Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липополисахаридная кандидат-вакцина для профилактики эндотоксического и септического шока

ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Липополисахаридная кандидат-вакцина для профилактики эндотоксического и септического шока"

На правах рукописи

Маркина Анна Александровна

Липополисахаридная кандидат-вакцина для профилактики эндотоксического и септического шока

03.03.03 — иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

6 ФЕВ 2014

Москва - 2013

005544709

005544709

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Научным руководитель: Апарин Пётр Геннадьевич

доктор медицинских наук, зав. лабораторией полисахаридных вакцин ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Официальные оппонепты: Пинегин Борис Владимирович.

доктор медицинских наук, профессор,

зав. отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России:

Винницкий Леонид Ильич,

доктор медицинских наук, профессор.

рук. лаборатории иммунологии и регуляторных

механизмов в хирургии ФГБУ

«Российский научный центр хирургии имени

академика Б.В.Петровского» РАМН.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и

сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится 25 декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институ т иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478. Москва. Каширское шоссе, д.24. корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан « » 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук / Г.О. Гудима

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Септический и эндотоксический шок являются чрезвычайно опасными патологическими состояниями, которые возникают на фоне массивного поступления в организм грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов (лииополисахаридов - ЛПС), вследствие септического (инфекционного) процесса или серьёзных нарушении микроциркуляции, и относятся к числу клинических состояний, в лечении которых не удаётся достичь существенного успеха. В мире ежегодно диагностируется 1,5 млн. случаев сепспса с частотой один случай на каждую сотню госпитализаций (Wheeler А.Р., Bernard G.R., 1999). В России количество септических состояний соответствует частоте проявления сепсиса в ведущих клиниках мира (Рожков A.C. и др., 2005). Несмотря на высокотехнологичные методы лечения, сепсис остаётся патологическим состоянием, ассоциированным с высоким уровнем летальности (до 50%) и занимает первое место по причине смертности пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии не кардиологического профиля (Friedman G. et al., 1998; Linde-Zwirbe W.T. et al., 1999).

Сепсис может развиваться как патологический процесс, сопровождая различные инфекционные заболевания, или проявляться в виде осложнений при травматических повреждениях (ожог, хирургическая операция или открытая рана, множественные травмы механического характера) во время которых эндогенные грамотрицательные бактерии (и их эндотоксины), преодолевая защитные барьеры организма, обуславливают развитие воспалотельного процесса (Hubbard W.J., et al., 2005). В основе сепсиса лежит синдром системного воспалительного ответа, который проявляется в генерализованном воспалении на фоне гиперактивации ЛПС клеток, экспрессирующих цитокины и медиаторы воспаления (Савельев B.C., Гельфанд Б.Р., 2006).

Иммунофармакологические интервенции на фоне эндотоксического и септического шока направлены на блокирование на разных уровнях патогенетических событий, ведущих к лавинообразной секреции провоспалительных цитокинов, и их действия. Селективное блокирование TLR4 рецепторов и нейтрализация эндотоксинов грамотрицательных бактерий (Cross A.S., 2010) или провоспалительных цитокинов с помощью различных агентов, оказываются недостаточно эффективными для снижения смертности среди септических больных (Salkowski С.А. et al., 1998; Remick D.G., Ward P.A., 2005).

Неудачи в области терапии сепсиса привлекли особое внимание к изучению иммунологического статуса пациентов с различными исходами септических состояний. Исследования последних лет показали, что неблагоприятные исходы при септических и эндотоксических состояниях ассоциированы с низким уровнем анти-ЛПС-антител (Bennett-

/

Guerrero E. et al., 1997; Strutz F. et al., 1999). В тоже время была установлено, что высокий анти-эндотоксиновый статус пациентов, характеризующийся повышенными уровнями предсуществующих антител IgG и IgM к олигосахариду кора молекулы ЛПС, несущему слабовариабельные консервативные участки, общие для различных представителей рода Enterobacteriaceae, коррелировал с повышением выживаемости больных с грамотрицательным сепсисом (Gibbs R.J. et al., 2004). Однако подходы к модификации анти-эндотоксинового статуса ограничены необходимостью конструирования ЛПС-иммуногена, безопасного для человека. На сегодняшний день разработан только один вариант противошоковой кандидат-вакцины на основе детоксицированного ЛПС мутантного штамма J5 E.coli 0111:В4 Rc-хемотипа (дЛПС J5), нековалентно присоединённого к белку внешней мембраны Neisseria meningiíides, которая на экспериментальных моделях защищала животных от септических состояний, а при иммунизации добровольцев обеспечивала модификацию анти-эндотоксинового статуса (Cross A. et al., 2004).

В последние годы была сформулирована концепция иммунопрофилактики эндотоксического и септического шока, направленная на разработку противошоковых вакцин, на основе молекул липополисахаридов, применение которой позволит создать устойчивость организма к последующему массивному попаданию грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов в кровоток. Поиск новых возможных кандидатных препаратов для создания противошоковой вакцины и их комплексное исследование является актуальной научной проблемой. В качестве таких кандидатов мы исследовали биополимеры углеводной природы (БУП) энтеробактрий, среди которых были биополимеры клеточной стенки -низкоэндотоксичные и нативные липополисахариды, полученные по методу Westphal, и капсулы - экзополисахарид Shigella sonnei, а также комплексный препарат, состоящий из экзополисахарида и нативного ЛПС S.sormei.

Цель исследования

Проведение комплексных исследований противошокового действия, иммуногенности, безопасности биополимеров углеводной природы энтеробактерий с целью получения образцов кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока.

Задачи исследования

1. Провести комплексное моделирование эндотоксического и септического шока.

2. Исследовать влияние предварительного введения БУП энетробактерий на выживаемость животных и продукцию ФНО-а in vivo на различных моделях эндотоксического шока.

3. Изучить взаимодействие низкоэндотоксичных (НЭТ) и нативных ЛПС энтеробактерий с транспортным липополисахарид-связывающим белком (ЬВР).

4. Исследовать влияние профилактического введения мышам БУП энтеробактерий на развитие септического шока (экспериментального перитонита).

5. Разработать схемы иммунизации для профилактики септического шока препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий.

6. Изучить продукцию анти-ЛПС-антител и возможность модификации анти-эндотоксинового статуса при разных схемах иммунизации низкоэндотоксичными ЛПС энтеробактерий.

7. Оценить безопасность НЭТ-ЛПС энтеробактерий в клинических исследованиях.

Научная новизна

Существенно расширены представления о возможностях иммунопрофилактики опасных патологических состояний - эндотоксического и септического шока. Доказана роль механизма понижающей регуляции продукции ФНО-а, инициированного предварительным введением мышам низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, в существенном увеличении выживаемости животных при индукции эндотоксического шока. Разработаны схемы вакцинации препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, индуцирующие адаптивный иммунный ответ к полиинфекции, вызывающей септический шок, с выработкой перекрёстно-реагирующих антител к олигосахариду кора молекулы ЛПС. Изучена связь между выработкой перекрёстно-реагирующих антител, специфичных к олигосахариду кора молекулы ЛПС и модуляцией септического шока (задержка развития экспериментального перитонита и продление времени жизни животных на фоне сепсиса) при профилактической иммунизации мышей низкоэндотоксичными ЛПС энтеробактерий. Подтверждена важность долговременного анти-эндотоксинового иммунного ответа в качестве одного из основных защитных механизмов при септическом шоке. Впервые получены оригинальные образцы липополисахаридной кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока, в качестве активного компонента которой предложены низкоэндотоксичные ЛПС энтеробактерий, активирующие механизмы неспецифической и специфической устойчивости к шоковым состояниям, безопасные для парентерального введения человеку.

Научно-практическая значимость

Полученные в ходе выполнения диссертационной работы результаты представляют собой основу для проведения клинических исследований противошокового действия вакцинного препарата, основной субстанцией которого являются низкоэндотоксичные ЛПС энтеробактерий, направленного па профилактику эндотоксического и септического шока.

Внедрение противошокового препарата в практику здравоохранения имеет целью создание новой медико-социальной технологии — иммунопрофилактики шока, которая может внести дополнительный вклад в обеспечение выживаемости больных с самой различной патологией, в том числе пациентов с синдромом ишемии-реперфузии. Противошоковая вакцина, стимулирующая выработку антител к олигосахариду кора молекулы ЛПС, может лечь в основу программы профилактики шоковых состояний у лиц, подвергающихся воздействию различных травматизирующих факторов, находящихся в «шоковой» группе риска (военные, пожарные, сотрудники МВД и МЧС).

Апробация диссертации

Основные результаты диссертационной работы доложены на 2-ом Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (2007 г., Москва), 11-ой Ежегодной конференции «Vaccine Research» (2008 г., Балтимор, США), X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (2009 г., Казань), 5-й Балтийской конференции по микробным углеводам (2012 г., Суздаль).

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 14 печатных работах, включающие 4 статьи в 3 научных журналах, которые входят в перечень научных периодических изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, и 10 публикаций в материалах российских и международных научных конгрессов.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка использованной литературы. Работа содержит 17 рисунков и 20 таблиц. Библиографический указатель содержит 202 литературных источника, из которых 12 отечественных и 190 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все эксперименты проводили на гибридных мышах первого поколения (CBAxC57Bl/6)Fl массой 20-22 г (филиал «Андреевка» НЦБМТ РАМН, Россия).

Объектами исследования были биополимеры углеводной природы энтеробактерий: нативные апирогенные низко- (НМ-ЛПС) и высокомолекулярные (ВМ-ЛПС) фракции низкоэндотоксичных ЛПС (НЭТ-ЛПС) из S.sonnei и E.coli 0:55, а также комбинированные

препараты (HM + ВМ) ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55, содержащие обе фракции в соотношении по массе 1:1; 13 и 16 серии дизентерийной кандидат-вакцины против шигелл Флекснера «Флексвак», полученные на основе НЭТ-ЛПС S.ßexneri 2а; апирогенные низкоэндотоксичные О-гликолипид или экзополисахарид (ЭПС) S.sonnei и комплексный препарат (ЭПС + wJinC) S.sonnei; нативные пирогенные лшюполисахариды S.sonnei и E.coli 0:55, полученные по методу Westphal (wJinC). Образцы препаратов БУП энтеробактерий были получены к.х.н. B.JI. Львовым в лаборатории препаративной биохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Изучение противошокового действия БУП энтеробактерий на различных моделях эндотокснческого шока

Влияние предварительного введения комплексного препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei в дозах 0,1, 1, 10 и 25 мкг/мышь на развитие эндотокснческого шока изучали на D-галакгозаминовой (D-GalN) модели. Через 12 часов после внутрибрюшинного (в/б) введения препарата животным вводили 0,1 мкг wJlIIC E.coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) совместно с 15 мг D-GalN (Alfa Aesar, Германия) в 0,5 мл физ.раствора. Контрольной группе мышей вместо препарата вводили 0,5 мл физ.раствора.

Профилактику развития эндотокснческого шока также осуществляли при прямом (без сенсибилизатора) в/б введении мышам 3 мг (ЛДюо) wJHlC E.coli 0:55 или 2мг (4ЛДюо) wjmc E.coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) через 72 часа после в/б введения комплексного препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei в дозах 50, 100, 200 и 400 мкг/мышь, низкоэндотоксичных НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС и (НМ + ВМ) ЛПС S.sonnei, луЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 в дозах 50, 100 или 200 мкг/мышь.

Содержание ФНО-а в сыворотках крови, взятой у мышей, которым были предварительно в/б введены исследуемые препаратами и у интактных мышей определяли с помощью тест системы Quantikine Mouse TNFa/ TNFSF1A (R&D Systems, США) методом иммуноферментного анализа (ИФА) согласно стандартной методике производителя. Кровь брали через 90 минут после индукции эндотокснческого шока (Dinarello С.А., 1999). Результаты выражали в пг/мл.

Исследование иммунопрофилактики септического шока на модели экспериментального перитонита (CLP-модель)

Моделирование экспериментального перитонита проводили на мышах с использованием CLP-модели (метод прокола и перевязки слепой кишки). Мышей оперировали под общей анестезией, вскрывали брюшину, извлекали слепую кишку и аппендикс. Слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и

прокалывали её насквозь 1 пли 2 раза иглой диаметром 22G. Содержимое слепой кишки выдавливали через образовавшиеся отверстия для обсеменения бактериями кишечника перитонеальной полости, затем возвращали органы обратно в брюшину и зашивали брюшную полость. Для изучения способности модулировать развитие/ течение септического шока исследуемы препараты вводили мышам в/б согласно разработанным схемам в разные сроки до проведения CLP-операции. Контрольную группу во всех экспериментах составляли интактные прооперированные животные.

Оценка связывания ЛПС энтеробактерий с липополпсахарид-евязывагощим белком LBP

Сыворотку крови мышей истощали препаратами wJTTTC и НЭТ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 по следующей методике: к 100 мкл цельной сыворотки крови мышей добавляли 100 мкл раствора исследуемого препарата (10мг/ мл физ.раствора), к контрольной пробе - 100 мкл физ.раствора. Затем пробы инкубировали 1 час при 37°С, центрифугировали 5 минут при 10 000 об/мин. Надосадочную жидкость на наличие несвязанного с липополисахаридом LBP исследовали с помощью метода ИФА по стандартной методике, предложенной в наборе Mouse LBP ELISA kit (Hycult biotechnology, Cellsciences, США). Процент связавшегося LBP определяли по формуле:

. / [LBPlnooie инкубации с препаратами \

1-ВРсвяззвшийся% =1 1-—------ ]хЮ0%

\ [LBFjnocne инкубации с физ.раствором/

Изучение пммупогенности БУП энтеробактерий на мышах (CBAxC57Bl/6)Fl

Для индукции адаптивного иммунного ответа мышей иммунизировали в/б дважды с интервалом в 30 дней препаратами НЭТ НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС и (НМ + ВМ) ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 в дозах 10 или 50 мкг/мышь. Забор крови для определения сывороточного уровня анти-ЛПС-антител с помощью ИФА проводили через 15 или 30 суток после повторного введения препаратов. В качестве контроля использовали сыворотки, полученные от интактных мышей того же возраста и привоза.

При постановке ИФА по стандартной методике в качестве антигенов использовали \уЛПС S.sonnei и коммерческие стандартные эндотоксины различного строения и серологической специфичности wTOC E.coli 0:55, Rc-ЛПС E.coli J5, Ra-ЛПС E.coli ЕН100, Ra-ЛПС Salmonella typhimurium TV119 (всё - Sigma-Aldrich, США). Оптическую плотность измеряли при двух длинах волн: 490 и 630 нм на фотометре iMark (Biorad, США). Результаты были обработаны с помощью программы «Excel» и представлены в виде средних значений ELISA-титров. Различия титров антител между иммунными и контрольными сыворотками

оценивали с помощью ^критерия Стьюдента, а достоверность различия - согласно критерию Фишера для двух независимых выборок.

Изучение безопасности дизентерийной вакцины «Флексвак» в клинических исследованиях

Клинические исследования безопасности дизентерийной вакцины «Флексвак» проводились квалифицированным медперсоналом в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Центральная медико-санитарная часть №8 Федерального медико-биологического агентства» под руководством главного исследователя И.Н. Хржановской на основании разрешения на проведение клинических исследований I фазы № 432 от 14 октября 2009 г., выданного Росздравнадзором Минздравсоцразвития России, по протоколу №ФВ-1До: «Изучение реактогенности и антигенной активности дизентерийной вакцины против шигелл Флекснера "ФЛЕКСВАК"».

Варианты вакцины «Флексвак», основной субстанцией которых являются 13 и 16 серии НЭТ-ЛПС Х/кхиеп 2а, вводились взрослым добровольцам подкожно в наружную поверхность верхней трети плеча с помощью шприцев одноразового использования в объеме

0.5 мл в дозах 25 или 50 мкг (0,3 и 0,6 мкг/кг) квалифицированным медперсоналом в ФГУЗ «Центральная медико-санитарная часть №8 ФМБА». После иммунизации добровольцы находились под наблюдением врачей в стационаре ФГУЗ «Центральная медико-санитарная часть №8 ФМБА» на протяжении 5 дней. В первые сутки наблюдения они проходили медицинское обследование через 2, 4, 6 и 24 часа после введения препаратов для выявления нежелательных явлений, которые могут представлять собой любой неблагоприятный симптом, жалобу или заболевание, время возникновения которого не исключает причинно-следственной связи с применением вакцинного препарата «Флексвак». Кровь для изучения продукции провоспалительных цитокинов врачи забирали у добровольцев из вены до (0 часов) и через 2, 4 и 6 часов после введения исследуемых препаратов и передавали образцы сывороток в лабораторию полисахаридных вакцин ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Содержание ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-6 в сыворотках крови добровольцев определяли с помощью тест-систем фирмы Вю.чоигсс (США) методом ИФА согласно стандартной методике производителя. Результаты выражали в пг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Экспериментальное моделирование эндотоксического и септического шока

Сложности в создании иммунотропных противошоковых препаратов диктуют необходимость тщательного подбора экспериментальных моделей для их изучения

(Remick D.G., Ward P.A., 2005). В работе были проведены эксперименты по комплексному' моделированию шоковых состояний с целью воспроизведения различных патогенетических вариантов клинического течения как эндотоксического, так и септического шока.

Эндотоксический шок, обусловленный попаданием в организм чистого ЛПС, возможно моделировать на мышах с использованием D-GalN, который применяют для создания состояния гиперчувствительности к ЛПС и/или провоспалительному цитокину ФНО-а (Lehmann B.V. et al., 1987). Введение в/б сверхмалых доз (10 или 100 нг/мышь) wJinC E.coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) мышам (CBAxC57Bl/6)Fl не оказывает летального эффекта. При одновременном в/б введении \уЛПС E.coli 0:55 в тех же дозах и 15 мг/мьппь D-GalN все мыши погибали. Для дальнейших исследований было решено использовать vvJIIIC E.coli 0:55 в дозе 100 нг/мышь. Учитывая, что при совместном действии D-GalN и ЛПС животные погибают от опосредованного ФНО-а апоптоза гепатоцитов без изменения самих механизмов эндотоксикоза (Mignon A. et al., 1999), D-GalN-модель позволяет оценить эффективность защиты организма при профилактическом введении исследуемых препаратов от летального действия ФНО-а.

Прямая модель эндотоксического шока воспроизводит такой его важный аспект как поступление значительных количеств бактериального эндотоксина в организм больного. При введении массивной летальной дозы ууЛПС E.coli 0:55 (3 мг на мышь или 150 мг/кг) через 90 минут концентрация ФНО-а в крови животных достигала 1000 пг/мл и выше, что позволяет использовать данную модель для оценки профилактического подавляющего действия исследуемых препаратов на продукцию ФНО-а при эндотоксическом шоке.

Патогенетические механизмы септического шока имеют ряд важных особенностей по сравнению с эндотоксическим. Экспериментальный перитонит, индуцированный методом перевязки и прокола слепой кишки (CLP-модель), наиболее точно воспроизводит патофизиологические осложнения, которые имеют место при клиническом течении септического шока: полимикробный характер обсеменения и нарастание бактериальной массы в перитонеальной полости, сопровождающиеся образованием некротических тканей (Hubbard W.J. et al., 2005).

При проведении операции по индукции экспериментального перитонита у мышей (CBAxC57Bl/6)Fl слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и надрезали глазными ножницами или прокалывали её насквозь (1 или 2 раза) иглой диаметром 22G (Yan J.J. et al., 2004). При надрезе слепой кишки наблюдалось самое обильное бактериальное обсеменение перитониальной полости в рамках данного эксперимента, которое характеризовалось наименее продолжительным временем жизни как первой, так и последней особи в группе. Максимально время жизни первой и последней

особи было продлено в группе мышей с одиночным проколом слепой кишки (Рис. 1). Динамика выживаемости мышей при моделировании экспериментального перитонита позволяет оценить влияние предварительного введения исследуемых препаратов на его развитие.

1---

—♦ -1 прокол иглой диаметром 22Э

—■— 2 прокола иглой диаметром 22С

- * - 1 надрез ножницами

Рис. 1. Разработка CLP-модели: влияние варьирования уровня бактериального обсеменения перитониальной полости на динамику выживаемости мышей (CBAxC57Bl/6)Fl.

Таким образом, изменяя число и размер проколов слепой кишки, нам удалось добиться варьирования уровня бактериального обсеменения перитонеальной полости и тяжести протекания экспериментального перитонита.

2. Установление возможности профилактики эндотоксического и септического шока при предварительном введении мышам (CBAxC57Bl/6)Fl БУП S.sonnei

Первая серия экспериментов была посвящена изучению противошокового действия апирогенного комплексного препарата, состоящего из нового природного варианта цви-ггерионного полисахарида, полученного из энтеробактерии S.sonnei - экзополисахарида, с небольшим добавлением эндотоксичного wJlilC S.sonnei. В состав ЭПС S.sonnei входит липидный компонент, представляющий собой диацилглицерофосфат, а полисахаридный домен идентичен с О-специфической полисахаридной цепью молекулы wJHIC S.sonnei.

При профилактическом в/б введении комплексный препарат (ЭПС + wJinC) S.sonnei обеспечивал 100 % выживаемость мышей во всех дозах (0,1, 1, 10 или 25 мкг/мышь) на D-GalN-модели эндотоксического шока, а на прямой модели - повышал выживаемость мышей в прямой зависимости от дозы введения. (Табл. 1). Предварительное в/б введение препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei в дозах 100, 200 и 400 мкг/мышь при индукции эндотоксического шока введением 3 мг/мышь (ЛДюо) vWHIC E.coli 0:55 способствовало снижению продукции

11

ФНО-а in vivo до уровня ниже 500 пг/мл, в то время, как концентрация ФНО-а в сыворотках крови мышей из контрольной группы была выше 1000 пг/мл (Табл.1). Учитывая, что выживаемость мышей ассоциирована с понижающей регуляцией продукции ФНО-а, можно сделать вывод о том, что противошоковое защитное действие препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei связано с индукцией ранней эндотоксической толерантности (Shade F.U. et al., 1999).

Табл. 1. Влияние предварительного в/б введения препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei на выживаемость мышей (CBAxC57Bl/6)Fl и продукцию ФНО-а при в/б инъекции ДДюо wJttlC E.coli 0:55.

Доза препарата Кол-во Гибель мышей (часы) % ФНО-а

(мкг/мышь) мышей 0-24 24-48 48-72 выживаемости (пг/мл)

400 10 0 0 0 100 323

200 10 1 0 0 90 413

100 10 2 2 0 60 495

0 (Контроль) 10 8 2 0 0 1020

В следующей серии экспериментов было установлено, что при профилактическом в/б введении мышам препаратов БУП из энтеробактерии в дозе 400 мкг/мышь за 7 дней

до проведения СЬР-операции, комплексный препарат (ЭПС + \уЛПС) и ЭПС Х^оиле;', также как и луЛПС ¿'.яоипе; обеспечивали задержку развития экспериментального перитонита и продлевали время жизни мышей на фоне сепсиса (Рис. 2). Следует отметить, что в течение первых 60 часов после индукции перитонита, не погибла ни одна из мышей, получивших в/б инъекцию препаратов БУП ¿'.«отиег.

*-*-X-*-А

-i-*--*--*

—♦— контроль —•— ЭПС S.sonnei - * -(ЭПС + wjmc) S.sonnei —w— wJinC S.sonnei

0 12 24 36 48 60 72 M 9S 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 часы

Рис. 2. Влияние предварительного в/б введения БУП из бактерии S.sonnei на динамику выживаемости мышей (CBAxC57Bl/6)Fl при индукции экспериментального перитонита.

Наблюдались существенные отличия морфологии абдоминальной полости у мышей, которым был предварительно введён в/б препарат (ЭПС + ууЛПС) Хдалие/, и интактных мышей при вскрытии после индукции экспериментального перитонита. Явные признаки разлитого перитонита были отмечены у контрольных мышей уже через 48 часов после СЬР-операции, тогда как у мышей при введении комплексного препарата, слепая кишка сохраняла целостность без явных признаков некроза через 96 ч. после СЬР-операции (Рис. 3), что свидетельствует о замедлении развития экспериментального перитонита.

А. Б. В.

Рис. 3. Изменение морфологии абдоминальной полости у мышей при экспериментальном перитоните. А. Морфология абдоминальной полости перед CLP-операцией. Б. Профилактическое введение препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei оказывает тормозящее действие на развитие экспериментального перитонита (96 ч. после CLP-операции). В. Разлитой перитонит (48 ч. после CLP-операции, контрольная группа).

Установленное в эксперименте на CLP-модели влияние предварительного (за 7 суток) введения комплексного препарата (ЭПС + wJmC) S.sonnei на динамику выживаемости мышей (замедление развития экспериментального перитонита и продление времени жизни животных на фоне сепсиса) открывает принципиальную возможность профилактики септического шока. Нам также удалось в результате предварительного (за 72 часа) в/б введения комплексного препарата (ЭПС + wJinC) S.sonnei существенно снизить летальность мышей и продукцию ФНО-а при эндотоксическом шоке, вызванным введением wJinC E.coli 0:55 в дозе 150 мг/кг. Противошоковый эффект был достигнут в прямой зависимости от дозы введения препарата.

3. Разработка кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического шока

Липополисахариды, продуцируемые даже одной бактериальной клеткой, обладают существенной гетерогенностью строения, и как следствие - разной биологической активностью (Alexander С., Rietschel Е.Т., 2001). Было показано, что только ЛПС, содержащие гексаацилированный липид А, являются лигандами (агонистами) для TLR4-рецепторов. Низкоэндотоксичные природные ЛПС, содержащие пента- и

тетраацилированные липиды А, продуцируемые нетоксичными штаммами R.capsulatus и P.gingivalis, соответственно, действуют как антагонисты по отношению к TLR4, но при этом сохраняют иммуногенный потенциал (Hajjar A.M. et al., 2002). Принимая во внимание, что структура липида А определяет биологическую активность ЛПС и наиболее часто определяемыми этиологическими агентами при эндотоксическом и септическом шоке являются бактерии (и их эндотоксины) семейства Enterobacteriaceae, нами проводились исследования по изучению противошокового действия оригинального класса биомолекул -низкоэндотоксичных липополисахаридов, полученных из эндотоксичных штаммов S.sonnei и E.coli 0:55, являющихся структурными аналогами нативных ЛПС с преобладанием триавдшьных производных липида А (Рис. 4). По характеристикам токсичности и пирогенности НЭТ-ЛПС энтеробактерий были сравнимы с линейными полисахаридами, используемыми в полисахаридных вакцинах.

