Серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих у детей в различных регионах России

Чагарян, Аида Нуримановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих у детей в различных регионах России
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих у детей в различных регионах России"

Ня права::рукописи

ЧАГАРЯН АИДА КУРИМАНОВНА

РОТИПЫ 11 АНТИБИОТШСОРЕЗКСТЕНТНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ И ЗООЛРИНГЕАЛЬИЫХ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, i i 1'КУЛ ИРУ Ю1ЦИХ У ДЕТЕЙ Е РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ

03.02.03 - •.^-"-биология АВТОРЕФЕРАТ

> ■.

лнсосргапмя ка со,'.екание ученой степсам кандидат бк-хтогеческих наук

25 СЕН 2014

Москва - 20! 4

005552797

Работа выполнена в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Козлов Роман Сергеевич Официальные оппоненты:

Тартаковский Игорь Семенович - доктор биологических наук, профессор, руководитель лабораторией легионеллеза ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Сидоренко Сергей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, руко водитель отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии человек ФГБУ «Научно-исследовательский институт детских инфекций» ФМБА России.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Мини стерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «03» октября 2014 г. в 11. 00 ч. на заседании диссертацион ного совета Д 208.130.01 ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпиде миологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Мини стерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, ул. Гама леи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетно го академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социальног развития Российской Федерации и на сайте института www.gam3leva.org

Автореферат разослан «02» сентября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного сов

доктор медицинских наук, профессор

Актуальность проблемы. Streptococcus pneumoniae является одним из основных возбудителей менингита, острого среднего отита, риносинусита, внебольничной пневмонии в различных возрастных группах населения. Особую опасность пневмококковая инфекция представляет для детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц с хроническими патологиями. Известно, что частота пневмококковой колонизации достигает пика к 2-3 годам. Новорожденные дети получают от матери антитела к пневмококкам многих серотипов, дающие определенную степень защиты от инфицирования. По мере снижения уровня материнских антител заболеваемость пневмококковой инфекцией взрывоподобно повышается со 2-го полугодия жизни ребенка [Платонов, 2006, Сидоренко, 2010].

Ежегодно в мире от пневмонии, вызванной S. pneumoniae, умирает 1 млн. детей младше 5 лет. В развивающихся странах пневмококковые инфекции вызывают до 11 млн. летальных исходов в год [Feikin, 2002].

По экспертным оценкам в России ежегодно пневмококковой септицемией заболевает около 9000 детей, пневмококковой пневмонией - около 85000 детей, отитами пневмококковой этиологии - свыше 713000 детей в возрасте до 5 лет [Mayanskiy, 2013]. Согласно данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заболеваемость пневмониями в 2012 г. среди детей от 0 до 17 лет составила 168718 случаев или 639,5 на 100000 населения, при этом до 34,5% пневмоний приходится на долю детей в возрасте до 2 лет, максимальный уровень заболеваемости отмечен в возрасте 611 мес. и 12-23 мес. Следует отметить, что регистрируются далеко не все случаи пневмоний из-за дефектов и трудностей этиологической диагностики.

Исходя из химического строения и антигенных свойств полисахаридной капсулы пневмококков выделяют 46 серогрупп и более 90 серотипов, число которых постоянно увеличивается. Полисахаридная капсула является главным фактором вирулентности микроорганизма. Во многих исследования было показано, что она во время инфекции способствует нарушению фагоцитоза пневмококков полиморфноядерными лейкоцитами [Bentley, 2006].

Важнейшими в медицинском отношении особенностями разных серогрупп пневмококков являются их различная территориальная распространенность, а также степень вирулентности для отдельных возрастных и социально-этнических групп населения. Не все серотипы являются одинаково патогенными, и большинство пневмококковых инфекций связаны с ограниченным числом серотипов. Спектр превалирующих капсульных типов меняется в зависимости от возраста и географического региона, хотя общие серотипы постоянно обнаруживаются во всех странах мира [Mcintosh, 2011]. В мировых масштабах на долю примерно 20 серотипов приходится более 80% случаев инвазивных пневмококковых инфекций во всех возрастных группах; 13 наиболее часто встречающихся серотипов ответственны не менее чем за 70-75% случаев инвазивной инфекции у детей.

Еще одна биологическая особенность пневмококков, имеющая важное медицинское значение - наличие корреляции между серогрупповой принадлежностью, устойчивостью к антибиотикам и патогенным потенциалом, т. е. способностью колонизировать носоглотку, вызывать локальную или инвазивную инфекцию.

Во всем мире вызывает тревогу ежегодно увеличивающийся объем назначаемых антибиотиков, и, как следствие - распространение отдельных серо-типов, характеризующихся множественной лекарственной резистентностью. При этом предупреждение распространения устойчивости к антибиотикам среди штаммов пневмококков, выделяемых от больных или носителей, затруднено [Klugman, 1990, Syrjanen, 2001].

Поэтому специфическая профилактика, основанная на использовании вакцин, в состав которых входят наиболее актуальные серотипы пневмококка, способствует не только снижению заболеваемости, но и ограничению циркуляции устойчивых к антибиотикам пневмококков.

В современных условиях для профилактики инфекций, вызванных S. pneumoniae, в мире применяют вакцины двух типов - полисахаридную вакцину (в состав входят 23 серотипа) и 3 конъюгированные вакцины (7-, 10- и 13-валентную конъюгированную вакцину (ПКВ7, ПКВ10 и ПКВ13) [Mcintosh, 2011]. Конъюгированные вакцины различаются количеством серотипов пневмококка, белком-конъюгатом и количеством полисахарида для каждого конъю-гата. Во многих странах, в том числе и в России, полисахаридная вакцина рекомендуется для вакцинации лиц старше 65 лет и для лиц от 2 до 64 лет с повышенным риском развития пневмококковых инфекций. Основным недостатком полисахаридной вакцины является ее низкая эффективность среди детей первых 2 лет, так как капсульный полисахарид является тимус-независимым антигеном, не формирует иммунологической памяти и практически не иммуно-генен для детей первых лет жизни. Поэтому в настоящее время используют так называемые конъюгированные пневмококковые вакцины (ПКВ), в которых ти-поспецифический полисахарид соединен с белковым носителем (дифтерийным или столбнячным анатоксинами, протективными белками других патогенов) [Костюкова H.H., Бехало В.А., 2014]. С 1 января 2014 года предусмотрено включение вакцинации против пневмококка в Национальный календарь прививок Российской Федерации.

Исследования, проведенные во многих странах мира, показали, эпидемиологическую эффективность массового применения ПКВ7 вакцины для профилактики инвазивных пневмококковых инфекций у детей младше 5 лет. Одновременно с этим существенно снизился и уровень носительства S. pneumoniae, что способствовало снижению заболеваемости пневмококковой инфекцией у не привитых детей и взрослых [Макинтош, Е.Д. 2009].

Вместе с тем, на фоне снижения заболеваемости инфекциями, вызываемыми «вакцинными» серотипами, отмечается возрастание роли «невакцинных» серотипов [Huang, 2009, Jefferics, 2010].

Таким образом, постоянное появление новых серогрупп пневмококков, замещение существующих серотипов в условиях широкомасштабной вакцино-профилактики определяют актуальность постоянного надзора, позволяющего своевременно выявлять изменение состава серотипов и устойчивости к антибиотикам у пневмококков.

Цель работы - изучить серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России, для усовершенствования подходов к эмпирической и этиотропной терапии пневмококковой инфекции и к оптимизации специфической профилактики пневмококковой инфекции.

Задачи исследования:

1. Создать коллекцию клинических и назофарингеальных штаммов пневмококков, циркулирующих в различных регионах России за период с 2004 по 2013 гг., у детей в возрасте до 5 лет, для выявления распространенности серотипов и антибиотикорезистентности штаммов S. pneumoniae.

2. Провести серологическое и молекулярное типирование штаммов S. pneumoniae и выявить доминирующие изоляты, циркулирующие у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России.

3. Провести оценку чувствительности штаммов пневмококка с целью выявления потенциальной связи между серотипом и уровнем резистентности.

4. Оценить соответствие серотипов S. pneumoniae, входящих в состав зарегистрированных в РФ 7-, 10- и 13- валентных конъюгированных вакцин, с сероти-пами пневмококков, циркулирующих в различных регионах России у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковой инфекции.

Научная новизна.

В представленной работе впервые:

1. Определены ведущие серотипы пневмококка, циркулирующие у здоровых детей и детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций, в возрасте до 5 лет в 18 городах Российской Федерации и входящие в состав пневмококковых вакцин.

2. Установлено, что большинство вакцинных серотипов пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, были выявлены у штаммов, характеризующихся антибиотикоустойчивостъю к пенициллину, эритромицину, клинда-мицину, тетрациклину и ко-тримоксазолу (триметоприму/сульфаметоксазолу).

3. Выявлено соответствие серотипов изученных штаммов пневмококка с серо-типами, входящими в состав 7-, 10-, 13- валентных конъюгированных пневмококковых вакцин, что обосновывает целесообразность вакцинопрофилак-тики пневмококковой инфекции.

Практическая значимость результатов

Результаты исследования позволили выявить распространение серотипов и чувствительность к антимикробным препаратам штаммов S. pneumoniae, цирку-

лирующих у детей в возрасте до 5 лет на территории РФ, что позволяет сформировать рекомендации по оптимизации терапии и вакцинных препаратов для специфической профилактики пневмококковых инфекций.

Использование в работе методов серологического типирования групповыми диагностическими сыворотками и молекулярного типирования методом ПЦР, позволяет выявлять все серотипы, включенные в пневмококковые вакцины, а также, невакцинальные серотипы, встречающиеся на территории РФ.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты исследований были использованы как рекомендации при принятии Федерального закона о включении в национальный календарь профилактических прививок конъюгированных пневмококковых вакцин для иммунизации детей с 7 до 9 месяцев на территории Российской Федерации (Федеральный закон от 21.12. 2013 г. №368 (О внесении изменений в ст.9 Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней»).

Результаты исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Резистентность пневмотропных микроорганизмов в Хабаровском крае и алгоритм антимикробной терапии внебольничных пневмоний у детей» (Хабаровск, 2011), утвержденных Министерством здравоохранения Хабаровского края, ХФ ДНЦ ФПД СО РАМ НИИ ОМИД.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, клинической фармакологии, кафедры госпитальной педиатрии с курсом неона-талогии ФПК и ППС ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России, лаборатории ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и используются в программах циклов повышения квалификации врачей - бактериологов и семинарах для практических врачей, проводимых в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.

Схемы типирования пневмококков с использованием пуловых и групповых диагностических сывороток PNEUMOTEST-LATEX (StatensSerum Institut, Копенгаген, Дания) внедрены в практику работы микробиологической лаборатории НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.

Связь работы с научными программами. Диссертация выполнена по плану НИР ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России (№ гос. регистрации ВНТИЦ 01200951949).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На территории РФ у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинва-зивными формами пневмококковых инфекций в возрасте до 5 лет, циркулируют «вакцинные» серотипы пневмококка, которые характеризуются известной высокой частотой распространенности штаммов резистентных к антибиотикам разных групп: пенициллину, эритромицину, клиндамицину, ко-тримоксазолу и терациклину.

2. Выявленная высокая степень корреляции серотипов S. pneumoniae, циркулирующих у детей, с серотипами, входящими в состав конъюгированных

пневмококковых вакцин, позволяет рекомендовать их включение в календарь профилактических прививок Российской Федерации.

3. Пенициллины, макролиды и линкозамиды сохраняют высокую активность в отношении пневмококков и могут рассматриваться в качестве препаратов выбора для терапии пневмококковых инфекций различной локализации.

4. Использование комбинации методов серологического типирования групповыми диагностическими сыворотками и молекулярного типирования методом ПЦР позволяет выявлять все серотипы, включенные в 7-, 10- , 13-валентные конъюгированные вакцины, а также большинство, встречающихся на территории РФ невакцинальных серотипов.

Апробация работы. Результаты исследования представлены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2011, 2013); XIX, XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012, 2013); на XIII, XIV, XV Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2011, 2012, 2013); на XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012); на VII национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2012); на межрегиональном саммите по проблеме пневмококковой инфекции (Киев, 2013); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, факультетской терапии, ЦНИЛ, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области» и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2012); 7 World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (WSPID) (Melbourne, Australia, 2011); 52 Annual Meeting of the European Society for Paediatric Research (Great Britain, Newcastle, 2011); European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseaes (Berlin, Germany, 2013); апробация диссертации состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, биологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (протокол № 19 от «27» сентября Смоленск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 - в рекомендованных ВАК журналах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты, обсуждение), выводы, практические рекомендации и список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами. Список литературы состоит из 222 источников, из них 42 отечественных и 180 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Центры-участники. Штаммы S. pneumoniae были выделены у детей-носителей из детских домов и детей, посещающих детские сады, а также у детей с острым средним отитом, пневмонией и инвазивными инфекциями (менингит, сепсис).

Исследование проводилось в 103 центрах 18 городов в 9 федеральных округах РФ:

• Сибирский федеральный округ (Новокузнецк, Новосибирск - 7 центров,

Иркутск - 6 центров);

• Северо-Западный федеральный округ (Санкт-Петербург - 11 центров);

• Уральский федеральный округ (Екатеринбург - 8 центров, Тюмень - 5

центров);

• Дальневосточный федеральный округ (Владивосток - 7 центров, Хаба-

ровск - 7 центров);

• Чукотский федеральный округ (Анадырь - 6 центров);

• Южный федеральный округ (Волгоград - 5 центров);

• Приволжский федеральный округ (Казань - 6 центров, Уфа - 4 центра);

• Северо-Кавказский федеральный округ (Ставрополь - 1 центр). Выделение и идентификация штаммов. Всего исследовано 582 штамма

S. pneumoniae, полученных от детей в возрасте до 5 лет. В каждом центре проводился отбор последовательных клинически значимых штаммов, а также штаммов, выделенных из назофарингеальных мазков у детей из детских домов и детских садов (табл. 1).

Таблица 1

Штаммы S. pneumoniae, включенные в исследование (п=582)

Носительство, п (%) Клинический материал, п=276

Неинвазивные, п (%) Инвазивные, п (%)

Пневмонии осо

306 (52,5) 223 (38,3) 39 (6,7) 14 (2,4)

Выделение и идентификация штаммов в центрах производилась в соответствии с принятой на местах практикой. Транспортировка штаммов в центральную лабораторию (НИИАХ, г. Смоленск) осуществлялась на модифицированной среде Дорсэ. В центральной лаборатории для субкультивирования 5. pneumoniae использовали колумбийский агар (bioMerieux, Франция) с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови. Инкубация проводилась в атмосфере с повышенным содержанием СО? (5%) при температуре +35 °С в течение 24 ч. Реидентификация пневмококков осуществлялась на основе таких

признаков, как морфология колоний на кровяном агаре, наличие а-гемолиза, чувствительности к оптохину, лизиса в присутствии солей жёлчных кислот с 10% раствором дезоксихолата натрия (Sigma, США), положительных результатов латекс-агглютинации с использованием набора «Slidex Pneumo-Kit» (bioMerieux, Франция).

После реидентификации штаммы хранили в пробирках с триптиказо-соевым бульоном (bioMerieux, Франция) с добавлением 30% стерильного глицерина (Sigma, США) при температуре - 70 °С.

Определение чувствительности к антибиотикам. Определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АМП проводилось в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04) и рекомендациями Комитета по клиническим и лабораторным исследованиям США [CLSI, 2013]. В соответствии с рекомендациями CLSI исследование чувствительности S. pneumoniae с определением МПК проводили методом микроразведения в ка-тион-сбалансированном бульоне Мюллера-Хинтон (BBL, США) с добавлением лизированной лошадиной крови (итоговая концентрация 5%).

Для приготовления бактериальной суспензии чистую суточную культуру микроорганизмов разводили в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда (DEN-1 McFarland Densitometr, BIOSAN, Латвия).

Полученную взвесь пневмококков вносили в лунки микротитровальных планшетов с помощью многоканальной пипетки.

Инкубация микротитровальных планшетов проводилась при температуре 35°С в течение 20-24 ч в обычной атмосфере.

Определялась чувствительность S. pneumoniae к 5 антимикробным препаратам: пенициллину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину, ко-тримоксазолу.

При тестировании использовали двойные серийные разведения химически чистых субстанций антибиотиков: пенициллин (Sigma, Германия), эритромицин (Polfa, Польша), клиндамицин (Pfizer, США), тетрациклин (Sigma, Германия), ко-тримоксазол (Sigma, Германия).

Интерпретацию результатов определения чувствительности штаммов S. pneumoniae и контроль качества с использованием контрольных штаммов S. pneumoniae АТСС 49619 поводили согласно рекомендациям МУК 4.2.1890-04 и CLSI 2013. Допустимые значения МПК для контрольных штаммов представлены в табл. 2.

Серологическое типирование штаммов S. pneumoniae. Серотипирование штаммов S. pneumoniae проводилось с помощью 14 пуловых и 21 групповых диагностических сывороток PNEUMOTEST-LATEX (Statens Serum Institut, Копенгаген, Дания). Для типирования использовалась суточная культура пневмо-

кокков, выросшая на колумбийском агаре (bioMerieux, Франция) с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови. Петлей с поверхности агаровой среды снимали 1-2 изолированные колонии пневмококков, тщательно растирали в 1 мкл 0,9% раствора NaCl на латексной полоске и добавляли 1 мкл сыворотки. Учет реакции проводился через 5-10 сек. Образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля указывало на положительную реакцию специфического взаимодействия. Отсутствие реакции с одной из основных серогрупповых сывороток указывало на необходимость продолжения проведения аналогичных исследований с другими специфическими сыворотками (A-I, Р-Т). К «невакцинальным» серотипам относили серотипы, не входящие в состав 23-валентной полисахаридной, 7, 10 и 13-валентных конъюгированных пневмококковых вакцин, соответственно.

Таблица 2

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S. pneumoniae к антибиотикам (МПК, мг/л) и допустимые диапазоны МПК (мг/л) для контрольного штамма S. pneumoniae АТСС 49619, CLSI, 2013 г.

Антибиотик Ч У/Р Р S. pneumoniae АТСС 49619

Пенициллин (для инвазивных штаммов, вызывающих менингиты) <0,06 - >0,12 0,25-1

Пенициллин (для неинвазивных штаммов) <2 4 >8 -

Эритромицин <0,25 0,5 > 1 0,03-0,12

Клиндамицин <0,25 0,5 >1 -

Тетрациклин < 1 2 >4 0,12-0,5

Триметоприм/сульфаметоксазол <0,5 1-2 >4 0,12-1

Молекулярное типирование штаммов S. pneumoniae Для валидации метода ПЦР - типирования пневмокков из коллекции было выбрано 113 штаммов, распределенных в 3 группы:

первая группа - 9 штаммов, выделенных из крови или ликвора больных инвазивными формами пневмококковой инфекции (Казань, Москва, Новокузнецк, Санкт-Петербург, Ярославль - по 1 штамму, Смоленск - 4 штамма);

вторая группа - 98 штаммов, изолированных из материала нестерильного типа (мокрота и т.п.) у больных пневмонией (85 штаммов) и ОСО (13 штаммов) (Екатеринбург - 6 штаммов, Иркутск - 30, Казань - 5, Москва - 19, Новокузнецк - 6, Смоленск - 7, Хабаровск - 13, Ярославль - 8, Тюмень, Новосибирск, Санкт-Петербург, Уфа - по 1 штамму);

третья группа - 6 штаммов от носителей (Брянск, Владивосток, Екатеринбург, Иркутск - по 1 штамму, Волгоград - 2 штамма).

В тестируемую выборку были включены представители всех обнаруженных серогрупп, а также ряд штаммов, серотип которых не удалось определить. В выборке было минимизировано число штаммов от носителей.

Выделение ДНК S. pneumoniae проводилось следующим образом. Бактериальная суспензия, разведенная в 500 мкл ТЕ-буфера (Трис-HCI - ЮмМ, pH 8,0, ЭДТА - 1мМ), прогревалась при 95°С в течении 5 мин. После прогрева суспензия центрифугировалась в течении 10 мин при скорости 12000 об/мин на центрифуге «MiniSpin plus» («Eppendorf», Германия). После центрифугирования из пробирок отбиралось 450 мкл раствора, содержащего бактериальную ДНК и готовились разведения ДНК в ТЕ-буфере до конечной концентрации 105-10б геномных эквивалентов в 1 мл.

Постановка ПЦР для детекции серотипов S. pneumoniae проводилась в соответствие с условиями, описанными в публикации [Pai, 2006]. ПЦР проводилась по следующей схеме: в пробирку добавлялась смесь, содержащая прайме-ры и нуклеотидтрифосфаты (0,44 мМ) - 10 мкл, «Воск для ПЦР» - 10 мкл, «ПЦР-смесь-2 blue» - 10 мкл, «Минеральное масло для ПЦР» - 10 мкл и 5 мкл выделенной ДНК. Во всех реакциях присутствовали праймеры «cpsA-f» и «cpsA-r» в концентрации 0,12 мкМ для амплификации фрагмента длиной 160 п.о., присутствующего у всех капсульных штаммов S. pneumoniae [Pai, 2006]. Амплификация проводилась на приборе «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems», США) по следующей программе 95°С - 5 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек/60°С - 30 сек/72°С - 30 сек (35 циклов), 72°С - 2 мин (1 цикл).

Детекция продуктов амплификации осуществлялась в 3% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Электрофорез проходил при напряжении 250 В в течение 30-40 минут с использованием маркера молекулярных масс с фрагментами ДНК, соответствующими 800, 500, 400, 300, 200 и 100 и.о.

Все реагенты для постановки ПЦР и детекции результатов амплификации были произведены в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия).

В работе использованы 24 пары праймеров, которые были распределены по четырем ПЦР-смесям № 1-4. Последовательности праймеров приведены на Интернет-сайте (http://www.cdc.gov/ncidodA^iotech/pcr.htm').

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Серогруппы штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей-носителей.

При анализе назофарингеалыюго носительства среди 306 штаммов S. pneumoniae, выделенных у здоровых детей в возрасте до 5 лет из детских садов и детских домов в различных регионах России преобладали пневмококки 19 (47,1%), 6 (13,1), 23 (9,2%), 14 (6,6%), 15 (5,9%), 3 (3,9%) серогрупп, в меньшей степени 18 и 7 серогруппы. (Рис. 1).

У 22 (7,2%) «невакцинальных» штаммов пневмококка серотип не был определен. Анализ ПЦР-типирования подтвердил, что это вероятно новые перере-

комбинировавшиеся серотипы пневмококка, которые являются нетипируемыми данной ПЦР методикой. Метод молекулярного ПЦР-типирования, позволил дифференцировать серотипы внутри серогрупп. Так, при типировании 6 назо-фарингеальных н!таммов пневмококка были идентифицированы серотипы 6А, 7FA, 11AD, 15ВС, 18ABCF, 23F (Таб. 9), которые входили в состав пневмококковых полисахаридных и конъюгированных вакцин. Данные, полученные в России ранее в 1981г., а также в исследованиях, проведенных НЦЗД РАМН в 2010 г. и результаты нашего исследования, показали, что спектр серотипов S. pneumoniae у носителей остался стабильным, перетерпев незначительные изменения [Катосова, 1990; Маянский, 2010]. Из литературных источников известно, что при носительстве у детей младше 2 лет серогруппы 6, 14, 19 и 23, вызывают большую часть пневмококковых инфекций [Катосова, 1987].

47.1

13 3.9 1 3.6 0.3 0.3 J-, _________и__ 6.5 5.9 ü й 92 7.2 Л L

Ъ Ь Л Ъ Q \\ n*. \<Ь ^

Рис. 1. Серогруппы S. pneumoniae, выделенные из назофарингеальных образцов у детей из детских садов и детских домов, %.

Спектр серотипов пневмококков, выявляемых при носительстве, является своего рода маркером, отражающим спектр серотипов, вызывающих у детей инфекции различной степени тяжести. Между тем, данные о серотиповом разнообразии выделенного пневмококка определяют прогноз вакцинопрофилакти-ки доступными в нашей стране пневмококковыми вакцинами.

С целью оценки целесообразности применения пневмококковых вакцин был проведен сравнительный анализ серогрупп S. pneumoniae, выделенных у детей-носителей и серогрупп входящих в состав зарегистрированных в РФ вакцин ПКВ7, ПКВ10, ПКВ13 и 23-валентной полисахаридной вакцины. Установ-

лено совпадение спектров серотипов на 80,4%, 80,7%, 84,6% и 92,8%, соответственно (табл. 3).

Таблица 3

Сравнение серотипов S. pneumoniae, входящих в состав вакцин ПКВ7, ПКВ10, ПКВ13 и 23-валентной полисахаридной вакцины с серогруппами, циркулирующими в группе носителей в возрасте до 5 лет, п (%)

Сергруппы ПКВ7 ПКВ10 ПКВ13 23-валентная полисахаридная Носительство серотипы п (%)п=306

1 + + + -

2 + -

3 + + 12(3,9)

4 + + + + -

5 + + + -

6 + + + + 40(13,1)

7 + + + 1(0,3)

8 + 1(0,3)

9 + + + + 11(3,6)

10 + -

11 + 6(1,9)

12 + -

14 + + + + 20(6,6)

15 + 18(5,9)

17 + -

18 + + + + 3(0,9)

19 + + + + 144(47,1)

20 + -

22 + -

23 + + + + 28(9,2)

33 + -

невакцинальные 22(7,2)

% перекрываемое™ 80,4 80,7 84,6 92,8

Следует отметить, что мониторинг циркулирующих серотипов необходимо проводить не только до, но и после введения вакцины в календарь прививок. Известно, что появление новых серотипов (феномен смены серотипов - serotype replacement), доминирующих в популяции S. pneumoniae, обусловлено интенсивными рекомбинационными процессами и явлением «переключения капсулы» (capsule switchin). Серотипы могут вытеснять друг друга в ходе естествен-

ной конкуренции и эволюции, но и специфическая вакцинация провоцирует частичную замену «вакцинных» серотипов на «невакцинные» еще более эффективно [Jefferies, 2010].

Полученные данные о высоком проценте перекрытия серогрупп S. pneumoniae, выделенных в группе носителей и серогрупп, входящих в состав вакцин ПКВ7, ПКВ10, ПКВ13, наряду с имеющимися убедительными доказательствами связи между штаммами, колонизирующими носоглотку и вызывающими инвазивные и неинвазивные (острые средние отиты, пневмонии) заболевания у детей [Syijanen, 2001] позволяют предположить эффективность использования данных вакцин в России. Несмотря на то, что полисахаридная вакцина обеспечивает более полное перекрытие по выделенным серотипам (92,8%), ее применение у детей раннего возраста (< 2 лет) ограничено из-за низкой иммуногенности.

Чувствительность назофарингеальных штаммов S. pneumoniae. Результаты определения чувствительности назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей-носителей в возрасте до 5 представлены в таблице 4. Определение чувствительности к антибиотикам назофарингеальных штаммов пневмококка имеет практическое значение, так как может быть использовано при выборе препарата для эмпирической антибактериальной терапии.

В целом следует отметить, что пенициллин сохраняет высокую активность в отношении штаммов S. pneumoniae, выделенных при назофарингеальном но-сительстве: частота нечувствительных штаммов составила 8,2%. Активность представителей группы макролидов и линкозамидов в отношении выделенных пневмококков также сохранялись на высоком уровне - частота нечувствительных к эритромицину и к клиндамицину составила 24,4% и 18,3%, соответственно. Необходимо отметить высокий уровень умеренно-резистентных к ко-тримоксазолу штаммов пневмококка 30,1% (92 штамма). Возможно, появление умеренно-резистентных штаммов в популяции является индикатором циркуляции резистентных штаммов или, по крайней мере, большой вероятности их появления в ближайшем будущем.

Таблица 4

Результаты определения чувствительности назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, Россия (п=306)

Антибиотик Назофарингеалькые штаммы S. pneumoniae п (%)

Чувствительные Умеренно-резистентные Резистентные

Пенициллин 281 (91,8) 24 (7,8) 1 (0,3)

Эритромицин 231 (75,6) 3 (0,9) 72 (23,5)

Кпиндамицин 250(81,7) 0 56(18,3)

Тетрациклин 114(37,3) 6(1,9) 186 (60,8)

Ко-тримоксазол 87 (28,4) 92(30,1) 127(41,5)

Данные по чувствительности назофарингеальных штаммов S. pneumoniae в зависимости от серогруппы представлены в таблице 5.

Таблица 5

Чувствительность к антибиотикам назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, в зависимости от серогруппы в России (п=306)

Антибиотик Серогруппы, УР/Р (%)

3 6 9 И 14 15 18 19 23 невакцинальные

Пенициллин - 0,3/0 - - 0,3/0 - - 7,2/0,3 - -

Эритромицин 0/2,3 0/1,9 - - 0,3/1,3 - - 0,7/7,1 0/1,3 0/0,3

Клицдамицин - 0/1.6 0/0,3 - 0/0,7 - 0/0,7 0/13,7 0/0,9 0/0,3

Тетрациклин 0/3,2 0/7,2 0/0,9 - 0/4,6 0/1,3 0/0,9 1,9/31,6 0/7,2 0,9/2,6

Ко- тримоксазол 0,7/1,3 5,2/4,6 1,6/0,7 0,3/0 1,9/3,3 1,6/0,7 0,3/0 12,6/25,8 3,9/2,9 0/0,9

Резистентным к пенициллииу был один штамм 19 серогруппы. Причем умеренно-резистентными к пенициллину были 24 штамма, среди которых большинство (22 штамма) относились к «вакцинной» 19 серогруппе, оставшиеся два распределились между «вакцинными» 6 и 14 серогруппами. При этом штаммы серогрупп 3, 9, 8, 11, 15, 18, 23, а также «невакцинальные» штаммы, были чувствительны к пенициллину.

Дальнейший анализ позволил выявить, что резистентными к эритромицину и клиндамицину пневмококи были обнаружены у штаммов «вакцинных» 6, 14, 19 и 23 серогрупп. Умеренно-резистентными к эритромицину были только 2 штамма 19 серогруппы и один штамм 14 серогруппы. Уровень нечувствительности к эритромицину и клиндамицину среди «невакцинальных» серогрупп не превышал 0,3%.

Резистентные к тетрациклину и ко-тримоксазолу штаммы S. pneumoniae принадлежали 3, 6, 9, 14, 15, 19 и 23 серогруппам, входящих в состав пневмококковых вакцин. Доля резистентных к тетрациклину и ко-тримоксазолу «невакцинальных» серогрупп S. pneumoniae, составила 2,6% и 0,9%, соответственно.

Ранее было показано, что резистентность к антимикробным препаратам встречается у штаммов, относящихся к сравнительно небольшому количеству серотипов [Klugman, 2000]. Известно, что во всем мире за развитие большинства инфекций, вызванных пенициллинрезистентными штаммами пневмококка, отвечают пять серотипов пневмококков 6В, 9V, 14, 19F и 23F. Штаммы этих же серотипов наиболее часто колонизируют детей, не имеющих каких-либо клинических проявлений [Kyaw, 2006].

Анализ связи между серотипом и уровнем резистентности пневмококков, показал, что наибольшая частота резистентных штаммов ко всем исследуемым груп-

пам антимикробных препаратов встречается среди штаммов 19-ой серогруппы. Было установлено, что в популяции пневмококков, резистентных к пенициллину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и ко-тримоксазолу, выделенных у здоровых детей до 5 лет, преобладали «вакцинные» серогруппы S. pneumoniae 6, 14, 19, 23. Таким образом, можно ожидать, что вакцинация будет способствовать снижению носительства резистентными штаммами пневмококка, что в свою очередь приведет к снижению частоты возникновения пневмококковых инфекций, вызванных полирезистентными штаммами пневмококков.

Серогруппы штаммов S. pneumoniae, выделенные у детей с острым средним отитом, пневмонией и инвазивными инфекциями. В данной работе было проанализировано 276 клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России. Известно, что различия в генетической организации серотипов частично объясняют ряд клинических феноменов, связанных с тем, что частота встречаемости различных серотипов зависит от локализации инфекции [Nikolich, 1992]. В ранее проведенных исследованиях, была показана связь между штаммами, колонизирующими носоглотку и вызывающими инвазивные заболевания, острые средние отиты, пневмонии. Полагают, что именно колонизация слизистой носоглотки предшествует развитию инвазивных и неинвазивных пневмококовых инфекций, а условия детских учреждений создают возможность быстрого распространения резистентных штаммов пневмококка [Syrjanen, 2001].

Среди клинических штаммов, вызывающих инвазивные и неинвазивные инфекции у детей до 5 лет выделялись серогруппы 3, 4, 6, 9, 14. Причем у детей доминировали преимущественно штаммы 6 и 19 серогрупп. Следует отметить, что пневмококки этих серогрупп составляли 13,4% и 34,1%, соответственно, среди всех выделенных штаммов у детей с ОСО, пневмонией, инвазивными инфекциями.

Среди клинических штаммов пневмококка 38(13,8%) штаммов были «невакцинальным». Исследования клинических «невакцинальных» изолятов молекулярными методами показали, что эти штаммы были не способны к синтезу полисахаридной капсулы или имели серотипы, не определяемые данной методикой. В популяции пневмококков, выделенных у детей с инвазивными и неин-вазивными инфекциями лидирующие позиции занимают следующие «вакцинные» серотипы 19F, 23F, 6А, 3, 14, 6В, 9VA. На рисунке 2 представлен спектр серогрупп, выделенных у детей с ОСО.

Так, средний отит чаще вызывался «вакцинными» ссрогруппами 19 (31,0%), 3 (10,2%), 14 (7,7%), реже обнаруживались серогруппы 15, 23, 4, 6 (по 5,1%, соответственно). «Невакцинальные» серотипы составили 20,7%. Молекулярное типирование таких штаммов показало, что эти штаммы принадлежат к новым серогруппам или бескапсульным пневмококкам. С помощью ПЦР-типирования штаммов пневмококков, выделенных из отделяемого среднего уха, было обнаружено, что штаммы 19 серогруппы принадлежали «вакцинному» се-

ротипу 19Р, штаммы 6 серогруппы были отнесены к серотипу 6А, штаммы 23 серогруппы - к серотипу 23Р, что коррелирует с результатами исследований, проведенных в период с 2011-2012 гг. в Москве в Научном центре здоровья детей НЦЗД РАМН.

f.! U

2.5 2.5 □__И

. . I

■о

.И-

Рис. 2. Спектр серогрупп S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет с острым средним отитом, %

Среди штаммов, вызывающих пневмонии, у детей в возрасте до 5 лет преобладающими серогруппами были 19 (33,6%), 6 (15.8%), 23 (8.9%), 14 (7,2%) (рис. 3).

33.6

3.6 □

1.4

Рис. 3. Серогруппы S. pneumoniae, выделенные у детей в возрасте до 5 лет с внебольничной пневмонией, %

С помощью метода ПЦР-типирования были выявлены серотипы 3, 4, 6А, 6В, 7FA, 8, 9VA, 9NL, 11AD, 14, 15AF, 15ВС, 18ABCF, 19F, 22FA, 23F. Причем' наиболее распространенным серотипом оказался 19F, за которым следовали 6А,

3, 6В серотипы. Из «невакцинальных» штаммов пневмококка, выделенных у детей с пневмонией, у 16 штаммов, взятых в молекулярное типирование выявить серотиповую принадлежность не удалось (серотипы, не включенные в систему ПЦР-типирования или утратившие способность к синтезу капсулы).

Ранее было показано, что распространенные среди носителей серогруппы чаще всего вызывают пневмонию у детей раннего возраста [Катосова, 1990], а при инфекциях, вызванных 6 и 19 серотипами пневмококкоами, деструктивные процессы в легочной ткани развивались в 20% случаев [Кешикбаева, 1986].

Преобладающими серогруппами, вызывающими инвазивные инфекции, были 19 (50%), 23 (14,2%), 3(14,2%), 1(7,1%), 14(7,1%), 5(7,1%) (рис. 4).

□

□ .□

ь ^ \i

Рис. 4. Распределение серогрупп 5. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет из крови, ликвора, ткани легкого, %

Использование метода ПЦР для типирования инвазивных штаммов пневмококка позволило идентифицировать серотипы 1, 3, 5, 14, 19F, 23В. Важно отметить, что серотипы 1, 14, 3 и 5 относятся к наиболее вирулентным, а серогруппы 1 и 5 еще получили название эпидемических серотипов в связи с тем, что нередко вызывают вспышки пневмококковых инфекций в развивающихся странах [Баранов, 2013].

Исходя из полученных результатов, можно сделать заключение, что практически повсеместно лидирующее положение занимала 19 серогруппа. Распространенность других серогрупп оказалась более вариабельной. В целом на долю 19 «вакцинной» серогруппы приходилось 34,1% от числа всех клинических изолятов пневмококка, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, из них на долю серогруппы 6 приходилось 13,4%; 23 - 8,6%: 14 - 7,2%.

Мы провели сравнительное исследование «вакцинных» серогрупп, с серогруппами клинических штаммов, выделенных у детей с ОСО, пневмонией и ин-вазивными инфекциями (табл. 6). Нами было установлено, что серогруппы пневмококковых конъюгированных вакцин (ПКВ7, ПКВ10, ПКВ13) перекрывают 69,2%, 70,6%, 76,0% штаммов, выделенных у детей в возрасте до 5 лет. Практически все серотипы клинических штаммов (85,8%) входили в состав 23-

валентной полисахаридной вакцины. Но из-за низкой иммуногенности, особенно у детей раннего возраста, ее рекомендуется использовать только по эпидемиологическим показаниям у детей старше 2-х лет.

Полученные результаты обосновывают целесообразность включения конъюгированных пневмококковых вакцин в отечественный календарь профилактических прививок.

Таблица 6

Сравнение серогрупп S. pneumoniae, входящих в состав вакцин ПКВ7, ПКВ10, ПКВ13 и 23-валентной полисахаридной вакцины, с серогруппами клинических штаммов, циркулирующими у детей в возрасте до 5 лет, п (%)

Серогруппы ПКВ7 ПКВ10 ПКВ13 23-валентная полисахаридная Клинические штаммы, серотнпы (%) п=276

1 + + + 2(0,7)

2 + -

3 + + 15(5,4)

4 + + + + 4(1,4)

5 + + + 1(0,4)

6 + + + + 37(13,4)

7 + + + 1(0,4)

8 + 2(0,7)

9 + + + + 9(3,3)

10 + 2(0,7)

11 + 6(2,2)

12 + 1(0,4)

14 + + + + 20(7,3)

15 + 11(3,9)

17 + -

18 + + + + 3(1,1)

19 + + + + 94(34,1)

20 + 3(1,1)

22 + 1(0,4)

23 + + + + 24(8,7)

33 + 2(0,7)

невакцинальные 38(13,8)

% перекрываемо-мости 69,2 70,6 76,0 85,8

Чувствительность клинических штаммов S. pneumoniae. При анализе результатов определения чувствительности выделенных у детей клинических штаммов пневмококка было установлено, что пенициллин, эритромицин и клиндамицин характеризовались высокой активностью в отношении тестированных штаммов: доля нечувствительных изолятов составила соответственно 1,4%, 7,6%, 7,9%. При этом имеет место увеличение частоты распространения клинических штаммов пневмококка, резистентных к тетрациклину и ко-тримоксазолу - 43,3% и 55,8%, соответственно (табл. 7).

Таблица 7

Результаты определения чувствительности клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, Россия (п=276).

Антибиотик Клинические штаммы S. pneumoniae п (%)

Чувствительные Умеренно-резистентные Резистентные

Пенициллин 272 (98,6) 2 (0,7) 2(0,7)

Эритромицин 255 (92,4) 2 (0,7) 19 (6,9)

Тетрациклин 156 (56,7) 8 (2,8) 112(40,5)

Клиндамицин 254(92,1) 0 22 (7,9)

Ко-тримоксазол 122 (44,2) 101 (36,6) 53 (19,2)

Было исследовано распределение серогрупп клинических штаммов пневмококка по уровню резистентности к пенициллину, эритромицину, клиндами-цину, тетрациклину и ко-тримоксазолу (табл. 8).

Таблица 8

Чувствительность к пенициллину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и ко-тримоксазолу серогрупп клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, Россия (п=276)

Антибиотик Серотипы УР/Р,%

3 6 9 И 14 15 18 19 23 невакцинальные

Пенициллин - - - - - - - 0,7/0,7 - -

Эритромицин 0/0,4 0/0,7 - ■ 0,7/5,1 0/0,7 -

Клиндамицин 0/0,4 0/0,7 - - - - - 0/5,1 0/0,4 -

Тетрациклин 0/0,7 0/5,4 0,4/0,4 0/1,4 0/2,9 0/2,5 0,4/2.5 1,8/15,9 0,4/6,5 0,4/5,6

Ко- тримоксазол 2,5/1,8 5,1/3,3 0/0,7 0,7/0,7 3,2/0,7 2,5/0,7 0,7/0 12,3/7,9 0,4/0,4 7,1/0,5

Независимо от серогруппы клинические штаммы пневмококков характеризовались высокой чувствительностью к пенициллину, только 4 штамма 19 «вакцинной» серогруппы были нечувствительны к пенициллину. Клинические штаммы, резистентные к эритромицину и клиндамицину, относились к 19, 6, 3 и 23 «вак-

цинным» серогруппам. В популяции клинических изолятов, резистентных к тетрациклину и ко-тримоксазолу, доминировали штаммы 19,6, 23 и 14 серогрупп.

Следует отметить, что появление резистентных пневмококков, вероятнее всего является результатом, как распространения клонов, так и эволюционного изменения популяции. При сохранении селективного давления антибиотиков, в ближайшем будущем следует ожидать полного вытеснения чувствительной субпопуляции пневмококков устойчивой.

Выявлено, что среди клинических штаммов пневмококка, выделенных у детей до 5 лет, с ОСО, пневмонией и инвазивными инфекциями, в популяции, резистентной ко всем классам тестируемых антибиотиков, преобладала 19 «вакцинная» серогруппа. В тоже время, практически все выделенные «вакцинные» серогуппы пневмококков обладали устойчивостью к тестированным антибактериальным препаратам.

В целом, результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о необходимости проведения постоянного мониторинга антибиотикорезистентно-сти, так как в зависимости от структуры применения антимикробных препаратов ситуация может меняться.

Определение серотипов S. pneumoniae методом ПЦР. В изученной выборке были найдены серогруппы (серотипы) пневмококков: 1, 3, 4 5 6А 6В

7FA, 8, 9NL, 9VA, 11AD, 14, 15AF, 15ВС, 18ABCF, 19F, 22FA, 23В, 23F.

Результаты определения серогрупп (серотипов) для штаммов, выделенных при разных формах пневмококковой инфекции, представлены в таблице 9.

Обращает на себя внимание, что все 12 штаммов серогруппы 19 принадлежали к вакцинному серотипу 19F. Оба штамма серогруппы 7 имели серотип 7FA (в вакцинах - серотип 7F). Из 12 штаммов серогруппы 23 одиннадцать штаммов имели «вакцинный» серотип 23F и только один - 23В. Приблизительно в равных количествах были представлены серотипы 9VA (6 штаммов) и NL (4), а также серотипы 15ВС (3) и 15 AF (3 штамма). Штаммы серогруппы 6 распределены следующим образом: 6 штаммов принадлежали серотипу 6В (включен во все коныогированные пневмококковые вакцины) и 10 - серотипу 6А (включен только в 13-валентную вакцину).

Использование метода ПЦР для определения серотипов S. pneumoniae позволяет сократить стоимость и время проведения анализа при планировании иммунопрофилактических мероприятий и мониторинге их результатов, а также избежать возможных ложноположительных и ложноотрицательных результатов, связанных с проблемой интерпретации визуальных наблюдений серологических реакций.

Определенным недостатком всех используемых в настоящее время схем ПЦР - серотипирования является то, что внутри некоторых выявляемых серогрупп не удается дифференцировать входящие в них серотипы. Однако этот недостаток не является принципиальным, так как по данным эпидемиологических исследований [Hanquet, G. 2002, Johnson, H.L 2010] в популяции циркулирующих пневмококков доминирует только один серотип из такой группы (например, вакцинный серотип 18С), а остальные серотипы не обнаруживаются вовсе или встречаются реже, чем в 0,5% случаев. Поэтому коммерческие тест-

системы для классического серотипирования («Pneumotest-Latex», Staten Sérum Institut, Дания) также не предусматривают возможности дифференцировки се-ротипов внутри подобных серогрупп.

Таблица 9

Результаты молекулярного типирования 113 штаммов S. pneumoniae.

Тип заболевания и источник штамма

Серотип п Пневмония Инвазивное заболевание Острый отит Носители

1 1 1

3 10 8 1 1

4 4 2 2

5 1 1

6А 10 8 0 1 1

6В 6 6

7FA 2 1 1

1С 0

8 1 1

9VA 6 4 2

9NL 4 4 0

11AD 6 5 1

12FA 0

14 7 4 1 2

15AF 3 3

15ВС 3 2 1

18ABCF 4 3 1

19F 12 8 3 1

19А 0

22FA 2 1 1

23F И 9 1 1

23В 1 1

23А 0

Не определен, ПЦР на серотипы отрицательна 14 12 1 1

ПЦР отрицательна, продукт амплификации cpsA отсутствует 5 4 1

Всего 113 85 9 13 6

Поскольку данная ПЦР - методика позволяет выявить 23 серотипа, на основании имеющихся предварительных данных [Hanquet, 2010, Johnson, 2010, Mcintosh, 2011], можно предположить, что проспективном эпидемиологическом исследовании с ее помощью удастся характеризовать не менее 85-90% изолятов. В частности, с помощью предложенной методики можно выявлять все серотипы, включенные в конъюгированные пневмококковые вакцины, и практически все часто встречающиеся на территории РФ невакцинальные серотипы. Таким образом, можно будет определять потенциальную эффективность вакцин.

Проведенные исследования по мониторингу антибиотикорезистентаости и серотипового состава популяции пневмококков, позволили получить достоверные и сопоставимые данные по чувствительности циркулирующих серотипов S. pneumoniae в различных регионах России. Полученные результаты могут быть использованы в качестве отправной точки для мониторинга и оценки влияния вакцин на эпидемиологию серотипов и антибиотикорезистентность S. pneumoniae в стране после введения ПКВ в национальный календарь вакци-нопрофилактики.

ВЫВОДЫ

1. Установлены доминирующие серотипы пневмококков 19(34,1%), 6(13,4%), 23(8,7%), 14(7,2%) и 3(5,1%), среди клинических штаммов, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в РФ, из которых более 69% представлены в коныогированных ПКВ7, ПКВ 10, ПКВ 13 вакцинах против пневмококковой инфекции.

2. Выявлены доминирующие серотипы пневмококков 19(47,1%), 6(13,1%), 23(9,2%), 14(6,5%), 15(5,9%) и 3(3,9%), среди назофарингеальных штаммов, у детей-носителей в возрасте до 5 лет в РФ, из которых более 80% представлены в конъюгированных ПКВ7, ПКВ 10, ПКВ 13 вакцинах.

3. Среди 276 клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, частота устойчивости к тетрациклину и ко-тримоксазолу была выше, чем к пенициллину, эритромицину и клиндамицину, при этом высокая частота полирезистентных штаммов ассоциировалась с «вакцинными» серо-группами 19, 6, 23, что позволяет ожидать снижения частоты развития инфекции, вызванных резистентными штаммами пневмококка на фоне вакцинации против пневмококковой инфекции.

4. Среди 306 назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, доля пневмококков, нечувствительных к тетрациклину и к ко-тримоксазолу, была выше, чем к пенициллину, эритромицину и клиндамицину. Из всех назофарингеальных штаммов пневмококков полирезистентностью обладали 19, 6, 14 и 23 « вакцинные» серогруппы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовано включить 7-, 10-, 13- валентные конъюгированные пневмококковые вакцины в отечественный календарь прививок.

2. Низкая активность ко-тримоксазола и тетрациклина свидетельствует о невозможности использования этих антибиотиков в качестве потенциальных препаратов эмпирической терапии пневмококковых инфекций в Российской Федерации в настоящее время.

3. Учитывая динамические изменения серотипового состава пневмококков, целесообразно проводить регулярное многоцентровое эпидемиологическое исследование по серотипированию и мониторингу резистентности штаммов пневмококка в каждом регионе.

4. Для адекватной оценки чувствительности штаммов пневмококка к пенициллину рекомендуется использовать обновленные критерии CLSI 2013 г. (пенициллин Ч< 0,06 мг/л; Р>0,012 мг/л - для инвазивных штаммов, вызывающих менингиты и Ч< 2мг/л, УР 4мг/л, Р>8мг/л для неинвазивных штаммов.

5. В работу микробиологических лабораторий наряду с серологическим типи-рованием рекомендуется внедрить метод молекулярного типирования, основанный на ПЦР, что позволит выявлять большинство часто встречающихся на территории РФ серотипов S. pneumoniae.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Козлов P.C., Чагарян А.Н., Козлова JI.B., Муравьев A.A., Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенная у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской федерации. КМАХ2011; 13(2):177-187.

2. Tatochenko V, Sidorenko S, Namazova-Baranova L, Mayanskiy N, Kulichenko T, Baranov A, Lobzin Y, Kharit S, Kozlov R, Andreeva I, Muravjev A, Chagaryan A, Koroleva I, Beloshitskiy G, Mironov K, Degtyareva E, Reinert RR., Streptococcus pneumoniae serotype distribution in children in the Russian Federation before the introduction of pneumococcal conjugate vaccines into the National Immunization Program. Expert Review of Vaccines. 2014 Feb; 13(2):257-264.

Другие публикации по теме диссертации:

1. R.Kozlov, A. Muraviev, A. Chagaryan. Serotypes of Streptococcus pneumoniae in different age groups in Belarus and the Ukraine // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseaes, Berlin (Germany), 27-30 April 2013. Abstract R2594

2. N. Mayanskiy, N. Alyabieva, O. Ponomarenko, A. Lazareva, L. Katosova, R.S. Kozlov, A. Muraviev, A. Chagaryan, T. Kulichenko, L. Namazova-Baranova. Serotype distribution and antibiotic-resistance of pediatric Streptococcus pneumoniae in

Moscow // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseaes, Berlin (Germany), 27-30 April 2013. Abstract P2173

3. R.S. Kozlov, A.N. Chagaryan, L.V. Kozlova, A.A. Muraviov. Penicillin resistance of predominant serotypes of Streptococcus pneumoniae in children of Russian Federation. // 7th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (WSPID), Melbourne(Australia), 16-19November,2011. Abstract 26.

Список использованных сокращений

АРП антибиотикорезистентный пневмококк

БАЛ бронхоальвеолярный лаваж

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ВП внебольничная пневмония

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

МПК минимальная подавляющая концентрация

НИИАХ Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии

НП нозокомиальная пневмония

ОСО острый средний отит

ПКВ пневмококковая коныогированная вакцина

ППВ пневмококковая полисахаридная вакцина

ПРВ полирезистентный возбудитель

ПСБ пенициллиносвязывающий белок

ПЦР полимеразная цепная реакция

Р резистентный

СКА серповидноклеточная анемия

СЬ8А комитет по клиническим и лабораторным исследованиям США

СМЖ спинномозговая жидкость

УР умереннорезистентный

ФО Федеральный Округ

ХОБЛ хроническая обструктивная болезнь легких

ЦНС центральная нервная система

Ч чувствительный

ЧАГАРЯН АИДА НУРИМАНОВНА

СЕРОТИПЫ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ И НАЗОФАРИНГЕАЛЬНЫХ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ У ДЕТЕЙ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 19.06.2014 г. Формат 60><84 1/16 Гарнитура «тайме». Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 322.

Издательство «Универсум» 214014, г. Смоленск, ул. Герцена, д.2. Тел. /факс: 8-903-890-82-40 E-mail: universum-print@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чагарян, Аида Нуримановна, Смоленск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

04201460560 тт

На Правах рукописи

Чагарян Аида Нуримановна

СЕРОТИПЫ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ И НАЗОФАРИНГЕАЛЪНЫХ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ У ДЕТЕЙ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ.

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-доктор медицинских наук, профессор P.C. Козлов

Смоленск - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................6

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................14

Глава 1. Эпидемиологические особенности пневмококковых инфекций......14

1.1. Инвазивные формы пневмококковых инфекций.......................15

1.2. Неинвазивные формы пневмококковых инфекций....................17

1.3. Факторы вирулентности и патогенез пневмококковой инфекции .20

1.4. Резистентность пневмококков к антимикробным препаратам......31

Глава 2. Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции.....................40

2.1. Характеристика пневмококковых вакцин и их эффективность... .40

2.2. Иммуногениость пневмококковых вакцин..............................44

2.3. Проблемы противопневмококковой вакцинации у детей...........46

Глава 3. Определение серотипов S. pneumoniae методом ПЦР..................53

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................55

Глава 4. Материалы и методы исследований........................................55

4.1 Центры-участники...........................................................55

4.2 Выделение и идентификация штаммов S. pneumoniae...............55

4.3 Определение чувствительности штаммов S. pneumoniae............56

4.4 Серологическое типирование штаммов S. pneumoniae.............. 58

4.5 Молекулярное типирование штаммов S. pneumoniae..................60

Глава 5. Результаты исследований......................................................63

5.1 Серогруппы штаммов S. pneumoniae, выделенные у детей-носителей......................................................................63

5.2 Серогруппы штаммов S. pneumoniae, выделенные у детей с острым средним отитом, пневмонией и инвазивными инфекциями.........69

5.3 Серотипы штаммов S. pneumoniae, определенные методом

ПЦР...............................................................................91

Глава 6. Обсуждение......................................................................96

ВЫВОДЫ..................................................................................105

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................106

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................107

АБТ

АРП

БАЛ

ВИЧ

ВОЗ

ВП

ДНК

жкт мпк

НИИАХ

нп осо пкв ппв

ПРВ ПСБ

ПЦР р

СКА СЬ8А

смж

УР

ФО

ХОБЛ

цнс ч

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

антибактериальная терапия антибиотикорезистентный пневмококк бронхоальвеолярный лаваж вирус иммунодефицита человека Всемирная организация здравоохранения внебольничная пневмония дезоксирибонуклеиновая кислота желудочно-кишечный тракт минимальная подавляющая концентрация

Научно-исследовательский институт антимикробной

химиотерапи.

нозокомиальная пневмония острый средний отит

пневмококковая конъюгированная вакцина пневмококковая полисахаридная вакцина полирезистентный возбудитель пенициллиносвязывающий белок полимеразная цепная реакция резистентный

серповидноклеточная анемия

комитет по клиническим и лабораторным исследованиям США спинномозговая жидкость умеренно-резистентный Федеральный Округ

хроническая обструктивная болезнь легких центральная нервная система чувствительный

С. pneumoniae Н. influenzae S. aureus S. pneumoniae M. catarrhalis M. pneumoniae L. pneumoniae

Микроорганизмы

Chlamydophila pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumoniae

ВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Streptococcus pneumoniae является одним из основных возбудителей менингита, острого среднего отита, риносинусита, внебольничной пневмонии в различных возрастных группах населения. Особую опасность пневмококковая инфекция представляет для детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц с хроническими патологиями. Известно, что частота пневмококковой колонизации достигает пика к 2-3 годам. Новорожденные дети получают от матери антитела к пневмококкам многих типов, дающие определенную степень защиты. По мере снижения уровней материнских антител заболеваемость пневмококковой инфекцией взрывоподобио повышается с 2-го полугодия жизни [30, 33].

Ежегодно в мире от пневмонии умирает 1 млн. детей младше 5 лет. В развивающихся странах пневмококки вызывают до 11 млн. летальных исходов [81].

По экспертным оценкам в России ежегодно пневмококковой септицемией заболевает около 9000 детей, пневмококковой пневмонией — около 85000 детей, отитами пневмококковой этиологии - свыше 713000 детей в возрасте до 5 лет [131]. Согласно данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заболеваемость пневмониями в 2012 г. среди детей от 0 до 17 лет составила 168718 случаев или 639,5 на 100000 населения, при этом до 34,5% пневмоний приходится на долю детей в возрасте до 2 лет, максимальный уровень заболеваемости отмечен в возрасте 6-11 мес. и 12-23 мес. Следует отметить, что регистрируются далеко пе все случаи пневмоний.

многих исследования было показано, что она во время инфекции способствует нарушению фагоцитоза пневмококков полиморфноядерными лейкоцитами [45].

Важнейшими в медицинском отношении особенностями разных серогрупп пневмококков являются их различная территориальная распространенность, а также степень вирулентности для отдельных возрастных и социально-этнических групп населения. Не все серотипы являются одинаково патогенными, и большинство пневмококковых инфекций связаны с ограниченным числом серотипов. Спектр превалирующих капсульных типов меняется в зависимости от возраста, времени и географического региона, хотя общие серотипы постоянно обнаруживаются во всех странах мира [137]. В мировых масштабах на долю примерно 20 серотипов приходится более 80% случаев инвазивных пневмококковых инфекций во всех возрастных группах; 13 наиболее часто встречающихся серотипов ответственны не менее чем за 70-75% случаев ипвазивной инфекции у детей.

Еще одна биологическая особенность пневмококков, имеющая важное медицинское значение — наличие корреляции между серогрупповой принадлежностью, устойчивостью к антибиотикам и патогенным потенциалом, т. е. способностью колонизировать носоглотку, вызывать локальную или инвазивную инфекцию.

Во всем мире вызывает тревогу ежегодно увеличивающийся объем назначаемых антибиотиков, и как следствие селективного давления антибиотиков являехся распространение отдельных серотипов, характеризующихся множественной лекарственной резистентностью. При этом предупреждение распространения устойчивосш к антибиотикам среди штаммов пневмококков, выделяемых от больных или носителей, затруднено [110, 194].

Поэтому специфическая профилактика, основанная на использовании вакцин, в состав которых входят наиболее распространенные серотипы

пневмококка, способствует не только снижению заболеваемости, но и ограничению циркуляции устойчивых к антибиотикам пневмококков.

В современных условиях для профилактики инфекций, вызванных S. pneumoniae, в мире применяют вакцины двух типов — полисахаридную вакцину (в состав входят 23 серотипа) и 3 конъюгированные вакцины (7-, 10-и 13-валентную конъюгированную вакцину (ПКВ7, ПКВ10 и ПКВ13) [137]. Конъюгированные вакцииы различаются количеством серотипов пневмококка, белком-конъюгатом и количеством полисахарида для каждого конъюгата. Во многих странах, в том числе и в России, полисахаридная вакцина рекомендуется для вакцинации лиц старше 65 лет и для лиц от 2 до 64 лет у лиц с повышенным риском развития пневмококковых инфекций. Основным недостатком полисахаридной вакцины является ее низкая эффективность среди детей первых 2 лет, так как капсульный полисахарид является тимус-независимым антигеном, не формирует иммунологической памяти и практически не иммуногенен для детей первых лет жизни. Поэтому в настоящее время используют так называемые конъюгированные пневмококковые вакцины (ПКВ), в которых типоспецифический полисахарид соединен с белковым носителем (дифтерийным или столбнячным анатоксинами, протективными белками других патогенов) [21]. С 1 января 2014 года предусмотрено включение вакцинации против пневмококка в Национальный календарь прививок Российской Федерации.

Исследования, проведенные во многих странах мира, показали, эпидемиологическую эффективность массового примепени ПКВ7 вакцины для профилактики инвазивных пневмококковых инфекций у детей младше 5 лет. Одновременно с этим существенно снизился и уровень носительства S. pneumoniae, что способствовало снижению заболеваемости пневмококковой инфекцией у не привитых детей и взрослых [24].

Вместе с тем, на фоне снижения заболеваемости инфекциями, вызываемыми «вакцинными» серотипами, отмечается возрастание роли «невакцинных» серотипов [102, 107].

Таким образом, постоянное появление новых серогрупп пневмококков, замещение существующих серотипов в условиях широкомасштабной вакцинопрофилактики определяют актуальность постоянного надзора, позволяющего своевременно выявлять изменение состава серотипов и устойчивости к антибиотикам у пневмококков.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России, для усовершенствования подходов к эмпирической и этиотропной терапии пневмококковой инфекции и к оптимизации специфической профилактики пневмококковой инфекции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

4. Оценить соответствие серотипов S. pneumoniae, входящих в состав зарегистрированных в РФ 7-, 10- и 13-валентных конъюгировапных вакцин, с серотипами пневмококков, циркулирующих в различных регионах России у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковой инфекции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В представленной работе впервые:

2. Установлено, что большинство вакцинных серотипов пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, были выявлены у штаммов, характеризующихся антибиотикоустойчивостыо к пенициллину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и ко-тримоксазолу (триметоприму/сульфаметоксазолу).

3. Выявлено соответствие серотипов изученных штаммов пневмококка с серотипами, входящими в состав 7-, 10-, 13-валентных конъюгированных пневмококковых вакцин, что обосновывает целесообразность вакцинопрофилактики пневмококковой инфекции.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. На территории РФ у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций в возрасте до 5 лет, циркулируют «вакцинные» серотипы пневмококка, которые характеризуются известной высокой частотой распространенности штаммов резистентных к антибиотикам разных групп: пенициллину, эритромицину, клиндамицину, ко-тримоксазолу и тетрациклину.

2. Выявленная высокая степень корреляции серотипов S. pneumoniae, циркулирующих у детей, с серотипами, входящими в состав конъюгированных пневмококковых вакцин, позволяет рекомендовать их включение в календарь профилактических прививок Российской Федерации.

3. Пенициллины, макролиды и линкозамиды сохраняют высокую активность в отношении пневмококков и могуг рассматриваться в качестве

препаратов выбора для терапии пневмококковых инфекций различной локализации.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ.

Результаты исследований были использованы как рекомендации при принятии Федерального закона о включении в национальный календарь профилактических прививок конъюгированных пневмококковых вакцин для иммунизации детей с 7 до 9 месяцев на территории Российской Федерации (Федеральный закон от 21.12. 2013г. №368. О внесении изменений в ст.9 Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней»).

Результаты исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Резистентность ппевмотроппых микроорганизмов в Хабаровском крае и алгоритм антимикробной терапии внеболышчных пневмоиий у детей» (Хабаровск, 2011), утвержденных Министерством здравоохранения Хабаровского края, ХФ ДИЦ ФПД СО РАМ НИИ ОМИД.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, клинической фармакологии, кафедры госпитальной педиатрии с курсом неонаталогии ФПК и ППС ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России, лаборатории ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и используются в программах циклов повышения квалификации врачей — бактериологов и семинарах для практических врачей, проводимых в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.

микробиологической лаборатории НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Полученные автором результаты представлены и обсуждены па заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2011, 2013); XIX, XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012, 2013); на XIII, XIV, XV Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2011, 2012, 2013); на XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012); на VII национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2012); на межрегиональном саммите по проблеме пневмококковой инфекции (Киев, 2013); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, факультетской терапии, ЦПИЛ, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области» и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2012); 7 World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (WSPID) (Melbourne, Australia, 2011); 52 Annual Meeting of the European Society for Paediatric Research (Great Britain, Newcastle, 2011); European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseaes (Berlin, Germany, 2013); апробация диссертации состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, биологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (протокол № 19 от «27» сентября Смоленск, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 -в рекомендованных ВАК журналах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, результатов, обсуждения полученных данных, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 222 источника, в том числе 42 отечественных и 180 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 12 рисунками.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Эпидемиологические особенности пневмококковых

инфекций

Самые ранние упоминания о клинической значимости пневмококков относятся к концу XIX века. Так в 1875 году Эдвин Клебс впервые описал их наличие в плевральной жидкости у пациентов с пневмонией. В последующие несколько лет была выявлена роль данных микроорганизмов не только в развитии бронхолегочных заболеваний, но и в этиологии инфекций кровотока, клапанов сердца, ЦЫС, среднего уха и суставов. В 1881 году одновременно и независимо друг от друга военный врач Георг Миллер Стернбер

Информация о работе

Чагарян, Аида Нуримановна
кандидата биологических наук
Смоленск, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих у детей в различных регионах России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы