Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование аттенуированных штаммов Yersinia Pestis с пониженной реактогенностью

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование аттенуированных штаммов Yersinia Pestis с пониженной реактогенностью"

На правах рукописи

АГЕЕВ Сергей Андреевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ

03.02.03- микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о СЕН ?ою

0боленск-2010

004609694

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна Доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Жемчугов Владислав Евгеньевич Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Лидия Васильевна Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится «20» октября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФГУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «20» сентября 2010 г. Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы:

За двести лет своего существования вакцинология достигла поразительных успехов -возбудитель оспы сохранился только в коллекциях двух лабораторий, заболеваемость целым рядом инфекций (полиомиелит, дифтерия и др.) удалось снизить до такой степени, что можно также надеяться на их полное искоренение, а сотни опаснейших болезней взяты здравоохранением под контроль благодаря классическим вакцинам, полученным методами инактивации и атгенуации. Способы получения вакцин с тех пор значительно изменились. Сегодня развитие методов молекулярной биологии, генной медицины, органической химии и иммунологии позволяют выделять очищенные нативные и получать синтетические антигены, направленно конструировать продуценты рекомбинантных протективных антигенов с заданными свойствами на основе технологичных штаммов бактерий или высших растений ("съедобные вакцины") и прецизионно атгенуированные мутанты и живые векторы на основе бактерий и вирусов, экспрессирующих протективиые антигены in situ; использовать ДНК, РНК и полисахариды для индукции запрограммированного релевантного иммунного ответа [Ме-дуницын Н.В. 1997; Levine, Sztein, 2004; Stanley, Plotkin, 2005].

Основные требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам, включают: безупречный уровень безопасности для всех слоев населения, в том числе лиц с измененной иммунной реактивностью (младенцы, беременные, пожилые, лица с нарушениями иммунного статуса); создание напряженного и долгосрочного уровня защиты, развивающегося не позднее чем через 2-3 недели после однократного введения вакцинного препарата; безинъекционный способ введения в организм (через рот, нос, слизистые); возможность комбинирования с другими вакцинами; устойчивость к внешним воздействиям и отсутствие специальных требований для хранения; и, наконец, экономичность и простоту изготовления [Levine, Sztein, 2004]. Однако до сих пор не существует "идеальной вакцины", полностью соответствующей всем перечисленным требованиям. Большинство вакцинных препаратов обладает лишь частью из этих характеристик, и каждый из них имеет свои недостатки и ограничения.

В последние годы наибольшее внимание в разработке препаратов для вакцинопрофи-лактики чумы уделяется созданию субъединичных вакцин, содержащих лишь протективные антигены и неспособных вызывать инфекционный процесс даже у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако и они не являются идеальными, т.к. слабо индуцируют клеточное звено иммунитета и не могут предохранять от гибели после заражения штаммами, полностью утратившими способность к продукции антигена, используемого для иммунизации, либо продуцирующими серовары антигена, нераспознаваемые поствакцинальным иммунитетом. Так, чумные субъединичные вакцины на основе капсульного антигена F1 не способны

3

стимулировать формирование напряженного поствакцинального иммунитета в отношении вирулентных бескапсульных штаммов Y. pestis, а препараты на основе V антигена неэффективны в отношении штаммов, продуцирующих серологически отличающиеся варианты белка [Anisimov etal., 2004]. В тоже время, применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного G. Girard'oM и J. Robic'oM в начале 30-х годов прошлого столетия [Girard, 1963] штамма Y. pestis EV лишена этих недостатков - она не только стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет, но и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [Анисимов, 1999]. Однако следует признать, что на настоящий момент эта вакцина морально устарела, прежде всего, из-за ее высокой ре-акгогенности и способности вызывать тяжелые местные и системные реакции у здоровых вакцинируемых и даже генерализованный инфекционный процесс у лиц со сниженным иммунным статусом [Наумов и др., 1992; Meyer etal., 1974а; Perry, Fetherston, 1997]. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины является одной из важных задач современной системы противочумной защиты населения.

Сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструированы мутанты вакцинного штамма EV с нарушенным синтезом лауриновой кислоты, в которых центральная часть гена IpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [Anisimov et al., 2007]. В серии экспериментов на мышах [Anisimov et al., 2007; Feodorova et al., 2007] и морских свинках [Feodorova et al., 2007] было установлено, что IpxM мутант по сравнению с исходным вакцинным штаммом не только снизил реактогенность, по и обладал повышенной иммуно-генностью. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости. Конструирование IpxM мутанта вакцинного штамма EV, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, позволит получить кандидат в вакцинные штаммы Y. pestis - основу для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью и повышенной иммуногенно-стъю.

Цель исследования - разработка способа конструирования кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба с пониженной эндотоксической активностью; получение AIpxM производных вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и оценка их в качестве кандидатов в новые вакцинные штаммы.

Задачи исследования:

1. Разработать способ конструирования IpxM мутантов Y.pestis, лишенных маркеров лекарственной устойчивости, и получить Д/рхА/вариант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ.

2. Подтвердить корректность введенной мутации с помощью секвенирования сконструированной аллели гена IpxM и определения структуры ЛПС, синтезируемого му-тантным штаммом.

3. Провести сравнительную комплексную оценку эндотоксических свойств препаратов ЛПС, синтезируемых родительским и мутантным штаммами.

4. Оценить биологические свойства кандидата в вакцинные штаммы, включая ре-актогеинось, безвредность и иммуногенную активность, в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.1113-02 "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба".

Научная новизна.

Впервые сконструирован и охарактеризован в соответствии с методическими указаниями "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба" [2002] ЫрхМ вариант вакцинного штамма Y.pestis EV линии НИИЭГ, лишенный маркеров анти-биотикоустойчивости. Установлено, что степень снижения токсичности ЛПС Y. pestis, утратившего шестой жирно-кислотный остаток, зависит от видовой принадлежности клеток -мишеней макроорганизма. Выявлено антагонистическое действие мутантного пентаацильно-го ЛПС по отношению к ЛПС дикого типа на модели человеческих, но не мышиных фагоцитирующих клеток. Впервые показано, что повышение иммуногенности штамма может сопровождаться снижением его "остаточной вирулентности"

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров анти-биотикоустойчивости неревертирующих ДIpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner [2000], клонирование му-тантной аллели blpxMv.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы: штамм Е. coli DH5- Xpir/pCVD442-A!pxM::cat (per. номер В-6512), продуцирующий суицидный вектор pCVD442-A/pxA/::cat, штамм Е. coli S17- }pirlpCVD442-A!pxM::cat (per. номер В-6511), предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора в штаммы чумного микроба Причем сконструированный штамм может использоваться как донор при соз-

дании новых кандидатов в вакцинные штаммы на основе любых атгенуированных штаммов У. pestis.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонирован авторский штамм У. pestis EVàlpxM (рег. номер В-6513), сочетающий делецию гена IpxM с отсутствием маркеров лекарственной устойчивости (федеральный уровень внедрения).

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций по изучению ингибирующего действия препаратов модифицированного ЛПС У. pestis на индукцию синтеза TNF-a эукариотическими клетками. (Оболенск, 2010, учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Путинского государственного университета (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов У. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.

2. Созданный на основе вакцинного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. Снижение провоспалительной активности его ЛПС проявляется в большей степени на моноцитах человека и в меньшей степени на макрофагах мыши.

3. Уменьшение реакгогенности (остаточной вирулентности) штамма У. pestis EVAlpxM сопровождается повышением его иммуногенности.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 124-Д от 11.06.2009 г. и № 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: 46* Oholo Conférence: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Médical Countermeasures" (Eilat, Israël, October 25-29, 2009,); VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасностъ» (Москва, 10-11 ноября 2009); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные

технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010); Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 8 сентября 2010 года.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях (включая 2 статьи в международных научных журналах реферируемых ISI и 1 главу в международной монографии) список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 42 работу отечественных и 173 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

В работе использовали четыре авирулентных штамма Y.pestis и один вирулентный штамм Y. pestis ssp. pestis 231, а также штаммы К coli: DH5a Ipir, S17 Xpir, S17 Xp;>/pCVD442 для проведения генетических манипуляций (МЖК ГНЦ ПМБ). Выращивание штаммов Е. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Луриа-Бертани (LB) при температуре 37 °С [Miller, 1972]. Клетки Y.pestis для мутагенеза растили на жидких и плотных питательных средах Хотгангера pH 7,2 -7,4 при 28 °С. Для выделения ЛПС штаммы Y. pestis выращивали с аэрацией при температуре 25 "С в ферментере «New Brunswick Scientific» в жидкой среде на основе солянокислого гидролизата казеина и дрожжевого автолизата.

Конструирование нокаугных мутантов по гену IpxM штамма Y. pestis EV линии НИИ-ЭГ проводили с помощью прямого сайт-направленного мутагенеза по методике К.А. Datsenko, B.L. Wanner, [2000]. Мугантную аллель AlpxM::cat клонировали в суицидный вектор pCVD442, предварительно гидролизованный Smal. Для удаления кассеты антибиота-коустойчивосги использовали плазмиду рСР20.

Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству Т. Maniatis et a!. [1982]. Передачу рекомбинангных шгазмид в штаммы Е. coli осуществляли "кальциевым" методом трансформации по S.N. Cohen и A.C.Y. Chang [1973], а в клетки Y. pestis - методом электро-стимулируемой трансформации [Еремин и др., 1991] и конъюгации [Miller, 1972]

Для определения нуклеотидной последовательности участка хромосомы ДIpxM штамма К. pestis ЕVAlpxM использовали прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК.

Выделение ЛПС проводили методом экстракции по С. Galanos [1969]. Электрофоре-тический контроль препаратов ЛПС проводили по U. Laemmli [1970] и О. Остерману [1985]. Для визуализации ЛПС гели окрашивали аммиачным раствором оксида серебра после окисления йодной кислотой в соответствии с рекомендациями С. Tsai и С. Frash [1982]. Концен-

7

трацию белковых примесей определяли по М. Bradford [1976] или О. Lowry [1951]. Содержание нуклеиновых кислот определяли спектрометрически, измеряя оптическую плотность при 260 нм [Wetmur J. Davidson N., 1968], и по окрашиванию препаратов бромистым этидием при электрофоретическом разделении в 0,7 % агарозном геле [Sharp etat1973].

Определение структуры полученных препаратов ЛПС проводили с использованием методов спектроскопия ядерно-магнитного резонанса (ЯРМ) и масс-спектрометрии (MC).

Для определения значений LDso изучаемых препаратов ЛПС использовали 8-10 недельных мышей линий Balb/C. Животным вводили подкожно пятикратные разведения препаратов ЛПС, растворенных в апирогенном 0,9 % растворе NaCl. Для повышения чувствительности к ЛПС мышей сенсибилизировали подкожным введением раствора актиномицина Д в дозе 10 мкг/мышь одновременно с введением ЛПС.

Основные фенотипические характеристики, культуральные и морфологические свойства вакцинных штаммов Y. pestis определяли в соответствии с методическими указаниями "Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба" [2002].

Оценку TNF-амшдуцирующей активности ЛПС проводили и vitro и от vivo. В качестве клеток мишеней использовали клетки разной видовой принадлежности: линию мышиных макрофагов J774A.1, перитонеальные макрофаги мыши, линию человеческих промиело-цитов U937, моноциты периферической крови человека. В экспериментах in vivo определяли количество TNF-or в сыворотке крови мышей Balb/C, сенсибилизированных актиномицином Д. Доза ЛПС составляла 50 мкг/мышь. Количество TNF-e в клеточном супернатанте или в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы Bender MedSystems.

Иммуноблотинг проводили по методу Н. Towbin [1979]. Иммунохимическую активность сывороток тестировали методом твердофазного ИФА согласно руководству Т.Т.Нгоссоавт. [1988].

Для определения уровня обсемененности органов у мышей линии Balb/C, инфицированных подкожно штаммами Y. pestis в дозе 107 КОЕ/мышь, проводили некропсию, забирали лимфатические узлы в месте введения и отдаленные лимфоузлы, селезенку, печень, легкие и головной мозг. Органы взвешивали и гомогенизировали, а затем десятикратные разведения гомогенатов высевали на агар Хоттингера. Через 48 ч подсчитывали количество колоний и проводили расчет обсемененности на орган.

Для сравнительной оценки иммуногенности клонов Y. pestis ЕУЫрхМ использовали «феномен переживания», описанный H.H. Гинсбургом [Гинсбург, 1969] в модификации Г.А. Апарина и Т.Н. Вершининой [1986].

Определение безвредности, иммуногенной и протекгивной активности экспериментальных вакцинных штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями «Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба» [2002].

Для определения эффективной иммунизирующей дозы (ED50) вакцинных штаммов группы беспородных мышей и мышей линии Balb/c (по 10 животных в каждой) иммунизировали подкожно в область верхней трети правого бедра дозами 2х 102, 1 х 103, 5 х 103 и 2,5 х 104 м.к. У. pestis EVAlpxM или У. pestis EV линии НИИЭГ в 0,2 мл 0,9 %-ого физиологического раствора. Заражение животных проводили на 21-е сутки после иммунизации подкожно в область верхней трети левого бедра вирулентным штаммом У. pestis 231 в дозе, соответствующей 200 DCL (1 Del = 10 КОЕ) выращенным на агаре Хоттингера при 28 °С в течение 48 ч. Величину ED50 исследуемого вакцинного штамма вычисляют по методу Kärber, описанному И.П. Ашмариным и A.A. Воробьевым [1962].

Напряженность противочумного иммунитета (индекс иммунитета - ИИ) определяли по величине заражающей дозы, выраженной в LD50 вирулентного штамма для интактных животных, при заражении которой на 21-е сутки выживает не менее 50 % животных.

Результаты исследований.

Учитывая, что одним из возможных путей уменьшения реактогенности живой вакцины является генно-инженерная модификация ЛПС, обеспечивающая образование молекул со сниженной токсичностью [Дентовская C.B. с соавт., 2006], был получен мутантный по гену IpxM штамм на основе вакцинного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ.

Конструирование LpxM" варианта штамма Y.pestis EV заключалось в инактивации гена IpxM с помощью замены его на кассету устойчивости к антибиотику и последующем удалением кассеты из хромосомы (рис.1).

IpxM регион

AlpxM::cat

МрхМ

Рисунок 1. Схема конструирования LpxM" варианта штамма ¥. pestis EV

Методом одноэтапной инактивации хромосомных генов с помощью ПЦР-продуктов [Datsenko, Wanner, 2000] на основе вакцинного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ был получен мутант, в котором кодирующая последовательность гена IpxM была заменена на кассету устойчивости к хлорамфениколу.

Для получения ПЦР-продукта, представляющего собой ген cat, ограниченный FRT сайтами и фланкированный с двух сторон короткими участками гомологии (55 п.н.) гена IpxM, в качестве матрицы в ПЦР была использована плазмида pKD3 с праймерами Catl-f и Cat2-r. После введения в родительский штамм У. pestis EV линии НИИЭГ, предварительно трансформированный хелперной плазмидой pKD46, 100 нг ПЦР-продукта было получено 11 CmRApR колоний. Полученный штамм Y. pestis EVA//»A/::cai/pKD46 был использован далее для клонирования инактивированного гена IpxM. Участок AIpxMv.cat амплифицировали с праймерами Caß-f и Cat4-r. Затем на основе суицидного вектора pCVD442 была создана ре-комбинантная плазмида $CVD442-AlpxM::cat (рис. 2) и клонирована в штамме Е. coli DH5a Яри; азатем в штамме Е. coli S17-1 Apir, для ее последующего конъюгативного переноса в штамм Y. pestis EV.

Рисунок 2. Рекомбинантная плазмида рСУ0442-Д/рхМ::ся/

После гомологичной рекомбинации проводили элиминирование интегрированного суицидного вектора и селективный отбор клонов У. резШ НУ НИИЭГ с инактивированным геном и кассетой анггибиотикоустойчивости на агаре Хотгингера в присутствии 5 % сахарозы. Бьио получено восемь Ар8Сшк5иск колоний, которые верифицировали методом Г1ЦР с локус-специфичными праймерами Са13-Г и Са14-г. Один из клонов У. рез/ю ЕУ НИИЭГ Д 1рхМ::сш был выбран для проведения дальнейшей работы.

Было проведено удаление кассеты устойчивости к хлорамфениколу в инактивирован-ном гене с помощью вектора рСР20. Элиминацию плазмиды рСР20 из полученного штамма У. рея^ ЕУ НИИЭГ А1рхМ проводили путем культивирования его в обогащенной среде при температуре +40 "С.

Отсутствие кассеты антибиотикоустойчивости в инактивированном гене АркСтк клонов подтверждали методом ПЦР (рис. 3).

В результате было получено 4 чувствительных к ампициллину и хлорамфениколу клона мугантного штамма У. реШз ЕУД1рхМ (Ар5Ст8) с инактивированным геном 1рхМ, синтезирующих модифицированный ЛПС, что обеспечивает образование молекул со сни-

10

женной токсичностью. Данное обстоятельство позволило нам предположить снижение реак-тогенности у полученных клонов и рассматривать их в качестве кандидатов в вакцинные.

Рисунок 3. Сравнительный анализ продуктов амплификации ДНК штаммов К pestis EV НИИЭГ, Е\МрхМ.:са и ЬУМрхМ. Треки: 1,2 - EVUpxM (1268 п.н.), 3,4 - ЕVAlpxM::cat (2198 п.н.), 5,6 - EV НИИЭГ (2457 п.н.), 7 - ДНК Я гидролизованная рестриктазой Hindlll. Электрофорез в 0,7 % агароз-ном геле.

Для подтверждения корректности мутации по гену IpxM было проведено секвениро-вание участка хромосомы полученного штамма Y. pestis ЕVAlpxM (рис. 4).

йрайквруюяй са*т для Cat3-f

S'-agicigicagcccaicgßsatggcigatatcagetiigctatiggjcttfaattgcgaagcggitaKlgcaaacart

Правммрттмдай сайт ляп Cali f FRT СаЙТ

-^----

Сайтожмммрабоаж ПрзАмнр^юшяй сайт дня Са(2-г

^I^paiMHpyioiHücaftTMaCalS-r

acgactggt attsgtcgiacc-aatggtgcccatcacatcgcc 3' Рисунок 4. Сиквенс участка хромосомы штамма К pestis EVAlpxM, ограниченного праймерами Cat3-f и CatS-r.

Иммуиогеиность полученных клонов была предварительно оценена с помощью «феномена переживания» H.H. Гинсбурга. Суть феномена заключается в том, что клетки вирулентного штамма чумного микроба теряют способность вызывать летальную инфекцию у белых мышей и морских свинок при введении их в одном шприце с микробами вакцинного штамма Y. pestis. Величина LDsa вирулентного штамма Y. pestis является коррелятивным критерием иммуногенности вакцинного штамма.

В качестве вирулентного штамма был использован штамм Y. pestis 231, LD50 которого для мышей составляет 5 КОЕ, a Del - 25 КОЕ. Проведенные эксперименты позволили нам отобрать наиболее перспективный в качестве кандидата в вакцинные штаммы клон Y. pestis EVAlpxM, индекс иммунитета которого был в три раза выше, чем у исходного вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Этот клон использовали для подтверждения мутации с помощью

структурного анализа ЛПС. Исследование масс-спектра ЛПС У. pestis EVAlpxM показало отсутствие остатка лауриновой кислоты в липиде А мутантного штамма и подтвердило, что бактериальные клетки штамма У. pestis EVA/prM продуцируют ЛПС, содержащий только •гетра - и пентаацильные варианты липида А. Следовательно, введенная нами мутация приводила к прекращению синтеза соответствующей ацшггрансферазы LpxM. Выбранный и предварительно охарактеризованный клон Y, pestis ЕV ЫрхМ использовали для сравнительной оценки эндотоксических и иммуногенных свойств и оценки его в качестве кандидата в вакцинные.

Изучение эндотоксических свойств ЛПС SlpxM мутанта вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ. Была оценена эвдотоксическая активность препаратов ЛПС, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV и его LpxM" мутанта - EVAIpxM.

Установлено, что все биологические эффекты ЛПС опосредуются цитокинами, наиболее значимым из которых является TNF-a [Beutler, Cerami, 1988; Dinarello, 1991]. Именно с повышенной концентрацией этого цитокина связывают основные проявления системных повреждений при поствакцинальных реакциях и эндотоксическом шоке. Свойства нокаутных мутантов грамотрицательных микроорганизмов с инактивированным геном IpxM были предметом многочисленных исследований [Шайхутдинова, 2008; Vorachek-Warren, 2002, d'Hautcville et al, 2002; Low et al., 1999; Somerville et al., 1999]. Во всех случаях подобные мутанты синтезировали ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

Полученные данные подтвердили, что модифицированный ЛПС слабее индуцирует синтез TNF-a макрофагами по сравнению с ЛПС «дикого типа». Использование клеток-мишеней различной видовой принадлежности позволило установить, что уменьшение эндотоксической активности мутантного ЛПС более выражено на человеческих, и менее - на мышиных клетках-мишенях (рис. 5).

-EVALpxM

1 10 1Ю 1000 ЛПС, НГ/ЫЛ

1 10 100 1000 ЛПС, нг/мп

Рисунок 5. Уровни TNF-вв супернатанте макрофагоподобных мышиных клеток J774.1A (А) и моиоцитарных клеток человека U937 (Б) после стимуляции препаратами ЛПС из штаммов Y. pestis EV НИИЭГ и EVAlpxM

Таким образом, моноциты человека были значительно более чувствительны к структурной модификации ЛПС по сравнению с мышиными макрофагами.

Выявленное различие провоспалительного ответа макрофагов разной видовой принадлежности на действие исходного и мутантного ЛПС, скорее всего, обусловлено разной специфичностью рецепторов к ЛПС у человека и мыши [Delude et al, 1995; Golenbock el al, 1991]

Данные, полученные на мышиной клеточной модели in vitro, согласовались с данными, полученными на мышах линии Balb/C. Внутрибрюшинное введение обоих препаратов ЛПС мышам, сенсибилизированным актиномицином Д, приводило к индукции синтеза TNF-а, уровни которого в сыворотке мышей после введения ЛПС исходного вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ достоверно превышали аналогичный показатель для препарата ЛПС EVAlpxM (рис. 6).

О 15мин 30мин 1ч 2ч Зч 4ч

-O- EVALpxM —О— Evwnsr

Рисунок 6. Концентрация ТЭТ-а в сыворотке крови актимицнн Д-сеисибиллизированиых мышей после внутрибрюшинного введения препаратов ЛПС, выделенных из штаммов К рейи ЕУД/рсД/ и ЕУ НИИЭГ

Определение ЬО^о для ЛПС родительского и мутантного штаммов У. рез№ ЕУ показало, что делеция гена 1рхМ приводит к пятикратному снижению токсичности ЛПС, синтезируемого мутантными бактериальными клетками, для мышей (табл. 1).

Таблица 1. Токсичность препаратов ЛПС для десенсибилизированных и сенсибилизированных актиномицнном Д Ва1Ь/С мышей

Источник ЛПС LD50 (пределы колебаний)

Несенсибилизированные мыши Сенсибилизированные акти-номицином Д (10 мкг/мышь)

Y. pestis EV НИИЭГ 129,7 (32,6-516,2) 2,5 (0,6-9,8)

Y. pestis ЕУД/рхА/ 648,3 (205-5149,3) 12,3(3,1-49,1)

Таким образом, результаты экспериментов in vivo коррелировали с данными экспериментов на клеточных культурах, что позволяет говорить о валидности данных, полученных in vitro.

Изучение биологических свойств штамма Y. pestis EV&lpxM в экспериментах на животных моделях. Оценка безвредности этого клона продемонстрировала снижение его токсических свойств для белых мышей линии Balb/C и беспородных мышей по сравнению с исходным штаммом EV НИИЭГ. Иммунизация мышей мутантным штаммом EVÁlpxM не вызывала гибели животных при подкожном введении его в дозах от 102 до 107 КОЕ, тогда как введение эталонного штамма EV НИИЭГ в дозах 10s и 107 КОЕ на мышь приводило к гибели 10-40 % животных (табл. 2). У всех павших мышей из органов (мозг, селезенка, легкие, печень, лимфоузлы) и крови выделялась чистая культура Y. pestis EV НИИЭГ, уровень обсемененности селезенки и крови достигал 108 КОЕ.

Таблица 2. Безвредность вакцинного штамма К. рег/м ЕУ НИИЭГ и его ЬрхМ~~ варианта для мышей.__

Иммунизирующая доза (КОЕ) Ва1Ь/С беспородные

Вакцина Число погиб- Число погиб-

ших/общее ших/общее

2х102 0/10 0/10

У. резн% ЕУ НИИЭГ 10' 0/10 0/10

10* 0/10 0/10

10* 0/10 1/10*

10' 4/10* 3/10*

2х 102 0/10 0/10

У. ЕУД/рдгА/ 10*" 0/10 0/10

10' 0/10 0/10

10ь 0/10 0/10

10' 0/10 0/10

* выделена культура У. рез№ ЕУ НИИЭГ Определение показателей персистенщш клеток вакцинного штамма У. рея/и в органах мышей позволяет оценить перспективы развития вакцинального процесса. Уровень обсеме-нснности регионарных лимфоузлов мышей, иммунизированных мутантным цггаммом У. резШ ЕУД 1рхМ, в первые сутки после вакцинации был достоверно выше, чем обсеменен-ность лимфоузлов мышей, которым вводили бактериальные клетки родительского штамма (табл. 3). Вес регионарных лимфоузлов у мышей, иммунизированных мутантным штаммом, на вторые и третьи сутки после вакцинации был достоверно ниже, чем у мышей, иммунизированных исходным штаммом ЕУ.

Таблица 3. Вес и обсемененность органов мышей после подкожного введения иггамма-

Дни Лимфоузлы Селезенки

Штамм У.раШ после заражения Средний вес, мг КОЕ/г органа Средний вес, мг КОЕ/г органа

1 52,4 ±15,9 3,6 ±0,2* 150,5 ±26,3 3,0 ±0,3

2 74,6 ±13,3* 4,1 ±0,1 125,7 ±15,9 3,4+1,0

ЕУ НИИЭГ 3 72,3 + 13,8* 3,8 ±0,5 106,4 ±19,9 3,9 ±0,4

4 51,9 ± 11,3 3,3 ±0,2 130,7 ±27,6 4,4 ±0,2

5 44,7 ±9,7 0 121,8 + 12,1 0

6 42,9 ±8,1 0 118,4 ±13,1 0

1 38,3 ± 7,8 4.2 ±0.3* : 154,3 ±75,3 2,7+0,5

2 40,8 ± 12.4* 4,1 ±0,2 134,0 ±21,6 3,6 ±0,4

ЕУ А!рхМ 3 42,9+10,4* 4,2 ±0,4 116,7 ±22,2 3,7 ±1,0

4 46,6 ± 12,6 3,4 ±0,2 109,7 ± 7,4 4,4 ±0,3

5 40,7 ±5,8 0 98,2 ±11,7 2,9 ±0,2

6 32,4 ±2,3 0 96,8 ±9,4 0

* различия между группами статистически достоверны (р < 0,05) Было показано, что уменьшение воспаления в лимфоузлах сопровождалось увеличением приживаемости и размножения в них бактериальных клеток муганпюго штамма У. рел/ц.

Одной из важнейших характеристик иммуногенности вакцинных штаммов является их антигенносгь. Для оценки антигенных свойств 1рхМмутанта вакцинного штамма Г. резИх была изучена его способность индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей. Титры антител к двум основным протективным антигенам У. резИя - Р1 и V - были определены в сыворотках мышей Ва!Ь/С на 21 сутки после однократной иммунизации штаммами У. рел/и ЕУ линии НИИЭГ и ЕУД/рхМв дозе 107 КОЕ (табл. 4).

Таблица 4. Реципрокные титры к антигенам в сыворотках мышей, иммунизированных штаммами К рейм ЕУ линии НИИЭГ и ЕУЫрхМ.__

Штаммы Y. pestis Средний титр ± доверительный интервал (разброс значений ипров в группе)

F1 V

EV линии НИИЭГ 1066,7 (800-1600) 133,3 (100-200)

EVAlpxM 10666,7 (6400-12800) 1066,7 (800-1600)

При одинаковой дозе иммунизации штамм Y. pestis VMAlpxM индуцировал у мышей существенно более высокий уровень гуморального иммунного ответа на иммунодоминант-ные антигены Y. pestis по сравнению с родительским штаммом EV НИИЭГ (табл. 4). Таким образом, мугантный штамм Y. pestis EVAlpxM по своим антигенным свойствам оказался существенно превосходящим родительский штамм EV НИИЭГ.

Заключительным этапом исследований было изучение протективных и иммуногенных свойств полученного штамма Y. pestis EVAlpxM в сравнении с родительским штаммом.

Согласно МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба» [2002], испытуемый вакцинный штамм У. pestis должен предохранять белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в той же или большей степени, что и эталонный штамм EV НИИЭГ, и индуцировать формирование у животных напряженного и длительного иммунитета.

¡Троте ктивная способность штамма определяется его иммуногениосгью, которая в свою очередь оценивалась по величине ED50 (рис. 7). Делеция гена IpxM приводила к снижению показателя ED50 для мутантного штамма У. pestis EVAlpxM в 2,5 раза, что свидетельствует о повышении его иммуногенности.

4000 3500 -3000 -2500 --

I

Y. pestis ЕУНИИЭГ У. pestis EV Д1р\М

Рисунок 7. ED50 вакцинного штамма К pestis EV НИИЭГ и Е\blpxM для мышей линии Balb/C при последующем заражении клетками вирулентного штамма Y. pestis 231

в дозе 200 Del

Напряженность иммунитета определялась по способности исследуемого вакцинного штамма предохранять животное от гибели после заражения массивной дозой вирулентной культуры У. pestis и оценивалась по LD50 для мышей, иммунизированных ДО4 КОЕ исследуемого вакцинного штамма Y. pestis, а также индексу иммунитета (табл. 5).