Для дальнейших исследований были отобраны пулы низкоэндотоксичных биомолекул из S.sonnei и E.coli 0:55: низкомолекулярные липополисахариды (НМ-ЛПС), содержащие короткую О-полисахаридную цепь (менее 6 повторяющихся звеньев), высокомолекулярные липополисахариды (ВМ-ЛПС), содержащие достаточно длинную О-полисахаридную цепь (6-30 повторяющихся звеньев) (Рис 4), а также комбинированный препарат (НМ + ВМ) ЛПС, содержащий обе фракции в эквивалентном по массе соотношении 1:1.

— Повторяющееся олигосахарщщое звено E.coli 0:55 Р — Фосфат

|СЧ'>|л — Повторяющееся олигосахарщщое звено &ятп£1 — Высшие жирные кислоты

НМ-ЛПС, и - 0-5 ВМ-ЛПС, п - 6-30

Рис. 4. Структура основных пулов биомолекул низкоэндотоксичных ЛПС Е.соИ 0:55 (А) и S.sonnei (Б).

НЭТ-ЛПС из S.sonnei оказались чрезвычайно мощными профилактическими препаратами при в/б введении мышам (CBAxC57Bl/6)Fl в дозах 50, 100 и 200 мкг/мышь за 72 часа до индукции эидотоксического шока путём в/б инъекции 2 мг/мышь (4ЛДЮ0) \¥ЛПС E.coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США). Низкозндотоксичные апирогенные НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС и (HM + ВМ) ЛПС S.sonnei были сравнимы по превентивному противошоковому действию с нативными пирогенными эндотоксинами S.sonnei и E.coli 0:55, полученными по методу Westphal, и более эффективно защищали мышей от гибели по сравнению с комплексным препаратом (ЭПС + wJmC) S.sonnei (Рис. 5).

\кЛПС S.sonnei игЛПС E.coli 0:55 НМ-ЛПС ВМ-ЛПС (НМ+ВМ1ЛПС (ЭПС + ^ЛПС) Контроль

(Sigma-Aldrich, США) S.sonnei S.sonnei S.sonnei S.sormei

Рис. 5. Влияние предварительного в/б введения различных структурных вариантов НЭТ-ЛПС S.sonnei на развитие эидотоксического шока и выживаемость мышей (CBAxC57Bl/6)Fl при в/б инъекции 4ЛДюо\уЛПС E.coli 0:55.

При профилактическом в/б введении препаратов низкоэндотоксичных НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС и (НМ + ВМ) ЛПС из S.sonnei в дозе 100 мкг/мыпгь повышенная выживаемость животных была ассоциирована с понижением продукции ФНО-а в ответ на в/б инъекцию 4ЛДюо \уЛПС E.coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США). В рамках этого эксперимента широко известный кандидатный противошоковый препарат - монофосфорил липид А (MPL) при предварительном введении в дозе 100 мкг/мышь не обладал противошоковым действием -уровень концентрации ФНО-а не снижался и был сопоставим с таковым в контрольной группе (Табл. 2). Полученные данные позволяют говорить о том, что, несмотря на введение

сверхвысокой дозы эндотоксина Е.соИ 0:55, препараты НЭТ-ЛПС 5\sonnei обладают полноценным толерогенным действием, тогда как МР1, его утрачивает.

Табл. 2.. Концентрация ФНО-а в сыворотке крови мышей (СВА*С57В1/6)Р1 через 90 минут после индукции эндотоксического шока инъекцией 4ЛДюо wЛПC Е.соН 0:55.

Препарат (доза введения - 100 мкг/мышь) ФНО-а (пг/мл)

шЛПС Е.соН 0:55 фата-АШсИ, США) 239,7

\уЛПС Хдалпе/ 259,4

НЭТ НМ-ЛПС Я-Юппе! 288,8

ПЭТ ВМ-ЛПС S.sonnei 324,2

ПЭТ (ИМ + ВМ) ЛПС Хлояие/ 295,0

(ЭПС + №ЛПС) 5иоппв1 502,0

МРЬ (,Чщта-Л1с1пс11, США) 523,6

Контроль 492,0

Ранняя эндотоксическая толерантность развивается на фоне мощного снижения продукции ФНО-а и других провоспалительных цитокинов в ответ на введение ЛПС и может быть обусловлена снижением количества молекул NFkB, доступных для активации (Cavaillon J-M., Adib-Conquy М., 2006). Было установлено, что в низких концентрациях ЛПС, связываясь с ТЫМ-рецепторами, активирует транскрипционный фактор IRF-3 по MyD88-независимому сигнальному пути (Jiang Z., et al., 2005). IRF-3 отвечает за продукцию ИФН-В, который активирует ключевой внутриклеточный медиатор эндотоксической толерантности -белок SOCS-1, препятствующий дезагрегации NFkB от ингибиторного белка 1кВ, и, как следствие, продукции провоспалительных цитокинов. При отсутствии SOCS-1 у мышей эндотоксическая толерантность не развивается (Nakagawa R. et al., 2002).

Отдельной задачей наших исследований являлось изучение транспортных характеристик противошоковых препаратов, основанное на оценке их взаимодействия с транспортным ЛПС-связывающим белком LBP. Различия в способности связываться с LBP между низкоэндотоксичными НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС из эндотоксичных бактерий S.sonnei и Е.соН и классическими ЛПС из тех же штаммов, полученными по методу Westphal, были особенно значимы для препаратов НЭТ-ЛПС из Е.соН 0:55 (Табл. 3).

Табл. 3. Эффективность связывания НЭТ-ЛПС и ЛПС, полученных по методу Westphal, из S.sonnei и Е.соН 0:55 с транспортным ЛПС-связывающим белком LBP.

Препарат Концентрация LBP в сыворотке после Связавшийся

(10 мг/мл) инкубации с препаратами (мкг/мл) LBP (%)

НЭТ НМ-ЛПС S.sonnei 2,33 50,9

НЭТ ВМ-ЛПС S.sonnei 2,33 50,9

\уЛПС S.sonnei 3,07 35,3

НЭ Г НМ-ЛПС Е.соН 0:55 1.37 71,15 А

НЭТ ВМ-ЛГ1С Е.соН 0:55 1,6 .66,3

иЛПС Е.соН 0:55 3,35 29,4

Контроль (0 мкг/ мл) 4,75 0

Эффективность взаимодействия ЛПС с Т1Л4-рецепторами коррелирует с его способностью связываться с LBP (Dixon D.R., Darveau R.P., 2005). Учитывая высокое сродство к LBP НЭТ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55, структурно являющихся антагонистами TLR4-peiienTopoB, можно предположить, что они будут конкурентно связываться с последними и, тем самым ингибировать провоспалительную активность эндотоксинов патогенов, что создаёт предпосылки для применения НЭТ-ЛПС энтеробактерий в качестве терапевтического препарата на фоне эндотоксикозов различного генеза.

Полученные в результате исследования противошоковых свойств НЭТ-ЛПС энтеробактерий данные (профилактика развития эндотоксического шока, снижение продукции ФНО-а, эффективное связывание с LBP) позволяют рассматривать НЭТ-ЛПС S.sonnei в качестве активных компонентов толерогенной кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического шока, эндотоксикозов различной этиологии и состояний, связанных с синдромом ишемии-реперфузии.

4. Клинические исследовании безопасности НЭТ-ЛПС эптеробактерий

В рамках клшгаческих испытаний кандидатной дизенетрийной вакцины против шигелл Флекснера «Флексвак» была исследована безопасность активных компонентов данной вакцины - 13 и 16 серии НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а. Метод получения, структура, физико-химические и иммунохимические характеристики, показатели чистоты и пирогеиности для препаратов НЭТ-ЛПС, полученных из энтеробактерии S.flexneri 2а, являются близкими к аналогичным параметрам для препаратов НЭТ-ЛПС полученных из

5.sonnei и E.coli 0:55.

При подкожной иммунизации добровольцев сериями НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а, системные эндотоксичные побочные реакции, такие как озноб, учащение пульса, падение систолического артериального давления, диарея, головная боль не были зарегистрированы. Отдельно следует отметить отсутствие температурных реакций при введении препаратов НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а, что является прямым подтверждением их низкой эндотоксичности и апирогенности для человека. У двух из 25 добровольцев была зарегистрирована незначительная гиперемия в месте введения НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а в течение 2-х часов после инъекции. Такие проявления местных эндотоксичных побочных реакций как болезненность, покраснение, образование инфильтратов не было выявлено за весь период наблюдения ни у одного из добровольцев.

При изучении уровня провоспалительных цитокинов в крови добровольцев было показано, что концентрации ФНО-а, ИЛ-ip и ИЛ-6, определяемые в сыворотках после введения вакцинных препаратов «Флексвак», на основе 13 и 16 серий НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а,

были низкими и достоверно не отличались от значений, зарегистрированных в сыворотках, взятых у добровольцев до введения препаратов (Табл. 4).

Табл. 4. Уровни провоспалительных цитокинов в сыворотках крови добровольцев до и после иммунизации сериями препарата «Флексвак», полученных на основе НЭТ-ЛПС Я./1ехпег12а.

Параметры Среднее значение (пг/мл) ± среднее отклонение

Серия препарата «Флексвак»/ доза введения 13 серия/ 50 мкг 13 серия/ 25 мкг 16 серия/ 50 мкг

ФНО-с«

0ч 11,23 ±2,2 12,75 ± 1,43 12,86 ± 1,6

2ч 17,95 ±4,34 17,74 ±2,25 17,45 ± 1,73

4ч 13,54 ±4,18 13,52 11,76 ±2,35

6ч 11,76 19,89 ± 1,69 13,08

11Л-1»

0ч 0,005 ± 0,009 0 0,05

2ч 0 0 0,02

4ч 1,49 ±0.51 0 0,3

6ч 0 0 0,05

И. 1-6

0ч 1,26 ±0,91 1,18 ±0,63 0,25 ±0,18

2ч 1,96 ±1,53 0,74 ± 0,49 2,86 ±1,8

4ч 6,06 ±2,1 1,78 ±0,74 2,26 ± 0,93

6ч 2,59 2,83 ± 1,32 1,32

Клинические испытания выявили принципиальную возможность безопасного парентерального введения человеку препаратов НЭТ-ЛПС из S.flexneri 2а в дозах до 50 мкг (0,7 мкг/кг). Можно ожидать, что структурные аналоги НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а, такие как НЭТ-ЛПС из S.sormei и E.coli 0:55, также будут безопасны при парентеральном введении человеку в рамках клинических исследований.

5. Индукция ЛПС-сиецифических антител и модификация анти-эндотоксинового статуса при иммунизации мышей (CBAxC57Bl/6)Fl НЭТ-ЛПС энтеробактерий

Анти-эндотоксиновый статус пациента является одним из немногих факторов, оказывающих влияние на исход шоковых состояний в клинике. Высокие уровни натуральных антител у пациентов к доменам молекулы ЛПС, в первую очередь к олигосахариду кора, ассоциированы с благоприятными исходами и отсутствием осложнений при септическом и эндотоксическом шоке (Gibbs R.J. et al., 2004). Поэтому повышение анти-эндотоксинового статуса и индукция адаптивного иммунного ответа к ЛПС при иммунизации может рассматриваться в качестве стратегического подхода к иммунопрофилактике шоковых состояний (Cross А., 2010).

Индукция адаптивного противошокового иммунного ответа у экспериментальных животных представляет собой нетривиальную и сложную методически задачу, реализация которой связана с разработкой оптимальных схем иммунизации. С другой стороны для

селективного определения пулов антител, специфичных к разным доменам молекулы ЛПС, потребовалось сформировать панель антигенов, выявляющих перекрёстно-реагирующие антитела к олигосахариду кора молекулы ЛПС, в которую вошли ЛПС E.coli и S.typhimurium Ra- и Rc-хемотипов (Рис. 6).

Рис.6. Схема строения липополисахаридов различных хемотипов.

Мышей (CBAxC57Bl/6)Fl иммунизировали в/б низкоэндотоксичным ВМ-ЛПС S.sonnei в дозах 10 или 50 мкг/мышь один, два (с интервалом в 30 дней) или три раза (с интервалом в 30 и 21 день). Забор крови в каждой группе осуществляли через 15 суток после последней иммунизации. По данным ИФА двукратная схема иммунизации была признана оптимальной для индукции О-полисахарид-специфичного иммунного ответа и выработки перекрёстно-реагирующих IgG-антител к ЛПС E.coli 0:55, Ra-ЛПС E.coli ЕН100, Rc-ЛПС E.coli J5. Ra- и Rc-хемотипы ЛПС, не имеют О-полисахаридного домена (Рис.6), что позволяет утверждать о продукции антител именно к олигосахариду кора молекулы ЛПС.

Для модификации анти-эндотоксинового статуса мышам двукратно в/б вводили препараты низкоэндотоксичных НМ-ЛПС, ВМ-ЛПС и (HM + ВМ) ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 в дозах 10 или 50 мкг/мышь с интервалом в 30 дней. Забор крови осуществляли через 15 или 30 дней после вторичной иммунизации. В результате ИФА были выявлены антитела IgG и IgM, специфичные к О-полисахаридным доменам '«'ЛПС гомологичных штаммов, и перекрёстно-реагирующие, специфичные к олигосахариду кора молекул Ra-ЛПС E.coli EH 100 и S.typhimurium TV119, Rc-ЛПС E.coli J5 (Табл. 5).

В результате проведённых экспериментов установлено, что выработка О-полисахарид- и кор-специфических антител IgG-изотипа сохраняется до 45-60 дней после первичной иммунизации, и до 15-30 дней, после повторного введения препаратов НЭТ-ЛПС энтеробактерий. Такой иммунный ответ можно считать долговременным. Факт наличия

длительно переистирующих ^О-аптител может выступать свидетельством в пользу возможности формирования иммунологической памяти при таких схемах иммунизации.

Табл.5. Коррекция анти-эндотоксинового статуса в эксперименте при иммунизации мышей (CBAxC57Bl/6)Fl препаратами НЭТ-ЛПС энтеробактерий.

Препараты 0- специфические антитела Перекрёстно-реагирующие антитела к области кора молекулы ЛПС

IgG IgM IfiG IgM

Ra-ЛПС E.coli ЕН100 Rc-ЛПС E.coli JS Ra-ЛПС S.typhimurium TV119 Ra-ЛПС E.coli ЕН100 Rc-ЛПС E.coli J5 Ra-ЛПС S.typhimurium TV119

нм-лпс S.sonnei +++ +++ НО НО + + + +++

ВМ-ЛПС Ssonnei +++ +++ + ++ + ++ ++ ++

(НМ+ВМ) ЛПС S.sonnei +++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++

нм-лпс E.coli 0:55 ++ +++ + НО + ++ + ++

ВМ-ЛПС E.coli 0:55 +++ +++ НО + НО ++ ++ HO

(НМ+ВМ) ЛПС E.coli О 55 +++ +++ + НО + ++ + +

+++ - антитела определены при обеих схемах иммунизации во всех дозах ++ - антитела определены при обеих схемах иммунизации не во всех дозах + - антитела определены при иммунизации только по одной схеме НО - антитела не были обнаружены

Наиболее значимые работы последних лет по коррекции анти-эндотоксинового статуса связаны с созданием препаратов на основе дЛПС J5 E.coli ОП1:В4. Было показано, что уровень апти-15 антител коррелировал с повышением выживаемости иммунизированных животных при последующем их заражении бактериальными клетками Р.aeruginosa или К.pneumoniae (Cross А., 2010). Нам также удалось при иммунизации ВМ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 и (НМ + ВМ) ЛПС S.sonnei индуцировать выработку противошоковых перекрёстно-реагирующих антител IgG и IgM, специфичных к Rc-ЛПС J5 E.coli.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что профилактическая иммунизация мышей НЭТ-ЛПС энтеробактерий обеспечивает модификацию анти-эндотоксинового статуса в эксперименте, связанную с формированием адаптивного иммунного ответа и иммунологической памяти, основанной на стабильной выработке кор- и О-полисахарид-специфических антител IgG-изотипа.

6. Профилактика развития септического шока на модели экспериментального перитонита при иммунизации мышей (CBAxC57BI/6)Fl НЭТ-ЛПС энтеробактерий

Для изучения способности НЭТ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 модулировать развитие/ течение септического шока исследования продолжили с использованием модели экспериментального перитонита (CLP-модель). Модификация анти-эндотоксинового статуса

при двукратном, с интервалом в 30 дней, в/б введении препаратов НЭТ-ЛПС н Е.соН

0:55 в дозах 10 или 50 мкг/мышь, была подтверждена регистрацией перекрёстно-реагирующих кор-специфических антител через 15 суток после повторного введения препаратов. Это стало обоснованием для использования данной схемы противошоковой иммунизации на модели экспериментального перитонита (перевязка и двукратная перфорация слепой кишки иглой диаметром 220).

При проведении СЬР-операции через 45 суток после первичного введения мышам препаратов НЭТ-ЛПС дХяолле; лучшими защитными свойствами обладали такие образцы как ВМ-ЛПС &50лле/ в дозе 10 мкг/мышь и (НМ + ВМ) ЛПС Хдалле/ в дозе 50 мкг/мышь, обеспечивающие задержку развития экспериментального перитонита на 27 ч. и 48 ч., соответственно. Время жизни последних гибнущих особей в этих же группах было продлено на 1,5 - 3,5 суток (Табл. 6).

Табл. 6. Выживаемость мышей (СВАХС57В1/6)['Т, иммунизированных двукратно НЭТ-ЛПС З'.хоппе!, при индукции экспериментального перитонита через 45 суток после первичного введения препаратов.

Препарат Доза (мкг/мышь) Гибель первой особи (часы) Гибель последней особи (часы) At* (первая) At* (последняя)

НМ-ЛПС S.sonnei 10 42 162 3 36

НМ-ЛПС S.sonnei 50 45 210 6 84

ВМ-ЛПС S.sonnei 10 66 162 27 36

ВМ-ЛПС S.sonnei 50 42 162 3 36

контроль 0 39 126 __ __

Препарат Доза (мкг/мышь) Гибель первой особи (часы) Гибель последней особи (часы) At* (первая) At* (последняя)

(НМ+ВМ) ЛПС S.sonnei 10 18 141 -- 48

(НМ+ВМ) ЛПС S.sonnei 50 69 186 48 ;V 93 !;■.■■:

контроль 0 21 93 -- —

Д1* - разница времени жизни иммунизированных и контрольных мышей (часы).

Возможность профилактики развития септического шока также была продемонстрирована при в/б иммунизации мышей препаратами НЭТ-ЛПС из E.coli 0:55. Лучшими протективными противошоковыми свойствами обладали препараты ВМ-ЛПС Е.соН 0:55 в дозе 10 мкг и (НМ + ВМ) ЛПС E.coli 0:55 в дозе 50 мкг, замедляя развитие экспериментального перитонита на 69 ч. и 72 ч., соответственно. Время жизни последних особей в этих же группах было продлено на 2-3 суток (Табл. 7).

Табл. 7. Выживаемость мышей (СВАхС57В1/6)Р1, иммунизированных двукратно НЭТ-ЛПС Е.соИ 0:55, при индукции экспериментального перитонита через 45 суток после первичного введения препаратов.

Препарат Доза (мкг/мышь) Гибель первой особи (часы) Гибель последней особи (часы) At* (первая) At* (последняя)

НМ-ЛПС E.coli 0:55 10 21 93 0 0

НМ-ЛПС E.coli 0:55 50 45 150 24 57

ВМ-ЛПС E.coli 0:55 10 90 141 69 •18

ВМ-ЛПС E.coli 0:55 50 42 90 21 —

(НМ+ВМ) ЛПС Е.соИ 0:55 10 45 186 24 93

-(НМ+ВМ) ЛПС V E.coli 0:55 50 93 165 72 72

контроль 0 21 93 — --

дг* = разница времени жизни иммунизированных и контрольных мышей (часы)

Отметим, что индукция адаптивного иммунного ответа и профилактика развития септического шока были реализованы при введении препаратов НЭТ-ЛПС энтеробактерий по одной и той же схеме, что может свидетельствовать о вовлечённости анти-ЛПС-антител в процесс элиминации бактериальных патогенов, оказывающихся в перитонеальной полости при проколе слепой кишки. Возможность модуляции септического шока при проведении CLP-операции через 45 суток после первичного введения препаратов ВМ-ЛПС и (НМ + ВМ) ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55, позволяет рассматривать эти образцы в качестве основных кандидатов для создания вакцины для профилактики септического шока.

ВЫВОДЫ

1. Разработана концепция иммунопрофилактики эидотоксического и септического шока, основанная на индукции ранней эндотоксической толерантности и модификации анти-эндотоксинового статуса при предварительном введении экспериментальным животным НЭТ-ЛПС энтеробактерий.

2. Установлен эффект профилактики развития эидотоксического шока при предварительном (за 72 часа) введении мышам НЭТ-ЛПС S.sonnei, связанный со значительным снижением летальности и продукции ФНО-а in vivo.

3. НЭТ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 связываются в 1,5-2 раза эффективнее с транспортным белком LBP по сравнению с эндотоксичными ЛПС, полученными из тех же штаммов.

4. Установлена возможность профилактики развития септического шока при предварительном введении НЭТ-ЛПС S.sonnei и E.coli 0:55 за 45 суток до индукции экспериментального перитонита.

5. Проведена модернизация подхода к моделированию шоковых состояний, основанная на анализе и комплексном использовании экспериментальных моделей, воспроизводящих различные патогенетические варианты эндотоксического и септического шока.

6. Двукратная схема иммунизации НЭТ-ЛПС энтеробактерий и доза 50 мкг/мышь (2500 мкг/кг) признаны оптимальными для модификации анти-эндотоксинового статуса у мышей (CBAxC57Bl/6)Fl.

7. При двукратной иммунизации мышей (CBAxC57Bl/6)Fl НЭТ-ЛПС энтеробактерий достигнута дозозависимая индукция долговременного (> 45 дней) адаптивного иммунного ответа к полиинфекции за счёт выработки перекрёстно-реагирующих IgG-антител к олигосахариду кора молекулы ЛПС

8. В клинических исследованиях была установлена возможность безопасного парентерального введения человеку дизентерийной кандидат-вакцины «Флексвак», полученной на основе НЭТ-ЛПС S.flexneri 2а, в дозах до 50 мкг (0,7 мкг/кг).

9. Впервые в качестве активного компонента кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока предложены низкоэндотоксичные липополисахариды энтеробактерий, активирующие механизмы неспецифической и специфической устойчивости к шоковым состояниям, безопасные для парентерального введения человеку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кондакова А.Н., Виноградов Е.В., Шехт М.Е., Маркина A.A., Линднер Б., Львов В.Л., Апарин П.Г., Книрель Ю.А. Структура олигосахаридной области (кора) липополисахаридов Shigella flexneri типов 2а и 2Ь. Биоорганическая химия, 2010, т. 36, № 3, с. 429-432.

2. Маркина A.A. Комплексное экспериментальное моделирование шоковых состояний. Иммунология, 2012, т.ЗЗ, №5, с. 250-254.

3. Маркина A.A., Львов В.Л., Апарин П.Г. Коррекция септического и эндотоксического шока при иммунизации цвиттерионным экзополисахаридом Shigella sonnei, фаза 1. Иммунология, 2013, т. 34, № 1, с. 39-42.

4. Маркина A.A., Кондратьева И.А. Исследование защитных свойств биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на моделях эндотоксического шока. Вестник Московского университета. Серия 16, Биология, 2013, №2, с. 12-15.

5. Маркина A.A., Львов В.Л., Курбатова И.Ю., Шмиголь В.И., Апартг П.Г. Влияние иммунизации биополимерами углеводной природы (БУП), продуцируемых Shigella sonnei, фаза 1, на выживаемость мышей и уровни провоспалительных цитокинов при

индукции эндотоксического шока // Российский аллергологический журнал, 2007, №3, приложение 1, с. 311-312.

6. Маркина А.А., Апарин П.Г. Увеличение выживаемости мышей (CBAxC57Bl/6)Fl, иммунизированных сериями вакцины «Шигеллвак» и биополимерами углеводной природы (БУП) из Shigella sorrnei при моделировании экспериментального перитонита // Российский аллергологический журнал, 2007, №3, приложение 1, с. 312.

7. Markina А.А., L'vov V.L., Kurbatova I.U., Aparin P.G. Immunization with "Shigellvac" lot 23 Vaccine and Shigella sonnei Carbohydrate Biopolymers Protects Mice against Cecal Ligation and Puncture - Induced Lethality and Downregulates Proinflammatory Cytokines Production in vivo under Experimental Endotoxic Shock Model // Abstracts of The Eleventh Annual Conference on Vaccine Research, Baltimore, USA, 2008, P. 77-78.

8. Маркина A.A., Апарин П.Г., Львов В.Л., Курбатова И.Ю. Защитный эффект профилактической вакцинации мышей (CBAxC57Bl/6)Fl шигеллёзной вакциной «Шигеллвак» и низкоэндотоксичным липополисахаридом Sksonnei, фаза 1, при моделировании экспериментального перитонита // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008, с.77.

9. Маркина А.А., Апарин П.Г., Львов В.Л., Курбатова И.Ю., Шмиголь В.И. Увеличение выживаемости мышей (CBAxC57Bl/6)Fl, иммунизированных низкоэндотоксичными нативным и модифицированными липополисахаридами Shigella sonnei, фаза 1, при индукции D-галактозаминной и прямой моделей эндотоксического шока // Российский аллергологический журнал, 2009, №3, выпуск 1, с. 367.

10. Маркина А.А. Защитный эффект профилактической вакцинации мышей (CBAxC57Bl/6)Fl низкоэндотоксичным липополисахаридом Shigella sonnei, фаза 1, при моделировании экспериментального перитонита // Российский аллергологический журнал, 2009, №3, выпуск 1, с. 368.

11. L'vov V.L., Shekht М.А., Markina А.А., Ledov V.A., Golovina M.E., Ankudinov I.V., Aparin P.G., Kondakova A.N., Perepelov A.V., Rnirel Y.A. Chemichally modified lipopolysaccharides of Shigella as potential protective preparations // Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Украина, Крым, Новый Свет, 2009, с. 120.

12. Апарин П.Г., Львов В.Л., Ванеева Н.П., Ёлкина С.И., Головина М.Э., Сергеев В.В., Шмиголь В.И., Книрель Ю.А., Курбатова И.Ю., Анкудинов И.В., Лучина Н.Н.,

Суркова И.Г., Вернер И.К., Ледов В.А., Маркина А.А., Шехт М.Е. Бактериальные кишечные инфекции: иммунопрофилактика и контроль распространения в различных регионах Евразии // Тезисы докладов международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней», Новосибирск, 2009, с. 226-229.

13. Маркина А.А. Индукция ранней и поздней эндотоксической толерантности при профилактической вакцинации мышей (CBA*C57B16)F1 низкоэндотоксичными биополимерами углеродной природы Shigella sonnei, фаза 1 // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения и инфекционных болезней», Москва, 2010, с. 74.

14. Markina А.А., L'vov V.L., Golovina М.Е., Kurbatova I.U., Ankudinov I.V., Aparin P.G. Immunization with Shigella sonnei exopolysaccharide protects mice (CBA*C57B1/6)F1 against lipopolysaccharide-induced lethality and downregulates TNF-a production in vivo in experimental endotoxic shock models // Сборник тезисов 5-й Балтийской Конференции по микробным углеводам, Суздаль, 2012, Р41.

Подписано в печать 08 октября 2013 г. Формат 60x90/16 ,объём 1,2 п.л. Тираж 100 экз., заказ № 081028

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912\772801001 Адрес: 105066, г. Москва, Лефортовский пер., дом 8, корпус 2. Тел. 728-97-17, +7(499)261-78-22. http://www.onlineeopy.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркина, Анна Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

На правах рукописи

04201451062

Маркина Анна Александровна

ЛИПОПОЛИСАХАРИДНАЯ КАНДИДАТ-ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО И СЕПТИЧЕСКОГО ШОКА

03.03.03 - иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук П.Г. Апарин

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список сокращений 5

ВВЕДЕНИЕ 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1. Сепсис - актуальная проблема современной медицины 14

1.2. Строение липополисахарида 17 1.2.1 Липид А 20 1.2.2. Олигосахарид кора 20 1.2.3.0-полисахарид 21

1.3. Этиология сепсиса 21

1.4. Патогенез сепсиса 22

1.4.1. Генерализованный васкулит 25

1.4.2. Гиперкоагуляция 27

1.4.3. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови 28

1.4.4. Полиорганная недостаточность 28

1.5. Клеточный механизм сепсиса 29

1.5.1. Распознавание ЛПС и активация рецепторного комплекса ТЬК.4-1УГО-2 29

1.5.2. МуВ88-зависимый путь передачи сигнала. Активация транскрипционного фактора ОТкВ 34

1.5.3. Му088-независимый путь передачи сигнала. Активация транскрипционного фактора ШРЗ 35

1.5.4. Особенности функционирования системы врождённого иммунитета при септическом шоке 36

1.6. Агонисты и антагонисты ТЬЯ4 39

1.7. Современные подходы к терапии и профилактике эндотоксического и септического шока 43

1.7.1. Терапия сеспсиса в клинике 43

1.7.2. Нейтрализация провоспалительных цитокинов в кровотоке 46

1.7.3. Антагонисты бактериальных эндотоксинов 47

1.7.4. Модификация анти-эндотоксинового статуса 49

1.7.5. Другие подходы к профилактике шоковых состояний 52

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55

2.1. Материалы 55

2.2. Методы 55

2.2.1. Определение прирогенности БУП энтеробактерий 55

2.2.2. Изучение противошокового действия БУП энтеробактерий на различных моделях эндотоксического шока 56

2.2.3. Исследование иммунопрофилактики септического шока на модели экспериментального перитонита 57

2.2.4. Оценка эффективности связывания ЛПС энтеробактерий с липополисахарид-связывающим белком ЬВР 57

2.2.5. Изучение иммуногенности БУП энтеробактерий в эксперименте 58

2.2.6. Оценка безопасности дизентерийной вакцины «Флексвак» в клинических исследованиях 59 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 61

3.1. Экспериментальное моделирование эндотоксического и септического шока 61

3.1.1. Б-галактозаминовая модель эндотоксического шока 61

3.1.2. Прямая модель эндотоксического шока 61

3.1.3. Разработка и оптимизация модели экспериментального перитонита (СЬР-модель) 62

3.2. Установление возможности профилактики эндотоксического шока при предварительном введении мышам (СВА*С57В1/6)Р1 БУП 64

3.3. Установление возможности профилактики септического шока при предварительном введении мышам (СВА><С57В1/6)Р1 БУП Б^оппег 65

3.4. Разработка кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического шока 69

3.5. Индукция ЛПС-специфических антител и коррекция анти-эндотоксинового статуса при иммунизации мышей (СВАхС57В1/6)П НЭТ-ЛПС энтеробактерий 73

3.6. Профилактика развития септического шока на модели экспериментального

перитонита при иммунизации мышей (СВА><С57В1/6)Р1 НЭТ-ЛПС

энтеробактерий 81

3.7. Клинические исследования безопасности НЭТ-ЛПС энтеробактерий 86

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 89

4.1. Комплексный подход к моделированию шоковых состояний 89

4.2. Установление возможности профилактики эндотоксического шока при предварительном введении мышам (СВАхС57В1/6)Р1 БУП Б.зоппе1 93

4.3. Установление возможности профилактики септического шока при предварительном введении мышам (СВАхС57В1/6)Р1 БУП 8.зоппе1 95

4.4. Разработка кандидат-вакцины для профилактикики эндотоксического шока 97

4.5. Модификация анти-эндотоксинового статуса при иммунизации мышей (СВАхС57В1/6)Р1 НЭТ-ЛПС энтеробактерий 102

4.6. Профилактика развития септического шока на модели экспериментального перитонита при иммунизации мышей (СВАхС57В1/6)Р1 НЭТ-ЛПС энтеробактерий 106

4.7. Клинические исследования безопасности НЭТ-ЛПС энтеробактерий 112 ВЫВОДЫ 114 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 116

Список сокращений

АД - артериальное давление

анти-15-антитела- антитела к Rc-ЛПС мутантного штамма J5 E.coli Olli:В4

анти-Яа-антитела - антитела к Ra-ЛПС E.coli EH 100

БСА - бычий сывороточный альбумин

БУП - биополимеры углеводной природы

в/б - внутрибрюшинно

в/в - внутривенно

ВМ-ЛПС - высокомолекулярная фракция низкоэндотоксичного липополисахарида ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови

дЛПС J5 - детоксицированный липополисахарид мутантного штамма

J5 E.coli Ol 11:В4

ИЛ - интерлейкин

ИЛ- lß- интерлейкин-1 ß

ИЛ-IP - рецептор ИЛ-1

ИЛ-1РА - антагонист рецептора ИЛ-1

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

КДО - 2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота

Кор - центральная олигосахаридная область липополисахарида

Кх - кратность подъёма титра антител

ЛПС - липополисахарид

МАТ - моноклональные антитела

НМ-ЛПС - низкомолекулярная фракция низкоэндотоксичного липополисахарида (НМ + ВМ) ЛПС - смесь низко- и высокомолекулярных фракций низкоэндотоксичных липополисахаридов в соотношении по массе 1:1 НЭТ-ЛПС - низкоэндотоксичный липополисахарид

ОМР - белок внешней мембраны Neisseria meningitidis (outer membrane protein) О-ПС - О-специфическая полисахаридная цепь липополисахарида ОРИТ - отделение реанимации и интенсивной терапии

ОФД - орто-фенилендиамин

ПАМП - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны п/к - подкожно

ПОН - полиорганная недостаточность

ПРР - паттерн-распознающие рецепторы

СВО - системный воспалительный ответ

ССВО - синдром системного воспалительного ответа

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

Физ.раствор - апирогенный 0,9% раствор хлорида натрия

ФНО-а - фактор некроза опухоли - а

ФНО-Р - рецептор фактора некроза опухоли

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭПС - экзополисахарид S.sonnei

ВТК - тирозин киназа Брутона (Bruton's tyrosine kinase)

CASP - метод стентирования брыжейки ободочной восходящей кишки (colon ascendens stent peritonitis)

CLP - метод перевязки и прокола слепой кишки (cecal ligation and puncture) DD - «домен смерти» (death domain) D-GalN - D-галактозамин

IkB - ингибиторный белок IkB (inhibitory-binding protein кВ)

IFR3 - интерферон-регулирующий фактор 3 (interferon-regulatory factor 3)

IKK - ингибиторная киназа NFkB (inhibitor of NFkB kinase)

IRAK - киназа, ассоциированная с IL-1R (IL-1R - associated kinase)

J5 E.coli - мутантный штамм J5 E.coli 0111 :B4, Rc-хемотип

LBP - липополисахарид-связывающий белок (LPS-binding protein)

LRR - лейциновые повторы (leucine-rich repeats)

MPL - монофосфорил липида A

MyD88 -фактор дифференцировки миелоидов 88 (myeloid differentiation factor 88) NFkB - ядерный фактор кВ (nuclear factor кВ) OD - оптическая плотность

RIP-1 - рецепторвзаимодействующий белок 1 (receptor-interacting protein 1)

SOCS - белок-супрессор проведения цитокиновых сигналов (suppressor of cytokine signaling)

TAB - ТАК 1-связывающий белок (ТАК1-binding protein)

ТАК - киназа, активирующая трансформирующий фактор роста р (transforming

growth factor- (3-activated kinase)

TF - тканевой фактор

TIR-домен - Toll/IL-1 -рецепторный домен

TIRAP - TIR-содержащий адаптерный белок (TIR-domain-containing adaptor protein) TLR - toll-подобные рецепторы (toll-like receptors)

TRAF6 - фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)

TRAM - TRIF-родственная адаптерная молекула (TRIF-related adaptor molecule) TRIF - TIR-содержащая адаптерная молекула (TIR-domain-containing adaptor protein including interferon-P)

wJIlTC - липополисахарид, полученный по методу Westphal

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Септический и эндотоксический шок являются чрезвычайно опасными патологическими состояниями, которые возникают на фоне массивного поступления в организм грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов, вследствие септического (инфекционного) процесса или серьёзных нарушений микроциркуляции, и относятся к числу клинических состояний, в лечении которых не удаётся достичь существенного успеха. Несмотря на прогресс в понимании патофизиологии сепсиса и разработку антибиотиков последнего поколения, обладающих широким спектром действия, смертность от сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями, остаётся высокой, особенно в случае развития септического шока.

В мире ежегодно диагностируется 1,5 млн случаев сепсиса, который занимает первое место по причине смертности пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии некардиологического профиля

(Linde-Zwirbe W.T.et al., 1999). Ежегодно от сепсиса умирает свыше 500 тыс. пациентов, причём основная доля приходится на технологически развитые страны Евросоюза (около 135 тыс.) и США (около 250 тыс.). Грамотрицательный сепсис ассоциирован с высокой летальностью, уровень которой в среднем составляет 2040%, а в случае септического шока - более 50% (Bone R.C., 1993).

Сепсис может развиваться как патологический процесс, сопровождая различные инфекционные заболевания, проявляться в виде осложнений заболеваний, вызванных травматическими факторами: ожог, хирургическая операция или открытая рана, множественные травмы механического характера. К факторам, обуславливающим (усиливающим) развитие грамотрицательного сепсиса, относят широкое распространение антибиотиков, иммуносупрессорную терапию (химиотерапия у больных онкологического профиля, препараты, подавляющие отторжение тканей при трансплантации), инвазивные методы лечения и приборы (хирургия, катетеры, дренажные трубки), кишечные язвы, возраст, тяжёлые сопутствующие заболевания (диабет, СПИД).

В 1950-е годы была выявлена роль бактериального эндотоксина (липополисахарида - ЛПС) в патогенезе грамотрицательного сепсиса (Cross A.S. et al., 2004). Если до 1960-х годов грамотрицательные патогены были не

типичны для клинических инфекций, то в дальнейшем произошёл сдвиг в сторону доминирования грамотрицательных бактерий в генезе различных воспалительных процессов, особенно у госпитализированных пациентов.

Стандартная терапия сепсиса заключается во введении инфузионных жидкостей и вазопрессоров (сосудосуживающие, повышающие кровяное давление препараты) для восстановления кровяного давления и кровотока в органах, оксигенации (насыщении кислородом) тканей и органов и использовании антибиотиков (Савельев B.C., Гельфанд Б.Р., 2006). Неэффективность иммунотерапевтических интервенций на фоне септических состояний и при хирургических вмешательствах диктует необходимость разработки новых подходов не только к лечению сепсиса, но и к предотвращению, профилактике, подготовке пациента к возможному септическому состоянию.

Неудачи в области терапии шоковых состояний привлекли особое внимание к изучению иммунологического статуса пациентов с различными исходами септических состояний. Исследования последних лет показали, что неблагоприятные исходы при септических и эндотоксических состояниях ассоциированы с низким уровнем анти-ЛПС-антител (Strutz F. et al., 1999; Bennett-Guerrero E. et al., 1997). В тоже время было установлено, что высокий анти-эндотоксиновый статус пациентов, характеризующийся повышенными уровнями предсуществующих антител IgG и IgM к олигосахариду кора молекулы ЛПС, несущему слабовариабельные консервативные участки, общие для различных представителей рода Enterobacteriaceae, и к О-полисахаридному домену ЛПС, коррелировал с повышением выживаемости больных с грамотрицательным сепсисом (Gibbs R.J. et al., 2004). Таким образом, модификация анти-эндотоксинового статуса является актуальной стратегией профилактики шоковых состояний.

В последние годы была сформулирована концепция иммунопрофилактики эндотоксического и септического шока, направленная на разработку противошоковых вакцин, на основе молекул липополисахаридов, применение которой позволит создать устойчивость организма к последующему массивному попаданию бактериального эндотоксина. Основные экспериментальные и клинические исследования в области профилактики эндотоксического шока,

проведённые в последние годы, связаны с использованием производных липополисахарида и его синтетических аналогов с пониженной эндотоксичностью, обладающих антагонистическим действием по отношению к ЛПС, например, компонента R-формы ЛПС из S.enterica sv Minnesota R595 - монофосфорил липида A (Salkowski С.A. et al., 1998), синтетических аналогов нетоксичного ЛПС Rhodobacter capsulatus - Е5531 и Е5564 (Bunnell Е. et al., 2000; Lynn M. et al., 2003). Другим направлением является прямая модификация анти-эндотоксинового статуса - вакцинация, направленная на индукцию анти-ЛПС-антител. На сегодняшний день разработан только один вариант противошоковой вакцины на основе детоксицированного ЛПС мутантного штамма J5 Escherichia coli Olll:В4 Rc-хемотипа, нековалентно присоединённого к белку внешней мембраны Neisseria meningitides, которая на экспериментальных моделях защищала животных от септических состояний, а при иммунизации добровольцев обеспечивала модификацию анти-эндотоксинового статуса (Cross A. et al., 2004).

Несмотря на важность проблемы, количество работ по модификации анти-эндотоксинового статуса ограничены необходимостью конструирования ЛПС-иммуногена, безопасного для человека. Путь к получению клинически-применимого препарата связан с решением проблемы рационального снижения токсичности ЛПС без снижения его иммуногенности. В последние годы сотрудниками ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России впервые были получены низкоэндотоксичные липополисахариды энтеробактерий, обладающие высокой степенью безопасности и представляющие интерес для клинического исследования. Оценка их противошокового действия представляется актуальной задачей в контексте разработки противошоковой вакцины, внедрение которой может привести к созданию новой медико-социальной технологии - профилактике эндотоксического и септического шока, которая может оказать существенное содействие в обеспечении выживаемости больных с различной патологией, а также лиц, находящихся в «шоковой» группе риска (военные, пожарные, сотрудники МВД и МЧС).

Цель исследования: проведение комплексных исследований противошокового действия, иммуногенности, безопасности биополимеров

углеводной природы (БУП) энтеробактерий с целью получения образцов кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное моделирование эндотоксического и септического шока.

2. Исследовать влияние предварительного введения БУП энетробактерий на выживаемость животных и продукцию ФНО-а in vivo на различных моделях эндотоксического шока.

3. Изучить взаимодействие низкоэндотоксичных и нативных ЛПС энтеробактерий с транспортным липополисахарид-связывающим белком (LBP).

4. Исследовать влияние профилактического введения мышам БУП энтеробактерий на развитие септического шока (экспериментального перитонита).

5. Разработать схемы иммунизации для профилактики септического шока препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий.

6. Изучить продукцию анти-ЛПС-антител и возможность модификации анти-эндотоксинового статуса при разных схемах иммунизации низкоэндотоксичными ЛПС энтеробактерий.

7. Оценить безопасность низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий в клинических исследованиях.

Научная новизна. Существенно расширены представления о возможностях иммунопрофилактики опасных патологических состояний - эндотоксического и септического шока. Доказана роль механизма понижающей регуляции продукции ФНО-а, инициированного предварительным введением мышам низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, в существенном увеличении выживаемости животных при индукции эндотоксического шока. Разработаны схемы вакцинации препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, индуцирующие адаптивный иммунный ответ к полиинфекции, вызывающей септический шок, с выработкой перекрёстно-реагирующих антител к олигосахариду кора молекулы ЛПС. Изучена связь между выработкой

перекрёстно-реагирующих антител, специфичных к олигосахариду кора молекулы ЛПС и модуляцией септического шока (задержка развития экспериментального перитонита и продление времени жизни животных на фоне сепсиса) при профилактической иммунизации мышей низкоэндотоксичными ЛПС энтеробактерий. Подтверждена важность долговременного анти-эндотоксинового иммунного ответа в качестве одного из основных защитных механизмов при септическом шоке. Впервые получены оригинальные образцы липополисахаридной кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока, в качестве активного компонента которой предложены низкоэндотоксичные ЛПС энтеробактерий, активирующие механизмы неспецифической и специфической устойчивости к шоковым состояниям, безопасные для парентерального введения человеку.

Научно-практическая значимость. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы результаты представляют собой основу для проведения клинических исследований противошокового действия вакцинного препарата, основной субстанцией которого являются низкоэндотоксичные ЛПС энтеробактерий, предназначенного для профилактики эндотоксического и септического шока. Внедрение противошокового препарата в практику �