Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к β-лактамным антибиотикам

Савинова, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к β-лактамным антибиотикам
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к β-лактамным антибиотикам"

4841763

Савинова Татьяна Александровна

Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к ß-лактамным

антибиотикам

03.02.03 - Микробиология, 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

4841763

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Сидоренко Сергей Владимирович

Ведущая организация: Государственное Образовательное Учреждение Высшего профессионального образования «Санкт-петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (ГОУ ВПО СПб ГПМА Росздрава)

Защита диссертации состоится «¿5» МИр']С\ 2011 г. в /у часов на заседании совета Д 208.130.01 при ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Мин-здравсоцразвития России (123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бондаренко Виктор Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Митрохин Сергей Дмитриевич

Ученый секретарь

Диссертационного совета /¡^

доктор медицинских наук, профессор

;ор /

Русакова Е.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Streptococcus pneumoniae - возбудитель менингита, пневмонии, обострений хронического бронхита, отита и синусита, относится к клинически и социально наиболее значимым микроорганизмам. Формирование пневмококками, как и другими микроорганизмами, устойчивости к антибактериальным препаратам является основной причиной снижения эффективности этио-тропной терапии инфекционных болезней, удлинения сроков госпитализации пациентов и увеличения летальности Применительно к пневмококкам наиболее актуальной представляется проблема их устойчивости к ß-лактамным антибиотикам (БЛА) (Hansman D.B., 1967) поскольку именно эти препараты составляют основу этиотропной терапии пневмококковых инфекций.

Устойчивость пневмококков к БЛА опосредуется достаточно сложными и не до конца понятными механизмами. К настоящему времени в развитии резистентности однозначно установлена роль модификации генов трех пенициллинсвязывающих белков (ПСБ) - ПСБ1а, ПСБ26 и ПСБ2х (Stanhope M.J., 2008; Tait-Kamradt A.G., 2009). Продуктами модифицированных генов являются ПСБ со сниженной аффинностью к БЛА. В формировании устойчивости обсуждается также возможная роль некоторых других механизмов (Hakenbeck R., 1999; Filipe S.R., 2000; Smith А.М, 2001; Dias R, 2009).

Закономерности распространения антибактериальной резистентности среди пневмококков во многом определяются особенностями структуры популяции этих бактерий. Согласно современным представлениям в глобальной популяции пневмококков одновременно происходят процессы формирования, распространения и эволюции отдельных генетических линий (клонов или клональных комплексов), а также горизонтальный обмен генов (вирулентности, резистентности, капсульных полисахаридов) между ними. Происходит также горизонтальный обмен генами с родственными микроорганизмами (Streptococcus mitis, Streptococcus oralis и др.). Однако многие детали этих процессов на глобальном и локальном (Российская Федерация) уровнях остаются неизученными.

Кроме того в настоящее время актуальна проблема точной идентификации пневмококков. Наиболее часто сложности в идентификации встречаются при исследовании образцов из респираторного тракта. Населяющие одни и те же экологические ниши S. mitis и S. oralis настолько близки к S. pneumoniae, что их дифференциальная идентификация сильно затруднена. Ошибочная идентификация S mitis и S. oralis как S. pneumoniae может приводить к искажению данных об этиологии респираторных инфекций и распространении антибиотикорезистентности.

Таким образом, разработка и адаптация методов микробиологического и молекулярного контроля над распространением резистентности к БЛА среди пневмококков представляется актуальной проблемой, решение которой подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Цель исследования

Изучить динамику распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к БЛА, и оценить их разнообразие на территории Российской Федерации (РФ) методами бактериологии и молекулярно-генетического анализа. Задачи исследования

1. Определить чувствительность клинических изолятов S. pneumoniae к БЛА и охарактеризовать динамику распространения резистентности;

2. Разработать высокопроизводительный метод выявления в генах ПСБ S. pneumoniae мутаций, приводящих к формированию резистентного к БЛА фенотипа;

3. Оценить возможность прогнозирования устойчивости S. pneumoniae к БЛА на основании анализа генов ПСБ (рЪрА, pbp2b, pbpX);

4. Оптимизировать протокол ПЦР-типирования капсульных антигенов, пригодный для установления серотипа S. pneumoniae, применительно к микробной популяции, циркулирующей на территории РФ;

5. Охарактеризовать с помощью метода ПЦР-типирования капсульных антигенов и с помощью мультилокусного сиквенс-типирования популяцион-ную структуру S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к БЛА.

Научная новизна

Проведена фенотипическая, а также генетическая характеристика клинических изолятов S. pneumoniae, резистентных к БЛА, в том числе разработан высокопроизводительный метод, основанный на реакции мшшсеквени-рования с последующим масс-спектрометрическим анализом, позволяющий быстро и эффективно выявлять мутации, приводящие к формированию резистентного фенотипа. С помощью разработанного метода проведена оценка распространенности значимых мутаций среди клинических изолятов S. pneumoniae.

Впервые охарактеризована популяционная структура изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к пенициллину, циркулирующих на территории РФ с помощью перспективного метода мультилокусного сиквенс-типирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST), часть изолятов охарактеризована методом ПЦР-типирования капсульных антигенов, позволяющим установить принадлежность 5. pneumoniae к определенному серотипу. Установлено, что среди изолятов с повышенной устойчивостью к пенициллину 39,7 % относятся к трем глобально распространенным клональным комплексам (СС81, СС271 и СС315). Данные об изолятах, выделенных на территории РФ, внесены в международную базу данных MLST (http://spneumoniae.mlst.net).

Практическая значимость

Полученные данные о динамике распространения изолятов S. pneumoniae, резистентных к БЛА в различных регионах РФ могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии респираторных инфекций. Так, данные полученные в ходе исследования, позволяют прогнозировать высокую эффективность бензилпеннциллина, амоксициллина и цефотаксима при респираторных пневмококковых инфекциях.

Разработанный метод выявления мутаций в генах ПСБ

может быть положен в основу создания диагностических тест-систем, направленных на обнаружение устойчивости S. pneumoniae к БЛА, в том числе непосредственно в клиническом материале больного.

Результаты исследования также имеют значение для понимания механизмов распространения, циркуляции и эволюции изолятов S. pneumoniae. Так, установлено, что устойчивость к пенициллину клинических изолятов S. pneumoniae, циркулирующих на территории РФ, связана, преимущественно, с распространением глобальных, множественно-устойчивых клональных комплексов этих бактерий; также установлено, что большинство таких изолятов относятся к «вакцинным», что говорит о перспективности антипневмококковой вакцинации как пути сдерживания распространения антибактериальной резистентности среди этих бактерий.

Результаты диссертационной работы были систематизированы и внедрены в педагогическую практику кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. В приложении представлены копии документов, подтверждающих практическую значимость работы («Акт внедрения результатов диссертационной работы в практику кафедры микробиологии РМАПО»).

Основные положения, выносимые на защиту

1. На территории РФ наблюдается тенденция к росту устойчивости пневмококков к БЛА на фоне выраженных колебаний этого показателя в отдельных регионах;

2. Отобраны специфичные мутации в генах ПСБ (рЪрА, pbp2b, pbpX), обнаружение которых позволяет прогнозировать устойчивость S. pneumoniae к БЛА;

3. Популяция S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к БЛА, циркулирующая на территории РФ, характеризуется выраженной кло-нальностью и представлена в основном серотипами пневмококка, входящими в состав 13-валентной пневмококковой вакцины.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (США, 2006), Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Германия, 2007; Финляндия, 2009), II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (Россия, 2010), одобрены на заседаниях кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России в 2007 - 2010 гг.

Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России 24 мая 2010 года.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с соискателем Боровской А.Д.

Публикация научных исследовании. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 листах и включает разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 317 источников, из них 15 - отечественных авторов, 302 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 27 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микробиологические исследования. В исследование были включены клинические изоляты S. pneumoniae, выделенные в течение 1998-2007 гг. в лабораториях лечебных учреждений Москвы, Санкт-Петербурга, Ярославля, Томска, Иркутска и Владивостока от пациентов с респираторными инфекциями различной локализации (острые синуситы, острые средние отиты, обострение хронических бронхитов, пневмонии, пневмонии с бактериемией, менингиты, конъюнктивиты). Источниками выделения бактерий были: мокрота, аспираты из синуса и среднего уха, мазки из зева, кровь, спинномозговая и плевральная жидкости и др.

Идентификацию S. pneumoniae осуществляли на основании культу-ральных, морфологических свойств, отрицательных результатов каталазного теста, чувствительности к оптохину, а также с помощью коммерческих тест-систем Slidex pneurao-Kit (BioMerieux, Франция) и BBL Crystal Gram-Positive (BD, США). В качестве контроля использован референтный штамм S. pneumoniae АТСС 49619.

Чувствительность изолятов к бензилпенициллину, ампициллину, амок-сициллину, цефуроксиму, цефотаксиму, а также эритромицину, кларитроми-цину, клиндамицину, левофлоксацину, тетрациклину, хлорамфениколу и ко-тримоксазолу (все препараты производства Sigma, США) определяли методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BBL, США) согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, 2009) и Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания, утвержденные Г.Г. Онищенко, 2004) в 96-лунковых планшетах для иммунологических исследований.

Определение серотипов пневмококков проводили в реакции набухания со специфическими антисыворотками.

Выделение ДНК. ДНК из суточной культуры, выращенной на твердом колумбийском агаре (BioMerieux, Франция), выделяли с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции,

Полимеразная цепная реакция. Для амплификации фрагментов генов S. pneumoniae, связанных с механизмами формирования резистентности к БЛА (pbpX, pbp2b, pbpÄ), использовали оригинальные праймеры, представленные в табл. 1.

Для амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» с целью последующего мультилокусного сиквенс-типирования использовали ранее рекомендованные праймеры (Enright М.С., 1998).

Для ПЦР-типирования капсульных антигенов использовали предложенные ранее праймеры, специфичные к вариабельным участкам генов cps, кодирующих капсульные полисахариды следующих сероти-пов/серогрупп: 1, 2, 3, 4, 5, 6А/6В/6С, 7F/7A, 7С/(7В/40), 8, 9L/9N, 9V/9A, ЮЛ, 10F/(10C/33C), 11АУ1ГО, 12F/(12A/44/46), 13,14,15A/15F, 15В/15С, 16F, 17F, 18A/18B/18C/18F, 19A, 19F, 20, 21, 22A/22F, 23A, 23B, 23F, 24A/24B/24F, 31, 33F/(33A/37), 34, 35A/(35C/42), 35B, 35F/47F, 38F/25F, 39F (Pai R., 2006, Dias C.A., 2007, Pimenta F.C., 2009).

Таблица 1.

Праймеры, используемые для амплификации генов, кодирующих детерминанты резистентности к ß-лактамным антибиотикам__

Ген Название праймера Последовательность S' 3' Размер продукта (п.о.)

pbpX Pbp2x-F QAGGACTTTGTTTGGCGTGAT 987

Pbp2x-R TCACCAGGTGAAATATCCTTGA

pbp2b Pbp2b-F CATCTGGATAAATATGGCAATATG 921

Pbp2b-R GGCAACCTGATAAAAACCTTG

pbpA Pbpla-F CCAGACGATGAATTGCAAGTCG 826

Pbpla-R CTGTCCATACAGCCATTGAATAT

ПЦР проводили в амплификаторе РТС-240 DNA Engine Tetrad2 (MJ Research Bio-Rad, США) с последующим анализом продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле.

Минисеквенирование проводили с праймерами, подобранными к точкам полиморфизмов: Т338А/Р, I371T, R384G, М400Т, Q552E, N605T (ген pbpX), Т445А, E475G, T488A/S (ген pbp2b\ T371A/S, Р432Т, L539W, TSQF574-577NTGY (ген pbpA). Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции минисеквенирования проводили с использованием MALDI-времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Dal tonics, Германия). Для записи и обработки масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): flexControl 2.4 и flexAnalysis 2.4.

Определение нуклеотидной последовательности генов проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония). ГТол-норазмерную последовательность генов получали путем склеивания нуклео-тидных фрагментов с использованием программного продукта «Vector NTI® Suite v. 9» (Informax Inc, США).

Анализ последовательностей генов «домашнего хозяйства» с определением сиквенс-типов (Sequence Type, ST) проводили с использованием базы данных MLST (http://spneumoniae.mlst.net). Для определения клональности изолятов использовали алгоритм eBURSTv3, интегрированный в MLST-вебсайт (http://eburst.mlst.net).

Для поиска гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей в международной базе данных GenBank использовали программу BLAST (http://wwvv.ncbi.nlrn.nih.gov/BLAST).

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1 Характеристика антибактериальной активности БЛА в отношении S. pneumoniae и динамика распространения устойчивости

Распределение МПК БЛА в отношении S. pneumoniae.

На коллекции из 2760 клинических изолятов 5. pneumoniae, собранных в течение 1998-2007 гг. в разных регионах РФ, проанализировано распределение МПК бензилпенициллина, амоксициллииа, цефогаксима и цефурокси-ма в отношении S. pneumoniae в сравнении с распределением МПК этих антибиотиков из базы Европейского комитета по оценке антибиотикочувстви-тельности (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EU-CAST, http://www.eucast.org) (рис. 1).

а) пенициллин b) амоксициллин

Рисунок 1. Сопоставление распределений МПК БЛА клинических изолятов S. pneumoniae, выделенных в данном исследовании, с данными для изолятов, представленными в базе EUCAST. Изоляты, относящиеся по определению EUCAST к «дикой» популяции, выделены светло-серым цветом.

EUCAST вводит понятие микробиологической «точки

отсечения» - величины МПК антибактериального препарата, отделяющей популяцию микроорганизмов, лишенную каких-либо механизмов устойчивости («дикий» тип), от популяции, обладающей какими-либо механизмами устойчивости к конкретному антибактериальному препарату («не дикий» тип). «Точки отсечения» для конкретных препаратов являются постоянными видовыми признаками микроорганизмов.

Следует отметить, что характеры распределения МПК пенициллина, амоксициллина, цефуроксима и цефотаксима очень близки. Для перечисленных антибиотиков EUCAST предлагает фактически одинаковые «точки отсечения» (0,06 мкг/мл для бензилпенициллина, амоксициллина, цефотаксима, 0,12 мкг/мл для цефуроксима), что отражает практически одинаковый уровень их природной антипневмококковой активности. Из рис. 1 следует, что изученные клинические изоляты представлены «дикой» и «не дикой» популяциями (по определению EUCAST). На основании визуальной оценки можно заключить, что характер распределения МПК антибиотиков в отношении «дикой» популяции изученных изолятов принципиально сходен с распределением их МПК в отношении «дикой» популяции представленной в базе EUCAST. Полученные результаты, прежде всего, характеризуют адекватность и стандартность использованных методов оценки антибиотикочувстви-тельности. Данные по распределению МПК БЛА, полученные в ходе настоящего исследования были проанализированы экспертами EUCAST и включены в общую базу данных.

Резистентность S. pneumoniae к пенициллину, амоксициллину, цс-фуроксиму и цсфотаксиму.

Следует отметить, что в настоящее время единой точки зрения о критериях чувствительности к антибактериальным препаратам не сложилось. Так, CLSI предлагает только клинические критерии чувствительности, предназначенные для прогнозирования эффективности лечения. EUCAST предлагает микробиологические («точки отсечения») и клинически ориентированные критерии чувствительности. При этом как CLSI, так и EUCAST рекомендуют различные критерии чувствительности в зависимости от источника выделения микроорганизма, а также различные схемы лечения в зависимости от уровня чувствительности бактерий.

В настоящей работе для оценки антибиотикочувствительности были использованы микробиологические критерии EUCAST. На рис. 2 приведены данные о динамике распространения устойчивых к БЛА изолятов S. pneumoniae в Москве и других регионах. Следует отметить, что за период наблюдения с 1998 по 2007 г. в Москве происходили значительные колебания в частоте распространения устойчивости к пенициллину: от 10,8 % в 2004 году до 23,8 % в 2002. В период с 2005 по 2007 г. частота устойчивости нарастала и достигла уровня 23,4 %. В других регионах также отмечалась тенденция к росту резистентности: в Иркутске, Санкт-Петербурге и Томске частота выделения изолятов с повышенной устойчивостью достигла максимума в 2006 году и составила 17,8 %, 14,5 % и 6,3 % соответственно.

«г »л ч> «t <л vo

ООО ООО

ГЫ N N ГЯ

/ / / / / / s 8 °

V л. Иркутск Томск С-Петербург

Годы Регион, годы

пенициллин —*—амоксициллин —Ж— цефуроксим —&— цефотаксим

Рисунок 2. Динамика распространения клинических изолятов S. pneumoniae, резистентных к БЛА в Москве (а) и других регионах (Ь).

Динамика распространения устойчивых к амоксициллину изолятов как в Москве, так и в других регионах практически идентична динамике устойчивости к пенициллину. Незначительные различия касались лишь относительных значений, частота устойчивости к амоксициллину в каждый период времени была на 2,5 % - 8,7 % ниже, чем к пенициллину.

В течение периода наблюдения в Москве отмечали также рост частоты выделения устойчивых к цефуроксиму изолятов с максимумом в 2006 году (18,6 %). Одновременно возрастал и уровень устойчивости пневмококков, так в 2006 году 14% изолятов демонстрировали МПК более 1,0 мкг/мл. В других регионах также отмечено распространение изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к цефуроксиму. В Санкт-Петербурге и Иркутске частота встречаемости таких изолятов достигла в 2006 году 20 %, в Томске -9 %. Однако, частота выделения изолятов с высоким уровнем устойчивости (МПК >1,0 мкг/мл) не превышала 5 %.

В Москве динамика распространения устойчивых к цефотаксиму пневмококков была практически аналогична динамике распространения устойчивости к пенициллину - пики и падения отмечались в те же периоды времени, с колебаниями от 8 % до 20 %. В Санкт-Петербурге и Иркутске максимальная частота выделения устойчивых к цефотаксиму изолятов была отмечена в 2006 году (15 %), в Томске этот показатель не превышал 4 %.

В целом, частота распространения устойчивых изолятов S. pneumoniae к БЛА в различных регионах в отдельные периоды существенно варьировала. Не рекомендуется использование усредненных данных по распространению резистентных к БЛА изолятов S. pneumoniae в отдельных регионах РФ для оптимизации терапии.

Продемонстрирована достоверная ассоциация (р < 0,001) высокого уровня резистентности к пенициллину с ростом устойчивости к антибиотикам других групп: до 86 % пневмококков с МПК пенициллина > 2 мкг/мл были также устойчивы к макролидным антибиотикам. Высокий уровень перекрестной устойчивости был также с линкозамидами (79,3 %), ко-тримоксазолом (81,5 %) и тетрациклином (89,2 %).

2.2.2 Разработка метода детекции генетических маркеров резистентности S. pneumoniae к БЛА с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии

При выборе значимых маркеров формирования устойчивости пневмококка к БЛА были отобраны три гена - pbpA, pbp2b и pbpX, продукты которых рассматриваются как мишени действия данного класса антимикробных препаратов. Поскольку единого мнения о первичном сайте возникновения мутаций, обуславливающих устойчивость S. pneumoniae к БЛА не существует, мутации в этих генах рассматривались независимо, но с учетом возможного кумулятивного эффекта. Для каждого гена был произведен анализ участка, кодирующий транспептидазный домен фермента. В рассмотрение ассоциации генотип-фенотип включены только те мутации, вклад которых в снижение аффинности ПСБ к пенициллину экспериментально показан в ходе кинетических экспериментов по изменению константы диссоциации, а также с привлечением искусственного мутагенеза и трансформации. По этому принципу для исследования отобраны мутации: Т338А/Р, I371T, R384G, М400Т, Q552E, N605T (ген pbpX), Т445А, E475G, T488A/S (ген рЪр2Ь), T371A/S, Р432Т, L539W, TSQF574-577NTGY (генрЪрА).

Для детекции известных мутаций в генах ПСБ S. pneumoniae, приводящих к соответствующим аминокислотным перестройкам, нами был разработан метод минисеквенирования с последующим определением молекулярной массы продуктов реакции с помощью времяпролётной масс-спектрометрии с лазерной десорбционной ионизацией в присутствии вспомогательного вещества - матрицы (MALDI-ToF масс-спектрометрии).

В основе предложенного подхода лежит реакция ферментативного достраивания олигонуклеотидного праймера с участием дезокси- и дидезокси-нуклеотидтрифосфатов. Последние обеспечивают специфическую остановку синтеза (в зависимости от нуклеотидной последовательности матричной ДНК) и получение набора нуклеотидных цепочек, отличающихся друг от друга по длине на 1 - 4 нуклеотида.

Последующий анализ продуктов реакции с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии позволяет сравнить молекулярные массы теоретически предсказанных и экспериментально полученных продуктов, и сделать заключение о наличие или отсутствие мутаций в исследуемом локусе.

На основании сравнения нуклеотидных последовательностей генов ПСБ, представленных в GenBank, были проанализированы значимые полиморфизмы в выбранных локусах и осуществлен дизайн внутренних прайме-ров с учетом всех возможных вариантов нуклеотидных замен, таким образом,

чтобы осуществлялся отжиг одного из праймеров в непосредственной близости к интересующей нас точке полиморфизма. Работу данной системы можно проиллюстрировать на примере анализа мутаций гена рЬрХ в точке полиморфизма 338 (рис. 3).

Intern;, [a.u.l А

6760 36

6 744,12

6792,37

+dA+ddC 79

Д587

7331,91 '»WH

Intens, [a.u.l В

6761:84

6743,72

6793,08

+ddC Д274.32

7018,04

ftz..

Inten!

[au]

6745,24

•At^*^Д

6794,72

6763,41

7680,78,

HdA+dG+ddC

l Д917.37]

Inten!

6760.60

6742.57

6790,99 ?69172

4+2dA+ddC

Д 900,73

tWwftvtrtJ Wn

mlz

Рисунок 3. Масс-спектры продуктов реакции минисеквенирования гена рЬрХ (точка полиморфизма Т338).

Примечание: Первые три пика соответствуют молекулярным массам внутренних праймеров, четвертый пик соответствует продукту достраивания одного из праймеров: А - продукты достраивания праймера Р-338-1 при выявлении «дикого» генотипа в положении Т338 (Теоретическая разница молекулярных масс продукта достраивания и исходного праймера (Г) = 586 Da, экспериментальная (Э) = 587,79 Da); В - продукты достраивания праймера Р-338-1 при выявлении мутантного генотипа Т338Р (Т = 273 Da, Э = 274,32 Da); С - продукты достраивания праймера Р-338-2 при выявлении мутантного генотипа Т338А (Т = 916 Da, Э - 917,37 Da); D - продукты достраивания праймера Р-338-3 при выявлении «дикого» генотипа в положении Т338 (Т = 899 Da, Э = 900,73 Da).

Данный метод по точности идентификации однонуклеотидного полиморфизма сопоставим с прямым определением нуклеотидной последовательности интересующих локусов, при этом является значительно более простым и дешевым в исполнении (стоимость расходных материалов сопоставима со стоимостью стандартной ПЦР).

С целью валидации разработанной системы детекции

генетических маркеров резистентности были секвенированы фрагменты генов рЬрХ, рЬр2Ъ, рЬрА, кодирующих транспептидазные домены ПСБ, для 45, 22 и 62 изолятов, соответственно. Внутри рассмотренной выборки результаты, полученные методом минисеквенирования, полностью совпали с результатами классического секвенирования по Сэнгеру, что говорит о высокой точности разработанного метода.

2.2.3 Результаты детекции генетических маркеров резистентности методом минисеквенирования

Всего методом минисеквенирования было проанализировано 226 клинических изолятов с известной чувствительностью к пенициллину и цефо-таксиму на наличие значимых мутаций в генах рЬрХ, рЬр2Ь и рЬрА.

Анализ отобранных точек полиморфизма в гене рЬрХ позволил выявить десять сочетаний мутаций, причем наиболее часто встречающейся была комбинация мутаций в локусах Т338, 1371, Ю84, N605 (33,6 %). Сочетание мутаций в 11384, 0552 и в Т338,11384 было обнаружено у 19,5 % и 7,1 % изолятов, соответственно. Остальные варианты комбинаций встречались у единичных изолятов, а изолированные мутации обнаружены только в кодоне (2552 (3,1 %).

Три комбинации мутаций было выявлено при анализе точек полиморфизма в гене рЬр2Ь, причем изолированные мутации в кодонах Е475 и Т488 не встречались, а в Т445 были обнаружены у 12 изолятов (5,3 %). Наиболее часто встречающимся было сочетание трех мутаций (62,8 %).

Среди проанализированной выборки отсутствовали изоляты с мутациями только в гене рЬрА. Этот факт, в совокупности с более низкой частотой выявляемое™ таких мутаций, может косвенно указывать на роль ПСБ 1а как вторичного, дополнительного звена в формировании устойчивости к пенициллину, что вполне согласуется с общепринятой точкой зрения (гарип А., 2008). Всего было выявлено три варианта комбинаций мутаций, наиболее часто встречались изоляты с мутациями в трех локусах Т371, Р432, ТЭС>Р574-577 (38,5 %).

Поскольку достоверной информации о существовании кумулятивного эффекта мутаций в ПСБ1а нет, и оценить его наличие в рамках проведенного исследования не представляется возможным, мутации в гене рЬрА не дискриминировали и рассматривали в совокупности как рЬрАтиЬ приравненные по частоте к аминокислотным заменам в Т8<2Р574-577 кодонах. Исхода из аналогичных предпосылок, сформирован рЬр2ЬтЛ генотип, равный по частоте встречаемости заменам Т445А. Полученное распределение изолятов с различными генотипами в зависимости от уровня чувствительности к пенициллину представлено в табл. 2.

По данным генетического тестирования, 65/226 (28,8 %) изолятов относились к «дикому» генотипу (не содержали мутаций в исследованных локусах). Среди оставшейся части выборки были выявлены 17 различных комбинаций генетических маркеров, потенциально вовлеченных в формирование резистентности пневмококков к пенициллину.

Все изоляты, чувствительные к пенициллину (п = 52, МГ1К < 0,06 мкг/мл) не имели мутаций ни в одном из проанализированных локусов, а наличие любой комбинации мутаций коррелировало с превышением значения MIIK «точки отсечения»,. (> 0,06 мкг/мл). В целом, из 174 изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к пенициллину мутации в рассмотренных ГТСБ были обнаружены в 161 (92,5 %) случае (табл. 2), что реально свидетельствует о высокой диагностической чувствительности метода.

Таблица 2.

Распределение изолятов S. pneumoniae в зависимости от уровня чувствительности к пенициллину для каждого генетического варианта _

Генотип изолята, согласно тестированию генов ПСЕ N (%) Категория чувствительности N (%) S I R

wt 65 (28,8) 52 (80) 13 (20)

pbpXQ552E 1 (0,4) 1(100)

рЬр2Ьтл pbpArout 5 (2,2) 4(80) 1(20)

pbpX Q552E, pbp2bmi 4(1,8) 4(100)

pbpX Q552E,pbp2bmut, рЪрАм 2 (0,9) 2 (100)

pbpX R384G, QS52E,рЬР2ЬтЛ 11(4,9) 11(100)

pbpX T338mut, R384G, рЬр2Ьты 15(6,7) 15(100)

pbpX 1371Т, N605T, рЬр2Ьтл 1(0,4) 1 (100)

pbpX R384G, QS52E,рЬр2Ьтф рЬрАтЛ 33 (14,7) 33 (100)

pbpX T338mut, Q552E,pbp2bM рЬрАта 1 (0,4) 1 (100)

pbpX T338mut, R384G,p6/)2Anl„t, pbpAma 1 (0,4) 1 (100)

pbpX T338mut, I371T, R384G,рЬр2Ь^л 1 (0,4) 1 (100)

pbpX T338mut, I371T, R384G,pfcp2£w pbpAM 3(1,3) 3(100)

pbpX T338mut, R384G, N605T, рЬр2ЬшЛ рЬрАщЛ 5(2,2) 4(80) 1(20)

pbpX T338mut, I371T, R384G, N60ST, 1 (0,4) 1 (100)

pbpX T338mut, I371T, R384G, Q552E, рЬр2ЬтЛ pbpA„M 1 (0,4) 1 (100)

pbpX T338mut, 137IT, R384G, N605T,pbp2blMI, pbpAma 75 (33,3) 17(23) 58 (77)

pbpX T338mut, I371T, R384G, QSS2E, N605T, рЬр2ЬтЛ 1 (0,4) 1 (100)

рЬрАтЫ

Всего 226 (100) 52 (23,0) 111 (49,1) 63 (27,9)

Примечание: " S - чувствительные (МПК < 0,06 мкг/мл), I - с промежуточной устойчивостью (МПК = 0,12-1 мкг/мл), R - устойчивые (МПК > 2 мкг/мл) по критериям CLSI.

Сочетания определенных мутаций коррелируют с уровнем резистентности пневмококков к пенициллину. Около 40 % изолятов с промежуточным уровнем резистентности (МПК = 0,12 - 1,0 мкг/мл) несли мутации Я384С, С>552Е в ПСБ2х и мутации в ПСБ26 (из них 75 % обладали также мутантным ПСБ1а). Промежуточный уровень устойчивости в 15 % случаев связан с мутациями в 4 локусах ПСБ2х (Т338ггш1,1371Т, Я3840, И605Т) совместно с мутациями в ПСБ26 и ПСБ1а, причем последним генотипом обладали 92 % высокорезистентных изолятов (МПК > 2 мкг/мл). Полученные нами результаты хорошо соотносятся с литературными данными, говорящими о существовании двух семейств, последовательностей ПСБ2х-. первое семейство характеризуется наличием замены ТЗЗвтЩ и связано с высокими уровнями резистентности, второе семейство с мутацией <2552Е связано с промежуточными уровнями устойчивости к пенициллину. Причем по литературным данным

одновременное наличие мутаций в локусах Т338 и Q552 является достаточно редким и коррелирует с высокими уровнями устойчивости к БЛА. Один высокорезистентный изолят (МПК = 4 мкг/мл) из проанализированной выборки обладал таким сочетанием мутаций.

В случае изучения феномена повышения устойчивости S. pneumoniae к цефотаксиму не наблюдалось четкого соответствия повышенного уровня резистентности с наличием мутаций в генах ПСБ, что может свидетельствовать о разных точках полиморфизмов, вовлеченных в формирование устойчивости к пенициллинам и цефалоспоринам.

2.2.4 Разработка метода ПЦР-типирования капсульных антигенов, позволяющего установить серотип клинических изолятов S. pneumoniae

Праймеры, специфичные к вариабельным участкам генов, кодирующих капсульные полисахариды, были протестированы на ограниченной группе изолятов с известными ссротипами, что позволило оптимизировать условия мультипраймерной ПЦР ио сравнению с вариантами, предложенными в статьях (Pai R., 2006; Saha S.K., 2008).

В результате внесенных изменений разработанная схема представляла собой каскад из 10 мультипраймерных реакций, проводимых последовательно. Праймерные системы оптимизированы таким образом, что в ходе первых четырех раундов амплификации удалось установить серотипы для большинства клинических изолятов S. pneumoniae.

Валидация была осуществлена на группе изолятов, серотип которых был определен классическим способом, а также было проведено секвениро-вание фрагментов срт-локусов.

2.2.5 Результаты определения серотипов клинических изолятов S. pneumoniae методом ПЦР-типирования капсульных антигенов

Молекулярный метод позволил определить серотипы 93,6 % (221/236) изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к пенициллину и/или другим антибиотикам, выделенных в 2003-2007 гг. Невозможность сероти-пировать 6,4 % изолятов может быть связана с присутствием серотипов, не включенных в мультинраймерные реакции, или с бактериальной нагрузкой ниже предела чувствительности мультипраймерной ПЦР.

Из 39 пар праймеров системы ПЦР-типирования капсульных антигенов только 22 обладали полной специфичностью в отношении конкретных серотипов, а 17 пар праймеров были специфичны в отношении серогрупп (6, 1 , 22,24) или 2-4 серотипов, относящихся к одной серогруппе, или обладающих перекрестной реактивностью (например, 9V/9A, 11A/11D, 33F/33A/37, 35А/35С/42). В результате использования молекулярного метода, дополненного данными классического серотипирования, было дифференцировано 29 серотипов/серогрупп: 1, 3, 4, 6 (в том числе 6А и 6В), 9V/A (в том числе 9А), 9L, 9N, 10А, IIB, 11A/D, 13,14, 15A/F (в том числе 15А), 16,17А, 18A/B/C/F, 19A, 19F, 23A, 23F, 33F/A/37,35А/С/42 (в том числе 35С), 35F, 39F.

Наиболее распространенными были серотипы 23F (35,2 %) и 19F (13,1 %). К серогруппе 6 относились 18,2 % изолятов. По 3,4 % изолятов относились к серотипу 3 и серогруппе 18, а 4,7 % изолятов - к серотипу 14. Семь

(3,0 %) и пять (2,1 %) изолятов относились к серотипам 6А и 19А соответственно, все изоляты обладали множественной резистентностью. Следует отметить, что использование вакцин без таких серотипов может привести к распространению резистентных изолятов.

К сожалению, использование данного метода ограничивается специфичностью некоторых пар праймеров из-за высокой гомологии последовательности капсульных антигенов в серогруппах 6 и 18. Для дифференцирования таких изолятов необходимо использовать классическое серотипирова-ние или секвенирование локусов, кодирующих капсульные антигены.

Тем не менее, полученные данные имеют определенное значение для оценки перспективности антипневмококковой вакцинации. Так, 63,1 % изолятов относились к серотипам, против которых направлена 7-валентная пневмококковая вакцина, рекомендованная к использованию в России с 2009 года, 63,6 % - к серотипам против которых направлена 10-валентная вакцина и 72,0 % - к серотипам против которых направлена 13-валентная вакцина, рекомендованная к использованию в США и странах Евросоюза с 2010 года.

2.2.6 Мультилокусное сиквенс-типирование

Метод мультилокусного сиквенс-типирования, подкрепленный данными серотипирования и детекции генетических маркеров резистентности, использован для анализа клонального родства изолятов S. pneumoniae, циркулирующих на территории РФ.

MLST в настоящее время также рассматривается как наиболее точный метод дифференцировки стрептококков и идентификации S. pneumoniae (Hanage W.P., 2005). Среди 73 изолятов, которые по классическим фенотипи-ческим признакам следовало отнести к пневмококкам, 10 относились к группе «зеленящих» стрептококков. Ошибки в идентификации пневмококков могут привести к завышению данных о распространении устойчивости к БЛА среди этих микроорганизмов.

Среди 63 клинических изолятов, идентифицированных с помощью MLST как S. pneumoniae, было выявлено 33 различных сиквенс-типа (ST) и 22 клональных комплекса (Clonal Complex, СС). Девять СС были представлены более чем одним изолятом: СС81, СС315, СС271, СС414, СС156, СС280, СС1012, СС15 и СС176. Шесть изолятов относились к сиквенс-типам, не входящим ни в один клональный комплекс. Среди проанализированной выборки было обнаружено 8 изолятов с новыми комбинациями аллелей и пять - с новыми последовательностями одного из семи генов «домашнего хозяйства». Все изоляты с новыми комбинациями аллелей были внесены в международную базу данных MLST и новым аллельным профилям были присвоены следующие номера: 3403,3816,4841,4842,4843,4844, 5180 и 5181.

Фенотипические и генотипические характеристики изолятов представлены в табл. 3. Самым распространенным был ST81, представленный 15 изо-лятами, выделенными преимущественно в Москве. Все изоляты ST81 относились к серотипу 23F, из них 12 обладали одинаковым профилем резистентности: были устойчивыми к пенициллину, цефотаксиму, эритромицину, тетрациклину и хлорамфениколу. Три изолята дополнительно имели устойчи-

вость к левофлоксациау. Генотипические характеристики проанализированных изолятов также показали высокую степень однородности выборки: все изоляты имели детерминанты резистентности к макролид-ным антибиотикам - гены те JE и егтВ. Комбинация мутаций в трех ПСБ была идентичной у подавляющего большинства изолятов, за исключением двух изолятов, обладающих промежуточным уровнем резистентности (МПК = 0,12-1 мкг/мл) к пенициллину.

Вторым по количеству изолятов был СС271, включающий в себя сик-венс-типы: ST236 (п=4), ST651 (п=1) и ST271 (п=1). Все серологически типи-рованные изоляты СС271 относились к серотипу 19F, кроме одного (19А). Несмотря на небольшую выборку, СС271 оказался фенотипически неоднородным: три изолята обладали ассоциированной устойчивостью к пенициллину, эритромицину и тетрациклину, один был устойчив к пенициллину и тетрациклину, и один показал невысокий уровень резистентности к пенициллину. Интересно, что устойчивость к эритромицину у трех изолятов была обусловлена наличием обеих детерминант резистентности - генов егтВ и meJE, а у четвертого - присутствием только mefE. Комбинации маркеров резистентности в ПСБ у четырех высокорезистентных к пенициллину клинических изолятов были идентичными, тогда как изолят с промежуточным уровнем резистентности (МПК = 0,25 мкг/мл) к пенициллину и чувствительный к цефотаксиму не имел значимых мутаций в ПСБ.

Четыре изолята ST315 относились к 6 серогруппе и обладали сходным профилем резистентности (были высоко устойчивы к эритромицину, тетрациклину и умеренно устойчивы к пенициллину). Резистентность к эритромицину обуславливалась наличием гена егтВ. Мутации в ПСБ2х и ПСБ26 были идентичными в трех изолятах (ПСБ 1а «дикого» типа), а в четвертом - были обнаружены дополнительные мутации в ПСБ 1а. Таким образом, ST315 в целом был однороден как по фенотипическим признакам, так и по генотипу.

Изоляты, относящиеся к клональному комплексу СС414, были представлены одним сиквенс-типом (ST1500), и три из них обладали фенотипиче-ской и генотипической однородностью, а один отличался как серотипом (6А), так и генетическими характеристиками и фенотипическим профилем. Клональные комплексы, представленные 2-3 изолятами, имели различающиеся в пределах каждого сиквенс-типа профили резистентности, несмотря на небольшое количество представителей.

Остальные сиквенс-типы были представлены единственными изолятами, они отличались невысоким уровнем устойчивости к пенициллину и низкой частотой ассоциированной устойчивости к антибактериальным препаратам других групп (табл. 3).

Наиболее многочисленные клональные комлексы - СС81, СС271, СС315 относились к международным клонам Spain 23F-1 (АТСС 700669), Taiwan 19F-14 (АТСС 700905), Poland 6В-20 (АТСС ВАА-612) соответственно.

Таблица 3.

Характеристика изолятов S. pneumoniae, относящихся к выявленным клональным комплексам.

СС (%) ST N Серо- МПК антибиотиков, мкг/мл Геиотип устойчивости к БЛА Генотип

тип Пенициллин Цефотак-сим ' )рм I- роми- ДНН Лево-флок-сяцин Ко-три-мокся-зол ПСБ2х (мутации в точках полиморфизма) ПСБ2 6 ПСБ1а устойчивости к макролидам

81 (23.8) 81 2 10 2 1 23F 23F 23F 23F 0,125-0,2S 2-8 4 2 0,125-0,25 0,5->8 8->8 1 >32 32->32 >32 >32 I 1-2 4-8 8 1-4 1->4 >4 >4 338, 384, 60S 338,371,384,605 338, 371,384, 552.605 338,371,384,605 mut» mut miit mut mut mut mut mut cnntí 1 ím'fE

271 236 1 19F 4 1 >32 0,5 >4 338, 371,384,605 mut mut crmB ^ mcfE

(9,5) 1 1 19F 19F г 0Д5 0,5 0,06 0,25 <0,015 1 0,5 >4 1 338,371,384,605 w.2) mut wt mut wt -

1 19А 1 1 32 0,5 1 338, 371, 384, 605 mut mut ertnB+mefE

271 1 19F 1 1 >32 1 4 338, 371, 384, 605 mut mut ermB+meflí

651 1 19F 2 1 2 1 >4 338,371,384, 605 mut mut me/E

315 (6.3) 315 3 I 6В 6В 0,125-0,25 0,125 0,03-0,06 0,5 >32 >32 0,5 1 1-4 4 338, 384 338, 384 mut mut wt mut errnß

414 (6,3) 1500 1 23F 23F 0,125 0,125 0,06 0,008-0,03 <0,008 0,03 1 1 1 0,5-2 384, 552 384, 552 mut mut mut mut -

1 6А 0,06 0.03 2 1 2 wt wt wt me/E

? ÜI ОО 790 143 1 1 14 14 г 4 1 2 >32 >32 1 0,125 >4 338, 371, 384, 605 338, 371,384, 605 mut mut mut mut crrníl

608 1 19А 4 2 0,06 1 2 338, 371,384,605 mut mi:t -

280 (3,2) 239 1 1 9V/A cpsA + ^ 1 0,25 0,5 0,015 0,125 0,03 1 2 1 0,125 wt wt wt wt wt wt

1012 (3.2) 1012 1 1 33F/A 11A/D 0,5 0,5 0,125 0,5 <0,008 0,008 0,5 1 1 2 wt wt wt wt wt wt -

15(3,2) 423 4844 1 1 19F 6В 0Д5 1 0,25 0,5 0,03 0,5 1 4 4 wt 384, 552 wt mut wt wt

176 93 1 6А I 0,5 >32 1 2 338. 371.384, 605 пни пни егтй

4282 1 срь-А-^ 1 0,5 0,5 1 4 384, 552 шШ ши!

2779(1,6) 2779 1 6В 0,125 0,125 0,03 0,5 >4 338, 371,384 пни тт ■

490(1,6) 3403 1 6А 0,015 0,015 >32 1 >4 \уГ \у1 егтВ

230(1,6) 230 1 № 0,5 0,125 <0,008 I >4 384,552 пни тт -

102(1,6) 102 1 18 0,125 0,03 0.03 0,5 0.5 552 шш «Ч -

90(1,6) 2009 1 6В 0,25 0Д5 0,03 0,5 2 384,552 пни •

439(1,6) 42 1 23А 0,25 0,125 0,25 1 4 384, 552 пни пни -

63(1,6) 3816 1 14 0,125 0,125 >32 1 0,5 552 пни егтВ

123(1,6) 123 1 гзи 0,25 0,125 0,03 1 >4 ми -

801(1,6) 801 1 0,008 0,008 о.оз 1 0,125 V»! -

180(1,6) 505 1 3 0,015 0,015 0,06 1 0,25 и1 «и wt -

2315(1,6) 4843 1 срхА+ 0,03 0,25 0,125 0,25 0,5 384, 552 пни wt -

346(1,6) 1203 1 19К 0,5 0,06 0.06 1 0,5 338, 552 ПН* ти1 -

-(1.6) 323 1 23Р 0,5 0,125 <0,015 0,5 1 384,552 ПНЦ -

-(1,6) 2912 1 19А 0,03 0,03 1 0,5 >4 ии »У) те/Е

- (1,6) 4841 I 23Р 0,25 0,25 <0,008 1 2 552 пни пни -

"(1,6) 4842 1 6 0,5 0,5 <0,008 1 2 384,552 тш «и -

"(1,6) 5180 1 6А 0,015 0,015 >32 1 4 и! И» егтИ

"(1,6) 5181 1 6А 0,03 0,015 2 1 2 и! 1У1 И! сгтВ

-0.6) леи>1 1 1 0,25 0,06 0,03 0,5 0,25 384, 552 тШ пни -

-(1.6) пе\у2 1 6В 0,25 0,125 >32 1 >4 338, 384 шт ИП сгтВ

-(1,6) ле\уЗ 1 19А 2 4 32 1 0,5 338, 371,384, 552 ши! ти1 егтВ

-(1,6) печ4 1 14 0Д5 0,125 <0,008 1 1 384, 552 пни ти1 -

-(1,6) пе\у5 1 г/>л>1- 0,125 0,125 <0,008 0,25 0,25 384, 552 тш пни -

Примечания-^любые мутации;

2) «дикий» тип (отсутствие мутаций);

3) ген срзА амплифицировался, но установить серотип методом ПЦР-типирования капсульных антигенов не удалось;

4) ген срзЛ не амплифицировался;

5) сиквенс-типы с новыми последовательностями одного из семи генов «домашнего хозяйства».

Особенностью изолятов ST81, распространенных в РФ, является наличие двух генов устойчивости к макролидным антибиотикам (егтВ и mefE). Изоляты ST81 с таким генотипом ранее описывали в Юго-Восточной Азии и Южной Африке, для изолятов этого сиквенс-типа циркулирующих в Европе и Северной Америке характерно сохранение чувствительности к макролидным антибиотикам. Все изоляты, выделенные в РФ (по данных настоящего исследования), имели фенотип, характерный для изолятов из Азии, причем часть их обладала устойчивостью к левофлоксацину.

Клональный комплекс 271, представленный в РФ сиквенс-типами 236, 271 и 651, наиболее широко распространен в Юго-Восточной Азии (54,3 %), однако достаточно часто он встречается и в других географических регионах. Причем как в Европе, так и в Азии доминантным является мультирезистент-ный фенотип (пенициллин-, эритромицин-, тетрациклин-устойчивый). Четыре из шести обнаруженных в ходе данного исследования изолятов относились к этому фенотипу.

По данным базы MLST сиквенс-тип 315 наиболее часто встречается на территории Европы (89,1 %) с преобладающим пенициллин-, эритромицин-, тетрациклин-устойчивым фенотипом. Все изоляты ST315, проанализированные в ходе данной работы, обладали таким же фенотипом.

Таким образом, более 39 % клинических изолятов с повышенной устойчивостью к пенициллину, циркулирующих в России, относились к трем глобальным клональным комплексам (СС81, СС271 и СС315). Независимое формирование перечисленных клональных комплексов на территории РФ является маловероятным, скорее всего, произошел их импорт из других географических регионов.

Выводы

1. Частота распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß-лактамным антибиотикам, варьирует в пределах от 3,1 % до 23,8 % в зависимости от региона и периода выделения изолята, что позволяет прогнозировать высокую эффективность эмпирической терапии пневмококковых инфекций дыхательных путей ß-лактамными антибиотиками;

2. Показана достоверная ассоциация высокой устойчивости клинических изолятов S. pneumoniae к пенициллину (МПК > 2 мкг/мл) с устойчивостью к макролидным антибиотикам, линкозамидам, ко-тримоксазолу и тетрациклину,

3. Обнаружение мутаций в генах ПСБ (pbpA, pbp2b, pbpX) разработанным методом минисеквенирования с последующей масс-спектрометрической детекцией продуктов амплификации позволяет прогнозировать устойчивость клинических изолятов S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам;

4. Оптимизирован протокол мультипраймерной ПЦР, позволяющий установить серотип клинических изолятов S. pneumoniae, циркулирующих на территории РФ, на основании вариабельности генов, кодирующих полисахаридную капсулу;

5. Около 72 % изолятов, устойчивых к ß-лактамным антибиотикам, относятся к серотипам, против которых направлена 13-валентная пневмококковая вакцина, что позволяет рассматривать вакцинацию как действенное средство сдерживания распространения резистентных изолятов;

6. Циркулирующая на территории России популяция 5. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß-лактамным антибиотикам характеризуется выраженной клоналыюстью; 39,7 % таких изолятов относятся к трем клональным комплексам (СС81, СС271 и СС315), имеющим мировое распространение.

Список опубликованных работ

1. Боровская, А.Д. Дифференцировка a-гемолитических стрептококков прямым масс-спсктрометрическим профилированием / А.Д. Боровская, E.H. Ильина, Т.А. Савинова, C.B. Сидоренко, С.А. Грудинина, В.М. Говорун// Биоорганическая химия. -2011. - Т. 37. -№ 1. - С. 61-69.

2. Савинова, Т.А, Масс-спектрометрический анализ генетических маркеров резистентности S. pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам / Т.А. Савинова, E.H. Ильина, C.B. Сидоренко // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2010. -N°3. - С. 16-25.

3. Савинова, Т.А. Динамика распространения резистентности к бета-лактамным антибиотикам среди Streptococcus pneumoniae, клиническая значимость результатов / Т.А. Савинова, C.B. Сидоренко, C.B. Буданов, С.А. Грудинина // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - Т. 55. -№1-2.-С. 12-20.

4. Савинова, Т.А. Генетическое разнообразие пенициллинустойчивых Streptococcus pneumoniae / Т.А. Савинова, О.Ю. Филимонова, С.А. Грудинина, C.B. Сидоренко // Журнал инфектологии. - 2010. - Т.1. -№ 4. - С. 66-71.

5. Borovskaya, A. The experience of a 2-year application of MALDI Biotyper technique in a routine setting / A. Borovskaya, E. Ilina, S. Sidorenko, A. Kruglov, D. Mudrak, T. Savinova, T. Maier, M. Kostrzewa, V. Govorun // Thesis from 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Vienna, 2010.

6. Савинова, Т.А. Клональная структура пневмококков, устойчивых к пенициллину / Т.А. Савинова, С.И. Солдатова, А.Н. Круглов, E.H. Ильина, C.B. Сидоренко // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2010.

7. Филимонова, О.Ю. Метод MALDI-tof масс-спектрометрической диф-ференцировки те/ генов стрептококков / О.Ю. Филимонова, Т.А. Савинова, С.И. Солдатова, А.Н. Круглов, E.H. Ильина, C.B. Сидоренко // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2010.

8. Savinova, Т.А. Clonal diversity of penicillin non-susceptible Streptococcus pneumoniae isolates in Moscow, Russia / T.A. Savinova, E.N. Ilina, A.D.

Borovskaya, S.V. Sidorenko // Thesis from 19th European

Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Helsinki, 2009.

9. Grudinina, S.A. Prevalence of mutations in PBP2x of Streptococcus pneumoniae / S.A. Grudinina, T.A. Savinova, E.N. Ilina, S.V. Sidorenko II Thesis from 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Munich, 2007.

10. Grudinina, S.A. Analysis of pbp2x Genes in Clinical Isolates of Streptococcus pneumoniae (Spn) / S.A. Grudinina, T.A. Savinova, O.Y. Filimonova, N.V. Dubrovskaya, E.N. Ilina, L.M. Weigel, S.V. Sidorenko // Thesis from 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy -San Francisco, 2006.

11. Guchev, I.A. Nasopharyngeal Carriage of Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae (Spn) After Prophylactic Administration of Azithromycin (Az) / I.A. Guchev, S.A. Grudinina, O.Y. Filimonova, T.A. Savinova, M.V. Malakchova, E.N. Uina, L.M. Weigel, S.V. Sidorenko // Thesis from 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - San Francisco, 2006.

12. Grudinina, S.A. Mass-spectrometric Discrimination of mefiА), meflE) and mefll) Genes and their Prevalence among Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae (Spn) Isolates from Russia / S.A. Grudinina, O.Y. Filimonova, T.A. Savinova, L.G. Stolyarova, E.N. Ilina, L.M. Weigel, S.V. Sidorenko // Thesis from 461h Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - San Francisco, 2006.

Список исполыуемых сокращений

БЛА - ß-лактамные антибиотики

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МПК - минимальная подавляющая концентрация

п.о. - пар оснований

ПСБ - пенициллинсвязывающий белок

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РФ - Российская Федерация

MALDI-TOF масс-спектрометрия - времяпролётная масс-спектрометрия с лазерной де-сорбционной ионизацией в присутствии вспомогательного вещества - матрицы (MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass-Spectrometry) MLST- мультилокусное сиквенс-типирование (Multi Locus Sequence Typing) CC -клоналъный комплекс (Clonal Complex) ST - сиквенс-тип (Sequence Type)

CLS1 - Институт клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute)

EUCAST - Европейский комитет по оценке антибиотикочувствительности (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)

Подписано в печать:

21.02.2011

Заказ № 5013 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 <499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савинова, Татьяна Александровна

список используемых сокращений. введение.1.

глава 1. обзор литературы.

1.1 Общая характеристика микроорганизма.

1.2 Клиническое значение 5. pneumoniae.

1.3 Методы идентификации и типирования 5. pneumoniae.

1.3.1 Идентификация пневмококков.

1.3.2 Типирование пневмококков.

1.4 Антибактериальная терапия пневмококковых инфекций.

1.5 Механизм резистентности S. рл/ш/иол/мякв-лактамнымантибиотикам.

1.6 Клиническое значение и распространениеS. pneumoniae, устойчивых к в-лактамным антибиотикам.

глава 2. материалы и методы исследования.

2.1 Микробиологические исследования.

2.1.1 Выделение, идентификация и хранение пневмококков.

2.1.2 Определение чувствительности к антимикробным препаратам.

2.1.3 Серотипирование.

2.2 Генетические исследования.

2.2.1 Выделение геномной ДНИ 5. pneumoniae.

2.2.2 Анализируемые последовательности ДНИ.

2.2.3 Амплификация фрагментов генома.

2.2.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ.

2.2.5 ПЦР-типирование капсульных антигенов.

2.2.6 Секвенирование pbp-генов, генов «домашнего хозяйства» и cps-генов.

2.2.7 Мультилокусное сиквенс-типирование.

глава 3. результаты.

3.1 Характеристика антибактериальной активности в-лактамных антибиотиков в отношении 5. pneumoniae и динамика распространения устойчивости.

3.1.1 Коллекция образцов клинических изолятов.

3.1.2 Распределение МПИ в-лактамных антибиотиков в отношении S. pneumoniae.

3.1.3 Резистентность S. pneumoniae к пенициллину.

3.1.4 Резистентность S. pneumoniae к амоксициллину.

3.1.5 Резистентность 5. pneumoniae к цефуроксиму.

3.1.6 Резистентность 5. pneumoniae к цефотаксиму.

3.1.7 Резистентность S. pneumoniae к другим группам антибиотиков.

3.2 Детекция генетических маркеров резистентности 5. pneumonia к в-лактамным антибиотикам с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии.

3.2.1 Разработка метода детекции.

3.2.2 Валидация метода минисеквенирования.

3.2.3 Анализ генетических маркеров резистентности клинических изолятов S. pneumoniae к в-лактамным антибиотикам.

3.3 ПЦР-типирование капсульных антигенов.

3.3.1 Оптимизация протокола мультипраймерной ПЦР.

3.3.2 Валидация метода ПЦР-типирования капсульных антигенов.

3.3.3 Результаты ПЦР-типирования капсульных антигенов.

3.4 Мультилокусное сиквенс-типирование.

глава 4. обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к β-лактамным антибиотикам"

Изучение особенностей формирования и распространения устойчивости пневмококков к ß-лактамным антибактериальным препаратам в России является актуальной проблемой. S. pneumoniae - возбудитель внебольничной пневмонии, обострений хронического бронхита, отита и синусита, является одним из клинически наиболее значимых микроорганизмов, развитие резистентности среди которых связано с наибольшими социальными и медицинскими последствиями. Формирование микроорганизмами устойчивости к антибактериальным препаратам является основной причиной снижения эффективности этиотропной терапии инфекционных болезней, удлинения сроков госпитализации пациентов и увеличения летальности.

Исторически, пенициллин считался наиболее активным антипневмококковым антибиотиком. Однако бесконтрольное и неоправданное использование антибиотиков при бактериальных инфекциях привело к появлению штаммов, устойчивых к ß-лактамным антибиотикам [118].

Устойчивость пневмококков к ß-лактамным антибиотикам опосредуется достаточно сложными и не до конца понятными механизмами. К настоящему времени в развитии резистентности однозначно установлена роль модификации генов трех пенициллинсвязывающих белков (ПСБ) - pbpA, pbp2b и рЬрХ [285, 290]. Продуктами модифицированных генов являются ПСБ со сниженной аффинностью к ß-лактамным антибиотикам, что закономерно ведет к невосприимчивости бактерий к данному классу антибактериальных препаратов. В формировании устойчивого фенотипа обсуждаются также возможная роль некоторых других механизмов, в частности, мутации в генах оперона murMN, гликозилтрансферазы СроА, гистидинпротеинкиназы CiaH, серинтреонинкиназы StkP [72, 94, 111, 276].

Закономерности распространения антибактериальной резистентности среди пневмококков во многом определяются особенностями структуры популяции этих бактерий. Согласно современным представлениям в глобальной популяции пневмококков одновременно происходят процессы формирования, распространения и эволюции отдельных генетических линий (клонов или клональных комплексов), а также горизонтальный обмен генов (вирулентности, резистентности, капсульных полисахаридов) между ними. Происходит также горизонтальный обмен генами с родственными микроорганизмами (Streptococcus mitis, Streptococcus oralis и др.)- Однако многие детали этих процессов на глобальном и локальном (Российская Федерация) уровнях остаются неизученными.

Кроме того, в настоящее время актуальна проблема достоверной видовой идентификации пневмококков. Наиболее часто сложности в идентификации встречаются при исследовании образцов из респираторного тракта. Населяющие одни и те же экологические ниши S. mitis и S. oralis настолько близки к S. pneumoniae, что их дифференциальная идентификация сильно затруднена. Ошибочная идентификация S mitis и S. oralis как S. pneumoniae может приводить к искажению данных об этиологии респираторных инфекций и распространении антибиотикорезистентности.

Таким образом, разработка и адаптация методов микробиологического и молекулярного контроля над уровнем резистентности S. pneumoniae к ß-лактамным антибактериальным препаратам и распространением устойчивых изолятов представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Цель исследования

Изучить динамику распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß-лактамным антибактериальным препаратам, и их генетическое разнообразие на территории Российской Федерации (РФ) методами бактериологии и молекулярно-генетического анализа.

Задачи исследования

1. Определить чувствительность клинических изолятов S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам и охарактеризовать динамику распространения резистентности;

2. Разработать высокопроизводительный метод выявления в генах ПСБ S. pneumoniae мутаций, приводящих к формированию резистентного к ß-лактамным антибиотикам фенотипа;

3. Оценить возможность прогнозирования устойчивости S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам на основании анализа генов ПСБ (pbpA, рЪр2Ъ, pbpX);

Научная новизна

Проведена фенотипическая, а также генетическая характеристика клинических изолятов S. pneumoniae, резистентных к ß-лактамным антибиотикам, в том числе разработан высокопроизводительный метод, основанный на реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом, позволяющий быстро и эффективно выявлять мутации, приводящие к формированию резистентного фенотипа. С помощью разработанного метода проведена оценка распространенности значимых мутаций среди клинических изолятов S. pneumoniae.

Впервые охарактеризована популяционная структура изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к пенициллину, циркулирующих на территории РФ с помощью перспективного метода мультилокусного сиквенс-типирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST), часть изолятов охарактеризована методом ПЦР-типирования капсульных антигенов, позволяющим установить принадлежность S. pneumoniae к определенному серотипу. Установлено, что среди изолятов с повышенной устойчивостью к пенициллину 39,7 % относятся к трем глобально распространенным клональным комплексам (СС81, СС271 и СС315). Данные об изолятах, выделенных,на территории РФ, внесены в международную базу данных MLST (http://spneumoniae.mlst.net).

Практическая значимость

Полученные данные о динамике распространения изолятов S. pneumoniae, резистентных к ß-лактамным антибиотикам в различных регионах РФ могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии респираторных инфекций. Так, данные полученные в ходе исследования, позволяют прогнозировать высокую эффективность бензилпенициллина, амокси-циллина и цефотаксима при респираторных пневмококковых инфекциях.

Разработанный метод выявления мутаций в генах ПСБ может быть положен в основу создания диагностических тест-систем, направленных на обнаружение устойчивости S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам, в том числе непосредственно в клиническом материале больного.

Результаты диссертационной работы были систематизированы и внедрены в педагогическую практику кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. В' приложении представлены копии документов, подтверждающих практическую значимость работы («Акт внедрения результатов диссертационной работы в практику кафедры микробиологии РМАПО»),

Основные положения, выносимые на защиту

1. На территории РФ наблюдается тенденция к росту устойчивости пневмококков к ß-лактамным антибиотикам на фоне выраженных колебаний этого показателя в отдельных регионах;

2. Отобраны специфичные мутации в генах ПСБ (pbpA, pbp2b, pbpX), обнаружение которых позволяет прогнозировать устойчивость S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам;

3. Популяция S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß-лактамным антибиотикам, циркулирующая на территории РФ, характеризуется выраженной клональностью и представлена в основном серотипами пневмококка, входящими в состав 13-валентной пневмококковой вакцины.

Апробация работы

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Савинова, Татьяна Александровна

Выводы

4. Оптимизирован протокол мультипраймерной ПЦР, позволяющий установить серотип клинических изолятов S. pneumoniae, персистирующих на территории РФ, на основании вариабельности генов, кодирующих поли-сахаридную капсулу;

5. Около 72 % изолятов, устойчивых к ß-лактамным антибиотикам относятся к серотипам, против которых направлена 13-валентная пневмококковая вакцина, что позволяет рассматривать вакцинацию как действенное средство сдерживания распространения резистентных изолятов;

6. Циркулирующая на территории России популяция S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß-лактамным антибиотикам характеризуется выраженной клональностью; 39,7 % таких изолятов относятся к трем кло-нальным комплексам (СС81, СС271 и СС315), имеющим мировое распространение.

Заключение

Широкое распространение резистентности к антимикробным препаратам среди пневмококков является основной причиной снижения эффективности этиотропной терапии инфекционных болезней. Изучение распространения и молекулярных механизмов резистентности S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам на территории Российской Федерации, является актуальной задачей.

Полученные в настоящем исследовании данные о динамике распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß-лактамным антибиотикам, в различных регионах России позволяют прогнозировать высокую эффективность бензилпенициллина, амоксициллина и цефотаксима при респираторных пневмококковых инфекциях и могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии.

Для исследования резистентных изолятов в клинической практике используются традиционные микробиологические методы, зачастую высокозатратные и мало информативные. В связи с этим задачи, связанные с разработкой и адаптацией новых эффективных молекулярно-генетических средств характеристики и типирования пневмококков, выглядят актуальными и своевременными.

В настоящей работе представлен разработанный метод минисеквени-рования, позволяющий быстро и эффективно выявлять мутации в ПСБ, приводящие к формированию резистентного фенотипа, и прогнозировать устойчивость клинических изолятов S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам.

В ходе исследования была показана выраженная клональность циркулирующих на территории России пенициллинустойчивых пневмококков с помощью перспективного метода мультилокусного сиквенс-типирования. С помощью метода ПЦР-типирования капсульных антигенов, адаптированного применительно к циркулирующей на территории РФ популяции, был охарактеризован серотиповый состав выборки пневмококков и показана перспективность антипневмококковой вакцинации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савинова, Татьяна Александровна, Москва

1. Винник А.Л., Варгина А.К., Ершова З.И. Питательная среда для выделения и культивирования пневмококка // Журн. микробиол. 1985. - № 8. - С. 19-22.

2. Грубер И.М., Жданова Л.Г., Мохов Ю.В. ц др. Физиологические особенности пневмококков // Журн. микробиол. 1981. - № 12. - С. 24-29.

3. Грубер И.М., Нисилевич В.Ф. Использование системы биологических параметров процессов культивирования при сравнительной характеристике различных штаммов Streptococcus pneumoniae // Журн. микробиол. 1989. - № 4. - С. 3-6.

4. Гучев И.А., Клочков О.И. Антибиотикопрофилактика вспышек внебольничной пневмонии в гомогенной популяции // Качественная клиническая практика. 2003. -№ 1. - С. 24-29.

5. Зубков М.Н., Гугуцидзе E.H. Микробиологические аспекты диагностики пневмоний // Пульмонология. 1997. - № 1. - С. 41-45.

6. Козлов М.Я. Острые отиты у детей и их осложнения. М: Медицина, 1986. - С. 232.

7. Костюкова H.H. Биологические свойства и распространенность Streptococcus pneumoniae // Журн. микробиол. 1981. - № 12. - С. 9-16.

8. Кречикова О.И., Козлов P.C., Богданович Т.М. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae (методические рекомендации) // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер, 2000. - № 2. - С. 88-98.

9. Мизерский Ю.Л., Сорокина Е.В. Эпидемиология внебольничной пневмонии у детей // Материалы совещания экспертов "Внеболъничная пневмония". Москва. -24-27 марта 2005.

10. Министерство здравоохранения и, социального развития Российской Федерации. Заболеваемость населения России в 2003 году // Статистические материалы, Москва. 2004. - № 1. - С. 34-38.

11. Навашин С.М., Чучалин А.Г., Белоусов Ю.Б. и др. Антибактериальная терапия пневмоний у взрослых. Учебно-методическое пособие для врачей. Москва: РМ-Вести, 1998. - С. 28.

12. Семине Н. Резван С., Страчунский Л., Ведьмина Е. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Методические указания МУК 4.2.-1890-04 // КМАХ. 2004. - № 4. - С. 306-359.

13. Цыганкова О.И. Бактериальные гемолизины и связь с вирулентностью. -Ставрополь: Медицина, 1988. С. 50.

14. Aanensen D.M., Mavroidi A., Bentley S.D., Reeves P.R.,Spratt В.G. Predicted fonctions and linkage specificities of the products of the Streptococcus pneumoniae capsular biosynthetic loci // J Bacteriol. 2007. - Vol. 189. - No. 21. - P. 7856-7876.

15. Aanensen D.M.,Spratt B.G. The multilocus sequence typing network: mlst.net // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - No. Web Server issue. - P. W728-733.

16. Alance S.R., McGee L., Jackson D., Chiou C.C., Feldman С., Morris A.J., Ortqvist A., Relio J,, Luna C.M., Baddour L.M., Ip M., Yu V.L.,Klugman K.P. Association of19.

Информация о работе

Савинова, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к β-лактамным антибиотикам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы