Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis

Платонов, Михаил Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis"

На правах рукописи

ПЛАТОНОВ Михаил Евгеньевич

Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis

03.02.03 - микробиология 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О СЕН 2010

Оболенск - 2010

004609693

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович; кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич; доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «20» октября 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховской р-н, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «20» сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Чума - острое инфекционное заболевание, относящееся к группе особо опасных карантинных инфекций. Возбудитель чумы, Yersinia pestis, - самый опасный из бактериальных патогенов. Чума была причиной трех пандемий и привела к гибели более 200 миллионов человек. Эта природно-очаговая инфекция передается укусами кровососущих насекомых - блох и циркулирует в популяциях диких грызунов, но при легочной форме может передаваться непосредственно от человека к человеку [Репу, Fetherston, 1997]. Помимо чумного микроба, род Yersinia включает в себя еще 14 видов [Souza et al., 2010], два из которых - У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica, вызывают у человека заболевания желудочно-кишечного тракта [Brubaker, 1991]. Данные молекулярно-биологических исследований указывают на то, что вид У. pestis произошел от У. pseudotuberculosis O.'lb серотипа [Skurnik et al., 2000] в последние 1500-20000 лет [Achtman et al., 2004]. Природные очаги чумы имеются на всех материках, кроме Австралии и Антарктиды, занимая 6-7 % территории земного шара [Репу, Fetherston, 1997]. На территории бывшего Советского Союза насчитывается 42 природных очага чумы, 11 из них - в Российской Федерации [Онищенко, Кутырев, 2004]. Следствием географической и физической разобщенности природных очагов, влияния различных биотических и абиотических факторов, явилась адаптация, в результате которой чумной микроб приспособился к циркуляции в популяциях более 200 видов диких грызунов и лагоморфов, используя около 120 видов блох в качестве переносчиков [Онищенко, Кутырев, 2004]. В процессе аллопатрического видообразования сформировались подвиды, различающиеся по своим питательным потребностям, способности ферментировать различные субстраты и вирулентности для чувствительных к ним млекопитающих. До недавнего времени вид У. pestis подразделяли на шесть подвидов: pestis, altaica, caucasica, hissarica, talassica и ulegeica [Anisimov et al., 2004]. По биохимической активности внутривидовые группы У. pestis делили натри биовара: antiqua, mediaevalis, orientalis [Devignat, 1951].

Для типирования У. pestis применяют как фенотипические, так и генетические методы. В основу фенотипических методов положены питательные потребности, способность ферментировать различные субстраты, и вирулентность для различных видов животных. Хотя фенотипические методы и позволяют различать подвиды и биовары У. pestis, с их помощью невозможно проводить дифференциацию на уровне штаммов. К тому же нестабильность проявления фенотипических признаков, их зависимость от условий эксперимента, а также наличие атипичных штаммов, существенно затрудняют интерпретацию результатов [Апарин, Голубинский, 1989; Anisimov et al., 2004].

В связи с этим, решающую роль в типировании чумного микроба, играют молекулярно-биологические методы. В разное время с этой целью использовали плазмидный скрининг [Ба-

лахонов, 1989; Filippov et al., 1990], определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов - RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) [Picard, 2000], риботапировапие [Guiyoule et al., 1994], IS-типирование [Бобров, 1995; Motin et al., 2002; Torrea et al., 2006], и PCR-фингерпринт. К методам PCR-фингерпринта относятся случайно амплифицированные полиморфные ДНК - RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA) [Huang et al., 2000], повторяющиеся эксграгенны палиндромы - REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic sequences) [Kim et al., 2003] и повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности эн-теробактерий ER1C-PCR (Enterobacterial Repetitive ¡ntergenic Consensus sequences) [Kingston J.J., et al., 2009]. Общими недостатками этих методов являются: низкая межлабораторная воспроизводимость, необходимость в большом количестве материала для исследования, сложность использования полученных результатов для создания совместимых баз данных.

Доступность полной нуклеотидной последовательности геномов микроорганизмов [Parkhill et al., 2001] послужила толчком для развития новых современных молекулярно-генетических методов. В настоящее время для генотипирования Y. pestis широко используют многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов - ML VA (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) [Klevytska et ai, 2001; Le Flèche et al., 2001], DFR-типирование - анализ отличающихся участков ДНК (Different Region), CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - кластеризованные короткие па-линдромные повторы, разделенные спейсерами) [Pourcel et ai, 2005]. SNP-типирование -анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (Single-Nucleotide Polymorphism) [Schork et al., 2000], полногеномный сиквенс [Eppinger et ai, 2010]. Данные методы лишены перечисленных выше недостатков и обладают высокой разрешающей способностью.

Активизация в конце XX века ряда природных очагов чумы Африки, Азии и Америки послужила причиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами данной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической обстановки [Оншцен-ко и др., 1998]. Не меняется эта тенденция и в начале XXI века [Онищенко, Кугырев, 2004]. Возрастание числа эпидемических проявлений чумы, наряду с возможностью перемещения авиатранспортом инфицированных У. pestis людей в течение нескольких часов с одного континента на другой, а также возрастающая опасность международного терроризма свидетельствуют об актуальности совершенствования молекулярно-эпидемиологических методов, направленных на генетическую паспортизацию штаммов Y. pestis из различных природных очагов, необходимую для выявления источников заражения и проведения адекватных лечебных и санитарно-эпидемиологических мероприятий. В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перепек-

тивных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов [Shangkuan et al., 1997; Sander et al., 1998], что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги чумы.

Изучение разнообразия и микроэволюции Y. pestis важно как для решения фундаментальных задач медицинской микробиологии, таких как выявление механизмов происхождения и эволюции инфекционных болезней человека и животных, так и для разработки новых высокоспецифичных методов молекулярной эпидемиологии, а именно идентификации, гено-и геномотипирования У. pestis. Генотипирование - один из наиболее эффективных и относительно недорогих методов, применяемых для целей паспортизации природных очагов, эпидемиологического расследования случаев заболеваний и экспертизы актов биотерроризма.

Цель исследования - изучение генетического разнообразия и микроэволюции чумного микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств методами DFR- и MLVA-типирования.

Задачи исследования:

1. Создать пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и МЬУА25-профилей) представительного набора штаммов Y. pestis, включающий данные, полученные в нашей лаборатории, лабораториях коллабораторов: Gilles Vergnaud (Université Paris-Sud, Institut de Génétique et Microbiologie, Orsay, France) и Ruiiu Yang (Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing, China), а также информацию о штаммах с доступными в Интернете полными последовательностями геномов.

2. Провести DFR-типирование штаммов Y. pestis', оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микроэволюции.

3. Провести многолокусный VNTR анализ штаммов Y. pestis, оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микрозвотоции; сравнить эффективность MLVA25- и DFR-типирования.

4. Подготовить предложения по дополнению внутривидовой таксономии Y. pestis и привидению ее в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.

Научная новизна. Обнаружено 60 новых DFR-генотипов и 352 новых MLVA25-генотипов штаммов чумного микроба. Установлено, что на территории одного природного очага чумы может циркулировать несколько DFR-, MLVA25- и DFR/MLVA25-renornnoB, входящих в единый генетический кластер. В то же время одинаковые DFR-типы могут вхо-

дить в состав разных MLVA25- и DFR/MLVA25-icnarrepoB, что свидетельствует о возможности гомоплазии по DFR-профилям. Циркуляция филогенетически близких MLVA25- и DFR/MLVA25-reH0THn0B на территориях смежных природных очагов свидетельствует о целесообразности их объединения. Так, Присеванский горный (5) и Зангезуро-Карабахский горный (6) очаги должны быть объединены в Нагорно-Закавказский (5/6), Бозчельский равнинно-предгорный (8) и Джейранчельский равнинно-предгорный (11) - в Бозчельско-Джейранчельский равнинно-предгорный (8/11), а к Горно-алтайскому очагу (36) - присоединены соответствующие территории Монголии. Кластеризация на основе DFR- и MLVA-профилей соответствует таковой при SNP-типировании, а сочетанный анализ результатов DFR- и MLVA-методов повышает их разрешающую способность и позволяет получать фи-лограммы, свидетельствующие о следующем порядке дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: У. pseudotuberculosis t Y. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) tY. pestis subsp. angola tY. pestis subsp. caucasica tY. pestis bv. intermedium tY. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) t Y. pestis bv. medievalis t Y. pestis bv. orientalis t Y. pestis subsp. ulegeica f Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

Практическая значимость и внедрение результатов работы. В GeneBank депонировано 8 последовательностей VNTR-локусов (международный уровень внедрения).

В коллекции микроорганизмов ГНЦ ПМБ депонирован набор из 10 штаммов Y. pestis - типовых для многолокусного VNTR анализа (федеральный уровень внедрения).

Создан постоянно пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и MLVA25, включающий на момент написания диссертации информацию о 601 штамме Y. pestis.

Установлено, что выделенные на территории Монголии штаммы подвида altaica входят в состав двух разных ветвей кластера talassica/qinghaiensis/xilingolensis/hissaricalaltaica, один из которых представлен штаммами близкими штаммам подвида altaica, циркулирующим на территории Горного Алтая в России. Второй кластер представлен штаммами подобными штаммам подвида xilingolensis, циркулирующим в L очаге на территории Китая. Необходима проверка штаммов подвида altaica в коллекциях учреждений, проводящих работы с возбудителем чумы для определения их действительного таксономического положения.

Изучение штаммов Y. pestis методами DFR- и MLVA-типирования рекомендовано нами в качестве одного га дополнительных критериев внутривидовой классификации возбудителя чумы.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении методических рекомендаций "Генотипирование штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного VNTR-анализа". Оболенск, 2009 (учрежденческий уровень внедрения). Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинского государст-

венного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ, а также при обучении современным методам генотипирования специалистов противочумных учреждений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов (электронный каталог, включающий информацию о DFR- и MLVA25-renonmax 601 штамма Y. pestis, а также методические рекомендации по проведению молекулярного типирования методом MLVA25) позволяет определять принадлежность штаммов чумного микроба к конкретным подвидам и биоварам, а также к природным очагам чумы: 1, 4, 5-7, 8/11, 9, 10, 31/33, 34, 36,37, 38, 39,40/М, 43, расположенным на территории стран СНГ.

2. Сочетание универсальной вирулентности со способностью ферментировать рамно-зу, а также ПРКУМЬУА25-профилъ, занимающий промежуточное положение между таковыми у представителей азиатской ветви bv. antiqua и кавказской группой штаммов bv. microtus, позволяет выделить штаммы, циркулирующие в очаге В Китая в новый внутривидовой таксон - биовар ¡ntermedium.

3. Сочетанное использование DFR/MLVA25-THrmpoBamM позволяет предложить следующий порядок дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: У. pseudotuberculosis t У. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Т У. pestis subsp. angola t У. pestis subsp. caucasica ÎY. pestis bv. intermedium t Y. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) t Y. pestis bv. medievalis T Y. pestis bv. orientalis t Y. pestis subsp. ulegeica t Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

4. Несоответствие правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий внутривидовой таксономии чумного микроба требует переименования биовара microtus в подвид microtus, а входящих в него в настоящее время филогенетических групп, а именно подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis - в биовары altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - К.М.Н. C.B. Дентовская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель -д.м.н., проф. А.П. Анисимов) и Госконтрактов № 119-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01890017743) и № 53-Д от 29.06.2010 г. с Роспотребнадзором (научный руководитель -д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с В.В. Евсеевой (ЛМЧ ГНЦ ПМБ). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали

участие сотрудники JIM4 ГНЦ ПМБ Е.В. Чиркова и Т.В. Гапельченкова. Всем им автор выражает глубокую благодарность. Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. С.В. Дентовской (ЛМЧ ГНЦ ПМБ) и дм.н., проф. А.П. Анисимова (ГНЦ ПМБ) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

2007); NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop "Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification" (Тбилиси, Грузия,

2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" (Оболенск, 2009); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней", посвященной 75-летию Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 2009); научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора "Современные технологии обеспечения биологической безопасности" (Оболенск, 2010); Ю41 International Symposium on Yersinia (Recife, Brazil, 2010); International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях (три статьи в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 39 работ отечественных и 102 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовано 176 штаммов Y.pestis, которые выращивали на агаре Хотгин-гера с добавлением 1 % гемолизированной крови в течение 48 ч при температуре 28 "С. Ге-

номную ДНК выделяли в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794 - 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-Й групп патогенности» с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК из биопроб производства НПФ «Литех».

В филогенетическом анализе также использовали данные по DFR- и МЬУА25-типам 403 штамма чумного микроба, предоставленные зарубежными коллабораторами: Gilles Vergnaud (Франция) и Ruifu Yang (Китай). Опубликованные полногеномные последовательности 22 штаммов чумного микроба, а так же штамма У. pseudotuberculosis IP32953 использовали для генотипирования методами мультилокусного VNTR анализа и DFR-анализа in silico.

DFR-анализ штаммов Y. pestis проводили, как описано ранее [Zhou et al., 2004b; Dai et al., 2005]. Полученные результаты вносили в базу данных программы Bionumerics 5.1. Для построения дендрограммы использовали метод Neighbor-Joining с коэффициентом Dice для бинарных данных. При построении дерева в качестве корневого вида использовали штамм Y. pseudotuberculosis IP32953. Для того чтобы определить DFR-генотипы профили исследованных штаммов сравнивали с профилями 32 геномоваров, выявленных ранее [Li et al., 2008].

MLVA25 типирование штаммов У. pestis проводили, как описано ранее [Le Fleche et al., 2001] в модификации [Li et al., 2009]. Полученные результата вносили в базу данных программы Bionumerics 5.1. Кластерный анализ выполняли с использованием метода Neighbor-Joining и категорического коэффициента. При построении дерева в качестве корневого вида использовали штамм Y. pseudotuberculosis IP32953.

Анализ и сравнение результатов полученных при использовании различных методов генотипирования проводили с помощью опции "composite data set" программы Bionumerics 5.1. О дискриминирующей способности методов DFR- и Ж,УА25-типирования по отдельности, а также сочетанного анализа DFR/MLVA25 судили по индексу разнообразия (Dm) Е.Н. Simpson'a [Simpson, 1949], рассчитанному, как было описано ранее [Hunter, Gaston, 1988].

Созданный и постоянно пополняемый электронный каталог штаммов У. pestis и их генотипов представляет собой электронную таблицу в формате Microsoft Excel. Вся информация по одному штамму представлена в ячейках одной строки (возможно внесение до 256 параметров): номер пггамма, видовое название, время выделения, место выделения/природный очаг, источник выделения/основной хозяин, подвид, биовар, а затем следуют ячейки с генотипами. При введении в таблицу данных генотипирования в первую ячейку вносят номер генотипа, а в последующие ячейки, число которых соответствует количеству анализируемых локусов, нумерические данные результатов исследований: для DFR-типирования - "1" или "0" при наличии или отсутствии амплификата, соответственно, а для MLVA - количество тандемных повторов в VNTR-локусе или "0" при отсутсвии амплификата. Таблица Microsoft

Excel может быть импортирована в программу Bionumerics 5.1 в соответствии с рекомендациями разработчиков (www.applied-maths.com).

Результаты исследования

На основании анализа DFR-профилей 235 штаммов Y.pestis1, одного штамма -Y. pseudotuberculosis и с учетом данных о ранее описанных 32 геномоварах2 [Li et al., 2008] нам удалось подразделить все исследованные к настоящему моменту изоляты на 92 DFR-типа (Dm = 0,687) (рис. 1). Согласно полученным результатам, на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 52 геномовара. Большинство геномоваров вошли в состав трех кластеров: А, В и С (по Y. Li et al. [2008]), соответствующих основным ветвям, 1, 2 и 0, дендрограмм, построенных М. Achtman et al. [2004] на основании данных SNP- и IS/00-типирования (рис. 2). В нашем исследовании вне кластеров остался африканский "полевочий" штамм subsp. angola - Angola, что может свидетельствовать как о его относительно древнем происхождении, так и об отсутствии среди анализируемых изолятов других филогенетически близких ему штаммов. Как и в публикации наших китайских коллег [Li et al., 2008], все штаммы биовара orientals (24 штамма в составе 10 геномоваров) вошли в состав кластера А/1, все штаммы биовара medievalis (67 штаммов в составе 28 геномоваров) - в кластер В/2, а представители биовара microtus (неосновные подвиды Y.pestis [Li et al, 2009]) (84 штамма в составе 26 геномоваров), за исключением геномовара 85, представленного штаммом Angola, - в кластер С/0. Штаммы биовара antiqua (58 штаммов в составе 27 геномоваров) распределились по различным ветвям кластеров А/1, В/2 и С/0.

В состав кластера В/2 входят две основные ветви (рис. 1). Одна из ветвей соответствует ветви 2.ANT на рис. 2 и представлена в основном геномоварами: 10-13, 17, 26-28, 58, 62, циркулирующими на территориях Китая и' Монголии, геномоваром 19 - основным DFR-типом в граничащем с Китаем и Монголией природном очаге 38 и минорным для очага 1, Монголии, Китая и Непала, атакже минорными геномоварами 57 и 59 природного очага 1.

Вторая ветвь соответствует вегви 2.MED на рис. 2 и образована, в основном, DFR-типами, характерными для природных очагов стран СНГ. Она включает геномовар 15 - основной DFR-тип штаммов биовара medievalis, циркулирующих в природных очагах Средней Азии.

1 ПРЯ-профшти 165 штаммов определены в настоящем исследовании экспериментально, аналогичные данные о 48 штаммах взяты из работы е1 а!., 2008], а DFR-пpoфили 22 штаммов получены в результате анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей, доступных в Интернете.

2 В работе рЛ е/ а!., 2008] первый геномовар включает два "подгеномовара": 1а и 1Ь.

Рисунок 1. NJ-дендрограмма и DFR-профили 92 геномоваров Y.pestis "gv" - геномовар; "bv" - биовар; "ANT" - antiqua (заглавные буквы обозначают, что геномо-вар описан ранее); "INT" - intermedium3; "med" - medievalis; "mic" - microtus; "ori" - orientalis; "ssp" - подвид (обозначены первой буквой названий, а в случае subsp. angola3 - двумя первыми буквами); "по" - количество штаммов, проанализированных в нашей работе;"?" - нет данных.

3 Аргументация по необходимости введения во внутривидовую классификацию новых таксонов приведена далее.

К pseudotuberculosis

0JUÍ4

O.PE2 4

i O.PE?

Angola

Antiqua B4200J004

2.MED .4 HM

K197J002

Ш!

con

IV275

2.ANT

•Ntpal51«

Е197Ч001 D1060M DIUM8

CA88-II2S 1149191« MGflMUH УЛ-1

!. A \T.

Antiqua

lidia 193 WOTií

Рисунок 2. Деидрограмма микроэволюции 21 штамма К pestis по данным SNP типиро-вания [Derbise etal., 2010]

Все мученные нами штаммы биовара orientalis вошли в состав кластера А/1 и были выделены за пределами СНГ, Монголии и Китая. В этот же кластер вошли штаммы биовара antiqua, циркулирующие на территории Монголии (геномовар 01Ь (минорный DFR-тип для китайских очагов В1, С, D, G и К2) - четыре штамма, геномовар 62 - один штамм) и стран СНГ в природных очагах: 31 (основной для соседнего китайского очага A [L¡ et al., 2008] геномовар 04 - один цггамм), 33 (геномовар 60, отличающийся от геномовара 04 отсутствием DFR18, - один ппамм) и 37 (геномовар 61 - девять штаммов, геномовар 01Ь - один штамм). В состав этого кластера входат и штаммы геномовара 03 биовара inteimedium, циркулирующие в китайском очаге ВЗ. Кластер включает две основные ветви, одна из которых (DFR-типы: 07-09,32-35, 56, 86-89) соответствует ветви 1.0Инарис. 2, а остальные геномовары в составе второй ветви - 1.ANT.

Кластер С/0 формировали две основные ветви (рис. 1), одна из которых включала геномовар 90 (ветвь 0.РЕ2 на рис. 2), а вторая DFR-типы 14 и 80 (ветвь 0.РЕ4 на рис. 2).

В 0.РЕ2 ветвь, кроме DFR-типа 90 входили геномовары: 24 (минорный геномовар штаммов bv. antiqua subsp. pestis из китайского очага С; основной - для subsp. ulegeica (семь штаммов из Монголии) и минорный для subsp. caucasica (по одному штамму из очагов 5 и 7)); 63, 67, 70,71, 74, 72, 76 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6,7,4,4,39,39, 5, соответственно); 64 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6 и 7) и основной для очага 39 геномовар 73 (семь штаммов subsp. caucasica).

Ветвь 0.РЕ4 более разнообразна по входящим в нее подвидам. Сюда вошли геномовары 62, 23, 30 основного подвида биовара antiqua из Монголии и Китая. Большинство входящих в группу 0.РЕ4 штаммов биовара microtus обладало DFR-типом 14 - основным геномо-варом китайских подвидов qinghaiensis и xilingolensis, который также оказался характерным

для трех монгольских штаммов, относимых к подвиду altaica. В случае выявления близкого родства этих штаммов и с помощью других методов молекулярного типирования следует поставить вопрос о тщательной проверке всех коллекционных штаммов подвида altaica, выделенных в Монголии, на предмет их перевода в соответствующий внутривидовой таксон. Ге-номовар 80 - основной для штаммов подвида altaica, выделенных в очаге 36 (12 штаммов) и в Монголии (один штамм). К этому же геномовару относится и единственный в нашем исследовании представитель bv. talassica А-1820. Штамм Pestoides А относится к этому же DFR-типу и, вероятно, является представителем подвида altaica или talassica. Штаммы subsp. caucasica геномовара 69 циркулируют в очагах 4 (два штамма), 5 (два штамма) и 7 (один штамм). Остальные входящие в ветвь 0.РЕ4 геномовары представлены одним - двумя штаммами подвидов hissarica, altaica, caucasica и ulegeica.

Маловероятно, что совпадение DFR-типов (03 и 24) у штаммов из географически изолированных природных очагов и разных внутривидовых групп (рис. 1) связано с их заносом с одной территории на другую. Скорее это совпадение можно объяснить независимой утратой амплифицируемых локусов или участков "посадки" праймеров и даже ошибками, допущенными при проведении коллекционной работы со штаммами. Верификация полученных нами результатов с помощью друтих методов мультилокусного генотипирования (MLVA, CRISPR-типирование и др.) поможет ответить на эти вопросы.

На основании анализа MLVA-профилей 601 штамма Y.pestis4 и одного штамма -Y. pseudotuberculosis нам удалось подразделить все исследованные к настоящему моменту изоляты на 430 МЬУА25-типов (D,„ = 0,993), причем 352 из них описаны впервые с нашим участием или непосредственно нами. На территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 119 МЬУА25-типов (проанализировано 139 и 23 штамма, соответственно).

На начальном этапе нашей работы был создан совместный с китайскими и французскими коллегами электронный каталог [Li et al., 2009] предложенных С. Pourcel et al. [2004] профилей 25 VNTR-маркеров У. pestis, включающий данные о генотипировании 383 штаммов из природных очагов Китая, 38 изолятов из СНГ и Монголии [Li et al., 2009], а также ранее опубликованные данные о 180 штаммах из французской коллекции штаммов чумного микроба [Pourcel et al., 2004]. Глобальная кластеризация Y. pestis, полученная нами с помощью MLVA (рис. 3), соответствует данным предыдущих исследований.

4 МЦУА25-профили 176 штаммов определены в нашей лаборатории, данные о 22 штаммах получены в результате анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей, доступных в Интернете, а остальная информация взята из нашей совместной работы с зарубежными коллегами [Ы е!а1, 2008].

•Microtus

У. pestis pestis

caucasica, uiegeica aitaica, hissarica xilingolensis qinghaiensis

Antiqua foci

H, KP, 38

¿Antiqua foci G, TTibet

JMedievalis foci

I, J, Kl, K2

Medäevalis foci -0, 16, 18, 21, 27, 43, Kurdistan

.Antiqua foci A, B, C

■¿¡Antiqua Africa

- Antiqua foci C, D

Antiqua focus E

including

DFR13+strains

Orientalis, "Yunnan, Fujian, Vietnam, Myanmar, "third pandemic"

Рисунок 3. NJ-дендрограмма М1Л'Л25-ти1кш Y. pestis

Левая точка - "корневой вид" Y. pseudotuberculosis; правая точка - штамм Angola; стрелки -штаммы Y. pestis subsp. pestis, с неожиданными генотипами.

Так, SNP анализ выявил две отличающиеся по данным молекулярного типирования группы bv. antiqua, представляющие две линии Y. pestis (1.ANT и 2.ANT), эволюционно связанные с ветвями bv. orientalis и bv. medievalis [Achtman et al., 2004]. В этих ранних исследованиях линия 1.ANT была представлена африканскими изолятами bv. antiqua. Аналогичная кластери-

зация bv. antiqua была проведена с помощью CRISPR-типирования [Pourcel et al., 2005]. Эти две ветви были классифицированы как азиатская и африканская, но настоящее исследование показывает, что оба кластера bv. antiqua циркулируют в азиатских природных очагах чумы.

Работа, начатая совместно с лабораториями G. Vergnaud и R. Yang [Li et al., 2009], получила продолжение в рамках федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)". Созданный в рамках международного сотрудничества электронный каталог [Li et al, 2009], включающий информацию о MLVA25-reno™nax более 450 штаммов У. pestis, а также методические материалы по проведению молекулярного титрования этим методом в 2009 г. были переданы нами для практического использования в Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока и Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. Совместно был определен перечень штаммов для дальнейшего исследования, и часть из них была передана в ГНЦ ПМБ для проведения генотипирования в нашей лаборатории. Значительное увеличение количества анализируемых штаммов из регионов Кавказа и Горного Алтая дало более полную картину о биоразнообразии чумного микроба, циркулирующего в природных очагах, расположенных на этих территориях. Так, увеличение числа изолятов из очагов 4-7 с семи до 24 и включение в исследование девяти штаммов из очага 39 позволило выявить в составе кластера subsp. caucásico три независимые ветви (рис. 4.А), соответствующие природным очагам 39 (Дагестан), 4 (Армения и Грузия) и группе очагов 5-7 (Азербайджан и Армения). Полученные данные свидетельствуют, что очаги 5, 6 и прилегающую к ним часть очага 7 можно рассматривать как единый природный очаг чумы.

Рисунок 4. Фрагменты NJ-дендрограммы MLVA25-tiiiiub штаммов К pestis (A) subsp. caucasica (цифрами указаны номера природных очагов чумы) и (Б) subspp. (alassica, qing-haiensis, xiüngolensis, hissarica и altaica

5-7

Увеличение количества штаммов subsp. ulegeica с трех до десяти не изменило положения этой относительно автономной гомогенной группы относительно других ветвей денд-рограммы.

Штаммы bv. microtus из очагов 34, 36, 40, L, М и изоляты subsp. altaica из Монголии образовывали единый кластер, в одну из ветвей которого входили подвиды talassica, qing-haiensis, xilingolensis, а во вторую - hissarica и altaica (рис. 4.Б). Результаты MLVA подтверждают представленные в предыдущей главе данные о принадлежности штаммов 1-3088, I-3132 и 1-3134 не к подвиду altaica, a KXilingolensis.

При анализе штаммов биоваров antiqua и medievalis из природных очагов СНГ и Монголии также подтверждена приуроченность определенных МЬУА25-типов к конкретным природным очагам чумы.

Построение достоверных деревьев филогенеза отдельных видов требует сочетанного использования информации о многих локусах/генах, полученной с помощью различных технологий (MLVA, SNP-, IS-, DFR-типирование и т.д.), и подбора аналитических методов, дающих близкие результаты кластеризации для различных технологий генотипирования [Heled, Drummond, 2010]. В результате использования опции "composite data sets" программы Bionumerics S.10 мы получили очень "простую" и логичную дендрограмму-филограмму (рис. S), в которой, в отличие от DFR-, ML VA- и SNP-дендрограмм нет проникновения генетических групп одного биовара в ветви, сформированные представителями других биоваров. По данным сочетанного DFR/MLVA25-THnHpoBamw (D¡„ = 0,996) наиболее древними представителями вида является группа изолягов биовара antiqua из Центральной Африки, за ними следует уникальный штамм 797 того же биовара, но выделенный по данным паспорта в среднеазиатском очаге 25, в котором циркулируют штаммы bv. medievalis. Скорее всего, этот штамм был занесен на территорию Туркменистана с приграничных территорий Ирана или Афганистана. Наиболее филогенетически близок к штамму 797 штамм Angola (bv. microtus subsp. angola), а затем следуют представители subsp. caucasica, азиатская ветвь биовара antiqua и т.д. (рис. 5). Вероятно, что проведение сочетанного анализа результатов генотипирования в формате DFR/MLVA/CRISPR/MLST/SNP позволит построить филограмму, приближающуюся по достоверности к результатам анализа данных полногеномного секвенирования.

Что же касается практического использования исследованных методов молекулярного типирования и созданного в ходе этого исследования электронного каталога DFR- и MLVA25-генотипов, то его можно продемонстрировать на примере внутривидовой идентификации штаммов Pestoides А и Pestoides F. После передачи группы штаммов из СССР в США их паспорта были утрачены, а затем присвоены новые наименования. Результаты MLVA25-типирования (DFR/MLVA25-типирования) однозначно свидетельствуют о том, что штамм Pes-

1сй(1е5 А был выделен в Горно-алтайском очаге 36 или на граничащей с ним территории Монголии, а штамм РеэКйаез Р - в группе очагов Закавказского нагорья - 04-07.

Суммируя результаты экспериментальной части нашей работы, следует отметить, что DFR-тишрование не во всех случаях позволяет дифференцировать изоляты из разных природных очагов. Кластеризация возбудителя чумы на основе MLVA согласуется с классификацией на основе DFR-типирования, но обладает большей разрешающей способностью. Сочетанный анализ результатов повышает филогенетическую достоверность генерируемых декцрограмм.

R. Devignat [1951] предложил деление вида Y. pestis на три биовара: antiqua, medievalis и orientalis, включающих эпидемически значимые изоляты - клоны штаммов с универсаль-

ной вирулентностью, послуживших причиной трех пандемий чумы. Позднее для эндемичных штаммов, циркулирующих в полевочьих очагах степей Ксилин Гол и Куингхай-Тибетского плато, китайскими исследователями был предложен четвертый биовар microtus [Zhou et al., 2004c], в который мы предложили включить штаммы всех внутривидовых групп, характеризующиеся способностью ферментировать рамнозу в сочетании с авирулентностью для морских свинок и людей [Cui et al., 2008]. Изначально биовар microtus включал неразличимые с помощью фенотипических признаков штаммы из китайских очагов L и М [Zhou et al., 2004с], по своим свойствам близкие, но не идентичные российским неосновным подвидам (табл. 1) [Anisimov etal., 2004]. Проведенное нами ранее CRISPR-типирование [Cui etal, 2008] и представленные в настоящей диссертации результаты MLVA-типирования не только позволили разделить на два отдельных подкластера китайские полевочьи штаммы из очагов L и М, но и показали их близкое филогенетическое родство с изолятами подвидов altaica, hissarica и talassica (рис. 4.Б). Мы предложили нашим китайским и французским коллегам по аналогии с отечественными неосновными подвидами классифицировать изоляты из очага L как subsp. xilingolensis, а из М - qinghaiensis, а также отнести наиболее древний по данным МЬУА25-типирования штамм Angola к subsp. angola. Предложение было принято и дополнения к классификации опубликованы [Cui et al., 2008].

Кроме того, результаты DFR/MLVA25-nnmpoBaHM в сочетании с данными о биологических свойствах (вирулешности в отношении разных видов животных, ферментативных активностей, частоты мутаций к Pgm" фенотипу; табл. 1) служит основанием для выделения филогенетической группы рамнозо-положительных штаммов с универсальной вирулентностью из очага В Северного Тянь-Шаня в отдельный таксон, bv. intermedium, название которого отражает промежуточные биологические свойства и промежуточное положение на дендрограм-ме (рис. 5). Наше предложение о введении нового таксона было опубликовано [Li et al., 2009].

Принятая в практической работе внутривидовая таксономия чумного микроба, наиболее полно описанная нами в публикации [Li et al., 2009], не соответствует правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий (МКНБ) [Lapage et al., 1992]. Так, в состав основного подвида Y. pestis входят четыре биовара; antiqua, medievalis, orientalis и intermedium, а все неосновные подвиды: altaica, angola, caucásico, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis, напортив, включены в состав одного биовара - microtus. Однако согласно правилам МКНБ внутривидовые таксоны - это подвиды, имеющие тринарное название (например, Pho-torhabdus luminescens subsp. caribbeanensis, где caribbeanensis - название подвида). Кроме того, ввиду нестабильности отдельных признаков бактерий, в их систематике применяют непредусмотренное МКНБ понятие - «вариант» (например, биовары - варианты по биологическим признакам; фаговары - по устойчивости к бактериофагам и т.д.). Естественно, что таксон мо-

жет входить в таксон более высокого ранга, но не может быть частью непредусмотренной МКНБ внутривидовой группы штаммов. Для приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами МКНБ необходимо переименование биовара пмсгоПк в подвид, а входящих в него филогенетических групп - в биовары (табл. 1).

Таблица 1. Предлагаемая внутривидовая таксономия К pestis

Виру- Частота

Подвид Биовар Ферментация рамнозы лентность для морских свинок Район циркуляции Основные хозяева мутаций от Pgm+ к Pgm" фенотипу за 10 генераций (%)

angola + + Ангола 0

caucasica + + Закавказское нагорье, горный Дагестан Microtus arvalis 0

ulegeica + + Северо-восточная Монголия, пустыня Гоби Microtus gregalis. Alúcela strelzovi, Ochotona pallasi pricei 0

£ о altaica + + Горный Алтай, Монголия Microtus gregalis, Alticola strelzovi, 0

Е Ochotona pallasi pricei

hissarica + + Гиссарский хребет Microtus carruthersi 0

xilingolensis + + Степи Ксилин Гол, Китай Microtus brandti 0

qinghaiensis + + Куингхай-Тибетское плато, Китай Microtus fuscas 0

talassica + + Таласский хребет Microtus gregalis, Marmota caudata 0

intermedium + - Северный Тянь-Шань, Китай Marmota baibacina, Spermophilus undulatvs 0

antiqua Центральна» Азия и центральная Африка Marmota spp. >20

pestis medievalis Центральная Азия Citellus (Spermophilus) Spp., Meriones spp., Rhombomys spp. >20

oríentalis Юго-восточная Азия, южные районы Африки, Америка Rattus spp., Cynomys spp., Spermophilus spp., Cavia spp., Peromyscus spp. и др. >20

Примечания: '? - нет данных.

В данную таблицу в диссертации дополнительно включены данные о генотипах, характерных для отдельных внутривидовых групп.

20 Выводы

1. Создан и постоянно пополняется электронный каталог штаммов Y. pestis и их MLVA25- и DFR-типов, включающий на момент написания диссертации информацию о 601 штамме, представляющих все известные подвиды и биовары чумного микроба.

2. Выявлено 60 новых DFR-типов (геномоваров) У. pestis (из 92, описанных к настоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 52 геномовара; определено распределение DFR-типов У. pestis по отдельным природным очагам чумы. Показано, что штаммы одного DFR-типа могут входить в состав разных подвидов и/или биоваров.

3. Вьивлено 352 новых МЬУА25-типов Y. pestis (из 430, описанных к настоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 119 MLVA25-THnoB; определено распределение МЬУА25-типов Y. pestis по отдельным природным очагам чумы. МЬУА25-кластеры/подкластеры, включающие близкие генотипы, соответствуют определенным природным очагам. Кластеризация возбудителя чумы на основе MLVA (D¡„ = 0,993) согласуется с классификацией на основе DFR-типирования (D¡„ = 0,687), но обладает большей разрешающей способностью.

4. Установлено, что основные ветви дендрограмм, полученных на основе анализа DFR- и MLVA-профилей, соответствуют таковым при SNP-типировании, а сочетанный анализ результатов двух методов повышает их разрешающую способность (D¡„ = 0,996) и позволяет получать филограммы, свидетельствующие о порядке дивергенции внутривидовых групп в ходе микроэволюции возбудителя чумы.

5. Показана возможность определения географического происхождения и внутривидовой принадлежности штаммов Y. pestis с не идентифицированными "родословными" на основе сравнения их MLVA- или MLVA/DFR-профилей с данными постоянно пополняемого нами электронного каталога.

6. На основании анализа биологических свойств (вирулентности в отношении разных видов животных, ферментативных активностей, частоты мутаций к Pgm" фенотипу), а также DFR- и MLVA-типирования предложены новые внутривидовые таксоны биовар intermedium, а также подвиды: angola, qinghaiensisnxilingolensis.

7. Предложен вариант приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий необходимо переименование биовара microtus в подвид, а входящих в него филогенетических групп - подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis - в биовары.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Dentovskaya S., Platonov М.Е., Vergnaud G., Pourcel C., Balakhonov S., Anisimov A. Multiple locus VNTR and DFR analysis of Yersinia pestis isolates from the FSU and Mongolian natural foci. Abstracts of the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30,2006, Opatija, Croatia), p. 16.

2. Денговская C.B., Платанов M.E.. Шестопадов М.Ю., Романова И.Ф., Балахонов C.B., Анисимов А.П. Мультилокусное VNTR и DFR типирование изолятов Yersinia pestis из природных очагов СНГ и Монголии. Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Они-щенко, В .В. Кугырева, И.А. Дятлова. Протаино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 97.

3. Vergnaud G., Li Y., Gorgé О., Song Y., Gui Y., Zhou D., Grissa I., Dentovskaya S.V., Platonov M.F.. Raton A., Balakhonov S.V., Pourcel C., Anisimov A., Yang R. Analysis of the three Yersinia pestis CRISPR loci in combination with polymorphic tandem repeats typing provide new tools for phylogenetic studies and possibly for the investigation of ancient DNA. Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4.1. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006. P. 18-19

4. Vergnaud G., Li Y., Gorgé О., Song Y., Cui Y., Zhou D., Grissa I., Dentovskaya S.V., Platonov M.E.. Rakin A., Balakhonov S.V., Neubauer H., Pourcel C., Anisimov A., Yang R. Analysis of the three Yersinia pestis CRISPR loci in combination with polymorphic tandem repeats typing provides new tools for phylogenetic studies and possibly for the investigation of ancient DNA IIAdv. Exp. Med. Biol. - 2007. - Vol. 603. - P.327-338.

5. Анисимов А.П., Pourcel C., Gorgé О., Li Y., Cui Y., Song Y., Zhou D., Grissa I., Денговская C.B., Платопов M.E., Ракин А., Балахонов C.B., Калмантаев T.A., Neubauer H., Yang R., Vergnaud G. Анализ трех CRISPR локусов - новый подход для филогенетических исследований Yersinia pestis. Материалы научно-практической конференции "современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007. - Ч. 1. - С. 22-24.

6. Cui Y., Li Y., Gorge О., Platonov M.E.. Yan Y., Guo Z., Pourcel C., Dentovskaya S.V., Balakhonov S.V., Wang X, Song Y., Anisimov A.P., Vergnaud G., Yang R. Insight into microevolution of Yersinia pestis by clustered regularly interspaced short palindromic repeats И PLoS ONE. - 2008. - Vol. 3. - e2652.

7. Анисимов А.П., Платонов M.E.. Евсеева B.B., Чиркова Е.В., Денговская C.B., Балахонов C.B. Генотипирование и внутривидовая таксономия чумного микроба II Журнал

инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 64.

8. Li У., Cui У, Наиск У„ Platonov М.Е.. Dai Е., Song У, Guo Z., Pourcel С., Den-tovskaya S.V., Anisimov A., Yang R., Vergnaud G. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: Insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci II PLoS ONE. - 2009. - Vol. 4. - ебООО.

9. Платонов M.E.. Евсеева B.B., Чиркова Е.В., Гапельченкова Т.В., Дентовская С.В., Ефременхо Д.В., Бабий А.М., Анисимов А.П. Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis. Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадеора (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - Протвино: А-Принг ЗАО, 2010. - С. 291-294.

Благодарности

Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору А.П. Анисимову и к.м.н C.B. Дентовской за помощь в формировании научной концепции работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам - сотрудникам ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, Université Paris-Sud, Institut de Génétique et Microbiologie (Orsay, France) и Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology (Beijing, China), принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Благодарю директоров ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - д.м.н., проф. И.А. Дятлова, Иркутского научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока - д.м.н., проф. C.B. Балахонова и Ставропольского научно-исследовательского противочумного института - д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за создание условий для проведения экспериментов, представленных в настоящей работе. Также благодарю директора ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - дм.н., проф. И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию на диссертационном совете Д 350.002.01 при ФГУН ГНЦ ПМБ.

Приношу искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.

Подписано в печать:

16.09.2010

Заказ № 4120 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Платонов, Михаил Евгеньевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ВОЗБУДИТЕЛЬ ЧУМЫ, Y. PESTIS, - УДОБНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ТАКСОНОМИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

1.3. ИСПОЛЬЗОВАНЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ Y. PESTIS.

1.3.1. КЛАССИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ.

1.3.2. МУЛЬТИЛОКУСНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ (MLST).

1.3.3. ПОЛИМОРФИЗМ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДОВ (SNP-ТИПИРОВАНИЕ).

1.3.4. CRISPR-АНАЛИЗ.

1.3.5. VNTR/MLVA-ТИПИРОВАНИЕ.

1.3.6. DFR-АНАЛИЗ.

1.3.7. ТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ МИКРОЭРРЕЕВ.

1.3.8. ТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВ АНИЯ.

1.4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ФИЛОГЕНЕТИКИ И ФИЛОГЕОГРАФИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis"

Актуальность проблемы. Чума - острое инфекционное заболевание, относящееся к группе особо опасных карантинных инфекций. Возбудитель чумы, Yersinia pestis, - самый опасный из бактериальных патогенов. Чума была причиной трех пандемий и привела к гибели более 200 миллионов человек. Эта природно-очаговая инфекция передается укусами кровососущих насекомых - блох и циркулирует в популяциях диких грызунов, но при легочной форме может передаваться непосредственно от человека к человеку [120]. Помимо чумного микроба, род Yersinia включает в себя еще 14 видов [142], два из которых - Y. pseudotuberculosis и Y enterocolitica, вызывают у человека заболевания желудочно-кишечного тракта [59]. Данные молекулярно-биологических исследований указывают на то, что вид Y. pestis произошел от Y. pseudotuberculosis О: lb серотипа [135] в последние 1500-20000 лет [50]. Природные очаги чумы имеются на всех материках, кроме Австралии и Антарктиды, занимая 6-7 % территории земного шара [120]. На территории бывшего Советского Союза насчитывается 42 природных очага чумы, 11 из них - в Российской Федерации [33]. Следствием географической и физической разобщенности природных очагов, влияния различных биотических и абиотических факторов, явилась адаптация, в результате которой чумной микроб приспособился к циркуляции в популяциях более 200 видов диких грызунов и лагоморфов, используя около 120 видов блох в качестве переносчиков [33]. В процессе аллопатрического видообразования сформировались подвиды, различающиеся по своим питательным потребностям, способности ферментировать различные субстраты и вирулентности для чувствительных к ним млекопитающих. До недавнего времени вид Y. pestis подразделяли на шесть подвидов: pestis, altaica, caucasica, hissarica, talassica и ulegeica [53]. По биохимической активности внутривидовые группы Y. pestis делили на три биовара: antiqua, mediaevalis, orientalis [71].

Для типирования Y. pestis применяют как фенотипические, так и генетические методы. В основу фенотипических методов положены питательные потребности, способность ферментировать различные субстраты, и вирулентность для различных видов животных. Хотя фенотипические методы и позволяют различать подвиды и био-вары Y. pestis, с их помощью невозможно проводить дифференциацию на уровне штаммов. К тому же нестабильность проявления фенотипических признаков, их зависимость от условий эксперимента, а также наличие атипичных штаммов, существенно затрудняют интерпретацию результатов [4; 53].

В связи с этим, решающую роль в типировании чумного микроба, играют мо-лекулярно-биологические методы. В разное время с этой целью использовали плаз-мидный скрининг [7; 79], определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов - RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) [121], риботипирование [87], IS-типирование [11; 117; 148], и PCR-фингерпринт. К методам PCR-фингерпринта относятся случайно праймированная ПЦР - AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) [119]случайно амплифицированные полиморфные ДНК - RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA) [92], повторяющиеся экстрагенные палиндромы - REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic) [96] и повторяющиеся межгенные консенсус-ные последовательности энтеробактерий ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Inter-genic Consensus sequences) [97]. Общими недостатками этих методов являются: низкая межлабораторная воспроизводимость, необходимость в большом количестве материала для исследования, сложность использования полученных результатов для создания совместимых баз данных.

Доступность полной нуклеотидной последовательности геномов микроорганизмов [118] послужила толчком для развития новых современных молекулярно-генетических методов. В настоящее время для генотипирования Y. pestis широко используют многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов - MLVA (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) [98; 107], DFR-типирование - анализ отличающихся участков ДНК (Different Region) [68; 109], CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - кластеризованные короткие палиндромные повторы, разделенные спейсерами) [123]. SNP-типирование - анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (Single-Nucleotide Polymorphism) [130], полногеномный сиквенс [75]. Данные методы лишены перечисленных выше недостатков и обладают высокой разрешающей способностью.

Активизация в конце XX века ряда природных очагов чумы Африки, Азии и Америки послужила причиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами данной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической обстановки [34]. Не меняется эта тенденция и в начале XXI века [33]. Возрастание числа эпидемических проявлений чумы, наряду с возможностью перемещения авиатранспортом инфицированных Y. pestis людей в течение нескольких часов с одного континента на другой, а также возрастающая опасность международного терроризма свидетельствуют об актуальности совершенствования молекулярно-эпидемиологических методов, направленных на генетическую паспортизацию штаммов Y. pestis из различных природных очагов, необходимую для выявления источников заражения и проведения адекватных лечебных и санитарно-эпидемиологических мероприятий. В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перспективных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов [131; 129], что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги чумы.

Изучение разнообразия и микроэволюции Y. pestis важно как для решения фундаментальных задач медицинской микробиологии, таких как выявление механизмов происхождения и эволюции инфекционных болезней человека и животных, так и для разработки новых высокоспецифичных методов молекулярной эпидемиологии, а именно идентификации, гено- и геномотипирования Y. pestis. Генотипирование -один из наиболее эффективных и относительно недорогих методов, применяемых для целей паспортизации природных очагов, эпидемиологического расследования случаев заболеваний и экспертизы актов биотерроризма.

Цель исследования состояла в изучении методами MLVA и DFR-типирования генетического разнообразия и микроэволюции чумного микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств.

Задачи исследования:

1. Создать пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (MLVA25- и DFR-профилей) представительного набора штаммов Y. pestis, включающий данные, полученные в нашей лаборатории, лабораториях наших коллабораторов, Gilles Vergnaud (Universite Paris-Sud, Institut de Genetique et Microbiologic, Orsay, France) и Ruifu Yang (Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing, China), a также информацию о штаммах с доступными в Интернете полными последовательностями геномов.

2. Провести DFR-типирование штаммов Y. pestis; оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микроэволюции.

3. Провести многолокусный VNTR анализ штаммов Ypestis; оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микроэволюции; сравнить эффективность MLVA25- и DFR-типирования.

Научная новизна

В ходе выполнения данной работы обнаружено 60 новых DFR-генотипов; 352 новых МЬУА25-генотипов штаммов чумного микроба.

Установлено, что на территории одного природного очага чумы может циркулировать несколько DFR-, MLVA25- и DFR/MLVA25-reH0THn0B, входящих в единый генетический кластер. В то же время одинаковые DFR-типы могут входить в состав разных MLVA25- и DFR/MLVA25-KnacTepoB, что свидетельствует о возможности го-моплазии по данному признаку. Циркуляция же филогенетически близких MLVA25-и DFR/MLVA25-reH0THn0B на территориях смежных природных очагов свидетельствует о целесообразности их объединения. Так, Присеванский горный (5) и Зангезуро-Карабахский горный (6) очаги должны быть объединены в Нагорно-Закавказский (5/6), Бозчельский равнинно-предгорный (8) и Джейранчельский равниннопредгорный (11) - в Бозчельско-Джейранчельский равнинно-предгорный (8/11), а к Горно-алтайскому очагу (36) - присоединены соответствующие территории Монголии.

DFR- и MLVA-профили соответствуют таковым при SNP-типировании, а соче-танный анализ результатов двух методов повышает их разрешающую способность и позволяет получать филограммы, свидетельствующие о следующем порядке дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: Y. pseudotuberculosis Т Y pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Т Y. pestis subsp. angola t Y. pestis subsp. caucasica t Y. pestis bv. intermedium t Y. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) t Y pestis bv. medievalis t Y. pestis bv. orientalis t Y. pestis subsp. ulegeica t Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

Теоретическая ценность диссертации

Предложено три новых подвида Y. pestis: angola, qinghaiensis и xilingolensis.

Предложен новый биовар - intermedium.

Предложен вариант приведения номенклатуры чумного микроба в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.

Практическая ценность диссертации

Депонировано в GeneBank 8 последовательностей VNTR-локусов (международный уровень внедрения).

В ГНЦ ПМБ депонирована коллекция, состоящая из 10 штаммов - типовых для многолокусного VNTR анализа Y. pestis (федеральный уровень внедрения).

Установлено, что выделенные на территории Монголии штаммы подвида altaica входят в состав двух разных ветвей кластера talassica!qinghaiensis Ixilingo-lensis/hissaricalaltaica, один из которых представлен штаммами близкими штаммам подвида altaica, циркулирующим на территории Горного Алтая в России. Второй кластер представлен штаммами подобными штаммам подвида xi lingo lens is, циркулирующим в L очаге на территории Китая. Необходима проверка штаммов подвида altaica в коллекциях учреждений, проводящих работы с возбудителем чумы, на предмет определения их действительного таксономического положения.

Создан постоянно пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (MLVA25- и DFR-генотипов), включающий на момент написания диссертации информацию о более чем 600 штаммах Y. pestis.

Результаты исследования изолятов Y. pestis методами MLVA- и DFR-типирования рекомендованы нами в качестве одного из дополнительных критериев внутривидовой классификации возбудителя чумы.

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинско-го государственного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ, а также при обучении современным методам генотипирования специалистов противочумных учреждений.

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработанный комплекс методических приемов (электронный каталог, включающий информацию о DFR- и ML V А2 5 - генотипах более 750 штаммов Y. pestis, а также методические рекомендации по проведению молекулярного типирования методом MLVA25) позволяет определять принадлежность штаммов чумного микроба к конкретным подвидам и биоварам, а также к природным очагам чумы: 1, 4, 5-7, 8/11,

9, 10, 31/33, 34, 36, 37, 38, 39,40/М, 43, расположенным на территории стран СНГ.

Сочетание универсальной вирулентности со способностью ферментировать рамнозу, а также БР11/МЬУА25-профиль, занимающий промежуточное положение между таковыми у представителей азиатской ветви bv. antiqua и кавказской группой штаммов bv. microtus, позволяет выделить штаммы, циркулирующие в очаге В Китая в новый внутривидовой таксон - биовар intermedium.

Сочетанное использование ОРШМЬУА25-типирования позволяет предложить следующий порядок дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: Y. pseudotuberculosis Ty. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Ty. pestis subsp. angola Ty. pestis subsp. caucasica Ty. pestis bv. intermedium t Y. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) t Y. pestis bv. medievalis t Y. pestis bv. orientalis t Y. pestis subsp. ulegeica t Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

Несоответствие правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий внутривидовой таксономии чумного микроба требует переименования биовара microtus в подвид microtus, а входящих в него в настоящее время филогенетических групп, а именно подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis - в биовары altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций (JIM4) ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - к.м.н. С.В. Дентовская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов) и Госконтрактов № 119-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01890017743) и № 53-Д от 29.06.2010 г. с Роспотребнадзором (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с В.В. Евсеевой (JIM4 ГНЦ ПМБ). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники JIM4 ГНЦ ПМБ Е.В. Чиркова и Т.В. Гапельченкова. Часть препаратов ДНК была получена нами от д.м.н., проф. С.В. Балахонова (Иркутский НИПЧИ СДВ). Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. С.В. Дентовской (ЛМЧ ГНЦ ПМБ) и д.м.н., проф. А.П. Анисимова (ГНЦ ПМБ) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на: NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006 г.); 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Инфекции, обусловленные иерсиниями" (Санкт-Петербург, 2006); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 2007); 9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People's Republic of China, 2007); NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop "Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification" (Тбилиси, Грузия, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" (Оболенск, 2009); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней", посвященной 75-летию Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 2009); научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора "Современные технологии th обеспечения биологической безопасности" (Оболенск, 2010); 10 International Symposium on Yersinia (Recife, Brazil, 2010); International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании ученого совета ГНЦ ПМБ 9 апреля 2010 г. протокол № 7. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол от8 сентября 2010 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях, в том числе в трех статьях, список которых приведен в автореферате (три статьи в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Платонов, Михаил Евгеньевич

118 ВЫВОДЫ

- Создан и постоянно пополняется электронный каталог штаммов Y. pestis и их MLVA25- и DFR-типов, включающий на момент написания диссертации информацию о более чем 600 штаммах, представляющих все известные подвиды и биовары чумного микроба.

- Выявлено 60 новых DFR-типов (геномоваров) Y. pestis (из 92, описанных к настоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 52 геномовара; определено распределение DFR-типов Y. pestis по отдельным природным очагам чумы. Показано, что штаммы одного DFR-типа могут входить в состав разных подвидов и/или биоваров.

- Выявлено 352 новых МЬУА25-типов Y. pestis (из 430, описанных к настоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 352 МЬУА25-типов; определено распределение MLVA25-типов Y. pestis по отдельным природным очагам чумы. MLVA25-кластеры/подкластеры, включающие близкие генотипы, соответствуют определенным природным очагам. Кластеризация возбудителя чумы на основе MLVA (Din = 0,993) согласуется с классификацией на основе DFR-типирования (Din = 0,687), но обладает большей разрешающей способностью.

- Установлено, что основные ветви дендрограмм, полученных на основе анализа DFR- и MLVA-профилей, соответствуют таковым при SNP-типировании, а сочетанный анализ результатов двух методов повышает их разрешающую способность (Din = 0,996) и позволяет получать филограммы, свидетельствующие о порядке дивергенции внутривидовых групп в ходе микроэволюции возбудителя чумы.

- Показана возможность определения географического происхождения и внутривидовой принадлежности штаммов Y. pestis с не идентифицированными "родословными" на основе сравнения их MLVA- или MLVA/DFR-профилей с данными постоянно пополняемого нами электронного каталога.

- На основании анализа биологических свойств (вирулентности в отношении разных видов животных, ферментативных активностей, частоты мутаций к PgrrT фенотипу), а также DFR- и MLVA-типирования предложены новые внутривидовые таксоны биовар intermedium, а также подвиды: angola, qinghaiensis и xilingolensis.

Предложен вариант приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий необходимо переименование биовара microtus в подвид, а входящих в него филогенетических групп - подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ule-geica и xilingolensis - в биовары.

120

БЛАГОДАРНОСТИ Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору А.П. Анисимову и к.м.н С.В. Дентовской за помощь в формировании научной концепции работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам - сотрудникам ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнолгии, Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, Universite Paris-Sud, Institut de Genetique et Microbiologie (Orsay, France) и Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology (Beijing, China), принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Благодарю директоров ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии -д.м.н., проф. И.А. Дятлова, Иркутского научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока - д.м.н., проф. С.В. Балахонова и Ставропольского научно-исследовательского противочумного института - д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за создание условий для проведения экспериментов, представленных в настоящей работе. Также благодарю директора ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - д.м.н., проф. И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию на диссертационном совете Д 350.002.01 при ФГУН ГНЦ ПМБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические методы типирования микроорганизмов играют важную роль в системе эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями. Разработанные к настоящему моменту методы отличаются по скорости получения результата, своей разрешающей способности, возможности интерпретации полученных данных и воспроизводимости в различных лабораториях [62]. Кроме того, необходимо учитывать стоимость требуемого для анализа оборудования/реактивов и квалификацию персонала [80]. Таким образом, в каждом конкретном случае при выборе наиболее подходящей технологии генотипирования необходимо определиться с оптимальным сочетанием указанных факторов. Особенно важно это при выборе объемов исследований, проводимых в лабораториях регионального и федерального уровней.

Среди методов, используемых для молекулярного типирования Y. pestis, можно выделить две крайности: риботипирование, позволяющее подразделить основные внутривидовые группы (биовары), но неспособное дифференцировать отдельные штаммы, и оценку профилей фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE), позволяющую различать отдельные линии штаммов, но неприемлемую для сравнения отдаленнородственных штаммов из-за значительного количества анализируемых рестрикционных фрагментов [111]. Выбранные в нашей работе методы генотипирования (MLVA и DFR-типирование) занимают промежуточное положение между указанными выше методиками, т.к. количество анализируемых фрагментов ДНК выше, чем при риботипировании, но их разделение при горизонтальном электрофорезе в агарозном геле лучше, чем при PFGE, что обеспечивает более достоверное сравнение близкородственных штаммов. К моменту начала наших . ■i исследований уже существовали базы данных (MLVA25 - во Франции [122] и DFR-типов - в Китае [68; 109]) штаммов, представляющих природные очаги чумы, расположенные вне стран СНГ.

Цель настоящей работы состояла в изучении генетического разнообразия и микроэволюции чумного микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств с использованием методов MLVA- и DFR-типирования.

Для изучения генетического разнообразия и микроэволюции Y. pestis необходим, прежде всего, набор природных изолятов, представляющий различные внутривидовые группы. На начальном этапе нашей работы в коллекции ГНЦ ПМБ было не более 20 штаммов, полученных в прошлом веке из Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб". Вирулентные штаммы (231, 358/12 и др.) использовали в качестве тест-заражающих при оценке вакцинных препаратов, а аттенуированные - как источник генов для конструирования продуцентов протективных антигенов [2]. В ходе исследований разнообразия структуры липо-полисахарида Y. pestis, проводимых совместно с Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом Сибири и Дальнего Востока [100], наша коллекция увеличилась до 38 штаммов, представляющих все циркулирующие на территории СНГ и Монголии подвиды возбудителя чумы. Созданная коллекция послужила основой для участия нашей лаборатории совместно со специалистами Иркутского НИПЧИ СДВ в международном консорциуме по разработке и внедрению в практику здравоохранения унифицированных методов генетического типирования Y. pestis, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов в разных лабораториях и применимых как для дифференциации внутривидовых групп (биоваров, подвидов, экотипов и т.д.) [67; 152], так и отдельных штаммов. Несомненный успех этой начальной стадии исследований послужил основой для включения MLVA- и DFR-типирования в исследования, планируемые в рамках Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)". Совместно с исследователями из Иркутского НИПЧИ СДВ и Ставропольского НИГТЧИ был определен перечень штаммов для дальнейшего исследования, и часть из них была передана в ГНЦ ПМБ для проведения генотипирования в нашей лаборатории. Поэтому разнообразие штаммов с курируемых этими институтами территорий представлено в настоящем исследовании достаточно широко. Все попытки получения типовых штаммов чумного микроба из не представленных в нашем исследовании природных очагов СНГ из Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" при одноименном противочумном институте были встречены вежливыми отказами.

В главах 3 и 4 описано использование методов DFR- и MLVA-типирования для генетической паспортизации набора исследованных штаммов, достоинства и ограничения этих методов по результатам анализа распределения отдельных генотипов по природным очагам чумы. В ходе исследований показано, что MLVA- (Din = 0,993) превосходит DFR-типирование (D;n = 0,687) по способности дискриминировать изо-ляты из разных очагов, мезоочагов и даже штаммы, циркулирующие в одном очаге. Сочетанное применение этих методов повышает их разрешающую способность (Din = 0,996) и позволяет получать дендрограммы, не противоречащие современным представлениям о микроэволюции возбудителя чумы.

Разумеется, пока еще исследовано относительно небольшое количество штаммов Y. pestis только из части природных очагов СНГ и Монголии и требуется дальнейшая работа по сбору недостающих сведений. Но и на современном этапе очевидна возможность плодотворных обобщений. На примере штаммов с неустановленными родословными, Pestoides А и Pestoides F, показана возможность их отнесения к определенным подвидам и природным очагам (subsp. altaica из Горно-алтайском очаге 36 или на граничащей с ним территории Монголии и subsp. caucasica группы очагов Закавказского нагорья - 04-07, соответственно). Циркуляция филогенетически близких или одинаковых генотипов на территории нескольких расположенных рядом природных очагов свидетельствует о необходимости их объединения в единые очаги. Так, Присеванский горный (5) и Зангезуро-Карабахский горный (6) очаги должны быть объединены в Нагорно-Закавказский (5/6), Бозчельский равнинно-предгорный (8) и Джейранчельский равнинно-предгорный (11) - в Бозчельско-Джейранчельский равнинно-предгорный (8/11), а к Горно-алтайскому очагу (36) - присоединены соответствующие территории Монголии.

Современные методы генотипирования Y. pestis позволяют дифференцировать отдельные бактериальные штаммы во внутривидовые группы, соответствующие био-варам, подвидам и экотипам. Однако принятая в практической работе внутривидовая таксономия чумного микроба (табл. 1.1), наиболее полно описанная в нашей недавней публикации [110], не соответствует правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий (МКНБ). Так, в состав основного подвида Y. pestis входят четыре биовара: antiqua, medievalis, orientalis и intermedium, а все неосновные подвиды: altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis, напротив, включены в состав одного биовара - microtus. Для приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами МКНБ необходимо переименование биовара microtus в подвид, а входящих в него филогенетических групп - в био-вары.

Основным итогом методической части настоящей работы является адаптация методов MLVA- и DFR-типирования для штаммов Y. pestis, циркулирующих на территории природных очагов чумы стран СНГ, и создание комплекса методических приемов (электронный каталог, включающий информацию о DFR- и MLVA25-генотипах более 600 штаммов Y. pestis, а также методические рекомендации по проведению молекулярного типирования методом MLVA25) для характеристики штаммов чумного микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств в лабораториях регионального и федерального уровней. Важным этапом проведенной работы является передача нами в 2009 г. предыдущей версии электронного каталога (с генотипами 478 штаммов Y. pestis) и методических рекомендаций в Иркутский НИПЧИ СДВ и Ставропольский НИПЧИ, где их используют в ходе работ, проводимых в рамках Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)". Предлагаемые методы достаточно трудоемки и могут быть использованы в лабораториях противочумных институтов, Референс-центра по мониторингу за чумой и Национальных центров верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, а для первичного изучения штаммов на базе противочумных станций и эпидотрядов вполне достаточно определения "видовой принадлежности штамма (дифференциация чумного микроба от близкородственных иерсиний) проведением моно- и мультило-кусных ПЦР и плазмидного скрининга" в соответствии с комплексным алгоритмом генотипирования и методов оценки генетического разнообразия природных штаммов возбудителей чумы [38].

В заключение следует отметить, что при обсуждении результатов исследований, представленных в различных разделах данной диссертационной работы, мы пытались коротко остановиться на том, как теоретические знания о филогенезе Y. pestis могут быть использованы в совершенствовании диагностики и профилактики чумы. Необходимо также подчеркнуть, что пока многие научные идеи, обсуждаемые в этих главах, являются упрощенными и предварительными, но мы надеемся, что они сыграют роль рабочих гипотез, возбуждая и направляя научную мысль.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Платонов, Михаил Евгеньевич, Оболенск

1. Абрамсон Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы // Вестник ВОГиС.-2007. Т. 11, №2.-С. 307-331.

2. Анисимов А.П. Факторы, обеспечивающие блокообразующую активность Yersinia pestis II Молекул, генетика. 1999. - № 4. - С. 11-15

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекул, генетика.- 2002. № 3. - С. 3-23; №4.-С. 3-11.

4. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. Иркутск, Иркутский государственный университет, 1989. - 92 с.

5. Балахонов С.В. Молекулярно-биологические критерии геномной близости в систематике бактерий рода Yersinia-. Дис. . канд. мед. наук. Иркутск, 1987. -111 с.

6. Балахонов С. В., Шестопалов М. Ю., Романова И. Ф. Результаты VNTR-анализа по локусу (5'-сааа-3')п штаммов Yersinia pestis из активных природных очагов чумы Сибири // Молекул, генетика. 2009. - №3. - С. 14-17.

7. Балахонов С.В., Цэнджав С., Эрдэнэбат А. Новые плазмидовары штаммов возбудителя чумы, изолированных в Монголии // Молекул, генетика. 1991. - № 11.- С. 22-29.

8. Бобров А.Г., Филиппов А.А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Молекул, генетика 1997. -№ 2. - С. 3640.

9. Берлин А.Л., Борзенков А.К. Рамнозопозитивные варианты и дифференциально-диагностическое значение среды с рамнозой // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. 1938. - Т. 17, № 3-4. - С. 238-246.

10. Бессонова А.А. О двух разновидностях В. pestis, обнаруживаемых при росте на глицериновых средах // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. 1928. -Т. 7, №3.-С. 250-253.

11. Бобров А.Г. Изучение распространенности и локализации мобильных элементов IS 100 и IS2S5 в геномах иерсиний: автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1995.- 18 с.

12. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. - № 99. -С. 35-41.

13. Горшков О.В. Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis: автореф. дисс. . канд. биол. наук. Саратов, 2000. - 136 с.

14. Домарадский И.В. Чума. //- М., Медицина. 1998. - 176 с.

15. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева JI.M., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В.Структурно-функциональный анализ гена агаС у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Молекул, генетика. 2009а. -№3.-С. 21-25.

16. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельность генов aspA у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов // Проблемы особо опасных инфекций. 2009b - № 99. - С. 52-54.

17. Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Куклева J1.M. и др. Генотипирование штаммов Yersinia pestis на основе вариабельности генов биосинтеза рРНК // Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007. - № 3. - С. 6-10.

18. Зудина И.В. Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы: автореф. дис. . канд. биол. наук. -Саратов, 2000. 25 с.

19. Иванова B.C., Лебедева С.А., Гончарова Н.А., Гурлева Г.Г. Скрининг плазмид у музейных штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов // Молекул, генетика. 1990. - № 3. - С. 16-18.

20. Иннокентьева Т.И. Повышение вирулентности и изменение других свойств чумного микроба при пассировании его через организм монгольских пищух Горного Алтая: автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1969. - 22 с.

21. Козлов М.П. Чума (природная очаговость, эпизоотология, эпидемиологические проявления) // М., Медицина. 1979. - 192 с.

22. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П.,

23. Одиноков Г.Н., Кутырев В.В. Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов // Проблемы особо опасных инфекций. 2008b. - № 97. - С. 38-42.

24. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирова-ние возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Молекул, генетика. 2003. - № 1. -С. 6-14.

25. Леванова Г.Ф., Блохина И.Н. Применение основных критериев геносисте-матики к некоторым конкретным таксономическим группам бактерий // Биохимия и биофизика микроорганизмов (Межвузовский сборник). Горький, 1987. - С. 82-92.

26. Леви М.И. Классификация разновидностей возбудителя чумы // Тез. докл. науч. конф. по природн. очаговости и профилактике чумы и туляремии (30 октября 2 ноября 1962 г.). - Ростов-на-Дону, 1962. - С. 72-74.

27. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов // М., Медицина. 1969. - 295 с.

28. Михайлова Р.С. Характеристика свойств и классификация штаммов чумного микроба, выделенных на Кавказе: автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1968-20 с.

29. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ генов пар оперона у штаммов Yersinia pestis разных подвидов. // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. - № 98. -40-42.

30. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Сравнительный анализ структуры гена inv у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. - № 100. - С. 50-52.

31. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири // М., 2004.

32. Пейсахис Л.А., Степанов В.М. Внутривидовая классификация возбудителя чумы по принципу географического районирования // Пробл. особо опасных инфекций. 1975.-№ 2. - С. 5-9.

33. Пейсахис Л.А., Степанов В.М., Пошевина Г.О. О глицериннегативных штаммах возбудителя чумы в Среднеазиатском пустынном очаге // Пробл. особо опасных инфекций. 1971. - № 4 (20). - С. 28-32.

34. Ралль Ю.М. Природная очаговость и эпизоотология чумы // М., Медицина.- 1965.-363 с.

35. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В. Наумова, JI.B. Самойловой. Саратов, 1992. - 279 с.

36. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Каштанова Т.Н. и др. Анализ геномного полиморфизма типовых и атипичных штаммов возбудителя чумы с использованием по-лимеразной цепной реакции с универсальными праймерами // Молекулярная генетика.-2004.-№ 1.-С. 22-26.

37. Слудский А.А. Природные очаги чумы полевочьего типа (Структура и функционирование): автореферат дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 1998. - 43 с.

38. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул, генетика 2006. - № 1. - С. 9-19.

39. Сучков И.Ю., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Шишияну М.В., Ми-шанькин Б.Н. Мультилокусный VNTR-анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природных очагах // Молекул, генетика. 2004. - № 4. - С. 19-28.

40. Тимофеева JT.A. О таксономии чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1972. -№ 1 (23). - С. 15-22.

41. Трухачев A.JL, Лебедева С.А. Способы диагностики и дифференциации возбудителя чумы: внутривидовая дифференциация Yersinia pestis II Молекул, генетика. -2006.- № 1: с. 3-6; 2007. -№ 1: С. 3-8.

42. Туманский В.М. О классификации разновидностей чумного микроба // ЖМЭИ. 1957.-№6.-С. 3-7

43. Филиппов А.А. Мобильные генетические элементы патогенных иерсиний: автореферат дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 2001. -24 с.

44. Ян Г. Биологические особенности штаммов чумного микроба из природных очагов России и Китая: автореферат дис. . канд мед. наук. Ставрополь, 2000. -42 с.

45. Achtman M., Zurth K., Molelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14043 - 14048.

46. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K., Klevytska A.M., Jackson P.J., Friedlan-der A.M., Keim P. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis // J. Clin. Microbiol.-2000.-Vol. 38. P. 1516-1519.

47. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis published erratum appears in Clin. Microbiol. Rev. 2004 Jul.; 17:695. // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17. - P. 434-464.

48. Baltazard M. Declin et destin d'une maladie infectieuse: la peste // Bull. World Health Organ. 1960. - Vol. 23, № 2-3. - P. 247-262.

49. Baltazard M., Aslani P. Biochemical characteristics of the strains of wild plague

50. Bobrov A.G., Huang X.Z., Lindler L.E., Filippov A.A., Garcia E. Genotyping of global Yersinia pestis isolates by using IS285, KP-38 // In Proceedings, 25th Army Science Conference,№ 27-30, 2006, Orlando, Florida. 5 p.

51. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic disease caused by yersiniae // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 4. - P. 309-324.

52. Busch U., Nitschko H. Methods for the differentiation of microorganisms // J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 1999. - Vol. 722, № 1-2. - P. 263-278

53. Butler T. Plague and other Yersinia infections // New York, NY: Plenum Press,1983.

54. Cohan F.M. Towards a conceptual and operational union of bacterial systemat-ics, ecology, and evolution // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2006. - Vol. 361, № 1475.-P. 1985-1996.

55. Dai E., Tong Z„ Wang X., Li M., Cui В., Dai R., Zhou D., Pei D., Song Y.,

56. Zhang J., Li В., Yang J., Chen Z., Guo Z., Wang J., Zhai J., Yang R. Identification of different regions among strains of Yersinia pestis by suppression subtractive hybridization // Res. Microbiol. 2005. - Vol. 156, № 7. - P. 785-789.

57. Derbise A, Chenal-Francisque V, Huon C, Fayolle C, Demeure CE, Chane-Woon-Ming B, Medigue C, Hinnebusch BJ, Carniel E. Delineation and analysis of chromosomal regions specifying Yersinia pestis // Infect. Immun. 2010. - Vol.78, №9. -P. 3930-3941.

58. Devignat R. Varietes de l'espece Pasteurella pestis: nouvelle hyphothese 11 Bull. W. H. O. 1951. - Vol. 4. - P. 247-263.

59. Dobrindt U., Hacker J. Whole genome plasticity in pathogenic bacteria // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - Vol. 4, № 5. - P. 550-557.

60. Eisen R.J., Gage K.L. Adaptive strategies of Yersinia pestis to persist during inter-epizootic and epizootic periods // Vet. Res. 2009. - Vol. 40, № 2.

61. Eppinger M., Guo Z., Sebastian Y., Song Y., Lindler L.E., Yang R., Ravel J. Draft genome sequences of Yersinia pestis isolates from natural foci of endemic plague in China//J. Bacteriol. 2009. - Vol. 191, №24.-P. 7628-7629.

62. Eppinger M, Worsham P.L., Nikolich M.P., Riley D.R., Sebastian Y., Мои S., Achtman M., Lindler L.E., Ravel J. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolution and pangenome of the plague bacte

63. Esaki H., Noda K., Otsuki N., Kojima A., Asai Т., Tamura Y., Takahashi T. Rapid detection of quinolone-resistant Salmonella by real time SNP genotyping // J. Microbiol. Methods. 2004. - Vol. 58.-P. 131-134.

64. Feil E.J., Maiden M.C., Achtman M., Spratt B.G. The relative contributions of recombination and mutation to the divergence of clones of Neisseria meningitidis II Mol. Biol. Evol.- 1999.-Vol. 16, № 11.-P. 1496-1502.

65. Feil E.J., Smith J.M., Enright M.C., Spratt B.G. Estimating recombinational parameters in Streptococcus pneumoniae from multilocus sequence typing data // Genetics. — 2000.-Vol. 154, №4.-P. 1439-1450.

66. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin // FEMS Microb. Lett. 1990. - Vol. 67. -P. 45-48.

67. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial food-borne pathogens // Infect. Genet. Evol. 2009. - Vol. 9, № 4. - P. 430-440.

68. Gage K.L., Kosoy M.Y. Natural history of plague: perspectives from more than a century of research // Annu. Rev. Entomol. 2005. - Vol. 50. - P. 505-528.

69. Goyal M., Saunders N.A., van Embden J.D., Young D.B., Shaw R.J. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates by spoligotyping and IS6110 restriction fragment length polymorphism // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, № 3. - P. 647-651.

70. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Res. 2007a. -Vol. 35(Web Server issue). - P. 2-7.

71. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats // BMC Bioinformatics. -2007a.-Vol. 8, № 1. P. 172.

72. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRcompar: a website to compare clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Res. 2008a. -Vol. 36(Web Server issue). - P. 145-148.

73. Grissa I., Bouchon P., Pourcel C., Vergnaud G. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing // Biochimie. 2008b. - Vol. 90. -P. 660-668.

74. Guiyoule A., Grimont F., Iteman I., Grimont P.A., Lefevre M., Carniel E. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains // J. Clin. Microbiol. -1994. Vol. 32. - P. 634-641.

75. Guiyoule A., Rasoamanana В., Buchrieser C., Michel P., Chanteau S., Carniel E. Recent emergence of new variants of Yersinia pestis in Madagascar // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 2826-2833.

76. Hai R., Yu D.Z., Wei J.C., Xia L.X., Shi X.M., Zhang Z.K., Zhang E.M. Molecular biological characteristics and genetic significance of Yersinia pestis in China // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2004. - Vol. 25, № 6. - P. 509-513.

77. Heled J., Drummond A.J. Bayesian inference of species trees from multilocus data // Mol. Biol. Evol. 2010. - Vol. 27, № 3. - P. 570-580.

78. Huang F., Yu D., Hai R., Cai H. Study on the application of random amplified polymorphic DNA in Yersinia pestis genotyping // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. -2000. Vol. 21. - P. 424-426.

79. Huang X.-Z., Chu M.C., Engelthaler D.M., Lindler L.E. Genotyping of a homogeneous group of Yersinia pestis strains isolated in the United States // J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40. - P. 1164-1173.

80. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity // J. Clin. Microbiol. 1988. -Vol. 26.-P. 2465-2466.

81. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W., Schouls L.M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43, № 6. -P. 1565-1575.

82. Kingston J.J., Tuteja U., Kapil M., Murali H.S., Batra H.V. Genotyping of Indian Yersinia pestis strains by MLVA and repetitive DNA sequence based PCRs // Antonie Van Leeuwenhoek. -2009. Vol. 96, № 3. - P. 303-312.

83. Klevytska A.M., Price L.B., Schupp J.M., Worsham P.L., Wong J., Keim P. Identification and characterization of variable-number tandem repeats in the Yersinia pestis genome // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 3179-3185.

84. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G., Morris J.G., Jr, Sulakvelidze A., Stine O.C. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 2674-2684.

85. Lawrence J.G., Hendrickson H. Lateral gene transfer: when will adolescence end? // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50, № 3. - P. 739-749.

86. Lechner D., Lathrop G.M., Gut I.G. Large-scale genotyping by mass spectrometry: experience, advances and obstacles // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - Vol. 6. - P. 3138.

87. Le Fleche P., Fabre M., Denoeud F., Koeck J.L., Vergnaud G. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosis complex based ontandem repeat typing // BMC Microbiol. 2002. - Vol. 2.

88. Lehmann K.B., Neumann R. Atlas und grundriss der bakteriologie und lehrbuch der speziellen bakteriologischen diagnostic 1st ed. // J.F. Lehmann, Munchen, 1896.

89. Lindler L.E. Typing methods for the plague pathogen, Yersinia pestis!I J. AOAC Int. 2009. - Vol. 92, № 4. - P. 1174-1183.

90. Lucier T.S., Brubaker R.R. Determination of genome size, macrorestriction pattern polymorphism, and nonpigmentation-specific deletion in Yersini pestis by pulsed-fieldgel electrophoresis // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 2078-2086.

91. Mollaret H.H., Karimi Y., Eftekhari M., Baltazard M. Burrowing plague // Bull. Soc. Pathol. Exot. Fil. 1963. - Vol. 56. - P. 1186-1193.

92. Mollaret II.H., Mollaret C. Melibiose fermentation in the genus Yersinia and its importance in the diagnosis of the varieties of Yersinia pestis И Bull. Soc. Pathol. Exot. Fil. 1965.-Vol. 58.-P. 154-156.

93. Pei D., Pang X., Song Y., Zhal J., Chen Z., Liu H., Guo Z., Wang J., Yang R. Fluorescent amplified fragment length polymorphism for genotyping Yersinia pestis // Chi.

94. J. End. -2004. Vol. 23. - P. 210-214.

95. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.

96. Picard B. Molecular epidemiology of large bacterial endemics in Sub-Saharan Africa //Bull. Soc. Pathol. Exot. 2000. - Vol. 93, № 3. - P. 219-223.

97. Pourcel C., Andre-Mazeaud F., Neubauer H., Ramisse F., Vergnaud G. Tandem repeats analysis for the high resolution phylogenetic analysis of Yersinia pestis II BMC Microbiol. 2004. - Vol. 4. - P. 22.

98. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies // Microbiology. 2005. - Vol. 151. - P. 653-663.

99. Prentice M.B., Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - Vol. 369. - P. 11961207.

100. Qiu J., Guo Z., Liu H., Zhou D., Han Y., Yang R. DNA microarray-based global transcriptional profiling of Yersinia pestis in multicellularity // J. Microbiol. 2008. -Vol. 46, №5.-P. 557-563.

101. Radnedge L., Agron P.G., Worsham P.L., Andersen G.L. Genome plasticity in Yersinia pestis // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 1687-1698.

102. Rakin, A., Heesemann J. The established Yersinia pestis biovars are characterized by typical patterns of I-Ceul restriction fragment length polymorphism // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1995. - Vol. 3. - P. 26-29.

103. Ruiz M., Rodriguez J.C., Sirvent E., Escribano I., Cebrian L., Royo G. Usefulness of different techniques in the study of the epidemiology of salmonellosis // APMIS. -2003. Vol. 111, № 9. - P. 848-856.

104. Sander A., Ruess M., Bereswill S., Schuppler M., Steinbrueckner B. Comparison of different DNA fingerprinting techniques for molecular typing of Bartonella henselae isolates // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, № 10. - P. 2973-2981.

105. SchorkN.J., Fallin D., Lanchbury J.S. Single nucleotide polymorphisms and the future of genetic epidemiology // Clin.Genet. 2000. - Vol. 58. - P. 250-264.

106. Shangkuan Y.H., Tsao C.M., Lin H.C. Comparison of Vibrio cholerae 01 isolates by polymerase chain reaction fingerprinting and ribotyping // J. Med. Microbiol. -1997. Vol. 46, № 11. - P. 941-948.

107. Shen X, Wang Q, Xia L, Zhu X, Zhang Z, Liang Y, Cai H, Zhang E, Wei J, Chen C, Song Z, Zhang H, Yu D, Hai R. Complete genome sequences of Yersinia pestis from natural foci in China // J. Bacteriol. 2010. - Vol. 192, № 13. - P. 3551-3552.

108. Simpson E.H. Measurement of diversity // Nature (London). 1949. - Vol. 163. -P. 688.

109. Skerman V.B.D., Mcgowan V., Sneath P.H.A. (editors). Approved lists of bacterial names // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - Vol. 30. - P. 225-420.

110. Smith J.E., Thai E. A taxonomic study of the Pasteurella using a numerical technique // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965. - Vol. 64. - P. 213-233.

111. Smith J.M., Feil E.J., Smith N.H. Population structure and evolutionary dynamics of pathogenic bacteria // Bioessays. 2000. - Vol. 22, № 12. - P. 1115-1122.

112. Smith M.J., Arndt A., Gorski S., Fajber E. The phylogeny of echinodermclasses based on mitochondrial gene arrangements // J. Mol. Evol. 1993. - Vol. 36, № 6. -P. 545-554.

113. Sneath P.H.A., Socal R.R. Numerical Taxonomy //Nature. 1962. - Vol. 139, №48.-P. 53-58.

114. Sokurenko E.V., Gomulkiewicz R., Dykhuizen D.E. Source-sink dynamics of virulence evolution // Nat. Rev. Microbiol. 2006. - Vol. 4, № 7. - P. 548-555.

115. Souza R.A., Falcao D.P., Falcao J.P. Emended description of the species Yersinia massiliensis II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. - DOI 10.1099/ijs.0.021840-0.

116. Weiner M.P., Hudson T.J. Introduction to SNPs: discovery of markers for disease // Biotechniques (Suppl. 4-3). 2002.

117. Yersin A. La peste bubonicque a Hong-Kong // Ann. Inst. Pasteur 1894. -Vol. 8.-P. 662-667.

118. Zhang W., Qi W., Albert T.J., Motiwala A.S., Alland D., Hyytia-Trees E.K. Probing genomic diversity and evolution of Escherichia coli 0157 by single nucleotide polymorphisms // Genome Res. 2006. - Vol. 16. - P. 757-767.

119. Zhang X, Hai R, Wei J, Cui Z, Zhang E, Song Z, Yu D. MLVA distribution characteristics of Yersinia pestis in China and the correlation analysis // BMC Microbiol. -2009.-Vol. 23 9:205.

120. Zhang G., Zhang J., Wang R. Survey of natural focuses of Plague and epidemic situations in China (in Chinese) // Chin. J. Ctrl. Endem. Dis. 2002. - Vol. 17. - P. 101-103.

121. Zhou D., Han Y., Song Y., Huang P., Yang R. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004a. - Vol. 6 - P. 1226-1234.

122. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

123. Федеральное государственное учреждение науки

124. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ1. ФГУН ГНЦ ПМБ)1. УТВЕРЖДАЮ

125. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО VNTR-АНАЛИЗ А (Методические рекомендации)1. Оболенск 2009

126. Методические рекомендации предназначены для специалистов, занимающихся выделением, идентификацией и генотипированием чумного микроба.1. РАЗРАБОТАНО:

127. Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»1. АВТОРЫ:

128. Науч. сотр. лаборатории микробиологии чумы Мл. науч. сотр. лаборатории микробиологии чумы Мл. науч. сотр. лаборатории микробиологии чумы Зав. лаб. микробиологии чумы, канд. мед наук Зам. директора по научной работе, д-р мед наук, проф.

129. М.Е. Платонов В.В. Евсеева

130. С.В. Дентовская А.П. Анисимов1. Е.В. Чиркова1. СОГЛАСОВАНО:

131. Зав. лаб. биологической безопасности, канд. мед наук1. Е.А. Тюрин1. РЕЦЕНЗЕНТЫ:

132. Зав. отделом особо опасных инфекций, канд. мед наук

133. Зав. лаб. микробиологии туляремии, канд. физ.-мат. наук

134. Ст. науч. сотр. отдела молекулярной микробиологии, канд. биол. наук1. A.Н. Мокриевич1. B.М. Павлов Н.К. Фурсова1. Принцип VNTR анализа.

135. Санитарные правила СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности)" М., 2003.

136. Методические указания МУ 1.3. 1794-03 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности» -М., 2003.

137. ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

138. MLVA Multiple-Locus VNTR Analysis) - мультилокусный VNTR-анализ

139. VNTR (Variable-Number tandem repeat) - вариабельные тандемные повторы - участки

140. ДНК с переменным количеством прямых повторов

141. ПЦР полимеразная Цепная Реакцияампликон продукт ПЦР (амплификации)дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфатып.о. пара оснований31. Формула метода

142. Генотипирование Yersinia pestis проводится путем определения количества тандемных повторов в 25 VNTR-локусах.

Информация о работе

Платонов, Михаил Евгеньевич
кандидата биологических наук
Оболенск, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы