Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка стафило-протейно-синегнойной вакцины и изучение ее свойств

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка стафило-протейно-синегнойной вакцины и изучение ее свойств"

и1 ; ол

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности РФ УфимскМ научно-йСследовательский институт вакцин и сывороток

им.И.И.Мечникова Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат"

На правах рукописи

Кунягина Ольга Владимировна

РАЗРАБОТКА СТАФИЛО-ПРОТЕЙНО-СИНЕГНОЙНОЙ ВАКЦИНЫ И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ СВОЙСТВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа 1996

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском .институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат".

Научный руководитель - доктор медицинских наук Н.А.Михайлова

Официальные оппоиешы: член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ ЛЯ.Эберт,

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РБ Е.В.Бобкова

Ведущая организация: Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича МЗ РФ

Защита диссертации состоится " & " и-ЮХ9, 1996 г. в_ 14 ч. на заседании диссертационного совета при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат" по адресу: 450024, г.Уфа, ул.Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат".

Автореферат разослан " & " ИЮКЯ- 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук В.П.Головин

© ГП НПО "Иммунопрепарат", 1996

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы значительно возросло количество гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами. Летальность при различных нозологических формах составляет от 3 до 60 %, достигая при генерализации инфекционного процесса уровня доантибиоти-ческого периода (С.В.Прозоровский, Л.А.Генчиков, 1984; М.И.Кузин, В.М.Костюченок, 1990; D.A.Whitelaw et al., 1992).

Ежегодно в России и странах СНГ регистрируется около 5 млн. больных с гнойно-воспалительными заболеваниями (А.А.Воробьев и др., 1996). Известно, что годовой экономический ущерб от госпитальных инфекций в странах с развитой медициной (Англии, США) составляет 2,4-10 млрд. долларов (P.S.Brachman, 1981; Р.П.Венцел, 1990), а присоединение гнойно-септических осложнений в процессе пребывания больных в стационаре в 2 раза увеличивает стоимость лечения одного больного (М.Л.Лившиц, Е.Б.Брусина, 1992).

Развитию инфекций способствуют, с одной стороны, формирование и широкое распространение штаммов возбудителей, отличающихся высокой резистентностью к различным антибактериальным препаратам, в том числе, к антибиотикам (И.А.Верещагин и др., 1995; С.В.Сидоренко, 1995; R.Meyer, 1994); с другой стороны, снижение естественного иммунитета макроорганизма в результате травм, ожогов, родов, хирургических операций, диагностических манипуляций, экологического неблагополучия.

В этиологической структуре гнойно-септических заболеваний значительное место занимают стафилококк, протей, синегнойная палочка, выделяемые из патологического материала в виде монокультур, но особенно часто в ассоциации друг с другом (М.И.Кузин, В.М.Костюченок, 1990; М.А.Галёев, Т.И.Мустафин, 1993; А.Б.Бакиров, З.Г.Габидуллин, 1995; А.З.Смолянская и др., 1995; М.С.Farinas et al., 1995; E.Ritter et al., 1995).

В связи с этим для профилактики и лечения инфекций, вызываемых условно патогенными бактериями, остаются актуальными не только разработки новых химиотерапевтических средств, но и препаратов, стимулирующих специфический иммунитет (Л.А.Левина и др., 1983; Н.Б.Егорова и др., 1988; А.Ф.Мороз и др., 1988).

Для профилактики гнойно-воспалительных заболеваний и внут-рибольничных инфекций в практике здравоохранения используют-

ся специфические моновакцины: стафилококковый анатоксин (В.В.Смирнов, А.Е.Вершигора, 1988); цитоплазматический антиген стафилококка (В.Я.Прохоров и др., 1988); стафилококковая вакцина (Н.Б.Егорова и др., 1991); вакцина протейная из антигенов сухая (Л.С.Крейнин и др., 1985; К.Г.Каверина, 1990); поливалентная химическая протейная вакцина (Ю.М.Грабарь, 1989); синегнойная поливалентная корпускулярная убитая вакцина (А.Ф.Мороз, 1986); пиоиммуноген (Е.С.Станиславский и др., 1983); псевдомонас-вак-цина (Т.А.Макаренко, 1994); анатоксин синегнойной палочки (Н.А.Михайлова и др., 1993, 1995).

Поскольку гнойно-воспалительные заболевания характеризуются полиэтиологичностыо и возможной сменой возбудителя, в нашей стране и за рубежом ведутся исследования по получению ассоциированных препаратов из условно патогенных бактерий. Анализ данных литературы по ассоциированной и комплексной иммунизации с использованием анатоксинов и бактерийных препаратов свидетельствует, что применение их позволяет значительно сократить время на создание полноценной защиты одновременно к нескольким возбудителям (Е.С.Станиславский и др., 1981; В.А.Ко-четкова и др., 1982; Р.Л.Московцева и др., 1987; D.Wasserman, 1980).

В последние годы разработаны и успешно применяются в клинике для терапии воспалительных заболеваний органов дыхания ассоциированные вакцины, полученные из микробных клеток и антигенов условно патогенных бактерий: бронховаксом, респивакс, бронхомунал, бесклеточная поликомпонентная вакцина ЦНИИВС им.И.И.Мечникова (Н.Б.Егорова и др., 1983, 1991; Г.Л.Осипова, 1993; A.Basacopol et al., 1986; A.G.Palma-Carlos, M.L.Palma-Carlos, 1990). Однако препараты для вакцинопрофилактики смешанных форм гнойных инфекций не созданы.

Цель работы. Разработка ассоциированной вакцины на основе протективных антигенов, наиболее часто встречающихся в клинике возбудителей (стафилококк, протей, синегнойная палочка), и изучение профилактической эффективности препарата.

Задачи исследования:

- подобрать состав вакцины и изучить взаимодействие антигенов в ней;

- изучить в эксперименте иммунобиологические свойства препарата (протективную активность, сенсибилизирующие свойства, токсичность);

- изучить безвредность, реактогенность и антигенную активность ассоциированной вакцины на людях.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые сконструирована новая стафило-протейно-синегнойная вакцина адсорбированная жидкая (СПСА-вакцина), представляющая собой комплекс сорбированных на гидроокиси алюминия очищенных концентрированных анатоксинов стафилококка, синегной-ной палочки, цитоплазматического антигена стафилококка и протейной химической вакцины. Обосновано профилактическое назначение препарата против инфекций, обусловленных условно патогенными микроорганизмами.

На основе математического моделирования определены оптимально сбалансированные дозы монокомпонентов.

Выявлена стимуляция иммуногашой активности стафилококкового анатоксина протейными антигенами и анатоксином синегной-ной палочки.

Установлена высокая иммуногенная активность, безвредность, низкие сенсибилизирующие свойства препарата в экспериментах на животных, отработаны методы контроля его специфической активности и безвредности.

При испытаниях на людях препарат оказался иммунологически безопасным, хорошо переносимым, проявил высокую специфическую активность.

Новизна проведенных исследований подтверждена патентом РФ № 2035189 «Способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно патогенными бактериями», зарегистрированным 20.05.95 г.

Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на препараты:

1. Диагностикум эритроцитарный синегнойный антигенный сухой (ВФС 42-361ВС-92 и ЭПР № 405-92). Инструкция по применению утверждена Минздравом РФ (1992).

2. Ассоциированная стафило-протейно-синегнойная вакцина (ВФС и ЭПР № 537-95).

Работа выполнена в рамках Союзной программы С-23 «Разработать и внедрить в практику здравоохранения эффективные меры борьбы и профилактики внутрибольничных инфекций и сепсиса».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на республиканской конференции «Иммунобиологические препараты» (Уфа, 1983); республиканской конференции «Иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний» (Уфа, 1985); 1-ой Всесоюзной конференции «Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза» (Москва, 1985); научной конференции «Научно-производственные проблемы улучшения качества вакцинно-сывороточ-ных препаратов» (Ташкент, 1986); республиканской научной конференции «Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепа-ратов» (Уфа, 1988); Всероссийском семинаре-выставке диагностических, профилактических и лечебных иммуно-биологических препаратов, производящихся в НПО и предприятиях концерна «Им-муноген» (Уфа, 1992); научно-практической конференции, посвященной 25-летию со дня основания НИИ военной медицины МО РФ «Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил» (Санкт-Петербург, 1994); международном симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова НПО «Иммунопрепарат» (Уфа, 1995).

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц, 6 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 207 источников (138 отечественных и 69 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Материалом для исследований явились лабораторные и экспериментально-производственные серии стафило-протейно-синегной-ной (СПСА) вакцины, сыворотки крови экспериментальных животных и доноров-добровольцев, иммунизированных СПСА-вакци-ной.

Для получения CITCA-вакцины использовали:

- анатоксин синегнойной палочки (ВФС 42-360ВС-92, ЭПР № 404-92), полученный путем обезвреживания экзотоксина А формалином и теплом с последующей очисткой с помощью ультрафильтрации, содержащий антигены экзотоксина А, слизи и протеазы;

- вакцину протейную поливалентную химическую, представляющую собой смесь белково-полисахаридных антигенных комплексов 6 штаммов Pr. mirabilis, полученную ограниченным протеолизом микробной массы с последующей очисткой ультрафильтрацией, осаждением этанолом, лиофильным высушиванием и растворением в равных соотношениях;

- цитоплазматический антиген стафилококка (ЦПА), представляющий собой белково-липополисахаридный комплекс, выделенный из цитоплазмы стафилококка путем дезинтеграции микробной массы двухкратным соляпокислотным осаждением с последующим ферментативным гидролизом;

- анатоксин стафилококковый очищенный, полученный по ФС 42-227ВС-88 в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

В работе использовали 9 штаммов Staphylococcus aureus, 16 штаммов Proteus mirabilis, 21 штамм Pseudomonas aeruginosa, типичные по культуральным и биохимическим свойствам. Из них вакцинными штаммами явились: St.aureus Б-243, 0-15; Pr.mirabilis № 6, 8, 40, 508, 1115, 4641; Ps.aeruginosa PA-7.

Экспериментальные животные: аутобредные мыши, массой 14-20 г; морские свинки, массой 250-300 г; кролики породы «Шиншилла», массой 2-2,5 кг, полученные из питомника лабораторных животных НПО «Иммунопрепарат». Все работы с животными проводились в соответствии с правилами, изложенными в Приказе Минздрава СССР № 775 от 12.08.77 г.

При проведении исследований использовано 25000 белых мышей, 1400 морских свинок, 40 кроликов.

Методы исследований

Протективную активность препаратов оценивали в тесте активной защиты мышей. Опыты проводили по двум схемам: титрование заражающей дозы культуры на иммунизированных (опыт) и неиммунизированных (контроль) животных с определением ЛД50 и индексов эффективности, а также титрование иммунизирующей дозы компонентов ассоциаций и моновакцин с определением ЕД50. В ряде экспериментов протективную активность изучали по про-

центу выживаемости иммунизированных животных при заражении их 3-4 ЛД50 культуры Pr.mirabilis и Ps.aeruginosa и 2-2,5 ЛД50 культуры St.aureus.

Каждый опыт сопровождали постановкой контроля вирулентности заражающего штамма на неиммунизированных животных той же партии. Гибель опытных и контрольных мышей учитывали в течение 4 суток.

Антигенную активность СПСА-вакцины оценивали путем определения специфических антител в сыворотках крови в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с помощью эритроцитарных диагностикумов: стафилококкового (Н.А.Михайлова, 1982), протейного (Ю.М.Грабарь и др., 1980, 1984), синегнойного.

Синегнойный диагностикум получали сенсибилизацией с помощью 0,5 % раствора хлорного хрома, формалинизированных по методу R.Weinbax (1958) эритроцитов овец, очищенным концентрированным анатоксином синегнойной палочки. Его сенсибилизирующая доза составляла 2-5 мг на 1 мл 20 % эритроцитов.

Оптимизацию дозового состава ассоциированного препарата осуществляли методом многофакторного математического анализа по Г.И.Разоренову (1979). Иммуногенную активность 108 различных вариантов препарата изучали в опытах на морских свинках, иммунизированных однократно подкожно. Эффективность вакцинации определяли по нарастанию титров антител.

Уровень анти-альфа-токсина определяли по Г.В.Выгодчикову (1963) в реакции задержки гемолиза кроличьих эритроцитов. Определение соотношения Т- и В-лимфоцитов в периферической крови осуществляли в реакциях розеткообразования.

Лимфоциты выделяли по A.Boyum (1968), использовали Ficoll-Paque шведской фирмы «Pharmacia».

Т-лимфоциты идентифицировали в реакции спонтанного розеткообразования по M.Jondal et al. (1972).

В-лимфоциты определяли в реакции комплементзависимого (ЕАС-) розеткообразования по С.Bianco et al. (1970).

Количественное определение содержания иммуноглобулинов А, G, M классов осуществляли в реакции радиальной иммунодиффу-зии по G. Mancini et al. (1965).

Превентивные свойства иммунных сывороток изучали в тесте пассивной защиты белых мышей. Животным внутрибрюшинно вводили цельную и разведенную 0,9 %-ным раствором натрия хло-

рида сыворотку в дозах от 0,5 до 0,0156 мл в объеме 0,5 мл. Через 2 часа мышей заражали внутрибрюшшшо 2-2,5 ЛД50 культуры стафилококка и протея, 4-6 ЛД50 культуры синегиойной палочки. Наблюдение осуществляли в течение 4 суток с последующим вычислением РД50 сыворотки.

Специфическую безвредность вакцины определяли при подкожном введении морским свинкам, регистрируя изменения общего состояния животных, веса и реакции на месте инъекции в течение 21 суток.

Острую и хроническую токсичность оптимизированного варианта ассоциированной вакцины изучали на двух видах животных (мыши и крысы) путем морфологического исследования внутрен-•них органов и кожи на месте инъекции. Исследование проведено в отделе токсикологии Уфимского НИИ медицины труда и экологии человека под руководством профессора Г.З.Бахтизиной.

Определение стерильности, белка по Лоури, формальдегида, гидроокиси алюминия, концентрации водородных ионов, токсичности проводили по методам, изложенным в Приказе Минздрава СССР № 31 от 13.01.81 г., ФС 42-344ВС-90.

Апробацию препарата на добровольцах проводили в соответствии с Программой испытания безопасности, реактогенности и антигенной активности вакцины стафило-протейно-синегнойной адсорбированной жидкой, утвержденной Комитетом МИБП 27.12.90 г.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали общепринятые методы (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка ассоциированной стафило-протейно-сннепюйной вакцины (СПСА-вакцины)

Исследования по разработке ассоциированной вакцины начаты с подбора состава препарата и доз моновакцин. Первоначально в качестве компонентов использовали стафилококковый анатоксин, анатоксин синегнойной палочки и протейную химическую вакцину.

Проведено сравнительное исследование протективной активности монопрепаратов и различных вариантов тривакцин, в которых менялось содержание только одного ингредиента, а дозы дру-

гих соответствовали дозам моновакцин, предложенным авторами: стафилококкового анатоксина -5 ЕС, анатоксина синегнойной палочки - 15 мкг, протейной химической вакцины - 50 мкг.

Результаты экспериментов свидетельствовали о выраженной протективной активности полученных препаратов в тесте активной защиты мышей.

Эффективность протейных антигенов в интервале доз от 12,5 до 100 мкг в составе тривакцин оказалась равной дозе 50 мкг монопрепарата протейной вакцины при заражении культурой штамма Pr.mirabilis № 6. Препараты в одинаковой степени защищали 96-100 % животных от 2-2,5 ЛД50 и 60-80 % - от 6-7 ЛД5о культуры протея.

Стафилококковый анатоксин, как компонент комплекса, в дозах от 1,25 до 10 ЕС обеспечивал выживаемость 70-82 % опытных мышей при инфицировании 2-2,5 ЛД50 культуры штамма St.aureus 0-15. Уровень защиты животных, иммунизированных монопрепаратом стафилококкового анатоксина (5 ЕС), оказался ниже и составил 53,6 % (Р<0,05).

Синегнойный анатоксин в составе ассоциации в интервале доз от 3,7 до 100 мкг, так же как монопрепарат анатоксина в дозе 15 мкг, обладал выраженной протективной активностью в отношении 2-8 ЛД50 культуры штамма Ps.aeruginosa РА-7. Препараты защищали 100 % животных от 2 ЛДзо и 65-75 % - от 8 ЛД50.

Полученные данные свидетельствовали о возможности совместного применения протейной химической вакцины, стафилококкового анатоксина и анатоксина синегнойной палочки, поскольку протективная активность комплексов антигенов не снижалась по сравнению с монопрепаратами в отношении вакцинных штаммов протея и синегнойной палочки. В то же время при заражении культурой стафилококка эффективность тривакцин оказалась значимо более высокой чем одного стафилококкового анатоксина (Р<0,01).

В опытах по изучению взаимодействия антигенов в составе 1 ассоциаций при определении ЕД50 монокомпонентов нами получены аналогичные результаты. Выявлено, что протейная химическая вакцина и анатоксин синегнойной палочки оказывали стимулирующее действие на стафилококковый анатоксин. Это выражалось увеличением выживаемости животных и достоверным снижением средней иммунизирующей дозы его в составе стафило-синегнойной и стафило-протейной дивакцин, а также стафило-протейно-сине-гнойной тривакцины по сравнению с монопрепаратом соответственно в 6, 16, 20 раз (табл.1). Полученные данные согласуются с

Таблица 1

Протективные свойства моновакцин и ассоциированных вакцин при заражении культурой стафилококка

N группы Вакцинный препарат Иммунизирующая доза Отношение числа выживших к числу зараженных животных, иммунизированных разными дозами препаратов ЕД50 стафилококкового анатоксина (ЕС) MjHn Достоверность различий

Сравниваемые группы Р

1 доза 0,1 доза 0,01 доза 0,001 доза по всем дозам

абс.

1 Стафилококковый анатоксин 5 ЕС 24/40 23/40 8/40 2/40 57/160 35,6 0,62+0,10 1 и 4 <0,01

2 Протейная вакцина 200 МКГ 0/10 0/10 0/10 0/10 0/40 0 1 и 5 <0,01

3 Синегнойный анатоксин 200 икг 0/10 0/10 0/10 0/10 0/40 0 1 и б 4 и 5 <0,01 >0, 05

4 Стафилококковый анатоксин + протейная вакцина 5 ЕС 200 МКГ 38/40 34/40 20/40 14/40 106/160 66,2 0,038+0,009

5 Стафилококковый анатоксин + синегнойный анатоксин 5 ЕС 200 МКГ 34/40 29/40 16/40 9/40 88/160 55,0 0,101+0,009

6 Стафилококковый анатоксин + протейная вакцина + синегнойный анатоксин 5 ЕС 200 МКГ 200 мкг 38/40 35/40 22/40 16/40 111/160 69,4 0,031+0,005

Примечание. Заражающая доза штамма St. aureus 0-15 составляла 3,5х109 микробных клеток (2-2,2 ЛД50 ).

материалами исследователей, выявивших стимулирующее влияние протейной и синегнойной вакцин на стафилококковый анатоксин (В.А.Юрова, 1987; Р.Л.Московцева, 1988).

Эффективность протейной химической вакцины и синегнойно-го анатоксина не изменялась в зависимости от состава комплексов.

При изучении протективных свойств выявлено, что стафилококковый анатоксин в составе тривакцины защищал 70-100 % белых мышей от воздействия вакцинного штамма О-15 и альфа-токсина. Однако он оказался неэффективен в отношении штамма стафилококка Б-243, относящегося к 3 фагогруппе, поскольку защищал не более 30-40 % животных от 2-2,5 ЛДзо культуры. Полученные нами результаты подтверждают данные А.К.Акатова (1969); А.К.Акатова, К.Р.Толовской (1971) показавших, что стафилококковый анатоксин обеспечивает защиту, в основном, от альфа-токсина и микробов 1, 2, 4 фагогрупп. Эта закономерность сохранилась и в наших экспериментах при совместном использовании стафилококкового анатоксина с протейной вакциной и синег-нойным анатоксином.

Известно, что эффективность стафилококковых вакцинных препаратов можно повысить сочетанием экстрацеллюлярных продуктов с антигенными субстанциями микробной клетки, в частности, цитоплазматическим антигеном стафилококка (ЦПА), обеспечивающим формирование антибактериального иммунитета (А.К.Акатов, К.Р.Толовская, 1969, 1971; Н.А.Михайлова, 1982; В.Я.Прохоров, 1990). Поэтому нам представлялось целесообразным ввести в состав тривакцины ЦПА стафилококка и провести сравнительное изучение протективных свойств ассоциированного препарата в зависимости от состава стафилококкового компонента.

Установлено, что введение в состав комплексной вакцины ЦПА не изменяло ее протективной активности в отношении штамма St.aureus 0-15, но усиливало защитный эффект в отношении штамма Б-243 (табл. 2). Кроме того, приведенные в таблице данные также подтвердили наши результаты о стимуляции иммуно-генной активности стафилококкового анатоксина двумя другими компонентами вакцины.

Таким образом, для расширения спектра противостафилокок-ковой активности в состав ассоциированного препарата наряду с анатоксином был введен цитоплазматический антиген стафилококка.

Таблица 2

Протективная активность СПСА-вакцины в зависимости от состава стафилококкового компонента при заражении St. aureus (штаммы 0-15 и Б-243)

N группы Вакцинный препарат Число выживших животных (числитель) из числа зараженных (знаменатель) различными дозами культуры (хЮ9 микробных клеток) ЛД50 (М+т)х109 микробных клеток (индекс эффективности)

штамм 0-15 штамм Б-243 штамм 0-15 штамм Б-243

16 8 4 2 по всем дозам 8 4 2 1 по всем дозам

1 Тривакцина 0/2 6 17/26 25/26 26/26 68/104 0/28 15/28 24/28 27/28 66/112 8,6+0,3 (4,0) 3,6+0,1 (3,3)

2 Тривакцина+ ЦПА 0/28 19/28 26/28 28/23 73/112 13/28 20/28 27/28 28/28 88/112 8,5+0,6 (4,0) 6,1+0,2 (5,6)

3 Стафилококковый анатоксин 0/28 _ 8/28 23/28 28/28 59/112 1/28 5/28 18/28 28/28 52/112 6,2+0,4 (2,9) 2,4+0,1 (2,2)

4 Стафилококковый анатоксин + ЦПА 0/28 11/28 21/28 28/28 60/112 4/28 14/28 21/28 28/28 67/112 6,4+0,2 (3,0) 3,7+0,1 (3,4)

5 Контроль штамма 0/24 3/24 16/24 20/24 39/112 0/26 0/26 5/26 11/26 16/104 2,1+0,1 1,1+0,1

Статистический анализ

Р < 0,05 Р > 0,05 1 И 3 1 И 2 1 И 4 3 и 4 2 И 3 Р < 0,05 Р < 0,05 Р > 0,05 1 и 2 2 и 4 1и4 1 и 3 3 и 4 2 И 3

В дальнейшем с целью оптимизации дозового состава стафидо-протейно-синегнойной вакцины проведен многофакторный эксперимент в соответствии с методикой, разработанной Г.И.Разореновым (1979). Математический анализ осуществляли путем построения функциональных моделей, связывающих логарифмы доз ингредиентов препарата и времени (от его введения до момента определения титров антител) с величинами титров специфических антител.

Опыты проведены на морских свинках, для иммунизации которых было приготовлено 108 вариантов ассоциированного препарата с варьируемыми величинами компонентов. Дозы моновакцин составляли: синегнойного анатоксина - 3, 15, 75 мкг; протейной вакцины - 5, 25, 125 мкг; стафилококкового анатоксина - 2,5; 5; 10 ЕС; ЦП А - 0,2; 1; 5 мг. Титры специфических антител определяли через две, пять и восемь недель после вакцинации.

В результате проведенного математического анализа полученных данных установлены следующие оптимальные дозы компонентов: анатоксина синегнойного - 37 мкг, протейной вакцины - 61 мкг, стафилококкового анатоксина - 7,9 ЕС, ЦП А - 1,17 мг.

Известно, что использование адъювантов при конструировании различных вакцин и анатоксинов усиливает их иммуногенную активность, поэтому нами осуществлена сорбция ассоциированного препарата на гидроокиси алюминия. О полноте сорбции судили по данным реакции торможения пассивной гемагглютинации и реакции связывания анатоксина по Г.В.Выгодчикову (1963), проводимыми с исходными и сконцентрированными надосадочными жидкостями.

Выявлено, что полная сорбция происходила при использовании гидроокиси алюминия в пересчете на АЬОз в дозе (2,0±0,5) мг/мл. Сорбция усиливала протективное действие вакцины, при этом выживаемость животных достоверно превышала выживаемость мышей, привитых препаратом без адьюванта. Сорбированная вакцина после однократного введения обеспечивала напряженный иммунитет на протяжении 10 недель в отношении штаммов протея и синегнойной палочки и 6-8 недель в отношении стафилококка. В то лее время при инъецировании несорбирован-ной вакцины защитный эффект снижался, начиная с четвертой недели (рис.1).

Двукратная иммунизация сорбированным препаратом с интер-

Заражение Рз.аеп^шова РА-7 (3-4 ЛД50)

2 нд 4нд бнд 8 нд 10 нд

Время (недели)

100

з

,_ о 80 х ° |3 60

о 5

О- ^

Заражение Рг.ггжаЬШэ N6 (3-4 ЛД50) 96 95

-О

т

40 20 0

-9в-

гь

80

80

:48

асорб □ Не сорб

40

2 нд 4нд бнд 8нд 10 нд Время (недели)

Заражение Б1.аигеиз Б-243 (2-2,5 ЛД 50)

100

^ о 80-1 х О

60

.и т

200

80

70

52

□ Сорб

□ Не сорб

50

;40

2 нд 4 нд 6 нд 8 нд 10 нд Время (недели)

Рис. 1 Выживаемость животных (в процентах) при однократном введении двух вариантов стафило-протейно-синегнойной вакцины

40

5

валом в 21 день обеспечивала стабильный высокий уровень защиты против всех возбудителей в течение 10 недель после последней инъекции (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, в дальнейших исследованиях мы использовали сорбированную стафило-протейно-синегнойную вакцину, получившую название «СПСА-вакцина».

2. Экспериментальное изучение иммунобиологических свойств СПСА-вакцины

Изучение свойств вакцины проводили в соответствии с общепринятыми методами контроля медицинских иммунобиологических препаратов.

Одной из основных качественных характеристик является специфическая активность. Установлено, что в тесте активной защиты препарат предохранял от гибели 70-100 % мышей после введения им 3-10 ЛД50 стафилококкового альфа-токсина и 2-3 ЛД50 экзотоксина A Ps.aeruginosa. Индексы эффективности составляли при заражении вакцинными штаммами St.aureus 3,5-5,5; Pr.mirabi-lis 8-12; Ps.aeruginosa 12-15.

Выявлен выраженный протективный эффект вакцины в отношении гомо-и гетерологичных штаммов синегнойной палочки, стафилококка, протея. Она защищала 95,8 % мышей от двух гомологичных штаммов Ps.aeruginosa Oll. сероварианта по Hab' s, 75-100 % - от 13 клинических штаммов и 58-75 %-от 5 музейных штаммов Ps.aeruginosa, основными факторами патогенности которых являлись антигены слизи.

При заражении St.aureus препарат предохранял от гибели 73-100 % животных от 2 вакцинных штаммов и 56-100 % от 7 штаммов стафилококка различных фагогрупп.

При заражении Pr.mirabilis выжило 90-100 % мышей при введении 6 вакцинных штаммов и 60-95 % - при введении 10 гомо- и гетерологичных штаммов.

В работе проведено изучение токсичности и аллергенных свойств СПСА-вакцины. Токсичность определяли в тесте изменения массы тела белых беспородных мышей и морских свинок в соответствии с Приказом Минздрава СССР № 31 от 13.01.83 г. Наблюдавшееся падение массы тела мышей после введения 0,5 и 1,0 мл вакцины восстанавливалось в течение 3-4 дней, и она постепенно увеличивалась в последующий период наблюдения. У морских свинок введение 0,5 и 1,0 мл вакцины не сопровождалось 16

изменением массы, и только увеличение дозы препарата до 5 мл вызывало падение массы в первые сутки опыта, которая нормализовалась через 72-96 часов и в последующем постепенно увеличивалась.

Определение специфической безвредности проводили на морских свинках путем подкожного введения в оба бока 3 мл вакцины. У большинства животных отмечали образование подкожных уплотнений на месте инъекций в виде узелка размерами 5-10 мм. У единичных свинок зарегистрирована потеря до 5 % первоначальной массы, восстанавливающаяся в течение первой недели наблюдения.

Для оценки токсичности проведены морфологические исследования внутренних органов животных (белых мышей и крыс). Характерных патологических изменений, свидетельствующих об острой токсичности препарата не выявлено. При изучении хронической токсичности отмечено формирование единичных небольшого размера гранулем без признаков воспаления на месте введения у двух из десяти белых мышей, которые получали вакцину подкожно в течение 10 дней в объеме 0,1 мл, соответственно максимальной разовой дозе для человека в пересчете на единицу массы тела животного.

Результаты изучения аллергенных свойств СПСА-вакцины в тестах индукции активного анафилактического шока и пассивной кожной анафилаксии, по Z.Ovary (1964), свидетельствовали о ее низкой сенсибилизирующей активности. Слабые аллергенные реакции (почесывание носа, беспокойство, взъерошивание шерсти) выявлены на введение моновакцин в дозах, десятикратно превышающих содержание их в комплексе. В экспериментах, проведенных по методу Z.Ovary, появление окрашенного пятна на месте введения иммунных сывороток в диаметре (8±4) мм зарегистрировано у морских свинок, разрешающие инъекции которым проводили стафилококковым анатоксином.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о низкой токсичности и слабых аллергенных свойствах СПСА-вакцины для организма экспериментальных животных.

Для исследования иммуногенной активности ассоциированной вакцины и выбора оптимальной схемы иммунизации проведено изучение динамики иммунного ответа у кроликов.

В первой серии опытов животных вакцинировали 1,0 мл препарата подкожно двукратно с интервалом между прививками в 4 недели. Введение вакцины не оказывало существенного влияния на количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови. В ответ на иммунизацию наблюдалось достоверное увеличение абсолютного и относительного числа В-розеткообразующих лимфоцитов. Максимальное их количество отмечалось через неделю после второй прививки. Изменения со стороны Т-РОЛ были незначимыми. Выявлено увеличение фагоцитарной активности не-йтрофилов крови по отношению к клеткам вакцинных штаммов.

Установлено достоверное увеличение титров специфических антител, выявляемых в РИГА с синегнойным, протейным, стафилококковым эритроцитарными диагностикумами, а также уровня анти-альфа-стафилолизина (рис.2). По сравнению с исходным фоном уровень антистафилококковых антител возрос в 13 раз, антипротейных-в 9,7 раза, антисинегнойных - в 15,3 раза, содержание стафилококкового антитоксина в среднем составило 4,7 АЕ/мл.

В последующем кроликов иммунизировали по трем схемам, различающимся между собой интервалами введения. Препарат вводили подкожно трехкратно в дозе 0,5 мл по 1 схеме на 0-20-30 дни, по 2 схеме - на 0-10-10 дни, по 3 схеме - на 0-30-60 дни.

Достоверных различий в уровнях антител ко всем компонентам ассоциированной вакцины в зависимости от схемы иммунизации не выявлено. Максимальный прирост титров отмечен после первого введения препарата. После второй прививки происходило дальнейшее статистически значимое увеличение их уровня. После третьего введения вакцины титры антител существенно не изменялись. В результате трехкратной вакцинации по сравнению с фоновыми значениями титр антистафилококковых антител возрос в 19,7-22,6 раза, антипротейных - в 19,6-25,4 раза, антисинегнойных - в 19,9-34,3 раза. Уровень анти-альфа-стафилолизина увеличился в среднем до 5,3-6,2 АЕ/мл.

Следует отметить, что средние значения титров антител оставались без изменения после иммунизации в течение 3-х месяцев (срок наблюдения). Не выявлено достоверно значимых различий в значениях титров антител в зависимости от схемы вакцинации.

Введение мышам иммунных сывороток кроликов позволило нам установить их высокую протективную активность при экспериментальной стафилококковой, протейной, синегнойной инфекциях. Способность сывороток защищать мышей от указанных возбу-

—ЕЗ—Антитела к

стафилококку

-Антителах —X—Антитела к —С—АЕ протею синегнойньй

папочке ,

1

Рис. 2 Динамика титров антител и уровня анти-альфа-сгафилолниша у иммунизированных кроликов

днтелей значительно возрастала после первой вакцинации: средние значения РД50 сывороток уменьшились при заражении St.aureus в 2,4 - 4,6 раза, Pr.mirabilis-в 12,1-19,9 раза, Ps.aeruginosa - в 2,5-4,2 раза. Превентивные свойства сывороток после 2 и 3 прививок значимо не изменялись, хотя прослеживалась тенденция к их увеличению.

Полученные данные о нарастании титров антител после первой и второй прививок, а также их превентивные свойства послужили основой для рекомендации двукратной схемы иммунизации добровольцев. .

Поскольку инфекции, вызываемые условно патогенными бактериями, развиваются у больных со сниженной резистентностью, представляло интерес выяснить, сохраняется ли протективный эффект СПСА-вакцины в условиях экспериментальной иммунодеп-рессии.

Иммунодефицигное состояние вызывали у белых аутобредных мышей введением цихлофосфана в дозе 150 мг/кг веса. Две группы животных иммунизировали однократно 0,5 мл ассоциированной вакцины. После чего животным первой группы через 2 и 4 суток, а второй группы через 7 и 9 суток после вакцинации дважды вводили циклофосфан. Мыши третьей группы получали иммунодеп-рессант однократно за сутки до введения СПСА-вакцины.

Результаты экспериментов показали, что иммунизация значительно повышала устойчивость мышей к стафилококковой, протейной, синегнойной инфекциям. В опытных группах отмечено менее выраженное снижение числа лейкоцитов в периферической крови по сравнению с контролем. Выживаемость животных, инфицированных культурами St.aureus, Pr.mirabilis, Ps.aeruginosa составила 66,7-95,8 %; 58,3-100 %; 75-100 % соответственно (табл.3).

Полученные данные позволяют считать перспективным применение СПСА-вакцины для формирования специфического иммунитета у лиц с угнетенной естественной резистентностью.

После завершения экспериментов по изучению иммунобиологических свойств сконструированной нами стафило-протейно-синег-нойной вакцины адсорбированной жидкой на животных мы приступили к следующему этапу - испытанию препарата на людях.

3. Испытание безопасности, реактогенности и антигенной активности СПСА-вакцины на добровольцах

Серии препарата, отконтролированные в ГИСК им.Л.А.Тара-севича, апробированы на 30 добровольцах в возрасте 19-25 лет. На первом этапе препарат вводили в объеме 0,5 мл в подлопаточную область 20 добровольцам. После изучения у них клинико-ла-бораторных показателей были отобраны 10 человек, которым повторно вводили 0,5 мл вакцины через 30 дней после первой инъекции. В дальнейшем провели изучение влияния вакцины на организм 10 добровольцев при однократном введении в дозе 1,0 мл.

Испытание выявило невысокую реактогенность вакцины. Повышение температуры тела до 37,6 °С зарегистрировано у одного человека после второй прививки, которая нормализовалась через 24 часа без дополнительных лечебных мероприятий. Местные поствакцинальные реакции отмечены у 30 % доноров после первой инъекции, независимо от введенной дозы препарата^ и у 10 % - после второй инъекции. Реакции в большинстве случаев

Таблица 3

Протективное действие СПСА-вакцины при экспериментальной иммунодепрессии

Заражающий штамм Доза заражения (ДД5 о ) Выживаемость в опытных группах животных Выживаемость в контроле

1 2 3

абс. % М+т абс. % М+т абс. % М+т

Ps. aeruginosa

РА-7* 3-4 24/24 100 23/24 95,8+4,1 24/24 100 0

109 3-4 20/24 83,3+7,6 21/24 87,5+6,7 22/24 91,7+5,6 0

185 3-4 21/24 87,5+6,7 22/24 91,7+5,6 21/24 87,5+6,7 0

192 3-4 19/24 79,2+8,5 22/24 91,7+5,6 24/24 100 0

200 3-4 22/24 91,7±5,6 19/24 79,2+8,5 23/24 95,8+4,1 0

1312 3-4 18/24 75,0+8,8 20/24 83,3+7,6 23/24 95,8+4,1 0

St. aureus

0-15* 2-2,5 2 0/24 83,3+7,6 17/24 70,8+9,2 22/24 91,7+5,6 0

Б-243* 2-2,5 19/24 79,2+8,5 22/24 91,7+5,6 23/24 95 ,8 + 4,1 0

1726 2-2,5 22/24 91,7+5,6 17/24 70,8+9,2 20/24 83,3+7,6 0

2778 2-2,5 20/24 83,3+7,6 23/24 95,8+4,1 18/24 75,0+8,8 0

Л-2944 2-2,5 16/24 66,7+9,6 20/24 83,3+7,6 17/24 70,8+9,2 0

Pr. mirabilis

6* 3-3,5 21/24 87,5+6,7 22/24 91V7+5,6 24/24 ,100 0

1115* 3-3,5 23/24 95,8+4,1 24/24 100 22/24 91,7+5,6 0

972 3-3,5 14/24 58,3+10,0 20/24 83,3+7,6 19/24 79,2+8,5 0

1054 3-3,5 18/24 75,0+8,8 22/24 91,7+5,6 17/24 70,8+9,2 0

2501 3-3,5 24/24 100 21/24 87,5+6,7 20/24 83 ,3+7,6 0

Примечание. В числителе - число выживших мышей; в знаменателе - число взятых в опыт мышей; * - вакцинный штамм.

носили слабовыраженный характер (гиперемия диаметром до 2,5 см, болезненность в области введения) и купировались в течение 24-72 часов также без дополнительных лечебных мероприятий.Только у одного человека, получившего 0,5 мл вакцины, отмечено появление инфильтрата размером 3x3,5 см, исчезнувшего самостоятельно.

Результаты клинико-лабораторного обследования не выявили отрицательного влияния вакцинации на функциональную активность костного мозга, печени, почек, сердечно-сосудистой системы. При постановке реакции бласттрансформации с использованием в качестве митогена ФГА отмечена стимуляция лимфоцитов в течение двух недель после Г и 2 введения вакцины: индекс стимуляции клеток (ИСК) увеличивался в 1,8-2,2 раза по сравнению с исходным фоном. При изучении специфической активации лимфоцитов, проведенной с помощью СПСА-вакцины, показатели ИСК после однократного введения препарата увеличивались в 3-4 раза, сохранялись на достигнутом уровне 4-5 недель, затем постепенно снижались, оставаясь выше первоначальных значений в течение 8 недель наблюдения.

Для выявления антигенной активности препарата у доноров определяли титры специфических антител. До иммунизации во всех оттитрованных сыворотках добровольцев присутствовали «естественные» антитела к антигенам условно патогенных бактерий (стафилококк, протей, синегнойная палочка). Исследование титров антител, проведенное в разные сроки после иммунизации, показало существенное их увеличение (табл.4,5). Достигнутые уровни антител сохранялись после иммунизации в течение 3 месяцев (срок наблюдения).

В процессе иммунизации отмечено нарастание уровня иммуноглобулинов класса О. Выявлено увеличение абсолютного и относительного количества В-розеткообразующих лимфоцитов. Число Т-РОЛ практически не изменялось.

Таким образом, полученные результаты испытания СПСА-вакцины на добровольцах свидетельствовали о хорошей переносимости, безопасности, иммуногенной активности препарата и позволили рекомендовать проведение клинических испытаний препарата с целью профилактики гнойно-септических осложнений.

Результаты апробации СПСА-вакцины в клинике не являлись предметом настоящих исследований. Однако испытание, проведен-

Таблица 4

Титры антител в сыворотках крови добровольцев, иммунизированных СПСА-вакциной

Вид антител N группы и время обследования Распределение доноров в зависимости от титров (обратные величины) антител Средняя геометрическая титров антител и ее доверительный интервал при Р=0,05

2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Антисинегнойные 1-ая до иммунизации после I инъекции после 2 инъекции 3 2 3 2 2 2 4 1 6 2 2 5,2(2,9-9,4) 27,9(13,9-55,7) 84,5(49,6-143,8)

П-ая до иммунизации после I инъекции 2 3 5 3 3 4 9,05(6,55-14,81) 68,59(44,45-105,81)

Антипротейные 1-ая до иммунизации после I инъекции после 2 инъекции 1 4 3 1 2 3 1 4 3 2 2 3 1 6,1(3,8-9,8) 26,1(16,3-41,6) 64,0(34,5-118,7)

П-ая до иммунизации после I инъекции 3 4 1 2 5 4 1 4,59(2,62-8,06) 26,0(16,25-41,59)

Антистафилококковые 1-ая до иммунизации после I инъекции после 2 инъекции 5 2 2 1 1 3 1 2 4 4 4 1 7,5(4,3-12,9) 59,7(34,6-103) 181,0(96,5-339,5)

П-ая до иммунизации после I инъекции 3 3 4 7 1 2 17,15(11,11-26,46) 90,51(59,41-137,89)

ы и)

Таблица 5

Распределение доноров, иммунизированных СПСА-вакциной, в зависимости от уровня анти-альфа-стафилолизина

N группы и время обследования Распределение доноров в зависимости от уровня анти-альфа-стафилолизина Средняя геометрическая уровня анти-альфа-стафилолизина и ее доверительный интервал при Р=0,05

0,1 0,5 1,0 1.5 2,0 2,5 3,0 4,0 5,0 6,0

Х-ая фон 1 9 0,46(0,36-0,55)

после 1 инъекции 2 7 1 2,0(1,70-2,29)

после 2 инъекции 1 3 5 1 4,6(3,99-5,20)

П-ая фон 7 3 0,65(0,47-0,82)

после 1 инъекции 5 1 4 2,45(2,09-2,80)

ное клиницистами в НИИ скорой помощи им.Н.В.Склифосовско-го, Республиканской клинической больнице им.Г.Г.Куватова, подтвердило безвредность, слабую реактогашость и антигенную активность препарата, а также показало его профилактическую эффективность. Это позволило рекомендовать СПСА-вакцину для внедрения в практику здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый препарат - стафило-протейно-синегнойная вакцина адсорбированная жидкая (СПСА-вакцина), предназначенный для профилактики гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно патогенными бактериями (стафилококк, протей, синегнойная палочка).

2. Определен состав и установлены оптимально сбалансированные дозы монокомпонентов комплекса, включающего 30 мкг анатоксина синегнойной палочки, 50 мкг протейной химической вакцины, 7 ЕС стафилококкового анатоксина, 1 мг цитоп-лазматического антигена стафилококка.

3. Выявлено адъювантное действие анатоксина синегнойной палочки и протейной химической вакцины на иммуногенную активность стафилококкового анатоксина.

4. Установлено увеличение напряженности и продолжительности иммунитета, создаваемого СПСА-вакциной в результате ее сорбции на гидроокиси алюминия.

5. Выявлен протективный эффект СПСА-вакцины как в отношении гомологичных, так и гетерологичных штаммов St.aureus, Pr.mirabilis, Ps. aeruginosa: однократная иммунизация обеспечивала защиту от 60 до 100 % животиых, инфицированных культурами соответствующих возбудителей. При экспериментальной иммунодепрессии, создаваемой введением циклофос-фана, протективная активность препарата не изменялась.

6. Установлены безвредность, безопасность, слабая реактоген-ность, низкие аллергенные свойства ассоциированной вакцины для организма животных и человека.

7. Выявлено формирование специфического иммунитета при введении СПСА-вакцины животным и донорам-добровольцам, о чем свидетельствовали подъем титра специфических антител ко всем антигенным компонентам препарата, стимуляция фагоцитарной активности нейтрофилов,увеличение числа В-ро-зеткообразующих лимфоцитов и уровня иммуноглобулинов класса G.

8. Результаты выполненных исследований позволили рекомендовать СПСА-вакцину для проведения широких клинических испытаний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАИНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кунягина О.В., Грабарь Ю.М., Михайлова H.A. Экспериментальное изучение иммуногенности стафилококковых компонентов в составе комплексной вакцины против раневых инфекций //Иммунобиологические препараты: Тез. докл. республиканской науч. конф. - Уфа, 1983. - С.8-9.

2. Протективные свойства моно- и ассоциированной вакцин против раневых инфекций в эксперименте /О.В.Кунягина, Ю.М.Грабарь, Ю.А.Шаронов, Г.И.Кремлев, Л.Г.Подгорная, А.А.Шинкаренко //Иммунобиологические препараты: Тез. докл. республиканской науч. конф.- Уфа, 1983. - С.6-7.

3. Кунягина О.В., Грабарь Ю.М., Шаронов Ю.А. Экспериментальное изучение некоторых аспектов протективной активности комплексного препарата против раневых инфекций //Специфическая профилактика и лечение заболеваний, вызванных условно патогенными бактериями: Сборник трудов МНИИВС им.И.И.Мечникова. - М., 1983. - С.114-119.

4. Использование протективных антигенов стафилококка в качестве компонента ассоциированного препарата против условно-патогенных инфекций /Н.А.Михайлова, В.Я.Прохоров, О.В.Кунягина и др. //Актуал. вопросы бактериофагии и прикладной иммунол. - Тбилиси, 1984. - С.46-47.

5. Михайлова H.A., Кунягина О.В. Использование анатоксина синегнойной палочки в качестве компонента комплексной вакцины против инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями //Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза: Тез. докл. 1-ой Всесоюзной конф. - Москва, 1-2 октября 1985. - С.74-75.

6. Кунягина О.В., Михайлова H.A., Мороз А.Ф. Протективная активность моно- и ассоциированных антигенов синегнойной палочки //Иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний: Тез. докл. республиканской науч. конф., посвящ. 80-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова. - Уфа, 1985. - С.26-28.

7. Изучение протективных свойств комплексного препарата против условно-патогенных микробов в эксперименте /Н.А.Михайлова, О.В.Кунягина, В.Я.Прохоров, А.К.Акатов, Н.С.Бро-динова, Г.А.Левдикова, А.Ф.Мороз //Иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний: Тез. докл. республиканской науч. конф., посвящ. 80-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова. - Уфа. 1985. -С.28-30.

8. Изучение токсичности и аллергенных свойств ассоциированной вакцины против условно-патогенных инфекций /Н.А.Михайлова, О.В.Кунягина, В.Я.Прохоров, А.Ф.Мороз, А.К.Акатов //Научно-производственные проблемы улучшения качества вакцшшо-сывороточных препаратов: Сборник научных трудов. - Ташкент, 1986. - С. 107-109.

9. Использование протективных антигенов стафилококка в качестве компонентов ассоциированного препарата против условно патогенных инфекций /Н.А.Михайлова, О.В.Кунягина,

B.Я.Прохоров, А.К.Акатов //Проблемы стафилококковых инфекций: Тез. докладов. - Саратов, 1986.- С.46-47.

10. Специфическая активность препаратов иммуноглобулина человека в отношении некоторых антигенов условно-патогенных бактерий /Н.А.Михайлова, Ю.М.Грабарь, О.В.Кунягина, Г.Б.Кудашева //Вопросы медицинской биотехнологии и имму-нопрепаратов: Тез. докл. республиканской науч. конф. - Уфа, 1988. - С.25-26.

11. Михайлова H.A., Магазов Р.Ш., Кунягина О.В. Оптимизация состава ассоциированной стафило-протейно-синегнойной вакцины //Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: Матер. науч. конф.,посвящ. 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток НПО «Вирион». - 4.2. - Томск, 1991 .-С.82-83.

12.Кунягина О.В., Михайлова H.A., Магазов P.HI. Изучение ре-актогенности, безвредности и антигенной активности стафило-протейно-синегнойной вакцины на добровольцах //Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными средствами, выпускаемыми НПО «Иммуноп-репарат»: Матер, научно-практ. конф,- Уфа, 1993. - С.56-62.

13. Разработка новых эритроцитарных диагностикумов /О.В.Кунягина, А.Ф.Садыкова, Ю.М.Грабарь, Г.П.Глухова, Н.А.Михайлова //Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными средствами, выпускаемыми НПО «Иммунопрепарат»: Матер, научно-практ. конф. - Уфа, 1993. - С.62-67.

14. Вакцинопрофилактика гнойно-воспалительных заболеваний /О.В.Кунягина, Н.А.Михайлова, Р.Ш.Магазов, Л.К.Здановс-кая, А.А.Михайлов //Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил: Тез. докл. научно-практ. конф., посвящ. 25-летию со дня основания НИИ военной медицины МО РФ. - Санкт-Петербург, 1994. -

C.198-199.

15.Стафило-протейно-с.инегнойная вакцина - новый препарат для

профилактики гнойно-септических заболеваний и осложнений /О.В.Кунягина, Н.А.Михайлова, Р.Ш.Магазов, Ю.М.Грабарь, А.А.Михайлов, Л.К.Зданрбская, Г.Н.Бодрова, В.Б.Хватов. //Роль. иммунобиологических препаратов в современной медицине: Матер, международного сими., посвящ. 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова НПО «Иммунопрепарат». - 4.1. - Уфа, 1995. - С.131-138.

16. Иммунокоррекция у больных приобретенными пороками сердца поликомпонентной стафило-протейно-синегнойной вакциной /Н.Г.Гатауллин, Н.А.Михайлова, Н.Г.Сибагатуллин, Р.П.Козленко, Р.Ш.Магазов, О.В.Кунягина //Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Матер, международного симп., посвящ. 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова НПО «Иммунопрепарат».- 4.2. - Уфа, 1995. - С.38-40.