V.dahllae, V.albo-atrvm, V.albo-atrm 110, V.tricorpua and F.oxysporm fungi were cloned and determined. New approach to the high sensitive diagnosis of pathogenic fungi using PCR technology on the basis of differences in ITS1 and ITS2

sequences of above mentioned fungi was developed and used for the revealing intraspecies distinctions in natural V.albo-atrwi isolates.

First the nucleotide sequences chloroplast 4.5S and 5S rlbosomal DNA of G.hirsutm cotton and nuclear 5.8S rRNA genes G.hirsutm and M.sail va alfalfa with adjacent to them sequences were determined. High evolutionary conservatism of the nucleotide sequence of 5.8S rDNA and sufficient variability of Internal transcribed spacers ITS1 and ITS2 were shown. Possible models of spatial secondary structures of these sequences were proposed.

The method of restriction-endonuclease analysis of 18S-5.8S-25S rDNA PCR-fragments of different cotton cultlvars and species as one of approaches to the identification of cotton Gossypim cultlvars and species was suggested.

A comparative analysis of hypervariable polymorphic patterns of various species and cultlvars of cotton Gossyplm showed the method of fingerprinting using DNA phage M13 as a hybridization probe allows to establish distinctions between species and cultlvars.

G.hirsutm cotton Ds-simllar element was cloned and sequenced which can be used as a hybridization probe to reveal of restriction fragment length polymorphism (RFLP) for study liitervariety and interspecies specificity as well as Z.mya maise Ds-6233 element.

Информация о работе

Мухамедов, Рустам Султанович
доктора биологических наук
Ташкент, 1996
ВАК 03.00.26

Автореферат

Похожие работы