Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях

Игнатова, Ольга Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях"

На правах рукописи

— JjfMwt-w

ИГНАТОВА Ольга Михайловна

Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях

03.02.03 - микробиология 14.03.39- клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 п irrf

201Q

Москва-2010

004616221

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Ирина Мироновна Грубер

доктор медицинских наук Нэлли Кимовна Ахматова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Алла Петровна Батуро

доктор медицинских наук, профессор Олег Витальевич Калюжин

Ведущая организация: Первый Московский Государственный

медицинский университет имени И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится «23» декабря 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «/У» 2010г.

Учёный секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Стафилококковая инфекция является одной из важнейших проблем медицинской практики. Staphylococcus aureus вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации от легких до генерализованных форм [А.В. Дехнич с соавт, 2008; К. Iwatsuki et al., 2006]. Факторами, определяющими трудности терапии данной патологии, является множественная лекарственная устойчивость возбудителя, хронический характер болезни, а также возникновение заболеваний на фоне снижения резистентности организма к инфекции [В.Н. Ефремова с соавт, 1998; Е.Н. Волкова с соавт, 2004].

Известен целый ряд комплексных вакцин (Бронхо-ваксом®, ИРС-19% Имудон®, стафило-протейно-синегнойная, Иммуновак-ВП-4®), в состав которых входят антигены стафилококка, и монопрепаратов (Анатоксин стафилококковый очищенный®, Анатоксин стафилококквый адсорбированный®, Антифагин®), обладающих антигенспецифическим, и иммуномодулирующим эффектом. В НИИВС им.И.И. Мечникова разработана и внедрена в производство (на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗСР РФ) поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4®. Важным компонентом этой вакцины являются стафилококковые антигены, которые составляют основу противостафилококкового монопрепарата «Стафиловак» (разрешен к применению в практике здравоохранения, приказ МЗ РФ №144/53 от 10 апреля 1996г). Антигены выделены из клеточных стенок 4-х

штаммов S. aureus (№№5,9,1986,1991), отобранных ранее из 16 штаммов на основе изучения перекрёстной протективной активности [Л.И. Корзая, 1982; В.Н. Ефремова с соавт, 1998;]. Клинические исследования, проведенные на разных базах, показали, что включение данной вакцины в комплексную терапию хронической стафилококковой инфекции, оказывает длительный терапевтический эффект [С.А. Масюкова с соавт.,1993; Е.В. Сорокина, 2006].

Борисова с соавт., 2008; R. Preston et al., 1998; P. Cassiday et al., 2000; S. Gandon et al., 2003]. В связи с развитием вакцинологии в направлении создания новых препаратов генетическая характеристика производственных штаммов, с учётом их факторов патогенности, приобретает особый интерес [В.М. Бондаренко, 1997, 2001; А.Л. Гинцбург с соавт., 1999; С.Ю. Комбарова, 2007]. Это явилось предпосылкой для изучения молекулярно-генетических свойств используемых вакцинных штаммов S. aureus, в частности, определение гена, кодирующего синтез белка А, являющегося одним из факторов патогенности и суперантигеном для В-лимфоцитов, вызывающим их поликлональную активацию, что может привести к подавлению иммунного ответа [P.M. Хаитов с соавт, 2010].

При изготовлении вакцин Иммуновак-ВП-4® и «Стафиловак» до настоящего времени штаммы стафилококка выращивали на плотной питательной среде. Этот процесс трудоемкий, нетехнологичный и малопроизводительный. Использование реакторного культивирования в жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом микрофильтрации устраняет эти недостатки. Так как стафилококковый компонент является довольно лабильным, возникает необходимость определения возможного влияния технологических изменений на свойства антигенных препаратов, приготовленных из культур, выращенных при периодическом реакторном культивировании. Кроме того, если для препарата Иммуновак-ВП-4® на молекулярно-клеточном уровне изучено действие на систему врождённого и адаптивного иммунитета [Н.К. Ахматова, 2006; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008], то в отношении стафилококкового компонента таких данных нет.

Цель исследования:

Получение антигенных препаратов из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых на плотных питательных средах и в реакторе, их характеристика (химическая, физико-химическая, иммунохимическая) и изучение влияния на эффекторы врождённого и адаптивного иммунитета.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать вакцинные штаммы S. aureus по наличию в них гена, ответственного за синтез протеина А.

2. Изучить накопление биомассы вакцинных штаммов S. aureus при выращивании в различных питательных средах.

3. Провести исследование антигенных препаратов, полученных при разных способах выращивания S. aureus (при реакторном культивировании в сравнении с выращиванием на плотной среде) по химическим, физико-химическим, иммунохимическим свойствам и специфической активности.

4. Исследовать влияние антигенных препаратов S. aureus на эффекторы врожденного иммунитета (дендритные клетки, натуральные киллеры, макрофаги).

5. Изучить действие антигенных препаратов на систему адаптивного иммунитета (продукция специфических антител, протективная активность).

Научная новизна работы

Впервые исследованы вакцинные штаммы S. aureus (№№ 5, 9, 1986, 1991) на наличие spa гена, ответственного за синтез протеина А, и установлено его присутствие только в штамме №5. Наиболее иммуногенные вакцинные штаммы №№ 1986 и 1991 обладали внутривидовой антигенной активностью: способствовали образованию в сыворотках иммунизированных мышей высокого уровня IgG-антител.

Антигенные препараты, полученные из культур, выращенных в условиях периодического реакторного культивирования и на плотной среде, обладали сопоставимой специфической антигенной активностью, включали полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами S. aureus Wood-46.

Показано, что антигенные препараты, полученные из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых разными методами (при периодическом реакторном выращивании и на плотных средах):

- стимулируют созревание дендритных клеток,

- индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей (МЛ) и периферической крови доноров (МЛПК),

- индуцируют экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов,

- усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей,

- стимулируют экспрессию TLR2 и взаимодействуют с ним in vitro,

- стимулируют выработку специфических антител;

- увеличивают численность Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), В-лимфоцитов (CD 19), T-reg лимфоцитов (CD4/CD25/FoxP3);

- способствуют формированию протективной активности против стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Обоснована возможность применения способа периодического реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus при получении антигенных препаратов для профилактики стафилококковой инфекции. Результаты использованы при разработке производственной технологии реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus и выделения антигенных препаратов стафилококка, входящих в состав Иммуновак-ВП-4®.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди исследованных вакцинных штаммов S. aureus, только штамм №5 содержит spa ген, ответственный за синтез фактора патогенности — протеина А. Наиболее иммуногенные штаммы (№№ 1986 и 1991) не содержат этот ген.

2. Антигенный препарат, полученный из биомассы вакцинных штаммов S. aureus, выращенных при периодическом реакторном культивировании, по сравнению с препаратом из культур с плотной среды, содержит больше белка и полипептидных компонентов, меньше углеводов.

Препараты сопоставимы по специфической антигенной активности, включают полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами стафилококковых препаратов сравнения.

3. Стафилококковые антигенные препараты активируют систему врожденного иммунитета: стимулируют созревание дендритных клеток, индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей и периферической крови доноров, усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей, стимулируют экспрессию TLR2 на мононуклеарных лейкоцитах и дендритных клетках, взаимодействуют с TLR2 (на модели эмбриональных клеток почки человека), усиливают экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов.

4. Установлена способность стафилококковых препаратов активировать адаптивный иммунитет с индукцией высокого уровня IgG-антител и повышением численности активированных Т и В лимфоцитов.

Дендритные клетки, созревшие под влиянием антигенных препаратов, приобретали способность представлять антиген Т лимфоцитам и защищать мышей от стафилококковой инфекции. На примере препарата, полученного при реакторном культивировании, показана протективная активность в отношении стафилококковой инфекции у мышей.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертационной работы доложены на: Объединённом иммунологическом форуме, (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной

системы», (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых учёных и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2008).

Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2010 г на совместной конференции отделов микробиологии и иммунологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 6 - статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 153 источника, из которых 68 отечественных работ.

Работа изложена на страницах машинописного текста,

иллюстрирована 25 рисунками и 27 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы микроорганизмов. В работе использовано 7 штаммов S. aureus: 4 вакцинных штамма (№№ 5,9, 1986, 1991) и штамм № 6, отобранные ранее по показателям широкой внутривидовой перекрёстной протективной активности из 16 штаммов (11 производственных и 5 выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями) [Л.И. Корзая, 1982]; 2 тест-штамма, получены из коллекции музея ФГУН НИИЭМ им. Пастера (Cowan 1 №№ 21/2 и 21/4, содержащие в клеточной стенке белок А).

Экспериментальные животные. Использованы мыши линий СВА, С57В1/6, BALB/c и беспородные, весом 12-14 и 16-18г (самцы), полученные из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка», содержащиеся в условиях вивария НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Питательные среды. Штаммы выращивали в жидких (полноценной и полусинтетических) питательных средах и на плотной среде. Изучение

накопления биомассы в динамике роста проведено в вариантах сред (табл. 1) из которых №№ 1 и 1а - полноценные среды, включающие панкреатический гидролизат казеина (ПГК) (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск) и дрожжевой экстракт (ДЭ) («Экстракт дрожжевой растворимый», «Биотехновация», Москва). Остальные варианты - полусинтетические среды, в которых к солевой основе - синтетической среде Ледерберга [J. Lederberg, 1950], добавлены глюкоза (ГЛ), дрожжевой экстракт (ДЭ) и аминопептид (АП) («Аминопептид», ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург).

Таблица 1. Состав питательных сред

Добавки Среды

Полноценные | Полу синтетические (основа-среда Ледерберга)

Плотная Жидкие

1а* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ПГК, г/л 40 40 - - - - - - - - -

ГЛ, г/л 2,0 2,0 2,0 5,0 2,0 5,0 2,0 5,0 2,0 5,0 5,0

ДЭ, г/л 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 3,0 3,0 3,0

АП, мл/л - - - - 50,0 50,0 100,0 100,0 50,0 50,0 100,0

*3 % агаровая среда

Выявление spa гена, ответственного за синтез протеина А.

Исследование проведено совместно с д.м.н. О.Ю. Борисовой (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) с использованием нового LAMP-метода, разработанного в Японии [Т. Notomi et al., 2000]. Loopmediated isothermal amplification (LAMP) - «петлеопосредованная» изотермальная амплификация, основана на свойстве полимеразы, лишенной эндонуклеазной активности, синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя цепь с внесенным однонитевым разрывом. Для выделения хромосомной ДНК использовали стандартный метод кипячения. Исследование проведено на основании протокола амплификации, разработанного [Y. Misawa et al., 2007]. В экспериментах использованы: адаптированный состав реакционного буфера, SsZ-полимераза и 5 праймеров. Амплификацию выполняли на термоциклере РТС-100 Peltier Effect Cycling, Mj Research Inc (США) в изотермальном режиме: 63 °С - 120 мин и 80 °С - 5 мин. Результаты выявляли в электрофорезе в 2 % агарозном геле при напряжении 160 V, с последующей визуализацией ампликонов в ультрафиолетовом свете.

Способы культивирования. Выращивание S. aureus проводили различными методами:

С использованием планшетного фотометра Multiskan-Ascent: в 96-луночном планшете через 18 часов оценивали накопление биомассы по приращению оптической плотности в опытных ячейках по сравнению с контролем (без культуры).

Реакторное культивирование проводили в ферментере АНКУМ-2М (Россия) с рабочим объёмом 10 л до конца фазы экспоненциального роста. Микробные клетки отделяли микрофильтрацией (через полисульфоновые мембраны УПМ-20 «Владипор», Россия), отмывали от среды и смывали их с мембраны обратным током 1 л стерильной дистиллированной воды.

Выращивание на плотной (агаровой) питательной среде на матрацах 4-х вакцинных штаммов проводили в соответствии с [ПУР № 04863057-80-10].

Получение антигенных препаратов. Микробную взвесь инактивировали ацетоном, клетки отделяли центрифугированием и полученный осадок высушивали при 7 ± 2 °С до получения рассыпчатого порошка («ацетоновый порошок» или «ацетоновые тела»).

Антигенные препараты получали методом водной экстракции «ацетоновых тел» с последующим отделением надосадочной жидкости путём центрифугирования (в дальнейшем изложении называемые «водные экстракты»). Из водных экстрактов после внесения стабилизирующих добавок (желатин и аскорбиновая кислота) были приготовлены лиофилизированные антигенные препараты, использованные в ряде экспериментов.

Химический и физико-химический анализ препаратов антигенов. Содержание белка, углеводов, нуклеиновых кислот определяли с использованием традиционных методов исследования [О.Н. Lowry et al, 1951; М. Dubois et al, 1956; K.H. Wong et al., 1977].

Хромато-масс-спектрометрический анализ (выполнен совместно с д.х.н., проф. Ю.А. Книрелем, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН): для определения моносахаридного состава предварительно гидролизованные ЗМ трифторуксусной кислотой (120 °С, 3 ч) антигенные

препараты наносили на колонку с анионообменной смолой Dowex АХ8 в 0,5 M натрий-боратном буфере (рН 8,0) и хроматографировали при 70 °С, используя углеводный анализатор Biotronik LC-2000 (Германия). Содержание отдельных моносахаридов оценивали по площади пиков на хроматограммах и выражали в виде отношения к площади пика галактозамина, принятого за единицу.

Вертикальный SDS электрофорез белковых компонентов проводили в полиакриламидном геле по [JI.A. Остерман, 1981; U.K. Laemmli, 1970], гели окрашивали с помощью серебряного реактива или раствора Coomassie brilliant blue R-250.

Иммунохшшческий анализ антигенных препаратов.

Препараты сравнения1: клеточные стенки (КС), полученные ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток S. aureus штамм Wood 46 [Н.Е. Ястребова, 1987]; поверхностный полисахарид (ПС), полученный по методу [I.W. Sutherland & J.F. Wilkinson, 1971] из супернатанта культуральной жидкости путем осаждения ацетоном и фенольной депротеинизации; тейхоевые кислоты (ТК), полученные из клеточных стенок [J. Baddiley, 1962] экстракцией трихлоруксусной кислотой. В реакциях использованы иммунные кроличьи сыворотки к S. aureus штамм Wood 46.

Двойную диффузию в геле, линейный и ракетный иммунноэлектрофорез проводили по [Н.А. Зорин, Т.Н. Белогорлова, 1983; О. Ouchterlony, 1958].

Реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) проводили в 96 луночных планшетах с использованием стафилококкового эритроцитарного диагностикума и иммунной кроличьей сыворотки к S. aureus (полученной при иммунизации кроликов «ацетоновыми телами» наиболее иммуногенных штаммов - №№ 1986 и 1991). Специфическую антигенную активность оценивали по минимальной дозе стафилококковых препаратов со стабилизатором (мкг) или водного экстракта (мкл), тормозящих 2 ГЕ (гемагглютинирующие единицы) сыворотки - минимальная тормозящая доза (МТД) [ПУР № 04863057-80-10].

' Препараты сравнения и иммунные кроличьи сыворотки любезно предоставлены д.м.н. Н.Е. Ястребовой, НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН 10

Иммуноферментный анализ. Уровень IgG-антител к антигенам S. aureus в сыворотках иммунизированных животных определяли с использованием метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с адсорбцией на носителе антигенных препаратов в 96 луночных планшетах [Н.Е. Ястребова, 2007]. Конъюгат - антитела диагностические против IgG кролика, меченные пероксидазой хрена (производство НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Для оценки уровня IgG антител сывороток, характеризующего их антигенную активность, использован индекс (I), рассчитанный по формуле:

I = (ОП им - ОПфон)/(ОПк - ОПфон), где

ОП им - оптическая плотность сывороток иммунизированных животных;

ОП ф0н. - средняя оптическая плотность фона;

ОП к_ - средняя оптическая плотность сывороток интактных животных (отрицательный контроль).

Иммунологические методы.

Для оценки взаимодействия антигенных препаратов с Толл-подобными рецепторами (TLR) использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно экспрессирующие hTLR4/MD2-CD2-CD14 и hTLR2/CD14, а также несущие ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора [Д.В. Шебляков с соавт., 2008]. В качестве положительного контроля экспрессии TLR2 и TLR4 использовали коммерческие препараты, соответственно, синтетический липополисахарид из Е. coli (Sigma) и липопептид, любезно предоставленный проф. B.C. Народицким (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Через 24 часа после добавления исследуемого препарата к клеткам удаляли среду и вносили буфер с субстратом для ß-галактозидазы. Уровень активности ß-галактозидазы определяли при X 414 нм.

Мононуклерные лейкоциты перефирической крови доноров (МЛПК) и селезенок мышей (MJI) выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу [A. Boyum, 1968].

Дендритные клетки (ДК) получали из МЛПК доноров и MJ1 селезенок мышей линии BALB/c по стандартной методике [Г.З. Чкадуа с соавт., 2002]. Культивирование клеток проводили в присутствии факторов роста (GM-CSF

и IL-4). В качестве индукторов созревания использовали антигенные препараты и TNF-a (положительный контроль).

Антигенпрезентирующую способность ДК мышей линии BALB/c оценивали в опытах активной защиты. ДК (ЗхЮ6), созревшие под действием антигенных препаратов, вводили двукратно подкожно (п/к) и однократно внутрибрюшинно (в/бр) с интервалом 14 суток по 0,5 мл. Через 14 суток после последней инъекции животных заражали 2 млрд. микробных клеток штамма S. aureus 1986 в 0,4 % голодном агаре. Протективную активность оценивали по проценту выживших мышей в опыте и контроле (интактные животные). Выживаемость рассчитывали в динамике по методу [С.А. Гланц, 1999].

Протективную активность препаратов изучали на беспородных мышах массой 12-14 г, иммунизированных дозой 0,5 мг препарата 6-кратно (3 раза - п/к, 3 раза - в/бр) с интервалом 7 дней. Через 14 дней после последней иммунизации и интактных (контроль) мышей заражали тремя пятикратно убывающими дозами вирулентного штамма S. aureus № 6 в 0,4 % голодном агаре. Выживаемость оценивали в течение 7 суток, рассчитывали LD50, доверительный интервал и значимость различий [И.П. Ашмарин, A.A. Воробьёв, 1962; Л.Б. Хейфец, 1965].

Определение экспрессии поверхностных маркеров мононуклеаров и ДК проводили при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США).

Уровень цитокинов определяли:

- в супернатантах культур ДК мышей методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (Австрия);

- в сыворотках мышей, иммунизированных антигенными препаратами, при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Thl/Th2 10 plex фирмы Bender MedSystems (Австрия). Уровень цитокинов определяли согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FacsCalibur («Becton Dickinson», США).

Цитотоксическую активность МЛПК доноров и МЛ селезенок мышей определяли на NK чувствительной линии клеток опухоли К-562. Опухолевые клетки (3x104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛПК или МЛ, обработанными антигенными препаратами, в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных планшетах 18 часов в С02 - инкубаторе при 37 °С и 4 % С02. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Fluka») и по оптической плотности при X 540 нм, измеряемой на мультискане MS («Labsystem», Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов оценивали по поглотительной способности в отношении штамма .У. aureus № 1991, определяли фагоцитарный индекс (ФИ) и число (ФЧ) [В.В. Меньшиков, 1987].

Острую токсичность антигенных препаратов оценивали введением мышам 0,2 мг на особь на основании поведения животных и изменения их веса в течение 7 суток в соответствии с [МУК 4.1/4.2.588-96].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 7.0), Exel, WinMdi и BioStat D. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью критерия Стьюдента. Данные представлены как М±ш. Различия рассматривались как значимые при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление в вакцинных штаммах S. aureus гена, ответственного за синтез белка A (spa).

Одним из факторов патогенности S. aureus, является белок А, синтез

которого детерминируется spa геном. Однако, вакцинные штаммы,

использованные при разработке Иммуновак-ВП-4® и «Стафиловак» [Н.Б.

Егорова, Е.А. Курбатова, 2008; Н.Б. Егорова с соавт.,2008], не были

охарактеризованы по его наличию. Изучение этих штаммов на присутствие в

них spa гена, выполненное с помощью современной LAMP-технологии (рис.

1), выявило его только в штамме № 5 (дорожка 2) - наименее вирулентном и

наименее иммуногенном из 4х вакцинных штаммов, а также в невакцинном

штамме № 6 (дорожка 6) - наименее иммуногеном и высоко вирулентном, который использовали при изучении протективной активности вакцин. Контролем служили два штамма Cowan, продуцирующие белок А. Следует подчеркнуть, что скрининг штаммов S. aureus - продуцентов антигенных препаратов, проведенный ранее, показал наиболее высокие протективные свойства препаратов из штаммов №№ 1991 и 1986, а их сочетание с препаратами из штаммов №№ 5 и 9 характеризовалось наиболее выраженной перекрёстной иммуностимулирующей активностью [Л.И. Корзая, 1982].

Дорожки 1 2 3 45 6 7 8 9 10

Рисунок 1. Профили LAMP-ампликонов штаммов S .aureus.

Обозначения: 1 - маркер молекулярных масс; штаммы S. aureus'. № 5- 2, № 9 - 3, № 1986 -4, № 1991 - 5, № б - 6, Cowan № 21/2 -7, Cowan № 21/4 - 8; 9 - отрицательный контроль пробы, 10 - отрицательный контроль (реакционная смесь без ДНК).

В сыворотках мышей, иммунизированных «ацетоновыми телами» из наиболее иммуногенных штаммов №№ 1986 и 1991, не содержавших белок А, отмечена высокая антигенная активность, по уровню IgG антител, а также перекрестная активность между собой и с клеточными стенками (КС) S. aureus Wood-46, не содержащего белок А (табл. 2).

Всестороннее изучение вакцинных штаммов, в том числе определение генов, ответственных за синтез основных факторов патогенности, и выявление их возможных взаимосвязей с вирулентностью и иммуногенностью штаммов, может быть перспективным и в последующем способствовать определению критериев для отбора вакцинных штаммов при разработке противостафилококковых препаратов.

Таблица 2. Результаты ИФА сывороток мышей, иммунизированных «ацетоновыми телами» (6-кратно, 900 мкг/мышь)__

Антиген для иммунизации мышей (микробные клетки, инактивированные ацетоном) из штамма: Уровень антител в сыворотках-1* к антигенным препаратам, сорбированным на планшете:

1986 1991 КС S. aureus Wood-46

1986 8,15** 8,14** 4 29**

1991 у 75** 8,22** 4,62**

отрицательный контроль (интактн.мыши I ± 2а) 1,0±0,08 1,0±0,1 1,0±0,56

* I - индекс реакции

** - статистически значимые различия с отрицательным контролем (р<0,05)

Получение антигенных препаратов при различных способах культивирования штаммов S. aureus и их химическая и иммунобиологическая характеристика.

Известно, что синтетические и полусинтетические питательные среды, предпочтительнее для получения продуктов микробного синтеза. Изучение динамики роста 4-х вакцинных штаммов, проведенное в 10 вариантах сред (9 полусинтетических сред и полноценная среда № 1) (табл. 1) с использованием планшетного фотометра Multiskan-Ascent, показало, что в конце фазы экспоненциального роста наибольшая продуктивность процессов выращивания, отражающая накопление биомассы в единицу времени (1 ч) (рис. 2), наблюдалась в полусинтетической среде № 3 и в полноценной - № 1. Однако, при реакторном культивировании наибольшее накопление биомассы отмечено только в полноценной среде (№ 1), в связи с чем в исследованиях, предполагающих их последующую реализацию в производственных целях, при периодическом реакторном культивировании вакцинных штаммов S. aureus была использована полноценная питательная среда, что обеспечило высокую продуктивность по накоплению биомассы.

На основе водных экстрактов, полученных при реакторном выращивании 4-х вакцинных штаммов в полноценной среде, а также с плотной среды, приготовлены антигенные препараты со стабилизатором.

Изучение химического состава показало, что водный экстракт, полученный после реакторного культивирования на полноценной среде, содержал больше белка и меньше углевода, чем препарат с плотной среды, при низком содержании нуклеиновых кислот. Специфическая активность антигенных препаратов со стабилизатором была сопоставима (табл. 3).

Рисунок 2. Продуктивность процессов выращивания штаммов S. aureus №№ 5, 9, 1986,

1991 в различных питательных средах

№№ 1-10 - номера питательных сред (см. табл.1)

0; 0,05; 0,1; 0,15 - продуктивность по накоплению биомассы (млрд/ч).

Таблица 3. Химический состав водных экстрактов и специфическая активность приготовленных на их основе антигенных препаратов со стабилизатором._

Химический состав (%) ± m Специфическая активность антигенных препаратов со стабилизатором (МТД, мкг)

Кг водный экстракт белки углеводы нуклеиновые кислоты

1 с плотной среды 43,4±1,89* 3,1 ±0,5 * 1,5±0,12 0,03

2 после реакторного культивирования 59,6±2,53* 1,5±0,25* 1,2±0,13 0,01

* Pi „ 2 <0,05

Различия в химическом составе водных экстрактов, полученных при разных способах культивирования штаммов, могут быть связаны, вероятно, с различной степенью их очистки от компонентов питательной среды.

В водных экстрактах, полученных при разных способах культивирования, исследован моносахаридный состав с использованием хромато-масс-спектрометрического анализа. Исследование показало, что водный экстракт, полученный из культур, выращенных на плотной среде, содержал значительное количество галактозы и почти в 2 раза меньше 16

глюкозы (табл. 4). Основным моносахаридным компонентом препарата, полученного при реакторном культивировании, являлась глюкоза, причем содержание ее в 3 раза меньше, а галактозы в 25 раз меньше, чем в препарате с плотной среды. Это соответствует данным о более высоком содержании углеводов (табл. 3) в водном экстракте с плотной питательной среды.

Таблица 4. Моносахаридный состав водных экстрактов

Водные экстракты Относительное содержание моносахаридов (при галактозамине=1):

Глюкоз-амин Галактоз-амин Манноза Галактоза Ксилоза Глюкоза

с плотной среды 7,8 1 6,3 52,6 4,0 21,4

после реакторного культивирования 1,6 1 2,1 2,1 + 7,1

Для сравнительного изучения состава белковых компонентов водных экстрактов, полученных при культивировании S. aureus 1991 на плотной и в жидких питательных средах (варианты сред №№ 1, 1а и 3, табл. 1), определяли полипептидный спектр в вертикальном SDS электрофорезе. В препарате, полученном из клеток, выращенных на плотной среде, содержание полипептидов ниже, чем в препаратах, полученных при реакторном культивировании (в полноценной и в полусинтетической средах), о чём свидетельствовала меньшая интенсивность окраски проявленных полос (рис. ЗА). При реакторном культивировании штамма S. aureus 1991 в полноценной среде выход антигенного препарата выше, чем при выращивании этого же штамма в полусинтетической среде (соответственно, 1,51 и 0,56 г «ацетоновых тел» на 1 л среды), однако полученные препараты сравнимы по составу полипептидных компонентов (рис. ЗА) и по специфической активности (МТД 0,35 и 0,75 мкл). При окрашивании азотнокислым серебром и изменении концентрации водных экстрактов, полученных из всех 4-х вакцинных штаммов при реакторном культивировании и на плотной среде в полноценных средах (рис. ЗБ): оба препарата содержали по 4 полипептидных компонента (м.м. 12; 15; 17 и 23 кДа), причем наиболее четкие полосы наблюдались в максимальной концентрации (10 мг/мл), особенно в препарате после реакторного культивирования, который содержал 2 дополнительных компонента - 40 и 66 кДа.

Рисунок 3. Электрофорез водных экстрактов: A. S. aureus 1991, выращенных на плотной (1) и в жидких - полусинтетической (2) и полноденной (3) питательных средах; met -весовой белковый маркер; Б. 4-х вакцинных штаммов, выращенных на плотной среде (13) и после реакторного культивирования (4-6), в концентрациях 10 (1и4), 5 (2и5) и 2,5 мг/мл (Зиб); маркер (7).

Иммунохимические свойства водных экстрактов, полученных при различных условиях выращивания вакцинных штаммов aureus, изучали в реакции двойной диффузии в геле по Оухтерлони (ДЦГ), в линейном иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) и РИЭФ, с антимикробной сывороткой против

■S'. aureus Wood 46 и препаратами сравнения из этого же штамма (рис. 4).

«-» «+»

А Б В

Рисунок 4. Данные иммунохимического изучения препаратов (водных экстрактов), полученных с плотной среды (АК) и при реакторном культивировании (PK). А. ДДГ, сыв. - в центральной лунке (титр в реакции агглютинации 1:800). Б. ИЭФ, сыв. - в бороздках (титр в реакции агглютинации 1:3200). В. РИЭФ, сыв. - в геле (титр в реакции агглютинации 1:3200).

Обозначения: ПС - поверхностный полисахарид S. aureus Wood 46, ТК - тейхоевая кислота клеточной стенки S. aureus Wood 46, д-т - дезинтеграт S. aureus Wood 46. №№ 1-4 - ПС; №№ 5-8 - PK, №№ 9-12 - AK, концентрация 1,25 мг/мл (1, 5, 9); 2,5 мг/мл (2, 6, 10); 5 мг/мл (3,7, 11); 10 мг/мл (4, 8, 12).

Показано, что в водном экстракте после реакторного культивирования содержались отрицательно заряженные компоненты (рис. 4Б), имеющие общие детерминанты с полисахаридом и тейхоевыми кислотами S. aureus Wood 46 (рис. 4А), причем, эти компоненты, активнее, чем в водном экстракте с плотной среды (рис. 4В). Можно предположить, что выявленные отличия, связаны с различной фазой роста культуры, которую используют для получения антигенных препаратов: при реакторном культивировании -экспоненциальная, на плотной среде - стационарная.

В экспериментах на мышах показано отсутствие токсичности вакцин.

Действие антигенных препаратов на эффекторные клетки врожденного иммунитета.

Дендритные клетки (ДК), являющиеся ключевыми клетками-эффекторами врожденного иммунитета, выделяли из клеток костного мозга мышей линии BALB/c (табл. 5) и из мононуклерных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) доноров. Индукцию созревания ДК осуществляли антигенными препаратами в сравнении с классическим индуктором созревания - TNF-a (положительный контроль). Культура ДК под действием антигенных препаратов имела неоднородный характер; отмечено формирование зрелых ДК (маркер терминальной дифференцировки - CD83, костимуляторные молекулы - CD 86, 80, 40, молекулы антигенного представления MHCII), а также присутствие макрофагов (F4/80) и незрелых ДК (нДК) - (CD34). Увеличение численности клеток, экспрессирующих TLR2, отмечено только в группах с вакцинами, что подтверждает наличие лиганд в их составе.

Аналогичные результаты получены при изучении ДК, выделенных из МЛПК доноров: увеличение клеток, экспрессирующих маркер CD83, молекулы антигенного представления HLA-DR, TLR2 на фоне снижения маркера незрелости (CD34) и присутствия макрофагальной фракции (CD14).

Функциональная активность ДК выражалась повышением уровня цитокинов IL-6 и TNF-a, и в меньшей степени IL-ip, IL-12, IL-10 и IFN-y (рис. 5). Эти данные свидетельствуют о потенциале полученных ДК индуцировать иммунный ответ преимущественно по первому типу - Thl.

Таблица 5. Уровень экспрессии поверхностных молекул ДК, генерированных из клеток

костного мозга мышей (м=20)

Маркеры Содержание клеток, (%) ± ш Достоверность различий между группами

нДК (отрицательный контроль) TNF-a (положительный контроль) Антигенные препараты с питательной среды:

плотной жидкой

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

CD83 2,9±0,3 29,3±2,3* 17,5±0,9*#* 5,2±0,5*# *Pi и 2 34<0,05; #Рг и з 4<0,05; *Рз и 4 <0,05;

CD34 24,6±2,7 3,5±0,4* 8,5*0,8**' 19,2±1,4*

MHCII 14,3±1,5 27,2±2,3* 21,7±1,7** 14,8±1,4#

CD80 3,7±0,5 12,5±1,8* 8,5±0,6** 4,7±0,4*

CD86 9,2±0,7 17,1±1,1* 16,8±0,7*' 9,1 ±0,7*

CD40 1,2±0,3 10,3±0,7* 7,7±0,6** * 2,5±0,2*#

F4/80 47,7±4,2 17,9±3,1* 29,3±2,7*" 33,7±3,9*"

TLR2 2,8±0,6 4,1 ±0,5 8,9±0,6**' 6,7±0,4*#

пкг/мл

3500 -

3000 2500 ■ 2000 ■ 1500 1000 -500 ■ 0

гЬ

feL

пкг/мл 100

т.

JGL

JTL.

отрицательный положительный ДК+АК отрицательный положительный ДК+АК

контроль контроль контроль контроль

□ IL6 OTNF-a niL-ip OIL-12 DIFN-y DIL-10 DIL-4 OIL-5

Рисунок 5. Уровень цитокинов в культуре ДК, сформированных под влиянием антигенного препарата с плотной среды (АК) и TNF-a (зДК, положительный контроль). По оси абсцисс: культура ДК.

По оси ординат: уровень цитокинов в культуре ДК, пкг/мл.

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, выделенных от

иммунизированных мышей, оценивали в динамике (через 4, 24 и 96 часов

после иммунизации) по поглотительной способности микробных клеток

штамма S. aureus 1991 (табл. 6). Фагоцитарный индекс (ФИ) в группе с

антигенными препаратами после реакторного культивирования штаммов

повышался в более поздние сроки (24 часа) и был ниже, чем в группе с

антигенными препаратами, полученными после культивирования штаммов

на плотной среде (р<0,05). 20

Таблица 6. Фагоцитарная активность макрофагов перитонеального экссудата мышей при однократном внутрибрюшинном введении стафилококковых антигенных препаратов в дозе 200 мкг (п=10).___

Исследование после введения препаратов через Антигенный препарат с питательной среды Контроль Достоверность различий между группами

плотной жидкой

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

30 мин1 1 час1 30 мин1 1 час' 30 мин' 1 час1

Фагоцитарный индекс (ФИ), (%) ± m

4 часа 74,5±3,8* 76,8±2,3* 62,4±3,1 65,7±3,3 62,2±3,4 65,5±2,3 Р|ИЗ;2И4<0,05

24 часа 84,2±3,2* 91,5±3,7* 70,8±3,8 75,5±2,8*

96 часов 91,2±3,5* 95,8±4,5* 76,2±2,8* 81,3±2,4*

* -р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

1 Время инкубации фагоцитирующих клеток (¡О6) и штамма S. aureus I991(5xl(f)

При сравнении водных экстрактов из штамма S. aureus 1991, выращенного в условиях реакторного культивирования в полноценной и полусинтетической средах, было выявлено, что они обладали сопоставимой фагоцитарной активностью (р>0,05) (табл. 7). Цитотоксическая активность мононуклеарных лейкоцитов (MJI) селезенок мышей, иммунизированных этими же препаратами, была сопоставима и выше контроля (табл. 8).

Таблица 7. Фагоцитарная активность макрофагов перитонеального экссудата мышей при однократном внутрибрюшинном введении водных экстрактов в дозе 200 мкг (п=10)._

Исследование после введения водных экстрактов через Антигенный препарат, полученный при реакторном культивировании S. aureus 1991 в питательной среде Контроль Достоверность различий между группами

полноценной полусинтетической

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

30 мин1 1 час1 30 мин1 1 час1 30 мин1 1 час1

Фагоцитарный индекс (ФИ), % ± m

4 часа 77,9±3,4* 82,2±2,3* 82,4±3,1* 85,2±3,2* 60,2±2,8 64,5±2,1 Pl«3;2„4>0,05

24 часа 87,6±2,2* 89,3±2,5* 88,3±3,5* 93,2±2,4*

96 часов 85,7±1,8* 88,2±2,2* 86,2±2,4* 89,3±4, г*

* -р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Время инкубации фагоцитирующих клеток (10 ) и штамма S. aureus ¡991(5x10")

Таблица 8. Динамика цитотоксической активности МЛ селезенок мышей при однократном внутрибрюшинном введении водных экстрактов.

Исследование после введения водных экстрактов через: Цитотоксическая активность NK по отношению к линии клеток К562, (%) ± ш

Антигенный препарат, полученный при реакторном культивировании S. aureus 1991 в питательной среде Достоверность различий

полноценной полусинтетической

4 часа 69,6=fc3,8* 71,4±5,1* Р>0,05

24 часа 76,2±4,1* 67,2±2,8*

96 часов 63,1 ±4,3* 65±3,2*

Контроль (интактные мыши) 24,4±2,3

*- Р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

В группах мышей, иммунизированных антигенными препаратами, отмечен дозозависимый эффект: цитотоксическая активность для доз 50 и 200 мкг, соответственно, 43,7 и 58 %, для препарата с плотной среды, и 36 и 55,3 % - для препарата после реакторного культивирования (при р<0,05 с контрольной группой - интактные мыши).

Важным элементом врожденного иммунитета являются ТЬЯв, которые участвуют в распознавании патоген-ассоциированных структур микробных клеток. Изучение специфического связывания ТЬ112 и ТЫ14 с различными водными экстрактами показало, что в диапазоне доз 0,1 - 10 мкг/мл, препараты взаимодействовали с ТЬЯ2, о чем свидетельствовало изменение окраски среды, отражающее активацию внутриклеточного ядерного фактора №-кВ (рис. 6), и не взаимодействовали с Т1Л4. з

■ 1 Омкг/мл

□ 1 мкг/мл

□ 0,1 мкг/мл

О с £

Ь О

Рисунок 6. Взаимодействие водных экстрактов, в дозах 0,1; 1 и 10 мкг/мл, с TLR2. По оси абсцисс - водные экстракты, вводимые в культуру клеток эмбриональной почки человека линии 293, стабильно экспрессирующих TLR2: 1- после выращивания 4-х вакцинных штаммов на полноценных плотной среде и 2- в реакторе, 3- после реакторного культивирования S. aureus 1991 в полноценной и 4 - полусинтетической средах; 5-синтетический липопептид; 6- интактные клетки. По оси ординат - оптическая плотность, активация NF-kB.

Оценка цитокинового статуса лимфоцитов мышей в динамике (через 2, 4, 8, 24 часа после иммунизации), показала, что антигенный препарат с плотной среды (А) в первые 8 часов исследования интенсивнее стимулировал экспрессию 1Ь-1, 2, 4, чем препарат, полученный после реакторного культивирования (Б) (табл. 9).

Таблица 9. Уровень цитокинов в сыворотках мышей, иммунизированных антигенными препаратами, по сравнению с контролем*_

Препарат Цитокины и их уровень

час IL-la IL-2 1L-4 IL-5 IL-6 GM-CSF 1L-10 IL-17 TNF-а IFN- У

А / 2 +++■* ++. ' + +++. ++ +++ ++++ ■Н-+ ++-+++ - - + ' + -+ + . +

4 +++✓ '+++ +++ ++ ++++' , +++ -Н-++ ++++ -Н-++ +++ +++ +++ + ' + ' + ++ ++ '

8 + / +++ , +++ ++++ I I и '-Н-+ + ++ + , + + + '' ' + + , + ++ ++

Б 24 + / ' + ++ + +++ ' ++ + ' ' + + -' + + + -" + +, + + +

* Условные обозначения: увеличение показателей по сравнению с интактными: (-) <1,5 раз; (+) 1,5 - 4,9 раза; (++) 5,0 - 8,9 раза; (+++) 9,0 - 12,9 раза; (++++) 13,0 - 16,9 раза.

Действие антигенных препаратов на формирование системы адаптивного иммунитета.

Анализ субпопуляционной структуры лимфоцитов мышей, иммунизированных антигенными препаратами в дозе 200 мкг через 48 часов после введения показал, что они повышают (р<0,05) уровень NK клеток, В-лимфоцитов (CD 19), TCR (у§Т) относительно контроля. Антигенный препарат с плотной среды сильнее повышал экспрессию NKT (CD3/NK), Treg (CD4/CD25/FoxP3), CTL (CD8), МНСИ, В1-лимфоцитов (CD5.2), чем препарат после реакторного культивирования (табл. 10).

Уровень специфических антител оценивали в сыворотках мышей (по уровню IgG антител), иммунизированных антигенными препаратами. Выявлена высокая антигенная активность этих препаратов и перекрестная активность между собой (табл. 11).

Таблица ¡0. Уровень экспрессии поверхностных молекул МЛ селезенок мышей ((%) ± т клеток) через 48 часов после однократного внутрибрюшинного введения антигенных препаратов (200 мкг)__________

№ Препараты CD3 NK CD3/ NK CD4 CD25 CD4/ CD25/ Foxp3 CDS TCR CD 19 МНС» CD5.2 TLR2

1 с плотной среды 36,2 ±3,2 13,8 ±1,2 5,2 ±0,4 44,1 ±4,4 7,8 ±0,4 11 ±0,2 20,1 ±2,1 1,8 ±0,3 40,5 ±3,8 45,6 ±4,7 5,7 ±0,4 2,1 ±0,3

2 после реакторного культивиро вания 27,8 ±3,0 11,8 ±0,8 1,6 ±0,2 33,2 ±3,3 10,6 ±0,6 2,4 ±0,2 11,08 ±0,9 1,7 ±0,2 33,9 ±3,7 22,3 ±2,1 1,7 ±0,2 0,5 ±0,1

3 Контроль 19,05 ±1,9 1,89 ±0,22 0,98 ±0,09 26,4 ±2,2 0,27 ±0,04 0,72 ±0,17 11,18 ±1,2 0,28 ±0,03 14,3 ±1,1 17,8 ±1,15 1,9 ±0,2 0,5 ±0,05

У-Р|И3;2„3<0,1

-Р.И2<0,05

Таблица 11. Уровень антител (I*) в сыворотках мышей, иммунизированных антигенными препаратами (6-кратно, 500 мкг/мышь)_

Антигенный препарат для иммунизации мышей Водные экстракты, сорбированные на планшете:

с плотной среды после реакторного культивирования

с плотной среды 6,43** 4,0**

после реакторного культивирования 5,14** 8,7**

отрицательный контроль (интактн. мыши I ± 2а) 1,14±1,4 1,49±1,19

* I - индекс реакции

** - статистически значимые различия с отрицательным контролем (р<0,05)

Оценку протективной активности осуществляли иммунизацией мышей ДК, созревшими под действием антигенных препаратов и заражением живой вирулентной культурой штамма S. aureus 1986. В группе мышей, иммунизированных ДК, созревшими под действием водного экстракта из штамма S. aureus 1986 или антигенного препарата, полученного при культивировании 4-х вакцинных штаммов, отмечен высокий процент защиты мышей от гомологичной инфекции (соответственно 75 % и 62,5 %).

При оценке протективной активности антигенных препаратов, отмечен выраженный эффект препарата, полученного после реакторного культивирования при иммунизации беспородных мышей и заражении высоковирулентной культурой штамма S. aureus № 6 (LD50 2,75x108) по сравнению с неиммунизированными мышами (LD5o 2,09х107), (р < 0,001).

Совокупность полученных результатов свидетельствует, что антигенные препараты, полученные при разных способах культивирования, сопоставимы по иммунобиологическим свойствам и активируют эффекторы врожденного 24

и адаптивного иммунитета. При этом по действию на эффекторы врожденного иммунитета активность препарата с плотной среды, по сравнению с полученным после реакторного культивирования, была выше. В то же время оба препарата индуцировали сопоставимый уровень IgG антител, а препарат после реакторного культивирования вызывал у мышей выраженный протективный эффект. Это свидетельствует о формировании адаптивного иммунитета, что является важным требованием при разработке вакцинных препаратов.

Выводы

1. Показано, что антигенные препараты, полученные из биомассы вакцинных штаммов S. aureus, после их реакторного культивирования отвечают требованиям, разработанным для препаратов из штаммов с плотной среды.

2. Определён состав полусинтетической питательной среды и показана возможность её использования, как и полноценной среды, для реакторного культивирования S. aureus', полученные антигенные препараты сопоставимы по специфической активности и действию на некоторые эффекторы врожденного иммунитета.

3. Впервые показано, что spa ген, ответственный за синтез протеина А, содержится в вакцинном штамме № 5, а наиболее иммуногенные штаммы (№№ 1986 и 1991), препараты из которых обеспечивают образование высокого уровня IgG антител, spa ген не содержат.

4. Установлено, что антигенные препараты сопоставимы по наличию полисахаридсодержащих компонентов, специфической активности, отсутствию токсичности.

5. Показано, что антигенные препараты стимулируют экспрессию TLR2 на ДК и взаимодействуют с ним на модели эмбриональных клеток почки человека.

6. Установлено, что антигенные препараты, полученные в разных условиях, активируют эффекторы врождённого иммунитета (созревание дендритных клеток, индукция их антигенпрезентирующей активности; усиление фагоцитарной активности макрофагов и цитотоксической активности NK мышей и МЛПК доноров; экспрессия про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов).

7. Выявлено, что у иммунизированных мышей препараты способствуют формированию адаптивного иммунитета (повышение численности NKT, Т, В T-reg лимфоцитов; индукция синтеза IgG антител; повышение протективной активности в отношении стафилококковой инфекции у мышей).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахматова Н.К. Влияние бактериальной вакцины на продукцию цитокинов у мышей при иммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном. / Кузьменко P.M.*. Кунягина О.В., Лебединская Е.А., Грубер И.М. // Российский иммунологический журнал.-2009.-Т. 3(12).- №1,- С. 58-63.

2. Ахматова Н.К. Коррекция индуцированной цитостатиком иммуносупрессии у мышей с помощью стафилококковой вакцины. / Кузьменко P.M.*. Грубер И.М, Доненко Ф.В. // Журнал микробиологии. - 2009. - № 1. - С. 46-52.

3. Кузьменко P.M.* Влияние бесклеточной стафилококковой вакцины «Стафиловак» на некоторые показатели иммунной системы мышей. / Ахматова Н.К., Грубер И.М. // Журнал микробиологии. - 2009. - № 3. - С. 32-37.

4. Кузьменко P.M.* Характеристика комплексов антигенов вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, полученных в различных условиях культивирования. / Злыгостев С.А., Михайлова H.A., Грубер И.М., Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Черкасова Л.С. // Журнал микробиологии. -2010. - № 2. - С.51-54.

5. Кузьменко О.М.* Индукция созревания дендритных клеток антигенами стафилококков / Ахматов Э.А., Лебединская Е.А. // Журнал микробиологии. - 2010. - № 4. - С. 48-54.

6. Кузьменко О.М.* Иммунопрофилактика и иммунотерапия стафилококковых инфекций бактериальными вакцинами. / Грубер И.М., Прияткин Р.Г. // Журнал микробиологии. - 2010. № 5. - С. 106-112.

7. Кузьменко P.M.* Стафилококковая вакцина усиливает цитотоксическую активность естественных киллеров у человека и мыши. / Ахматова Н.К., Грубер И.М. // Объединённый иммунологический форум, Санкт-Петербург, 2008. Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11). - № 2-3. - С. 337.

8. Кузьменко О.М.* Влияние стафилококкковой вакцины «Стафиловак» на эффекторные механизмы иммунитета. / Ахматова Н.К., Грубер И.М. // Международная конференции «Физиология и патология иммунной системы». Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. - № 3. - С. 274.

9. Кузьменко О.М.* Коррекция индуцированной цитостатиком иммуносупрессии у мышей с помощью стафилококковой вакцины «Стафиловак». / Ахматова Н.К., Грубер И.М. // Международная конфереции «Физиология и патология иммунной системы». Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. - № 3. - С. 275.

10. Кузьменко P.M.* Влияние комплекса антигенов стафилококка на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов. / Ахматова Н.К., Грубер И.М., Кунягина Р.В., Лебединская Е.А., Кабановская И.Н., Некрасов A.M., Бородовский М.В., Уткина Н.П. // Материалы XIII Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 8-11 июня 2009. Медицинская иммунология.-2009.-Т. II,- №4-5. С. 321.

11. Игнатова P.M. Выявление в вакцинных штаммах S. aureus гена, ответственного за синтез белка A (spa). / Борисова Р.Ю., Грубер И.М., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Егорова Н.Б., Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 ноября 2010, С. 52.

*- Кузьменко О.М. = Игнатова О.М.

Заказ № 149-А/11/2010 Подписано в печать 17.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

- ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

114))

www.cfr.rit; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатова, Ольга Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Иммунобиотехнология профилактических и терапевтических противостафилококковых препаратов.

1.1 Микробиологические аспекты биотехнологии получения стафилококковых вакцин.

1.2 Основные факторы патогенности Staphylococcus aureus и их роль в противостафилококковом иммунитете.

1.3 Современные моно- и комплексные противостафилококковые препараты.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях"

Стафилококковая инфекция является одной из важнейших проблем медицинской практики. Staphylococcus aureus вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации от легких до генерализованных форм [91]. Факторами, определяющими трудности терапии этой патологии являются множественная устойчивость возбудителя к применяемым антибиотикам, хронический характер болезни, а также развитие ее на фоне снижения эффекторных функций иммунной системы и соответственно резистентности организма к инфекции [17, 30].

Известен целый ряд препаратов, как комплексных (Бронхо-Ваксом®, ИРС-19®, Имудон®, стафило-протейно-синегнойная вакцина, Иммуновак-ВП-4®), так и стафилококковых монопрепаратов (Анатоксин стафилококковый очищенный®, Антифагин®), обладающих как специфическим, так ни. иммуномодулирующим эффектом. Ранее в НИИВС им. И.И. Мечникова была разработана сухая стафилококковая бесклеточная вакцина [30], приготовленная на основе водных экстрактов антигенов клеточной стенки 4-х штаммов S. aureus (№ №5, 9, 1986, 1991), отобранных из 16 штаммов (выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями и у производственных), которые были изучены по общепринятым критериям [34]. Эти штаммы, выбранные на основе изучения иммуногенной активности, как способные защищать животных от гетерологичных штаммов S. aureus, различались по вирулентности.

Разработанная сухая стафилококковая бесклеточная вакцина была разрешена к применению в медицинской практике ещё в 1996 г (Приказ МЗ

РФ 3144/53 от 10.04.1996), однако её производственный выпуск не был налажен. Вместе с тем клинические исследования, проведенные на разных базах, показали, что включение данной вакцины в комплексную терапию хронических стафилококковых инфекций, оказывает длительный терапевтический эффект [38, 56]. Антигенные препараты из приведенных вакцинных штаммов стафилококка использованы также при 6 конструировании поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4®, внедренной в производство (на базе НПО Микроген, Уфа). Стафилококковый компонент этого препарата оказался эффективным, как по клиническим, так и по иммунологическим показателям [25].

В последние годы появились исследования по сравнительной характеристике вакцинных и выделенных от больных штаммов S.aureus. Выявленные различия в их структуре могут влиять на течение эпидемических и инфекционных процессов [14, 16, 73, 84, 132]. В связи с развитием вакцинологии в направлении создания новых препаратов генетическая характеристика производственных штаммов, с учётом их факторов патогенности, приобретает особый интерес [11, 12, 18, 33]. Это явилось предпосылкой для изучения молекулярно-генетических свойств используемых вакцинных штаммов S. aureus, в частности, определение гена,. кодирующего синтез белка А, являющегося одним из факторов патогенности и суперантигеном для В-лимфоцитов, вызывающим их поликлональную активацию, что может привести к подавлению иммунного ответа [58].

До настоящего времени антигенные препараты стафилококка, входящие в бесклеточную стафилококковую вакцину и в Иммуновак-ВП-4®, получали, при культивировании штаммов на плотной питательной среде и инактивировании ацетоном смытой с поверхности агара биомассы с последующим ее отделением методом центрифугирования, что представляет трудоемкий, малопроизводительный и дорогостоящий процесс. Использование реакторного культивирования в жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом микрофильтрации устраняет эти недостатки. Так как стафилококковый компонент является довольно лабильным, возникает необходимость определения возможного влияния технологических изменений на свойства антигенных препаратов, приготовленных из культур, выращенных при периодическом реакторном культивировании.

Достижения иммунологии на современном этапе [100, 119] позволяют охарактеризовать полученные антигенные препараты не только по их иммуногенности, но и на молекулярно-клеточном уровне по их действию на ключевые эффекторы врождённого и адаптивного иммунитета. Если для препарата Иммуновак-ВП-4® такое исследование проведено [3, 4], то в отношении стафилококкового компонента подобных данных нет.

Цель исследования: получение антигенных препаратов из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых на плотных питательных средах и в реакторе, их характеристика (химическая, физико-химическая, иммунохимическая) и изучение влияния на эффекторы врождённого и адаптивного иммунитета.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать вакцинные штаммы S. aureus по наличию в них гена, ответственного за синтез протеина А.

2. Изучить накопление биомассы вакцинных штаммов S. aureus при выращивании в различных питательных средах.

Научная новизна работы

Впервые исследованы вакцинные штаммы S. aureus (№ № 5, 9, 1986, 1991) на наличие spa гена, ответственного за синтез протеина А, и установлено его присутствие только в штамме № 5. Наиболее иммуногенные вакцинные штаммы № № 1986 и 1991 обладали внутривидовой антигенной активностью: способствовали образованию в сыворотках иммунизированных мышей высокого уровня IgG-антител.

- стимулируют созревание дендритных клеток;

- индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов . мышей (MJI) и периферической крови доноров (МЛПК);

- индуцируют экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов;

- усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей;

- стимулируют экспрессию TLR2 и взаимодействуют с ним in vitro;

- стимулируют выработку специфических антител;

- увеличивают численность Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), В-лимфоцитов (CD 19), T-reg лимфоцитов (CD4/CD25/FoxP3);

- способствуют формированию протективной активности против стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди исследованных вакцинных штаммов S. aureus, только штамм №5 содержит spa ген, ответственный за синтез фактора патогенности — протеина А. Наиболее иммуногенные штаммы (№ № 1986 и 1991) не., содержат этот ген.

2. Антигенный препарат, полученный из биомассы вакцинных штаммов; S. aureus, выращенных при периодическом реакторном культивировании, по сравнению с препаратом из культур с плотной среды, содержит больше белка,, и полипептидных компонентов, меньше углеводов.

ТЬЯ2 (на модели эмбриональных клеток почки человека), усиливают экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов.

4. Установлена способность стафилококковых препаратов активировать адаптивный иммунитет с индукцией высокого уровня ^О-антител и повышением численности активированных Т и В лимфоцитов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1.

Иммунобиотехнология профилактических и терапевтических противостафилококковых препаратов

Стафилококковая инфекция - одна из важнейших проблем медицинской практики, поскольку Staphylococcus aureus является этиологическим фактором пиодермий, занимающих ведущее место в структуре кожной патологии, и различных гнойно-воспалительных заболеваний других органов и систем человека. Этот возбудитель отличается резистентностью к широкому спектру антибиотиков, а клиническое течение вызываемой им патологии характеризуется многообразием - от легких до тяжелейших, генерализованных форм: гнойно-воспалительные заболевания кожи (хронические и рецидивирующие формы пиодермий) и мягких тканей, стафилококковая инфекция со скарлатиноподобным синдромом, гинекологические заболевания, эндокардиты, энтероколиты, абсцессы внутренних органов, менингиты, сепсис, пневмонии, в том числе нозокомиальные, у больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких, и др. [22, 91].

Большую проблему представляют метициллинрезистентные штаммы S. aureus (MRSA), частота распространения которых у больных пиодермией и в некоторых отделениях реанимации, онкологии и гематологии в России превышает 50-60 %, что создаёт крайне серьёзные проблемы для терапии [38, 48]. Резистентность стафилококковых штаммов к метициллину - результат продукции изменённых пенициллинсвязывающих белков РВР2а, которые менее аффинны для большинства (З-лактамных антибиотиков. Этот белок локализуется на мембраносвязанной поверхности клетки и очень важен для биогенеза клеточной стенки, являясь медиатором перекрёстных связей пептидогликана [138]. О резистентности к ванкомицину ранее сообщалось только в отношении энтерококков [106], затем она была отмечена и у S. aureus - VISA: первый высокорезистентный к ванкомицину штамм S. aureus выделен в 2002 г [124]. У этих штаммов значительно толще клеточная стенка, что позволяет им удерживать больше ванкомицина, чем чувствительные штаммы, препятствуя его бактерицидному эффекту [76].

Проблема терапии антибиотиками осложнена не только значительной резистентностью возбудителя, но и тем, что многие антибиотики, обладая иммунодепрессивными свойствами, снижают защитные силы организма и в этих случаях способствуют колонизации высоко вирулентных и инвазивных госпитальных штаммов микробов. Это нередко ведет к формированию вторичных иммунодефицитных состояний, характеризующихся затяжным течением, хронизацией воспалительных процессов, повышением частоты обострений и осложнений [50, 59, 60]. Такие процессы определяют необходимость комплексной терапии стафилококковой инфекции, сочетающей использование бактериостатических препаратов и активаторов (корректоров) иммунной системы, влияющих, в первую очередь, на эффекторы врожденного иммунитета, осуществляющих процессинг и презентацию антигена Т-лимфоцитам, а, следовательно, через них - на формирование адаптивного иммунитета. Развитие резистентности S. aureus к антибиотикам стимулирует разработку вакцин [78].

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Игнатова, Ольга Михайловна

выводы

2. Определён состав полусинтетической питательной среды и показана возможность её использования, как и полноценной среды, для реакторного культивирования S. aureus; полученные антигенные препараты сопоставимы по специфической активности и действию на некоторые эффекторы врожденного иммунитета.

3. Впервые показано, что spa ген, ответственный за синтез протеина А, содержится в вакцинном штамме № 5, а наиболее иммуногенные штаммы (№ № 1986 и 1991), препараты из которых обеспечивают образование высокого уровня IgG антител, spa ген не содержат.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на многолетние исследования в области терапии и профилактики стафилококковой инфекции, S. aureus остаётся одной из основных причин как внебольничных, так и нозокомиальных инфекций, что в большой степени обусловлено снижением у таких больных защитных функций иммунной системы, в частности, по отношению к наиболее распространенным метициллинрезистентным штаммам S. aureus (MRSA). Разработанная в НИИВС им. И.И. Мечникова сухая стафилококковая бесклеточная вакцина, рекомендованная к применению в практике здравоохранения, оказывает длительный терапевтический эффект при включении её в комплексную терапию хронических стафилококковых инфекций [25, 38, 56]. Кроме того, эти же стафилококковые антигенные препараты входят в состав поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4®, которая детально охарактеризована по механизму действия на систему врождённого и адаптивного иммунитета [4, 28], однако роль стафилококковых антигенных препаратов в этом процессе оставалась неизученной. В связи с разработкой промышленных методов получения Иммуновак-ВП-4®, возникла необходимость изучения возможного влияния вводимых технологических изменений на иммуногенные свойства отдельных компонентов. Это особенно касается стафилококкового компонента, который может быть использован как монопрепарат. Скрининг штаммов S. aureus -продуцентов антигенных препаратов, проведенный для этой цели ещё в 80-е годы прошлого века, показал, что антигенные препараты из штаммов № № 1991 и 1986 обладали наиболее высокими протективными свойствами, а их сочетание с препаратами из штаммов № № 5 и 9 характеризовалось наиболее выраженной перекрёстной иммуностимулирующей активностью [34]. В течение последующих более 30 лет динамика иммунобиологических свойств этих штаммов не изучалась; необходимость в таких исследованиях возникла не только из-за длительности хранения, но и в связи с разработкой условий их реакторного культивирования и внесения изменений в методы выделения антигенных препаратов. Изменение фазы роста микроба и состава среды культивирования в значительной степени влияет на экспрессию факторов патогенности микроорганизма [23, 77, 95, 136]. Современные методы молекулярной биологии позволили провести определение в вакцинных штаммах гена, ответственного за синтез одного из основных факторов патогенности, а именно spa гена, кодирующего синтез протеина А. В результате проведенного исследования с применением LAMP-метода, spa ген выявлен только в вакцинном штамме S. aureus 5, одном из менее вирулентных и менее иммуногенных из использованных вакцинных штаммов, и в штамме № 6, используемом, как наиболее вирулентный, при изучении протективной активности полученных препаратов. Установлено также, что наиболее иммуногенные вакцинные штаммы № № 1991 и 1986, не содержащие белок А, обладают внутривидовой антигенной активностью: обеспечивают высокий уровень IgG-антител в сыворотках иммунизированных мышей, перекрёстно взаимодействующих между собой и с клеточной стенкой S. aureus Wood-46. Следовательно, отсутствие корреляции между наличием гена, ответственного за синтез белка А, вирулентностью и иммуногенностью штаммов, свидетельствует о том, что способность синтезировать протеин А не может быть показателем для выбора вакцинных штаммов. Полученные результаты согласуются с данными D.P. Greenberg с соавт. [88], показавшими, что специфические антитела к белку А не оказывают протективного эффекта на модели стафилококковой бактериемии новорожденных крыс.

Было показано (гл.1, п.2), что некоторые факторы патогенности стафилококка могут быть перспективными как потенциальные антигены для введения в вакцину [78, 80, 109, 153]. Всестороннее изучение вакцинных штаммов, в том числе определение генов, ответственных за синтез основных факторов патогенности, и выявление их возможных взаимосвязей с вирулентностью и иммуногенностью штаммов, может быть перспективным и в последующем способствовать определению критериев для отбора вакцинных штаммов при разработке противостафилококковых препаратов.

Поскольку до настоящего времени антигенные препараты стафилококка, входящие в бесклеточную стафилококковую вакцину, и в Иммуновак-ВП-4®, получали при культивировании штаммов на плотной питательной среде (что представляет трудоемкий, малопроизводительный и дорогостоящий процесс), обоснованным являлось использование современных технологических методов при получении антигенных препаратов стафилококка. Для получения большого количества биомассы в; настоящее время используют метод реакторного культивирования. Этот метод предполагает,, с одной стороны, использование помимо полноценных, синтетических и полусинтетических сред, с другой: — использование продуцентов в конце, экспоненциальной фазы роста, а не в стационарной фазе (как при выращивании на плотной питательной среде). В наших исследованиях, при реакторном культивировании биомассу инактивировали ацетоном после её отделения от среды микрофильтрацией, в отличие от биомассы, получаемой' непосредственно после смыва с поверхности агаровой среды, которую обрабатывают ацетоном без дополнительных технологических приёмов. Это обусловило необходимость исследования параметров выхода биомассы, и свойств выделенных антигенных препаратов.

Среды определённого состава, такие как синтетические и полусинтетические, предпочтительны при получении продуктов микробного синтеза, их использование является одним из факторов, способствующих получению стандартных целевых продуктов. В связи с этим было составлено 10 вариантов сред (из них 9 - полусинтетических, в которых сахарно-солевая среда Ледерберга [107] являлась солевой основой; к ней добавляли коммерческие компоненты - дрожжевой экстракт и аминопептид). По накоплению биомассы и продуктивности процесса культивирования оптимальной оказалась полусинтетическая питательная среда, в которой к солевой; основе добавлен дрожжевой экстракт (2 г\л) и увеличено (до 5 г\л) содержание глюкозы. Антигенный препарат, полученный при реакторном культивировании штамма № 1991 в этой среде, не отличался по специфической активности и способности активировать некоторые показатели врождённого иммунитета, от выделенного при выращивании штамма на полноценной среде, однако продуктивность процесса по накоплению биомассы в этих условиях и количество, полуфабриката («ацетонового порошка») для получения антигенного препарата были ниже. В связи с этим в исследованиях, предполагающих их последующую реализацию в производственных целях, при периодическом реакторном культивировании вакцинных штаммов S. aureus была использована полноценная питательная среда, что обеспечило высокую продуктивность по накоплению биомассы.

В антигенных препаратах, приготовленных после реакторного культивирования продуцентов, в сравнении с полученными из культур с плотной среды, при их сопоставимой специфической активности, выявлено большее содержания белка и полипептидных компонентов и меньшее содержание углеводов, в частности глюкозы и галактозы. Такие отличия можно объяснить тем, что при реакторном культивировании, с одной стороны, культуры в фазе экспоненциального роста находятся в физиологически активном состоянии и обладают высокими биосинтетическими свойствами, а с другой стороны, в выделенных препаратах отсутствуют углеводные примеси, обычно попадающие в препарат при смыве культур с плотной среды.

Иммунохимическое исследование препаратов, в частности на основании преципитации в геле позволило установить, что в их составе присутствуют компоненты, имеющие общие детерминанты с препаратами сравнения -поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами клеточной стенки S. aureus Wood-46, причём, наличие этих серологически активных компонентов было наиболее выражено в препаратах, полученных из культур, в конце фазы экспоненциального роста в условиях реакторного культивирования: в линейном иммуноэлектрофорезе только в этом препарате определены отрицательно заряженные серологически активные компоненты, а ракетный иммуноэлектрофорез показал, что содержание поверхностного полисахаридсодержащего комплекса S. aureus в препарате в 2,5 раза выше, чем в полученном после выращивания штаммов на плотной среде (в стационарной фазе роста).

Способность антигенных препаратов вызывать синтез специфических IgG-антител показана в ИФА, причём высокий уровень их выявлен в гомологичной (для препаратов, приготовленных при выращивании вакцинных штаммов на плотной среде и при реакторном культивировании, при сорбции на планшете соответствующих водных экстрактов), и в гетерологичной системе. Сравнительный анализ специфической активности антигенов, проведенный на основе торможения иммуноферментной реакции, выявил различия в уровне перекрёстной специфической активности, которая для препарата, полученного после реакторного культивирования, была в 2 раза больше в гетерологичной системе (57,1 % - при сорбции на планшете водного экстракта, полученного после выращивания на плотной среде), чем у препарата с плотной среды (28,6 % - при сорбции на планшете водного экстракта, полученного после реакторного культивирования). Следует подчеркнуть, что, несмотря на сопоставимость высоких титров IgG-антител в сыворотках мышей, иммунизированных обоими препаратами, выявлены различия в их протективной активности. Это согласуется с данными литературы об отсутствии корреляции между увеличением титров антител у животных под действием противостафилококковых препаратов и их протективной эффективностью [78, 89, 122, 130].

На молекулярно-клеточном уровне была изучена способность полученных антигенных препаратов активировать систему врожденного и адаптивного иммунитета. Было установлено, что, они стимулируют созревание дендритных клеток • - ключевых эффекторов врожденного иммунитета, которые приобретают способность представлять антиген Тлимфоцитам и активировать эффекторы адаптивного иммунитета. При этом выявлено, что антигенные препараты, полученные при реакторном культивировании вакцинных штаммов, по сравнению с приготовленными с плотной среды, в меньшей степени стимулировали процесс созревания ДК, что было показано по морфологическим данным, по сохранению большого количества незрелых ДК и высокого процента макрофагальной фракции. Выявленные особенности действия препаратов отмечены при получении ДК из клеток костного мозга мышей и из МЛПК доноров. Большая активность антигенного препарата, полученного после выращивания штаммов на плотной среде, как индуктора созревания ДК, подтверждена увеличением численности клеток, экспрессирующих костимулирующие (CD80, CD86), адгезивный (CD38) маркеры и молекулы антигенного представления (MHCII). Оба препарата при внутрибрюшинном введении усиливали фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей, однако активность препарата, полученного после реакторного культивирования (по ФИ, ФЧ и скорости запуска фагоцитоза), уступала активности препарата с плотной среды.

Стафилококковые антигенные препараты стимулировали экспрессию TLR2 на дендритных клетках, что не было отмечено при использовании классического индуктора созревания TNF-a. Это, вероятно, объясняется наличием в антигенных препаратах патоген-ассоциированных молекулярных структур (РАМР), являющихся агонистами толл-подобных рецепторов, и отсутствующих у TNF-a.

ДК, созревшие под влиянием антигенов штамма S. aureus 1986, защищали мышей от гомологичной инфекции в 15 % случаев, что подтверждает способность дендритных клеток предъявлять антигены Т-лимфоцитам, которые при этом дифференцируются в специфические клетки-эффекторы адаптивного иммунного ответа.

Профиль и уровень цитокинов, продуцируемых дендритными клетками, выделенных из МЛ мышей, и созревших под воздействием обоих исследованных препаратов, показал высокую активность зрелых ДК, синтезировавших большое количество TNF-a, IL-6, IL-ip, IL-12, что свидетельствовало о приобретении дендритными клетками свойств, необходимых для эффективной презентации антигена и примирования иммунного ответа.

Изучение функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов мышей и МЛПЕС доноров было проведено по определению цитотоксической активности MJI селезёнки к NK-чувствительной линии опухолевых клеток К562 на мышах ex vivo (после в\бр введения препаратов), in vitro (МЛ селезенок мышей, культивировали с антигенными препаратами, после отмывания вносили в клетки К562) и in vitro на мононуклеарных лейкоцитах периферической крови доноров. Это исследование выявило индукцию анализируемыми стафилококковыми препаратами киллерной активности как МЛ мышей, так и МЛПК доноров.

Анализ субпопуляционной структуры лимфоцитов мышей, иммунизированных в\бр исследуемыми антигенными препаратами, показал, что они повышают численность NK, TCR (Ту8-распознавание нативных антигенов) [101], CD19 (В-лимфоциты) (р<0,05). Процент клеток, экспрессирующих маркеры NKT (CD3/NK), T-reg (CD4/CD25/Foxp3), CD8, MHCII, CD5.2 (В 1-лимфоциты), TLR2 в большей степени повышался под действием препарата с плотной среды. Таким образом, препараты по исследованным маркерам в той или иной степени активировали Т-лимфоциты (CD3, CD4, CD8), NKT, В-лимфоциты. При этом на клетках экспрессировались как ранний (CD25), так и поздний (MHCII) маркер активации клеток.

В сыворотке вакцинированных мышей отмечено повышение уровня провоспалительных и регуляторных цитокинов (IL-ip, IL-2, IL-4, IL-5, GM-CSF, TNF-a и IFN-y) в период 2-8 часов, а к 24 часам уровень продукции снижался. Однако активность исследуемых препаратов отличалась в определенные интервалы времени: так, иммунизация препаратом с плотной среды индуцировала более раннюю активацию цитокинов, чем полученным после реакторного культивирования. В то же время в тесте активной защиты мышей протективная активность антигенного препарата, выделенного после реакторного культивирования штаммов, была выше, чем полученного при выращивании на плотной среде (ИЭ 13,2 и 3,1, соответственно). Вероятно, этот факт связан с различием в составе антигенных препаратов, полученных в разных условиях.

Некоторые различия, которые определены в отношении действия двух типов антигенных препаратов, позволяют предположить, что препараты, приготовленные на основе штаммов, выращенных на плотной среде, более выражено активируют эффекторы врождённого иммунитета, в отличие от препаратов, выделенных из штаммов после реакторного культивирования, которые в большей степени стимулируют адаптивные иммунные механизмы. В данном случае, возможно, определенную роль на формирование врожденного иммунитета оказывают углеводсодержащие компоненты питательной среды (декстрансульфаты, входящие в состав агаровых сред). В то же время активация адаптивного иммунитета, проявившаяся в высокой протективной активности антигенного препарата, полученного после реакторного культивирования продуцентов, обусловлена их активным физиологическим состоянием в" конце фазы экспоненциального роста, проявившимся, в частности, в увеличении содержания белка и спектра полипептиных компонентов, что требует дальнейшего исследования. Следует ' также подчеркнуть, что использование для реакторного культивирования полусинтетической питательной среды, хотя и приводит, в конечном счете, к меньшему выходу антигенного препарата, чем при росте на полноценной среде, однако, полученные препараты сравнимы не только по их специфической активности, но и по способности активировать некоторые эффекторы врожденного иммунитета (фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей, киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов и взаимодействовие с толл-подобным рецептором 2 на модели лейкоцитов и взаимодействовие с толл-подобным рецептором 2 на модели клеток эмбриональной почки человека). В связи с этим полусинтетическая среда может быть использована, когда главным является необходимость получения более очищенных препаратов.

В результате проведенных исследований подтверждена сохранность антигенных и иммуногенных свойств штаммов, используемых в экспериментально-производственных процессах в течение более 30 лет. Изучены антигенные препараты, приготовленные из штаммов S. aureus, при их реакторном культивировании в полноценной питательной среде, с последующей микрофильтрацией. Установлено, что полученные по такой технологии препараты, активируют врождённый и адаптивный иммунитет. Выявленные отличия между препаратами, выделенными из вакцинных штаммов после их реакторного культивирования и выращивания на плотной среде, не влияют на их антигенную и специфическую активность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Игнатова, Ольга Михайловна, Москва

1. Авербах М.М. Иммунологические аспекты чувствительности . и резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции. Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1995, 34 с.

2. Антитела. Методы. Кн. 2: Пер. с англ. Под ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991,384 с.

3. Ахматова Н.К. Молекулярные и клеточные механизмы действия иммуномодуляторов микробного происхождения на функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета. Автореф. дис. докт. мед. наук. 2006. 50 с.

4. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный. М., Практическая медицина, 2008, 255 с.

5. Ашмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL, Медгиз, 1962.

6. Барышников А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал. УРСС, 2002, 51 с.

7. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., Медицина, 1992, 192 с.

8. Бобровник С.А. Биологическая роль белка А стафилококков. Докл. АН УССР, 1985, 6 (10): 52-54.

9. Бобровник С.А. Иммуносупрессорная роль белка А стафилококка. Ж. микробиол., 1986, 8: 48 -52.

10. Бондаренко В.М. Острова патогенности бактерий. Ж. микробиол., 2001,4:67-74

11. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. Ж. микробиол., 1997, 4: 20-26.

12. Бондаренко В.М., Вертиев Ю.В. Факторы патогенности и токсигенности микроорганизмов. В «Руководстве по медицинской микробиологии. Кн. 1. Общая и санитарная микробиология», под. ред. Лабинской А.С и Волиной Е.Г. М., 2008: 422-447.

13. Борисова И.Э., Селезнева Т.С. Антигенный дрейф коклюшного микроба. Ж. эпидемиол. и вакцинопрофилактики, 2008, 1: 39-44.

14. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях. Дис. докт. мед. наук. М., 2009, 293 с.

15. Борисова О.Ю. Патогенные и молекулярно-биологические свойства штаммов C.diphtheriae, циркулирующих на территории России в течение 1994-1998 гг. Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1999, 29 с.

16. Волкова Е.Н, Бутов Ю.С., Морозов С.Г. К проблеме иммунопатогенеза гнойничковых заболеваний кожи. Вестн. дерматол. венерол., 2004, 1: 20-22.

17. Гинцбург А.Л., Зигангирова H.A., Романова Ю.М. Современной состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии. Ж. микробиол., 1999, 5: 22-26.

18. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999, 459 с.

19. Грубер И.М. Микробиологические аспекты биотехнологии ферментов сайт-специфической рестрикции и других продуктов биосинтеза. Автореф. дис. док. мед. наук. М., 1990. 44 с.

20. Грубер И.М., Николаева В.Б., Горбачев И.Д., Рощупкина М.Н. Влияние окислительно-восстановительного потенциала питательной среды на динамику процесса культивирования Bordetella pertussis. Ж. микробиол., 1993, 6: 11 13.

21. Дубинина Г.П., Перельман Е.В., Булк В.Ф., Ершова З.И., Варгина А.К., Винник A.JI. Рост и накопление протеина A Staphylococcus aureus А-676 на среде из непищевого сырья. Ж. микробиол., 1988, 9: 24 28.

22. Егорова Н.Б., Vymola F., Ефремова В.Н., Vrbova Е. Экспериментальное изучение препаратов для иммунотерапии стафилококковых инфекций. Ж. гигиены, эпидемиол., микробиол. и иммунологии, 1987, 31 (4): 489-496.

23. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафилококковой вакцины «Стафиловак». Ж. микробиол., 2008, 6: 102-108.

24. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Кузьмина JI.A. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомопнентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов. Ж. микробиол., 1997, 6: 96-101.

25. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Петрухин И.С. Клиническое испытание антигенного комплекса стафилококка, полученного методом водной экстракции (реактогенность, клиническая эффективность, иммуногенность). Ж. микробиол., 1982, И: 18-21.

26. Ефремова В.Н., Егорова Н.Б. Токсичность и протективная активность комплексного антигена стафилококка, полученного методом водной экстракции. Ж. микробиол., 1978, 12: 59-63.

27. Ефремова В.Н., Егорова Н.Б., Масюкова С.А. Бесклеточная антистафилококковая вакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции. Патент РФ на изобретение, № 2122862 от 10.12.1998.

28. Зорин H.A., Белогорлова Т.Н. Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов методом ракетного иммуноэлектрофореза. Лаб. дело, 1983, 12: 30-33.

29. Киселевский М.В., Халтурина Е.О. «Трансфер фактор плюс» в лечении больных раком желудка. Научно-практич. конф. с междунар. участием «Иммунореабилитация при инфекционно-воспалительных заболеваниях». Сб. докл., 2003, 33-38.

30. Комбарова С.Ю. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг вохбудителя дифтерийной инфекции. Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 2007, 49 с.

31. Корзая Л.И. Исследование иммунологических свойств комплекса водорастворимых антигенов, полученного из разных штаммов стафилококка. Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1982, 24 с.

32. Курбатова Е.А. Разработка поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (экспериментальное и клинико-иммунологическое исследование). Дис. докт. мед. наук. М., 1997,303 с.

33. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Применение топических иммуномодуляторов в группе длительно и часто болеющих детей. В кн.: Иммунокоррекция в педиатрии под ред. М.П.Костинова. М., 2001: 91-99.

34. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г., Гаращенко Т.И. Механизм действия и эффективность бронхомунала в группе длительно и часто болеющих детей. Иммунология, 1999, 6: 56-59.

35. Масюкова С.А., Ефремова В.Н., Федоров С.М. Вакцинотерапия больных хронической пиодермией сухой бесклеточной стафилококковой вакциной. Вестн. дерматол. венерол., 1993, 4: 64-68.

36. Медуницын Н.В. Вакцинология. М., 1999, 272с.

37. Менделенко М.М. Влияние лимфоцитофереза на динамику субпопуляционного состава лимфоцитов у больных бронхиальной астмой. Иммунология, 1998, 3: 52-54.

38. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н, Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. М.: Медицина. 1987,368 с.

39. Михайлов А.Т., Смирский В.Н. Метод иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство). М.: Наука. 1991, 228 с.

40. Мокроносова М.А., Ляпорова Т.В., Сергеев A.B. и др. Клинические и иммунологические изменения у больных с атопическим дерматитом при терапии анатоксином стафилококковым очищенным. Ж. микробиол., 2004, 1: 71-74.

41. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н. Особенности строения и функционирования иммунной системы желудочно-кишечного тракта. Аллергол. иммунол., 2002, 3 (2): 282-292.

42. Остерман Л.А. Метод исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981, 286 с.

43. Практическая химия белка. Пер. с англ. Под ред. А.Дарбе. М: Мир, 1989, 623 с.

44. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. М., 2002: 23.

45. ПУР №04863057-80-10 «Иммуновак-ВП-4® » 2010.

46. Семенов Б.Ф. Терапевтические вакцины. Российские медицинские вести, 2000, 5 (3): 26-32.

47. Семенов Б.Ф., Киселевский М.В., Семенова И.Б., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Ахматова Н.К. Клеточные и молекулярные события при введении поликомпонентной бактериальной вакцины и заражении S. typhimurium. Молек. мед., 2005, 4: 48-54.

48. Семёнова И.Б. Закономерности коррекции вторичных иммунодифицитов иммуномодуляторами (на примере анатоксина стафилококкового очищенного и ликопида). Дис. докт. мед. наук. М., 2004, 260 с.

49. Сепиашвили Р.И. Славянская Т.А. Фенотипические особенности лимфоцитов крови больных ревматоидным артритом. Rus. J. Immunol., 1999,4: 143-147.

50. Сидорова E.B. Королевство B-лимфоцитов. Мед. иммунология, 2004, 6(3-5): 176-185.

51. Симонова A.B., Лиознер Л.А., Сидоренко И.В. Анализ субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии в разных группах доноров. Иммунология, 1998, 6: 72-75.

52. Сорокина Е.В. Бактериальные вакцины в терапии хронической пиодермии. Автореф. дис. канд.мед.наук. М., 2006, 26 с.

53. Таточенко В.К., Озерецковский H.A., Федоров A.M. Иммунопрофилактика-2009 (Справочник 9-е издание, дополнительное). М., 2009, 174 с.

54. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология: Учебник. 3-е изд. - М.: «Издательство «Медицина», 2010.-752 с.

55. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение. Иммунология, 2003, 4: 196-203.

56. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирующей терапии. Аллергия, астма и клинич. Иммунология, 2000, 1: 9-15.

57. Хейфец Л.Б. Итоги изучения вакцин против брюшного тифа в четырёх контролируемых полевых опытах в СССР. Бюллетень ВОЗ, 1965, 32 (1): 5-19.

58. Чикилева И.О., Халтурина Е.О., Киселевский М.В. Современные подходы и направления в иммунотерапии и иммунопрофилактике злокачественных новообразований. Молек. мед. 2003, 2: 40-47.

59. Шутова А.А., Мордвинова Н.Б. Оценка метода иммунизации беременных стафилококковым анатоксином для профилактики гнойно-септических заболеваний новорожденных. В сб. научн. тр. МНИИЭМ «Острые детские инфекции». М., 1978, 89-92.

60. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В. Микоплазменная инфекция N.arginini ведет к конститутивной активации NF-kB и подавлению апоптоза в клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы TLR2/6. Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 2008, 4: 6 -10.

61. Юсупова Р.Ш., Сибиряк С.В., Каюмова Э.Ю., Сибиряк Д.С. Экспрессия Fas-антигена на лимфоцитах периферической крови и антиген специфический апоптоз лимфоцитов при туберкулезе легких. Мед. иммунология, 2000, 2 (2): 205-206.

62. Ястребова Н.Е. Разработка и изучение диагностических возможностей иммуноферментных тест-систем на основе антигенных препаратов золотистого стафилококка и ДНК. Дис. канд. мед. наук. М., 1987, 144 с.

63. Ястребова Н.Е. Система для мониторинга антител к условно патогенным бактериям и аутоантител. Опыт ее применения. Дис. докт. мед. наук. М., 2007, 239 с.

64. Adlam С., Ward P. D., Arbuthnott А. С., Arbuthnott J. P., Thorley С. N. Effect of immunization with highly purified alpha- and beta-toxins on staphylococcal mastitis in rabbits. Infect. Immun., 1977, 17: 259-263.

65. Baddiley J. Teichoic acid in walls and cells of grampositive bacteria. Fed. Proc., 1962,21: 1084-1088.

66. Banchereau J. Immunobiology of dendritic cells. Ann. Rev. Immunol., 2002, 18:767-811.

67. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 267: 95 99.

68. Cassiday P., Sanden G., Heuvelman K., Mooi F., Bisgard K.M., Popovic T. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factor in the United States, 1935-1999. J. Infect. Dis., 2000, 182: 1402 1408.

69. Cheung A.L., Bayer A.S., Zhang G., Gresham H., Xiong Y-Q. Regulation of virulence determinations in vitro and in vivo Staphylococcus aureus. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004, 40: 1-9.

70. Cheung A.L., Projan S.J., Edelstein R.E., Fischetti V.A. Cloning, expression and nucleotide sequence of Staphylococcus aureus gene (fbpa) encoding a fibrinogen-binding protein. Infect. Immun., 1995, 63: 19141920.

71. Dassy В., Stringfellow W.T., Lieb M., Fournier J.M. Production of type 5 capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus grown in semi-synthetic medium. J. Gen.Microbiol. 1991, 137(5): 1156-1162.

72. Daum R.S. Staphylococcus aureus vaccines. Руководство «Vaccines», Eds.: Plotkin S.A., Orenstein W.A., Offit P.A. Elsevier, 2008: 1307-1315.

73. Dibois M., Gilles K.A., Hamilton Y.K., Reber P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analit. Chem., 1956, 28:350-356.

74. Fattom A.L., Sarwar J., Ortiz A., Naso R. Staphylococcus aureus capsular polysaccharide vaccine and CP-specific antibodies protect mice against bacterial challege. Infect. Immun., 1996, 64 (5): 1659-1665.

75. Fields R.D., Lancaster M.V. Dual attribute continuous monitoring of cell proliferation/cytotoxity. Americ. Biotechnol. Laborat., 1996, 11(4): 48-50.

76. Fontenot J.D., Rasmussen J.P., Williams L.M., Dooley J.L., Farr A.G., Rudensky A.Y. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity, 2005, 22: 329-341.

77. Foster Т., Hook M. Surface protein adhesions of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol., 1998, 6: 484-488.

78. Gandon S., MacRinnon M., Nee S., Read F. Imperfect vaccines and the evolution of the pathogen virulence. Nature, 2001, 414 (6865): 751-756.

79. Garcia V.E., Gomes M.I., Sanjuan N. Intramammary immunization with live-attenuated Staphylococcus aureus: microbiological and immunologicalstudies in a mouse mastitis model. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1996, 14: 45-51.

80. Georgantas R.W., Leong K.W., August J.T. Antigen-spesific induction of peripherial T cell tolerance in vivo by codelivery of DNA vectors encoding antigen and Fas ligand. Hum. Gene Ther., 2000, 11: 851-858.

81. Gomes M.I., Sordelli D.O, Buzzola F.R, Garcia V.E. Induction cellmediated immunity to Staphylococcus aureus in the mouse mammary gland by local immunization with a live attenuated mutant. Infect. Immun., 2002, 70: 4254-4260.

82. Greenberg D.P., Bayer A.S., Cheung A.L., Ward J.L. Protective efficacy of protein A-specific antibody against bacteremic infection due to Staphylococcus aureus in an infant rat model. Infect. Immun., 1989, 57: 1113-1118.

83. Greenberg D.P., Ward J.L., Bayer A.S. Influence of Staphylococcus aureus antibody on experimental endocarditis in rabbits. Infect. Immun., 1987, 55: 3030-3034.

84. Immunoelecrophoretic techniques with the LKB 2117// Multiphor. 1978: 12

85. Iwatsuki K., Yamasaki O., Morizane S., Oono T. Staphylococcal cutaneous infections: invasion, evasion and aggression. J. Dermatol Sci., 2006, 42(3): 203-214.

86. Joh D., Wann E.R., Kreikemeyer B., Speziale P., Hook M. Role of fibronectin-binding MSCRAMMs in bacterial adherence and entry into mammalian cells. Matrix Biol, 1999, 18: 211-223.

87. Josefsson E., Hartford O., O'Brien L., Patti J.M., Foster T. Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J. Infect. Dis., 2001, 184: 1572-1580.

88. Karakawa W.W., Sutton A., Schneerson R., Karpas A, Vann W.F. Capsular antibodies induce type-specific phagocytosis of capsulated Staphylococcus aureus by human polymorphonuclear leucocytes. Infect. Immun., 1988, 56 (5): 1090-1095.

89. Karas M., Bachmann D., Bahr D., Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. Int. J. Mass Spectrom. IonProc., 1987, 78: 53-68.

90. Kaufmann S.H.E., Schaible U.E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Curr. Opin. Immunol., 2005, 17: 79-87.

91. Kawakami K. Regulation by innate immune T lymphocytes in the host defense against pulmonary infection with Cryptococcus neoformans. Jpn. J. Infect Dis., 2004, 57(4): 137-145.

92. Kronenberg M. Toward an understanding of NKT cell biology: progress and paradoxes. Ann. Rev. Immunol., 2005, 23: 877-900.

93. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature., 1970, 227: 680-685.

94. Leclercq R., Derlot E., Weber M., Duval J., Courvalin P. Transferable vancomycin and teicoplanin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33: 10-15.

95. Lederberg J. The nutrition of Salmonella. Arch. Biochem., 1950 13 (2): 287-290.

96. Lee J.C. The prospects for developing a vaccine against Staphylococcus aureus. Trends Microbiol., 1996, 4: 162-166.

97. Lee J.C., Park J.S., Shepherd S.E. Carey V., Fattom A. Protective efficacy of antibodies to the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide in a modified model of endocarditis in rats. Infect. Immun. 1997, 65 (10): 4146-4151.

98. Lotze M.T., Thomson A.W. Dendritic cells. Biology and clinical applications. 1999, 14-237.

99. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193 (1): 265-275.

100. Lyon G.J., Wright J.S., Muir T.W., Novick R.P. Key determination of receptor activation in the agr autoinducing peptides of Staphylococcus aureus. Biochemistry. 2002,41 (31): 10095-10104.

101. Maul J. Stimulation of immunoprotective mechanisms by OM-85 BV. Respiration,1994, 61 (Suppl. 1): 8-15.

102. McDevitt D, Francois P., Vaudaux P., Foster T.J. Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol., 1994, 11: 237-248.

103. McKenney D., Hubner J., Muller E., Wang Y., Goldmann D.A., Pier G.B. The ica locus of Staphylococcus epidermidis encodes production of the capsular polysaccharide/adhesion. Infect. Immun., 1998, 66: 4711-4720.

104. McKenney D., Pouliot K.L., Wang Y., Murthy V., Ulrich M., Döring G., Lee J.C., Goldmann D.A., Pier G.B. Broadly protective vaccine for Staphylococcus aureus based on an in vivo-expressed antigen. Science, 1999,284:1523-1527.

105. Medzhitov R., Janeway Jr. C.A. Innate immune induction of the adaptive immune response. Cold spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2002, 64: 429435.

106. Meroni P.L., Barcellini W. In vivo and in vitro effects of a new immunomodulating agent (biostim) on human lymphocytes. Abstr. of the third Intern. Confer. On Immunopharmacol. Pergamon Press, Intern. J. of Immunopharmac., 1985, 7 (3): 368.

107. Nemeth J., Lee J.C. Antibodies to capsular polysaccharides are not protective against Staphylococcus aureus endocarditis. Infect. Immun., 1995, 63 (2): 375-380.

108. Nilsson I. M, Patti J.M, Bremeil T., Hook M., Tarkowski A. Vaccination with a recombinant fragment of collagen adhesion provides protection against Staphylococcus awrews-mediated septic death. J. Clin. Invest., 1998, 101:2640-2649.

109. Noble W. C., Virani Z., Cree R. G. Co-transfer of vancomycin and other resistance genes from Enterococcus faecalis NCTC 12201 to Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett., 1992, 72: 195-198.

110. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Research., 2000, 28 (12): 63 (i-vii).

111. Nour El-Din A., Shkreta L., Talbot B.G., Diarra M.S., Lacasse R DNA immunization of dairy cows with the clumping factor A of Staphylococcus aureus. Vaccine, 2005, 24 (12): 1997-2006.

112. Ouchterlony O. Diffusion in gel methods for immunological analisis. Progr. Allerg., 1958, 1: 1-78.

113. Palmqvist N, Silverman G.J, Josefsson E.,Tarkowski A. Bacterial cell wall-expressed protein A triggers supraclonal B-cell responses upon in vivo infection with Staphylococcus aureus. Microbes Infect., 2005, 7 (15): 1501-1511.

114. Peacock S J., Moore C.E., Justice A., Kantzanou M., Story L., Mackie K., O'Neill G., Day N.P. Virulent combinations of adhesion and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus. Infect. Immun., 2002, 70 (9): 4987-4996.

115. Poole-Warren L.A., Hallett M.D., Hone P.W., Burden S.H., Farrell P.C. Vaccination for prevention of CAPD-associated staphylococcal infection: results of a prospective multicentre clinical trial. Clin. Nephrol., 1991, 35: 198-206.

116. Pragman A.A., Yarwood J.M., Tripp T.J., Schlievert P.M. Characterization of virulence factor regulation by SrrAB, a two-component system in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 2004, 186 (8): 2430-2438.

117. Preston G.M., Hauboldt B., Rainey P.B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implication for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Op. Microbiol. 1998, 589-597.

118. Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Ann. Rev. Immunol., 2004, 22: 531—562.

119. Schennings T., Heimdahl A., Coster K., Flock J.I. Immunisation with fibronectin-binding protein from Staphylococcus aureus protects against experimental endocarditis in rats. Microb. Pathogen., 1993, 15: 227-236.

120. Seidl R., Stucki M., Ruegg M., Goerke Ch., Wolz Ch., Harris L, Berger-Bachi B., Bischoff M. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance . Antimicrob. Agents Chemother., 2006, 50 (4): 1183 1194.

121. Shkreta L., Talbot B.G., Diarra M.S., Lacasse P. Immune responses to a DNA / protein vaccination against Staphylococcus aureus induced mastitis in dairy cows. Vaccine, 2004, 23: 114-126.

122. Sibiryak S., Muldashev E., Selsky N., Yusupova R. Fas (APO-1/CD95) antigen expression on the peripherial blood lymphocytes (PBL) in different disease states. 4th World cong. Inflammation. Paris, 1999: 245.

123. Sieg S.F., Rodriguez B., Asaad R., Jiang W., Bazdar D.A., Lederman M.M. Peripheral S-phase T cells in HIV disease have a central memory phenotype and rarely have evidence of recent T cell receptor engagement. J. Infect. Dis., 2005, 92(1): 62-70.

124. Singh A.K., Yang J.Q., Parekh V.V., Wei J., Wang C.R., Joyce S., Singh R.R., Van K.L. The natural killer T cell ligand alpha-galactosylceramide prevents or promotes pristane-induced lupus in mice. Eur. J. Immunol., 2005,35(4): 1143-1154.

125. Sutherland I. W., Wilkinson J. F. Chemical extraction methods of microbial cells. In Methods in Microbiology, vol. 5B, (eds. J. R. Norris and D. W. Ribbons), Academic, New York, 1971: 345-383.

126. Takeuchi O., Kawai T., Muhlradt P.F., Morr M., Radolf J.D., Zychlinsky A., Takeda K., Akira S. Discrimination of bacterial lipoproteins by Tolllike receptor 6. Int. Immunol., 2001, 13: 933-940.

127. Tanaka F., Hashimoto W., Okamura H., Robbins P.D., Lotze M.T., Tahara H. Rapid generation of potent and tumor-specific cytotoxic T lymphocytes by interleukin 18 using dendritic cells and natural killer cells. Cancer Res., 2000, 60(17): 4838-4844.

128. Towbin H., Stachelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poliacrylamide gel to nitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1979, 76: 4350-4354.

129. Walsh S.R., Bhardwaj N., Ganahi R.T. Dendritic cells and the promomise of therapeutic vaccines for human immunodeficiency virus (HIV). Carrent HIV Research., 2003, 1: 205-216.

130. Wong K.H., Barrera O., Sutton A., May J., Hochstein D.H., Robbins J.D. Standartization and control of meningococcae vaccine, groupA and group C polysaccharides. J. Biol. Standart., 1977, 5: 197-215.

131. Zagar S., Lofler-Badzek D. Broncho—Vaxom in children with rhinosinusitis. A double-blind clinical trial. ORL., 1988, 50: 397^104.

Информация о работе

Игнатова, Ольга Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы