Полигостальность условно-патогенных энтеробактерий на модели их взаимодействия с растениями

Маркова, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полигостальность условно-патогенных энтеробактерий на модели их взаимодействия с растениями
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Полигостальность условно-патогенных энтеробактерий на модели их взаимодействия с растениями"

О1

На правах рукописи

МАРКОВА ' |

Юлия Александровна

ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

^ 2-

е !тм 20)3

Иркутск - 2013

005060973

Работа выполнена в ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук и в ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Савилов Евгений Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор Войников Виктор Кириллович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Иннокентьева Тамара Ивановна (научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН) доктор биологических наук, профессор Огарков Борис Никитович (заведующий кафедрой микробиологии ФГБОУ ВПО ИГУ) доктор биологических наук Цивилева Ольга Михайловна

(старший научный сотрудник лаборатории микробиологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН)

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿¿V » июня 2013 г. в /0 часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 001.038.01 при ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16. Почтовый адрес: 664003, г. Иркутск, а/я 221.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»

СО РАМН.

Автореферат разослан « /К» ЛС^Х^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Кулеш Дмитрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Инфекционные болезни по-прежнему занимают лидирующие позиции среди причин смертности во всем мире (Брико Н.И. с соавт., 2010). Среди них значительная роль принадлежит острым кишечным инфекциям (ОКИ) (Сергиев В.П. с соавт., 2000; Newell D.G. et al., 2010). В настоящее время среди возбудителей этой группы заболеваний все большее медицинское значение приобретают условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ) (Бондаренко В.М., 2011; Анганова Е.В., 2012 и др.).

УПЭ, как правило, характеризуются значительной экологической пластичностью, что создает предпосылки для их убиквитарного распространения. К настоящему времени установлена возможность существования указанных бактерий в воде, почве, а также в растительном материале (Сомов Г.П., 2004; Бузолева JI.C., 2011; Пушкарева В.И. с соавт., 2012; Korzeniewska Е. et al., 2012).

Обитание во внешней среде может привести к усилению вирулентности патогенов за счет горизонтального переноса генов (Stecher В. et al., 2012). Благоприятные условия для этого процесса создаются в местообитаниях, характеризующихся высокой плотностью бактериальных клеток, например, в ризосфере растений, где горизонтальная передача генов, включая передачу островов пато-генности, происходит достаточно часто (Tyler H.L., Triplett E.W., 2008). Обмен генетическим материалом между бактериями, ассоциированными с человеком, и автохтонными обитателями природных объектов, может способствовать появлению новых эпидемических вариантов возбудителя, устойчивых во внешней среде и персистирующих на разных живых организмах. Изменение вирулентности патогенов во внешней среде может быть также результатом взаимодействия с другими живыми организмами, например, простейшими (Бухарин О.В. с соавт., Литвин В.Ю., 1997; Речкин А.И., Евтеева Н.И. с соавт., 2007; Berk S.G. et al., 2008; Saeed A. et al., 2012).

Вышеизложенное обусловливает возникновение явления полигостальности, характерной для ряда микроорганизмов (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997; Литвин В.Ю. с соавт., 1998). Полигостальность связывают с древним эволюционным происхождением процесса взаимодействия микро- и макроорганизмов, частным случаем которого является патогенез. Обычно оба хозяина принадлежат к одному биологическому царству. Гораздо реже встречаются случаи взаимодействия патогенного микроорганизма с представителями разных царств жизни, так называемые cross-kingdom host jumps (van Baarlen P. et al., 2007). К наиболее изученным представителям полигостальных патогенов относятся: Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica, Escherichia coli, причем с каждым годом в эту группу попадает все больше видов бактерий и грибов (Dong Y.M. et al., 2003; Tyler H.L., Triplett E.W., 2008).

Установлено, что некоторые виды условно-патогенных бактерий—Klebsiella pneumoniae (IniguezA.L. et al., 2004), Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes

(Zinniel D.K. et al., 2002), Serratia marcescens (Gyaneshwar P. et al., 2001), разные виды Pseudomonas (Rahme L.G. et al., 1997) обитают в растительных тканях. Исследованиями последних лет доказано присутствие в эндосфере растений бактерий, патогенных для человека — Listeria monocytogenes (Gorskiye L. et al., 2003), Campylobacter jejuni (Brandl M.T. et al., 2004), S. enterica (Franz E. et al., 2007), E. coli (Wachtel M.R. et al., 2002; Bernstein N. et al., 2007).

Все это определяет высокую актуальность проблемы изучения сосуществования бактерий семейства Enterobacteriaceae с растениями, как в теоретическом, общебиологическом аспекте для изучения механизмов полигостальности и транспатогенеза, так и в прикладном медицинском, для определения роли растений в процессе циркуляции этих микроорганизмов во внешней среде.

Цель работы: обосновать механизмы полигостальности условно-патогенных энтеробактерий на основе изучения биологических свойств этих микроорганизмов и особенностей их взаимодействия с растениями.

Задачи:

1. Определить влияние условий культивирования (среда, температура) на кинетику роста патогенных и условно-патогенных энтеробактерий (Sh. sonnei, Sh.jlexneri, Е. cloacae, Е. aerogenes, С. freundii, К. pneumoniae, P. mirabilis).

2. Выявить продукцию биологически активных соединений у исследуемых видов энтеробактерий, способствующих их выживанию в тканях и органах растений.

3. Оценить влияние условий культивирования на формирование биопленок исследуемыми видами патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.

4. Провести сравнительный анализ воздействия условно-патогенных и патогенных энтеробактерий на рост и развитие растений.

5. Определить скорость контаминации растительных тканей энтеробакте-риями.

6. Изучить развитие ответных реакций растения на заражение энтеробак-териями.

7. Оценить контаминацию энтеробактериями растительных объектов (дикорастущие и культурные растения, в том числе, приобретенные в розничной продаже).

Научная новизна

Впервые показано, что недостаток пищевых субстратов в среде культивирования способствует большей устойчивости патогенных и условно-патогенных энтеробактерий к условиям низких температур. Впервые у энтеробактерий, выделенных от больных людей, выявлены ферменты и биологически активные соединения, способствующие их персистенции в организме растения. Установлена зависимость формирования биопленки от условий культивирования.

системе «растение картофеля in vitro—Е. coli», показано, что полная колонизация растительных тканей энтеробактериями происходит на вторые-третьи сутки после инокуляции, при этом растение-хозяин распознает присутствие энтеробактерий в ризо- и эндосфере и отвечает активацией иммунного ответа уже в первые минуты после заражения.

Практическая и теоретическая значимость

Разработан метод определения контаминации внутренних тканей овощей и фруктов патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, что позволяет оценить потенциальную опасность этих продуктов питания для здоровья человека.

Показано, что заражение растений условно-патогенными бактериями, как правило, не вызывает внешних симптомов повреждения растительного организма. Следовательно, контаминированные продукты питания растительного происхождения могут использоваться в качестве источников питания и способствовать последующему инфицированию человека.

Выявлено, чтоУПЭ, возбудители ОКИ человека, при попадании во внешнюю среду могут использовать растительные ткани как резервуар обитания, способствующий их сохранению вне организма человека.

Внедрения

Материалы исследований использованы для подготовки методических рекомендаций для студентов ИГУ «Микробиологический мониторинг окружающей среды», утверждена научно-методическим советом ИГУ (2000 г.), врачей «Определение ферментативной активности условно-патогенных бактерий», утверждена Методическим советом ГБОУ ДПО ИГМАПО (2013 г.). Полученные результаты используются при проведении лекционных занятий на кафедре микробиологии ИГМУ, кафедре эпидемиологии и микробиологии ИГМАПО, кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ИГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Недостаток питательных элементов способствует развитию устойчивости условно-патогенных и патогенных энтеробактерий человека к широкому диапазону температур (от 4 до 37 °С), что в конечном итоге обусловливает их выживаемость во внешней среде.

2. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, обладают набором специфических экзоферментов и биологически активных соединений, способствующих, при попадании во внешнюю среду, созданию активных взаимоотношений с растительным организмом.

3. В ответ на колонизацию энтеробактериями, условно-патогенными для человека, растение-хозяин отвечает активацией паттерн-индуцированного иммунитета (РТТ) уже в первые минуты после инфицирования. Отсутствие специфических факторов патогенности, аналогичных таковым для фитопатогенов, приводит

к тому, что контаминированное растение, как правило, не проявляет симптомов поражения и не способно быстро элиминировать из тканей эти микроорганизмы.

4. Условно-патогенные энтеробактерии при попадании во внешнюю среду персистируют в растительных тканях, что позволяет считать растения одним из резервуаров, способствующих сохранению этих микроорганизмов во внешней среде.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены: на Всероссийской научной конференции, «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); Региональной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания» (Иркутск, 2006); семинаре врачей-эпидемиологов «Эпидемиология кишечных инфекций» (Иркутск, 2006); Научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья» (Иркутск, 2007); Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», СИФИБР (Иркутск, 2007); Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания», ИрГТУ (Иркутск, 2007); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы Права, Экономики и Управления», СИПЭУ (Иркутск, 2008); 2-м межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2008); II Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе» (Иркутск, 2008); Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); Международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти М.М. Кожова» (Иркутск, 2010); VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); II Международной научно-практической конференции «Особенности формирования здорового образа жизни: факторы и условия» (Улан-Удэ, 2012); научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летнему юбилею ИЭМ ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН (Иркутск, 2012).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, подборе методов исследования и анализе полученных результатов. Все результаты, представленные в работе, получены при личном участии автора.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 52 работы, из них 16 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, и 2 монографии.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 291 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 21 таблицу и 74 рисунка. Список литературы состоит из 377 источников, в том числе 304 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Объекты исследования

Микроорганизмы. В работе использовались: условно-патогенные энтеро-бактерии, выделенные от людей, больных острыми кишечными инфекциями, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу -Е. cloacae, Е. aerogenes, К. pneumoniae, P. mirabilis, M. morganii, С. freundii; патогенные энтеробактерии Sh. sonnei и Sh.flexneri, выделенные от людей, больных дизентерией, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу; Е. coli штамм XL-1 Blue (Fermentas, Латвия); фитопатогены - Clavi-bacter michiganensis subsp. sepedonicus штамм 5369 (вирулентный, мукоидный), штамм CsR14 (вирулентный, мукоидный), полученные из НИИ картофельного хозяйства (пос. Коренево, Московская обл.) и Pectobacterium carotovorum штамм ВКМ В-1247, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино).

Растения. Картофель in vitro (Solanum tuberosum L.), сортов Луговской -устойчивый и Лукьяновский (Украинский НИИ картофельного хозяйства), восприимчивый к бактериальному фитопатогену С. michiganensis subsp. sepedonicus. Суспензионные культуры клеток картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний и табака (Nicotiana tabacum). Семена растений салата (Lactuca sativa L.), сорт Крупнокочанный, сорт Кучерявец Одесский; редиса (kaphanus sativus), сорт Жара; капусты белокочанной (Brassica rapa), сорт Казачок Супер; гороха (Pisum sativum), сорт Аксайский усатый.

Объем проведенных исследований представлен в таблице 1.

1.2. Материалы и методы

Для выделения бактерий из эндосферы проводили дезинфекцию поверхности растений с помощью 0,7% раствора гипохлорита натрия. После этого растительный материал гомогенизировали и высевали в чашки Петри с МПА и со средой

Таблица 1

Объекты и объем выполненных исследований

Направление исследований Объекты исследований Методы исследований Кол-во исследований

Выявление бактерий семейства Еп1егоЬас1епасеае в биотопах, выделяемых на растении Ризосфера, филлосфера и эндосфера дикорастущих и культурных растений - Клен ясенелистный (Acernegundo L), Груша уссурийская (Pyrus pasha), Одуванчик лекарственный (Taraxacum officinalis), Подорожник большой (Plantago major). Чистотел большой (Chelidonium majus), Салат сорт Кучерявец Одесский, Томат сорт Сибирский скороспелый, Картофель сорта Луговской, Адретта, Огурец сорт Изящный Посев на микробиологические среды, идентификация выделенных культур с помощью биохимических тестов, определение антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом, определение адгезивное™ 55 проб

Овощи и фрукты, приобретенные в розничной продаже (персик, слива, нектарин, черный виноград, томат, зеленый лук, зелень петрушки, перец болгарский, огурец, груша, яблоко, апельсин, банан) 256 проб

Сравнительный анализ способности условно-патогенных, патогенных и фитопатогенных видов энтеробактерий заселять эндосферу растений Патогенные и условно-патогенные виды семейства Enterobacteriaceae (Е. aerogenes, Е. cloacae, С. freundii, P. mirabilis, M. morganii, К. pneumoniae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, P. carotovorum) Семена растений - салат сортов Крупнокочанный и Кучерявец Одесский, капуста сорт Казачок Супер, редис сорт Жара, горох сорт Аксайский Усатый. Растения картофеля in vitro сорта Луговской, Лукьяновский Определение динамики ОП суспензии бактериальных клеток в зависимости от температуры и среды культивирования 184 измерения

Определение активности ферментов 132 измерения

Определение способности формировать биопленки 240 измерений

Определение способности синтезировать фитогормон ИУК 414 измерений

Влияние на рост и развитие растений 350 измерений

Таблица 1 (продолжение)

Направление исследований Объекты исследований Методы исследований Кол-во исследований

Определение колонизации растений энтеробактериями, патогенными для человека £ соН XL-1 Blue С. michiganensis ssp. sepedonicus CsR14 Растения картофеля in vitro сорта Луговской, Лукьяновский Определение КОЕ в разных частях инокулированного растения в динамике 150 посевов

Сравнение АФК, продуцируемых суспензионной культурой клеток растений при заражении £. coli (XL1-Blue) и С. michiganensis ssp. sepedonicus (вирулентный штамм CSR14) 50 измерений

Ответные реакции растений при взаимодействии с энтеробактериями, патогенными для человека £ со//XL-1 Blue P. carotovorum B-1247 С. michiganensis ssp. sepedonicus CsR14 Определение АФК на поверхности корней растений картофеля (Solanum tuberosum) и редиса (Rhaphanus sativus L.) в ответ на £ co//'(XL1-Blue), окраска DCF 30 измерений

Динамика внеклеточных АФК из корней редиса (R. sativus L.) сорта Жара в ответ на £ coli (XL1-Blue) и Р. carotovorum (В-1247) 500 измерений

Динамика пероксидазной активности в растении редиса (R. sativus L.) сорта Жара при инокуляции £ coli (XL1 -Blue) 50 измерений

Динамика пероксидазной активности в растении картофеля in vitro при инокуляции £ coli (XL1-Blue) и С. michiganensis ssp. sepedonicus (СsR14) 500 измерений

Эндо. Идентификацию бактерий проводили с использованием системы ММТЕ1 и ММТЕ2 (Multimicrotest systems for biochemical identification of Enterobacteriaceae).

Инокуляцию растений и суспензионных культур проводили в асептических условиях, делая смыв суточной культуры бактерий в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга (MS). Для инокуляции растений in vitro вносили 1,0 мл инокулята в каждую пробирку в конечной концентрации бактерий 1 х 108 КОЕ/мл. Для инокуляции табака на поверхность листовой пластины трехнедельных растений наносили каплю бактериальной суспензии. Инокулированные растения выращивали в факторостатных условиях при 16-часовом световом дне с контролируемым режимом выращивания при температуре 23-25 °С днем и при 18-20 °С ночью, влажностью 75-85 %, освещенностью 5000-7000 лк. При инокуляции суспензионных культур клеток растений 1,0 мл инокулята вносили в 24,0 мл суспензии.

Определение колонизации растений in vitro бактериями проводили следующим образом. Инокулировали растения картофеля in vitro суспензией клеток Е. coli и С. michiganensis. Ежедневно делали высев каждого растения на чашки Петри с МПА (Оболенск, Россия); для этого, с помощью стерильного пинцета вынимали растение из пробирки на стерильный коврик; разрезали растение на 4 зоны (зона корней, нижняя зона, средняя зона, верхушка). Все зоны растения выдерживались 10 мин в обеззараживающем растворе следующего состава: 0,7% раствор гипох-лорита натрия с добавлением 2 капель детергента Твин 80 («Ferak», Германия) и гомогенизировались. Для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) проводили последовательное разведение инокулированной среды растения и полученного гомогената в стерильных эппендорфах.

Биотестирование проводили с помощью стандартных методов с некоторыми модификациями (Возняковская Ю.М., 1969).

Скорость размножения бактерий определяли в физиологическом растворе, забуференном 0,1 М фосфатным буфером с pH 7 (голодная среда) и среде Красиль-никова (полная среда). В колбу с 200,0 мл среды вносили 1,0 мл бактериальной суспензии по стандарту мутности. Бактерии культивировались на качалке при температуре 4, 24, 30 и 37 °С. Оптическую плотность измеряли на фотометре КФК-3 (Прибортех, Москва) при длине волны 540 нм через 1, 3, 5, 7, 24, 30, 48, 54, 72 часа.

Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли диско-диффузионным методом (НИЦФ, Санкт-Петербург) (МУК 4.2.1890-04). Определение формирования биопленок бактериями проводили по методике И.А. Шагинян с соавт. (2007). Амилазную, протеолитическую, целлюлазную активности изучали общепринятыми методами (Нетрусов А.И., 2005). Целлюлазную активность выявляли по фильтровальной бумаге, которую гидролизовали в 0,1 М ацетатном буфере (pH 5.9) при температуре 50 °С. Количество редуцирующих Сахаров оценивали по методу Шомоди - Нельсона (Синицын А.П. и др., 1990). Активность липазы определяли по оливковому маслу (Нетрусов А.И., 2005).

Для определения количества белка использовали метод Лоури. Для изучения образования ауксинов в среду культивирования добавляли 200 мг/л триптофана. Бактериальную суспензию центрифугировали при 30000 g 10 мин. Дальнейшие исследования проводили с супернатантом. Количество ауксинов определяли по методу Сальковского (Чумаков М.И. и др., 1992).

Определение активности общей пероксидазы растений картофеля in vitro проводили по методу Бояркина (Бояркин А.Н., 1951) и выражали в условных единицах на мг белка. Активные формы кислорода оценивали спекгрофотометри-ческим методом с использованием ксиленолового оранжевого (Bindschedler L.V. et al., 2001). Определение активных форм кислорода на поверхности корней, окрашенных флуоресцентнным красителем DCF, проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Observer ZI (Carl Zeiss) с цифровой монохромной камерой Axio Саш MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений «AxioVision Reí 4,6».

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех аналитических и трех биологических повторностях. Для статистической обработки результатов исследований использовали общепринятые параметрические и непа-рамегрические критерии статистики (Рокицкий П.Ф., 1973; Гланц С., 1999; Сави-лов Е. Д. с соавт., 2011 ). Степень внутривидового разнообразия на уровне микробной популяции оценивали с помощью индекса разнообразия Симеона (Одум Ю., 1986), сходство между видовым составом двух объектов определяли, используя индекс сходства Серенсона (Одум Ю., 1986). В качестве коэффициента синхронности применяли коэффициент корреляции Спирмена (Савилов Е.Д. с соавт., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация условно-патогенных и патогенных энтеробактерий

к условиям внешней среды

При сапрофитном существовании патогенные и условно-патогенные бактерии подвергаются комплексному воздействию абиотических и биотических факторов среды обитания. В первую очередь, это более низкие температуры, а также недостаточное содержание питательных веществ. В случае, когда питательный элемент отсутствует, бактерии воспринимают новые условия как условия голодания. В процессе адаптации к таким условиям в клетках происходят изменения, затрагивающие их физиологию и морфологию, что приводит, в конечном счете, к мультирезистентности (Ермилова Е.В., 2007).

Для изучения адаптации к условиям внешней среды, УПЭ, изолированные от больных людей, помещали в условия, различающиеся доступностью питательных веществ и температурой. Использовались следующие виды - Е. aerogenes, Е. cloacae, С. freundii, P. mirabilis, M. morganii, К. pneumoniae. Для сравнения были взяты классические патогенные микроорганизмы, возбудители дизентерии - Sh. sonnei и Sh. ßexneri.

Кривая роста каждого вида микроорганизма имела свою форму. При этом отмечено, что в условиях экстремально низкой температуры (4 °С) колебания плотности бактериальной популяции больше зависели от состава среды, чем при более благоприятных температурных условиях. Показано, что при этой температуре снижение количества клеток бактерий при культивировании в полной среде было более существенным, чем в голодной (рис. 1).

О 5 11 17 24 30 36 42 48 54 60 66 72 часы

О 5 11 17 24 30 36 42 48 54 60 6

часы

0 5 11 17 24 30 36 42 48 54 60 66 72 часы

=4; 24 30 37

=<*: 4

------•---'-'-'- =Os 24

0 5 11 17 24 30 36 42 48 54 60 66 72 ^ 30 ^ 37

часы

Рис. 1. Динамика концентрации Е. aerogenes (1) и К. pneumoniae (2) в забуферен-ном физиологическом растворе (А) и в среде Красильникова (Б).

Это свидетельствует о том, что доступность питательных веществ оказывает большее влияние на адаптацию микроорганизмов, чем температурные условия. Таким образом, в условиях внешней среды, где в отличие от организма человека и животных наблюдается недостаток пищевых субстратов, бактерии лучше переносят действие неблагоприятных температур.

Можно предположить, что выявленная особенность является следствием так называемого, «глобального стрессового ответа», когда клетка в условиях действия одного стрессора (в данном случае недостатка питательных веществ) приобретает устойчивость к действию другого стрессора (температуры) (Ермилова Е.В., 2006). Причем в этой ситуации влияние среды культивирования, вероятно, обусловливает устойчивость к низким температурам. 12

Таблица 2

Коэффициент синхронности динамики популяции

Klebsiella pneumoniae

Среда Температура, °С Голодная Полная

Температура, °С

4 24 30 37 4 24 30 37

Голодная 4 1,00 -0,30 0,47 -0,71* -0,55 -0,35 -0,54 -0,30

24 -0,30 1,00 -0,34 0,17 0,79* 0,19 0,45 0,50

30 0,47 -0,34 1,00 -0,16 -0,25 -0,01 -0,12 0,03

37 -0,71* 0,17 -0,16 1,00 0,38 0,21 0,38 0,22

Полная 4 -0,55 0,79* -0,25 0,38 1,00 0,45 0,63 0,56

24 -0,35 0,19 -0,01 0,21 0,45 1,00 0,92* 0,90*

30 -0,54 0,45 -0,12 0,38 0,63 0,92* 1,00 0,95*

37 -0,30 0,50 0,03 0,22 0,56 0,90* 0,95* 1,00

Примечание: * - р < 0,05.

Таблица 3

Коэффициент синхронности динамики популяции Shigella sonnei

Среда Температура, °С Голодная Полная

Температура, °С

4 24 30 37 4 24 30 37

Голодная 4 1,00 1,00* 0,99* 0,99* 0,71* 0,91* 0,71* 0,75*

24 1,00* 1,00 1,00* 1,00* 0,68* 0,88* 0,65* 0,70*

30 0,99* 1,00* 1,00 1,00* 0,68* 0,86* 0,61* 0,66*

37 0,99* 1,00* 1,00* 1,00 0,69* 0,88* 0,65* 0,70*

Полная 4 0,71* 0,68* 0.68* 0,69* 1,00 0,64* 0,68* 0,70*

24 0,91* 0,88* 0,86* 0,88* 0,64* 1,00 0,79* 0,81*

30 0,71* 0,65* 0,61* 0,65* 0,68* 0,79* 1,00 0,99*

37 0,75* 0,70* 0,66* 0,70* 0,70* 0,81* 0,99* 1,00

Примечание: * - р < 0,05.

Интересно, что у многих изученных видов энтеробактерий количество бактериальных клеток при всех условиях культивирования изменялось синхронно, отличаясь при этом лишь амплитудой колебаний. Степень синхронизации для разных видов была различной, однако, при культивировании в полной среде при благоприятных температурах (24,30 и 37 °С) она значима для всех исследованных видов (табл. 2, 3). Показано, что наибольшей степенью синхронности обладали патогенные микроорганизмы Бк миие/ и БИ./1ехпеп (табл. 3).

Биологические свойства энтеробактерий, обусловливающие

их способность выживать в организме растений

1) Образование биопленок

Необходимым компонентом процесса колонизации как животных, так и растений, являются биопленки (Eberl L. et al., 2007). На поверхности листа биопленки формируются преимущественно вокруг устьиц и трихом, а также вдоль сосудов. Эти местообитания наиболее благоприятны по влажности и концентрации питательных веществ (Monier J.M., Lindow S.E., 2004). Патогены, например, фитопатогенная энтеробактерия Pantoea stewartii, вызывающая вилт кукурузы, формирует биопленки в инфицированных сосудах, синтезируя полисахарид стевартан и нарушая процессы транспорта (Koutsoudis M.D. et al., 2006). Существенное влияние на степень формирования биопленок оказывают условия среды. Это, в первую очередь, наличие питательных элементов и доступность кислорода (Danhom T. et al., 2004; Monds R.D. et al., 2001 ; Okinaka Y. et al., 2002).

Способность образовывать биопленки была изучена у вышеуказанных видов энтеробактерий. Дополнительно использовали фитопатогенную энтеробактерию P. carotovotum ВКМ В-1247.

Сравнение оптической плотности биопленок, сформированных разными видами энтеробактерий культивируемых в мясопептонном бульоне при 37 °С, как наиболее оптимальных условиях, показало, что наиболее высокую способность к пленкообразованию продемонстрировали виды -P. mirabilis, Е. aerogenes, Sh. sonnei, Sh. flexneri и P. carotovoriim (рис. 2).

* О.'

Рис. 2. Образование биопленок условно-патогенными и патогенными видами энтеробактериями при 37 "С: 1 - забуференный физиологический раствор, 2 - мясопептонный бульон.

Эти же виды, за исключением Sh. flexneri, формировали более плотные бипленки при культивировании в забуференном физиологическом растворе при той же температуре (см. рис. 2). Таким образом, при 37 °С виды P. mirabilis, Е. aerogenes и Sh. sonnei обладают большей пленкообразующей способностью независимо от среды культивирования.

На следующем этапе исследований изучали роль температурных условий в процессе формирования биопленочных сообществ. Оказалось, что при культивировании в бульоне, снижение температуры до 30 °С практически не влияло на способность энтеробактерий образовывать биопленки, за исключением Е. cloa-сае и С. freundii. При этом, в забуференном физрастворе у бактерий Е cloacae, С. frendii, P. mirabilis, Е. aerogenes, Sh. sonnei оптическая плотность биопленки при 30 °С была значимо ниже биопленок при 37 °С.

700 600 500 400 300 200 100

0 37 °С л 24 °С

□ 30 "С 04 °С

вид

350 300 250 -200 -150 100

о 37 °С л 24 "С

□ 30 °С 04 °С

□

вид

Рис. 3. Оптическая плотность биопленки, сформированной разными видами энтеробактерий, в зависимости от температуры культивирования (А - бульон, Б - забуференный физиологический раствор): 1-Е. cloacae, 2-Е. aerogenes, 3 - С. freundii, Л - P. mirabilis, 5 - К. pneumoniae, 6 - Sh. sonnei, 7 - Sh. flexneri, 8 - P. carotovotum.

Сравнение биопленок, образованных при 24 °С и при 37 °С выявило значимые различия, полученные для видов P. mirabilis, К. pneumoniae, Е. aerogenes, Sh. sonnei, Sh. flexneri, культивируемых в бульоне. При этом, оптическая плотность биопленок при 24 °С была выше, чем при 37 °С. Эти же виды показали значимые различия при культивировании в физрастворе. Однако, плотность биопленки в этой среде была выше при культивировании при 37 °С. Температура 4 °С является неблагоприятной для исследуемой группы микроорганизмов, поэтому в этих условиях большинство видов энтеробактерий, за исключением P. mirabilis, Е. aerogenes и Sh. sonnei при культивировании в бульоне, не образовывали биопленку или ее оптическая плотность была незначительной. Таким образом, наиболее оптимальной температурой для формирования биопленок при культивировании энтеробактерий в бульоне является 24 °С, тогда как бактерии культивируемые в забуференном физиологическом растворе образовывали биопленку с максимальной оптической плотностью при 37 °С (рис. 3). Следовательно, влияние температуры на степень формирования биопленки зависит от среды культивирования. При этом, бактерии, характеризующиеся высокой пленкообразующей способностью, при культивировании в бульоне при 37 °С сохраняли эту способность в физиологическом растворе при той же температуре (см. рис. 3).

2) Экзоферменты энтеробактерий, необходимые для выживания в рас-пштельных тканях

Для того, чтобы определить,- могут ли энтеробактерии, этиологические агенты ОКИ, при попадании во внешнюю среду взаимодействовать с растениями, необходим набор особых экзоферментов, способствующих использованию растительных углеводных биополимеров в качестве питательных субстратов. Для решения представленной задачи были выбраны ферменты — марганец-перокси-даза, каталаза, липаза, уреаза, протеаза, целлюлаза, амилаза и пектиназа, которые определяли в супернатанте культуральной жидкости бактерий, находящихся в стационарной фазе роста (трое суток).

Основной компонент клеточной стенки растений — волокна целлюлозы. Целлюлозные микрофибриллы окружены пектинами, которые сильно гидратированы и образуют гель. Еще один компонент клеточной стенки - лигнин, ароматический полимер, обладающий высокой устойчивостью к биодеградации. Для того чтобы персистировать в организме растений, бактерии должны обладать ферментами, способными разлагать эти соединения. Марганец-пероксидаза, целлюлаза и ферменты пектиназного комплекса являются важными факторами патогенности фитопатогенных бактерий. У патогенных и условно-патогенных для человека энтеробактерий эти ферменты ранее не изучались.

Марганец-пероксидазная активность, способствующая разрушению лигнина, обнаружена в среде культивирования бактерий Е. cloacae, Е. aerogenes, P. mirabilis, С. freundii. Максимальный показатель активности фермента

(2,85 Ед/мг) зарегистрирован для Е. cloacae, культивируемого в забуференном физиологическом растворе при 4 °С.

Целлюлазная активность супернатанта исследованных бактерий была слабая, однако микробиологический анализ с использованием карбоксиметил-целлюлозы (КМЩ показал присутствие данного фермента, который, по всей вероятности, является индуцибельным (рис. 4). Особенно выраженной активностью целлюлазы обладали Е. cloacae и C.freundii.

«¿ev •

1 3 4 аШКЯШЁ"-«*. -^^eMUÉifcfcw.

4/ \ - / я* t Т ^ .......'', . .. /t. .-'л .Г^**"^*^--.. : >

5 6 7 8

Рис. 4. Целлюлазная активность используемых культур бактерий на среде с кар-боксиметилцеллюлозой (1-Е. а erogenes, 2 - P. mirabilis, 3-Е. cloacae, 4 - С. freundii, 5 - P. carotovorum, 6 - Sh. flexneri, 7 - Sh. sonnei, 8 -K. pneumoniae).

Ферменты пектиназного комплекса являются основными факторами вирулентности фитопатогенных энтеробактерий - представителей рода Pectobac-terinm. Другие представители Enterobacteriaceae, включая некоторые патогены человека, обладают сокращенными путями разложения пектина (Abbott D.W., Во-raston А.В., 2008). Проведенные исследования выявили пектиназную активность супернатанта культуральной жидкости у бактерий видов Е. cloacae, Е. aerogenes, С. freundii, культивируемых в забуференном физрастворе (рис. 5). Показано ее снижение при увеличении температуры культивирования.

Защиту бактерий от действия активных форм кислорода (АФК), образующихся в результате активации иммунной системы растения, обеспечивает каталаза, которая нейтрализует свободные кислородные радикалы. Высокими значениями активности этого фермента характеризовались условно-патогенные

виды Е. aerogenes (3,30 Ед/мг) и P. mirabilis (2,25 Ед/мг), тогда как для патогенных энтеробактерий, например, Sh. sonnei, она была относительно низкой (0,86).

Рис. 5. Активность пектиназы в среде культивирования бактерий.

Ферменты, обладающие липазной и протеазной активностью, являются неспециализированными факторами патогенности и существенны для колонизации хозяев разных таксономических групп. Высокой липазной активностью обладали Е. cloacae и Е. aerogenes - 2,50 и 1,84 Ед/мг, соответственно. Протеазная активность у исследованных видов практически не регистрировалась.

Запасающим веществом у растений служит крахмал, расщепление которого с помощью амилаз может обеспечить бактериальные клетки глюкозой. Проведенные эксперименты показали, что наибольшей амилолитической активностью обладали C.freundii (6,67 Ед/мг). Причем активность этого фермента возрастала в богатой среде культивирования при снижении температуры.

Определение амилолитической активности с помощью микробиологического анализа показало ее наличие у всех исследуемых видов (рис. 6).

Выживанию в почве и созданию ассоциаций с растениями способствует уреаза. Бактерии, продуцирующие уреазу, будучи широко распространены в природе, играют весьма важную роль, переводя накапливающуюся в почве мочевину, не усваиваемую растениями, в легко усваиваемый углекислый аммоний. Нами показано, что максимальной активностью внеклеточной уреазы характеризовалась Е. aerogenes, культивируемая в забуференном физрастворе (14,60 Ед/мг). Достаточно высокая активность фермента выявлена у Е. cloacae (6,88 Ед/мг).

Все изложенное свидетельствует, что условно-патогенные и патогенные эн-теробактерии, выделенные от людей с ОКИ, при попадании во внешнюю среду обладают спектром экзоферментов, обеспечивающих этим микроорганизмам проникновение в растения и их колонизацию.

5 6 7 8

Рис. 6. Амилолитическая активность исследуемых видов энтеробактерий на среде с крахмалом (1-Е. aerogenes, 2 - P. mirabilis, 3-Е cloacae, Л-С. freundii, 5 - Sh. flexneri, 6 - Sh. sonnei, 7 - К. pneumoniae).

3) Синтез индолилуксусной кислоты

Одним из метаболитов, способствующих взаимодействию бактерий с растительным организмом, является бактериальная индолилуксусная кислота (ИУК). ИУК - одна из главных форм фитогормонов класса ауксинов. Показано, что этот фитогормон синтезируется как фитопагогенными, так и симбиотическими бактериями, так называемыми PGPR-штаммами (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) (Цавкелова Е.А. и др., 2006; Dimkpa С.О. et al., 2012). В то же время, имеются сведения о синтезе этого соединения свободноживущими микроорганизмами (Bianco С. et al., 2006).

Нами показано, что в забуференном физиологическом растворе при добавлении 200 мг/л трип тофана и культивировании при 24 °С, наиболее высокие концентрации ИУК (333,82 ± 18,7 мкг/мл) продуцировал Е. aerogenes. Достаточно много этого фитогормона обнаружено в супернатанте С. freundii (140,91 ± 12,23 мкг/мл) и P. mirabilis (184,12 ± 12,65 мкг/мл) (рис. 7).

Даже в отсутствие триптофана, который, как известно, является предшественником бактериальной ИУК, в забуференном физиологическом растворе наблюдаются существенные концентрации ИУК в супернатанте Е. aerogenes (148,23 ± 5,02 мкг/ мл) и P. mirabilis (138,86 ± 2,32 мкг/мл). Внесение триптофана способствует возрастанию ее концентрации у Е. aerogenes, С. freundii, P. mirabilis и Sh. sonnei (табл. 4).

400 350 300 250 200 150 100 50 0

Гу1

ф го о го о о

вид

о >

о о

8 CL

Рис. 7. Концентрация ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования энте-робактерий разных видов

Таблица 4

Концентрация ИУК в среде культивирования разных видов энтеробактерий в зависимости от добавления триптофана (200 мг/л)

Вид микроорганизма Забуференный физиологический раствор без триптофана, 24 °С (мкг/мл) Забуференный физиологический раствор с триптофаном, 24 °С (мкг/мл)

Е. aerogenes 148,23 ±5,02 333,82 ± 18,70

Е. cloacae 41,69 ±4,87 37,65 ± 10,40

К. pneumoniae 0,0 0,0

С. freundii 68,51 ±6,22 140,91 ± 12,23

P. mirabilis 138,86 ±2,32 184,12 ± 12,65

S. sonnei 24,51 ± 5,83 27,42 ± 3,44

S. flexneri 34,83 ±26,07 78,83 ±7,57

P. carotovorum 17,34 ±5,40 20,40 ±2,48

Таким образом, виды Е. aerogenes, С. freundii и P. mirabilis, изолированные от больных людей, являются активными продуцентами ИУК, что может обусловливать их действие на рост и развитие растений. Шгамм К. pneumoniae при используемых условиях не образовывал данный метаболит.

Известно, что синтез метаболитов бактериями зависит от условий культивирования - в первую очередь, температуры и состава среды. Поэтому на следующем этапе исследований было изучено влияние температуры (4, 24 и 37 °С) на синтез ИУК в забуференном физиологическом растворе с 200 мг триптофана (рис. 8). Определение зависимости концентрации синтезированной ИУК в зависимости от температурных условий проводили с помощью критерия Стьюдента с поправкой

Бонферрони (Гланц С., 1999). В результате попарного сравнения всех трех групп были получены следующие результаты. Для видов Е. cloacae, P. mirabilis и Р. саго-tovorum не выявлено значимого влияния температуры на синтез исследуемого метаболита. Остальные виды, за исключением Sh.flexneri, продемонстрировали увеличение синтеза ИУК при возрастании температуры культивирования. Причем для Е. aerogenes значимый рост концентрации исследуемого соединения зафиксирован уже при 24 °С, тогда как для С. freundii и Sh. sonnei показано ее увеличение, только при 37 °С. Sh. flexneri, напротив продуцировала большие концентрации ИУК при 4 °С.

вид

Рис. 8. Зависимость количества ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования разных видов энтеробактерий от температуры культивирования.

Межклеточная жидкость растений, где обитают эндофитные микроорганизмы, богата сахарами, в связи с чем, было необходимо оценить влияние разных концентраций глюкозы на синтез исследуемого метаболита. Использовали забуференный физиологический раствор с 200 мг триптофана, обогащенный глюкозой (1 и 5 г/л) (рис. 9).

Показано, что Е. cloacae, Sh. flexneri и P. carotovorum синтезируют ИУК независимо от содержания глюкозы в среде. Для Е. aerogenes, С. freundii и Sh. sonnei установлено, что внесение в среду культивирования 1 г глюкозы значимо снижает концентрацию синтезируемого фитогормона, в то время как при добавлении 5 г концентрация синтезированного метаболита не отличается от его содержания в забуференном физиологическом растворе без внесения сахара. Концентрация ИУК, синтезируемого P. mirabilis снижается при внесении Сахаров в среду культивирования. Все изложенное свидетельствует, что концентрация ИУК в среде культивирования не увеличивается при ее обогащении глюкозой.

400 350 300 250

I 200

s 150 100 50 0

Рис. 9. Зависимость количества ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования разных видов энтеробактерий от количества глюкозы.

Таким образом, энтеробактерии разных видов, выделенные от больных, способны синтезировать фитогормон ИУК, что свидетельствует о том, что при проникновении в организм растения они могут оказывать влияние на его жизнедеятельность. Из этих видов наиболее активными продуцентами были Е. aero-genes, С. freundii и P. mirabilis, причем эти виды образовывали существенные концентрации метаболита даже в отсутствие триптофана. К. pneuminiae в данных условиях культивирования не образовывала ИУК. Оценка вклада температуры культивирования показала, что она либо увеличивала концентрацию синтезируемого продукта (Е. aerogenes, С. freundii, Sh. sonnei), либо не оказывала влияния на его содержание в супернатанте (Е. cloacae, P. mirabilis, P. carotovorum). Добавление в среду культивирования глюкозы не увеличивало концентрацию синтезированной ИУК, что свидетельствует, что этот метаболит формируется в голодной среде. Это можно объяснить тем, что экспрессия ключевого гена биосинтеза ИУК - ipdC происходит при недостатке углерода или при стрессовых условиях (Опа О. et al., 2005).

Изложенное выше свидетельствует, что патогенные и условно-патогенные для человека энтеробактерии, изолированные от больных людей, обладают биологическими свойствами, благоприятными для колонизации растительных тканей. Следовательно, при попадании в организм растения эти виды (в первую очередь Е. aerogenes, С. freundii и P. mirabilis) могут оказывать существенное влияние на рост и развитие растительного организма, сопоставимое с таковым у эндофитных и ризосферных бактерий.

НО □ 1 ы5

вид

Влияние энтеробактерий разных видов на рост и развитие растений

Классическим методом определения влияния бактерий на растения является метод биотестирования, позволяющий определить их фитотоксичность по всхожести семян и развитию проростков.

Оценку воздействия Е. coli (штамм XLl-Blue) проводили, определяя влияние данного вида на всхожесть семян различных сельскохозяйственных растений: редис сорт Жара, капуста сорт Казачок Супер, горох Аксайский, салат крупнокочанный, салат сорт Кучерявец Одесский. Выбор растений был обусловлен тем, что они употребляются человеком в сыром виде и могут представлять потенциальную угрозу в качестве источника патогенов, вызывающих кишечные инфекции. Было выявлено, что при инокуляции семян этот микроорганизм по-разному действует на различные виды растений, преимущественно ингибируя их прорастание и развитие.

Сравнительный анализ воздействия разных видов условно-патогенных и патогенных энтеробактерий на всхожесть и развитие растений был проведен с использованием семян редиса сорта Жара, который показал достаточную чувствительность к бактериям Е. coli, в эксперименте, описанном выше. Взаимодействие происходило при температурах: 4, 24, 30 и 37 °С.

Оценка всхожести семян редиса, обработанных суспензией клеток разных видов бактерий, показала, что ни один из исследуемых видов не оказал такого подавляющего воздействия на всхожесть как фитопатоген Р. carotovorum В-1247. Для этого вида наибольший процент подавления всхожести зарегистрирован при 24 °С, температуре соответствующей условиям окружающей среды (табл. 5).

Таблица 5

Всхожесть семян редиса сорта Жара, обработанных разными видами энтеробактерий (п = 30)

Вид Всхожесть при температуре (%)

30 "С 24 °С 4 °С

Enterobacter cloacae 90 ±0,06 87 ± 0,06 90 + 0,05

Citrobacter freundii 97 + 0,03 87 ± 0,06 77 ± 0,08

Proteus mirabilis 83 ± 0,07 87 ± 0,06 77 ± 0,08

Enterobacter aerogenes 77 ± 0,08 97 ± 0,03 77 ± 0,08

Shigella sonnei 93 ± 0,05 93 ± 0,05 73 ±0,08

Shigella flexneri 83 ± 0,07 100 + 0,00 73 ±0,08

Klebsiella pneumoniae 67 ± 0,09 100 + 0,00 87 ±0,06

Pectobacterium carotovorum 70 + 0,08 43 ± 0,09 90 ±0,05

Наиболее заметное влияние условно-патогенных и патогенных бактерий отмечено при 30 °С. В этих условиях, К. pneumoniae ингибировала всхожесть почти 30 % семян редиса.

Фитопатоген P. carotovorum B-1247 оказывал также наиболее ингибирующее воздействие на длину проростков и корешков редиса при всех температурах, кроме 4 °С. Это согласуется с данными литературы, согласно которым оптимум для данного фитопатогена располагается в диапазоне от 15 до 40 °С (Bhat К.А. etal., 2010)

Значимый ингибирующий эффект при 30 °С оказывали К. pneumoniae и Е. aerogenes, а Е. cloacae, напротив, оказывала стимулирующее воздействие на длину проростка. При 24 °С значительное ингибирование длины проростка зафиксировано для С. freundii, К. pneumoniae, Sh.flexneri, корней - С. freundii, P. mirabilis, К. pneumoniae. При 4 °С у пятисуточных растений редиса были только корни, длину которых ингибировали виды — P. mirabilis и Sh. sonnei (рис. 10).

и Проростки в Корни

CD "G ф а) ts "о (Л =3 аз со ¿5 а; о (/) ф "а) с с: ГО œ g .5? Й jz а>

го -Q 8 го .о с: Z3 о го го XJ с CD о с/з

О аз о CD а. Е о Oî о J5 со с=

Ф С Ш Т5 б ш с ш аЗ го ф аз !с С/5

1 §

3 <D С

ja о о )=

Т> 8 щ

Рис. 10. Длина проростка и корня редиса, обработанного суспензией бактерий: 1 - температура 30 "С, 2 - температура 24 'С.

Оценка зависимости ингибирующего влияния энтеробактерий от температуры с помощью дисперсионного анализа показала, что она значима для Е. aerogenes и К. pneumoniae, а также при воздействии на корневую систему Е. cloacae, Sh. sonnei и Sh. flexneri. 24

Сравнение внешних признаков заражения пятисуточных проростков редиса показало, что некоторые условно-патогенные и патогенные энтеробактерии обладают фитопатогенным действием, что проявляется в потемнении корешков и проростков (рис. 11). Наибольшее воздействие на растения редиса оказали К. pneumoniae и Е. aerogenes. Влияние этих видов зависело от температуры, при которой происходило взаимодействие.

Оценку влияния некоторых УПЭ проводили также в гнотобиогических условиях на модели растений картофеля in vitro сортов Луговской и Лукьяновский. Использовали виды Е. coli, штамм JM103, M. morganii, P. mirabilis, C.freundii и фитопатоген P. carotovorum var. atroseptica. Действие этих бактерий оценивали на прирост растений в длину. Оказалось, что влияние разных видов бактерий различается. Выраженное угнетение и последующая гибель зарегистрированы для растений, контаминированных фитопатогеном. Влияние Е. coli, штамм JM103 проявлялось в виде стимулирующего действия на растения картофеля сорта Лукьяновский.

Рис. 11. Внешний вид проросших семян редиса при заражении энтеробактериями.

А - контроль 30 "С; Б - заражение С. freundii, 30 "С; В - заражение Sh. flex-neri, 30 'С; Г - заражение P. carotovorum, 30 "С.

Заражение растений картофеля сорта Лукьяновский другими видами энтеро-бактерий, выделенных от больных людей (P. mirabilis, M. morganii, С. freundii), показало их преимущественно ингибирующее воздействие, зависимое от концентрации бактерий, при этом задержка роста уже в первые сутки контакта с патогеном свидетельствует о возможном включении защитных реакций растения.

Следует отметить, что при внесении М. morganii в концентрации 1 х 103 значимо стимулировало прирост растительного объекта.

Изучение скорости распространения и накопления энтеробактерий

в растении

Эксперименты, вошедшие в данный раздел исследования, посвящены определению кинетики колонизации растений энтеробактерией Е. coli. Исследования выполнялись в гнотобиотической системе на растении картофеля in vitro. Использовали растения двух сортов - Луговского и Лукьяновского. Для сравнения скорости колонизации картофеля был использован фитопатоген С. michiganensis ssp. sepedonicus, так как ранее было установлено, что Луговской сорт обладает устойчивостью к фитопатогену, в то время как Лукьяновский сорт к нему восприимчив (Romanenko A.S. et al., 1999).

Показано, что С. michiganensis достигала верхней части растения восприимчивого сорта картофеля только через шесть суток после инокуляции, тогда как при заражении Е. coli бактерии обнаруживались в этой же зоне уже в первые сутки. Одной из причин этого явления может быть высокая подвижность и быстрая скорость роста Е. coli, в то время как С. michiganensis — неподвижный микроорганизм и, скорее всего, распространяется по растению с током воды.

Сравнение колонизации различных по специализации патогенов (условно-патогенная и фитопатогенная) выявило ряд особенностей в этом процессе. И в том, и в другом случае восприимчивый сорт (Лукьяновский) быстрее колонизировался бактериями, что связано, вероятно, с отличиями в неспецифических защитных реакциях, замедляющих распространение бактерий независимо от их вида.

Изложенное выше свидетельствует об активном участии растения хозяина в регулировании заселения его тканей не только фитопатогенами, но и бактериями, условно-патогенными для человека.

Ответные реакции растений при взаимодействии сэнтеробактериями,

патогенными и условно-патогенными для человека

Активация защитной системы растений индуцируется распознаванием присутствия чужеродного организма с помощью образ-распознающих рецепторов, т.н. паттерн-индуцированный ответ (PTI). Это узнавание запускает процессы последующего сигналлинга, включая активацию каскада МАР-киназ, потоки ионов и продукцию АФК, наблюдаемые в первые минуты после начала взаимодействия (O'Brien J.A. et al., 2012). При наличии у бактерий системы секреции третьего типа, способствующей поступлению эффекторных белков в цитозоль клетки-хозяина, развивается эффектор-индуцированный иммунитет (ETI). Он соответствует второй волне окислительного «взрыва» и наступает через три-пять часов после контакта с патогеном. В этом случае наблюдаются совместимые взаимодействия, приводящие к развитию болезни, либо несовместимые, заканчивающиеся реакцией сверхчувствительности (СЧ). Все изложенное касается

взаимодействия растений с фитопатогенами, однако практически отсутствуют данные о реакции растений на бактерии, патогенные для человека.

В настоящем исследовании культуры суспензионных клеток картофеля {Solanum tuberosum) сорта Жуковский Ранний и табака {Nicotiana tabacum), находящиеся в экспоненциальной фазе роста, инокулировали Е. coliXL-1 Blue. Для сравнения использовали фитопатоген С. michiganensis ssp. sepedonicus (штамм CsR14), хозяином которого является картофель, а табак вступает в несовместимые взаимодействия с этой бактерией. Для определения АФК использовали метод окрашивания перекиси водорода ксиленоловым оранжевым, поэтому под термином АФК подразумевается в первую очередь это соединение.

Продукцию АФК определяли в динамике, начиная с первых минут взаимодействия. Оказалось, что в табаке первый пик окислительного «взрыва», индуцированного фитопатогеном и патогеном человека, совпадал по амплитуде, тогда как в культуре клеток картофеля количество АФК в ответ на С. michiganensis было ниже.

Для того чтобы изучить развитие окислительного «взрыва» при несовместимых взаимодействиях, исследования были продолжены только на культуре суспензионных клеток табака. Оказалось, что в ответ на С. michiganensis наблюдается второй подъем уровня АФК, что соответствует данным литературы, согласно которым табак отвечает на заражение этим фитопатогеном реакцией СЧ. В ответ на патоген человека также развивалась вторая волна окислительного «взрыва», хоть и меньшая по амплитуде. Это свидетельствует, что развитие ответа на данный микроорганизм суспензией табака ближе к несовместимому варианту взаимодействия бактерий с растениями.

Сравнение развития ответных реакций в корневой системе растений разных видов: семисуточные проростки редиса (Rhaphanus sativus L.) и растения картофеля (Solanum tuberosum) in vitro показало, что продукция АФК при воздействии Е. coli XL-1 Blue имела сходную динамику. В исследуемых растениях увеличение уровня АФК наблюдалось уже через пять минут после взаимодействия. Второй подъем концентрации этих сигнальных частиц зарегистрирован через 180 минут. Таким образом, как растения картофеля in vitro, так и семисуточные проростки редиса отвечают на заражение условно-патогенной Е. coli сходным образом.

Основным местом, где происходит взаимодействие между ризосферными микроорганизмами и растением, является среда, непосредственно окружающая корни. Здесь скапливается большое количество метаболитов, в том числе активных форм кислорода.

Измерение концентрации перекиси водорода проводили в течение 28 часов в стерильной дистиллированной воде, помещая туда корни редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара и инокулируя Е. coli XL-1 Blue. Для сравнения использовали фитопатогенную энтеробактерию P. carotovorum В-¡247 (рис. 12, 13).

мин

Рис. 12. Концентрация АФК в среде при кокультивировании корней редиса (ЙЬарЬапиэ ваИ^ив /..) сорта Жара и Е. соНХи-В1ие.

мин

Рис. 13. Концентрация АФК в среде при кокультивировании корней редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара и Р. carotovorum В-1247.

Первая фаза окислительного «взрыва», приходящаяся на первые минуты взаимодействия, соответствует, вероятно, развитию PTI. При этом ответ на Е. coli был более протяженным по времени (60 мин). Вторая волна окислительного «взрыва» была сильнее выражена при взаимодействии с условно-патогенной бактерией, тогда как концентрация АФК, индуцируемая Р. carotovorum на протяжении последующих пяти часов, была практически неизменной. Вероятно, фитопатоген блокирует развитие защитных реакций растения с помощью эффекторных молекул, поставляемых посредством системы секреции третьего типа (Galan J.E., Wolf-Watz Н., 2006).

Через 24—28 часов, напротив, флуктуации концентраций этих сигнальных частиц, образующихся в ответ на инокуляцию Е. coli XLl-Blue, постепенно затухали с тенденцией к снижению содержания этой молекулы в среде. Тогда

как амплитуда колебаний концентрации этой сигнальной молекулы в ответ на фитопатоген увеличивалась. Можно предположить, что в этот момент времени начинается поражение растительных тканей пектолитическими ферментами микроорганизма и, следовательно, развитие заболевания.

Значительную роль в генерации перекиси водорода в процессе защитного ответа и в резистентности к широкому кругу патогенов играют пероксидазы (Dau-di A. et al., 2012), которые вносят большой вклад в первую фазу окислительного «взрыва» (O'Brien J.A. et al., 2012). Учитывая это положение, было проведено определение активности этого важного стрессового фермента на ранних стадиях взаимодействия растений с бактерией, патогенной для человека. Активность пероксидазы измеряли в корнях, стеблях и листьях семисуточных проростков редиса и картофеля in vitro сортов Луговской и Лукьяновский. Для сравнения использовали фитопатоген С. michiganensis ssp. sepedonicus.

Инокуляция патогеном человека приводила к значительному изменению активности пероксидазы в первые минуты эксперимента. Однако, через час взаимодействия активность фермента возвращалась на уровень контроля и оставалась на этом уровне до пяти часов (время эксперимента) (рис. 14).

мин после инокуляции

Рис. 14. Активность растворимой пероксидазы в разных частях проростков растений редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара после взаимодействия с Е. coli XL1 -Blue.

Активность пероксидазы в ответ на фитопатоген в первый час кокультиви-рования имела динамику, сходную с таковой на патоген человека, в то время как в последующие часы в разных частях растения картофеля и в разных сортах она имела отличия. С различной активностью пероксидазы, вероятно, связана и большая восприимчивость Лукьяновского сорта картофеля к возбудителю кольцевой гнили. Изменения активности пероксидазы в верхней части стебля картофеля могут быть показателями системного ответа растения как на фитопатоген, так и на патоген человека.

Через десять суток кокультивирования результаты активности пероксидазы продемонстрировали, что у растений, кокультивируемых с Е. coli активность фермента в корнях и верхушке возвращалась на уровень контроля. В средней же части растений исследуемый показатель был значительно выше. При заражении С. michiganensis, напротив, активность исследуемого фермента в верхней части растения была значимо выше контрольной. При этом существенных отличий между сортами зафиксировано не было.

Таким образом, на ранних стадиях взаимодействия (в первые пять часов) динамика активности пероксидазы, большей частью зависит от сортовых особенностей растения. Тогда как через десять суток кокультивирования на ее уровень влияет вид микроорганизма. Это может быть связано с тем, что динамика активности пероксидазы в первые часы после заражения отражает развитие неспецифического PTI, а на поздних стадиях инокуляция растений микроорганизмами приводит к специфическим отношениям: хозяин-паразит или хозяин — ассоциативный микроорганизм и т.д.

Одним из наиболее часто используемых тестов на активацию эффектор-ин-дуцированного иммунитета является тест на развитие реакции сверхчувствительности с помощью нанесения микробной взвеси на поверхности листа растения, с которым этот микроорганизм вступает в несовместимые взаимоотношения (Spoel S.H., Dong X., 2012).

Известно, что система секреции третьего типа у патогенов животных и растений имеет существенные отличия, поэтому, вероятно, возбудители болезней человека не способны поставлять эффекторные белки в цитозоль клетки-хозяина (Galan J.Е., Wolf-Watz Н., 2006). Существуют лишь единичные работы, посвященные этому вопросу, в которых предоставляются косвенные доказательства участия эффекторных белков Salmonella в регуляции иммунного ответа растений (SchikoraA. etal., 2011).

Нами не зарегистрировано развитие реакции сверхчувствительности (СЧ) при нанесении большинства бактерий на поверхность листа растения табака. Только для C.freundii и К. pneumoniae были выявлены некротические поражения, по форме напоминающие СЧ.

Полученные данные свидетельствуют, что исследуемая группа энтеробакте-рий не оказывает выраженного патологического влияния на организм растения, за исключением К. pneumoniae, которая показала ингибирующее воздействие на всхожесть и развитие проростков семян редиса и привела к поражению листовой пластинки табака (Nicotiana tabacum). Действие большинства патогенов человека, вероятно, аналогично действию нефитопатогенных эндофитов, которые распознаются растением, но сосуществуют с ним в мутуалистической манере. Тем не менее, эти бактерии, возможно, способны блокировать ряд ответных реакций растения, связанных с развитием паттерн-индуцированного иммунитета или эффектор-индуцированного иммунитета. Именно с этим может быть связана

способность УПЭ быстро распространяться по растению и вести эндофитный образ жизни.

Выделение патогенных для человека бактерий из ризо-, филло-и эндосферы растительных тканей

В настоящем разделе представлены исследования, посвященные определению контаминации разных видов растений представителями семейства Еп1егоЬас1епасеае. Соотношение почвенных, ризосферных и эндосферных микроорганизмов, выросших на различных средах, показало, что количество микроорганизмов в ризосфере на порядок больше, чем в почве (8x107 и 2х 106). При этом, в почве количество КОЕ, выросших на среде Эндо, значимо ниже КОЕ на других средах, в то время как в ризосфере эти количества были сопоставимы. В эндосфере количество КОЕ, выросших на всех средах было значимо ниже, чем в ризосфере и почве, что свидетельствует об относительно низкой заселенности растительных тканей микроорганизмами (рис. 15).

¡8 Почва н Ризосфера иЭндосфера

МПА

КАА

ЭШБИ

ЭНДО

Среда

Рис. 15. Логарифм количества КОЕ почвенных, ризосферных и эндосферных бактерий в растении салата сорт Кучерявец Одесский.

Сравнение соотношения морфологических типов бактерий показало, что как в ткани, так и в смывах представлены большей частью грамотрицательные палочки (52,3 % - в тканях и 54,9 % — в смывах), грамотрицательные кокки чаще встречались в смывах (8,1 % и 14,8 % соответственно) (рис. 16). Количество грамположительных палочек в мякоти растений было более чем в два раза больше, чем в смывах (25,6 и 11,3 %, соответственно), тогда как количество грамположительных кокков практически не различалось (13,9 и 19,0 %). Сравнение контаминации исследованных объектов бактериями различных типов с помощью критерия Боярского показал, что значимые различия выявлены только в содержании грамположительных палочек.

15%

11%

52%

Рис. 16. Соотношение морфологических форм в мякоти (А) и смывах (Б) исследованных овощей и фруктов: И - грамположительные палочки; 22

- грамотрицательные палочки; ЕЗ-мотрицательные кокки.

грамположительные кокки

гра-

Представители семейства Enterobacteriaceae значительно чаще встречались в почве (75,00 % проб) и в смывах (76,86 %), чем в тканях растений (50,90 %).

Всего было выделено 179 культур микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Из них 69 были изолированы из почвы, 46 из смывов и 64 из растительных тканей.

Родовой состав условно-патогенных микроорганизмов в зависимости от исследуемого объекта (ризосферная почва, смыв с поверхности, ткань растения) представлен на рис. 17.

Полученные результаты свидетельствуют, что родовой спектр энтеробактерий в исследованных объектах достаточно богат. Индекс разнообразия Симпсона показал, что наибольшим разнообразием характеризовалась филлосфера (0,90), тогда как в эндосфере и ризосфере он составлял 0,84 и 0,66 соответственно. Таким образом, несмотря на большое количество изолятов из ризосферы видов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, зарегистрировано меньше, чем в других биотопах растения. Это объясняется тем, что в пробах ризосферной почвы наиболее часто встречался вид Providentia stuarti, который составлял 55,07 % от

всех выделенных культур, о чем свидетельствует индекс доминирования Симп-сона равный 0,34. В эндосфере индекс доминирования был равен 0,16. В этом биотопе в 34,38 % случаев выделялся Enterobacter aerogenes. Наиболее низкий показатель доминирования отмечен для смывов (филлосферы) - 0,10.

Ткань

Смыв

Почва

0% 20% 40%

в Providentia и Enterobacter

öSalmonella nMorganella

□ Klebsiella aHafnia

60% 80% 100%

»Serratia и Citrobacter

□ Escherichia в Proteus ■ Erwinia

Рис. 17. Спектр родов энтеробактерий, выделенных из ризосферной почвы, смывов с поверхности и ткани обработанной дезинфектантом.

Для оценки потенциальной опасности выделенных культур для человека было использовано определение степени адгезии бактериальных клеток к эритроцитам человека.

Фактор адгезии определяли у 43 культур, выделенных из дикорастущих и съедобных растений. Из них неадгезивных культур (меньше 1,75) не было, слабоадгезивных (1,76-2,5)-одна, среднеадгезивные (2,51-4)-девять, высокоадгезивные (выше 4,1) — 33.

Таким образом, большая часть энтеробактерий, выделенных из смывов, почвы и внутренних тканей растений, обладала высокой степенью адгезии, что может свидетельствовать об их потенциальной вирулентности. Сравнение уровня адгезивности в зависимости от объектов выделения не показало значительных различий. Так, среди культур, выделенных из ткани растений, 66,7 % обладали высокой адгезивностью, из почвы — 75,0 %.

Другим фактором, позволяющим установить эпидемическую значимость выделенных культур является их отношение к антибиотикам. Известно, что патогенные для человека и животных микроорганизмы могут приобретать устойчивость к антибиотикам, применяемым в клинической практике и ветеринарии. Поэтому, с помощью диско-диффузионного метода было проведено определение антибиотикочувствительности выделенных культур к 22 антибиотикам (табл. 6).

Все выделенные культуры были чувствительны по отношению к амикацину, офлоксацину, тобрамицину, цефтазидину и цефтриаксону. Высокая чувствительность зарегистрирована для карбенициллина, цефотоксима, ципрофлоксацина, гентамицина. Больше половины штаммов (56-77 %) были чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, канамицину, фурадонину, цефуроксиму, левомицетину, рифампйцину. 89 % всех культур были устойчивы к оксациклину.

Таблица б

Отношение к антибиотикам культур энтеробактерий, выделенных из ризо-, филло- и эндосферы растений

Антибиотик Чувствительные культуры (%) Устойчивые культуры (%)

Амикацин 100,00 0,00

Норфлоксацин 100,00 0,00

Тобрамицин 100,00 0,00

Цефтазидин 100,00 0,00

Цефтриаксон 100,00 0,00

Карбенициллин 93,33 6,67

Цефотоксим 93,33 6,67

Ципрофлоксацин 93,33 6,67

Гентамицин 88,64 11,36

Стрептомицин 77,36 22,64

Тетрациклин 75,47 24,53

Канамицин 73,58 26,42

Фурадонин 73,33 26,67

Цефуроксим 73,33 26,67

Левомицетин 66,04 33,96

Рифампицин 56,60 43,40

Ампицилин 49,06 50,94

Цефазолин 46,67 53,33

Цефалексин 46,67 53,33

Полимиксин 43,40 56,60

Цефалотин 40,48 59,52

Оксациллин 11,36 88,64

Проведенные исследования позволили выявить высокую обсемененность продуктов питания растительного происхождения, а также дикорастущих и куль-

турных растений бактериями - представителями семейства ЕтегоЪааепасеае. Эти микроорганизмы, обитая во внешней среде, перестраивают свой метаболизм, синтезируя ряд ферментов и биологически активных веществ, что способствует их выживанию в тканях растения, как экологической нише. Различия с фитопато-генами в строении аппарата системы секреции третьего типа не позволяют УПЭ полностью развить свой патологический потенциал на растении. Поэтому при контакте с этой группой бактерий растение отвечает только неспецифическим паттерн-индуцированным иммунитетом, что, вероятно, не вызывает полную элиминацию патогенов из эндосферы. Все это приводит к быстрому заселению растительных тканей энтеробактериями, не вызывая при этом симптомов заражения растения. В связи с этим, пораженные фрукты и овощи могут употребляться в пищу и, при высоком уровне контаминации микроорганизмами или при снижении резистентности человеческого организма, вызывать пищевые инфекции (рис. 18).

Рис. 18. Взаимодействие условно-патогенных энтеробактерий с растениями.

ВЫВОДЫ:

1. Лимитирование по пищевым субстратам способствует лучшей адаптации энтеробактерий к неблагоприятным температурам, что обусловливает выживание этой группы микроорганизмов во внешней среде.

2. Процесс образования биопленок разными видами условно-патогенных и патогенных энтеробактерий в голодной среде, зависит от температурных условий в большей степени, чем в полной среде.

3. Условно-патогенные энтеробактерии, возбудители острых кишечных инфекций человека, синтезируют экзоферменты (целлюлазы, пектиназы, амилазы, Mn-пероксидазы и др.) и биологически активные вещества (индолилуксусная кислота), способствующие их персистенции в организме растений.

4. Условно-патогенные и патогенные энтеробактерии оказывают разнонаправленное влияние на рост и развитие растений, свидетельствуя о видоспеци-фических реакциях, возникающих в результате этого взаимодействия. В отличие от патологического действия фитопатогена, реакция растений на контакт с условно-патогенными и патогенными энтеробактериями зависит от температурных условий.

5. Контакт корневой системы с условно-патогенными энтеробактериями приводит к проникновению микроорганизмов в растительные ткани и полной колонизации растения в течение двух-трех суток.

6. Растения реагируют на присутствие энтеробактерий, патогенных для человека, уже в первые минуты взаимодействия, что вызывает стремительное увеличение уровня АФК — «окислительный взрыв».

7. Условно-патогенные энтеробактерии, этиологические агенты ОКИ человека, при попадании во внешнюю среду обладают набором биологических свойств, позволяющих проникать и персистировать в организме растений. Все это свидетельствует о полигостальности этой группы микроорганизмов, что может способствовать, в свою очередь, возникновению острых кишечных инфекций при употреблении в пищу контаминированных растений в необработанном виде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Маркова Ю.А., Савилов Е.Д. Использование показателей разнообразия возбудителя для оценки состояния эпидемического процесса II Журн. инфекционной патологии. - 1999. -№ 2-3. - С. 10-15.

2. Маркова Ю.А., Галушкина С.Н. Внутригодовая и многолетняя динамика разнообразия популяции возбудителя // Региональная научно-практическая конференция: Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование (Иркутск, 2 ноября 1999 г.): Тез. докл. - Иркутск, 1999. - С. 28.

3. Мамонтова JI.M., Маркова Ю.А., Марков A.B. и др. Разнообразие микробных сообществ водных экосистем // Региональная научно-практическая конференция: Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование (Иркутск, 2 ноября 1999 г.): Тез. докл. -Иркутск, 1999. - С. 32.

4. Маркова Ю.А., Савилов Е.Д. Разнообразие шигелл по продуцированию колицинов в сезонном и межгодовом аспектах // Актуальные проблемы клинической медицины Материалы X научно-практической конференции, посвященной 20-летию Иркутского ГИУВа. - Иркутск, 1999. - Часть 1. - С. 56-60.

5. Мамонтова JI.M., Савилов Е.Д., Протодьяконов А.П., Маркова Ю.А. Инфекционная агрессивность окружающей среды: Концепция микробиологического мониторинга. — Новосибирск: Наука, 2000. - 240 с.

6. Мамонтова JI.M., Кондратьева A.M., Марков A.B.,... Маркова Ю.А. Принципы организации микробиологического мониторинга //Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. - № 4 (18). - С. 50-55.

7. Мамонтова Л.М., Маркова Ю.А., Завезенова Т.В. Микробиологический мониторинг окружающей среды. - Уч.-метод. пособие для студентов ИГУ, 2000. -30 с.

8. Савилов Е.Д., Маркова Ю.А. Изменение уровня разнообразия возбудителя во внутригодовом движении заболеваемости (на примере дизентерии) // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. — 2000. — Вып. 130, № 11. - С. 1093-1094.

9. Маркова Ю.А., Мамонтова JI.M., Савилов Е.Д. Внутрипопуляционное разнообразие шигелл Зонне по маркерам лекарственной устойчивости // Жури. микр. эпидем. и иммун. — 2002. - № 2. - С. 6-9.

10. Мамонтова Л.М., Астафьев В. А., Протодьяконов А.П., Зуенок Н.В., Маркова Ю.А., Колесников В.Н. Антибиотикорезистентные микроорганизмы в водных экосистемах // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов. — М., 2002. - Т. 4. — С. 97.

11. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Игумнова Е.К., Саляев Р.К. Растения как возможные резервуары бактерий, патогенных для животных и человека // Доклады РАН. - 2002. - № 386. - С. 454-^56.

12. Духанина A.B., Маркова Ю.А., Романенко A.C. Патогенные для человека энтеробактерии присутствуют в растительных тканях // Материалы научно-практической конф. «Сиббезопасность-СПАССиб-2003». - 2003. - С. 135-136.

13. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Донская А.Е., Криволапова Н.В., Духанина A.B. Влияние бактерий, патогенных для человека на жизнедеятельность растений // Стрессовые белки растений: Материалы Всероссийской научной конф., 6-10 сентября 2004 г., Иркутск, СИФИБР СО РАН. - Иркутск: Изд-во Института географии СО РАН, 2004. — С. 73.

14. Маркова Ю.А., Романенко A.C. Растения Прибайкалья как возможные резервуары и хозяева бактерий, патогенных для человека и животных // Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами: Тез. Междунар. конф. Улан-Удэ (Россия)-Улан-Батор (Монголия), 1-8 сентября 2004 г. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2004.-Т. 2.-С. 25.

15. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Духанина А.В., Малахаева Н.К. Растения как возможные резервуары и хозяева бактерий, патогенных для человека // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование: матер, научн.-практ. конф. - Иркутск, 2004, - С. 38-39.

1 б. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Духанина А.В. Выделение бактерий семейства Enterobacteriaceae из растительных тканей // Микробиология. — 2005. - Т. 74, № 5. - С. 575-578.

17. Маркова Ю.А., Романенко А.С. Выделение условно-патогенных микроорганизмов из растений II Гигиена и санитария. - 2006. — № 1. — С. 58-60.

18. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Климов В.Т., Чеснокова М.В. Взаимодействие Yersinia pseudotuberculosis с пробирочными растениями картофеля // Журнал стресс-физиологии и биохимии. - 2006. - Т. 2, № 1. - С. 21-27.

19. Маркова Ю.А., Емельянова Н.В., Алексеенко A.JL, Баров ИЛО. Культурные растения как промежуточные хозяева микроорганизмов, патогенных для человека // Материалы докладов региональной научно-практической конференции. Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания, Иркутск, 17-19 октября 2006 г. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006. - С. 111-113.

20. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Емельянова Н.В. и др. Загрязнение овощей и фруктов патогенными и условно-патогенными микроорганизмами // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ. Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья. — Иркутск: Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2007. — С. 139—142.

21. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Емельянова Н.В. и др. Распространение патогенных для человека бактерий по организму растения // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ. Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья. — Иркутск: Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2007. - С. 142-144.

22. Маркова Ю.А., Алексеенко A.JI. Продукты питания растительного происхождения - возможный источник микроорганизмов, патогенных для человека // Материалы Международной научно-практической конференции. — Иркутск: Изд-во СИПЭУ, 2007.

23. Алексеенко A.JL, Маркова Ю.А., Романенко А.С. Колонизация растений картофеля in vitro условно-патогенной Escherichia coli II Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды: матер. Всероссийской научной конференции, 16—19 сентября 2007 г., Иркутск, СИФИБР СО РАН. - Иркутск: РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН, 2007. - С. 18-20.

24. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Духанина А.В. и др. Растения как возможные резервуары микроорганизмов патогенных для человека // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды: матер. Всероссийской научной конференции, 16—19 сентября 2007 г., Иркутск, СИФИБР СО РАН. -Иркутск: РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН, 2007. - С. 168-170.

25. Алексеенко А.Л., МарковаЮ.А., Беловежец Л.А. Колонизация растений картофеля условно-патогенной Escherichia coli// Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания: матер, докладов Всероссийской молодежной НПК. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2007. - С. 46-48.

26. Маркова Ю. А., Романенко A.C., Климов В.Т. и др. Взаимоотношения растений с энтсробактериями, патогенными для человека //Доклады РАН.

- 2006. - Т. 411, № 3. - С. 1-3.

27. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Алексеенко А.Л., Саляев Р.К. Колонизация растений картофеля in vitro условно-патогенной бактерией Escherichia coliApPTzl9 II Доклады РАН. - 2008. - Т. 420, № 2. - С. 279-281.

28. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Табарова О.Н., Духанина A.B. Загрязнение растительных организмов патогенными и условно-патогенными бактериями // Сибирский экологический журнал. —2007.—№ 6. — С. 927—931.

29. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Шафикова Т.Н. Механизмы полигосталь-ности бактерий (обзор) // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2007. -Vol. 3, N 2. — P. 4—9.

30. Маркова Ю.А., Беловежец Л.А., Алексеенко А.Л. Вариабельность ферментативного аппарата энтеробактерий в зависимости от температуры культивирования //Известия Иркутского государственного университета. Серия биология, экология.-2008.-Т. 1,№ 1.-С. 18-21.

31. Маркова Ю.А., Беловежец Л.А., Алексеенко А.Л. Влияние температуры культивирования на метаболизм некоторых энтеробактерий // Актуальные проблемы Права, Экономики и Управления: сб. ст. международной научно-практической конференции. - Иркутск: РИО СИПЭУ, 2008. - С. 272-274.

32. Маркова Ю.А., Беловежец Л. А., Алексеенко А.Л. Изучение особенностей метаболизма некоторых энтеробактерий в зависимости от температуры культивирования // Международная научная конференция: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2-6 июля 2008.-С. 291-293.

33. Баров И.Ю., Беловежец Л.А., Маркова Ю.А. и др. Влияние температуры на биологические свойства энтеробактерий // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН.

- 2008. - № 2 (60). - С. 54-55.

34. Маркова Ю.А., Беловежец Л.А., Баров И.Ю., Савилов Е.Д. Возможности адаптации условно-патогенных энтеробактерий к различным температурам // Журн. микр., эпндем. и иммун. - 2009. — № 2. - С. 15-18.

35. Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Граскова И.А. и др. Растения как возможные резервуары патогенных для человека бактерий // Тезисы докладов V международной школы конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». — М., 2009. — С. 4—5.

36. Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Граскова И.А. и др. Ответные реакции растения при взаимодействии с бактериями, патогенными для человека //

Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды: матер. Всероссийской научной конференции. - Иркутск, СИФИБР СО РАН. — Иркутск: РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН, 2009. - С. 21-24.

37. Омеличкина Ю.В., Шафикова Т.Н., Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Еникеев А.Г. Развитие реакций у растения табака при заражении возбудителем кольцевой гнили // Картофелеводство: сб. науч. тр. / РУП «Науч.-пракг.центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству», редкол.: В.Г. Иванюк (гл. ред) [и др.] - Минск, 2009. - Т. 16. - С. 246-251.

38. Граскова И.А., Живетьев М.А., Кузнецова Е.В., Дударева Л.В., Путили-на Т.Е., Маркова Ю.А., Войников В.К. Растения Прибайкалья: адаптация к низким температурам и антропогенным воздействиям // Экологические проблемы промышленных городов: сб. научных трудов. Часть 2. — Саратов, 2009. — С. 62—65.

39. Омеличкина Ю.В., Шафикова Т.Н., Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А. и др. Ответные реакции растений и культуры клеток табака на заражение Clavibacter michiganensis ssp sepedonicus IIВ мире научных открытий. — 2010. — № 1.

40. Омеличкина Ю.В., Шафикова Т.Н., Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Еникеев А.Г. Развитие реакций у растения табака при заражении возбудителем кольцевой гнили // Картофелеводство: сб. науч. тр. / РУП «Науч.-пракг.центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству», редкол.: В.Г. Иванюк (гл. ред) [и др.] - Минск, 2009. - Т. 16. - С. 246-251

41. Беловежец Л.А., Маркова Ю.А., Анганова Е.В., Духанина А.В., Сави-лов Е.Д. Адаптационные возможности Shigella sonnei и Shigellaflexneri / Вопросы экологической безопасности и охраны окружающей среды: 3-я региональная научно-практическая конференция (Иркутск, 3—5 июня 2010 г.): материалы / ред. кол. О.Ю. Гайкова и др. — Иркутск, 2010. — С. 93-94.

42. Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Граскова И.А. и др. Особенности взаимодействия условно-патогенной Escherichia coli с растениями / Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы конференции / V Всероссийская конференция молодых ученых, Саратов, 28 сентября — 1 октября 2010. — Саратов: Научная книга, 2010. — С. 88.

43. Алексеенко А.Л., Маркова Ю.А., Омеличкина Ю.В. и др. Особенности взаимодействия условно-патогенной Escherichia coli с растениями / Проблемы экологии: чтения памяти М.М. Кожова: тез. докл. междунар. науч. конф. и между-нар. шк. для молодых ученых (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.). - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. — С. 314.

44. Маркова Ю.А., Беловежец Л.А., Анганова Е.В., Духанина А.В., Сави-лов Е.Д. Изменения активности экзоферментов бактерий рода Enterobacter в зависимости от источника выделения и условий культивирования / Проблемы экологии: чтения памяти М.М. Кожова: тез. докл. междунар. науч. конф. и между-

нар. шк. для молодых ученых (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.). - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 353.

45. Беловежец JI.A., Маркова Ю.А., Анганова Е.В., Духанина A.B., Сави-лов Е.Д. Адаптационный потенциал бактерий рода Shigella к разным условиям культивирования // Журнал инфекционной патологии. - 2010. - Т. 17, № 4. -С. 29-30.

46. Крамарский A.B., Анганова Е.В., Духанина A.B., Лещук С.И., Маркова Ю.А. Обработка яблок сорта Фу-ши разными видами дезинфектантов // Особенности формирования здорового образа жизни: факторы и условия: материалы II Международной научно-практической конференции (27 апреля 2012 г). - Улан-Удэ: Изд-во ВСГУТУ, 2012. - С. 95-96.

47. Турская А.Л., Маркова Ю. А., Живетьев М.А. и др. Биологические свойства бактерий, выделенных из растений побережья озера Байкал // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». - 2012. — Т. 5, № 2. - С. 3-8.

48. Маркова Ю.А., Алексеенко А.Л., Крамарский A.B., Савилов Е.Д. Растения как одно из звеньев цепи циркуляции патогенных для человека бакт ерий в окружающей среде (обзор) // Сибирский медицинский журнал. -2012.-№7.

49. Маркова Ю. А., Духанина A.B., Анганова Е.В., Беловежец Л. А., Савилов Е.Д. Контаминация продуктов питания растительного происхождения патогенными и условно-патогенными энтеробактериями // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 5. - С. 268-270.

50. Маркова Ю.А., Турская А.Л. Растения как экологическая ниша патогенных для человека энтеробактерий // Кубанский политематический научный журнал. - 2012. -№ 84. - С. 87-101.

51. Анганова Е.В., Маркова Ю.А., Беловежец Л.А. и др. Определение ферментативной активности условно-патогенных энтеробактерий. Методические рекомендации. — Иркутск, 2013. - 17 с.

52. Маркова Ю.А., Савилов Е.Д., Анганова Е.В., Войников В.К. Природная среда как потенциальное местообитание патогенных и условно-патогенных энтеробактерий. - Иркутск: РИО ИГМАПО, 2013. - 158 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ИСУ - индуцированная системная устойчивость

ИУК - индолил-уксусная кислота

кмц - карбоксиметилцеллюлоза

лпс - липолисахариды

МАМР - микроб-ассоциированные молекулярные паттерны

МПА - мясопептонный агар

ОКИ - острые кишечные инфекции

ОП - оптическая плотность

РАМР - патоген ассоциированные молекулярные паттерны

СПУ - системная приобретенная устойчивость

СЧ - реакция сверхчувствительности

УПЭ - условно-патогенные энтеробактерии

эпс - экзополисахариды

CMS - Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus

ETI - effector - triggered immunity

МАРК (MAP киназы) - Mitogen Activated Protein Kinase

MTI - МАМР-индуцированный иммунитет

PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria

PRR pattern recognition receptors

PTI - pattern-triggered immunity

R-белки - белки резистентности растений

TTSS - система секреции третьего типа

Подписано в печать 10.04.2013. Бумага офсетная. Формат 60х84'/16. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 042-13._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Маркова, Юлия Александровна, Иркутск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции

человека»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования»

На правах рукописи

05201351220

Маркова Юлия Александровна

ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ

03. 02.03 - микробиология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты: д.м.н., проф Е. Д. Савилов

д.б.н., проф. В. К. Войников

Иркутск, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1. Эндофиты 15

1.2. Выделение патогенных для человека бактерий из эндосферы и 19 филлосферы растительных тканей

1.3. Проникновение патогенных и условно-патогенных бактерий в 23 растение

1.4. Ответ растений при взаимодействии с патогенными и 27 непатогенными микроорганизмами

1.4.1. Ответ растений при взаимодействии с фитопатогенами 27

1.4.2. Ответ растений при взаимодействии с непатогенными 42 эндофитами

1.4.3. Ответ растений при взаимодействии с бактериями, 47 патогенными для человека

1.5. Универсальные факторы патогенности бактерий 55

1.6. Случаи заболеваний, вызванные растениями, 58 контаминированными патогенными и условно-патогенными микроорганизмами

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 63

ГЛАВА 3 АДАПТАЦИЯ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ И 81

ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ К УСЛОВИЯМ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, 99

ОБУСЛОВЛИВАЮЩИЕ ИХ СПОСОБНОСТЬ ВЫЖИВАТЬ В ОРГАНИЗМЕ РАСТЕНИЙ

4.1. Влияние условий культивирования на образование биопленок 99 условно-патогенными и патогенными энтеробактериями

4.2. Определение антагонизма менаду патогенными и условно- 110 патогенными для человека энтеробактериями и эндофитом

Bacillus subtilis 26D и фитопатогеном Pectobacterium carotovorum В-1247

4.3. Экзоферменты энтеробактерий, необходимые для выживания в растительных тканях

4.4. Синтез индолилуксусной кислоты условно-патогенными и патогенными энтеробактериями

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ РАЗНЫХ ВИДОВ НА ш РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ

5.1. Влияние Escherichia coli (штамм XL-1 Blue) на всхожесть и ^^ развитие проростков разных видов сельскохозяйственных растений

5.2. Сравнение влияния разных видов энтеробактерий на всхожесть и развитие редиса сорта Жара

5.3. Влияние энтеробактерий на растения картофеля in vitro ^д

5.4. Выживаемость суспензионных культур табака при jg^ кокультивировании с Escherichia coli

5.5. Фитотоксичность супернатанта среды культивирования ^^ энтеробактерий разных видов

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ СКОРОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В РАСТЕНИИ

6.1. Колонизация растений in vitro условно-патогенными ^^ энтеробактериями

6.2. Сохранение заражения условно-патогенными бактериями в растениях при их пассировании

6.3. Сохранение энтеробактериями генов, отвечающих за ^^ вирулентность при пассировании их через растение

ГЛАВА 7. ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЯ ПРИ 167

ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ, ПАТОГЕННЫМИ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

7.1. Определение активных форм кислорода в суспензионной 167 культуре клеток при заражении патогенной для человека

Escherichia coli (штамм XLl-Blue) и фитопатогенной Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (вирулентный штамм CsR14)

7.2. Определение АФК в корнях растений картофеля {Solanum 171 tuberosum) и редиса (Rhaphanus sativus L.) в ответ на внесение Escherichia coli (XLl-Blue)

7.3. Динамика внеклеточных АФК из корней редиса (Rhaphanus 173 sativus L.) сорта Жара при обработке E.coli XLl-Blue и

Pectobacterium carotovorum В-1247

7.4. Динамика пероксидазной активности в растении редиса 177 (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара при инокуляции E.coli (XLl-

Blue)

7.5. Активность пероксидазы в тканях растений картофеля in vitro 181 при инокулировании патогенной для человека Escherichia coli

(штамм XLl-Blue) и фитопатогенной С. michiganensis ssp.

sepedonicus (вирулентный штамм CsR14)

7.6. Развитие СЧ реакции растениями табака (Nicotiana tabacum) in 188

vitro при инокуляции энтеробактериями разных видов

ГЛАВА 8. ВЫДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ш БАКТЕРИЙ ИЗ РИЗО-, ФИЛЛО- И ЭНДОСФЕРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 212

ВЫВОДЫ 240

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 241

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 243

ВВЕДЕНИЕ

Условно-патогенные энтеробактерии в настоящее время приобретают все большее медицинское значение. Такие представители семейства Enterobacteriaceae как Escherichia coli, Serracia marcescens, Enterobacter, Citrobacter, Proteus вызывают до 50% поражений мочевыводящих путей, 35% госпитальных пневмоний, 57% бактериемий, 4% менингитов (Поздеев O.K., Федоров Р.В., 2007).

В связи с высокой экологической пластичностью и широким распространением этой группы микроорганизмов, большое значение имеет выявление их связей с другими живыми организмами, что в конечном итоге будет способствовать определению новых резервуаров их обитания. Это является необходимым этапом в разработке мероприятий по прерыванию путей передачи от источника инфекции до восприимчивого организма.

В настоящее время появились исследования по проблеме так называемых cross-kingdom инфекций. Этиологические агенты этих инфекций способны поражать различные группы хозяев, вплоть до относящихся к разным царствам жизни (растения и животные), так называемое явление полигостальности (Литвин В. Ю. и др., 1997). Самые изученные представители: Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica, E. coli, причем с каждым годом в эту группу попадает все больше видов бактерий и грибов. Появляются данные, свидетельствующие о медицинской значимости фитопатогенов - Agrobacterium tumefaciens, Erwinia sp. и др. Полным ходом идет сравнительное изучение факторов патогенности фитопатогенов и патогенов животных, а также сравнительный анализ иммунного ответа растений и животных. Исследованиями последних лет выявлено значительное сходство в патологическом процессе у тех и других групп живых организмов, что позволило предположить, что основные этапы взаимодействия высших организмов с бактериями развились на ранних стадиях эволюции до разделения на царства жизни.

Установлено, что некоторые виды условно-патогенных бактерий Klebsiella pneumoniae (lniguez A. L. et al., 2004), Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes (Zinniel D. K. et al., 2002), S. marcescens (Gyaneshwar P. et al., 2001), разные виды Pseudomonas (Rahme L. G. et al., 1997) обитают в растительных тканях как эндофиты. Исследованиями последних лет доказано присутствие в растительных тканях и бактерий, патогенных для человека - Listeria monocytogenes (Gorski L. et al., 2003), Campylobacter jejuni (Brandl M. T. et al., 2004), S. enterica (Franz E. et al., 2007), E. coli (Bernstein N. et al., 2007; Wachtel M. R. et al., 2002). Здесь следует отметить, что локализация в глубине растительных тканей - межклетниках, проводящей системе и др. делает эти микроорганизмы недоступными для действия большинства дезинфектантов.

Все это определяет актуальность проблемы изучения сосуществования бактерий семейства Enterobacteriaceae с растениями, как в теоретическом, общебиологическом аспекте для изучения механизмов полигостальности и транспатогенеза, так и в прикладном медицинском для установления резервуара обитания этих микроорганизмов.

Цель работы обосновать механизмы полигостальности условно-патогенных энтеробактерий на основе изучения биологических свойств этих микроорганизмов и особенностей их взаимодействия с растениями.

ЗАДАЧИ:

1. Определить влияние условий культивирования (среда, температура) на кинетику роста патогенных и условно-патогенных энтеробактерий (Sh. sonnei, Sh. ßexneri, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae, P. mirabilis).

5. Определить скорость контаминации растительных тканей энтеробактериями.

6. Изучить развитие ответных реакций растения на заражение энтеробактериями.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Выявлено специфическое взаимодействие между условно-патогенными энтеробактериями и растениями, о чем свидетельствует их различное влияние на рост и развитие растений, зависимое от температуры. Впервые в модельной системе «растение картофеля in vitro - Е. coli», показано, что полная колонизация растительных тканей энтеробактериями происходит на вторые-третьи сутки после инокуляции, при этом растение-хозяин распознает присутствие энтеробактерий в ризо- и эндосфере и отвечает активацией иммунного ответа уже в первые минуты после заражения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Выявлено, что УПЭ, возбудители ОКИ человека, при попадании во внешнюю среду могут использовать растительные ткани как резервуар обитания, способствующий их сохранению вне организма человека.

ВНЕДРЕНИЯ

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Недостаток питательных элементов способствует развитию устойчивости условно-патогенных и патогенных энтеробактерий человека к широкому диапазону температур (от 4 до 37 °С), что, в конечном итоге, обусловливает их выживаемость во внешней среде.

3. В ответ на колонизацию энтеробактериями, условно-патогенными для человека, растение-хозяин отвечает активацией паттерн-индуцированного иммунитета (РТ1) уже в первые минуты после инфицирования. Отсутствие специфических факторов патогенности, аналогичных таковым для фитопатогенов, приводит к тому, что контаминированное растение, как правило, не проявляет симптомов поражения и не способно быстро элиминировать из тканей эти микроорганизмы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были представлены: на Всероссийской научной конференции, "Стрессовые белки растений", Иркутск, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2004; Региональной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания», Иркутск, 2006; семинаре врачей-эпидемиологов «Эпидемиология кишечных инфекций», Иркутск, 2006; Научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья», Иркутск, 2007; Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, СИФИБР, 2007; Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность

продуктов питания», Иркутск, ИрГТУ, 2007; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы Права, Экономики и Управления», СИПЭУ, Иркутск, 2008; 2-м межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями», Иркутск, 2008; II Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, 2008; Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2009; V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2010; Международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти М. М. Кожова», Иркутск, 2010; VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Нижний Новгород, 2011; II Международной научно-практической конференции «Особенности формирования здорового образа жизни: факторы и условия», Улан-Удэ, 2012; научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летнему юбилею ИЭМ ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, Иркутск, 2012.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 52 работы, из них 16 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций и 2 -монографии.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Любой высший организм, в том числе и растение, является хозяином обширного микробного сообщества, выступающего в роли как мутуалистов, так и патогенов (Тец В. В., 2003). В современной литературе все многообразие отношений между микроорганизмом и хозяином объединяют термином симбиоз. Изучение симбиозов, в настоящее время, занимает одно из первых мест в ряду актуальных проблем современной биологии (Бухарин О. В. и др., 2007).

Симбиозы рассматриваются как биологические комплексы, образующиеся в результате функциональной и, иногда, структурной интеграции генных систем неродственных организмов, приводя к реализации новых программ развития и адаптации, недоступных свободноживущим организмам (Проворов Н. А. и др., 2008).

Степень взаимосвязи симбиотических бактерий с хозяином различна. Выявляют факультативную, экологически облигатную или генетически облигатную формы зависимости (Проворов Н. А., Воробьев Н. И., 2012).

Факультативные взаимодействия с растениями или животными не приводят к качественным изменениям адаптивного потенциала микроорганизмов и осуществляются, как правило, посредством тех же генов, что и при свободном существовании. Эти взаимодействия мало специфичны, а кодирующие их гены функционируют и в отсутствие хозяина (Проворов Н. А. и др., 2008). Вероятно, к этому типу можно отнести, так называемых ассоциативных симбионтов, играющих значительную роль в формировании, стабильном существовании и продуктивности симбиоза (Бухарин О. В. и др., 2007). Экологически облигатные взаимодействия (например, бобово-ризобиальный симбиоз) заключаются в бактериальном заселении временных ниш в организме хозяина, позволяющем избежать конкуренции со свободноживущими организмами. При этом используются особые генные системы. И, наконец, при генетически облигатных симбиозах существование микробов вне хозяина (микоплазмы, риккетсии)

невозможно в связи с утратой необходимых для этого генов (Проворов Н. А. и др., 2008).

В зависимости от позиций симбионта по отношению к хозяину выделяют три категории ассоциаций: комменсализм (использование хозяина как источника пищевых ресурсов, без причинения ему вр

Информация о работе

Маркова, Юлия Александровна
доктора биологических наук
Иркутск, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Полигостальность условно-патогенных энтеробактерий на модели их взаимодействия с растениями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы