Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение штаммов YERSINIA PESTIS, образующих "атипичные" капсулы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение штаммов YERSINIA PESTIS, образующих "атипичные" капсулы"

РГБ ОД

2 2 АПР 2С02

На правах рукописи

MAJIAXAEBA Алина Николаевна \

ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS, ОБРАЗУЮЩИХ "АТИПИЧНЫЕ" КАПСУЛЫ

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2002

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации (г.Саратов) и Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича (г.Москва).

Научные руководители: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Анисимов А.П., доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Л.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Самойлова;

доктор медицинских наук, профессор И.Г.Швиденко.

Ведущая организация: научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской академии медицинских наук (г.Москва)

Защита состоится 02 апреля 2002 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан.........................................2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Г.А. Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Существование крупных природных iroB чумы на территории ряда государств (в том числе СНГ) сохраняет вероятность пространения одной из наиболее опасных инфекций. Во время вспышки чумы в дии (Kumar К. et al., 1997) и на Мадагаскаре (Chanteau S. et al., 1998) выделены {родные штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (Galimand М. et 1997), установлена резистентность блох к инсектицидам (Chanteau S. et al., 1998). ; это свидетельствует об ухудшении экологической обстановки и снижении целения типичных штаммов чумного микроба.

Паразитоценозы природных очагов чумы являются целостными системами, ранение и поддержание которых обеспечивается межвидовыми экологическими зями между их сочленами (Апарин Г.П, 1989, Perry R.D., 1997). И хотя входящие в тав этих биоценозов организмы в свою очередь - единые системы, все шоненты и функции которых взаимосвязаны, межвидовые взаимодействия и их :од, в первую очередь, определяются особенностями поверхностных структур ¡ельных клеток взаимодействующих организмов.

Поверхностные структуры бактерий в значительной степени определяют заженность их вирулентных и иммуногенных свойств в связи с тем, что именно i определяют возможность и характер взаимодействия с макроорганизмом, :спечивают развитие инфекционного или иммунного процессов, антигенную никрию. Роль отдельных клеточных структур определяет характер ответа анизма на микроорганизмы. В связи с этим в последние годы повысился интерес к чению поверхностных структур бактерий - капсул, пилей и фимбрий, юполисахаридов, а также мембранных белков и молекул с ярко выраженной циализированной функцией (ферментов, рецепторов, поринов и т.д.), в том числе оделяющей иммунореактивность.

Сведения о механизмах реализации патогенности и иммуногенности фоорганизмов и, в первую очередь, факторах, определяющих способность ■живаться в тканях организма хозяина, а также размножаться в них, лежат в основе работки эффективных средств профилактики и лечения инфекционных олеваний.

Штаммы, циркулирующие в природных очагах чумы, различаются по свои\ свойствам. Внутривидовое разнообразие штаммов чумного микроба, выделенных i разных природных очагах, проявляется в отличиях по степени вирулентности дл! различных видов диких и лабораторных животных (Апарин Г.П., Голубинский Е.П. 1989, КЬкушкин A.M., 1995, Perry, 1997), плазмидному составу (Балахонов C.B. 1989 Балахонов C.B. и др., 1991; Филиппов A.A. и др.,1992; Filippov A.A. et al, 1990) питательным потребностям и ферментативной активности (Апарин Г.П., 1989, Perrj R.D., 1997).

Вопрос о роли в эпизоотологии и эпидемиологии чумы "атипичных" штаммов отличающихся по ряду признаков от характерного для данного очага вариантг возбудителя чумы, до настоящего времени остается открытым (Кондрашкина, К.И 1971, Степанов В.М., 1981, Топорков В.П., 1987, 1999).

Атипичные штаммы по капсульному антигену рассматриваются как Fra* и Fra" В то же время, направленный мутагенез структурного гена cafl оперона fra приводит к образованию "бесфракционных" вариантов Y.pestis, сохраняющих вирулентность для лабораторных животных на уровне исходных штаммов (Drozdov I.G. et al., 1995, Friedlander A.M. etal., 1995).

Более того, Fra" штаммы периодически выделяются от больных животных и людей (Кудинова Т.П., 1968, Топорков В.П. и др., 1987, Burrows T.W., 1963). Былс показано, что нарушение структуры гена cafl M fra-оперона приводит к образовании вариантов Y.pestis с серологически "атипичными" капсулами (Анисимов А.П.. Захарова Н.М., 1992).

Изучению капсульного антигена посвящено большое число исследований. Капсула Y.pestis признана одним из "классических" факторов патогенности и основным иммуногеном, чумного микроба (Вейнблат В.И.,1974; Вейнблат В.И. и др., 1980, 1983, Домарадский И.В., 1993, 1998; Жуков-Вережников H.H., 1940; Perry R.D., 1997).

FI является главным иммуногеном, на котором основаны все иммуно-серологические методы диагностки и вакцины, используемые для создания противочумного иммунитета. Иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена FI или антител к нему. Кроме того, он является основным

сомпонентом большинства коммерческих и экспериментальных чумных препаратов Наумов А.В. и др., 1992, Perry R.D., 1997).

Иммуно-серологическая диагностка чумы, в том числе и эпизоотологическое »бследования осуществляются иммуно-биологическими препаратами на основе FI [умного микроба. Поэтому изучение штаммов с "атипичными" капсулами федставляет интерес с точки зрения рассмотрения специализированных механизмов г систем, обеспечивающих существование чумного микроба на отдельных этапах его кизненного цикла при различных путях передачи возбудителя, и возможности ¡пецифической защиты макроорганизма от заражения такими штаммами.

До настоящего времени не проводились широкие исследования штаммов [умного микроба с "атипичной" капсулой методами световой, флюоресцентной и, 'собенно, иммунноэлектронной микроскопии. Поэтому изучение таких штаммов и 'Собенно определение эффективности их выявления с помощью различных методов абораторной диагностики являются важными и актуальными.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучить функциональную и диагностическую начимость капсулы штаммов Y. pestis с фенотипами Fra* и Fra".

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить поверхностную структуру природных и экспериментальных ггаммов с нарушенным синтезом капсульного антигена и капсулообразования с омощью иммунологических и иммунохимических методов, различных вариантов [икроскопии и охарактеризовать основной компонент "атипичной" капсулы.

2. Найти возможности методических подходов идентификации штаммов pestis с Fra* и Fra", невыявляемые коммерческими диагностическими препаратами,

снованными на антигене FI.

3. Установить значение различных продуктов гена fra-оперона Y. pestis на рансмиссивный и алиментарный пути передачи чумы.

4. На модели иммунизированных и интактных лабораторных животных пределить роль штаммов Y. pestis с фенотипом Fra* в развитии экспериментальной умы.

5. Изучить эффективность выявления штаммов возбудителя чумы с шшичной" капсулой методом полимеразной цепной реакции

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Получены новые данные о морфологии, функциональной и диагностической значимости капсулы Fra* и Fra- штаммов возбудителя чумы. Впервые с помощью комплекса . иммунологических и иммунохимических методов, световой, флюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии получены доказательства образования капсулы, сформированной из компонентов, отличных от капсульного антигена FI.

С помощью сканирующего оптического микроскопа ближнего поля получены новые данные о поверхностной структуре штаммов Y. pestis, с фенотипом Fra+, Fra1 и Fra" на ультраструктурном уровне.

Предложены методические приемы по идентификации штаммов Y.pestis с "атипичными" капсулами. На основании результатов наших исследований с помощью световой микроскопии с окраской по Гинсу-Бурри, флюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии, методов электрофореза и иммуноблотгинга секретируемых белков из штаммов, выращенных при различных значениях pH, дополнены паспортные данные 31 штамма Y. pestis характеристиками капсулы.

Впервые показана способность штаммов Y.pestis с фенотипами Fra^Tox* и Fra'Tox+, отличающихся по экспрессии генов /га-оперош, вызывать с низкой частотой, по сравнению с типичными штаммами, формирование блоков преджелудка у блох Xenopsylla cheopis Roths, и Nosopsyllus lacviceps Wagn., обеспечивать трансмиссивный путь передачи чумы белым мышам.

На модели белых мышей показано, что штаммы, содержащие "атипичные" капсулы, преодолевают иммунитет, индуцированный вакцинным штаммом Y.pestis EV НИИЭГ. Впервые установлено, что у переболевших чумой морских свинок, вызванной штаммом с "атипичной" капсулой, патоморфологические изменения внутренних органов принципиально не отличались от таковых у животных, погибших в результате их заражения типичным природным штаммом У. pestis.

Проведена детекция пггаммов Y. pestis с фенотипами Fra1 и Fra" с помощью ПЦР-анализа с праймерами, комплементарными нуклеотидной последовательности генов са/1 и pía.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

По результатам работы составлены "Методические рекомендации по идентификации штаммов Yersinia pestis с атипичными капсулами", которые одобрены Ученым Советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол № 11 от 28.12.2000 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб".

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей по особо опасным инфекциям при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. При изучении природных и экспериментальных штаммов возбудителя чумы, невыявляемых антифракционными диагностическими препаратами, с помощью иммунохимических методов и различных вариантов микроскопии у них обнаружено наличие "атипичной" капсулы.

2. В штаммах Y. pestis с фенотипами Fra* и Fra" образуется "атипичная" капсула, в состав которой входят белки, большая часть которых не идентифицирована. При закислении среды культивирования (рН 5,8) образуется капсула, состоящая в основном из рН 6-антигена.

3. Предложенный комплекс иммунологических и бактериоскопических методических приемов (световая микроскопия с окраской по Гинсу-Бурри, флюоресцентная и иммуноэлектронная микроскопия, исследования с помощью электрофореза и иммуноблоттинга) позволяет проводить идентификацию штаммов Y. pestis, образующих "атипичные" капсулы.

4. Штаммы Y. pestis с "атипичной" капсулой передаются грызунам трансмиссивным и алиментарным способами заражения, являются вирулентными для лабораторных животных.

5. Штаммы Y. pestis, с фенотипами Fra" и Fra1, образующие "атипичные" капсулы, преодолевают иммунитет у белых мышей, иммунизированных штаммом Y. pestis EV НИИЭГ.

Штаммы Y. pestis с "атипичной" капсулой обнаруживаются методом ПЦР с помощью диагностической тест-системы для выявления возбудителя чумы с праймерами, комплементарными нуклеотидной последовательности генов cafl и pía.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Исследования проведены в рамках плановой темы "Изучение структурно-функциональной организации генома чумного микроба и разработка генетических тест-систем для характеристики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний" № 003-96, № Госрегистрации 01.9.70000638.

Материалы диссертации доложены и представлены: на Всероссийском обществе эпидемиологов и паразитологов (Москва, 1997), Biomedical Opticus -Europe'97 (San-Remo, Italy 1997); 7th International Congress on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998); XVII, XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1998, 2000); X, XI Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования - РЭМ-97, РЭМ-99 (Черноголовка, 1997, 1999); юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск, 1999); 1-й Всероссийской научно-практической конференции по генной диагностике особо опасных инфекций (Саратов, 2000); 3rd International Conference on Emerging Zoonoses (Noordwijkerhout, the Netherlands, 2001).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" 29.06.2001 г. протокол № 1 и ученом совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича 20.11.2001 г. протокол № 14.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, состоит из введения; 1 главы обзора литературы; 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выводов; списка литературы, включающего работы 143 отечественных и 101 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использован 31 штамм Y. pestis, 9 из которых получены генно-инженерным путем и 22 выделены из различных природных очагов чумы в разное время.

Основные фенотипические характеристики штаммов определяли согласно "Руководству по профилактике чумы" (1992).

Наличие капсулы определяли с помощью световой по методу Гинса-Бурри, электронной и иммуноэлектронной микроскопии, используя негативное контрастирование микробных клеток.

Капсульный антиген выделяли и очищали методом изоэлектрической преципитации (Титенко М.М., 1983). Суммарные секретируемые белки У. pestis получали осаждением из культуральной жидкости 2,5 объемами этанола, охлажденного до температуры -20 °С. Электрофоретическое разделение белков в системе ПААГ с 0,1 % SDS осуществляли по методу U.K. Laemmly (1970).

Препараты белков для электрофореза готовили, как описано L.G. Bennet., T.G. Tornabene (1974). Иммуноблоттинг проводили по методу H. Towbin et al. (1979). Электрофорез в свободном потоке проводили на приборе EIphor-Vap5 (Germany).

Вирулентность исследуемых штаммов для интактных, иммунных и переболевших животных, определяли при внутрибрюшинном способе заражения белых мышей по показателю LD50, для подсчета которого использовали формулу Г. Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962).

Заражение белых мышей осуществляли алиментарным путем и укусами блокированных блох. Вакцина чумная живая сухая представляет собой культуру вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, поэтому вакцинацию лабораторных животных проводили данным штаммом подкожно в соответствии с РП №702-97. Внутренние органы морских свинок и лабораторных белых мышей (лимфатические узлы, печень, селезенка, легкие, почки, надпочечники и сердце) исследовали патоморфологическими методами. Изготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

В ПЦР-методе для выделения ДНК использовали метод нуклеосорбции на селикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата (Boom R., et al., 1990). Для

амплификации участка геномной ДНК использовали олигонуклеотидные праймерь; F21-F22 (комплементарные нуклеотидной последовательности гена cafl) и PlaYl-PlaY22 (комплементарные нуклеотидной последовательности гена pía). Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 2 % агарозе в аппарате ПГ-9, с блоком питания и набором штампов для подготовки геля.

Математический анализ результатов проводили путем определения средних величин, ошибок средней арифметической, уровней значимости и доверительны) вероятностей по рекомендациям И.П .Ашмарина и A.A. Воробьева (1962). Б.С. Бессмертного (1967), Е.В. Гублера и A.A. Генкина (1973).

Графическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерной программы Excel 7,0 for Windows 95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Из Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" были отобрань: штаммы Y. pestis, выделенные из различных природных очагов в разное время невыявляемые в РНГА, но образующие капсулу, видимую под световым микроскопом. Мы провели их сравнение с экспериментальными штаммами Y. pestis. полученных генно-инженерным путем. С помощью комплекса методов (РНГА. световой микроскопии по методу Гинса-Бурри, флюоресцентной микроскопии) нами показано, что штаммы Y. pestis с фенотипом Fra* имели отчетливо видимую пол световым микроскопом капсулу. Анализ капсулообразующей способности природных Fra+, Fra" и Fra* изолятов Y. pestis из ГосКПБ "Микроб" и аналогичных экспериментальных штаммов позволил разделить все исследованные культуры бактерий на три группы:

К первой группе нами были отнесены штаммы Y. pestis, обладающие выраженной серологической активностью (титры в РНГА от 1:512 до 1:4096) и содержащие в своих популяциях от 70 % до 100 % клеток с отчетливо видимыми пол световым и люминесцентным микроскопами капсулами. Это природные штаммы: 115-Ур, 128-Ур, 231, 305(1694), 358; вакцинный штамм EV НИИЭГ; и экспериментальные штаммы Y. pestis-. КМ276; КМ272, КМ278.

