Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis"

ШАЙХУТДИНОВА Рима Завдатовна

На правах рукописи

UU3165212

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА YERSINIA PESTIS

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 ^2008

Москва - 2008

003165212

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель —

доктор медицинских наук Анисимов Андрей Павлович Официальные оппоненты

доктор биологических наук Лахтин Владимир Михайлович доктор биологических наук Черепанов Петр Алексеевич Ведущая организация

Федеральное государственное учреждение науки «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « » J? 2008 года в /& часов на

заседании диссертационного совета Д 208 046 01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, д 10 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского»

Автореферат разослан «_ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук СЮ Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы.

Липополисахариды (ЛПС) - компоненты внешней мембраны грамотрица-тельных бактерий, обуславливающие в значительной степени физико-химические и биологические свойства бактериальных клеток ЛПС обеспечивает целостность и стабильность мембраны, селективную проницаемость и межклеточные взаимодействия [Ludentz et al, 1982] Кроме того, ЛПС - один из основных факторов патоген-ности грамотрицательных бактерий [Raetz, Whitfield, 2002]

Молекулы ЛПС, как правило, состоят из липида, называемого липидом А, который ковалентно связан с гетерополисахаридными цепями, включающими две субструктуры - коровые олигосахариды (непосредственно связаны с липидом А) и О-специфические цепи, которые представляют собой повторяющиеся олигосаха-ридные единицы Такой тип структуры придает ЛПС амфифильный характер из-за гидрофобности липида А и гидрофильносги гетерополисахаридных цепей [Zahnnger etal, 1994]

Липид А — часть молекулы ЛПС, ответственная за его эндотоксическую активность, то есть способность вызывать эндотоксический шок, возникающий в результате лавинообразной экспрессии провоспалительных цитокинов, основным из которых является TNF-ct [Beutler, Cerami, 1988, Dinarello, 1991] К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о зависимости эндотоксической активности ЛПС от количества, длины, степени насыщенности жирнокислотных остатков, а также наличия фосфатных групп в липидной части молекулы ЛПС Показано, что максимальной эндотоксической активностью обладает ЛПС с дифосфо-рилированным липидом А, состоящим из двух /М,6-связанных остатков D-глюкозамина, ацилированный шестью жирными кислотами [Rietschel et al, 1987, Takada et al, 1992] Любые отклонения от этой структуры приводят к уменьшению токсичности молекулы [Rietschel et al, 1994] Кроме того, показано, что есть определенная зависимость между токсичностью и пространственной конформацией молекул ЛПС, которая определяется Тс-температурой фазового перехода от ламелляр-

ной (бислойной) фазы в гексагональную фазу Наиболее биологически активный липид А имеет коническую или цилиндрическую форму [Seydel et al, 1993]

В отличие от большинства других патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, Yersiniapestis - возбудитель чумы, продуцирует ЛПС, лишенный О-полисахаридных цепей [Brubaker, 1972, Darveau et al, 1983, Prior et al, 2001] ЛПС штаммов Y pestis, выращенных при температуре 28 °С, более токсичен для мышей, чем ЛПС штаммов Y pestis, выращенных при температуре 37 °С [Тынянова и др, 2003], что связано с отличиями в структуре молекул ЛПС [Kawahara et al, 2002]

Наличие ЛПС (эндотоксина) в составе живых и убитых вакцин на основе грамотрицательных бактерий, в том числе и чумных, используемых в настоящее время, определяет их высокую реактогенность Это является их основным недостатком [Дмитровский, 1994, Медуницын, 1997, Galanos, Freudenberg, 1993, Raetz, 1990, Raetz, Whitfield, 2002, van Amersfoort et al, 2003, van der Poll, van Deventer, 1999, Дентовская и др, 2006] Альтернативные им "химические" вакцины позволяют за счет введения в их состав только иммунодоминантных антигенов значительно снизить реактогенность препарата в целом, эффективны для ревакцинации, могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками и исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса Однако, вакцины, сконструированные на основе однош-двух индивидуальных иммунодоминантных антигенов, не являются идеальными, т к не могут обеспечить зашиты от всех вирулентных вариантов возбудителя инфекции Отсутствие у патогена антигенов, использованных в составе вакцины, или присутствие их серологически отличающихся вариантов позволяют измененным формам микроорганизмов уклоняться от иммунитета, индуцированного подобной вакцинацией [Amsimov et al, 2004]

В то же время показано, что вакцина живая чумная на основе штамма EV линии НИИЭГ обеспечивала защиту животных как от штаммов "дикого" типа (индекс иммунитета (ИИ) для белых мышей и 3,3 х 104, для морских свинок « 1,4 х Ю5), так и от их бескапсульных вариантов (ИИ для белых мышей » 2,6 х 102, для морских

свинок и 1,2 х 106) [Анисимов, 1999] Есть данные, что вакцина живая чумная эффективна и в отношении "полевочьих" штаммов возбудителя чумы [Абгарян, 1966], в которых V антиген представлен вариантом, характерным для У enterocolitica О 3 серовара [Amsimov et al-, 2007, Worsham, Hunter, 1998] Оба серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y pestis с V антигеном другого серовара [Gnffin et al, 1998; Roggenkamp et al, 1997] Это подтверждает то, что наличие в живых вакцинах, сконструированных на основе атгенуированных штаммов, не только одного-двух иммунодоминантных, но и целого спектра сложных (комплекс белка с ЛПС и т п), конформационно-лабильных и минорных антигенов обеспечивает индукцию "гетерогенного" иммунного ответа, способного защитить макроорганизм от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью Для конструирования современных живых чумных вакцин со сниженной реактогенностью необходима генно-инженерная модификация ЛПС У pestis, обеспечивающая образование молекул со сниженной эндотоксической активностью

Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Escherichia coli и Salmonella enterica bv Typhimunum Определены кластеры генов, кодирующие биосинтез липида А, кора и О-антигена [Coleman, Raetz, 1988, Austin et al, 1990, Clementz, 1992] Одним из этапов синтеза липида А является процесс вторичного ацилирования, в котором участвует целый ряд ацилтрансфераз LpxL (HtrB), LpxP и LpxM (MsbB) [Clementz et al, 1997, Murray et al, 2001] В частности, показано, что мутация по i ену IpxM в клетках сальмонелл приводила к снижению степени ацилирования липида А и, соответственно, к снижению вирулентности (токсичности) на три-четыре порядка [Raetz, Whitfield, 2002] Доступносгь же аннотированных геномов нескольких штаммов Y pestis fhttp //www encbrc org/portal/enc/versmiapestis^id^default&subid^yersiniapestis) дает возможность провести направленный поиск аналогичных генов и их последующий сайт-направленный мутагенез в клетках возбудителя чумы Исследование структурно-функциональной организации ЛПС возбудителя чумы с привлечением ком-

плекса методов бактериологии, аналитической химии, биофизики и иммунологии позволит получить новые сведения о биосинтезе этой молекулы, ее роли в патогенезе и иммуногенезе чумы Это создаст основу для разработки методологии полусидя штаммов чумного микроба с генно-инженерно модифицированным ЛПС, необходимую для конструирования нового поколения вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью

Цель исследования: Получение новых данных о структурно-функциональной организации и генно-инженерная модификация липополисахарида У pestis, направленная на снижение его эндотоксической активности

Задачи исследования:

1 Определить структуру ЛПС из штаммов различных внутривидовых групп У pestis, выращенных при различных температурах

2 Изучить зависимость эндотоксической активности ЛПС от его структуры

3 Разработать на основе методов генной инженерии и с учетом полученных данных о структурно-функциональной организации ЛПС У pestis методологию получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью

4 Оценить биологические свойства мутантов У pestis со сниженной эндотоксической активностью ЛПС, включая вирулентность и иммуногенную активность

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы получены новые данные о структуре корового олигосахарида штамма биовара onentalis (ssp pestis), а также структуре ЛПС штаммов возбудителя чумы ssp pestis, принадлежащих к биоварам antiqua и medievalis, и подвида caucasica (bv antiqua) Установлено, что структура ЛПС зависит от подвидовой принадлежности и температурных условий культивирования бактерий

Выявлена зависимость биологических свойств У pestis от структуры ЛПС Установлено, что более высокая степень ацилирования липида А вызывает повы-

шение ТМ^-а-индуцирующей активности - основного медиатора септического шока в патогенезе инфекций, вызванных грамотрицательными микроорганизмами

Установлено, что мутация по гену 1рхМ, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид А У рсхн,*; шестого жирнокислотного остатка -лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба "дикого" типа, но снижает вирулентность аттенуированных штаммов У ре.чШ

Показано, что отсутствие в клетках 1рхМ мутанта вакцинного штамма ЕУ гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетагшым снижением остаточной вирулентности и повышением протективной активности на модели мышей

Практическая значимость работы. Разработана простая и надежная методика направленного конструирования вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью Сконструированный штамм У рет/и ЕУД 1рхМ, дефектный по синтезу гексаацильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой вакцины живой чумной В коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 4 авторских штамма У рюШ, мутантных по гену 1рхМ

Внедрение результатов работы Результаты проведенных исследований послужили основой для составления ниже перечисленных документов

- Методические рекомендации «Получение очищенных препаратов ЛОС У ретйя» Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения)

- Методические рекомендации «Сайг-направленный мутагенез генома чумного микроба» Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения)

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета

Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы, а также препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Московская обл), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Мо-

сковская обл), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), ГИСК им Л А Тарасевича (Москва), Института биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН (Москва), Саратовского Государственного университета им НГ Чернышевского (Саратов)

Положения, выносимые на защиту:

1 Выявлены особенности, определяющие современные представления о структуре ЛПС Y pestis основного подвида биоваров antiqua, medievalis, onentahs, а также подвидов caucasica и altaica Установлено, что в бактериальной клетке одновременно образуется несколько структурных вариантов молекул ЛПС, которые отличаются по степени ацилирования и степени замещения аминоарабинозой фосфатных остатков в липиде А, по концевым углеводным остаткам в олигосахариде кора Температура культивирования определяет преобладание определенных структурных вариантов ЛПС

2 Мутация по гену IpxM, приводящая к избирательному «выключению» синтеза гексаацильных форм ЛПС, вызывает снижение вирулентности аттенуирован-ных штаммов Y, pestis в отношении белых мышей, не вызывая аналогичных изменений при использовании мутантных штаммов Y pestis "дикого" типа

3 Сочетанное снижение остаточной вирулентности и повышение протектив-ной активности вызывается отсутствием в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма EV гексаацильных молекул ЛПС Величина LDS0 мутанта YNAlpxM при подкожном (п/к) заражении мышей, по сравнению с исходным штаммом, снизились в 4,6 раз, а протективная активность в отношении вирулентного штамма 231 выросла на 2 порядка

Апробация материалов диссертации. Апробация диссертации проведена на межлабораторном научном семинаре сотрудников ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии 24 июля 2007г Результаты работы представлены на 20 научных конференциях, в том числе 7th International Symposium on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998 r), 8th International Symposium on Yersinia (Turku, Finland, 2002 г), Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Даль-

него Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 г), 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология состояние и перспективы развития" (10-14 ноября 2003 г, Москва), Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review" (Санкт-Петербург, 12-15 июля 2004г), 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, October 10-14,2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ Объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 36 источников отечественных и 172 - зарубежных авторов Работа иллюстрирована 29 рисунками и 11 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования.

В работе использовали 12 авирулентных штаммов Y pestis различных подвидов pestis, caucasica и altaica, а также вирулентный штамм Y pestis ssp pestis 231 (РКПБ «Микроб», МЖК ГНЦ Г1БМ) Для проведения генетических манипуляций использовали штаммы Е coli DH5a, SM10 Дргг, S17-1 Apir (МЖК ГНЦ ПБМ) Биомассу Y pestis для выделения препаративных количеств ЛПС нарабатывали в жидкой аэрируемой среде на основе солянокислого гидролизага казеина и дрожжевого автолизата в лабораторном ферментере фирмы «New Brunsuik Scientific» (США) Штаммы Е coli выращивали на жидких или плотных питательных средах Луриа-Бергани (LB) при температуре 37 °С [Miller, 1972] Для мутагенеза Y pestis клетки выращивали на жидких и плотных питательных средах Хоттингера или ВН1 (Brain Heart Infusion Broth) pH 7,2-7,4 при 28 °С

Инактивацию гена IpxM в клетках Y pestis проводили с помощью плазмиды pMSB3K, созданной на основе суицидного вектора pCVD442, позволяющей за счет гомологичной рекомбинации осуществлять замену интактного гена IpxM хромосо-

мы на рекомбинантный ген, созданный заменой 0,66 kb участка гена на 1,2 kb BamHI фрагмент плазмиды pUC4K, несущий устойчивость к канамицину (настоящее исследование (НИ))

Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству Mamatis et al [1982] Передачу рекомбинантных плазмид в штаммы Е coli осуществляли "кальциевым" методом трансформации по Cohen, Chang [1973], а в клетки Y pestis, методом электростимулируемой трансформации [Еремин и др, 1991] и конъюгации [Miller, 1972]

Комплементацию дефектного гена IpxM проводили с использованием в качестве вектора плазмиды pUC19, содержащей вставку IpxM из исходного штамма Y pestis (НИ)

Выделение ЛПС проводили по Galanos [1969], с использованием этапов очистки, включающих ферментативный гидролиз и ультрацентрифугирование При необходимости препараты ЛПС очищали от фосфолипидов по методу Bligh, Dyer [1951] Для проведения скрининговых исследований ЛПС выделяли по Hitchcock, Brown [1983]

Электрофоретический контроль препаратов ЛПС проводили по Laemmli [1970] и Остерману [1985] Для визуализации ЛПС гели окрашивали аммиачным раствором оксида серебра после окисления йодной кислотой в соответствии с рекомендациями Tsai, Frash [1982] Содержание белковых примесей в препаратах ЛПС оценивали по Bradford [1976] или Lowry [1951] Содержание нуклеиновых кислот определяли спектрометрически, измеряя оптическую плотность при 260 нм [Wetmur, Davidson, 1968], и по окрашиванию препаратов бромистым этидием при электрофоретическом разделении в 0,7 % агарозном геле [Sharp et al, 1973]

Определение структуры полученных препаратов ЛПС проводили с использованием методов спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (MC)

Дефосфорилирование препаратов ЛПС проводили с использованием плавиковой кислоты [Беспалова и др 1995], а дезацилирование - с использованием раствора 0,25 M NaOH согласно Borreih et al [1995]

Определение LD50 препаратов ЛПС проводили на 8-10 недельных самках мышей линии Swiss Webster Животным вводили внутрибрюшинно (в/б) двукратные разведения препаратов ЛПС, растворенных в апирогенном 0,9% растворе NaCl Максимальная доза ЛПС составляла 3000 мкг, минимальная - 187,5 мкг Для повышения чувствительности к действию ЛПС животных сенсибилизировали в/б введением раствора актиномицина Д (10 мкг в 0,2 мл апирогенного 0,9 % раствора NaCl на мышь), содержащего 10-кратные разведения препаратов ЛПС

Для сравнения протективной активности (ImD50) штамма Y pestis EV НИИЭГ и его IpxM мутанта мышей иммунизировали п/к десятикратными разведениями двухсуточных культур, приготовленных в 0,9 %-ном растворе NaCl (109 КОЕ-Ю5 КОЕ на животное, по 7 мышей на одну дозу) Двум группам мышей вводили только 0,9 %-ный раствор NaCl Через 21 сут после иммунизации мышей п/к заражали аналогично приготовленной суспензией штамма Y pestis 231 в дозе 2,1 х 105 КОЕ (3,5 х Ю4 LD50) на животное Контрольные группы заражали двумя дозами штамма Y pestis 231 2,1 х 105 КОЕ (3,5 х 104 LD50) и 1,0 х 102 КОЕ (17 LD,0) За животными наблюдали в течение 21 дня с момента заражения Величины LD50j 1шО50и доверительные интервалы (для вероятности 95 %) вычисляли по методу Karber [Ашмарин, Воробьев, 1962]

Сравнение антигенной активности штамма Y pestis EV НИИЭГ и его IpxM мутанта проводили на беспородных белых мышах Суспензии двухсуточных 28 °С-ных культур, приготовленных в 0,9 %-ном растворе NaCl вводили п/к в дозе Ю7КОЕ на животное (по 10 мышей на дозу) Контрольной группе мышей (3 мыши) вводили по 0,2 мл 0,9%-ного раствора NaCl Иммунохимическую активность антисывороток тестировали через 21 сут и 28 сут методом ИФА с использованием в качестве антигенов капсульного антигена Fl, V антигена, мышиного токсина, ЛПС и дезинтегрированной улыразвуком клеточной суспензии Y pestis EV НИИЭГ

TNF-a-индуцируюшую активность ЛПС тестировали in vitro на модели мак-рофагоподобной линии клеток мышей J774 AI В качестве положительного контроля использовали ЛПС штамма Е coli 055 В5 (Sigma), а отрицательного - ЛПС F tularensis 15/10 (выделено нами по Westphal)

11

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАВИСИМОСТЬ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ЛПС ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ВНУТРИВИДОВЫХ ГРУПП 7. ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Учитывая тот факт, что повышение температуры культивирования чумного микроба с 26 °С до 37 °С приводит к уменьшению размеров молекул ЛПС (Оагуеаи, 1983; Гремякова и др., 1999), мы провели структурное исследование молекул ЛПС представителей некоторых внутривидовых групп К рехИя, выращенных в различных температурных условиях, имитирующих температурные режимы жизненного цикла микроорганизма в период сохранения в организме зимоспящих грызунов и их эктопаразитов (6 °С), в организме насекомых в летний период (21-28 °С) и организме активных млекопитающих (37 °С).

Метод элекгрофоретического разделения препаратов ЛПС позволил детектировать разнообразные формы молекул ЛПС не только по скорости миграции, но даже по площади и по интенсивности окрашиваемых пятен (рис. 1). Скорость миграции молекул ЛПС, выделенных из штаммов 7. /эау/и, выращенных при 25 °С (ЛПС-25) и 37 °С (ЛПС-37), отличалась - у последних она была выше, а окрашиваемое пятно более компактно, что свидетельствует о меньшем разнообразии структурных вариантов ЛПС при 37 °С.

1 23 456 789 10 11

Рисунок 1. Электрофоретическое разделение препаратов ЛПС из штаммов Y. pestis, выращенных при 25 °С или 37 °С и ЛПС из К coli 055:В5 (окрашивание серебром). Треки 1,2- КМ218 - 25 и 37, соответственно; треки 3, 4 - KIMD1 - 25, 37, соответственно; треки 5, 6 - КМ260(11) - 25; 37; треки 7, 8 - 1146 -25; 37, треки 9, 10 - EV11M - 25, 37, соответственно; трек 11 -Е. coli 055:В5.

Был проведен анализ полученных МС и ЯМР - спектров выделенных препаратов ЛПС и установлены их детальные структуры Коровая часть ЛПС У резПв, подобно ЛПС других энтеробактерий, состоит из внутренней части, представленной

Кёо дисахаридом и гептозным

tí-uillcpp-(W3)-a-u>Hcpp'-0->'>)-a Kdo/>-<2-> 7 4

Í т

I 2

га-М)Нсрр"' a-Kdcyj"

Н Г ЕС

3-D-Glc/íNAc-(l-+3)-L-a-D-HeRp-(l->3)-L-a-D-Hep/)41-»5)-Kdo

7 4 4

t t т

1 1 2 D-ct-D-Hepp-(l->7)-L-a-D-Hepp р-D-Glcp oc-Kdop

K/J G I D

L-a-D-Hepp-(l-»3)-L-a-D-Hepp-(l->5)-Kdo

7 4 4

T t í

1 1 2 D-a-D-Hepp-(l-+7)-L-a-D-Hepp p-D-Glcp a-Kdop

P-D-GlcpNAc-(l-+3)-L-a-D-lIepp41->3yL-a-D-Hepp41-»5)-Kdo

7 4 4

t t t 1 1 2 p-D-Ga1p-(l->7)-L-a-D-Hepp P-D-Glcp a-Kdop

L-cc-D-Hepp-(l ->3)-L-a-D-Hepp-(l ->5)-Kdo 7 4 4

T T t

1 1 2 P-D-Gal-(l-í-7)-L-a-D-IIepp р-D-Glcp a-Kdop

p-D-GlcpNAc-(l->3)-L4i-D-Hcpp-(l->3)-L-a-D-Hepp-(l-^5)-Kdo

D-a-D-Hepp-( 1 -»7)-L-a-D-Hepp

t 1

P-D-Glcp

T 2

a-Kop

I -ct-D-Hcpp-(l—*3)-L4x-D-Hepp-(l—>5)-Kdo

7 4 4

t t t

1 1 2

D-a-D-Hep/7-(l-»7)-L-a-D-Hep/> P-D-Glcp a-Kop

la

la'

Ib

Ib'

le

le'

трисахаридом (рис 2) Рисунок 2. Структура внутренней области кора ЛПС Y pestis

По результатам ЯМР-спекфоскопии, общая структура кора ЛПС Y pestis основного подвида биовара onentalis штамма КМ218 (25 °С) характеризуется высокой степенью гетерогенности, которая связана с одновременным синтезом нескольких глико-форм Отличия между ними проявляются как в строении внутреннего участка кора (одна из них содержит Ко, а другая - Kdo в положении D), так и внешнего участка (одна гликоформа содержит Gal К, а другая - DD-Hep J) Дополнительная гетерогенность обусловлена несте-

р-0-01срЫАс-(1^3)-ь-а-0-Нерр-(1->3)-Ь-а-0-нер/)-(1->5)-ка0 ы хиометрическим замещени-

7 4 4

т I ^ ем остатка ЬЭ-Нер Р в по-

1 1 2 ложении 3 остатком GlcNAc

Р- 0-Са1^-( 1 —>7)-Ь-а-0-Нер/? Р-Б-С1ср а-Кор

Ь-а-0-Нер/т-(1->3)-Ь-а-0-Нерр-(1—>5)-Кс1о 1сГ Н (рис 3)

7 4 4

Т Т Т

1 1 2 Р- 0-0а1^-(1—>7)-Ь-а-Е)-Нер/> Р-О-йср а-Кор

Рисунок. 3. Установленные варианты структур кора ЛИС штамма К рЫа КМ218, выращенного при температуре 25 °С

Таблица 1. Структурные варианты кора в ЛПС различных штаммов К рЫв, выращенных при 25 °С и 37 °С

1 к или а н У резЬ1$ У ре б б саисагюа

КМ218 КМ260 К1МЛ1 1146

25°С 37°С 25°С 37°С 25°С 37°С 25°С 37°С

а КсЬ1 о-а-й-Нср р-астс ++ ++ + ++ ++ ++

Ь Мо1 р-вШАс ++ + + ++

с а-Ко П-а-о-Нср р-вШАс ++ + ++ + ++ +

<1 а-Ко /?-Са1 ++ ++ ± ++ +

е као1 Н Р-асИАс ++

а' Кск>' п-а-ц-Нер н + + + + ++ +

Ь' Кск.1 Р-вЫ н + + + + +

с' а-Ко В-а-п-Нер н ++ ++ ++

а- а-Ко /?-Оа1 н ++ -н- ++ ++ +

в* Кск>! Н н ++

Кс1о - концевой остаток Кс)о в положении Б. Гликозвдная связь Ыо-ВИо разрывается в условиях

мягкого кислотного гидролиза, а связь Кс1о-Ко остается в этих условиях стабильной ++ - преобладающее количество, + - минорное количество, ± - следовые количества.

Культивирование при 37 °С приводило к синтезу гликоформ кора 1а и 1а' -уменьшение температуры увеличивало разнообразие синтезируемых гликоформ

Кор 7 ра1и- подвида саисаиса отличался от кора основного подвида отсутствием ББ-Нер в положении К при любой температуре культивирования, что, по-видимому, определяется или дефектом синтеза ББ-Нер или ее переноса Присоединение галактозы, главным образом, происходило при 25 °С и лишь в незначительной степени - при 37 °С

Кор штамма Y pestis И-2377 подвида altaica можно отнести к структурному типу ЛПС Y pestis 1146 по отсутствию терминального остатка DD-Hep Кроме того, ЛПС штамма И-2377-25 отличался присутствием молекул (~ 13 %) с остатком фос-фоэтаноламина (EtNP), который мы ранее наблюдали только в коре ЛПС пггаммов КМ218 [Knirel et al, 2005] и 260(11), вьфащенных при 6 °С

Е Для кора этого минор-

ß-D-GlcpNAc-(l->3)-L-a-D-Hep/j-(l—>3)-L-a-D-Hcp/7-(l->5)-Kdo

ного варианта ЛПС из

т штамма И-2377-25

2

a-Kdo/7 (7->) EtNP предложена следующая структура Е (рис 4)

Рисунок 4. Гликоформа коровой части ЛПС штамма И-2377-25

Содержание других заместителей в коре также зависело от температуры выращивания Например, содержание GlcNAc у штаммов основного подвида Y pestis увеличивалось с 0,5 до 0,9 относительно стехиометрического содержания, а глицина - уменьшалось с 0,25 до 0,1 при повышении температуры культивирования с 6 °С до 37 °С При 6 °С происходил синтез гликоформы, характеризующейся большим содержанием DD-Hep по сравнению с галактозой и присоединением фос-фоэтаноламина в положение 7 концевого Ко или Kdo Ее характерными чертами является отсутствие глицина и меньшее содержание GlcNAc по сравнению с другими гликоформами

Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать вывод о вариабельности коровой части ЛПС Y pestis Существование DD-Нер-содержащих гли-коформ выявлено в штаммах Y enterocohtica [Oertelt et al, 2001], в то время как гликоформы, содержащие галактозу, встречаются только в штаммах Y pestts

При проведении масс-спектрометрического анализа ЛПС и липида А штаммов Y pestis основного подвида с полноценным ЛПС (КМ218, КМ260 и KIMD1), подвидов caucasica (1146 и 1680р~) и altaica (И-2377) нами были подтверждены данные о структуре липида А, полученные незадолго до нас в отношении культур Y pestis, выращенных в диапазоне температур 27 °С-37 °С [Aussei et al, 2000,

t т

i i ß- D-Galp-(1—>7)-L-a-D-Hep/> ß-D-Glc/>

Kawahara et al, 2002] Кроме того, мы впервые определили полную структуру ЛПС из клеток Y pestis, выращенных при температуре 6 °С Все возможные структурные варианты липида А представлены на рис 5 Структура липида A Y pestis оказалась подобна аналогичной струетуре других представителей семейства Enterobacteri-асеае Липид А состоит из /Д->6 связанного дисахарида D-глюкозамина (GlcN), фосфорилированного в позиции 1 и 4' Четыре (Я)-3-гидроксимиристоила (ЗН014 0) в качестве первичных жирных кислот в позициях 2, 2', 3 и 3' связаны с углеводной основой В штаммах "дикого" типа встречаются тетра-, пенга- и гексаа-цильные варианты липида А В дополнение к четырем первичным ацильным группам гексаадильный липид А (типы А1 и А2) содержит остатки лауриновой (12 0) и пальмитолеиновой (16 1) кислот, связанных в качестве вторичных кислот с ОН-группами двух остатков 3-гидроксимиристиновых кислот, формируя ацилоксиа-цильную структуру в позициях 3' и 2' остатка глюкозамина, соответственно В пен-таацильном липиде А отсутствует пальмитолеиновая группа (тип В1) Тетраадиль-ный липид А представлен двумя вариантами (типы Cl и С2) первый - содержит только первичные ацильные группы (тип Cl), второй - имеет три ЗН014 0 и одну 16 1 ацильные группы (тип С2)

Выявленные нами детальные изменения структуры липида А в зависимости от изменения температуры культивирования представлены в табл 2

Гексаацильный тип А1 липида А не синтезировался при 37 °С, его синтез происходил только при пониженных температурах - 6 °С и 25 °С, в то время как тип В1 пенгаацильного варианта липида А был представлен в минорных количествах при 37 °С Тип Cl тетраацильного липида А был характерен для бактерий, выросших при 37 °С, но присутствовал также и при (21-28) °С Уровень ацилирования липида А при выращивании бактерий в этом диапазоне температур варьировал от штамма к штамму и зависел от условий культивирования Альтернативный тип С2 тетраацильного липида А образовывался при 6 °С

Все представленные типы липида А, кроме типа С2 могли быть модифицированы гликозилированием по одной или двум фосфатным группам катионным углеводом 4-амино-4-дезокси-Ь-арабинозой (Ara4N) В штаммах основного подвида и

16

представителя ssp. altaica, И-2377, содержание Ara4N увеличивалось с уменьшением температуры и достигало стехиометрического соотношения при 25 °С. При 6 °С в штамме КМ218, наряду с Al и С1 формами липида А, насыщенными Ara4N, сосуществовали типы А2 и С2, полностью лишенные этого углевода. В штамме 1146 содержание Ara4N было близко к стехиометрическому и практически не зависело от температуры. Липид А штамма EVI IM содержал тетраацильный тип С1 и пен-таацильный вариант со вторичной жирной кислотой 16:0 в неидентифицированной позиции. Модифицирование Ara4N происходило частично и не было связано с температурными колебаниями.

Наши данные подтвердили, что структура липида А, как и структура коровой части менялась в зависимости от температуры выращивания. Понижение температуры выращивания до 25 °С приводило к повышению степени ацилирования липида А. Кроме того, уровень гликозилирования фосфатных групп липида А был существенно выше и достигал почти стехиометрического соотношения при 25 °С по сравнению с 37 °С.

[КаЬ,-

.£?•«'• ,» ... __ - Т г 5е ^

9 }' 4 $

А1

В1

jCcxef-

t i

< < í Г Г í И ; <

шТ г Г

А2

t

/ <

В2

C1

í !

r-KP

С2

Рисунок S. Структурные варианты липцда А К pestis

[Aussei el al., 2000; Kawahara et al., 2002, настоящее исследование]

^S¡¿ ^ " гексаацильные варианты лигщда А, синтезируемые бактериями, выращенными при 25 "С и 6 °С). В - пентаацильные варианты липида А, синтезируемые при 25 "С клетками "дикого" типа (В1) или IpxM мутантом (В2). С - тетраацильные ва-

С

S ? > > ■ff и

>-

ir

< 4

риангы липида А, синтезируемые при 37 "С и 25 °С, и тетраацильный липид А, синтезируемый при 6 "С Точками отмечено нестехиометрическое гликозилирование фосфатных групп Ага4Н

Жизненный цикл У. раНл- представляет собой цепь последовательных передач от пойкилотермных блох (< 30 °С) теплокровным хозяевам - грызунам (37 °С),

17

что сопровождается глобальными изменениями в экспрессии генов, отвечающих за адаптацию к этим отличающимся экологическим нишам [Yanpmg et al, 2005] При этом, структура ЛПС Y pestis, так же как и у других иерсиний, является терморегулируемой, изменение температуры культивирования от 26 °С до 37 °С приводит к уменьшению молекулярной массы этой биомолекулы [Darveau, 1983, Гремякова и др, 1999, Kawahara et al, 2002, Rebeil et al, 2004, настоящее исследование]

Таблица 2 Относительное содержание (%) компонентов ЛПС у различных штаммов У резш в зависимости от температуры культивирования

Варьирующиеся компонентов ЛПС БЭР рСНИ ээр саисаяса актса

КМ218 КШО! КМ260 1146 1680р" И-2377

25 °С 37 °С 25 °С 37 °С 25 °С 37 °С 25 °С 37 °С 25 °С 37 "С 25 °С 37 °С

Ацильные варианты липида А

Тетраацильные варианты (4x3-ОНО 4 0) 70 100 85 81 95 100 52 93 90 н/о 56 100

Пентаацильные варианты (тетраацильные+С12 0 или+С16 0) 15 следы 11 19 5 0 42 7 10 н/о 35 0

Гексаацильные варианты (тетраацильные+С12 0+С16 1) 15 0 4 0 следы 0 6 0 0 н/о 9 0

Варианты с различным содержанием Ага4Ы в липидеА

Варианты с двумя остатками Ага4К 92 27 72 16 76 43 93 94 91 н/о 62 29

Варианты с одним остатком Ага4К 8 35 28 45 24 45 7 6 9 н/о 38 47

Варианты, не содержащие Ага4К 0 38 0 39 0 12 | 0 0 0 н/о следы 24

Терминальные моносахариды и глицин в коре

Кёо 57 95 47 94 37 86 12 100 16 н/о 38 100

Ко 43 5 53 6 63 14 88 0 84 н/о 62 0

Нер 58 100 60 100 54 92 0 0 0 н/о 0 0

Са1 42 0 40 0 46 8 100 42 100 н/о 100 10

асЫАс 75 93 61 91 60 90 13 47 81 н/о 73 83

«у1 20 10 н/о н/о н/о н/о 38 28 19 н/о 18 7

1 местопотожение не определено

ЗАВИСИМОСТЬ ЭНДОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛПС ОТ ЕГО СТРУКТУРЫ

Установление структуры ЛПС позволило изучить влияние структурных вариаций ЛПС, выделенного из представителей различных подвидов Y. peslis, на его эндоток-сическу ю активность. В качестве критерия воспалительного потенциала in vitro мы выбрали способность различных препаратов ЛПС индуцировать продукцию TNF-a мышиной макрофагоподобной клеточной линией J774A.1. Результаты экспериментов представлены на рис. 6

Рисунок 6. Уровни TNF-or в супернатанте культуры мышиных макрофагов J774A.1 после стимуляции препаратами ЛПС (100 нг/мл)

"деацил" - деацилирован-ный по методу S. Borrelli el al [1995] препарат ЛПС Y. pestis KIMD1 (25 °C).

Полученные данные свидетельствуют о высокой TNF-a-индуцирующей активности ЛПС штаммов основного подвида Y. pestis ssp.pestis (КМ218, КМ260(11) и K.IMD1), выращенных при температуре 25 °С. Цитокин-индущшрующая активность ЛПС Y. pestis ssp. caucasica 1146 и 1680р , а также Y. pestis ssp. altaica И-2377 была достоверно ниже, чем у штаммов основного подвида, при сохранившейся температурной зависимости. Мы не обнаружили зависимых от температуры культивирования значимых различий в индукции TNF-« дта ЛПС мутангного штамма Y. pestis ssp. pestis EV11М (Р > 0,05). Деацилированный нами по методу S. Borrelli et al. [1995] препарат ЛПС Y. pestis KIMDL (25 DC) обладал низкой TNF-a-индуцирующей активностью - на уровне ЛПС F. tularensis 15/10, являющегося отрицательным контролем.

Повышение TNF-a-индуцирующей активности при 25 ПС коррелировало с более высокой степенью ацилирования липида А, характерной для данной температуры [Krurel Y etal, 2005а, Knirel Y etal, 2006, настоящее исследование] Эти результаты согласуются с данными других исследователей [Kawahara К et al, 2002, Rebeil R. et al, 2004], полученными на мышиных и человеческих макрофагальных линиях

Для определения различий в токсических свойствах препаратов ЛПС из штаммов различных биоваров и подвидов Y pestis, выращенных при температурах 25 °С и 37 °С использовали нелинейных белых мышей Swiss Webster, сенсибилизированных актиномицином Д (табл 3) По результатам эксперимента наблюдалась общая тенденция повышения летальной токсичности препаратов ЛПС из штаммов, выращенных при температуре 25 °С Однако, полученные результаты, принимая во внимание величины доверительных интервалов, были достоверны только для штаммов KIMD1 и 1680р~ Можно предположить, что различие в строении кора ЛПС представителей основного и неосновных подвидов, а именно, отсутствие в последних терминального остатка DD-Hep, является причиной различной конформа-ции липида А, которая, в конечном счете, и определяет эндотоксическую активность ЛПС [Rietschel Ь etal, \ 996]

Токсичность препаратов ЛПС из мутантного штамма EV11М-25 и EV11М-37 была практически идентичной и достаточно высокой, но при этом TNF-a-индуцирующая активность наблюдалась на уровне величин, соответствующих препаратам ЛПС-37 штаммов основного подвида Возможно, это объясняется его кон-формацией Наличие усеченного кора, состоящего только из дисахарида Kdo-Kdo или Kdo-Ko, приводит к превалированию гидрофобной части молекулы над гидрофильной и, соответственно, к существованию молекул в виде гексагональной биологически активной формы

Суммируя данные, полученные в настоящем разделе исследований, следует отметить, что наши эксперименты подтвердили ведущую роль липида А в эндоток-

сических свойствах ЛПС Деацнлирование ЛПС приводило к снижению величин 1ЛЭ50 в 6,1 х 103 раз

Таблица 3. Токсичность препаратов ЛПС для актиномицин Д-сепсибнлизированных мышей

Источник ЛПС иэ50, мкга

25°С 37°С

У реИч КМ218 0,79(0,20-3,16) 5,01 (1,26-19,95)

У реэйя К1МВ1 0,13 (0,03-0,50) 7,94(1,99-31,62)

У рюш КМ260(11) 1,99 (0,50-7,90) 12,59(3,10-50,12)

У реИч 1146 0,079 (0,02-0,30) 1,26 (0,30-5,00)

У ре.чш 1680р~ 0,05 (0,01-0,21) 1,30(0,33-5,16)

У рет/дт И-2377 0,36 (0,09-1,42) 1,79 (0,45-7,12)

У реЫи ЕУ11М 0,32(0,08-1,25) 0,50(0,12-1,99)

ДеацилК1М01" 794,00 н/о

^ Ыагепьи 15/10 н/о 1000,00

арезультаты приведены с 95 % доверительным интервалом

ь Деацилированный ЛПС К1М01(25°С)

Поэтому, в качестве мишени для генно-инженерной модификации ЛПС чумного микроба, направленной на снижение его эндо токсичности, был выбран ген 1рхМ - один из генов, отвечающих за встраивание в липид А вторичных ацильных заместителей Инактивирование гена проводили с использованием плазмиды рМБВЗК, созданной на основе суицидного вектора рСУГ)442 Подтверждение результатов инактивации гена 1рхМ осуществляли исследованием структуры ЛПС полученных мутантов и их комплементированных производных с помощью МС В масс-спектре липида А из мутантных штаммов (рис 7) присутствовали основные пики ЬАк(га и ЬА'репы и отсутствовали пики ЬЛ|ХП!а и ЬАЬеха

Сравнительный структурный анализ препаратов ЛПС показал, что

1 мутантный штамм продуцирует соответствующие исходному штамму гликоформы кора, отличающиеся только количественными соотношениями,

2 в мутантном штамме лаурильный остаток не включается в липид А, и, следовательно, мутация затрагивает ген, который кодирует соответствующую ацилтрансферазу (ЬрхМ)

3 масс-спектр липида А комплементированного штамма включал тетраа-цильные и пентаацильные производные, причем подтверждено наличие остатка

лауриновой кислоты

Полученные данные позволяют сделать следующие выводы В хромосоме

Y pesíis был идентифицирован функциональный ген, кодирующий ацилтрансфера-зу, ответственную за добавление лаурата С[2 к удаленному остатку GlcN11 при температурах ниже 37 °С В Е сок ацилтрансфераза LpxM, кодируемая геном IpxM, переносит остаток миристоила С14 при всех температурах роста Таким образом, несмотря на большую гомологию генов IpxM в штаммах Y pestis, Е coli и S enterica по специфичности используемого субстрата - лаурата ацилтрансфераза LpxM

Y pestis функционально более схожа с ацилтрансферазой LpxL в Е coli Последовательность, гомологичная гену IpxL Е coli не была идентифицирована в геноме

Y pestis Отсутствие гена IpxL и температурозависимость гена IpxM может объяснить наличие преимущественно тетраацилированных вариантов липида А при температуре 37 °С в клетках Y pestis

LA™" < •> la«™ 1

1 2 1 О i 08 I 0 6

«04

I 02

OI

a: 0 0

í-

¿T n

T 132« 69

l-A^pínU

1W0Í ♦Ara4N [~TM1 w

_11j

—1 LA,..

■ П ^

1 2

1 o 08 06 04

02 00

ЗИОН 0 у

I i UA1p

LAtfl

117В 88 I Л

1 г

г 10

g 08 ф

í 06

104 i 02: 00

LA»

Г" LA«

Л"

.1

1». I

1 2 1 0 08 06 04 { 02 0 0.

I 1

LA« 16*10?

i

I . 1

Рисунок 7 Масс-спектр отрицательных ионов липида А штаммов К реяйэ КМ218 (А), КМ218А//»хМ(В), КМ260(11)(С), КМ260(11)&1рхМ (О), выращенных при 25 °С

ЬАо,, ЛАмта, и тд

обозначают триацильные, тетраацильные производные и т д

Исследование биологических свойств полученных 1рхМ мутантов и препаратов ЛПС по сравнению с их исходными вариантами показало • по способности стимулировать продукцию ТМ^-ог макрофагоподобной линии клеток мышей 1774 ЛПС У рея№ КМА 1рхМ занимает промежуточное положение между ЛПС исходного штамма, выращенных при 25 °С и 37 °С, что коррелирует со степенью ацилирования липида А (рис 8),

• по токсичности препаратов ЛПС при в/б введении белым мышам, несенсиби-лизированным актиномицином Д (табл. 4), ЖТС штамма КМ218Д//?хМ также занял промежуточное положение между наиболее токсичным ЛПС КМ218-25 и менее токсичным ЛПС КМ218-37; в по остаточной вирулентности аттенуированных штаммов, содержащих мутацию в гене 1рхМ, для мышей сенсибилизированных актиномицином Д, наблюдалось уменьшение от 2,5 до 16 раз, при этом токсичность препаратов ЛПС уменьшилась в 10 раз (табл. 5). При этом мутация в гене 1рхМ при использовании высоковирулентного штамма 231 изменения вирулентности на модели мышей не вызывала;

в значительное повышение иммуногеяности - введение 107-109 КОЕ ЕУМрхМ обеспечивало выживание от 71,4 до 100% животных после заражения вирулентным штаммом К реэИз 231, причем в этом случае в группе иммунизированных вакцинным штаммом ЕУ линии НИИЭГ мышей выживших не оказалось (табл. 6).

Исследование иммунохимической активности антисывороток показало (рис. 9): уровень антител к П и мышиному токсину был выше в сыворотках мышей иммунизированных мутантным штаммом, соответственно, такое же превышение наблюдали при использовании лизатов клеток, выращенных при 37 °С. Напротив, практически отсутствовали или находилось на уровне контрольных мышей, содержание антител к V антигену, рН6 антигену, ЛПС-25, ЛПС-37 и к суммарному лиза-ту клеток У. ре^м ЕУ НИИЭГ, выращенных при 28 °С.

Рисунок 8. Уровень продукции TNF-or in vitro на модели макрофагоподоб-ной линии клеток мы-

шей J774.A1 стимулируемой 100 нг ЛПС1

___________ Таблица 4. Токсич-

IlJ___i _ ность препаратов ЛПС

Г pestli

F hiUmmls 13/10

при их в/б введении не сенсибилизированным актиномицином Д мышам

1ЛЭ50, (мкг) ЛПС штаммов К рейИй

КМ218-25 КМ218-37 КМ218А1рхМ

197,0 (147,5-587,3)" 585,5 (438,5-1745,5) 435,0(325,8-1296,9)

Таблица. 5. Остаточная вирулентность штаммов К на мышах и токсичность препарата ЛПС

Наименование штамма Способ введения ЬЭзо

У. рет/и 231 подкожно 6(1-22)а

ИШрхМ 9 (2-38)

ЕУНИИЭГ внутрибрюшинно по 0,2 мл с актиномицином Д* по 10 мкг/мышь 1,6x105 (4,0x104- 6,3x105)

ЕУНИИЭГД/рхМ 4,0ХЮ5Х1,0Х105- 1,6x1 О6)

КМ218 6,ЗХ105(1,5Х105- 2,5X1 О6)

¥М2\%МрхМ 4,0x1 О6 (1,0x106- 1,6x107)

К1МШ 1 х 105 (2,5x104- 4,0x105)

¥ЛМЮ\ЫрхМ 1,6х].06(4,0х105- 6,3х10б)

ЛПС У. ра$ги КМ218 внутрибрюшинно по 0,2 мл с актиномицином Д** по 5 мкг/мышь 5,0 мкг (1-21 мкг)

КМ218Д/рхМ 53 мкг( 13-337 мкг)

а - 95 % доверительные интервалы

Таблица 6. Влияние мутации в гене 1рхМ на протективные свойства вакцинного штамма Крет/м ЕУ линии НИИЭГ на модели мышей

Инфицирующая доза У. рея^я 231 1шВ50> КОЕ

ЕУНИИЭГ ЕУНИИЭГД/р.Ш

7x105 1Х>50 (4,2x106 КОЕ/мл) >109 3,4х107 (8,6х107-1,3х107)

Рисунок 9. Уровень антител в сыворотках

□ Бтаииэг мышей'полу-

ш ШЫрг.М ченных после

однократного п/к введения 107 КОЕ ЕУ НИИЭГ (белые столбики)и ЕУА 1рхМ (темные столбики)

Многие биомолекулы возбудителя чумы, синтезируемые при температуре организма млекопитающего, обладают ярко выраженными имуносупрессивными

Клеточный Клеточный лизат лизат

ЕУНИИЭГ-37 ЕУНИИЭГ-28

свойствами [Schesser et al, 1998, Muller et al, 1998] и препятствуют запуску каскада защитных реакций организма, в том числе и путем предотвращения индукции синтеза таких провоспалительных цитокинов, как 1L-8, TNF-ar [Schesser etal, 1998] Основа патогенеза чумы -подавление реакций иммунной системы хозяина в ответ на внедрение чужеродного организма на самых ранних стадиях инфекции, и затем -безудержный рост микроба Один из уникальных механизмов, работающих для реализации этой стратегии, - температуро-опосредованная модификация JIIIC, приводящая к уменьшению способности индуцировать синтез провоспалительных цитокинов и вызывать повышение неспецифической резистентности организма хозяина

Раннее распознавание внедрившегося патогена имеет решающее значение для мобилизации сил врожденного иммунитета теплокровных хозяев Таким образом. повышение иммуногенности мутантного авирулентного штамма по сравнению с исходным укладывается в схему поведения Y pestis в организме теплокровных животных - способность мутантного штамма уклониться от распознавания защитными силами макроорганизма на этапе внедрения позволяет ему быстрее размножиться, но отсутствие основных факторов патогенности, не позволяет инфекции генерализоваться, что в дальнейшем обеспечивает более эффективный вакцинный процесс - выработку антитела, направленных на важнейшие представленные микроорганизмом антигены

ВЫВОДЫ

1 Установлена химическая структура ЛПС штаммов Y pestis основного подвида биоваров antiqua, medievahs и представителей подвидов caucasica и altaica Уточнена структура ЛПС биовара onentahs Подтверждена взаимосвязь структуры липида А и биологических свойств Y pestis - более высокая степень ацилирования липида А вызывает повышение TNF-a-индуцирующей активности

2 Показано, что в клетках Y pestis одновременно образуются несколько структурных вариантов молекул ЛПС, отличающихся по степени ацилирования и степе-

ни замещения аминоарабинозой фосфатных остатков в лиииде А, по терминальным углеводам в олигосахариде кора Преобладание определенных структурных вариантов ЛПС определяется температурой культивирования

3 Получены штаммы Y pestis, содержащие, мутацию по гену IpxM, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид A Y pestis лауриновой кислоты и изучены их биологические свойства Показано, что данная мутация не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба "дикого" типа, но снижает остаточную вирулентность аттенуированных штаммов Y pestis

4 Определено, что снижение остаточной вирулентности IpxM мутанта вакцинного штамма EV сопровождается сочетанным повышением его протективной активности

5 Сконструированный штамм Y pestis EVAlpxM, дефектный по синтезу гексаа-цильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой живой чумной вакцины

Список работ, опубликованных по теме диссертации'

1 Гремякова Т А, Волковой К И, Шайхутдинова Р 3, Степанов А В Температурозависимые изменения иммунохимических свойств липополисахарида Yersinia pestis II Вести Росс Акад Мед Наук. 1999 -№ 12 -С -32-34

2 Vinogradov Е V, Lindner В, Kocharova N А, Senchenkova S N, Shashkov A S, Knirel Y А, Hoist О, Gremyakova Т А, Shaikhutdinova R.Z, Amsimov А Р The core structure of the lipopolysaccha-ride from the causative agent of plague, Yersinia pestis //' Carbohydr Res -2002 -V 337 -P 775777

3 Виноградов E В, Линднер Б, Кочарова Н А, Сенченкова С Н, Шашков А С, Книрель Ю А, Холст О, Шайхутдинова Р 3, Гремякова Т А, Анисимов А П Структура коровой части липополисахарида чумного микроба // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Вторая научная конференция с международным участием (29-31 мая 2002 г, Новосибирск, Россия) Новосибирск ЦЭРИС, 2002 - С 217-218

4 Gremyakova Т А, Vinogradov Е V, Lindner В, Kocharova N А, Senchenkova S N, Shashkov A S , Knirel Yu А, Hoist О, Shaikhutdinova R.Z, Anisimov A P Influence of growth temperature on the core structure of the lipopolysacchande of Yersinia pestis strain KM218 II Abstracts of the 8th International Symposium on Yersinia (September 4-8,2002, Turku, Finland) - Turku, 2002 - P 6768

5 Shaikhutdinova R.Z, Gremyakova T A, Zhilenkov E L, Dentovskaya S V, Amsimov A Phage-susceptibility testing and LPS-electrophoretic mobility analysis of different Yersinia pestis "subspecies"//Ibid. - P 71

6 Gremyakova ТА Vinogradov EV, Lindner B, Kocharova NA, Senchenkova SN, Shashkov AS, Knirel YA, Hoist O, Shaikhutdinova RZ, Amsimov AP The core structure of the lipopolysacchande of Yersinia pestis strain KM218 Influence of growth temperature // Adv Exp Med Biol - 2003 -V 529 -P 229-231

7 Kmrel Y A, Vinogradov E V, Senchenkova S N, Kocharova N A, Lindner В , HoJst О, Shaikhut-dmova R.Z, Anisimov A P, Gremyakova T A Temperature-dependent variations m the Iipopoiysac-chande structure of Yersinia peslis II Abstracts of the XIl* European Carbohydrate Symposium (July 6-11,2003, Grenoble, France) -Grenoble, 2003 -P 120

8 Шайхутдинова P 3, Мокриевич A H, Дентовская С В , Анисимов А П Биологические свойства msbB мутантов Yersinia pest is // Успехи современного естествознания -2003 - № 10 - С 108

9 Бахтеева И В, Титарева Г М, Шайхутдинова Р 3, Анисимов А П Способность линополисаха-рида Yersiniapestis вызывать эндотоксический шок // Там же - С 54

10 Анисимов А П, Книрель Ю А, Виноградов Е В , Линднер Б, Комарова Н А , Дентовская С В , Фурсова Н К, Бахтеева И В , Титарева Г М, Шашков А С, Шайхутдинова Р 3 , Сенченко-ва С Н, Гремякова Т А, Холст О Липоолигосахарид (JIOC) Yersinia pestis - один из основных факторов патогенности и возможная мишень для химиотерапии // Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 2-го Московского международного Конгресса (10-14 ноября 2003 г, Москва) М ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им ДИ Менделеева - С 15

] 1 Шайхутдинова Р 3, Мокриевич А Н, Дентовская С В, Анисимов А П Получение msbB мутантов Yersinia pestis А Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МОРФ Киров, НИИ микробиологии МО РФ, 2003 -С 136-137

12 Бахтеева И В, Титарева Г М, Шайхутдинова Р 3, Анисимов АII Изучение экспрессии TNF-a в сыворотке мышей при введении липоолигосахаридов (ЛОС) Yersinia pestis // Там же - С 6566

13 Knirel Y А, Vinogradov Е, Lindner В, Shaikhutdinova R.Z, et al Diversity and Variations of the Lipopolysacchande (LPS) Structure in Yersinia pestis // Abstracts of 104111 ASM General Meeting (May 23-27,2004, New Orleans, Louisiana) 2004 -J-012

14 Анисимов А П, Книрель Ю A, Виноградов E, Линднер Б, Шайхутдинова P 3, Кочарова H А, Сенченкова С Н, Дентовская С В , Н К Фурсова, Бахтеева И В , Титарева Г М, Балахонов С В, Хольст О, Шашков А С, Пиер Д Б, Гремякова Т А Струетура липополисахарида Yersinia pestis // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний Тезисы докладов международной конференции (8-10 сентября 2004 г, "Соснов-ка", Новосибирская об часть, Россия) ЦЭРИС, Новосибирск, 2004, с 43-44

15 Анисимов А П, Виноградов Е В, Lindner В, Шайхутдинова Р 3, et al Изменения структуры и биологических свойств липополисахарида Yersinia pestis '/ М;п ер конф Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review (12-15 июля 2004 г, Санкт-Петербург) С-П Институт особо чистых биопрепаратов С 14-15

16 Shaikhutdinova R.Z, Senchenkova SN, Dentovskaya S V, Lmdner B, Moknevich A, Titareva GM, Knirel YA, Anisimov A. P Mutation in the msbB (IpxM) gene of Yersinia pestis KM218 caused modifications in lipid A structure and influences biological properties of bactenal cell // Abstracts of the INT AS strategic workshop, Bactenal glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens 3rd German-Pohsh-Russian meeting on bactenal carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroctaw, Poland), P 12 Wroctaw, Poland, p 72-73

17 Bakhteeva IV, Titareva G M, Senchenkova S N, Kocharova N A, Shaikhutdinova R.Z, Lindner В, Knirel YA, Anisimov AP Temperature-dependent variations of the structure of lipid A and biological properties of the lipopolysacchande of Yersinia pestis KM218//Ibid - Pll,p 71

18 Knirel Y A, Lindner В, Vinogradov E V, Kocharova N A, Senchenkova S N, Shaikhutdinova R.Z, et al Temperature-dependent variations and mtraspecies diversity of the structure of the lipopolysacchande of Yersinia pestis //Biochemistry -2005 - V 44 -P 1731-1743

19 Knirel Y A, Lmdner В, Vinogradov E V, Kocharova N.A, Senchenkova S N, Shaikhutdinova R.Z et al Cold temperature-induced modifications to the composition and structure of the lipopolysacchande of Yersinia pestis // Carbohydr Res -2005 - V 340 -P 1625-1630

20 Kmrel Y A, Vinogradov E, Lindner В, Shaikhutdinova R Z , Kocharova N A, Senchenkova S N, Dentovskaya SV, Bakhteeva IV, Titareva GM, Hoist O, Pier GB, Anisimov AP Cold

temperature-induced modifications to the chemical composition and biologic activity of the lipopolysacchande of Yersinia pestis II Abstracts of the 105th ASM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA), J-002

21 Анисимов А П, Виноградов E В , Lindner В , Шайхутдинова P 3, Дентовская С В , Бахтеева И В, Титарева Г М, Комарова Н А, Сенченкова С Н, Visser Н, Hoist О, Pier G В , Книрель Ю А Изучение структуры и биологических свойств липополисахарида Yersinia pestis // Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review (10-13 октября 2005 г, Санкт-Петербург) С -П Институт особо чистых биопрепаратов С 24-28

22 Amsimov А Р, Dcntovskaya S V, Titareva G М, Bakhteeva IV, Shaikhutdmova R.Z, Balakhonov S V, Lindner В, Kocharova N A, Senchenkova S N, Hoist О, Pier G В, Knirel Y A Intraspecies and temperature-dependent variations in susceptibility of Yersinia pestis to bactericidal action of serum and polymyxin В // Infect Immun 2005,73,7324-7331

23 Knirel Y, Dentovskaya S, Senchenkova S, Shaikhutdmova R, Kocharova N, Anisimov A Structural features and structural variability of the lipopolysacchande of Yersinia pestis, the cause of plague// J Endotoxin Res 2006,12 (1), 3-9

24 Дентовская С В , Шайхутдинова Р 3, Книрель Ю А, Иванов С А, Анисимов А П Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностыо // Молекуч генетика - 2006 - № 2 - С 3-8

25 Anisimov А Р, Shaikhutdmova R.Z, Panlana L N ,etal Effect of deletion of the IpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice // J Med Microbiol 2007, 56 (4) 443^453

26 Knirel Y A, Dentovskaya S V, Bystrova О V, Kocharova N A, Senchenkova S N, Shaikhutdmova R.Z, Titareva G M, Bakhteeva IV, Lindner В , Pier G В , Anisimov A P Relationship of the lipopolysacchande structure of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial factors // Adv Exp Med Biol 2007,603 88-96

27 Федорова В A , Панышна JIH, Савостина Е П, Шайхутдинова Р 3, Дентовская С В, Анисимов А П Изучение молекулярных механизмов повышенной иммуногенности IpxM мутанта вакцинного штамма Y pestis EV НИИЭГ // Российский аллергологический журнал - 2007 -№3 (приложение № 1) - С 315

28 Feodorova V А, Pan'kma L N, Savostina Е Р, Sayapina L V, Motin V L, Dentovskaya S V, Shaikhutdmova R Z, Ivanov S A, Lindner В, Kondakova A N, Bystrova О V, Kocharova N A, Senchenkova S N, Hoist О, Pier G В , Knirel Y A, Anisimov АРА Yersinia pestis Z/aM-mutant live vaccine induces enhanced immunity agamst bubonic plague in mice and guinea pigs // Vaccine 2007,25 7620-7628

29 Feodorova V, Pan'kina L, Savostina E, Sayapina L, Motin V, Dentovskaya S , Shaikhutdmova R, Ivanov S, Lindner В , Kondakova A, Bystrova О, Kocharova N, Senchenkova S, Hoist О, Pier G, Knirel Y, Anisimov A P Genetically modified live plague vaccine with improved characteristics to safety and immunogenicity (ID #173) // Proceedings of the 50th ABSA Annual Biological Safety Conference (October 7-10,2007, Nashville, Tennessee, USA), S4 1 - American Society for Microbiology, Mundelein, Illinois, 2007 P 18-19

30 Дентовская С В , Бахтеева И В , Титарева Г М, Шайхутдинова Р 3, Кондакова А Н, Быстрова О В , Линднер Б, Книрель Ю А, Анисимов А П Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis II Биохимия 2008,73(2) 237-247

Подписано в печать 26 02 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 0 п л Тираж 100 экз Заказ № 698 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шайхутдинова, Рима Завдатовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИ

НИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.Ю

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ЛПС.

1.2. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ.

1.3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛПС.

1.4. СТРУКТУРА МОЛЕКУЛ ЛПС.

1.5. ХИМИЧЕСКАЯ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛПС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Липополисахариды (ЛПС) - специфические компоненты внешней мембраны грамот-рицательных бактерий, в значительной степени обусловливающие физико-химические и биологические свойства бактериальных клеток. ЛПС обеспечивает целостность и стабильность мембраны, ее нормальное функционирование (селективную проницаемость, межклеточные взаимодействия) [Ьискгкг О. е( а1., 1982]. Кроме того, эти молекулы играют существенную роль во взаимоотношениях паразит-хозяин и являются одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий [Репу Ы., РеШе^оп I., 1997].

Молекулы ЛПС, как правило, состоят из липида, называемого липидом А, который ковалентно связан с гетерополисахаридными цепями, включающими две субструктуры - ко-ровые олигосахариды (непосредственно связаны с липидом А) и О-специфические цепи, которые представляют собой повторяющиеся олигосахаридные единицы. Такой тип структуры придает ЛПС амфифильный характер из-за гидрофобности липида А и гидрофильности ге-терополисахаридных цепей раЬппяег и. а а.1., 1994].

Липид А - часть молекулы ЛПС, ответственная за его эндотоксическую активность, то есть способность вызывать эндотоксический шок, возникающий в результате лавинообразной экспрессии провоспалительных цитокинов, основным из которых является "ПЧР-а [ВеиНегВ., Сегагш А., 1988; БтагеПо С. 1991]. К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о зависимости эндотоксической активности ЛПС для млекопитающих от количества, длины, степени насыщенности жирнокислотных остатков, а также наличия фосфатных групп в липидной части молекулы ЛПС. Показано, что максимальной эндотоксической активностью обладает ЛПС с дифосфорилированным липидом А, состоящим из двух /?-1,6-связанных остатков Б-глюкозамина, ацилированный шестью жирными кислотами [Ь^БсИе! Е. е/ а1., 1987, Такас1а Н. ег1 а/., 1992]. Любые отклонения от этой структуры приводят к уменьшению токсичности молекулы [Rietschel Е. et al., 1994]. В частности, биологические свойства ЛПС Francisella tularensis (низкая токсичность), по-видимому, связаны с необычной структурой липида A [Vinogradov Е. et al., 2002]. Кроме того, показано, что есть определенная зависимость между токсичностью и пространственной конформацией молекул ЛПС, которая характеризуется Тс-температурой фазового перехода от ламеллярной (бислой-ной) фазы в гексагональную фазу. Наиболее биологически активный липид А имеет коническую или цилиндрическую форму [Seydel U. et al., 1993].

Известно, что, в отличие от большинства других патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, Yersinia pestis — возбудитель чумы, продуцирует ЛПС, лишенный О-полисахаридных цепей [Brubaker R., 1972; Darveau R. et al.; 1983; Chart H. et al., 1995; Minka S., Bruneteau M., 1998; Prior J. et al., 2001]. Изучение биологических свойств показало, что ЛПС штаммов Y. pestis, выращенных при температуре 28 °С, более токсичен для мышей, чем ЛПС штаммов Y. pestis, выращенных при температуре 37 °С [Тынянова В. и др., 2003], что v связано с отличиями в структуре молекул ЛПС [Kawahara К. et al., 2002].

Основным недостатком используемых в настоящее время живых и убитых вакцин на основе грамотрицательных бактерий, в том числе и чумных, является высокая реактоген-ность, определяемая наличием в их составе ЛПС (эндотоксина) [Дмитровский А., 1994, Ме-дуницын Н., 1997, Galanos, Freudenberg, 1993; Raetz С., 1990, Raetz, Whitfield, 2002; van Am-ersfoort et al., 2003; van der Poll, van Deventer, 1999, Дентовская C.B. и др., 2006]. Химические вакцины позволяют за счет введения в их состав только иммунодоминантных антигенов или кодирующих их генов значительно снизить реактогенность препарата в целом. Они эффективны для ревакцинации, могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками и исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако, вакцины, сконструированные на основе одного-двух индивидуальных иммунодоминантных антигенов или кодирующих их генов (в случае ДНК вакцин), не являются идеальными, т.к. не могут обеспечить защиты от всех вирулентных вариантов возбудителя инфекции. Отсутствие у патогена антигенов, использованных в составе вакцины, или присутствие их серологически отличающихся вариантов позволяют измененным формам микроорганизмов уклоняться от иммунитета, индуцированного подобной вакцинацией [Anisimov et al., 2004].

В то же время показано, что вакцина живая чумная на основе штамма EV линии НИИЭГ способна обеспечивать защиту животных как от штаммов "дикого" типа (ИИ для белых мышей « 3,3х104, для морских свинок » 1,4х105), так и от их бескапсульных вариантов (ИИ для белых мышей ^2,6х102, для морских свинок » 1,2х106) [Анисимов А., 1999]. Есть данные, что вакцина живая чумная эффективна и в отношении "полевочьих" штаммов возбудителя чумы [Абгарян Г., 1966]. В "полевочьих" штаммах Y. pestis V антиген представлен вариантом, характерным для Y. enterocolitica 0:3 серовара [Anisimov A. et al., 2007; Worsham P., Hunter M., 1998]. Оба серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [Griffin К. et al., 1998; Roggenkamp A. et al., 1997]. Это подтверждает то, что наличие в живых вакцинах, сконструированных на основе аттенуированных штаммов, не только одного-двух иммунодоми-нантных, но и целого спектра сложных (комплекс белка с ЛПС и т.п.), конформационно-лабильных и минорных антигенов обеспечивает индукцию "гетерогенного" иммунного ответа, способного защитить макроорганизм от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью. Для конструирования современных живых чумных вакцин со сниженной реактогенностью необходима генно-инженерная модификация ЛПС Y. pestis, обеспечивающая образование молекул со сниженной эндотоксической активностью.

Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Escherichia coli и Salmonella enterica bv. Typhimurium (далее по тексту S. typhimurium). Определены кластеры генов, кодирующие биосинтез липида А, кора и О-антигена [Coleman J., Raetz С., 1988; Austin Е. et al., 1990; Clementz Т., 1992]. Одним из этапов синтеза липида А является процесс вторичного ацилирования, в котором участвует целый ряд ацилтрансфераз LpxL (HtrB), LpxP и LpxM (MsbB) [Clementz Т. et al., 1997; Murray S. et al., 2001]. В частности, показано, что мутация по гену IpxM в клетках сальмонелл приводила к снижению степени ацилирования липида А и, соответственно, к снижению вирулентности (токсичности) на три-четыре порядка [Raetz С., Whitfield С, 2002].

Доступность аннотированных геномов нескольких штаммов Y. pestis rhttp://www.ericbrc.org/portal/cric/versiniapestis?id=default&subid=versiniapestis) дает возможность провести направленный поиск аналогичных генов и их последующий сайт-направленный мутагенез в клетках возбудителя чумы.

Исследование структурно-функциональной организации ЛПС возбудителя чумы с привлечением комплекса методов бактериологии, аналитической химии, биофизики и иммунологии позволит получить новые сведения о биосинтезе этой молекулы, ее роли в патогенезе и иммуногенезе чумы. Это создаст основу для разработки методологии получения штаммов чумного микроба с генно-инженерно модифицированным ЛПС, необходимую для конструирования нового поколения экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной ре-актогенностью.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучение структурно-функциональной организации ли-пополисахаридов Y. pestis и их генно-инженерная модификация, направленная на снижение эндотоксической активности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить структуру ЛПС из штаммов различных внутривидовых групп Y. pestis, выращенных при различных температурах.

2.Изучить зависимость эндотоксической активности ЛПС Y. pestis от его структуры.

3.Разработать на основе методов генной инженерии методологию получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

4. Оценить биологические свойства мутантов У резИя со сниженной эндотоксической активностью ЛПС, включая вирулентность и иммуногенную активность.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В ходе выполнения данной работы впервые определена структура корового олигосахарида штамма биовара опеЩаИз (эзр. ре^г'я), а также полная структура ЛПС штаммов возбудителя чумы Бэр. резИя, принадлежащих к биоварам ап1^иа и тесИеуаПз, и подвида ca.uca.sica (Ьу. апйциа). Установлено, что структура ЛПС зависит от подвидовой принадлежности и температурных условий культивирования бактерий.

Выявлена взаимосвязь структуры ЛПС и биологических свойств У резШ. Установлено, что более высокая степень ацилирования липида А вызывает повышение ТЫБ-а-индуцирующей активности.

Впервые установлено, что мутация по гену 1рхМ, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид А У резСт шестого жирнокислотного остатка — лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба дикого типа, но снижает вирулентность аттенуированных штаммов У. реэИз.

Впервые установлено, что отсутствие в клетках 1рхМ мутанта вакцинного штамма ЕУ гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетанным снижением остаточной вирулентности и повышением протективной активности на модели мышей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

Разработана простая и надежная методика направленного конструирования вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью. Полученный штамм У. резИя ЕУД 1рхМ, дефектный по синтезу гекса-ацильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой живой чумной вакцины

В коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 4 авторских штамма

У. ре.зИз, мутантных по гену 1рхМ.

Результаты проведенных исследований послужили основой для составления ниже перечисленных документов:

- Методические рекомендации «Получение очищенных препаратов ЛОС У. резИя». Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения). \

- Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома чумного микроба». Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения).

Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы, а также препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетиче- ~ ских, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГЫЦ прикладной микробиологии и биотехнологи (Оболенск, Московская обл.), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Московская обл.), РосНИПЧИ "Микроб", ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Института биоорганической химии им. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Саратовского Государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Список документов по внедрению научных достижений в практику приведен в конце автореферата.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Установлена полная структура ЛПС У. ре.у^'-у основного подвида биоваров апйдиа, тесИеуаНБ, опег^аНэ и кавказского подвида. В бактериальной клетке одновременно образуется несколько структурных вариантов молекулы ЛПС, отличающихся в липиде А - по степени ацилирования и замещения аминоарабинозой фосфатных остатков; в олигосахариде кора - по терминальным углеводам. Преобладание определенных структурных вариантов ЛПС определяется температурой культивирования.

2. Избирательное "выключение" синтеза гексаацильных форм ЛПС не приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов У. ре.дикого типа в отношении белых мышей.

3. Отсутствие в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма EV гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетанным снижением остаточной вирулентности и повышением про-тективной активности. По сравнению с исходным штаммом, величины LD50 мутанта EVЫрхМ при подкожном заражении мышей снизились в 4,6 раз, а протективная активность в отношении вирулентного штамма 231 выросла на 2 порядка.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза чумы, псевдотуберкулеза, сибирской язвы и туляремии" научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов, № гос. регистрации 01.200.2 13001; "Структурная организация и биологические свойства липополисахарида Yersinia pestis" отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации» (договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 74-Д от 31 декабря 2005 г.), научные руководители темы: к.м.н. C.B. Дентовская и д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов. Данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04-49280 "Структурно-функциональный и генетический анализ липополисахарида возбудителя чумы, Yersinia pestis, с помощью сайт-направленного мутагенеза", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов) и Международного научно-технического центра (проект МНТЦ № 1197 "Изучение роли структурной организации липополисахаридов Yersinia pestis в создании иммунных препаратов", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на: 7th International Symposium on Yersinia (Nijmegen, Голландия, 1998 г.), Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 г.); 8th International Symposium on Yersinia (Турку, Финляндия, 2002 г.); рабочем семинаре DTRA «Обзор совместных научно-исследовательских проектов по биобезопасности» (Серпухов, 3-5 июня 2002 г.); ежегодной конференции Российской Академии Естествознания «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Лутраки, Греция 5-12 октября 2003 г.); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (10-14 ноября 2003 г., Москва); XIIth European Carbohydrate Symposium (July 6-11, 2003, Grenoble, France); 2-ом Московском международном конгрессе: Биотехнология: состояние и перспективы развития (10-14 ноября 2003 г., Москва); 104th ASM General Meeting (May 23-27, 2004, New Orleans, Louisiana, USA); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (12-15 июля 2004 г., Санкт-Петербург); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний" (8-10 сентября 2004 г., "Сосновка", Новосибирская область, Россия); INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroctaw, Poland); 105th ASM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA, USA); VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (13-14 сентября 2005 г., Волгоград); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (1013 октября 2005 г.; Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA) УП-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и саконференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (10-13 октября 2005 г.; Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA) VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30, 2006, Opatija, Croatia); 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на Ученом Совете ГНЦ ПМБ 7 декабря 2006 г. протокол №11. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 24 июля 2006 г.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 30 научных публикациях, в том числе в семи статьях, список которых приведен в автореферате (включая пять статей в международных рецензируемых журналах, а четыре статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шайхутдинова, Рима Завдатовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена полная структура ЛПС штаммов Y.pestis основного подвида биоваров antiqua, medievalis, кавказского подвида и уточнена структура основного подвида биовара orientalis.

2. Впервые показано, что в клетках Y.pestis одновременно образуются несколько структурных вариантов молекулы ЛПС, отличающихся в липиде А: по степени ацилирова-ния и степени замещения аминоарабинозой фосфатных остатков и в олигосахариде кора по терминальным углеводам. Преобладание определенных структурных вариантов ЛПС определяется температурой культивирования.

3. Подтверждена взаимосвязь структуры липида А и биологических свойств Y.pestis - более высокая степень ацилирования липида А вызывает повышение TNF-or-индуцирующей активности.

4. Разработана методика получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

5. Впервые показано, что мутация по гену 1рхМ, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид А У. реяМя лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба дикого типа, но снижает остаточную вирулентность атте-нуированных штаммов У. резШ.

6. Впервые доказано, что снижение остаточной вирулентности 1рхМ мутанта вакцинного штамма ЕУ сопровождается сочетанным повышением его протективной активности.

7. Сконструированный штамм У. резШ ЕУА 1рхМ, дефектный по синтезу гексаа-цильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой живой чумной вакцины

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Чума одно из самых опасных инфекционных заболеваний в человеческой истории. В результате трех пандемий: «чумы Юстиниана» (541-767 г.г.), «черной смерти» (1346-1350 г.г.) и третьей, начавшейся в Китае и распространившейся по всему миру, по разным данным погибло около 200 миллионов человек [Perry, Fetherston, 1997].

С приходом эры антибиотиков в 30-40 годы прошлого столетия чума, казалось бы, перестала представлять глобальную опасность для человечества, но эпидемические вспышки чумы продолжают регистрироваться ежегодно. По данным ВОЗ за период с 1987 г. по 2001 г. в мире зарегистрировано 36876 случаев заболевания чумой, из них 2847 закончились гибелью людей. Причем, большая часть заболеваний приходилась на долю африканского континента [Prentice, Rahalison, 2007].

В ходе энзоотического цикла передача Y. pestis в популяциях восприимчивых теплокровных животных (грызунах и логоморфах) осуществляется кровососущими насекомыми -блохами Передача Y. pestis блохами обеспечивается высоким уровнем предагональной бактериемии у инфицированных грызунов [Анисимов, 1999, 2002; Brubaker, 1991; Hinnebusch, 2004; Lorange et al, 2005; Perry, Fetherston, 1997].

В организме блохи Y. pestis размножается в виде бактериальных биофильмов, заполняя преджелудок (клапан, соединяющий пищевод и среднюю кишку) и блокирует прохождение пищи. Постоянные попытки блокированных блох поглотить новую порцию крови ведут "к переполнению пищевода и регургитации крови вместе со смытыми бактериями в ранку от укуса. Попав в организм млекопитающего, Y. pestis преодолевает врожденный иммунитет и начинает безудержное размножение [Анисимов, 1999, 2002; Brubaker, 1991; Hinnebusch, 2003, 2004; Lorange et al., 2005; Perry, 2003; Perry, Fetherston, 1997]. Обычно, фаза бактериемии приводит к летальному септическому шоку, а гибель млекопитающего хозяина вынуждает блох искать новых прокормителей, вызывая инфицирование последних [Анисимов, 2002; Brubaker, 1991; Butler, 1989].

Пусковым механизмом септического шока, вызываемого грамотрицательными бактериями, является ЛПС. Липид А, токсическая составляющая молекулы ЛПС, индуцирует в организме млекопитающих синтез различных провоспалительных цитокинов, активирует систему комплемента сыворотки и коагуляционные процессы [Das, 2000; Van Amersfoort, 2003].

ЛПС Y. pestis не содержит О-антигенных полисахаридных цепей, но состоит из липи-да А и олигосахарида, аналога внутреннего и внешнего кора ЛПС энтеробактерий [Gremy-akova et al., 2003; Hitchen et al., 2002; Kawahara et al, 2002; Knirel et al., 2005a, 2005b; Prior et al., 2001; Rebeil et al., 2004; Vinogradov et al., 2002]. Как показано для E. coli, главными отличительными чертами, обеспечивающими максимальную эндотоксическую активность, является наличие в молекуле ЛПС дифосфорилированного липида А, состоящего из двух /?-1,6-связанных остатков D-глюкозамина, ацилированных шестью жирными кислотами [Alexander, Rietschel, 2001; Rietschel et al., 1994]. Показано, что у У. pestis повышение температуры при передаче от блох (21-28 °С) теплокровным животным (37 °С) вызывает уменьшение уровня ацилирования липида А с шести до четырех жирнокислотных остатков [Kawahara et al., 2002; Knirel et al., 2005a; Rebeil et al., 2004; раздел 3.1 настоящего исследования] и соответственное уменьшение иммуностимулирующей/эндотоксической активности ЛПС [Kawahara et al., 2002; Rebeil et al., 2004; Тынянова и др., 2003; раздел 3.2 настоящего исследования].

Остановимся более подробно на особенностях структурного разнообразия и характера температуро-зависимых изменений ЛПС у представителей различных внутривидовых групп У. pestis, выявленых нами в ходе выполнения данной работы. Основные изменения структуры ЛПС Y. pestis, вызванные повышением температуры до температуры тела млекопитающих (37 °С) можно свести к следующему:

• для штаммов всех подвидов - замена терминального углевода внутренней части кора Ко на Kdo, т.е. его дегидроксилирование;

• для штаммов основного подвида - преобладание в качестве терминального углевода внешней части кора гептозы над галактозой;

• для штаммов подвидов caucasica и altaica - уменьшение содержания галактозы -терминального углевода внешней части кора (при полном отсутствии терминальной гептозы);

• для штаммов всех подвидов - увеличение содержания GlcNAc и уменьшение содержания глицина;

• для штаммов всех подвидов - уменьшение степени ацилирования липида А - преобладание тетраацильных форм;

• для штаммов основного подвида и подвида altaica - уменьшение гликозилирова-ния фосфатных групп катионными углеводами, в частности Ara4N; а для подвида altaica -появление пирофосфатной группы;

• в штаммах подвида caucasica - отсутствует температурная зависимость включения Ara4N, и, как правило, оно стехиометрично.

Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что Y. pestis реагирует на повышение температуры культивирования не только увеличением отрицательного заряда на поверхности клетки счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в липиде А, но и уменьшением гидрофобности молекул ЛПС, которое обеспечивается как уменьшением ацилирования, так и увеличением углеводной части за счет включения GlcNAc. Это, в свою очередь, может привести к существованию индивидуальных молекул ЛПС в ламеллярной (биологически малоактивной форме).

Билогическая роль этих структурных изменений при повышении температуры культивирования до температуры тела млекопитающих (37 °С) выражается в уменьшении токсичности препаратов ЛПС. Наблюдается ослабление цитокин-индуцирующей активности (на примере одного из основных медиаторов эндотоксического шока - TNF-а) и увеличение LD50 препаратов ЛПС из представителей всех изученных подвидов Y. pestis. Отсутствие полной корреляции между TNF-ог-индуцирующей активностью ЛПС Y. pestis на клетках мышиной макрофагоподобной клеточной линией J774A.1 и его летальной токсичностью на модели мышей может быть связано с изменением пространственной конформации молекул ЛПС in v/vo-Наши предположения требуют дальнейших исследований в области определения трехмерной структуры ЛПС. Работы в этом направлении уже ведутся. В любом случае моделирование такого сложного явления как септический шок на изолированных клетках животных, культивируемых в питательных средах вне организма, позволяет изучать тонкие механизмы взаимодействия эндотоксинов с отдельными эукариотическими клетками, но не может создать полную картину синдрома системного воспалительного ответа в макроорганизме.

Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Е. coli иг S. typhimurium [Raetz С., 1996, Raetz С., Whitfield С., 2002, Clementz Т., 1992]. Одним из этапов синтеза липида А является процесс вторичного ацилирования, в котором участвует мембранные белки - Kdo зависимые ацилтрансферазы LpxL и LpxM [Reeves et al., 1996; Clementz Т. et al., 1997; Murray S. et al., 2001; Brozek, Raez, 1990; Nichols et al., 1997; Raetz, Whitfield, 2002; Sunshine et al., 1997]. LpxM - «поздняя» ацилтрансфераза, переносящая миристат (Си) после инкорпорирования лаурата (С12) в структуру KD02-lipid IVA [Clementz et al., 1997; Raetz, Whitfield, 2002]. Показано, что ЛПС, выделенный из ЫрхМ нокаутных мутантов, содержащий пентаацильный липид А, и клетки ЫрхМ мутантов Е. coli обладали в 1000-10000 раз меньшей способностью стимулировать продукцию Е-селектина человеческими эндоте-лиальными клетками и продукцию TNF-a моноцитами по сравнению с исходными бактериями, продуцирующими гексаацильный липид A [Somerville et al., 1996]. Позднее было показано, что в Y. pestis гомологи IpxM [Dentovskaya et al., 2006; Rebeil et al. 2006; раздел 3.3 настоящего исследования] и IpxP [Rebeil et al., 2006] кодируют ацилтрансферазы, добавляющие, соответственно, С12 и С]б 1 жирнокислотные группы к липиду, и экспрессия этих генов происходит при температуре 21 °С in vitro и в организме блох [Rebeil et al., 2006].

В мутантных по гену IpxM бактериях Е. coli [Somerville J. et al 1996, Somerville J.et al., 1999, Vaara M., 1999; Vorachek-Warren M., 2002], H.s influenzae [Low K. et al, 1999], S. enterica [Khan S. et al., 1998, Low K. et al., 1999], N. meningitidis и N. gonorrhoeae [Van der Ley et al. 2001; Post D. et al., 2002], Shigella flexneri [d'Hauteville et al., 2002] проявлялись общие свойства: снижение способности стимулировать продукцию TNF-a как моноцитами человека, так и дендритными и макрофагальными клетками мыши [D.M. Hone et al., 1998, Kalupahana et al. 2003] и уменьшение эндотоксической активности, выражающееся в увеличении величины LD50 на мышиной модели по сравнению с исходными штаммами [Somerville J. et al., 1999].

Пентаацильный ЛПС, выделенный из мутантного штамма N. meningitidis ЫрхМ имел уменьшенную эндотоксическую активность, но демонстрировал хорошие адьювантные свойства [van der Ley et al., 2001]. Эти данные позволили нам предположить, что штаммы Y. pestis, мутантные по гену IpxM будут менее вирулентны и могут использоваться для создания новых вакцин.

Установление структурно-функциональной организации ЛПС и определение генов, отвечающих за биосинтез липида А, позволили нам разработать методику направленного конструирования мутантов Y. pestis с нарушенным синтезом одной из ацилтрансфераз -LpxM, обладающих сниженной эндотоксической активностью. Инактивацию предполагаемого гена IpxM в клетках возбудителя чумы мы проводили сайт-направлепным мутагенезом с использованием суицидного вектора pMSB3K, позволяющего за счет гомологичной рекомбинации осуществлять замену интактного гена IpxM хромосомы на аллельный ген, большая часть которого была замещена геном, кодирующим канамицинфосфотрансферазу. Проведенный нами сравнительный структурный анализ препаратов ЛПС из полученных мутантов показал, что мутантные штаммы синтезируют только тетра-и пентаацильные формы липида А, не содержащие остатки лауриновой кислоты. Таким образом, мутация привела к инактивации гена, кодирующего соответствующую ацилтрансферазу (LpxM) [Шайхутдинова и др., 2003; раздел 3.3 настоящего исследования]. Следовательно, в хромосоме Y. pestis был идентифицирован функциональный ген, кодирующий ацилтрансферазу, ответственную за добавление лаурата С12 к удаленному остатку GlcN11 при температурах ниже 37 °С. Позднее наши данные были подтверждены зарубежными коллегами [Rebeil et al., 2006].

Для изучения влияния этой мутации на эндотоксическую активность, вирулентность и иммуногенность мы сконструировали ЫрхМ мутанты на основе ряда штаммов, в том числе вирулентного штамма 231 и вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Мы обнаружили 10-кратное увеличение величин LD5o для ЛПС ЫрхМ мутанта по сравнению с ЛПС дикого типа (Р<0,05). Неспособность вирулентного штамма Y. pestis 231 ЫрхМ продуцировать гексаа-цильный ЛПС не снижала его вирулентность, в то время как вакцинный штамм при некотором снижении токсических свойств для белых мышей продемонстрировал значительное повышение иммуногенности, обеспечивая защиту от 71,4 % до 100 % животных после заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231. Сравнительный анализ уровня антител в сыворотке мышей после их вакцинирования показал значительное превышение уровня'антител, в случае мутантного штамма, что свидетельствует о более эффективном вакцинальном процессе.

Суммируя вышеизложенное, отметим, что установление структурно-функциональной организации ЛПС позволило приступить к направленному конструированию штаммов гра-мотрицательных бактерий, обладающих сниженной на несколько порядков эндотоксической активностью. Можно ожидать, что использование мутантов с редуцированным числом вторичных ацильных заместителей в липиде А в качестве продуцентов биологически активных веществ для фармацевтической промышленности даст возможность значительно повысить степень очистки конечного продукта от эндотоксина.

Использование аттенуированных IpxL и IpxM мутантов в качестве вакцинных штаммов может привести к разработке нового поколения живых и убитых вакцин, обладающих пониженной реактогенностью. Принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липида А могут вызывать эндотоксические эффекты разнонаправленного действия у человека и мыши [Delude R. et al., 1995] или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков [Kawahara К. et al., 2002, Somerville J. et al., 1996, Somerville J. et al., 1999], можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реактогенно-сти будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных.

Учитывая, что IpxM мутанты, в отличие от бактерий, дефектных по гену IpxL, не являются температуро-чувствительными [Karow, Georgopoulus, 1992], именно они являются оптимальными для конструирования живых вакцин, так как в ходе развития вакцинального процесса бактерии должны одну-две недели персистировать в макроорганизме при температурах выше 36 °С. В свою очередь, IpxL мутанты могут быть использованы при температурах культивирования, не превышающих 33 °С, в качестве основы для убитых вакцин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шайхутдинова, Рима Завдатовна, Москва

1. Абгарян Г.П. Характеристика некоторых штаммов чумного микроба, выделенных на Армянском нагорье от обыкновенных полевок: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1966. - 16 с

2. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. . докт. мед. наук. Саратов, Оболенск, 1999. - 326 с.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 3-23.

4. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. -Иркутск, Иркутский государственный университет, 1989. 92 с

5. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.

6. Беспалова И.А. Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону. - 1995. - 23 с.

7. Беспалова И.А., Васильева Г.И., Г нчарова Л.А., Мишанькин Б.Н., Дорошенко Е.П., Иванова И.А. Влияние ферментативного дефосфорилирования липополисахарида Yersinia pestis на его. токсичность in vitro и in vivo. II Биотехнология. 2006. - № 3. - С. 42-46.

8. Боровикова Т. А. Характеристика специфических полисахаридсодержащих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов, 1972. - 13 с.

9. Галазка А. Общая иммунология. Иммунологические основы иммунизации. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1993. -28 с.

10. Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Алутин И.М. и др. Локализация ответственного за синтез фракции I участка ДНК на плазмиде pYTчумного микроба // Молекул, генетика. 1992. - № 11-12. - С. 10-14.

11. Гремякова Т. А., Анисимов А.П., Захарова Н.М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток // Журн. микробиол. 1995. -№ 1. - С. 3-6.

12. Гремякова Т.А., Волковой К.И., Шайхутдинова Р.З., Степанов A.B. Температурозависимые изменения иммунохимических свойств липополисахарида Yersinia pestis // Вестн. РАМН. 1999. - № 12. -С. 32-34.

13. Дентовская C.B., Шайхутдинова Р.З., Книрель Ю.А., Иванов С.А., Анисимов А.П. Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью // Молекул, генетика. 2006. - № 2. - С. 3-8.

14. Дмитровский A.M. // Профилактика и меры борьбы с чумой. Материалы межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (6-7 сентября 1994 г., Алматы). Алматы, 1994.-С. 15-16.

15. Захарова И. Я., Варбанец JI. Д 1983 Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий / Захарова И. Я., Варбанец JI. Д.- Киев: Наукова думка, 1983.-428 с - .

16. Изучение молекулярных основ патогенности возбудителей особо опасных и социально значимых инфекций: Отчет о НИР (заключительный) / ГНЦ прикладной микробиологии УДК 578.76; 616.9; № ГР 0120.0 409071"; Инв. № 0220.0 405040". - Оболенск, 2003. -55 с.

17. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микробов. Саратов. - 1992

18. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридовграмотрицательных бактерий. // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 12. -С. 1784-1851.

19. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. // Биохимия. 1993. - Т. 58. - Вып. 2. -С. 166-181.

20. Красикова И. Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Синтез липополисахаридов у бактерий Yersinia pseudotuberculosis: влияние плазмиды pVM82 и температуры роста // Биохимия. 2000. - Т. 65. -Вып. 11.-С. 1507-1515.

21. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. -М.: Медицина, 1978. С. 24-36.

22. Медуницын Н.В. Вакцинология. М. Триада-Х, 1997. 272 с.

23. Оводов Ю.С., Горшкова Р.П. Липополисахариды псевдотуберкулезного микроба. // Химия природных соединений. 1988. - № 2. — С. 163-171.

24. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Наука, 1981.-288 с.

25. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина 1, антигена фракция 1 и экзотоксина "мышиного" токсина // л Генетика. 1983. - Т. 19. - № 7. - С. 1081-1090;

26. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В. Наумова, Л.В. Самойловой. Саратов, 1992. — 278 с.

27. Руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях".- ВОЗ. 2006. - Женева.

28. Тынянова В. И., Зюзина В.П. Демидова Г. В. и др. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinia pestis EV 76, выращенной при 28 ° и 37 // Биотехнология. 2003. - №6. - С. 10-16.

29. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир. - 1980. - 582 с.

30. Amura C. Silverstein R., Morrison D. The role of polyamines in the , neutralization of bacteriophage deoxyribonucleic acid. // Infect. Immun. -1998.-V. 66.-P. 5372-8.

31. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - V. 17. - P. 434-464.

32. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch Т.Е., Dentovskaya S.V. Variability . of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis II Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. -P. 23-27.

33. Aussel L., Therisod H., Karibian D., Perry M.B., Bruneteau M., Caroff M. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species. I I FEBS Lett. 2000. - V. 465. - P. 87-92.

34. Austin E., Graves J., Hite L., Parker C., Schnaitman C. Genetic analysis of lipopolysaccharide core biosynthesis by Escherichia coli K-12: insertion mutagenesis of the rfa locus. // J Bacterid. 1990. - V. 172. - P. 5312-25.

35. Bacot A., Martin C. Observations on the mechanism of the transmission of plague by fleas. // J.Hygiene Plague Suppl.3. 1914. -V. 13. - P. 423-39.

36. Baker E., Sommer H., Foster L., Meyer E., Meyer K. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis. // J. Immunol. 1952. - V. 68. - P. 13145.

37. Bengoechea J.-A., Lindner B., Seydel U., Diaz R., Moriyon I. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis are more resistant to bactericidal cationic peptides than Yersinia enterocolitica II Microbiology 1998. - V. 144. -P. 1509-1515.

38. BeutlerB., Cerami A. The common mediator of shoch cachexia, and tumor necrosis. //Adv. Immunol. 1988. - V. 42.-P. 213-31.

39. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1515-23.

40. Bligh E., Dyer W. // A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. - 1959. - V. 37. - № 8. - P. 911-23.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification ofimicrogramm quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

42. Brandenburg K., Seydel U. Investigatios into the fluidity of lipopolysaccharide and free lipid A membrane systems by Fourier-transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry. // Eur. J. Biochem. 1990.-V. 191.-P. 229-236.

43. Brandenburg K., Andra J., Miiller M., Koch M., Garidel P. Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity. // Carbohydrate Research. 2003. - V. 338. - P. 2477-2489.

44. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate. // J. Biol. Chem. 1990.-V. 265.-P. 15410-15417

45. Brubaker R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence. //

46. Curr Top Microbiol Immunol. 1972. -V. 57. - P. 111-158.

47. Brubaker R.R., Beesley E.D, Surgalla M.J. Pasteurella pestis: role of pesticin I and iron in experimental plague // Science. 1965. - V. 149. - P. 422-424.

48. Brubaker R. R. Factors promoting acute and chronic disease caused by yersiniae. // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - V. 4. - P. 309-24.

49. Butler T. Plague and other Yersinia infections. // New York: Plenum Press. -1983.

50. Caron E., Gross A., Liautard J.-P., Dornand J. Brucella species release a specific, protease-sensitive, inhibitor of TNF-or expression, active on human macrophage-like cells. // J. Immunol. 1996. - V. 257. - P. 2885-93.

51. Carty S. M., Sreekumar K.R., Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosyntesis in Escherichia coli: Induction at 12 °C of an acyltransferase specific for palmitoleoyl-acyl carrier protein. // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274.-P. 9677-9685.

52. Chart, H., T. Cheasty. and B. Rowe. Differentiation of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis by SDS-PAGE analysis of lipopolysaccaride. // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 20. - P. 369-370.

53. Chen T.H., Elberg S.S., Boyles J. et al. Yersinia pestis\ correlation of ultrastructure and immunological status // Infect. Immun. 1975. - V. 11. -P. 1382-90.

54. Chen P., Toribara T., Warner H. Estimation of organic phosphorus. // Anal. Chem. 1956.-V. 28.-P. 1756-1761.

55. Clementz T. The gene coding for 3-deoxy-manno-octulosonic acid ransferase and the rfaQ gene are transcribed from divergently arranged promoters in Escherichia coli. IIJ Bacteriol. 1992. -V. 174. - P. 7750-76.

56. Clementz T., Bednarski J. J., Raetz C.R.H. Function of the htrB high temperature requirement gene of Escherichia coli in the acylation of lipid A: HtrB catalyzed incorporation of laurate. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. -P. 12095-12102.

57. Clementz T., Zhou Z., Raetz C.R.H. Function of the Escherichia coli msbB gene, a multicopy suppressor of htrB knockouts in the acylation of lipid A. 11 J. Biol. Chem. 1997. -V. 272. - P. 10353-10360.

58. Cohen, S., Chang, A., Boyer H., Heling, R. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. II Proc. Natl. Acad. Sei. 1973. - V. 70.-P. 3240-4.

59. Coleman J., Raetz C. First committed step of lipid A biosynthesis in Escherichia coli: sequence of the IpxA gene. // J Bacterid 1988. - V. 170. -P.1268-74.

60. Darveau R. P., Hancock R. E. W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeroginosa and Salmonella typhimurium strains. // J. Bacteriol. — 1983a. — V. 155. P. 831-838.

61. Das U. Critical advances in septicemia and septic shock. // Crit. Care 2000. -V. 4.-P. 290-6.

62. Davies D. A specific polysaccharide of Pasteurella pestis. II Biochem J. -1956.-V. 63.-P. 105-116.

63. Delude R.L., Savedra R., Zhao Jr.H., Thieringer R., Yamamoto S., Fenton M.J., Golenbock D.T. Cdl4 enhances cellular responses to endotoxin without imparting ligand-specific recognition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92.-P. 9288-9292.

64. Dentovskaya, S. V., R. Z. Shaikhutdinova, Y. A. Knirel, S. A. Ivanov, and A. P. Anisimov. Construction of attenuated vaccine strains of Gram-negative bacteria. // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2006. - V. 2. - P. 3-8.

65. Dinarello C. The proinflammatory cytokines interleukin-1 and tumor necrosis factor and treatment of the septic shock syndrome.// J.infect. Dis. 1991. -Vol. 163. - P. 1177-84.

66. Ding J., Zhu Y., Ho B. High-perfomance affinity capture-removal of bacterial pyrogen from solution. // J. of chromatography 2001. - V. 759. - P. 237246.

67. Donnenberg M. S., Kaper J. B. Construction of an eae deletion mutantenteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector // Infect. Immun. 1991 - V. 59. - P. 4310-4317

68. Dower W., Miller J., Ragsdale C.,High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. // Nucl. Acids res. 1988. - V. 16. - P. 6127.

69. Dubois M., Gilles K., Hamilton J., Rebers P., Smith F. Colorimetric methods for determination of sugars and related substances. // Anal. Chem. 1956. - V. 28. - P. 350-8.

70. Eisen R., Bearden S., Wilder A., Montenieri J., Antolin M., Gage K. Early-phase transmission of Yersinia pestis by unblocked fleas as a mechanism explaining rapidly spreading plague epizootics // Proc Natl Acad Sci USA 2006.-V. 103.-P. 15380-15385.

71. Erridge C., Bennett-Guerrero E., Poxton I. Structure and function of lipopolysaccharides. // Microbes and Infection. 2002. - V. 4. - P. 837-85.

72. Evans J. S., Maiden C. J. Purification of meningococcal lipooligosaccharide by FPLC techniques // Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 57-62.

73. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // European J. Biochem. 1969. - V. 9. - P. 245-249.

74. Galanos C, Freudenberg M.A. Mechanisms of endotoxin shock and endotoxin hypersensitivity // Immunobiology. 1993. V. 187. — P. 346-356.

75. Gay P.', Lecog D., Steimetz M. et al., Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escherichia coli J. Bacterid// 1983.-V. 153.-p. 1424-1431.

76. Glauser et al., 1998 TNF alpha глава 3.2

77. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N. Takayama K., Raetz C.R.H. -Lipid A-like molecules that antagonize the effects of human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 19490-19498.

78. Griffin К., Hill J., Murray K. et al. Protective efficacies of the V antigen variants in Yersinia II Medische Microbiologic (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. - V. 6 (Suppl. П). - P. 535.

79. Gunn J., Lim K., Krueger J., Kim K., Guo 1., Hackerr M., Miller S. PmrA-PmrB- regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymixin resistance. // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 1171-82.

80. Hiimebush B. Transmission factors: Yersinia pestis genes required to infect the flea vector of plague. II Adv Exp Med Biol. 2003. - V. 529. - P. 55-62.

81. Hinnebusch В J. Interactions of Yersinia pestis with its flea vector that lead to the transmission of plague. // In: Gillespie S, Smith G,

82. Osbourn A, eds. Microbe-vector interactions in vector-bourne diseases. Cambridge. 2004. - P. 331-44.

83. Hirayama C., Sakata M:, Nakamura M., Ihara H., Kunitaka M., Todokoro M. J. Chromatogr. B, 1999, V.721 P.187.

84. Hitchcock P.J., Brown T.M. Preparation of proteinase K-treated cell lysates for SDS-PAGE // J. Bacterid. 1983. - V. 154. - P. 269-277.

85. Hofer M, Hampton R., Raetz C., Yu H. Aggregation behavior of lipid ГУд in aqeous solutions at physiological pH. 1: Simple buffer solutions. // Chem. Phys. Lipids.-1991.-V. 59.-P. 167-181.

86. Hoist O., Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. // В книге Endotoxin in health and disease. Под ред Brade H.et al. New-York Basel. 1999.-P. 115-154.

87. Ikawa M, Koepfli J., Mudd S., Niemann С An agent from E. coli causinghemorrage and regression of an experimental mouse tumor. III. The component fatty acids of the phospholipid moiety. // J Am Chem Soc. 1953. -V. 75.-P. 1035-1038.

88. Imoto M., Shiba T., Naoki H., Iwashita T., Rietschel ET., Wollenweber H-W., Galanos C., Lüderitz O. Chemical structure of E. coli lipid A: linkage site of acyl groups in the disaccharide backbone. // Tetrahedron Lett. 1983. -V. 24.-P. 4017-20.

89. Israelachvili J., Marcelja S., HormR. Physical" principles of membrane organization. // Rev Biophys 1980. - V. 13. - P. 121-200.

90. Johns M.A., Bruins S.C., McCabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. II. Serological response to lipid A and thr. lipopolysacchrides of Re-mutants // Inf. Immun. 1977. - V. 17. - P 9-15.

91. Kadrmas J. Brozek KA, Raetz CR Lipopolysaccharide core glycosylation in Rhizobium leguminosarum. An unusual mannosyl transferase resembling the heptosyl transferase I of Escherichia coli. II J Biol Chem. 1996. - V. 271. -P. 32119-25.

92. Kalupahana R, Emilianus A., Maskell D., Blacklaws B. Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing mutant lipid A with decreased endotoxicity causes maturation of murine dendritic cells // Infect. Immun. 2003 — V. 70-P. 6132-6140.

93. Kauffmann F, Lüderitz O, Stierlin H, Westphal O. Zur Immunchemie der O-Antigene der Enterobacteriaceen. I. Analyse der Zuckerbausteine von &zWze//a-0-Antigenen. // Zentralbl Bact I orig- 1960. 178:442-458

94. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner B., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature. // Infect. Immun. 2002. — V. 70. -P. 4092-4098

95. Kenne L., Lindberg B., Madden J., Lindberg A., Gemski P. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen. // Carbohydr Res. 1983. V. 122. - P. 249256.

96. Khan S.A., Everest P., Servos S., Foxwell N., Zäringer U., Brade H., Rietschel E.Th., Dougan G., Charles I.G., Maskell DJ. A lethal role for lipid A in Salmonella infections // Mol. Microbiol. 1998. - V. 29. - P. 571-579.

97. Kim S., Jia W., Bishop R., Gyles G. An msbB homologue carried in plasmid p0157 encodes an acyltransferase involved in lipid A biosynthesis in Escherichia coli 0157:H7. // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. - 1174-80.

98. Knirel Y., Dentovskaya S., Senchenkova S., Shaikhutdinova R., Kocharova N., Anisimov A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague// J of Endotoxin Research 2006. - V. 12. - P.

99. Kohara J., Tsuneyoshi N., Kimoto M., Gauchat J., Nakatake H., Fukudome K. Comparison.of lipopolysaccharide-binding functions of CD14 and MD-2.- - // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2005. - V. 12. - P. 1292-7.

100. Kohara J., Tsuneyoshi N., Gauchat J., Kimoto M., Fukudome K., Preparation and characterization of truncated human lipopolysaccharide-binding protein in Escherichia coli. II Protein Expr. Purif. 2006. - V. 49. - P. 276-83.

101. Konkel M., Tilly K. Temperature-regulated expression of bacterial virulence genes // Microbes and Infection 2000. - V. 2. - P. 157-166.

102. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - V. 227. - P. 680-685.

103. Lenaz G., Parenti Castelli G. Membrane fluidity, molecular basis and, physiological significance. // in: Benga G, ed. Stucture and Properties of cell

104. Membranes. Boca Raton, FL: CRC Press. 1985. - P. 93-136.

105. Lorange, E., Race B., Sebbane F., Hinnebusch B. Poor vector competence of fleas and the evolution of hypervirulence in Yersinia pestis. II J. Infect. Dis. -2005.-V. 191.-P. 1907-12.

106. Lowry O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L. et al. Protein measurement with the folin phenol // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 115-119.

107. Luchl M., Morrison D. Comparable endotoxic properties of lipopolysaccharides are manifest in diverse clinical isolates of gram-negative bacteria. II Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 1899-1904.

108. Liideritz O, Staub AM, Westphal O. Immunochemistry of O and R antigens ' of Salmonella and related Enterobacteriaceae. II Bacterid Rev 1966a. -V. 30.-P. 192.

109. Liideritz O. Galanos C., Risse HJ., Ruschmann E., Schlecht S., Schmidt G., Schulte-Holthausen H., Wheat R., Westphal O., J. Structural relationships of Salmonella O and R antigens. // Ann NY Acad Sci 1966b. - V. 133. - ' P. 349-374.

110. Luderitz O., Galanos C., Rietschel E. Endotoxins of Gram-negative bacteria. // Pharmacol Ther. 1982. - V. 15. - P. 383-402.

111. Luzzati V., Mariani P., Gulik-Krzywicki T., The cubic phases of liquid-containing systems: physical structure and biological implications. // In: Mennier J. Langevin D. Boccara N, eds. Physics of Amphiphilic Layers. -1987.-V. 21.-P. 131-137.

112. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y., Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

113. Mariani P., Luzzati V., Delacroix H. Cubic phases of liquid-containing systems. Structure analysis and biological implications. // J. Mol. Biol., 1993, 204, P. 165-189.

114. Martin G., Ghabrial H. High-performance liquid chromatographic method to resolve and determine lipopolysaccharide sub-groups of Escherichia coli endotoxin in isolated perfused rat liver perfusate // J. of Chromatography.1992,-V. 574.-P. 205-211.

115. Miller J. H. Experiments in Molecular Genetics. 1972. - P. 280.

116. Minka S., Bruneteau M. Isolation and chemical characterization of type R lipopolysaccharides of a hypovirulent strain of Yersinia pestis. II Can J Microbiol. 1998. - V. 44. - P. 477-81.

117. Muck A., Ramm M., Hamburger. Efficient method for preparation of highly purified lipopolysaccharides by hydrophobic interaction chromatography // J of Chromatography B 1999. - V. 732. - P. 39-46.

118. Murray S.R., Bermudes D., de Felipe K., Low K. Extragenic suppressors of growth defects in msbB Salmonella.// J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 5554-5561.

119. Nikaido H. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharides and the outer membrane layer of gram-negative cell wall.-Bacterial membranes and walls // Ed. L. Leive. New York: Dekker Inc. 1973. - V. 1. - P. 131-3.

120. Oertelt C., Lindner B., Skurnik M., Hoist O. Isolation and structural characterization of an R-form lipopolysaccharide from Yersinia enterocolitica 0:8 //Eur. J. Biochem. -2001. -V. 268. P. 554-564.

121. Whitehead,S., Barrell,B.G. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague // Nature 2001 - V. 413. - P. 523-527.

122. Perry R., Fetherston J. Yersinia pestis—Etiologic Agent of Plague // Clin Microbiology 1997.-V. 10. -№ l.-P. 35-66.

123. Perry R., Abney J., Mier I., Lee Y., Bearden S., Fetherston J. Regulation of the Yersinia pestis Yfe and Ybt iron transport systems. // Adv Exp Med Biol. 2003. - V. 529. - P. 275-83.

124. Porat R., McCabe W., Brubaker R. Lipopolysaccharide-associated resistance to killing of Yersinia by complement // J. Endotoxin. Res. 1995. - V. 2. -P. 91-97.

125. Portnoy D.A., Martiner RJ. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. - V. 118. P. 29-51.

126. Post D.M.B., Phillips N.J., Shao J.Q., Entz D.D., Gibson B.W., Apicella M.A. Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: importance of a hexaacyl lipid A // Infect. Immun. 2002 - V. 70-P. 909-920.

127. Prentice M., Rahalison L. Plague. // Lancet. 2007. - V. 369. - P. 1196-207.

128. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D., Reason A.J., Morris H.R., Dell A. Wren B.W., Titball R.W. Characterization of the lipopolysaccaride of Yersinic pestis. II Microb. Pathog. 2001b. - V. 30. - V. 49-57.

129. Radziejewska-Lebrecht. J., Shashkov A. S., Stroobant V., Wartenberg K., Warth C., Mayer H. The inner core region of Yersinia enterocolitica Ye 75 R(0:3) lipopolysaccharide. // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 221. - P. 343351.

130. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins // Aniiu. Rev. Biochem. 1990. -V. 59.-P. 129-170.

131. Raetz C.R.H. Escherichia coli and Salmonella In Cellular and moleculai biology // Edited by F. Niedhardt. American Society of Microbiology. 1996 -P. 1035-1063.

132. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipooligosaccaride endotoxins // Annu. Rev.

133. Biochem. 2002. - V. 71. - P. 635-700.

134. Rebeil R., Ernst R.K., Gowen B.B., Miller S.I., Hinnbush BJ. Variation in lipid A structure in the pathogenic Yersinia. II Mol. Microbiol. 2004. -V. 52.-P. 1363-1373.

135. Rebeil R. Ernst R.K., Jarrett C.O., Adams K.N., Miller S.I., Hinnebush BJ. Characterization of late acyltransferase genes of Yersinia pestis and their role in temperature-dependent lipid A variation. // J. Bactenol. 2006. - V. 188. -P. 1381-1388.

136. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R.H., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. -V. 4.-P. 495-503.

137. Rietschel E., Kirikae T., Schade F., Ulmer A., Holst O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H., Kusumoto S., Zahringer U. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology // ■ 1993.-V. 187.-P. 169-190

138. Rietschel E. T., Krikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. // FASEB J 1994. - V. 8. - P. 217-225.

139. Rietschel E., Westphal O. Endotoxin: historical perspectives. // In Endotoxin in health and disease. Marcel Dekker Inc., New York. 1999. - P. 1-30.

140. Roggenkamp A., Geiger A.M., Leitrritz L. et al. Passive immunity to infection with Yersinia spp. mediated by anti-recombinant V antigen isdependent on polymorphism of V antigen // Infect. Immun. 1997. - V. 65. -P. 446-451

141. Sandstrom G. Sjostedt A, Johansson T, Kuoppa K, Williams JC Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS. // FEMS Microbiol Immunol. 1992. - V. 5. - P. 201-210.

142. Scerra A.phosphorothionate primers imrove the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity. // Nucleic Acids res. 1992. - V. 20. - P. 3551-3554.

143. Sebbane F., Jarrett C., Linkenhoker J., Hinnebusch B. Evaluation of the role of constitutive isocitrate lyase activity in Yersinia pestis infection of the flea vector and mammalian host. // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. 7334-7.

144. Seiberth H., Schmidt-Gayk H., Hackental E. Toxicity, clearance and distribution of endotoxin in mice as influenced by actinomycin D, cycloheximide, a-amanitin and lead acetate. // Toxicon. 1972. - V. 10. -P. 491-500.

145. Seydel, U., Labischinski M., Kastowsky K., Brandenburg K. Phase behaviour, supramolecular structure and molecular conformation of lipopolysaccharide. // Immunobiology 1993. - V. 187 - P. 191-211.

146. Shepherd A., Hummitzsch D., Leman P., Swanepoel R., Searle LA. Comparative tests for detection of plague antigen and antibody in experimentally infected wild rodents. // J Clin Microbiol. 1986. - V. 24. P. 1075-8.

147. Shiba T, Naoki H, Iwashita T, Rietschel ET, Wollenweber H-W, Galanos C, Liideritz O. Chemical structure of E. coli lipid A: linkage site of acyl groupsin the disaccharide backbone. // Tetrahedrron Lett. 1983. V. 24. - P. 40174020.

148. Simon R., Priefer U., Pulher A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria // Biotechnology- 1983. -V. 1. -P. 784-791.

149. Skurnik M., Bolin I., Heikkenen H. etal. Virulence plasmid associated autoagglutination in Yersinia species // J. Bacterid. 1984. - V. 158. -P. 1033-6

150. Sodeinde O., Subrahmanyam Y., Stark K., Quan T., Bao Y., Goguen J. A surface protease and the invasive character of plague // Science. — 1992. -V. 258.-P. 1004-7.

151. Somerville J. E., Cassiano L., Bainbridge B., Cunningham M.D., Darveau R.P. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an antiinflammatory lipopolysaccharide // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97. - P. 359365.

152. Somerville J.E., Cassiano L., Darveau R.P. Escherichia coli msbB gene as i virulence factor and a therapeutic target. I I Infect. Immun. 1999. - V. 67. -P. 6583-6590.

153. Takayama K., Din Z., Mukeijee P., Cooke P., Kirkland T Physicocheical properties of the lipopolysaccharide unit that activates B lymphocytes. // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265. - P. 14023-29.

154. Tan N. S., Ho B., Ding J. L. High-affinity LPS binding domain(s) in recombinant factor C of a horseshoe crab neutralizes LPS-induced lethality // FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 859-70.

155. Tian L., White J., Lin H. et al. Induction of Mn SOD in human monocytes without inflammatory cytokine production by a mutant endotoxin. // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. - P. 740-7.

156. Tsai C.M., Frash C.E. A sensitive silverstain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 1982. -V. 119.-P. 115-119.

157. Tsuneyoshi N., Fukudome K., Kohara J., Tomimasu R., Gauchat JF.,

158. Nakatake H., Kimoto M. The functional and structural properties of MD-2 required for lipopolysaccharide binding are absent in MD-1. // J Immunol. -2005.-V. 174.-P. 340-4.

159. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. // Microbiol. Rev. 1992.-V. 56.-P. 395-411.

160. Vaara M., Nurminen M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. //Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -V. 43. - P. 145962.

161. Van Alphen L, Lugtenberg B, Rietschel ET, Mombers C. Architecture of the outer membrane of Escherichia coli K12. Phase transitions of the bacteriophage K3 receptor complex. 11 Eur J Biochem. 1979. - V. 101. -P. 571-9.

162. Van Amersfoort ES, Van Berkel TJ, Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. // Clin Microbiol Rev. 2003. - V. 16. - P. 379-414.

163. Van der Poll, Van Deventer. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis. // Infect Dis Clin North Am. 1999.* V. 13. - P. 413-426.

164. Vogelstein B., Gillespie D., Preparative and analytical purification of DNA from agarose //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.- P. 615-619.

165. Weisbach A., Hurwitz J. The formation of 2-keto-3- . of Escherichia coli. Identification. // J. Biol. Chem. 1959 - V. 234. - P. 705-12.

166. Welkos S., Friedlander A., Davis K. Studies on the role of plasminogen activator in systemic infection by virulent Yersinia pestis strain C092. // MicrobPathog.- 1997.-V. 23.-P. 211-23.

167. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure // Methods in carbohydrate chemistry / Roy L. Whistler (ed.). New York: Academic Press. Inc., 1965. -V. 5.-P. 83-91.

168. Wetmur J. G., Davidson N. J. Kinetics of renaturation of DNA. // Mol. Biol. -1968.-V. 31. P. 349-370.

169. Worsham P.L., Hunter M. Characterization of pestoides F, an atypical strain of Yersinia pestis II Medische Microbiologie (Nederlands Tijdschrift voor).1998. V. 6 (Suppl. II). - P. S34-35

170. Wyckoff T.J., Lin S., Cotter R.J., Dotson G.D., Raetz C.R. Hydrocarbon rulers in UDP-N-acetylglucosamine acyltransferases // J. Biol. Chem. 1998. -V. 273. 32369-32372.

171. Yanping H., Dongsheng Z., Xin P., etal. DNA microarray analysis of the heat- and cold-shock stimulons in Yersinia pestis // Microbes and Infection.— -2005.-V. 7.-P. 335-348

172. Zahringer U., Lindner В., Rietschel E. Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994. - V. 50. - P. 211-276.

173. Zahringer U., Lindner В., Rietschel E. Chemical structure of lipid A: recent advaces in structural analysis of biologically active molecules. // В книге Endotoxin in health and disease. Под ред Brade H.et al. New-York Basel.1999.-P. 93-114.