Напряженность иммунитета, создаваемого культурой испытуемого вакцинного штамма, превышала аналогичный показатель, полученный на животных, иммунизированных культурой вакцинного штамма EV в четыре раза

Таким образом, исследования подтвердили, что делеция гена IpxM, приводит к снижению эндотоксической активности ЛПС и остаточной вирулентности бактериальных клеток Y. pestis EV. При этом иммуногенностъ и протекгивность мушгшого штамма EVAlpxM возрастает.

Таблица 5. Показатели напряженности иммунитета для мышей линии Ва1Ь/С, вакци-

Иммунизирующий штамм LD5o (КОЕ) У. pestis 231 Индекс иммунитета

Y. pestis EVAIpxM 10s 5 х 107

У. pestis EV НИИЭГ 2,5 х 10' 1,25 х 107

Суммируя все полученные данные, можно заключить, что полученный нами штамм У. pestis ЕЧЫрхМ по своим культурально-морфологическим свойствам не отличались от исходного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ, обладал меньшей остаточной вирулентностью для мышей по сравнению с родительским штаммом У. pestis EV НИИЭГ. Мутантный штамм был способен к более эффективному размножению в лимфоузлах по сравнению с родительским штаммом, но при этом вызывал менее выраженное воспаление. Считается, что более выраженная остаточная вирулентность вакцинного штамма обеспечивает формирование более эффективного противочумного иммунитета. Однако в наших исследованиях иммунизация мугантным штаммом У. pestis EVAlpxM приводила к индукции более высокого специфического антительного ответа на иммунодоминантные антигены У. pestis F1 и V по сравнению с исходным штаммом У. pestis EV НИИЭГ. Кроме того, штамм У. pestis EVAIpxM предохранял белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в 2,5 раза более успешно по сравнению с эталонным штаммом EV НИИЭГ и индуцировал у животных формирование более напряженного иммунитета.

Продукция TNF-a макрофагами человека и мыши после стимуляции их ЛПС из У. pestis Е\AIpxM была значительно ниже по сравнению с продукцией TNF-a, индуцированной ЛПС родительского штамма EV НИИЭГ. Снижение воспалительного ответа макрофагов на этапе внедрения инфекции позволяет бактериальным клеткам мутантного штамма EVAIpxM успешнее преодолевать фагоцитарный барьер и диссеминироватъ в организме, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протекгивного иммунитета.

Следует отметить, что различие в способности к стимуляции продукции TNF-a между ЛПС эталонного вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ и ЛПС его LpxM" варианта было гораздо более выражено на человеческих моноцитах по сравнению с мышиными макрофагами. Поскольку данные по эндотоксической активности мутантного ЛПС полученные в экспериментах in vitro на клеточных культура, коррелировали с данными экспериментов in vivo, нельзя не согласиться с мнением C.B. Дентовской с соавт. [2006] - "принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липидаА могут вызывать эндотоксические эф-

фекты разнонаправленного действия у человека и мыши или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков, можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реакгогенности будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных".

Перспективным направлением дальнейших исследований может быть получение AlpxM мутантов на основе других высокоиммуногенных штаммов У. pestis, аттенуированных за счет делении существенных для вирулентности генов, несвязанных с pgm локусом, отсутствующим у вакцинного штамма EV. Разработанный способ мутагенеза гена IpxM делает возможным получение подобных мутантов У. pestis на основе любых родительских штаммов чумного микроба.

Выводы

1. Разработан способ для контролируемого конструирования лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов У. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реакгогенностью. Методическая схема включает в себя: прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner [2000] в клетках Y.pestis, переклонирование мутантной аллели AIpxM::cat в суицидный вектор pCVD442 в клетках Е. coli, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику в клетках У. pestis. Разработанные методические подходы могут быть легко адаптированы для других грамотрицательных бактерий.

2. Подтверждена корректность проведения сайт-направленного мутагенеза с помощью секвенирования сконструированной аллели гена IpxM, определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным пгтаммом У. pestis EVAIpxM, а также изучения основных фенотипиче-ских характеристик сконструированного штамма.

3. Впервые доказано, что «феномен переживания» H.H. Гинсбурга [1969] пригоден для оценки иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба не только с высокой, но и со сниженной "остаточной вирулентностью".

4. Подтверждено, что созданный на основе вакцинного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a.

5. Показано, что степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом У. pestis EV AlpxM значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.

6. Впервые показано, что снижение "остаточной вирулентности" штамма У. pestis EV AlpxM не приводит к уменьшению эффективности вакцинации, но, напротив, сопровождается повышением его иммуногенности.

Список, опубликованных работ по теме диссертации.

1. Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina Е.Р., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A.. Lindner В., Kondakova A.N., Kocharo-va N.A., Senchenkova S.N., Hoist 0., Pier G.B., Knirel Y.A., Motin V.L. Yersiniapestis live vaccine with improved characteristics // Procedia in Vaccinology. - 2009. - V 1 (1). - P 97-100.

2. Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A.. Lindner В., Kondakova A.N., Bystrova O.V., KocharovaN.A., Senchenkova S.N., Hoist O., Pier G.B., Knirel Y.A., Anisimov A.P., Motin V.L. Pleiotropic effects of the IpxM mutation in Yersinia pestis resulting in modification of the biosynthesis of major immunoreactive antigens // Vaccine. - 2009. - V 27. - P. 2240-2250

3. Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner В., Kondakova A.N., Bystrova O.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Hoist O., Pier G.B., Knirel Y.A., , Motin V.L. Development of new generation of plague vaccines with improved safety and immunity // Abstracts of the 1st annual Biosafety Association for Central Asia and Caucasus conference "Biosafety and Bacterial-Viral Zoonotic Diseases" (May 18-20, 2009, Almaty, Kazakhstan). Almaty: BACAC, 2009. P. 85.

4. Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A.. Lindner В., Kondakova A.N., Pier G.B., Knirel Y.A., Motin V.L. A live plague vaccine candidate with improved safety and immunogenisity // Abstracts of the 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (October 25-29, 2009, Eilat, Israel). Ness-Ziona: Institute for Biological Research, 2009, p. 35

5. Панькина JI.H., Федорова B.A., Савостина Е.П., Саяпина Л.В., Дентовская С.В., Шайхутдинова Р.З., Агеев С.А.. Линднер Б., Кондакова А.Н., Комарова H.A., Сенченкова С.Н., Книрель Ю.А., Мотин В.Л. Модификация синтеза липополисахарида (ЛПС) и иммуно-доминантных антигенов ДIpxM мутанта Yersinia pestis EV НИИЭГ, индуцирующего повышенный уровень иммунитета к чуме у мышей и морских свинок // Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.). - Санкт-Петербург, 2008. - С. 98.

6. Агеев С.А.. Шайхутдинова Р.З., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Конструиро вание варианта вакцинного штамма Yersinia pestis со сниженной ре акгогенностью // Материалы шестой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10-11 ноября 2009 г.), Москва, 2009, стр. 29.

7. Агеев СЛ.. Шайхутдинова Р.З., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Дентовская C.B., Анисимов А.П. Изучение иммуногенности LpxM-отрицательных вариантов вакцинного штамма Yersiniapestis EV линии НИИЭГ с помощью «феномена переживания» при экспериментальной чуме // Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.) Оболенск, 2010, стр. 255-257.

8. Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina Е.Р., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A.. Lindner В., Kondakova A.N., Hoist O., Pier G.B., Knirel Y.A., Anisimov A.P., Motin V.L. A live plaque vaccine candidate with improved safety and immunogenicity // The challenge of highly pathogenic microorganisms: Mechanisms of virulence and novel medical countermeasures. Shafferman A., Velan В., Ordentlich A. (Eds.) 1st Edition, 2010, XVIII, 261-268. DOI: 10.1007/978-90-481-9054-6_28

Список сокращений и условных обозначений

ГНЦ ПМБ - Государственный научные центр прикладной микробиологии и биотехнологии

ИИ - индекс иммунитета

ИФА- иммуно-ферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛПС - липополисахарид

МЖК - музей живых культур

м.к. - микробная клетка

мкг - микрограмм

MC - масс-спектрометрия

нг - нанограмм

ПЦР - полимеразная цепная реакция ЯРМ - ядерный магнитный резонанс Арад - чувствительность (устойчивость) к ампициллину

- чувствительность (устойчивость) к хлорамфекиколу cat - ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу Del - абсолютно летальная доза (dosis certa letalis)

ED50 - наименьшее количество микробов, способных индуцировать формирование специфического иммунитета, обеспечивающего выживание 50 % животных, вакцинированных этой дозой и зараженных на 21-е сутки 200 Del вирулентного штамма Y. pestis Fl - капсульный антиген - "фракция I" (fraction I) FRT - Flp -recombinase target site -сайты распознования Flp-рекомбиназы LB - среда Luria-Bertani

LDjo - доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50)

IpxM - ген, отвечающий за включение КДО-зависимой ацшпрансферазой остатков лауриновой кислоты к глюкозаминовым единицам посредством образования сложноэфир-ных связей с гидроксильными группами остатков ß-гидроксимиристиновых кислот в Е. coli

LpxM - миристоилтрасфераза Escherichia coli (у Y. pestis и Yersinia pseudotuberculosis - лаурилтрасфераза

SucS(R) - чувствительность (устойчивость) к сахарозе TNF-a- фактор некроза опухолей-альфа (tumor necrosis factor-a) V - антиген Y. pestis

Благодарности

Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору А.П. Анисимову и к.м.н Дентовской C.B. за неизменно высокий интерес и огромную помощь в формировании научной концепции работы.

Приношу благодарность всем членам ученого совета, а также моим научным рецензентам Е. А. Панферцеву и Н. К. Фурсовой за глубокую проработку моей диссертационной работы и ценные замечания, которые будут учтены при проведении дальнейших исследований.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность Бахтеевой И.В., Шайхутдиновой Р.З., Комбаровой Т.И., Титаревой Г.М., Кравченко Т.Б., а также всем моим соавторам и сотрудникам ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

Подписано в печать:

16.09.2010

Заказ № 4119 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Агеев, Сергей Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Молекулярные механизмы патогенеза чумы

1.2 Особенности формирования специфического иммунитета при чуме

1.3 Чумные вакцины

1.3.1 Краткая история вакцинопрофилактики чумы

1.3.2 Коммерческие чумные вакцины

1.3.3 Основные направления конструирования чумных вакцин нового поколения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование аттенуированных штаммов Yersinia Pestis с пониженной реактогенностью"

Актуальность проблемы

За двести лет своего существования вакцинология достигла поразительных успехов - возбудитель оспы сохранился только в коллекциях двух лабораторий, заболеваемость целым рядом инфекций (полиомиелит, дифтерия и др.) удалось снизить до такой степени, что можно также надеяться на их полное искоренение, а сотни опаснейших болезней взяты здравоохранением под контроль благодаря классическим вакцинам, полученным методами инактивации и аттенуации. Способы получения вакцин с тех пор значительно изменились. Сегодня развитие методов молекулярной биологии, генной медицины, органической химии и иммунологии позволяет выделять очищенные нативные и получать синтетические антигены, направленно конструировать продуценты рекомбинантных протективных антигенов с заданными свойствами на основе технологичных штаммов бактерий или высших растений ("съедобные вакцины") и прецизионно аттенуированные мутанты и живые векторы на основе бактерий и вирусов, экспрессирующих протективные антигены in situ; использовать ДНК, РНК и полисахариды для индукции запрограммированного релевантного иммунного ответа [27; 127; 181].

Основные требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам, включают: безупречный уровень безопасности для всех слоев населения, в том числе лиц с измененной иммунной реактивностью (младенцы, беременные, пожилые, лица с нарушениями иммунного статуса); создание напряженного и долгосрочного уровня защиты, развивающегося не позднее чем через 2-3 недели после однократного введения вакцинного препарата; безынъекционный способ введения в организм (через рот, нос, слизистые); возможность комбинирования с другими вакцинами; устойчивость к внешним воздействиям и отсутствие специальных требований для хранения; и, наконец, экономичность и простоту изготовления [127]. Однако до сих пор не существует "идеальной вакцины", полностью соответствующей всем перечисленным требованиям. Большинство вакцинных препаратов обладает лишь частью из этих характеристик, и каждый из них имеет свои недостатки и ограничения.

В последние годы наибольшее внимание в разработке препаратов для вакцинопрофилактики чумы уделяется созданию субъединичных вакцин, содержащих лишь протективные антигены и неспособных вызывать инфекционный процесс даже у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако и они не являются идеальными, т.к. слабо индуцируют клеточное звено иммунитета и не могут предохранять от гибели после заражения штаммами, полностью утратившими способность к продукции антигена, используемого для иммунизации, либо продуцирующими серовары антигена, нераспознаваемые поствакцинальным иммунитетом. Так, чумные субъединичные вакцины на основе капсульного антигена F1 не способны стимулировать формирование напряженного поствакцинального иммунитета в отношении вирулентных бес-капсульных штаммов Y. pestis, а препараты на основе V антигена неэффективны в отношении штаммов, продуцирующих серологически отличающиеся варианты белка [48]. В то же время, применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного G. Girard'oM и J. Robic'oM в начале 30-х годов прошлого столетия [100] штамма Y. pestis EV лишена этих недостатков — она не только стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет, но и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [1]. Однако следует признать, что на настоящий момент эта вакцина морально устарела, прежде всего, из-за ее высокой реактогенности и способности вызывать тяжелые местные и системные реакции у здоровых вакцинируемых и даже генерализованный инфекционный процесс у лиц со сниженным иммунным статусом [29; 138; 154]. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины является одной из важных задач современной системы противочумной защиты населения.

Сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструированы мутанты вакцинного штамма EV с нарушенным синтезом лауриновой кислоты, в которых центральная часть гена IpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [47]. В серии экспериментов на мышах [47; 89] и морских свинках [89] было установлено, что IpxM мутант по сравнению с исходным вакцинным штаммом не только снизил реактогенность, но и обладал повышенной иммуногенностью. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости. Конструирование IpxM мутанта вакцинного штамма EV, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, позволит получить кандидат в вакцинные штаммы Y pestis - основу для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью и повышенной иммуногенностью.

Цель исследования — разработка способа конструирования кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба с пониженной эндотоксической активностью: получение A IpxM производных вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и оценка их в качестве кандидатов в вакцинные штаммы.

Задачи исследования:

1. Разработать способ конструирования IpxM мутантов Y. pestis, лишенных маркеров лекарственной устойчивости, и получить AlpxM вариант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ.

2. Подтвердить корректность введенной мутации с помощью секве-нирования сконструированной аллели гена IpxM и определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом.

3. Провести сравнительную комплексную оценку эндотоксических свойств препаратов ЛПС, синтезируемых родительским и мутантным штаммами.

4. Оценить биологические свойства кандидата в вакцинные штаммы, включая реактогеннось, безвредность и иммуногенную активность, в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.1113-02 "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба".

Научная новизна.

Впервые сконструирован и охарактеризован в соответствии с методическими указаниями "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба" [4] A IpxM вариант вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости. Установлено, что степень снижения токсичности ЛПС Y. pestis, утратившего шестой жирно-кислотный остаток, зависит от видовой принадлежности клеток — мишеней макроорганизма. Выявлено антагонистическое действие мутантного пен-таацильного ЛПС по отношению к ЛПС дикого типа на модели человеческих, но не мышиных фагоцитирующих клеток. Впервые показано, что повышение иммуногенности штамма может сопровождаться снижением его "остаточной вирулентности"

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих A IpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner [78], клонирование мутантной аллели AIpxMv.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы: штамм Е. coli DH5- Xpir/pCVD442-AlpxM\\cat (per. номер B-6512), продуцирующий суицидный вектор pCVD442-АIpxMv.cat, штамм Е. coli SI7- Xpir/pCVD442-AlpxM::cat (per. номер B-6511), предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора в штаммы чумного микроба. Причем сконструированный штамм может использоваться как донор при создании новых кандидатов в вакцинные штаммы на основе любых аттенуированных штаммов Y. pestis.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонирован авторский штамм Y. pestis EVAIpxM (per. номер B-6513), сочетающий делецию гена IpxM с отсутствием маркеров лекарственной устойчивости (федеральный уровень внедрения).

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций по изучению ингибирующего действия препаратов модифицированного ЛПС Y. pestis на индукцию синтеза TNF-or эукариотиче-скими клетками. (Оболенск, 2010, учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis — кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.

2. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчи-вости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. Снижение провоспалительной активности ЛПС штамма Ypestis EVA IpxM проявляется в большей степени на моноцитах человека и в меньшей степени на макрофагах мыши.

3. Уменьшение реактогенности (остаточной вирулентности) штамма Ypestis EVAlpxM сопровождается повышением его иммуногенности.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦПМБ по Государственным контрактам № 124-Д от 11.06.2009 г. и № 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (Eilat, Israel, October 25-29, 2009,); VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10-11 ноября 2009); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010); Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 8 сентября 2010 года.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях (включая 2 статьи в международных научных журналах реферируемых ISI и 1 главу в международной монографии) список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на. 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 42 работы отечественных и 173 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Агеев, Сергей Андреевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ контролируемого конструирования лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis — кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью. Методическая схема включает в себя: прямой сайт-направленный мутагенез по методике К.А. Datsenko и B.L. Wanner в клетках Y. pestis, переклонирование мутантной аллели AIpxMv.cat в суицидный вектор pCVD442 в клетках Е. coli, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику в клетках Y.pestis. Разработанные методические подходы могут быть легко адаптированы для других грамотрицательных бактерий.

2. Подтверждена корректность проведения сайт-направленного мутагенеза с помощью секвенирования сконструированной аллели гена IpxM, определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis

EVA IpxM, а также изучения основных фенотипических характеристик сконструированного штамма.

3. Впервые доказано, что «феномен переживания» Н.Н. Гинсбурга [1969] пригоден для оценки иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба не только с высокой, но и со сниженной "остаточной вирулентностью".

4. Подтверждено, что созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену IpxM, лишенный маркеров ан-тибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a.

5. Показано, что степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM, значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.

6. Впервые показано, что снижение "остаточной вирулентности" штамма Y. pestis EVAlpxM не приводит к уменьшению эффективности вакцинации, но, напротив, сопровождается повышением его иммуногенности.

Очевидно, что блокирование раннего (врожденного) иммунного ответа макроорганизма имеет решающее значение для патогена, так как дает ему возможность адаптироваться и начать успешную интервенцию макроорганизма. Поэтому стратегия Y. pestis при внедрении в теплокровный организм, заключающаяся в модификации своей клеточной стенки на менее "узнаваемую" макрофагами, является абсолютно логичной. Однако для "переодевания", то есть для перехода на синтез менее ацилированных форм липидаА чумному микробу требуется некоторое время для запуска температуро-зависимых регуляторных механизмов. В то время как мутантный по гену IpxM штамм У. pestis с его независимым от температуры перманентным синтезом менее ацилированного липида А не нуждается в подобной lag-фазе, поэтому он с момента попадания в макроорганизм более надежно по сравнению с родительским штаммом прикрыт от рокового внимания фагоцитов. В свете этого механизма повышение иммуногенности менее реактогенного штамма EVAlpxM абсолютно укладывается в. схему, поведения Y. pestis в организме теплокровных животных. Способность мутантного штамма благодаря синтезу пентаацилированного ЛПС снизить агрессивность макрофагов на этапе внедрения позволяет ему несколько успешнее, чем исходному штамму размножиться внутри них и диссеминировать по организму, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протективного противочумного иммунитета. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что нынешнее столетие называют временем господства вирусов, когда наибольшую эпидемическую опасность для населения представляют вирусные инфекции, чума продолжает оставаться одной из немногих бактериальных инфекций, которая до сих пор представляет глобальную угрозу для человечества, благодаря своей способность к молниеносному течению и распространению в случае перехода ее во вторичную легочную форму. Эпидемические вспышки чумы продолжают регистрироваться ежегодно. Применяемая в Российской Федерации живая чумная вакцина, разработанная в 30-40-е годы прошлого столетия [29], до сих пор является наиболее надежным средством защиты от этой опаснейшей бактериальной инфекции. Однако применение чумной вакцины сопровождается достаточно большим количеством случаев поствакцинальных осложнений, обусловленных ее высокой реактогенностью. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины при полном сохранении ее протективных свойств остается задачей, актуальной для российского здравоохранения.

Биологической основой реактогенности живых вакцин на основе гра-мотрицательных бактерий является входящий в их состав эндотоксин (ЛПС). Поскольку на данный момент многочисленными исследованиями установлено, что токсичность ЛПС определяется степенью ацилирования липида А, то одним из способов снижения его токсичности является генно-инженерная модификация ЛПС, заключающаяся в нарушении последнего этапа ацилирования липида А и обеспечивающая образование пентаацильных. молекул ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

Ранее сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструирован штамм ЫрхМ\\кап - производный,вакцинного штамма EV линии НИИЭГ с нарушенным присоединением лауриновой кислоты, в котором центральная часть гена IpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [47]. В серии предварительных экспериментов было показано, что снижение его токсичности сопровождалось повышением протективной активности [40; 47; 87; 89], что давало основание рассматривать аттенуированные IpxM мутанты чумного микроба в качестве кандидатов в вакцинные штаммы. Поскольку присутствие в геноме EVAIpxMwkan маркера лекарственной устойчивости не позволяло нам использовать ранее полученный штамм в качестве основы для живой вакцины, в рамках настоящего исследования была разработана технология получения мутантных по гену IpxM штаммов Y. pestis, лишенных генов лекарственной устойчивости. Конструирование LpxM" варианта штамма

Y. pestis EV заключалось в инактивации гена IpxM с помощью замены его на кассету устойчивости к антибиотику и последующем удалением кассеты из хромосомы. С помощью сайт-направленного мутагенеза на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нами были получены клоны с делети-рованным геном IpxM, лишенные генов антибиотикоустойчивости.

По своим культурально-морфологическим свойствам сконструированные IpxM мутанты не отличались от исходного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ. Верификация мутаций методом ПЦР (у всех ЫрхМ штаммов) и сек-венирования (у выбранного для дальнейших исследований клона) подтвердила делецию гена IpxM. Предварительная оценка иммуногенных свойств мутантных LpxM" клонов с использованием «феномена переживания» [13] показала, что их способность индуцировать протективный противочумный иммунитет различна, что, вероятнее всего, связано с неидентифицированны-ми мутациями вне гена IpxM. Клон Y. pestis EVA IpxM, продемонстрировавший максимальный уровень защиты белых мышей от заражения чумой, был отобран в качестве кандидата в вакцинные штаммы. Исследование масс-спектра ЛПС Y. pestis EVA IpxM показало отсутствие остатка лауриновой кислоты в липиде А мутантного штамма Y. pestis EVAlpxM и подтвердило, что введенная нами мутация приводила к прекращению синтеза соответствующей ацилтрансферазы LpxM. Полученный и предварительно охарактеризованный штамм Y. pestis EVAlpxM использовали для сравнительной оценки эндотоксических и иммуногенных свойств и оценки его в качестве кандидата в вакцинные. Продукция TNF-а макрофагами человека и мыши после стимуляции их пентаацильным ЛПС из мутанта Y. pestis EVA IpxM была значительно ниже по сравнению с продукцией TNF-et; индуцированной ЛПС родительского штамма EV НИИЭГ. Сравнение данных, полученных на человеческих и мышиных иммунокомпетентных клетках показало, что различие в способности к стимуляции продукции TNF-a между ЛПС эталонного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и ЛПС его LpxM-негативного варианта было гораздо более выражено на человеческих моноцитах по сравнению с мышиными макрофагами.

Более того, в экспериментах in vitro при совместном введении с полноценным ЛПС дикого типа пентаацилированный липид А выступал в качестве антагониста секреции TNF-a, когда тестировался с моноцитами человека, но являлся агонистом для мышиных фагоцитов. Данные отличия связывают с различной специфичностью к ЛПС рецепторов у человека и мыши [79; 101], которая, в свою очередь, вероятнее всего обусловлена разной чувствительностью мыши и человека к ЛПС Y. pestis и особенностям иммуногенеза [36; 37; 51; 69]. Существует мнение, что оптимальная для клеточной активации структура липида А не аналогична оптимальной структуре для связывания с клеточной мембраной, которая представляет собой просто дифосфорилиро-ванный дисахарид, имеющий минимум две жирные кислоты без какого-то специфического расположения. Структуры, которые очень хорошо связываются с клетками, не обязательно индуцируют сильное высвобождение моно-кинов, так как не всякое связывание индуцирует олигомеризацию TLR-4, которая необходима для дальнейшей трансдукции сигнала. Это является дополнительным свидетельством того, что эндотоксическая активность определяется количеством, структурой и распределением жирных кислот, то есть характером ацилирования липида А. Менее токсичные аналоги липида А в то же время могут являться более активными иммуностимуляторами [8]. Данные, полученные нами на мышиной клеточной модели in vitro, согласовались с данными, полученными на мышах линии Balb/C. После введения мышам ЛПС из родительского штамма Y. pestis EV НИИЭГ уровень сывороточного TNF-a у них достигал более высоких значений по сравнению с показателем сывороточного TNF-a мышей, обработанных ЛПС из LpxM клона Y. pestis EV. Кроме того, делеция гена IpxM приводила к пятикратному снижению токсичности синтезируемого мутантными бактериальными клетками ЛПС для мышей. Таким образом, результаты экспериментов in vivo коррелировали с данными экспериментов на клеточных культурах, что говорит о валидности данных, полученных нами in vitro на клеточных культурах.

Полученный нами штамм Y. pestis EVA IpxM обладал меньшей остаточной вирулентностью для мышей по сравнению с родительским штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Несмотря на это, мутантный штамм в первые сутки после заражения мышей был способен к более эффективному размножению в лимфоузлах по сравнению с родительским штаммом, но при этом вызывал менее выраженное воспаление. Отметим, что кинетика размножения в селезенке была сходна у мутантного и исходного штаммов Y. pestis. Считается, что более выраженная остаточная вирулентность вакцинного штамма обеспечивает формирование более эффективного противочумного иммунитета. Однако в наших исследованиях иммунизация мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM приводила к индукции более высокого специфического антительного ответа на иммунодоминантные антигены Y. pestis F1 и V по сравнению с исходным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Кроме того, штамм Y. pestis EVAlpxM предохранял белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в 2,5 раза более успешно по сравнению с эталонным штаммом EV НИИЭГ и индуцировал у животных формирование более напряженного иммунитета. По нашему мнению, синтез пентаацильного ЛПС приводит к модификации клеточной стенки бактерии на менее "узнаваемую" макрофагами, что снижает их воспалительный ответ на этапе внедрения инфекции и позволяет кандидату в вакцинные штаммы успешнее преодолевать фагоцитарный барьер и диссеминировать по организму, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протективного иммунитета. Завершая обсуждение наших исследований, нельзя не согласиться с мнением С.В. Дентовской с соавт. [16] - "принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липида А могут вызывать эндотоксические эффекты разнонаправленного действия у человека и мыши или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков, можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реактогенности будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных".

Развитие генной инженерии, позволяющей манипулировать с отдельными генами, значительно расширило возможности реорганизации микробных геномов. Перспективным направлением дальнейших исследований может быть получение A IpxM мутантов на основе других высокоиммуногенных штаммов Y.pestis, прецизионно аттенуированных за счет делеции существенных для вирулентности генов, не связанных с pgm локусом, отсутствующим у вакцинного штамма EV. Особенный интерес могут представлять эксперименты со снижением эндотоксической активности штаммов Y.pestis, лишенных способности синтезировать липопротеин. Делеция гена nlpD, отвечающего за синтез NlpD-липопротеина, приводила к неспособности Г. pestis колонизировать организм мышей. Показано, что A nlpD мутант обладал на два порядка большей протективностью, чем вакцинный штамм EV [190]. Разработанная нами методика мутагенеза гена IpxM делает возможным получение необходимых мутантов Y.pestis на основе любых родительских штаммов чумного микроба.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агеев, Сергей Андреевич, Оболенск

1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекул. Генетика. 2002а. - № 3. - С. 3-23.

2. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекул, генетика. 20026. - № 4. - С. 3-11.

3. Анисимова Т.И., Саяпина Л.В., Сергеева Г.М. Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: МУ 3.3.1.1113-02. Саратов, 20021

4. Анисимова Т.И., Свинцова Е.М. «Феномен переживания» при чуме у морских свинок и испытание безвредности новых вакцинных штаммов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1976. -№47.-С. 32-35.

5. Апарин Т.И., Вершинина Т.И. Способ определения степени иммуно-генности авирулентных штаммов чумного микроба // 1986. — Авторское свидетельство SU 1100304 А.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях II — Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. С. 85-104.

7. Беспалова И. А., Пустовалов В. Л., Львов В. Л:, Вернер И.К., Васильева Г.И. Получение и некоторые свойства модифицированного1 липопо-лисахарида Yersina pestis // Биотехнология. 1995. - № 910. - С. 31 -34.

8. Бывалов А.А., Паутов В.Н., Чичерин Ю.П., Лебединский В.А., Евстигнеев В.И. Эффективность ревакцинации павианов гамадрилов чумной живой сухой вакциной НИИС и фракцией 1 чумного микроба // Журн. микробиол. 1984. - № 4. - С. 74-76.

9. Вогачева Н.В., Дармов И.В., Борисевич И.В., Крючков А.В., Печенкин Д.В. Динамика показателей клеточного иммунитета на фоне введения чумной живой сухой вакцины // Клинич. лаб. диагн. 2009. - № 8. -С. 24-27.

10. Воробьев А.А., Лебединский В.А. Массовые способы иммунизации // Медицина, Москва, 1977. - 254 с.13