Во вторую группу вошли штаммы Y. pestis, необладающие серологической активностью (РНГА отрицательная) и несодержащие в своих популяциях клетки с видимыми под световым микроскопом капсулами. Это экспериментальные штаммы.

утратившие плазмиду рРга в процессе их получения. К ним относятся штаммы У. резШ КМ218, КМ254, КМ261, КМ271.

К третьей группе нами отнесены штаммы У невыявляемые с помощью чумного эритроцитарного диагностикума или дающую положительную реакцию в РНГА только в разведении 1:2* и содержащие в своих популяциях от 15 % до 97 % теток с отчетливо видимыми под световым микроскопом капсулами. К ним были этнесены природные штаммы У. часть из которых, лишена плазмиды рРга в штономном состоянии: 10087, 16-К, 252 (Рос), 622, 1ауа-8, М-493, М-509, М-510, У1-512, М-513, М-521, М-522, М-957, М-962, М-974 и экспериментальные штаммы Г. ре^'г. КМ280,358рРга/рРВК10.

Помимо этих штаммов к третьей группе отнесен природный штамм И-2422, ¡тносящийся к Улегейскому подвиду, который в процессе музейного хранения 'тратил автономную плазмиду рРга. Этот штамм не реагировал с антителами к Р1 в 'НГА, но содержал до 97 % клеток, образующих капсулы, отчетливо видимые в :ветовом микроскопе с окраской их по методу Гинса-Бурри.

Таким образом, нами выявлено, что только экспериментальные штаммы, голученные генно-инженерным путем, истинно бескапсульные варианты, поскольку ■ природных штаммов У. реМз с Бга1 и Рга' фенотипами, содержалось от 15 до 97 % леток, образующих "атипичные" капсулы, нереагирующие с антителами к П.

Дальнейшая работа была направлена на элекгрофоретическое исследование и ммуноблотгинг белков капсулы штаммов У. резИя, а также иммуноэлектронную и канирующую зондовую микроскопию штаммов чумного микроба с типичными и атипичными" капсулами.

Для электрофоретического анализа использовали бактериальные культуры, редварительно выращенные в течение 24 ч при температуре 28 °С в 30 мл бульона [отгингера (рН 5,8, 7,2 или 8,0), а затем культивированные в течение 24 ч при ;мпературе 37 °С с использованием бифазной системы бульон-агар Хоттингера >Н 5,8, 7,2 или 8,0). В данном эксперименте проводили контроль рН использованных итательных сред. При электрофоретическом анализе белков капсулы различных ггаммов У. ревШ было установлено, что из штаммов КМ278, М-493 и ЕУ НИИЭГ

В настоящих исследованиях первая лунка содержала 10'м.к/мл, согласно ФС 42-3810-99, диагностику)* итроцитарный чумной иммуноглобулиновый должен выявлять У, реаи в концентрации 2,5 х ю5 м.к./мл.

отчетливо видны полосы, совпадающие с подвижностью антигена FI, у штаммов КМ278 и EV НИИЭГ наибольшая продукция FI отмечается при рН 8,0. У штаммов М-493, И-2422 и EV НИИЭГ при рН 5,8 четко образовывалась полоса, совпадающая с подвижностью антигена рН 6.

Иммуноблотгинг капсульных белков штаммов Y.pestis, с использованием сыворотки против рН 6 антигена Y. pestis подтвердил, что тестируемые количества рН 6 антигена образовывались всеми исследованными штаммами кроме рН 6" варианта КМ278, только при кислых значениях рН среды (5,8). С моноспецифическими IgG против типичного капсульного антигена Y. pestis выявлена реакция исследованных препаратов только у штаммов КМ278 и EV НИИЭГ, наибольшая продукция FI отмечена при рН 8,0.

С помощью иммуноэлектронной микроскопии впервые выявлены в составе типичной и "атипичных" вариантов капсул компоненты, идентифицированные с помощью иммуноблотганга, в препаратах суммарных секретируемых белков.

Так клетки штамма Y.pestis М-493, выращенного при температуре 37°С и рН 5,8, были способны образовывать отчетливо видимую капсулу, а бактерии этого же штамма, культивированные при температуре 37 °С и рН 7,2, были бескапсулышми, но к их поверхности присоединялись антитела к рН б антигену (рис.

1-2).

Рис. 1. Электронная микрофотография единичной клетки штамма Y. pestis М-493.

Негативное контрастирование. Размер масштабной линейки - 1 мкм. Бактерии выращивали 48 ч при температуре 37 °С (рН 5,8). К - капсула.

'9

Рис. 2. Иммуноэлектронная микрофотография клетки штамма КМ493. Негативное контрастирование. Размер масштабной линейки - 1 мкм. Бактерии выращивали 48 ч при температуре 37 °С (рН 7,2). - кроличьи моноспецифические антитела к рНб-антигену, конъюгированные с коллоидным золотом.

Клетки рН 6" штамма К />е5/м КМ278 образовывали отчетливо видимую капсулу, не реагировали с антителами к рН 6 антигену, однако реагировали с штителами с Р1 (рис. 3-4).

к

не. 3. Иммуноэлектронная микрофотография единичной клетки штамма К pestisKM27$. егативное контрастирование. Размер масштабной линейки - 1 мкм. Бактерии выращивали 3 ч при температуре 37 "С (рН 7,2). К - капсула. ^ - мышиные моноклональные антитела к [ и конъюгат белка А с коллоидным золотом.

Рис. 4. Электронная микрофотография единичной клетки штамма КрейиКМ278. Негативное контрастирование. Размер масштабной линейки - 1 мкм. Бактерии выращивали 48 ч при температуре 37 °С (рН 5,8). К - капсула.

С помощью сканирующего зондового светового микроскопа ближнего поля на ультраструктурном уровне нами впервые установлены различия поверхностной структуры штаммов Y. pestis Fra+ и Fra" У Fra+ штаммов на поверхности клетки имеются глобулярные структуры бежа FI, тогда как у Fra" штаммов поверхность морщинисто-шероховатая.

Вопрос об эпизоотологическом значении штаммов Y. pestis с "атипичными" капсулами решался с точки зрения наличия у них свойств, определяющих способность возбудителя чумы циркулировать в популяции грызунов по схеме трансмиссивного заболевания - "грызун-блоха-грызун". Весьма важным стало изучение способности штаммов Y. pestis с "атипичными" капсулами передаваться укусами блох - основных переносчиков чумы в конкретных энзоотичных очагах.

Заражение переносчиков болезни происходит в процессе кровососания, при наличии бактеремии у теплокровного хозяина. Эффективность дальнейшей передачи зависит от феномена блокообразования.

В нашем исследовании задача состояла в определении связи блокообразования штаммов У. pestis со способностью образовывать капсулу. Известно, что утрата возбудителем чумы репликона pFra приводит к снижению частоты блокообразования и уменьшению вероятности трансмиссивной передачи (Кокушкин A.M., 1995). В этой связи мы провели эксперименты с генетически охарактеризованными Fra+, Fra* и Fra"

штаммами У. для выяснения роли капсульного антигена в процессе

блокообразования у разных видов блох.

В опыт были взяты блохи со 100 % зараженностью. Но, несмотря на это, варианты возбудителя чумы (КМ254 - бескапсульный вариант; КМ280 - образующий "атипичную" капсулу; КМ282 - несущий плазмиду рИЭКЗ, несущую ген са/1) быстро элиминировались из блох. После 4-ой подкормки инфицированность насекомых составляла 10-20 % (табл. 2).

Таблица 2. Зараженность блох и частота блокообразования.

Вия блох Количество блох в опытах Штамм У. pestis Инфицированность блох (%) после Частота формирования блоков (В%)

заражения 4-й подкормки

X. cheopis 400 КМ280 (Fra±To>c+) 100 15 единичные

X. cheopis 400 КМ282 (Fra+Tox) 100 10 0

Ns. laeviceps 400 КМ254 (FraTox4) 100 20 1,9

X. cheopis 400 231 (Fra+ Tox+) 100 20 2,4

Блохи X. cheopis быстрее освобождались от штаммов У. pestis с Fra^Tox-(КМ282) и среди них не было обнаружено особей с закупоркой преджелудка. Низкая способность к блокообразованию характерна для вариантов Y. pestis, обладающих Fra1 или Fra~ фенотипом, несущих мутацию /га-оперона. У блох Ns. laeviceps, зараженных штаммом У. pestis Fra Тох+ (КМ254) особи с блоком преджелудка появились на 8-10 сутки после 4-ой подкормки, частота блокообразования составила 1,9 %. По 1 блохе с закупоркой преджелудка были посажены на 3 белые мыши. Две из них пали (на 3-й и б-е сутки) от генерализованной формы чумы. Эти данные свидетельствуют, что такие штаммы могут передаваться по схеме: "грызун-блоха-грызун".

Для генерализации инфекции и быстроты взаимодействия чумного микроба с клет-ками фагоцитарной системы применялось внутрибрюшинное заражение белых мышей. В экспериментах по изучению роли штаммов У. pestis с "атипичными" капсулами в развитии чумной инфекции нами было установлено, что вирулентность при таком способе заражения штаммами Y. pestis с "атипичными" капсулами для

интактных белых мышей имела тенденцию к снижению. Достоверное снижение наблюдалось только у штаммов У. резИз КМ280. Для мышей, предварительно иммунизированных вакцинным штаммом У. реШз ЕУ НИИЭГ, 1Л)5о у таких штаммов бьша на 1-3 порядка ниже, чем у У. рел/и 231 (табл.3).

Таблица 3. Результаты заражения различными штаммами У. резИз интактных и иммунизированных белых мышей. ___

Штаммы Y. pestis Показатели LD50 (м.к.) Индекс иммунитета Средние сроки жизни (сут)

интактные иммунные интактные иммунные

231 10 (2-36) 2,0x105 X5j3xl04 - 5,3х105) 20000 6,0 6,0

КМ254 18 (4-65) 9,0x102 (280 - 2,8х103) 50 7,6 5,3

КМ279 39 (11-142) 1,0x10" (З,9х103-2,9x10") 256 5,7 7,8

КМ280 200 (55 - 730) 3,0х102 (64 - 800) 1,5 14 6,5

М-493 70 (14-444) 686 (137-4,ЗхЮ3) 9,8 6,1 7,2

При патомофологическом исследовании внутренних органов белых мышей (интактных и иммунных), павших в результате заражения штаммами возбудителя чумы с "атипичной" капсулой, выявлены признаки острого инфекционного процесса, не уступающие таковым при заражении исходным штаммом.

При алиментарном заражении (каннибализме) белых мышей возбудителем У. pestis с полным плазмидным профилем наблюдается скоротечность процесса, в то время как при таком же заражении, штаммом, лишенным плазмиды pFra, наблюдается затяжной характер течения заболевания. Наши результаты алиментарного заражения белых мышей подтверждают данные A.M. Кокушкина (1995) о незначительном влиянии продуктов плазмиды pFra на течение инфекционного процесса при алиментарном заражении белых мышей,

Патоморфологические изменения у интактных и иммунных белых мышей, зараженных алиментарно штаммами У. pestis с различными вариантами капсулы, характерны для острой бубонно-септической чумы.

В результате проведенных исследований по изучению инфекционного процесса ;ыявлено, что при первичном инфицировании морских свинок штаммом У pestis 231 : типичной капсулой, наблюдались более выраженные патоморфологические вменения, чем у таких же морских свинок, зараженных штаммом с "атипичной" :апсулой. А у переболевших морских свинок морфологическая картина при аражении теми же штаммами сходная и соответствует признакам ярко выраженного торичного иммунологического ответа.

Таким образом, нами показано, что у штаммов Y. pestis с фенотипом Fra~ и 'га*, нет снижения абсолютных величин LD50 по сравнению со штаммами У. pestis с )енотипом Fra+. Однако у животных, зараженных штаммами с фенотипом Fra", тмечали достоверно больший срок жизни. Средняя продолжительность жизни при аражении "классическим" штаммами У. pestis составляла 6 дней, штаммами с )енотипом Fra* 6-8 дней, с фенотипом Fra- до 14 дней. Выраженность перехода умной инфекции в подострую форму зависела от вида животных и исходного ггамма У. pestis.

Fra* штаммы У pestis были способны вызывать у животных инфекционный роцесс, не отличающийся от "классической" чумы, но не индуцировали перестройки ммунной системы, защищающей от повторного заражения этими же штаммами.

Полученные результаты позволяют предположить возможность участия 1таммов возбудителя чумы с "атипичными" капсулами в развитии инфекционного роцесса, а также в формировании затяжных форм чумной инфекции в популяциях иких грызунов в природных очагах чумы.

Как показали исследования фенотипической изменчивости возбудителя чумы \нисимов П.И. с соавт., 1999), функциональная перегруппировка активности гнетических детерминант синтеза капсульного антигена приводит к определенным рудностям диагностики чумы методами, основанными на обнаружении FI. Метод [ЦР позволил с высокой специфичностью обнаружить У. pestis с измененным енотипом. Нами проведено исследование штаммов чумного микроба, образующих шлгачные" капсулы методом ПЦР с тест-системой, представленной РосНИПЧИ Микроб" (г. Саратов) и НИИЭМ МО (г. Киров). В опыт брали полноценные штаммы . pestis, заведомо дефектные по гену cafl, а так же с неполными паспортными аиными.

В результате проведенных исследований при изучении штаммов Y. pestis с измененным фенотипом (Fra* или Fra~) показано, что у 16 природных штаммов У. pestis, не имеющих автономных плазмид pFra и pPst, не продуцирующих белок FI, были зарегистрированы положительные результаты с праймерами, соответствующими нуклеотидной последовательности участка cafl. Штаммы с "атипичной" капсулой были обнаружены методом ПЦР при дозе 103 м.к./мл. в 100 % случаях, в 102 м.к./мл. - в 49 % и 10 м.к./мл. - в 16 %.

Таким образом, для исследования штаммов Y. pestis, образующие "атипичные" капсулы, может применяться метод полимеразной цепной реакции. Данный метод идентификации чумного микроба позволяет выявить штаммы Y. pestis, трудно поддающиеся детекции коммерческими специфическими диагностикумами.

Применение высокоэффективных ПЦР-тест-систем параллельно с использованием широко известных иммунологических и бактериологических методов, будет способствовать эффективной идентификации и индикации типичных и "атипичных" штаммов возбудителя чумы.

Таким образом, наши исследования показали, что чумной микроба способен образовывать несколько типов морфологически неразличимых капсул, сформированных из различных компонентов (FI, рН6 и др.). Отсутствие в составе капсулы "классического" капсульного антигена FI делает Fra" и Fra* штаммы Y. pestis недоступными для индикации коммерческими иммунодиагнстикумами, основанными на антителах к FI антигену, но тест-система диагностическая для выявления Yersinia pestis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) дает возможность выявлять подобные штаммы в случае наличия в них гена р!а, а также при сохранении в геноме неэкспрессируюегося гена cafl. О функциональной значимости капсулы для возбудителя чумы в экосистемах природных очагов свидетельствует тот факт, что у всех исследованных нами Fra~ и Fra* "природных изолятов" даже после музейного хранения по данным световой и иммуноэлеюронной микроскопии капсулы присутствовали у 15-97 % клеток популяций отдельных штаммов.

Полученные в ходе настоящей работы данные свидетельствуют, на наш взгляд, о необходимости продолжения исследований по идентификации компонентов "атипичных" капсул штаммов Y. pestis и выяснению их эпизоотологической значимости и значения в создании специфической защиты от чумы.

19

ВЫВОДЫ

1. В штаммах Y. pestis с фенотипами Fra* и Fra" образуется "атипичная" капсула, в ;остав которой входят белки, большая часть которых не идентифицирована. При ¡акислении среды культивирования (рН 5,8) образуется капсула, состоящая в JCHOBHOM из рН 6-антигена.

2. С помощью иммунохимических методов и сканирующего оптического ликроскопа ближнего поля впервые установлены различия поверхностной структуры птаммов Y. pestis Fra+, Fra1 и Fra". У Fra+ и Fra* штаммов на поверхности клетки шеются глобулярные структуры, тогда как у Fra" штаммов поверхность шероховатая.

3. По результатам иммуно-серологических методов (РИГА, ПЦР, ИФА, а также :ветовой и иммунноэлектронной микроскопий дополнены характеристиками капсулы мспортные данные природных и экспериментальных штаммов Y. pestis с фенотипами ;га* и Fra".

4. Показана способность штаммов Y. pestis с фенотипами Fra±Tox+ и FraTox4 формировать с низкой частотой по сравнению с Y. pestis Fra' блок преджелудка у шох X. cheopis, Ns. laeviceps и передавать инфекцию здоровым животным, 'езультаты алиментарного заражения штаммами Y. pestis с "атипичными" капсулами :видетельствуют о незначительном (р > 0,05) влиянии продуктов /га-оперона на !ирулентность для белых мышей при этом методе инфицирования.

5. Микробы с "атипичной" капсулой способны преодолевать специфический [ммунитет у мышей, индуцированный вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ.

6. Во внутрешшх органах иммунизированных и контактных морских свинок, гавших в результате заражения штаммами возбудителя чумы с серологически атипичной" капсулой или умерщвленных на 30 сут после заражения, выявлены [атоморфологические признаки острого инфекционного процесса, соответствующие аковьм при заражении полноценным штаммом.

7. Штаммы Y. pestis с фенотипами Fra" и Fra1, образующие "атипичные" капсулы, бнаруживаются методом ПЦР с помощью диагностической тест-системы для ыявления возбудителя чумы с праймерами, комплементарными нуклеотидной оследовательности генов cafl и pía.

8. Предложены методические приемы идентификации штаммов Y. pestis, бразующих "атипичпые" капсулы и невыявляемых антифракционными

коммерческими диагностическими препаратами, включающие постановку РИГА, световой микроскопией с окраской бактерий на капсулы по методу Гинса-Бурри, электронной и иммуноэлекгроной микроскопий, ПЦР, выделение компонентов капсулы и исследование их с помощью электрофоретического разделения белков в системе SDS-ПААГ, проведение иммуноблотганга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Konnov N.P., Baiburin V.B., Shcherbakov А.А, Malahaeva A.N., Zadnova С.P., Volcov Y.P. Scanned probe microscope for biological application // BIOS Europe 97, 4-8 Sept, - San Remo,1997. - V.3197. - P.294-301.

2. Baiburin V.B, Konnov N.P, Shcherbakov A.A, Malahaeva A.N, Volcov Y.P. Near field light microscopy with SEM light generation // IDem - San Remo,1997. - V.3197, -P.302-304.

3. Baiburin V.B, Konnov N.P, Shcherbakov A.A, Malahaeva A.N, Volcov Y.P. Near field optical microscopy of bacteria thin sections // IDEM - San Remo,1997. - V.3197, -P.305-307;

4. Коннов Н.П, Байбурин В.Б, Волков Ю.П, Малахаева А.Н. Сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля с РЭМ возбуждением света // X Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. Тез.докл. - Черноголовка, 1997. - C.I53.

5. Коннов Н.П, Байбурин В.Б, Волков Ю.П, Малахаева А.Н, Заднова С.П. Исследования ультратонких срезов бактерий с помощью сканирующего оптического микроскопа ближнего поля. // Там же - С. 154.

6. Коннов Н.П, Малахаева А.Н, Волков Ю.П. Изучение колоний бактерий чумы в сканирующем электронном микроскопе. // Там же - С. 155.

7. Коннов Н.П, Байбурин В.Б, Волков Ю.П, Малахаева А.Н. Универсальный комплекс сканирующих зондовых микроскопов для микробиологических и молекулярных исследований // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, 28-31 января, 1997,- М, 1997, - Том 1. - С.205

8. Sayapina L.V, Anisimova T.I, Kasina I.V, Malahaeva A.N, Adamova G.V, Garanina S.B, Mayorov N.V, Tuchkov I.V, Kulichenko A.N, Darmov I.V, Vorobyov A.A, Shvedun G.P, Anisimov A.P, Sergeeva G.M, Plotnikov O.P. Study of diagnostic value of new test-system for Yersinia pestis detection by polymerase chain reaction // Chinese J. of Control of Endemic Disease. - 1999. - V. 14 (Special issue). - P. 76-77.

9. Малахаева А.Н., Анисимов А.П., Саяпина JI.B. Образование капсулы у FI" и FI* штаммов Yersinia pestis. // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Сборник тезисов докладов. Юбилейная научная конференция, посвященная 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (14-15 декабря 1999 г., Оболенск). - Оболенск, 1999. - С. 98.

10. Малахаева А.Н., Анисимов А.П., Коннов Н.П., Саяпина JI.B. Иммуноэлектронная микроскопия штаммов Yersinia pestis, отличающихся по способности образовывать капсулу. // Там же. - С. 99.

11. Саяпина J1.B., Анисимова Т.Н., Малахаева А.Н., Адамова Г.В., Касина И.В., Тучков И.В., Майоров Н.В., Гаранина С.Б., Давыдова H.A., Шведун Г.П., Грачева И.В., Ливанова Л.Ф., Куличенко А.Н., Шарова И.Н. Новые тест-системы для индикации возбудителей Y. pestis и V. cholerae методом полимеразной цепной реакции // Там же. - С. 135.

12. Анисимов А.П., Малахаева А.Н., Черновская Т.В., Руденко Е.Г., Васильев A.M., Хлебников B.C., Абрамов В.М., Завьялов В.П. Капсулообразование у Fl" и Fl* штаммов возбудителя чумы. // Эрдем шинжилгээний бутээл (Байгалийн голомтот халдварт бвчнийг эсэргууцэн судлах т9в). Улаанбаатар, 1999. - Дугаар 7. - С. 169-171.

13. Байбурин В.П. Коннов Н.П. Малахаева А.Н., Красникова И.В., Волков Ю.П. Универсальный комплекс сканирующей световой микроскопии ближнего поля. // XI Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. РЭМ,99. - Черноголовка, 1999. - С.7.

14. Anisimova T.I., Sayapina L.V., Malahaeva A.N., Kasina I.V., Adamova G.V., Garanina S.V., Mayorov N.V., Tuchcov I.V., Kulichenco A.N., Darmov I.V., Vorobyov A.A., Shvedun G.P., Anisimov A.P., Sergeeva G.M., Plotnicov O.P. New test-system for detection Yersinia pestis by polimerase chein reaction // Chinese J. of Control of Endemie Disease, 1999. - V. 14. - P. 34-35.

15. Величко Л.Н., Князева Т.В., Анисимов А.П., Назарова Л.С., Мокроусова Т.В., Кокушкин A.M., Белобородов P.A., Еремин С.А., Малахаева А.Н., Ежов И.Н., Дроздов И.Г., Попов Ю.А. К вопросу о влиянии продуктов плазмиды pFra Yersinia pestis на трансмиссивный и алиментарный пути передачи чумы // Проблемы особо опасных инфекций - Саратов, 2000. - С. 127-133.

16. Малахаева А.Н., Анисимов А.П., Коннов Н.П. Состав капсулы клеток чумного микроба по данным иммуноэлектронной микроскопии. // XVIII Российская

конференция по электронной микроскопии ЭМ.2000 5 июня - 8 июля 2000 г. Черноголовка, 2000. - С.263.

17. Саяпина JI.B., Анисимова Т.И., Адамова Г.В., Касина И.В., Малахаева А.Н., Куличенко А.Н., Майоров Н.В., Тучков И.В., Гаранина С.Б., Шарова И.Н., Давыдова Н.А., ДентоЬская С.В., Плотников О.П., Шведун Г.П., Грачева И.В., Ливанова Л.Ф., Гусева И.В. Определение эффективности новых диагностических тест-систем для индикации возбудителей особо опасных инфекций методом ПЦР // Генная диагностика особо опасных инфекций. Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции (21-22 ноября 2000 г.), Саратов, 2000. - С. 11-14.

18. Anisimov A., Malahaeva A., Konnov N.. Antonova О., Dyatlov I., Chemovskaya Т., Rudenco E., Vasil'ev A., Khlebnicov V., Abramov V. Non-capsulate strains of Yersinia pestis: reality or myth. // Program and abstract of the 3rd international conference on emerging zoonoses (Noordwijkerhout, Holland, October 10-14, 2001). - Centers for Disease Control and Prevention, USA, 2001. - P. 57.